JP6666084B2

JP6666084B2 - Natural immunity level evaluation method and product containing baker's yeast beta-glucan for improving natural immunity level

Info

Publication number: JP6666084B2
Application number: JP2015134666A
Authority: JP
Inventors: 庸右梶本
Original assignee: FINGGAL LINK CO., LTD.
Current assignee: FINGGAL LINK CO., LTD.
Priority date: 2015-07-03
Filing date: 2015-07-03
Publication date: 2020-03-13
Anticipated expiration: 2035-07-03
Also published as: JP2017012125A

Description

本発明は、ヒトの自然免疫力レベルを評価する自然免疫力レベル評価方法および自然免疫力レベルの改善用パン酵母ベータグルカン含有製品に関する。 The present invention relates to a natural immunity level evaluation method for evaluating a human natural immunity level and a baker's yeast beta-glucan-containing product for improving the natural immunity level.

ヒトの免疫は、人々の健康維持のために必須の生体防御システムである。健康の維持には免疫、ホルモン、中枢神経の三システムがそれぞれ正常に機能することが大切であり、それぞれのシステムが相互に関連して機能していると考えられている。ヒトの免疫システムは、大別すると自然免疫システムと獲得免疫システムからなり、この両免疫システムは相互に連携してヒトの免疫を担っている。
特に自然免疫システムは、もともと体に備わった外敵に対する生体防御システムである。自然免疫システムには、補体や白血球その他の免疫担当細胞が関与しており、中でも白血球を構成する免疫細胞のマクロファージや好中球が、ウイルスやバクテリアなどの外敵に対する最初の防御を担当している。 BACKGROUND OF THE INVENTION Human immunity is an essential host defense system for maintaining people's health. It is important for the maintenance of health that the immune, hormonal, and central nervous systems function normally, respectively, and that these systems are thought to function in conjunction with each other. The human immune system is roughly divided into an innate immune system and an acquired immune system. These two immune systems cooperate with each other to carry out human immunity.
In particular, the innate immunity system is a biological defense system originally provided in the body against external enemies. The innate immune system involves complement, leukocytes, and other immune-competent cells.The immune cells that make up the leukocytes, macrophages and neutrophils, are responsible for the first defense against foreign enemies, such as viruses and bacteria. I have.

高齢化が進展し、ストレスの多い現在社会では、加齢やストレスにより自然免疫力の低下が問題になってきている。感染症に対する抵抗力の低下や、がんや多くの病気に罹患するのは自然免疫力の低下が原因の一つと考えられている。
ちなみに、日本人の５０％は、生涯に一度はがんに罹患し、最近の死亡原因の第１位はがんで約３０％、死亡原因第３位は肺炎で約１０％であり、合計約４０％のこれら２つの死亡原因には自然免疫力の低下が関係していると考えられる。 With the aging of society and the current stressful society, the deterioration of natural immunity due to aging and stress has become a problem. Reduced resistance to infectious diseases, as well as cancer and many other diseases, are thought to be due in part to reduced innate immunity.
By the way, 50% of Japanese suffer from cancer at least once in their lifetime. The most recent cause of death is about 30% for cancer, and the third largest cause of death is about 10% for pneumonia. It is believed that 40% of these two causes of death are associated with reduced innate immunity.

つまり、現在社会では一般に日々健康に生活している人々において、ストレスや加齢その他の原因により自然免疫力のレベルが低下しており、そのような免疫力レベルが低下した状態で年月が経過するにつれて、がんの芽が増大して、がんが発症したり、肺炎球菌などの病原体による肺炎、インフルエンザその他感染症に罹患し、結果的に免疫力低下により命を落とすことが多くなっていると考えられる。
一見健康状態にあると見える時でも、実は自然免疫力レベルの低下が起こっていることが多く、自然免疫力レベルを高めるための方策を講じて自然免疫レベルを高い状態に保つことが免疫健康の維持に必要である。 In other words, in today's society, the level of innate immunity generally declines due to stress, aging, and other causes in people who live healthy every day. As the disease grows, the buds of the cancer increase, the cancer develops, and pneumonia, influenza and other infectious diseases caused by pathogens such as pneumococci, and the likelihood of death due to reduced immunity are increasing. It is thought that there is.
At first glance, even when it appears that you are in a healthy state, the level of your natural immunity often decreases, and it is important to take measures to increase your level of your natural immunity and maintain a high level of your natural immunity. Necessary for maintenance.

近年、免疫の強化や増強に役立つと言われる様々な化合物が提案され、特許出願されている。多くの免疫力強化、免疫力賦活、免疫力増加などの働きをするとされる化合物は、ＮＫ活性、ＩＦＮ−γ産生能、ＩｇＡ産生能、その他それぞれ特定の免疫関連マーカーや指標を基準にしたデータでもって、免疫力の強化・賦活・増強の効果があると主張されているが、それらの化合物を投与する際に予め各免疫関連マーカーや指標を基にして各人の免疫力レベルを把握されることは、ほとんどなされてこなかった。 In recent years, various compounds that are said to be useful for enhancing or enhancing immunity have been proposed and patent applications have been filed. Many compounds that are said to enhance immunity, activate immunity, increase immunity, etc. are based on NK activity, IFN-γ production ability, IgA production ability, and other specific immune-related markers and indicators. Therefore, it is claimed that there is an effect of strengthening, activating, and enhancing immunity.However, when administering these compounds, the immunity level of each individual is grasped in advance based on each immune-related marker and index. Little has been done.

特許文献１は、採血した血液に含まれる免疫細胞に対する免疫細胞マーカーを用いて免疫力を評価する免疫力評価方法を提示している。免疫細胞マーカーとしては、Ｔ細胞数、Ｔ細胞増殖係数、ＣＤ４Ｔ細胞／ＣＤ８Ｔ細胞比率、ナイーブＴ細胞数、ナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比率、ＩＬ−２サイトカイン産生能、ＩＦＮ−γサイトカイン産生能、ＩＬ−４サイトカイン産生能、Ｂ細胞数、及びＮＫ細胞数のうち少なくとも２つが挙げられている。その他ＣＤ３再発現量を用いる評価方法も記載されている。
特許文献２に記載の発明では、総合的な免疫力を高精度に評価できる免疫評価方法として、採血した血液における、ＣＤ８陽性且つＣＤ２８陽性又は陰性である特定Ｔ細胞の数を計測し、パラメータや年齢の相関による回帰式からＴリンパ球年齢を算出している。
非特許文献１には、「免疫系は病原体の貪食を主な働きとする顆粒球・マクロファージなどからなる自然免疫系と病原体特異的に働く抗体をつくるＢ細胞、ウイルスに対抗するキラーＴ細胞などからなるリンパ球を中心とした獲得免疫系からなっている。自然免疫系は病原体の種類をあまり問わずに作用し、人の誕生後すぐ機能し始める。その後加齢に伴い、顆粒球やマクロファージは大きな変化を示さない。」と記載され、獲得免疫は、加齢や老化により低下することが説明されている。 Patent Literature 1 discloses an immunity evaluation method for evaluating immunity using an immune cell marker for immune cells contained in collected blood. Examples of immune cell markers include T cell number, T cell proliferation coefficient, CD4 T cell / CD8 T cell ratio, naive T cell number, naive T cell / memory T cell ratio, IL-2 cytokine production ability, IFN-γ cytokine production ability, At least two of the IL-4 cytokine-producing ability, the number of B cells, and the number of NK cells are listed. In addition, an evaluation method using the CD3 re-expression amount is described.
In the invention described in Patent Document 2, as an immunity evaluation method capable of evaluating comprehensive immunity with high accuracy, the number of specific T cells that are CD8-positive and CD28-positive or negative in blood collected is measured, and parameters and T lymphocyte age is calculated from a regression equation based on age correlation.
Non-Patent Literature 1 states that “the immune system is composed of granulocytes and macrophages that mainly phagocytose pathogens. B cells that produce antibodies that work specifically with pathogens, killer T cells that fight against viruses, etc. It consists of an adaptive immune system consisting mainly of lymphocytes consisting of: The innate immune system acts regardless of the type of pathogen and begins to function as soon as a person is born. Does not show large changes. ", Which explains that acquired immunity is reduced by aging and aging.

一方、パン酵母βグルカンに関しても様々な研究が行われている。
パン酵母ベータグルカンが自然免疫力の強化に役立つ化合物であり、マクロファージや好中球の活性化に関与することが、著明な科学雑誌であるＮＡＴＵＲＥ掲載の論文でも明らかにされている（非特許文献２参照）。 On the other hand, various studies have been conducted on baker's yeast β-glucan.
Baker's yeast beta-glucan is a compound that enhances innate immunity and is involved in the activation of macrophages and neutrophils. Reference 2).

特にパン酵母ベータグルカンが免疫力の強化に関係する健康食品として有用であるとして、世界中で実用に供されている。どのような機序で自然免疫が強化されるかについては、感染防御やがんの治療効果に関する基礎試験で確認されている（非特許文献３〜４参照）。
経口投与されたパン酵母ベータグルカンは、小腸のパイエル板を通じて体内に取り込まれた後、マクロファージにより飲み込まれ、そのマクロファージが脾臓、リンパ節、骨髄へ移行する。骨髄中でマクロファージが飲み込んだパン酵母ベータグルカンは、消化されて小さな可溶性のβ−グルカン断片として放出され、好中球のＣＲ３レセプターに吸着し、好中球を活性化する。活性化された好中球が、ウイルス、バクテリア等の外敵や抗体で覆われたがん細胞を攻撃して殺す。これがパン酵母ベータグルカンの自然免疫力の強化改善および抗体抗がん剤との併用投与による抗がん作用の作用機序である。 In particular, baker's yeast beta-glucan has been put to practical use all over the world because it is useful as a health food related to enhancement of immunity. The mechanism by which innate immunity is strengthened has been confirmed in basic tests on protection against infection and therapeutic effects on cancer (see Non-Patent Documents 3 and 4).
The orally administered baker's yeast beta-glucan is taken into the body through the Peyer's patch of the small intestine and then swallowed by macrophages, which migrate to the spleen, lymph nodes, and bone marrow. The baker's yeast beta-glucan swallowed by macrophages in the bone marrow is digested and released as small soluble β-glucan fragments, adsorbs to the CR3 receptor of neutrophils, and activates neutrophils. The activated neutrophils attack and kill foreign cells such as viruses and bacteria and cancer cells covered with antibodies. This is the mechanism by which baker's yeast beta-glucan enhances and enhances the natural immunity and the anticancer effect of the combined administration with an antibody anticancer agent.

食品レベルのパン酵母ベータグルカン原料は、一般に水に不溶性であるが、更に加工して水溶性の原料として飲料などに添加できるものも製造されている。米国Ｂｉｏｔｈｅｒａ社では、不溶性のパン酵母ベータグルカン原料としてＷｅｌｌｍｕｎｅＷＧＰＦ３００５を、水溶性の原料としてＷｅｌｌｍｕｎｅＷＧＰＦ３０２０を製造販売している。また、水溶性のパン酵母ベータグルカンのがん治療用注射剤ＩｍｐｒｉｍｅＰＧＧを製造し、抗体抗がん剤との併用による大腸がんや小細胞性肺がん、その他腫瘍に対するがん治療薬としての臨床試験が海外で実施されている（非特許文献５〜６参照）。 Food-grade baker's yeast beta-glucan raw materials are generally insoluble in water, but some are further processed to produce water-soluble raw materials that can be added to beverages and the like. Biothera in the United States manufactures and sells Wellmune WGP F3005 as an insoluble baker's yeast beta-glucan raw material and Wellmune WGP F3020 as a water-soluble raw material. We also manufacture Imprime PGG, a water-soluble baker's yeast beta-glucan injection for cancer treatment, and use it in combination with antibody anticancer drugs as a cancer treatment for colorectal cancer, small cell lung cancer, and other tumors. Tests have been conducted overseas (see Non-Patent Documents 5 and 6).

近年、ＨＨＶ−７やＨＨＶ−６と疲労度との関係について研究がなされている。例えば特許文献３では、「ヒトが疲労すると、免疫力が低下することが考えられ、ヒトの免疫力の低下の一つの表現系として、ウイルス感染が挙げられる。しかし、ヒトの疲労とウイルス感染との関係は明らかにはなっていない」として、ＨＨＶ−６やＨＨＶ−７の唾液中のウイルス量が疲労度を評価方法として有用であると記載されている。彼らは、自然免疫力レベルではなく、疲労の評価方法として唾液中のウイルス量に対する研究開発を行っている。唾液中のＨＨＶ−７の測定は、免疫力レベルではなく疲労度の評価指標としての認識がなされていたわけである。 In recent years, research has been conducted on the relationship between HHV-7 or HHV-6 and the degree of fatigue. For example, in Patent Document 3, it is considered that when a human is fatigued, immunity is reduced, and one expression system of the reduced immunity of a human is viral infection. It is described that the virus amount in saliva of HHV-6 and HHV-7 is useful as a method for evaluating the degree of fatigue. They are conducting research and development on salivary viral load as a method of assessing fatigue, not natural immunity levels. The measurement of HHV-7 in saliva has been recognized as an evaluation index of the degree of fatigue, not the level of immunity.

特許文献４は、被験者の病的疲労の疲労度を評価することを特徴とする疲労度評価方法に関する発明である。
特許文献４に記載の実施例２によれば、健常者２０名に対して７日間の通常勤務（内２日は休日）直後とその後の７日間の連休後に唾液検体を採取し、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ヒトサイトメガロウイルス、エプシュタイン・バーウイルスの４種に関しウイルス量を判定量測定している。健常者２０名で就労中５０％、休息時において３０％の被験者においてのみ、ＨＨＶ−７のＤＮＡが検出され、別途大学病院の慢性疲労症候群（ＣＦＳ）外来を受信したＣＦＳ患者２４名では９２％（２２名）においてＨＨＶ−７が検出されたと記載され、特許明細書中に測定結果が示されている。確かに慢性疲労症候群患者では高率にＨＨＶ−７が検出されている。 Patent Literature 4 is an invention related to a fatigue evaluation method characterized by evaluating the degree of morbid fatigue of a subject.
According to Example 2 described in Patent Document 4, saliva samples were collected from 20 healthy subjects immediately after 7 days of normal work (of which 2 days are holidays) and after 7 days of consecutive holidays, and HHV-6 was collected. , HHV-7, human cytomegalovirus, and Epstein-Barr virus, the amount of the virus is determined. HHV-7 DNA was detected only in 50% of the 20 healthy subjects at work and 30% at rest, and 92% in 24 CFS patients who received a separate CFS outpatient clinic at a university hospital (22) reported that HHV-7 was detected, and the measurement results are shown in the patent specification. Certainly, HHV-7 is detected at a high rate in patients with chronic fatigue syndrome.

しかし、健常者２０名では、ＨＨＶ−７の検出者数が通常勤務就労後では１０名、休息時の後には６名であり、休息によりＨＨＶ−７の検出者は４名減少している。個々の症例ごとの測定値の変化が報告されていない。陽性と検出された被験者のＨＨＶ−７の量（単位：ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）と人数は、通常勤務就労後と休息時後では下記の通りである。
通常勤務就労後：３×１００：２名、４×１０：３名、１．６×１０：５名
休息時後：１．４×１０００：１名、３×１００：３名、４×１０：２名
つまり、休息時後の１名は、ＨＨＶ−７の量が１４００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌと就労後のどの症例よりも高く、残り４名中２名は先の就労後よりも高い値；３００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌとなっている。 However, among the 20 healthy subjects, the number of HHV-7 detected was 10 after regular work and 6 after rest, and the number of HHV-7 detected decreased by 4 after rest. No changes were reported for individual cases. The HHV-7 amount (units: copies / ml) and the number of subjects positively detected are as follows after normal work and rest.
After regular working: 3 × 100: 2, 4 × 10: 3, 1.6 × 10: 5 After rest: 1.4 × 1000: 1, 3 × 100: 3, 4 × 10 In other words, one person after resting had an HHV-7 level of 1400 copies / ml, which was higher than any of the cases after working, and two of the remaining four persons had a higher value than after the previous working; 300 copies / ml.

結果的には、休息時後は就労後に比較して、陽性被験者の３名がより高い値になり、４例は検出されなくなった。しかも、陽性被験者中１例は休息時後の値が就労後の値の約８倍も高い値になっていたのである。従って、健常人でＨＨＶ−７の値が群として改善したとの結論にはならない。１週間の休息後に２０例中新たに４名、合計１４名でＨＨＶ−７が検出されなくなったとし、ＨＨＶ−７が検出された６症例の検出値が増加したことを勘案しないで群として疲労が回復した人数が増えたとの評価は妥当性を欠いている。慢性疲労症候群患者でのＨＨＶ−７の値が高く、同患者等での病的疲労の疲労度を評価することを特徴とする疲労度評価方法とすることは理に適っており、その範囲で特許請求項が認められた特許が成立している。一般の健常者の疲労度評価方法としては特許審査では認められなかったのである。 As a result, three of the positive subjects had higher values after resting than after working, and four cases were not detected. Moreover, in one of the positive subjects, the value after rest was about eight times higher than the value after work. Therefore, it cannot be concluded that the HHV-7 value improved as a group in healthy subjects. HHV-7 was no longer detected in a total of 14 out of 20 cases after a week of rest, and the group was fatigued without considering that the detection value of 6 cases in which HHV-7 was detected increased. However, the assessment that more people have recovered has lacked relevance. The value of HHV-7 in patients with chronic fatigue syndrome is high, and it is reasonable to use a fatigue evaluation method characterized by evaluating the degree of morbid fatigue in the same patient. A patent has been granted for which a claim has been granted. It was not recognized in patent examination as a method for evaluating the degree of fatigue of normal healthy persons.

非特許文献７は、特許文献４に記載された実施例の試験結果を一般の学術論文として公表している。「ヘルペスウイルス感染と疲労」と題して主にＨＨＶ−６と疲労の関係についての関係を論じている。全身的な自然免疫力レベルの評価に、唾液中のＨＨＶ−７量が指標として使えることは想定外であったのである。免疫力の低下は、疲労の原因となることもあるが、免疫が低下すると必ず疲労する訳ではない。 Non Patent Literature 7 discloses test results of the examples described in Patent Literature 4 as general academic papers. He mainly discusses the relationship between HHV-6 and fatigue under the title "Herpes virus infection and fatigue". It was unexpected that the amount of HHV-7 in saliva could be used as an index to evaluate the systemic innate immunity level. Reduced immunity can cause fatigue, but reduced immunity does not necessarily mean fatigue.

本発明者が唾液中のＨＨＶ−７量を測定するにあたって、ＨＨＶ−７の測定に関する先行技術を調査したところ、下記の情報があることが分かった。
特許文献５によれば、ヘルペスウイルスに対するオリゴヌクレオチドを用いるマイクロアレイ遺伝子解析方法であるが、定量的な測定には不向きである。
特許文献６によれば、ＨＨＶ−７ＤＮＡの配列を同定し、１９３塩基対の各種断片を用いてＰＣＲ反応に使用している。移植患者、ＨＩＶ感染者等の血液や発熱性の病気の子供の唾液でのＨＨＶ−７の定性および定量分析している。
特許文献７によれば、唾液検体にビオチン化レクチンを混合してＨＨＶ−７を結合させ、さらにビオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、ビオチン化レクチンに結合したＨＨＶ−７をビーズに結合させた後、ＨＨＶ−７をビーズから回収し、ＰＣＲ法で定量する方法を実施している。 When the present inventor measured the amount of HHV-7 in saliva, the prior art on the measurement of HHV-7 was investigated, and the following information was found.
According to Patent Literature 5, a microarray gene analysis method using an oligonucleotide for a herpes virus is not suitable for quantitative measurement.
According to Patent Document 6, the sequence of HHV-7 DNA is identified and used in a PCR reaction using various fragments of 193 base pairs. The qualitative and quantitative analysis of HHV-7 in saliva of blood and febrile diseased children such as transplant patients and HIV-infected persons is performed.
According to Patent Document 7, a saliva specimen is mixed with a biotinylated lectin to bind HHV-7, and a bead to which a biotin-binding protein is bound is further added to bind the HHV-7 bound to the biotinylated lectin to the bead. After that, HHV-7 is recovered from the beads, and a method of quantification by PCR is performed.

従来の定量的ＰＣＲ法よりも、迅速かつ簡便に、かつ高感度で検出・測定できる測定法としてＱプローブ法ＰＣＲが発明されている（特許文献８〜１０参照）。 A Q probe method PCR has been invented as a measurement method that can be detected and measured more quickly, easily, and with higher sensitivity than the conventional quantitative PCR method (see Patent Documents 8 to 10).

再公表ＷＯ２００７／１４５３３３号公報Re-publication WO2007 / 145333 特開２０１０−１４５２０５号公報JP 2010-145205 A 特許第４８１２７０８号公報Japanese Patent No. 4812708 特許第５５４２０９３号公報Japanese Patent No. 5542093 特表２００９−５３１０４８号公報JP-T-2009-531048 特表平１１−５０９４１０号公報Japanese Patent Publication No. 11-509410 再公表ＷＯ２００９／１２３３４７号公報Re-publication WO 2009/123347 特許第３４３７８１６号公報Japanese Patent No. 3437816 特許第３９８５９５９号公報Japanese Patent No. 3985959 特許第４７２４３８０号公報Japanese Patent No. 4724380

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先に記述した通り、自然免疫力はストレスや加齢その他の原因により低下することが知られており、健康の維持やがん、感染症の予防に、自然免疫力を強化することが大切であり、そのための対策が必要と言われているものの、各個人が具体的に自然免疫力のレベルが低下した状態であるのか、高い状態にあるのかを容易に判定する実用的な方法が未だ確立されていないのが、大きな問題である。 As mentioned earlier, innate immunity is known to decrease due to stress, aging, and other causes.It is important to enhance innate immunity to maintain health and prevent cancer and infectious diseases. Although it is said that countermeasures are necessary, a practical method for easily determining whether each individual is in a state of reduced natural immunity or in a high state is still established. What is not done is a big problem.

自然免疫の主たる担い手である顆粒球、中でも好中球やマクロファージは加齢により数が大きく変動しないことから、それらの免疫担当細胞が関与する自然免疫力は、加齢により低下しないと考えられてきた。
しかしながら、本特許発明者は、自然免疫力が加齢やストレスにより低下すると考えるものである。老齢化、加齢による感染防御力の低下には、自然免疫力の低下が大きく関与している。パン酵母ベータグルカンによる好中球の貪食能を強化するメカニズムが明らかにされ、加齢やストレスで低下した感染防御力がパン酵母ベータグルカンの摂取により高まる事実が確認されている。つまり、顆粒球やマクロファージ等の自然免疫担当細胞の数ではなく、それぞれの免疫担当細胞の感染防御機能の低下によって自然免疫力は、低下するのである。 Granulocytes, the main players in innate immunity, in particular, neutrophils and macrophages do not fluctuate significantly with age, so it is thought that the innate immunity involving these immune cells does not decrease with age. Was.
However, the present inventor believes that innate immunity is reduced by aging and stress. Aging and aging decrease the infection defense ability, which is largely related to a decrease in innate immunity. The mechanism by which baker's yeast beta-glucan enhances the phagocytic activity of neutrophils has been elucidated, and it has been confirmed that ingestion of baker's yeast beta-glucan enhances the protective ability reduced by aging and stress. In other words, the natural immunity is reduced not by the number of cells in charge of innate immunity such as granulocytes and macrophages, but by the decrease in the infection defense function of each cell in charge of immunity.

本発明者は、簡便に各個人の免疫力レベルを測定することが出来れば、一見健康そうに見えても、実は加齢やストレスなどの要因で、多くの場合免疫力レベルが低下していることを確認することが可能となり、自然免疫力レベルを高い状態に保つ対策が立てられると考えた。 The present inventor has found that if it is possible to easily measure the immunity level of each individual, even if it looks healthy at first glance, in fact, the immunity level is often reduced due to factors such as aging and stress. We thought that it would be possible to take measures to keep the natural immunity level high.

上記事情を鑑み、本発明の課題は、ヒトの自然免疫力レベルを評価する免疫力レベル評価方法および自然免疫力レベルの改善用パン酵母ベータグルカン含有製品を提供することにある。 In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide an immunity level evaluation method for evaluating a human's natural immunity level and a baker's yeast beta-glucan-containing product for improving the natural immunity level.

本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、突発性発疹の原因とされるＨＨＶ−７やＨＨＶ−６が幼児時期に感染後も持続潜伏感染し、その後再活性化して唾液中に多く排出されていることは、自然免疫力レベルの低下と関係しているのではないかと考えるに至った。また、唾液中のウイルス量がＨＨＶ−６に比べ特に多いことが特徴であるＨＨＶ−７が測定定量対象として適しているのではないかと考えた。そして、唾液中のウイルス量が多いことが特徴であるＨＨＶ−７量を測定・定量することにより、全身的な自然免疫力レベルを定量的に評価できることを独自に見出し、免疫力レベルの新しい評価方法を発明した。
さらに本発明者は、パン酵母ベータグルカンを連日経口摂取することにより、唾液中のＨＨＶ−７により評価される免疫力レベルの低下に対して免疫力レベルを高め、免疫力レベルを改善することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。パン酵母ベータグルカンとしては、カプセル製剤を用いて試験を行った。 The present inventor has conducted intensive studies in view of the above-mentioned problems, and as a result, HHV-7 and HHV-6, which are the cause of the sudden rash, are persistently latently infected even after infection in infancy, and then reactivated and reactivated in saliva. It was concluded that the high levels of excretion might be related to lower levels of innate immunity. In addition, it was considered that HHV-7, which is characterized in that the amount of virus in saliva is particularly large as compared with HHV-6, may be suitable as an object for measurement and quantification. By measuring and quantifying the amount of HHV-7, which is characterized by a large amount of virus in saliva, we have uniquely found that the systemic natural immunity level can be quantitatively evaluated, and a new evaluation of the immunity level Invented a method.
Furthermore, the inventor of the present invention is able to improve the immunity level by increasing the immunity level against the decrease in the immunity level evaluated by HHV-7 in saliva by daily ingestion of baker's yeast beta-glucan. They have found that they can do this and have completed the present invention. As a baker's yeast beta-glucan, a test was performed using a capsule preparation.

すなわち、本発明は以下の特徴を有する自然免疫力レベル評価方法および自然免疫力レベルの改善用パン酵母ベータグルカン含有製品に関する。
（１）唾液中のヒトヘルペスウイルス７の量を指標として、被験者の自然免疫力レベルを評価する方法であり、
前記唾液中のヒトヘルペスウイルス７の量の定量は、前記ヒトヘルペスウイルス７のＤＮＡを前記唾液中から分離し、リアルタイムＰＣＲ法によりＤＮＡ量の測定し、得られた結果をもとに一定量の唾液当たりに含まれているヒトヘルペスウイルス７のウイルス量を算出して指標とし、
前記リアルタイムＰＣＲ法は、Ｑプローブ法ＰＣＲであり、
前記被験者の自然免疫力レベルを、前記唾液中のヒトヘルペスウイルス７量が
０〜１０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの場合に、正常ないし高レベルである、
１０，０００〜５０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの場合に、やや低レベルである、
５０，０００〜２５０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの場合に、低レベルである、
２５０，０００〜８００，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの場合に、非常に低レベルである、と評価することを特徴とする自然免疫力レベル評価方法。
（２）パン酵母ベータグルカンとして、パン酵母からの抽出工程での粒子径調節操作により、粒子径が２〜４ミクロンメーターの粒子を含むように加工された不溶性のベータグルカンと、該不溶性のベータグルカンを更に加工して得られた水溶性のベータグルカンとを含有し、
前記不溶性のベータグルカンと、前記水溶性のベータグルカンとの含有質量割合が５：１〜１：５の範囲であり、
（１）に記載の自然免疫力レベル評価方法で、自然免疫力レベルが、やや低レベルである、低レベルである、又は非常に低レベルであると評価された被験者に、自然免疫力レベルを改善するために摂取されることを特徴とするパン酵母ベータグルカン含有製品。 That is, the present invention relates to a method for evaluating a natural immunity level having the following characteristics and a product containing baker's yeast beta-glucan for improving the natural immunity level.
(1) A method for evaluating the natural immunity level of a subject using the amount of human herpes virus 7 in saliva as an index ,
The amount of the human herpesvirus 7 in the saliva was determined by separating the DNA of the human herpesvirus 7 from the saliva, measuring the amount of the DNA by a real-time PCR method, and determining a certain amount based on the obtained result. Calculate the amount of human herpes virus 7 contained per saliva and use it as an index,
The real-time PCR method is a Q probe method PCR,
The natural immunity level of the subject was determined by comparing the amount of human herpesvirus 7 in the saliva.
Normal to high levels at 0 to 10,000 copies / ml,
In the case of 10,000 to 50,000 copies / ml, the level is slightly lower.
Low level at 50,000-250,000 copies / ml,
An innate immunity level evaluation method characterized in that the level is extremely low when the concentration is 250,000 to 800,000 copies / ml .
( 2 ) An insoluble beta-glucan processed to contain particles having a particle size of 2 to 4 μm as a baker's yeast beta-glucan by a particle diameter adjusting operation in an extraction step from baker's yeast, and the insoluble beta-glucan Containing water-soluble beta-glucan obtained by further processing glucan,
The mass ratio of the insoluble beta-glucan and the water-soluble beta-glucan is in the range of 5: 1 to 1: 5,
The innate immunity level evaluation method according to (1) is applied to subjects whose innate immunity level is evaluated to be slightly low, low, or very low. A product containing baker's yeast beta-glucan, which is ingested for improvement.

本発明による自然免疫力レベルを評価する方法は、健常人や未病の人達の加齢やストレスにより低下した自然免疫力レベルを簡便に評価できるので、健康増進や健康維持にとって不可欠の判断材料を提供できる。本発明により評価される自然免疫力レベルを知ることで、免疫力レベルの低下が認められた際には、パン酵母ベータグルカンのような自然免疫強化健康食品の摂取や、免疫の増強に効果があるとされる地中海食などの食事や、睡眠、運動、プレバイオティクスやプロバイオテクスの摂取など適切な対策を講じて免疫健康の増進・強化をはかることができる。 The method for evaluating the natural immunity level according to the present invention can easily evaluate the natural immunity level lowered by aging and stress of healthy persons and undiseased persons, so that it is indispensable for health promotion and maintenance of health. Can be provided. Knowing the natural immunity level evaluated by the present invention, when a decrease in immunity level is observed, ingestion of natural immunity-enhancing health foods such as baker's yeast beta-glucan, and effects on enhancing immunity Appropriate measures, such as the inclusion of certain Mediterranean diets, sleep, exercise, and the intake of prebiotics and probiotics, can be used to enhance and strengthen immune health.

がんの発症予防や感染症対策上も、免疫力レベルを高めておくことは非常に大切であり、多くの人々が自らの自然免疫力レベルを確認し、自然免疫力レベルを高めることは、国民的な健康増進と医療行政上の経済性の向上にも役立つものと思われる。 It is very important to raise the level of immunity also in preventing the onset of cancer and countermeasures against infectious diseases, and many people check their own natural immunity level and raise the level of natural immunity, It is thought to be useful for promoting national health and improving economic efficiency in medical administration.

自然免疫力の強化に最も効果的と思われるパン酵母ベータグルカンの摂取を普及するためにも、本発明により自然免疫力レベルを評価し、免疫力レベルの低下が確認された際には、パン酵母ベータグルカンの摂取を開始することが望ましいとの判断が出来る。 In order to spread the ingestion of baker's yeast beta-glucan, which seems to be the most effective in enhancing innate immunity, the innate immunity level was evaluated according to the present invention. It can be determined that it is desirable to start taking yeast beta-glucan.

現在の高齢化社会において、健康状態を判定する従来の検査手法に加えて、新たに自然免疫に基づく免疫力レベルを判定することができれば、がんや肺炎に罹患するリスクを少なくするために必要かつ適切な全身的な抵抗力の強化を講じることが可能となる。 In today's aging society, it is necessary to reduce the risk of developing cancer and pneumonia if it is possible to determine the level of immunity based on innate immunity in addition to the conventional test methods for determining health status. And it becomes possible to take appropriate reinforcement of the whole body resistance.

唾液中のＨＨＶ−７を測定・定量する方法は、ＨＨＶ−７のＤＮＡを唾液中から分離し、リアルタイムＰＣＲ法によりＤＮＡ量を測定し、得られた結果をもとに一定量の唾液当たりに含まれているＨＨＶ−７のウイルス量を算出し、ＨＨＶ−７量が多ければ自然免疫力レベルが大きく低下しており、低ければ自然免疫力レベルは高いと判断する免疫力レベルの判定方法である。
本発明者は、Ｑプローブ法ＰＣＲでの唾液中のＨＨＶ−７ＤＮＡ量測定は、未だ誰も実施したことがないと考えられることに注目した。その結果、実際に、本発明で用いるリアルタイムＰＣＲ法としては、Ｑプローブ法ＰＣＲが好ましく用いられることを見出した。 A method for measuring and quantifying HHV-7 in saliva is to separate HHV-7 DNA from saliva, measure the amount of DNA by real-time PCR, and determine the amount of HHV-7 per fixed amount of saliva based on the results obtained. The amount of HHV-7 virus contained is calculated, and the method for determining the level of immunity is such that the level of natural immunity is greatly reduced if the amount of HHV-7 is large, and the level of natural immunity is determined to be high if the amount of HHV-7 is low. is there.
The present inventor has noted that it has been considered that no one has yet performed the measurement of the amount of HHV-7 DNA in saliva by the Q probe method PCR. As a result, they have found that the Q probe method PCR is actually preferably used as the real-time PCR method used in the present invention.

以下に本発明に至った経緯や根拠について記述する。
唾液中のＨＨＶ−７量をＱプローブ法ＰＣＲ法により測定した結果を示す。日常会社勤務や主婦、学生として健康に過ごしているボランティアの被験者１０名を募り、パン酵ベータグルカンのカプセル製剤の連日４週間投与を行い６週間後まで観察することにし、症例によっては８週目まで追跡測定した。
パン酵ベータグルカンを用いたのは、自然免疫力を強化することが多くの文献や実用化結果から明らかにされており、連日摂取することで自然免疫力の強化が起こり、唾液中のＨＨＶ−７量の含有量がどのように変化するかが解析されると考えたためである。
また、投与期間を、１日１回、４週間連続としたのは、全身的な自然免疫力レベルは、１週間や１０日間の短期間では変化を的確にとらえられないだろうと考えたためである。近藤一博らの２週間内での疲労についての試験とは異なる視点でとらえようとしたのである。 Hereinafter, the history and grounds of the present invention will be described.
The result which measured the HHV-7 amount in saliva by Q probe method PCR method is shown. Ten volunteer volunteers who are working daily and working as housewives or students are recruited and administered capsule preparations of baker's yeast beta-glucan for 4 weeks every day and observe until 6 weeks later. Follow-up measurement.
The use of baker's yeast beta-glucan has been clarified from many literatures and the results of practical application that it enhances natural immunity. Ingestion every day enhances natural immunity, and HHV- This is because it was considered that how the content of the 7 amount changes would be analyzed.
In addition, the administration period was set to once a day for four consecutive weeks, because the systemic innate immunity level could not be accurately detected in a short period of one week or ten days. . They tried to take a different perspective from Kondo's two-week fatigue test.

最初に投与開始前の１０名の唾液を採取したＨＨＶ−７量の試験結果は、後述する表１の通りである。
ＨＨＶ−７のＤＮＡ測定値（単位：ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）を数値の大きなものから順に表に示した。被験者１０名のＨＨＶ−７のＤＮＡ測定値でも、約２３０，０００の高値からから９００の低値まで幅広く分布していることが分かる。免疫力レベルが低下した人では、唾液腺皮下細胞に潜伏感染しているＨＨＶ−７の再燃が起こり、結果的に唾液中のＨＨＶ−７量が多くなり、免疫力レベルが本来各人の保有していた高いレベルを保っている人では、ＨＨＶ−７の再活性化が抑制されて唾液中のＨＨＶ−７量が少なくなると考えられる。従って、各人の免疫力レベルの高低を判定するには、唾液中のＨＨＶ−７量は最適の指標であることが明らかになった。１０名の被験者は、それぞれＨＨＶ−７の値が高い人から低い人まで、いずれも疲労を感じてはいなかった。慢性的疲労症候群などの病的疲労や、日常生活で生じる生理的疲労の蓄積による過労状態にある生理的病的疲労状態の被験者はいなく、一般的な疲労とＨＨＶ−７量が関係していないことを示唆している。 First, the test results of the amount of HHV-7 obtained by collecting saliva of 10 subjects before the start of administration are shown in Table 1 described later.
The measured values of HHV-7 DNA (units: copies / ml) are shown in the table in descending order of numerical value. It can be seen that the HHV-7 DNA measurement values of 10 subjects are widely distributed from a high value of about 230,000 to a low value of 900. In people with reduced immunity levels, relapse of HHV-7, which latently infects salivary gland subcutaneous cells, occurs, and as a result, the amount of HHV-7 in saliva increases, and the immunity level originally possessed by each individual is reduced. It is thought that in those who maintain the high level, the reactivation of HHV-7 is suppressed and the amount of HHV-7 in saliva decreases. Therefore, it was revealed that the amount of HHV-7 in saliva is an optimal index for judging the level of immunity of each individual. Ten subjects did not feel any fatigue, from high to low HHV-7. No subject has pathological fatigue such as chronic fatigue syndrome or a physiologically pathological fatigue state that is overworked due to accumulation of physiological fatigue that occurs in daily life, and general fatigue and HHV-7 levels are not related Suggest that.

次に、被験者１０名から無作為に選んだ５名に対して、不溶性の原料であるアメリカＢｉｏｔｈｅｒａ社製の原料（ＷｅｌｌｍｕｎｅＷＧＰＦ３００５）を１２５ｍｇ含有するパン酵母β−グルカンのカプセル製剤（フィンガルリンク株式会社製「フエルミューン」）を１日１粒、４週間連日投与し、１〜２週間ごとに測定したＨＨＶ−７ＤＮＡ測定値を後述する表２に示す。
５例とも投与開始１週後（１週目）には、いずれも０週目の値よりも低値になった。投与開始前の値が２２９，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌと最も高かった症例（Ｎｏ．１）では２週目に一旦値が高くなった後、４週目から５週目に段階的に低下し、６週目には再度上昇した後８週目にはまた減少した。投与開始前の値に比較すると、６週目では、６１．６％であったが、８週目には更に４１．０％まで低下した。
投与開始前の値が２１９，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌと２番目に高かった症例（Ｎｏ．２）では、１週目に投与開始前の約半分の値に低下し、２週目には検出限界以下の０になり、６週目までずっと０であった。３番目と４番目の症例では、１週目に低下した後、２週目、３週目と高い値になって５週目から６週目に段階的に低下し、投与開始時よりも大幅に低い値（５．４％、６１．２％）になった。 Next, a capsule preparation of baker's yeast β-glucan containing 125 mg of an insoluble raw material (Wellmune WGP F3005), which is an insoluble raw material, was prepared for five randomly selected from 10 subjects (Fingal Link Co., Ltd.). The "Hermune" manufactured by the company) was administered once a day for 4 weeks, and HHV-7 DNA measurement values measured every 1 to 2 weeks are shown in Table 2 below.
One week after the start of administration (week 1), the values were lower than those at week 0 in all five cases. In the case where the value before the start of administration was 229,000 copies / ml, which was the highest (No. 1), the value once increased in the second week, then gradually decreased from the fourth week to the fifth week, and then decreased to the sixth week. After rising again in the eyes, it decreased again in the eighth week. Compared to the value before the start of administration, it was 61.6% at the 6th week, but further decreased to 41.0% at the 8th week.
In the case of the second highest value (219,000 copies / ml) before the start of administration (No. 2), the value was reduced to about half the value before the start of administration in the first week, and was below the detection limit in the second week. It was 0 and remained zero until week 6. In the third and fourth cases, the value decreased at the first week, then increased to the second and third weeks, gradually decreased from the fifth to the sixth week, and was larger than at the start of administration. Low values (5.4%, 61.2%).

５例中１例、最も投与開始前の値が１，２７０ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌとＨＨＶ−７値の低い症例（Ｎｏ．５）は、１週目にさらに半分以下の低値５２１ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌになったが、２週目の３日前に急性の腸炎に罹患し、３８℃の発熱、翌日下痢と軽い嘔吐や４０℃の発熱、翌々日にクリニックにて点滴と薬の投与を受け、２週目の翌日からは通常生活にもどった症例である。２週目には最大の７３９，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌに急上昇し、４週目も５９２，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌと極めて高い値で継続し高値を持続した後大幅に低下し、第５週目には１５，３００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ、第６週目には３０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌにまで低下した。見たところ病状も回復し、元気になったように見えても増大したＨＨＶ−７量は高値のまま２週間以上経過し、自然免疫力レベルは低下した状態を継続したと考えられる。その後に自然免疫力レベルが高くなり、次第に回復するにつれてＨＨＶ−７量も減少したのである。 In one of the five cases, the value before the start of administration was 1,270 copies / ml and the case with a low HHV-7 value (No. 5) had a low value of 521 copies / ml, which was less than half in the first week. She suffered from acute enteritis 3 days before the second week, and had fever at 38 ° C, diarrhea and mild vomiting and fever at 40 ° C the next day. Is a case that has returned to normal life. In the second week, it rapidly increased to a maximum of 739,000 copies / ml, continued in the fourth week at an extremely high value of 592,000 copies / ml, continued to be at a high value, and then decreased significantly. It decreased to 300 copies / ml at the sixth week and 30,000 copies / ml. Apparently, the condition recovered, and the increased amount of HHV-7 remained high for more than two weeks even though it seemed to be well, and the natural immunity level was considered to have continued to decline. Thereafter, the level of innate immunity increased, and the HHV-7 level decreased as the level gradually recovered.

このように重度の疾病に罹患後に、唾液中のＨＨＶ−７量が急激に増大することが起こりえることが分かった。しかもＨＨＶ−７量は１０名の被験者の０日目の最大測定値の約４倍近くまで増大したわけであり、驚くべき事実である。しかし、一旦急激にＨＨＶ−７量が増えたが、４週目以降に比較的少ない量に低下したことは、低下した全身的な自然免疫力レベルは、改善向上に時間がかかることを示唆している。 Thus, it has been found that the amount of HHV-7 in saliva can rapidly increase after suffering from a severe disease. Moreover, the amount of HHV-7 increased to almost four times the maximum measured value on day 0 of 10 subjects, which is a surprising fact. However, once the HHV-7 level increased rapidly, but decreased to a relatively low level after week 4, the decreased systemic innate immunity level suggests that it takes time to improve and improve. ing.

唾液中のＨＨＶ−７が、重度の腸炎に罹患した際に、これほどまでにウイルス量が増えることは、如何に抵抗力、すなわち免疫力レベルが低下したかを示す貴重な臨床結果である。もともと唾液中のＨＨＶ−７が少ない症例では、免疫レベルが高い状態にあったので、パン酵母β−グルカンの連続摂取により元の高い免疫力レベルに回復しつつあることが示唆される。 This increase in viral load when salivary HHV-7 suffers from severe enteritis is a valuable clinical result showing how resistance, ie, immunity levels, has decreased. Originally, in cases in which HHV-7 in saliva was low, the level of immunity was high, suggesting that continuous ingestion of baker's yeast β-glucan is recovering the original high level of immunity.

結論としては、重篤な急性疾患に罹患した症例を除く４症例が全て５週目には０週目に比較して唾液中のＨＨＶ−７の量が少なくなった。また、重篤な急性疾患に罹患した症例では、罹患後直ぐに急激にＨＨＶ−７量が増大し、発病後２週間経過後も高値であったが３週間経過後にかけて急激に低値に減少した。 In conclusion, salivary HHV-7 levels were lower in all four cases at week 5 than at week 0, except for those suffering from severe acute illness. In cases suffering from severe acute illness, the amount of HHV-7 rapidly increased immediately after the illness and remained high two weeks after onset, but rapidly decreased to low after three weeks. .

次に、上記の５症例の他の５名の被験者には、パン酵母不溶β−グルカンの不溶性原料（ＷｅｌｌｍｕｎｅＷＧＰＦ３００５）に可用性の原料（ＷｅｌｌｍｕｎｅＷＧＰＦ３０２０）を２：１（質量比）の割合で混合した原料１２５ｍを含有するカプセル製剤（フィンガルリンク株式会社製「フエルミューンＳＤ」）を１日１粒、４週間連日投与し、１〜２週間ごとに測定したＨＨＶ−７ＤＮＡ測定値を表３に示す。 Next, in the other five subjects in the above five cases, the insoluble raw material (Wellmune WGP F3005) of the baker's yeast insoluble β-glucan was added to the available raw material (Wellmune WGP F3020) at a ratio of 2: 1 (mass ratio). Table 3 shows the HHV-7 DNA measurement values obtained by administering a capsule formulation ("Fermune SD" manufactured by Fingal Link Co., Ltd.) containing 125 m of the raw material mixed once a day for 4 weeks, and measuring every 1-2 weeks. Show.

唾液中ＨＨＶ−７の０週目のＤＮＡ値が８８，４００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌと最も大きかった症例（Ｎｏ．６）は、１週目には大幅に低下した後、２週目から４週目にかけて増大を行い、５週目、６週目と低下し、６週目と８週目の値は０週目対比で、それぞれ３２．５％、３４．４％まで低下した。次に値の大きな症例（Ｎｏ．７）では、１週目から５週目まで増減を繰り返した後、６週目、８週目には０週目対比で、４９．１％、４９．２％まで低下した。残りの３例では０週目の値も６，０９０、２，１７０、９１２ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌと小さく、２〜４週目には検出基準以下、つまり０になり、その後も６週目まで０か低値で推移した。 The case where the DNA value of salivary HHV-7 at week 0 was the highest at 88,400 copies / ml (No. 6) was significantly decreased at the first week and then increased from the second to the fourth week. After that, the values decreased at the 5th and 6th weeks, and the values at the 6th and 8th weeks decreased to 32.5% and 34.4%, respectively, as compared with the 0th week. In the case with the next largest value (No. 7), the increase and decrease were repeated from the 1st week to the 5th week, and then, at the 6th and 8th weeks, 49.1%, 49.2 compared to the 0th week. %. In the remaining three cases, the value at week 0 was also as small as 6,090, 2,170, and 912 copies / ml, and was below the detection standard, that is, 0, at weeks 2 to 4, and was 0 or low until week 6 thereafter. The value has changed.

結論として、５症例のいずれもＤＮＡ量の値が５週目以降６週目までに、投与開始前の値対比で大幅に減少していた。０週目のＤＮＡ量値が小さな症例では、６週目にかけて０か低値で推移した。０週目の値が大きな症例も６週目、８週目で約３０％〜５０％まで低下した。つまり、免疫力レベルが高い症例では高い状態を維持し、免疫力レベルが低下した症例では免疫力レベルを高めることが出来たと考えられる。 In conclusion, in all of the five cases, the value of the DNA amount was significantly reduced from the 5th week to the 6th week as compared with the value before the start of administration. In the case where the DNA amount value at week 0 was small, it changed to 0 or a low value over the sixth week. Cases with large values at week 0 also dropped to about 30% to 50% at week 6 and week 8. In other words, it is considered that the case where the immunity level was high could be maintained in the case where the immunity level was high, and the immunity level could be raised in the case where the immunity level decreased.

さらにＨＨＶ−７のＤＮＡ量の低下を達成するためには、継続してパン酵母β−グルカンを摂取することが望ましい。また、いったんＤＮＡの量が少ない値や０まで低下した場合でも、パン酵母ベータグルカンを継続して摂取し、低値を持続することが望ましいと考えられる。 In order to further reduce the amount of HHV-7 DNA, it is desirable to continuously ingest baker's yeast β-glucan. Even if the amount of DNA once decreases to a small value or to zero, it is considered desirable to continue ingesting baker's yeast beta-glucan and maintain the low value.

なお、今回試験に使用したパン酵母ベータグルカンは、アメリカのＢｉｏｔｈｅｒａ社が製造している原料粉末を使用したのであり、特許製法により粒子径が２〜４μｍの粒子が多くなるように加工した原料ＷｅｌｌｍｕｎｅＷＧＰＦ３００５および、水に不溶性のＷｅｌｌｍｕｎｅＷＧＰＦ３００５を更に加工して製造された水溶性の原料ＷｅｌｌｍｕｎｅＦ５０３０とＷｅｌｌｍｕｎｅＦ３００５との配合物を含有するカプセル製剤である。
カプセル製剤は、１粒にＷｅｌｌｍｕｎｅＷＧＰが１２５ｇと賦形剤、安定剤として結晶セルロースが含有されたものを使用した。 The baker's yeast beta-glucan used in this test was a raw material powder manufactured by Biothera, Inc. of the United States. The raw material Wellmune processed by a patent manufacturing method to increase the number of particles having a particle diameter of 2 to 4 μm was increased. This is a capsule preparation containing a mixture of WGP F3005 and a water-soluble raw material Wellmune F5030 and Wellmune F3005 produced by further processing water-insoluble Wellmune WGP F3005.
The capsule preparation used contained 125 g of Wellmune WGP, excipients, and crystalline cellulose as a stabilizer in one capsule.

パン酵母β−グルカンの２種類のサプリメントを使って４週間連日投与効果を検証した結果、０週目と６週目の唾液中のＨＨＶ−７量すなわちＤＮＡ測定量を対比した結果は表４の通りである。
但し、試験期間中に重篤な急性疾患に罹患した１症例を除いて表示した。
９例のいずれの症例もパン酵母β−グルカンの連日４週間投与により、唾液中のＨＨＶ−７ＤＮＡ量が６週目までに大幅に低下ないし検出基準以下の０となった。 As a result of examining the effect of daily administration for 4 weeks using two kinds of supplements of baker's yeast β-glucan, the results of comparing the amount of HHV-7 in saliva, that is, the measured amount of DNA in the 0th week and the 6th week are shown in Table 4. It is on the street.
However, it is shown except for one case that suffered a serious acute illness during the test period.
In all of the nine cases, the administration of baker's yeast β-glucan for four weeks on a daily basis resulted in a significant decrease in the amount of HHV-7 DNA in saliva by the sixth week or to a level below the detection standard of 0.

自然免疫力を強化する作用を有するパン酵母β−グルカンの４週間の連日投与で、低下していた免疫力レベルが高められたが、ＨＨＶ−７の量が多くて免疫力レベルが大幅に低下していると考えられる症例では、ＨＨＶ−７量を完全にゼロや極めて低値にまで減少し尽くすことが出来ていないので、さらに再度パン酵母β−グルカンを４週間以上、投与を行って、ＨＨＶ−７の量をさらに低下させ、自然免疫力レベルの改善向上効果を高めることが有用だと考えられる。 Daily administration of baker's yeast β-glucan, which has the effect of enhancing natural immunity, for 4 weeks increased the reduced immunity level, but the amount of HHV-7 was large and the immunity level was significantly reduced In the case considered to have been performed, since the HHV-7 amount could not be completely reduced to zero or extremely low, the baker's yeast β-glucan was administered again for 4 weeks or more, It is considered useful to further reduce the amount of HHV-7 and enhance the effect of improving and improving the level of innate immunity.

また、途中で重篤な急性疾患に罹患した被験者ではＨＨＶ−７量が大幅上昇後高い値をしばらく保った後、低値に低下したものの、元の低い値にまでは低下できていないので、さらにパン酵母β−グルカンを再投与することが望ましいと考えられる。従来から、大病や大手術を行った後は、１〜２カ月は免疫力が低下しているので肺炎その他感染症に罹らないように安静にする必要があると言われている。今回のデータは、まさに自然免疫力のレベルの回復にパン酵母β−グルカンの連日摂取が効果を発揮し、早めに自然免疫力レベルの強化が達成されることを示唆している。 In addition, in subjects suffering from a serious acute illness on the way, after the HHV-7 level maintained a high value for a while after a significant increase, it decreased to a low value, but it could not be reduced to the original low value, Furthermore, it may be desirable to re-administer the baker's yeast β-glucan. Conventionally, it is said that after performing a major disease or major surgery, immunity is reduced for one to two months, so that it is necessary to rest so as not to suffer from pneumonia and other infectious diseases. The present data suggests that daily intake of baker's yeast β-glucan is just effective in restoring the level of innate immunity, and that the level of innate immunity is achieved sooner.

本発明の自然免疫力レベルの評価方法において、唾液の採取方法については、特に限定されるものではなく、市販の採取器具のサリベットや、Ｓａｌｉｖａｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎａｉｄその他や、飲料水用のストローなどを用いることができる。
時間的には、毎回同じ時間帯で採取することにより、採取時間によるＨＨＶ−７含有量のバラツキが少なくなると思われる。今回の試験では、主に午前中、人によっては午後に同じ時間帯で採取した。 In the method for evaluating the level of innate immunity according to the present invention, the method for collecting saliva is not particularly limited, and may be a commercially available collection device such as Sarivet, Saliva collection aid, or a drinking water straw. Can be.
In terms of time, it is considered that the variation of the HHV-7 content due to the collection time is reduced by collecting the same time every time. In this study, the samples were collected mainly in the morning and in the afternoon for some people at the same time.

唾液中からＨＨＶ−７のＤＮＡの抽出分離は、唾液中のＨＨＶ−７をプロテナーゼで可溶化し、磁性ビーズを用いてＤＮＡ精製を行って分離した。特に分離方法を限定するものではなく、種々の改良方法を用いることが出来る。 In the extraction and separation of HHV-7 DNA from saliva, HHV-7 in saliva was solubilized with proteinase, and DNA was purified using magnetic beads and separated. The method of separation is not particularly limited, and various improved methods can be used.

分離したＨＨＶ−７ＤＮＡ量を指標とするＨＨＶ−７量の測定には、リアルタイムＰＣＲ法が使える。本発明者はＱｕｅｎｃｈｉｎｇＰｒｏｂｅ（Ｑプローブ）法を用いたリアルタイムＰＣＲによりＤＮＡ量の定量を行った。本発明者は、これまで誰もＨＨＶ−７ＤＮＡの測定にＱプローブ法ＰＣＲを用いたことが知られておらず、はじめて試験した結果、予想以上に本発明に適した測定方法であることを見出した。 The real-time PCR method can be used for measuring the amount of HHV-7 using the amount of the separated HHV-7 DNA as an index. The present inventors quantified the amount of DNA by real-time PCR using the Quenching Probe (Q probe) method. The present inventor has known that no one has ever used the Q probe method PCR for the measurement of HHV-7 DNA, and as a result of the first test, it has been found that the measurement method is more suitable for the present invention than expected. I found it.

Ｑプローブ法ＰＣＲでの検量線作成では、ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｕ４３４００として登録されたＨＨＶ−７ゲノム配列の８４，２０１〜８４，４００ｂｐ領域（全長：２００塩基）を人工的に合成し、配列番号１および配列番号２のベクターのユニバーサルプライマーでＰＣＲ増幅して、標準ＤＮＡが作製される。
（配列番号１フォワードプライマー；ＨＨＶ７＿Ｆｗ）：ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ（１８塩基）
（配列番号２リバースプライマー；ＨＨＶ７＿Ｒｖ）：ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ（１９塩基） In preparing a calibration curve by Q probe method PCR, GenBank accession no. An 84,201 to 84,400 bp region (full length: 200 bases) of the HHV-7 genomic sequence registered as U43400 was artificially synthesized, and PCR-amplified with the universal primers of the vectors of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, A standard DNA is prepared.
(SEQ ID NO: 1 forward primer; HHV7_Fw): GTAAAACGACGGGCCAGTG (18 bases)
(SEQ ID NO: 2 reverse primer; HHV7_Rv): GGAAACAGCTATGACCATG (19 bases)

唾液中のＨＨＶ−７のＤＮＡ量の算出は、採取した唾液量を唾液採取後のキット重量から、採取前のキット重量を差し引いて算出し、測定に用いて溶液中の唾液の割合を基に、唾液ｍｌ当たりのＤＮＡ量が算出される。 The amount of HHV-7 DNA in saliva was calculated by subtracting the kit weight before collection from the kit weight after collection of saliva, and using the ratio of saliva in the solution for measurement. The amount of DNA per ml of saliva is calculated.

ＨＨＶ−７量と自然免疫力レベルの関係については、自然免疫力レベルが低下している場合は、ＨＨＶ−７の再活性化を抑制する能力が低下していると考えられる。今回測定された各被験者のＤＮＡ量から判断すると５０，０００〜２５０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌはかなり自然免疫力レベルが低下していると考えられる。しかし、１名の急性感染症に罹患した被験者では、重篤な症状をきたした数日後では、約８００，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ近くにまでＤＮＡ量が急激に上昇しており、慢性疲労症候群患者で報告されている高値レベル相当と考えられる。つまり２５０，０００〜８００，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌでは、相当に特別に高い値と考えられ、自然免疫力レベルが非常に低下していると考えられる。１０，０００〜５０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌでは低値レベルであり、０〜１０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌでは、さらに低値レベルと考えられる。このようにＨＨＶ−７のＤＮＡ量が少ない場合は、本来の高い自然免疫力レベルが保たれていると考えられる。 Regarding the relationship between the amount of HHV-7 and the level of innate immunity, when the level of innate immunity is reduced, it is considered that the ability to suppress the reactivation of HHV-7 is reduced. Judging from the DNA amount of each subject measured this time, it is considered that the level of 50,000 to 250,000 copies / ml has considerably decreased the level of innate immunity. However, in one subject with an acute infection, the amount of DNA rapidly increased to about 800,000 copies / ml several days after the onset of severe symptoms, and was reported in patients with chronic fatigue syndrome. It is considered to be equivalent to the high level that has been set. That is, in the range of 250,000 to 800,000 copies / ml, the value is considered to be considerably high, and the level of the natural immunity is considered to be extremely reduced. At 10,000 to 50,000 copies / ml, the level is low, and at 0 to 10,000 copies / ml, the level is considered lower. Thus, when the HHV-7 DNA amount is small, it is considered that the original high innate immunity level is maintained.

本発明に至る一連の唾液中のＨＨＶ−７量の測定・評価のために実施したＱプローブ法ＰＣＲの詳細を記述する。
＜唾液サンプルの採取＞
スワブ存液（日鉄住金環境社製）７５０μｌを添加したスクリューキャップチューブ（１．５ｍｌ容量、イナ・オプティカ社製、Ｎｏ．Ｔ３３４−４）に、唾液を、ＳａｌｉｖａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＡｉｄ〈ＳＣＡ〉（ＳａｌｉｖａＢｉｏ社）を用いて、スワブ保存液とのトータル液量が大凡１，０００μｌとなるよう採取した。唾液採取量は、唾液採取前後におけるスワブ保存液入りチューブの重量を測定し、その差より求めた。
なお、採取した唾液サンプルは、ＤＮＡ抽出を実施するまでは、冷蔵ないし冷凍保存した。 The details of the Q probe method PCR performed for the measurement and evaluation of the amount of HHV-7 in saliva leading to the present invention will be described.
<Collection of saliva sample>
Saliva is placed in a screw cap tube (1.5 ml capacity, Ina Optica, No. T334-4) containing 750 μl of swab remaining liquid (manufactured by Nippon Steel & Sumikin Environment Co., Ltd.), and Saliva Collection Aid <SCA> (SalivaBio) ) Was collected using the swab preservation solution so that the total liquid volume was approximately 1,000 μl. The amount of saliva collected was determined from the difference between the weight of the tube containing the swab preservation solution before and after saliva collection.
The collected saliva samples were refrigerated or frozen until DNA extraction was performed.

＜ＤＮＡ抽出＞
唾液を採取したスワブ保存液含有スワブより、６００μｌのサンプルを採取し、これを対象としてＤＮＡ抽出を実施した。ＤＮＡ抽出は、日鉄住金環境社製のＥｘｔｒａｐＢｕｃｃａｌＳｗａｂＤＮＡＫｉｔ（商品コード：２１４−００１）を用いて、唾液を採取したスワブ保存液含有チューブにプロテナーゼＫを１００μｌ添加した。
次に、５５℃のヒートブロック（またはウォーターバス）で１０分間加温した。上清を６００μＬ採取し、１．５ｍｌチューブに移し、ＭＢｓＳｏｌｕｔｉｏｎ５０μｌ、ＢｉｎｄｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ４００μｌを添加した。
次にチューブを２分間程度転倒混和し、よく撹拌した。
チューブをマグネティックスタンドにセットして集磁したのち、マイクロピペットを使用して上清を除去した。
７０％エタノール溶液４００μｌを添加し、ボルテックスミキサー（低速）で十分に撹拌した。
マグネティックスタンドで集磁したのち、マイクロピペットを使用してエタノールを除去した。
再度７０％エタノール溶液４００μｌを添加し、ボルテックスミキサー（低速）で十分に撹拌し、マグネティックスタンドで集磁したのち、マイクロピペットを使用してエタノールを除去した。
チューブの蓋をあけたまま、室温で磁性粒子を１０分間程度風乾した。
次に溶出液（ＴＥバッファー、滅菌水等）１００μｌを添加後、ボルテックスミキサー（低速）で十分に撹拌した。
途中で数回攪拌しながら、６５℃のヒートブロック（またはウォーターバス）で５〜１０分間加温した。
マグネティックスタンドにチューブをセットして集磁したのち、溶出液を新しいチューブに移した。 <DNA extraction>
A 600 μl sample was collected from the swab containing the swab preservation solution from which saliva was collected, and DNA extraction was performed on the sample. For DNA extraction, 100 μl of proteinase K was added to a swab preservation solution-containing tube from which saliva was collected using Extra Buccal Swab DNA Kit (product code: 214-001) manufactured by Nippon Steel & Sumitomo Metal Environment Co., Ltd.
Next, the mixture was heated for 10 minutes in a 55 ° C. heat block (or water bath). 600 μL of the supernatant was collected, transferred to a 1.5 ml tube, and 50 μl of MBs Solution and 400 μl of Binding Solution were added.
Next, the tube was mixed by inversion for about 2 minutes and stirred well.
After the tube was set on a magnetic stand to collect magnetic flux, the supernatant was removed using a micropipette.
400 μl of a 70% ethanol solution was added, and the mixture was sufficiently stirred with a vortex mixer (low speed).
After magnetizing with a magnetic stand, ethanol was removed using a micropipette.
400 μl of a 70% ethanol solution was added again, and the mixture was sufficiently stirred with a vortex mixer (low speed). After magnetizing with a magnetic stand, ethanol was removed using a micropipette.
The magnetic particles were air-dried for about 10 minutes at room temperature with the tube lid open.
Next, 100 μl of an eluate (TE buffer, sterile water, etc.) was added, and the mixture was sufficiently stirred with a vortex mixer (low speed).
While stirring several times on the way, the mixture was heated in a heat block (or water bath) at 65 ° C for 5 to 10 minutes.
After the tube was set on a magnetic stand to collect magnetic flux, the eluate was transferred to a new tube.

＜ＨＨＶ−７検量線用標準ＤＮＡの作成＞
ＨＨＶ−７検量線用標準ＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｕ４３４００として登録されたＨＨＶ−７ゲノム配列の８４，２０１〜８４，４００ｂｐ領域（全長：２００塩基）を人工的に合成した。配列番号１および配列番号２のベクターのユニバーサルプライマーでＰＣＲ増幅して、標準ＤＮＡを作製した。
（配列番号１フォワードプライマー；ＨＨＶ７＿Ｆｗ）：ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ（１８塩基）
（配列番号２リバースプライマー；ＨＨＶ７＿Ｒｖ）：ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ（１９塩基）
上記ＰＣＲにて得られたＰＣＲ産物は、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて定量し、その定量結果より１０〜１０^６コピー／μｌとなるよう希釈したものを標準ＤＮＡとして用いた。 <Preparation of standard DNA for HHV-7 calibration curve>
The standard DNA for the HHV-7 calibration curve was obtained from GenBank accession no. An 84,201 to 84,400 bp region (total length: 200 bases) of the HHV-7 genomic sequence registered as U43400 was artificially synthesized. A standard DNA was prepared by PCR amplification using universal primers of the vectors of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
(SEQ ID NO: 1 forward primer; HHV7_Fw): GTAAAACGACGGGCCAGTG (18 bases)
(SEQ ID NO: 2 reverse primer; HHV7_Rv): GGAAACAGCTATGACCATG (19 bases)
PCR products obtained by the above PCR was used as the quantified using Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies) was diluted to its quantitative results from 10 to 10 ⁶ copies / [mu] l as the standard DNA .

＜ＨＨＶ−７定量＞
唾液中のＨＨＶ−７量の定量を目的に、ＱｕｅｎｃｈｉｎｇＰｒｏｂｅ（以下、ＱＰｒｏｂｅ）を用いたリアルタイムＰＣＲを実施した。唾液サンプルのＨＨＶ−７定量を実施する場合、ＰＣＲ反応溶液の全量は２０μｌとし、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴＩＴＡＮＩＵＭＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（×５０）（タカラバイオ（株）社製）を０．４μｌ／ＰＣＲチューブ、ＴＩＴＡＮＩＵＭＴａｑＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（×１０）（タカラバイオ（株）社製）を２μｌ／ＰＣＲチューブ、ＵｒａｃｉｌＤＮＡＧｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ロッシュ・ライフサイエンス社製）を０．２μｌ／ＰＣＲチューブ（最終濃度：０．０１ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＰＣＲヌクレオチドミックスＰＬＵＳ（ロッシュ・ライフサイエンス社製）を０．４μｌ／ＰＣＲチューブ（最終濃度０．２ｍＭ）、１０μＭフォワードプライマー（配列番号３）溶液を１．０μｌ／ＰＣＲチューブ（最終濃度０．５μＭ）、１０μＭリバースプライマー（配列番号４）溶液を０．３μｌ／ＰＣＲチューブ（最終濃度０．１５μＭ）、５’末端が蛍光色素、３’末端がリン酸基で標識されたＱＰｒｏｂｅ−ＧＰ（配列番号５、日鉄住金環境社製）の１０μＭ溶液を０．１μｌ／ＰＣＲチューブ（最終濃度０．０５μＭ）、ＰＣＲグレードウオーター（ロッシュ・ライフサイエンス社製）を１０．６μｌ／ＰＣＲチューブ、および鋳型ＤＮＡとして唾液サンプル由来抽出ＤＮＡを５μｌ／ＰＣＲチューブほど含むＰＣＲ反応溶液を調整後、リアルタイムＰＣＲによるＨＨＶ−７定量に供した。抽出ＤＮＡの原液を使用した際、ＰＣＲ阻害が確認された場合は、１０倍希釈した抽出ＤＮＡを５μｌ使用した。１０倍希釈は、抽出ＤＮＡを５μｌおよび０．２×ＴＥバファー４５μｌを採取し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブで混合することで実施をした。
標準ＤＮＡを用いて検量線作成をする場合のＰＣＲ反応溶液は、ＰＣＲグレードウオーターを１３．６μｌ／ＰＣＲチューブ、鋳型ＤＮＡとして標準ＤＮＡ溶液を２μｌとする以外は、唾液サンプルのＨＨＶ−７定量を実施する場合のＰＣＲ反応溶液と同様とした。 <HHV-7 determination>
For the purpose of quantifying the amount of HHV-7 in saliva, real-time PCR using Quenching Probe (hereinafter, QProbe) was performed. When performing HHV-7 quantification of a saliva sample, the total volume of the PCR reaction solution was 20 μl, and 0.4 μl of TITANIUM Taq DNA Polymerase (× 50) (manufactured by Takara Bio Inc.) as a DNA polymerase / PCR tube, TITANIUM Taq PCR Buffer (× 10) (manufactured by Takara Bio Inc.) 2 μl / PCR tube, Uracil DNA Glycosylase (manufactured by Roche Life Science) 0.2 μl / PCR tube (final concentration: 0.01 units / μl) 0.4 μl of PCR nucleotide mix PLUS (manufactured by Roche Life Science) / PCR tube (final concentration: 0.2 mM), 1.0 μl of 10 μM forward primer (SEQ ID NO: 3) solution / PCR tube (final concentration) 0.5 μM), 0.3 μl of 10 μM reverse primer (SEQ ID NO: 4) solution / PCR tube (final concentration: 0.15 μM), 5P-end fluorescent dye, 3′-end QProbe-GP labeled with a phosphate group ( 0.1 μl / PCR tube (final concentration: 0.05 μM) of a 10 μM solution of SEQ ID NO: 5, Nippon Steel & Sumitomo Metal Corporation, 10.6 μl / PCR tube of PCR grade water (Roche Life Science), and template After preparing a PCR reaction solution containing about 5 μl of a DNA extracted from a saliva sample / PCR tube as a DNA, the sample was subjected to HHV-7 quantification by real-time PCR. When PCR inhibition was confirmed when a stock solution of the extracted DNA was used, 5 μl of a 10-fold diluted extracted DNA was used. The 10-fold dilution was performed by collecting 5 μl of the extracted DNA and 45 μl of a 0.2 × TE buffer and mixing them in a 1.5 ml Eppendorf tube.
The HHV-7 quantification of saliva samples was performed, except that the PCR reaction solution used when preparing a calibration curve using standard DNA was 13.6 μl of PCR grade water / PCR tube and 2 μl of standard DNA solution as template DNA. The reaction was performed in the same manner as the PCR reaction solution.

検量線を作成する際は、１０コピー／μｌ、１０^２コピー／μｌ、１０^３コピー／μｌ、１０^４コピー／μｌ、１０^５コピー／μｌ、１０^６コピー／μｌの６つの希釈系列を調整後、各希釈系列の溶液を２μｌ／ＰＣＲチューブで添加したＰＣＲチューブを６本準備し、これらＰＣＲチューブを検量線作成に使用した。なお、量線は、分析を実施する都度作成をした。 When creating a calibration curve, 10 copies / [mu] l, 10 ² copies / [mu] l, 10 ³ copies / [mu] l, 10 ⁴ copies / [mu] l, 10 ⁵ copies / [mu] l, adjusted six dilution series of ¹⁰⁶ copies / [mu] l Six PCR tubes were prepared by adding the solution of each dilution series at 2 μl / PCR tube, and these PCR tubes were used for preparing a calibration curve. The dose curve was created each time the analysis was performed.

以下にプライマー、ＱＰｒｏｂｅの配列を示す。配列は、５’末端が左端となるよう表記されている。
（配列番号３フォワードプライマー；ＱＰｒｏｖｅ＿Ｆｗ）：ＣＣＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＧＴＴＧＧＴＧ（２６塩基）
（配列番号４リバースプライマー；ＱＰｒｏｖｅ＿Ｒｖ）：ＴＴＴＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＡＴＣＧ（２２塩基）
（配列番号５ＱＰｒｏｂｅ＿ＧＰ）：Ｆ−ＣＴＡＴＴＴＴＣＧＧＴＣＴＴＴＣＣＡＡＴＧＣＡＣＧＣＡ−Ｐ（２７塩基）
（Ｆは蛍光色素、Ｐはリン酸を示す） The sequences of the primer and QProbe are shown below. The sequence is shown with the 5 'end at the left end.
(SEQ ID NO: 3 forward primer; QProbe_Fw): CCCAACTATTTACAGTAGGGGTTGGGTG (26 bases)
(SEQ ID NO: 4 reverse primer; QProbe_Rv): TTTAGTTCCAGCACTGCAATCG (22 bases)
(SEQ ID NO: 5 QProbe_GP): F-CTATTTTCGGTCTTTCCAATGCACGCA-P (27 bases)
(F indicates a fluorescent dye, P indicates phosphoric acid)

上記反応溶液をリアルタイムＰＣＲ装置であるＲｏｔｏｒ−ＧｅｎｅＱ（キアゲン社）を用いて以下のＰＣＲ反応に供した。
（１）ホットスタート工程：９５℃、１２０秒間
（２）熱変性工程：９５℃、１５秒間
（３）アニーリング／伸長工程：６０℃、６０秒間
（１）の熱変性工程の後、工程（２）および（３）を５０サイクル繰り返した。 The above reaction solution was subjected to the following PCR reaction using a real-time PCR apparatus Rotor-Gene Q (Qiagen).
(1) Hot start step: 95 ° C., 120 seconds (2) Thermal denaturation step: 95 ° C., 15 seconds (3) Annealing / elongation step: 60 ° C., 60 seconds (1) After the heat denaturation step, step (2) ) And (3) were repeated 50 cycles.

蛍光測定は、（２）の熱変性工程後と（３）のアニーリング／伸長工程後に実施し、Ｒｏｔｏｒ−ＧｅｎｅＱ付属のソフトウエア上で、（３）の蛍光値を（２）の蛍光値でノーマライズをした後に（（３）の蛍光値を（２）の蛍光値にて割る計算をした後に）、ノーマライズした補正蛍光強度データを用い、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ解析モードにて検量線作成およびＨＨＶ−７の定量解析を実施した。
リアルタイムＰＣＲで得られた定量値を、最終的には唾液１ｍｌ中のＨＨＶ−７量に換算し、得られた換算定量値を結果の評価に用いた。 The fluorescence measurement was performed after the heat denaturation step (2) and the annealing / extension step (3), and the fluorescence value of (3) was converted to the fluorescence value of (2) on the software attached to Rotor-Gene Q. After normalization (after calculating the fluorescence value of (3) by the fluorescence value of (2)), use the normalized corrected fluorescence intensity data to create a calibration curve and quantify HHV-7 in the Quantitation analysis mode. Analysis was performed.
The quantitative value obtained by the real-time PCR was finally converted into the amount of HHV-7 in 1 ml of saliva, and the obtained converted quantitative value was used for evaluation of the result.

驚くべきことに、唾液を採取後直ちに保存液に入れたり、希釈倍率を１０倍以上にしたり、Ｑプローブ法ＰＣＲで考案工夫した結果、高感度で再現性良く定量出来た。上記Ｑプローブ法ＰＣＲで定量された結果から、本方法は従来実施されて報告されているリアルタイムＰＣＲに比べて、ＨＨＶ−７ＤＮＡを精度よく測定できていることが分かり、Ｑプローブ法ＰＣＲは、簡便で費用的にも安価であって、本発明のＤＮＡ量定量方法として最適であることが見出された。 Surprisingly, as a result of putting saliva into a preservation solution immediately after collection, increasing the dilution ratio to 10 times or more, and devising a Q probe method PCR, it was possible to quantify with high sensitivity and reproducibility. From the results quantified by the above-mentioned Q-probe PCR, it can be seen that the present method can measure HHV-7 DNA more accurately than real-time PCR that has been conventionally performed and reported. It has been found that the method is simple and inexpensive and is most suitable as the DNA amount quantification method of the present invention.

パン酵母ベータグルカンのカプセル製剤として、これまで市販実用化されている不溶性の原料を用いた製剤だけでなく、新たに水溶性の原料を不溶性の原料と配合した製剤も用いた。いずれも同様に唾液中のＨＨＶ−７量を低下させて自然免疫力レベルを高めることができた（ＮａｎｄｉｔａＢｏｓｅら、「ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＯｘｉｄａｔｉｖｅＢｕｒｓｔｂｙＤｉｓｔｉｎｃｔ β−Ｇｌｕｃａｎ−ＢｉｎｄｉｎｇＲｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄＳｉｇｎａｌｉｎｇＰａｔｈｗａｙｓｉｎＨｕｍａｎＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＢｌｏｏｄＭｏｎｏｎｕｃｌｅａｒＣｅｌｌｓ」、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１４年、第２４巻、ｐ．３７９−３９１）。 As a capsule preparation of baker's yeast beta-glucan, not only a preparation using an insoluble raw material that has been commercially practically used until now, but also a preparation in which a water-soluble raw material is newly mixed with an insoluble raw material was used. In all cases, the level of HHV-7 in saliva was similarly reduced, and the level of innate immunity was increased (Nandita Bose et al., "Differential Regulation of Oxidative Burst by Distinction β-Glucan-Responsoring Receptor Receptor Inspector Receptor Inspector Receptor Inspector Receptor Inspector Receptor Inspector Receptor Receptor Inspector Receptor Inspector Receptor Insulation). Blood Monocular Cells ", Glycobiology, 2014, 24, 379-391).

水溶性のパン酵母ベータグルカン原料は、好中球のレセプターに結合して活性化させるメカニズムが不溶性のパン酵母ベータグルカン原料とは異なることも報告されている。
不溶性のパン酵母ベータグルカンはマクロファージに一旦貪食されてから、より小さな水溶性の断片に消化されて放出された後、好中球のＣＲ３レセプターに吸着して好中球を活性化する。一方、水溶性のパン酵母ベータグルカンは小腸のパイエル板から体内に吸収された後、すぐに好中球に吸着できると考えられる。 It has also been reported that the water-soluble baker's yeast beta-glucan raw material has a different mechanism for binding and activating neutrophil receptors from the insoluble baker's yeast beta-glucan raw material.
The insoluble baker's yeast beta-glucan is once phagocytosed by macrophages, digested into smaller water-soluble fragments and released, and then adsorbs to neutrophil CR3 receptors to activate neutrophils. On the other hand, it is considered that water-soluble baker's yeast beta-glucan can be immediately adsorbed to neutrophils after being absorbed into the body from the Peyer's patch of the small intestine.

両者を配合することにより、小腸のパイエル板を経由して体内により早く吸収されて異なる作用機序での好中球の活性化も水溶性のパン酵母ベータグルカンにより付加されるのではないかと考えた。通常は、沈殿物を生じない飲料用に開発され、価格も高くなる原料を、わざわざ不溶性の原料に配合することは、容易に考案実施されるものではない。本発明者がパン酵母ベータグルカン自然免疫力レベルの改善を、効果がより迅速で、かつ持続性もあるようにと工夫して考案した結果の発明である。言われてみれば簡単な発想のようであるが、これまで誰もこのようなパン酵母ベータグルカンの配合製品を考案しなかった。本発明者の臨床試験結果で、本発明配合物を含む製品が、唾液中のＨＨＶ−７量を指標とする免疫力レベルを高める効果があることが確認されたのである。 By combining both, it is thought that neutrophil activation by a different mechanism of action is quickly absorbed by the body via the Peyer's patch of the small intestine and added by water-soluble baker's yeast beta-glucan. Was. Normally, it is not easy to conceive and mix a raw material which is developed for a beverage which does not produce a precipitate and which is expensive, with the intention of mixing it with an insoluble raw material. This is the invention as a result of the present inventors devising an improvement in baker's yeast beta-glucan natural immunity level by devising the effect to be faster and more durable. It sounds like a simple idea, but no one has ever devised such a baker's yeast beta-glucan combination. From the results of clinical tests by the present inventors, it was confirmed that a product containing the compound of the present invention had an effect of increasing the level of immunity based on the amount of HHV-7 in saliva as an index.

本発明により、これまで全身的な自然免疫力レベルの低下を判定することが難しかったが、簡便に測定して判定する方法が確立された訳である。唾液中のＨＨＶ−７のウイルス量が多ければ各個人の免疫力が低下した状態であり、少なければ免疫力が高い状態にあると判断される。自然免疫力レベルを高める効果があるパン酵母ベータグルカンを摂取することにより各個人の免疫力レベルが向上し、結果的に唾液中のＨＨＶ−７のウイルス量が少なって、体の抵抗力が高い状態を保持し、がんの発症や感染症に罹る危険性が小さくなり、快適な健康の維持がなされると思われる。 According to the present invention, it has been difficult to determine a decrease in systemic innate immunity level until now, but a method for simply measuring and determining the reduction has been established. If the amount of HHV-7 virus in saliva is large, it is determined that the immunity of each individual is reduced, and if the amount is small, it is determined that the immunity is high. The ingestion of baker's yeast beta-glucan, which has the effect of increasing the level of innate immunity, improves the level of immunity of each individual, and consequently reduces the amount of HHV-7 virus in saliva, thereby reducing the body's resistance. It is likely to remain elevated, reduce the risk of developing cancer and infectious diseases, and maintain comfortable health.

インフルエンザウイルス感染など血中ウイルス量が多くなるウイルス血症の場合は、活性化された好中球細胞がウイルスを攻撃して速やかに殺してしまうので、ウイルスの血中濃度に相関して反応するインターフェロン反応に起因する発熱は、ウイルスが少なくなると速やかに平熱にもどる。ＨＨＶ−７は、唾液腺上皮細胞中に潜伏感染しており、免疫力のレベルの低下に応じて再活性化が起こり、ウイルス産生が生じるので、血中の好中球の貪食能を高めても直接的に唾液中のウイルスを攻撃してウイルス量を少なくするわけではなく、全身的な自然免疫の強化により唾液腺上皮細胞でのウイルスの再活性化を抑制して行くものと考えられる。 In the case of viremia in which the amount of virus in the blood increases, such as influenza virus infection, activated neutrophil cells attack the virus and kill it quickly, so it responds in correlation with the virus blood concentration The fever caused by the interferon reaction returns to normal fever as soon as the virus is reduced. Since HHV-7 is latently infected in salivary gland epithelial cells, reactivation occurs in response to a decrease in the level of immunity, and virus production occurs, thus increasing the phagocytic ability of neutrophils in the blood. It is thought that virus reactivation in salivary gland epithelial cells is suppressed by systemic enhancement of innate immunity rather than directly attacking virus in saliva to reduce the amount of virus.

つまり、唾液中のＨＨＶ−７量は、自然免疫力レベルの低下により増大し、反対に自然免疫力レベルが高くなると少なくなると考えられる。唾液中のＨＨＶ−７が多く、自然免疫力レベルが大幅に低下している人では、パン酵母ベータグルカンを摂取することによりＨＨＶ−７の産生量は、一旦減少後再度増加した後、また減少することを繰り返しながら、自然免疫力レベルが向上するのに応じて次第に減少してゆくのである。 That is, it is considered that the amount of HHV-7 in saliva increases due to a decrease in the level of innate immunity, and conversely decreases as the level of innate immunity increases. In a person who has a large amount of HHV-7 in saliva and whose innate immunity level is significantly reduced, the amount of HHV-7 produced by ingesting baker's yeast beta-glucan once decreased, increased again, and decreased again. As it repeats, it gradually decreases as the level of innate immunity increases.

もともと免疫レベルが高い人が、感染症に罹患したりして体力が消耗し、自然免疫力レベルが低下して一時的にＨＨＶ−７の再活性化が起こってＨＨＶ−７の量が増えていたような場合には、パン酵母ベータグルカンの摂取で自然免疫力が強化され、結果的にＨＨＶ−７の再活性化による産生が抑制されて唾液中のＨＨＶ−７量が次第に低下すると考えられる。 Naturally, people with high levels of immunity suffer from infectious diseases and deplete their stamina, the level of natural immunity decreases, and the reactivation of HHV-7 occurs temporarily, resulting in an increase in the amount of HHV-7. In such cases, ingestion of baker's yeast beta-glucan enhances innate immunity, and as a result, production by reactivation of HHV-7 is suppressed, and the amount of HHV-7 in saliva is thought to gradually decrease. .

本発明者は、パン酵母ベータグルカンとして従来一般に用いられている不溶性の原料だけでなく、新たに水溶性の原料を混合させて製造したカプセル製剤を使っての試験も行った。体内に取り込まれた後の作用機序が異なるパン酵母ベータグルカン原料の混合組み合わせ使用は、本発明者により初めて実施された発明である。本組み合わせからなる製品は、低下した免疫力レベルの向上改善に役立つことが確認された。不溶性の原料と水溶性の原料の配合割合は、特に限定するものではないが、５：１〜１：５の間で適宜配合できる。 The present inventor also conducted tests using a capsule preparation prepared by mixing a water-soluble raw material as well as an insoluble raw material conventionally generally used as baker's yeast beta-glucan. The use of a mixed combination of baker's yeast beta-glucan raw materials having different mechanisms of action after being taken into the body is an invention first implemented by the present inventors. It was confirmed that the product comprising this combination is useful for improving and improving the reduced immunity level. The mixing ratio of the insoluble raw material and the water-soluble raw material is not particularly limited, but can be appropriately mixed between 5: 1 and 1: 5.

本発明により、唾液中のＨＨＶ−７量を指標とする自然免疫力レベルの改善用パン酵母ベータグルカン含有製品の有用性が確認されたのである。パン酵母ベータグルカンとしては、多くの粒子径が２〜４μｍとなるように加工された不溶性のパン酵母ベータグルカンや、さらに同不溶性の原料をさらに加工して得られる水溶性のパン酵母ベータグルカンとの配合物が好ましく用いられる。 According to the present invention, the usefulness of a baker's yeast beta-glucan-containing product for improving the level of natural immunity using the HHV-7 level in saliva as an index has been confirmed. As baker's yeast beta-glucan, insoluble baker's yeast beta-glucan processed so that many particle diameters become 2 to 4 µm, and water-soluble baker's yeast beta-glucan obtained by further processing the same insoluble raw material, Are preferably used.

以下に、実際に行った臨床試験の実施例について記述する。 Hereinafter, examples of the clinical tests actually performed will be described.

日常健康で社会生活を行っているボランティア１０人を対象に唾液中のＨＨＶ−７量をＤＮＡ測定により行った。男性７人、女性３人、平均年齢；４８．２±１４．９９才、平均体重；６５．６±１０．７３ｋｇであった。既往歴では、高血圧、糖尿病、花粉症、アレルギー性鼻炎があった。唾液の採取は、原則パン酵母ベータグルカンのカプセル製剤を連日摂取開始する当日または前日に実施した。
先に記載した方法で、リアルタイムＰＣＲ法で得られた唾液中のＨＨＶ−７のＤＮＡ量（単位：ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）は、前述の表１の通りであった。 The amount of HHV-7 in saliva was measured by DNA measurement for 10 volunteers who were living in a social life with daily health. Seven men, three women, average age: 48.2 ± 14.99 years, average weight: 65.6 ± 10.73 kg. History included hypertension, diabetes, hay fever, and allergic rhinitis. Saliva was collected on the day or the day before the start of daily intake of baker's yeast beta-glucan capsule formulation in principle.
The amount of HHV-7 DNA in saliva (unit: copies / ml) obtained by real-time PCR by the method described above was as shown in Table 1 above.

１０症例中無作為に群別した５症例に、パン酵母ベータグルカンの不溶性タイプの原料（ＷｅｌｌｍｕｎｅＷＧＰ３００５）を１２５ｍｇ含むカプセル製剤（フィンガルリンク社製「フエルミューン」）を１日１カプセル、毎日４週間摂取してもらった。１週間後（１週目）、２週間後（２週目）、４週間後（４週目）、５週間後（５週目）、６週間後（６週目）に唾液サンプルを摂取開始前（０週目）と同じように採取し、唾液中のＨＨＶ−７のＤＮＡ量を測定した。さらに１例は８週間後（８週目）にも唾液サンプルを採取してＨＨＶ−７のＤＮＡ量を測定した。
測定結果は、表２の通りである。 Five cases randomly grouped out of the ten cases were ingested with a capsule preparation ("Fermune" manufactured by Fingal Link) containing 125 mg of an insoluble type ingredient (Wellmune WGP3005) of baker's yeast beta-glucan once a day for 4 weeks every day. I was asked to. One week (1 week), 2 weeks (2 weeks), 4 weeks (4 weeks), 5 weeks (5 weeks), and 6 weeks (6 weeks), ingestion of saliva sample Samples were collected as before (week 0) and the amount of HHV-7 DNA in saliva was measured. In one case, a saliva sample was collected after 8 weeks (8th week) to measure the amount of HHV-7 DNA.
The measurement results are as shown in Table 2.

別の５症例に対しては、パン酵母ベータグルカンの不溶性タイプの原料（ＷｅｌｌｍｕｎｅＷＧＰＦ３００５）と水溶性の原料（ＷｅｌｌｍｕｎｅＷＧＰＦ３０２０）との２：１の割合での含有物を１２５ｍｇ含むカプセル製剤を１日１カプセル、毎日４週間摂取してもらった。１週間後（１週目）、２週間後（２週目）、４週間後（４週目）、５週間後（５週目）、６週間後（６週目）に唾液サンプルを原則午前中の空腹時に採取し、唾液中のＨＨＶ−７のＤＮＡ量を測定した。さらに２例は８週間後（８週目）にも唾液サンプルを採取してＨＨＶ−７のＤＮＡ量を測定した。
測定結果は、表３の通りである。 For another 5 cases, a capsule formulation containing 125 mg of a 2: 1 ratio of the ingredients of the insoluble type of baker's yeast beta-glucan (Wellmune WGP F3005) and the water-soluble ingredient (Wellmune WGP F3020) was used. They had one capsule daily for four weeks. After 1 week (1 week), 2 weeks (2 weeks), 4 weeks (4 weeks), 5 weeks (5 weeks), and 6 weeks (6 weeks) It was collected on an empty stomach and the amount of HHV-7 DNA in saliva was measured. In two cases, saliva samples were also collected after 8 weeks (8th week), and the HHV-7 DNA content was measured.
Table 3 shows the measurement results.

この途中で重篤な急性腸炎に罹患した１症例を除く９症例で、０週目と６週目の値と対比して表４に示した。９例について０日目と６週目とのＨＨＶ−７ＤＮＡの定量値を対比して統計処理した。平均±ＳＤは、８７，４０８±９１２４２と２５，３４３±４５，３４４であり、Ｔ検定でのＰ＝０．０３８２３６であった。有意に６週目のＨＨＶ−７のＤＮＡ量が減少していた。
上記の急性腸炎に罹患してしまった１例を除き、全ての症例でパン酵母ベータグルカンを１日１カプセル（１２５ｍｇ含有）４週間摂取した結果、摂取前の唾液中のＨＨＶ−７のＤＮＡ量よりも６週目では、少ない値になっていた。内３例は０となり、残り５例では、０日目と比べ、５．４％、３２．５％、４９．１％、５２．５％、６１．２％、６１．６％であった。
つまり、パン酵母ベータグルカンを４週間連日投与した効果を６週目で判定すると、ＨＨＶ−７のＤＮＡ量は、平均２６．４％まで低下していた。０まで低下する症例もあれば、６１〜６２％までしか低下していない症例もあり、効果の程度には個体差があった。 The results are shown in Table 4 in comparison with the values at the 0th week and the 6th week in nine cases except one case suffering from severe acute enteritis during the course. Nine subjects were statistically processed by comparing the quantified values of HHV-7 DNA between day 0 and week 6. Mean ± SD was 87,408 ± 91242 and 25,343 ± 45,344, and P = 0.038236 in T test. The amount of HHV-7 DNA at week 6 was significantly reduced.
Except for one case suffering from the above-mentioned acute enteritis, in all cases, the ingestion of baker's yeast beta-glucan 1 capsule (containing 125 mg) a day for 4 weeks resulted in the DNA amount of HHV-7 in saliva before ingestion. At week 6, it was lower. Three cases were 0, and the remaining 5 cases were 5.4%, 32.5%, 49.1%, 52.5%, 61.2%, and 61.6% compared to day 0. .
In other words, when the effect of daily administration of baker's yeast beta-glucan for 4 weeks was determined at week 6, the HHV-7 DNA amount was reduced to an average of 26.4%. In some cases, it decreased to 0, in other cases it decreased only to 61-62%, and there were individual differences in the degree of effect.

本発明は、医療業、製薬業、健康食品産業、健康機器産業など免疫にかかわる広範な分野で利用が可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used in a wide range of fields related to immunity such as the medical industry, the pharmaceutical industry, the health food industry, and the health device industry.

Claims

A method for evaluating the innate immunity level of a subject using the amount of human herpes virus 7 in saliva as an index ,
The amount of the human herpesvirus 7 in the saliva was determined by separating the DNA of the human herpesvirus 7 from the saliva, measuring the amount of the DNA by a real-time PCR method, and determining a certain amount based on the obtained result. Calculate the amount of human herpes virus 7 contained per saliva and use it as an index,
The real-time PCR method is a Q probe method PCR,
The natural immunity level of the subject was determined by comparing the amount of human herpesvirus 7 in the saliva.
Normal to high levels at 0 to 10,000 copies / ml,
In the case of 10,000 to 50,000 copies / ml, the level is slightly lower.
Low level at 50,000-250,000 copies / ml,
An innate immunity level evaluation method characterized in that the level is extremely low when the concentration is 250,000 to 800,000 copies / ml .

As baker's yeast beta-glucan, an insoluble beta-glucan processed to include particles having a particle size of 2 to 4 μm by a particle size adjusting operation in an extraction step from baker's yeast, and the insoluble beta-glucan, Containing water-soluble beta-glucan obtained by processing,
The mass ratio of the insoluble beta-glucan and the water-soluble beta-glucan is in the range of 5: 1 to 1: 5,
The innate immunity level evaluation method according to claim 1 , wherein the innate immunity level is a slightly low level, low level, or a subject evaluated as very low level , the natural immunity level , A product containing baker's yeast beta-glucan, which is ingested for improvement.