JP6665740B2 - ペプチド解析方法、ペプチド解析装置、及びペプチド解析用プログラム - Google Patents

Description

本発明は、液体クロマトグラフ質量分析装置を用いてペプチドを構成するアミノ酸の異性化を解析するペプチド解析方法、ペプチド解析装置、及びペプチド解析用プログラムに関する。

タンパク質は老化によりその一部のアミノ酸がＬ体からＤ体に変化することが知られており、このような現象が白内障やアルツハイマー症等の老年期に多く見られる各種疾病の要因となる可能性が指摘されている。このようなことから、タンパク質やペプチドの構造解析は、生命科学や医療、医薬品開発等、様々な分野において非常に重要になっている。こうした解析のために質量分析は非常に威力を発揮しており、質量分析を利用したタンパク質やペプチドの様々な分析手法が研究・開発されている。

質量分析を利用して、一部のアミノ酸が異性化したタンパク質の構造解析を行う際には、多くの場合、クロマトグラフ質量分析装置を用いて、タンパク質を断片化して得られるペプチドに対する質量分析が行われる。この際、Ｄ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸を特異的に加水分解する酵素を用いてターゲットとなるペプチドを分解し、得られた分解物をクロマトグラフにより分離しながら質量分析することにより、目的とするペプチドが分解されたかどうかを確認する。

非特許文献１には、液体クロマトグラフ−エレクトロスプレーイオン化イオントラップ型質量分析装置を用いて、一部のアミノ酸が異性化したペプチド（以下、異性化ペプチドという。）を検出する手法が報告されている。

この手法では、イオントラップ型質量分析装置を用いて異性化ペプチドを含む可能性がある試料のＭＳ／ＭＳスペクトル（ＭＳ^２スペクトル）を取得し、このスペクトルをデータベースに収録されているＭＳ／ＭＳスペクトルの情報と照合する、もしくはペプチド配列を推測するソフトウエアなどでそのスペクトルの配列情報を得ることで目的とするペプチドの同定を行う。次に、同定されたペプチドのクロマトグラム（ＭＳクロマトグラム）を作成し、このＭＳクロマトグラムに現れるピークが１本の場合は異性化ペプチドが検出されなかったと判断し、ピークが複数本の場合は異性化ペプチドが存在する可能性があると判断する。このように判断することができる理由は、異性化ペプチドと異性化していないペプチドとはカラムによる保持挙動が異なるため、クロマトグラフによって別々に検出することができるからである。

異性化ペプチドが存在する可能性があると判断された場合、ＭＳクロマトグラムの複数本のピークのそれぞれに対応するＭＳ／ＭＳスペクトルの一致度を確認し、一致している場合は異性化ペプチドの存在を検証するための追加実験の対象とし、一致していない場合は異性化ペプチドが存在しないと判断する。すなわち、非異性化ペプチドのプロダクトイオンと異性化ペプチドのプロダクトイオンにはアミノ酸配列が同じものが含まれることから、ＭＳクロマトグラム中の複数本のピークが異性化ペプチドの存在を示す場合は、これらピークに対応する各ＭＳ／ＭＳスペクトルからアミノ酸配列が同じプロダクトイオンが検出され、ＭＳ／ＭＳスペクトルの形状が一致することになる。

Fujii N, Sakaue H, Sasaki H, and Fujii N., J Biol Chem., 287; 39992-40002, 2012 Maeda H, Takata T, Fujii N, Sakaue H, Nirasawa S, Takahashi S, Sasaki H. and Fujii N., Anal. Chem., 87; 561-568, 2015

ＭＳ／ＭＳスペクトルが一致した場合の追加検証実験の方法としては、例えば標準ペプチドに異性体のアミノ酸を導入したもの（異性化標準ペプチド）を合成し、該異性化標準ペプチドのＭＳクロマトグラムに現れるピークの保持時間と、試料中に含まれる異性化ペプチドの候補となるペプチドのピークの保持時間の一致・不一致を確認する方法（非特許文献１）、Ｄ−Ａｓｐ残基に特異的に作用するペプチダーゼを用いて試料中のペプチドを加水分解し、その分解物をＬＣ／ＭＳを用いて確認する方法（非特許文献２）が、それぞれ報告されている。しかし、前者の方法では異性化標準ペプチドを合成する工程を経なければならず、後者の方法では酵素反応という工程を経なければならない。いずれの工程も作業が煩雑で面倒である。また、酵素を用いる場合は、該当する酵素がなければ追加検証実験を行うことができないという問題もある。

本発明が解決しようとする課題は、煩雑な作業を行うことなく、異性化ペプチドの存在を確認することができる、ペプチド解析方法、ペプチド解析装置、及びペプチド解析用プログラムを提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明は、ＭＳ／ＭＳ測定が可能なクロマトグラフ質量分析装置を用いて、タンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸の異性化を解析するためのペプチド解析方法であって、
a) 解析目的であるタンパク質又はペプチドを含む試料をクロマトグラフによって時間的に分離する工程と、
b) 該分離された試料に含まれるタンパク質又はペプチドがイオン化して生じるプリカーサイオン、該プリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して形成される複数種のフラグメントイオンに応じた複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定を実行する測定実行工程と、
c) 前記ＭＲＭ測定により得られたデータに基づき、前記複数のＭＲＭトランジションの各値におけるクロマトグラムを作成する工程と、
d) 前記複数のクロマトグラムの各々についてピークを検出するピーク検出工程と、
e) 前記複数のクロマトグラムの各々に複数のピークが検出された場合であって、前記複数のクロマトグラムに共通に、複数のピークがそれぞれ同一保持時間に存在するか否かを判定することにより、前記解析目的であるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸が異性化しているか否かを判断する工程
とを備えることを特徴とする。

また、上記課題を解決するために成された本発明に係るペプチド解析装置は、上記本発明に係るペプチド解析方法を実現するための装置であり、ＭＳ／ＭＳ測定が可能なクロマトグラフ質量分析装置を含み、タンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸の異性化を解析するためのペプチド解析装置であって、
a) 解析目的であるタンパク質又はペプチドを含む試料をクロマトグラフによって時間的に分離し、その分離された試料に含まれるタンパク質又はペプチドがイオン化して生じるプリカーサイオン、該プリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して形成される複数種のフラグメントイオンに応じた複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定を実行するように前記クロマトグラフ質量分析装置を動作させる分析制御部と、
b) 前記ＭＲＭ測定により得られたデータに基づき、前記複数のＭＲＭトランジションの各値におけるクロマトグラムを作成するクロマトグラム作成部と、
c) 前記複数のクロマトグラムの各々についてピークを検出するピーク検出部と、
d) 前記複数のクロマトグラムの各々に複数のピークが検出された場合であって、前記複数のクロマトグラムに共通に、複数のピークがそれぞれ同一保持時間に存在するか否かを判定することにより、前記解析目的であるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸が異性化しているか否かを判断する異性化判断部
とを備えることを特徴とする。

さらに、上記課題を解決するために成された本発明に係るペプチド解析用プログラムは、上記本発明に係るペプチド解析方法を実現するためのコンピュータ用プログラムであり、タンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸の異性化を解析するために、ＭＳ／ＭＳ測定が可能なクロマトグラフ質量分析装置の動作を制御するとともに該装置で得られたデータを処理する、コンピュータ上で動作するプログラムであって、
a) 解析目的であるタンパク質又はペプチドを含む試料をクロマトグラフによって時間的に分離し、その分離された試料に含まれるタンパク質又はペプチドがイオン化して生じるプリカーサイオン、該プリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して形成される複数種のフラグメントイオンに応じた複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定を実行するように前記クロマトグラフ質量分析装置を動作させる分析制御機能部と、
b) 前記ＭＲＭ測定により得られたデータに基づき、前記複数のＭＲＭトランジションの各値におけるクロマトグラムを作成し、前記複数のクロマトグラムの各々に複数のピークが検出された場合において、前記複数のクロマトグラムに共通に、複数のピークがそれぞれ同一保持時間に存在するか否かを判定することにより、前記解析目的であるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸が異性化しているか否かを判断する異性化判断機能部
とを備えることを特徴とする。

本発明では、ＭＳ／ＭＳ測定が可能なクロマトグラフ質量分析装置を構成するクロマトグラフとしては、例えばガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ、キャピラリ電気泳動などがあり、質量分析装置としては、タンデム四重極型質量分析装置（三連四重極型質量分析装置とも呼ばれる）、四重極飛行時間型質量分析装置（ＱＴＯＦ）、イオントラップ型質量分析装置、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析装置などがあり、それらを組み合わせた装置を用いることができる。

本発明において、一部のアミノ酸が異性化したペプチドとは、ペプチドを構成する複数のアミノ酸のうちの１個ないし複数がＬ体からＤ体に変化したペプチド、あるいはその逆の変化が生じたペプチド、又は、αアミノ酸からβアミノ酸に変化したペプチド、βアミノ酸がαアミノ酸に変化したペプチド等をいう。また、一部のアミノ酸がＬ体のαアミノ酸からＤ体のβアミノ酸に変化したペプチド等、光学異性化、立体異性化が生じたペプチドも一部のアミノ酸が異性化したペプチドに含まれる。一部のアミノ酸が異性化したタンパク質も同様である。

本発明では、タンパク質試料をトリプシンなどのタンパク質消化酵素によりペプチド断片化した試料をクロマトグラフで分離し、質量分析装置に導入する。ただし、分子量が比較的小さいタンパク質については、消化酵素を用いずに分析することも可能である。以下では、タンパク質をペプチド断片化した試料を用いる場合について説明するが、タンパク質をそのまま試料として用いる場合も同様のことが言える。

試料中のペプチドは複数のアミノ酸がペプチド結合した構成を有しており、液体クロマトグラフ質量分析装置で用いられる一般的なイオン化法であるエレクトロスプレーイオン化により、イオンが生成される。従って、異性化が生じていることが予想されるアミノ酸を含むイオンがプリカーサイオンとなり、さらに、このプリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して生じたイオンがフラグメントイオンとなるように、ＭＲＭトランジションを設定する。つまり、フラグメントイオンを構成するアミノ酸の開裂場所の違いに応じた複数のＭＲＭトランジションが設定される。なお、「異なる箇所でアミノ酸が開裂する」とは、「異なるアミノ酸が開裂する」こと、「あるアミノ酸が異なる箇所で開裂する」こと、の両方を含む。このようにして設定された複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ（多重反応イオンモニタリング）測定を実施すると、フラグメントイオンのアミノ酸の数に応じたＭＲＭトランジションにおいて、それぞれ元のペプチド由来のイオンが検出される。

着目するアミノ酸に異性化が生じている場合、あるＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定で得られるクロマトグラムと、別のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定で得られるクロマトグラムには、いずれも非異性化ペプチドと異性化ペプチド（これらを合わせて「ペプチドの異性体」又は「異性体ペプチド」ともいう）の数に応じた複数のピークが現れ、しかも、これら複数のピークは、複数のクロマトグラムに共通に、それぞれ同一保持時間に現れる。一方、各クロマトグラフに現れる複数のピークの強度はプリカーサイオンからフラグメントイオンが生成されるときに開裂した箇所（つまり、それぞれのＭＲＭトランジション）に応じた値となる。従って、複数のＭＲＭトランジションにおけるクロマトグラムを作成し、各クロマトグラムに複数のピークが観測され、これら複数のピークが、複数のクロマトグラムに共通に、それぞれ同一保持時間に存在する場合には、着目するアミノ酸に異性化が生じていると判断することができる。このとき、複数のクロマトグラムにおいて同一保持時間に観察される各ピークの強度は異なることになる。

この場合、複数のＭＲＭトランジションを測定条件とするＭＲＭ測定でそれぞれ得られたクロマトグラムを同一座標軸上に重ねて表示するようにすれば、各クロマトグラムのピークが同一保持時間に現れていること、及び、それらピークの強度が異なっていることが一目瞭然となるため、好ましい。

また、ペプチド鎖の中のアミノ酸異性体は、ペプチドバックボーンに対する側鎖カルボキシル基の相対位置が異なる。これは、各アミノ酸に不斉炭素が含まれているため、アミノ酸異性体がジアステレオマーの関係になるためである。ジアステレオマーは一般的には、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラムなど逆相カラムを用いた液体クロマトグラフで分離することが可能である。さらにまた、アミノ酸の異性体によって、ペプチドバックボーンを構成する炭素数が異なる場合がある。例えば、図８は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）の異性体であるＤα−Ａｓｐ、Ｌα−Ａｓｐ、Ｄβ−Ａｓｐ、Ｌβ−Ａｓｐのペプチドバックボーン（長方形又はＶ字形状の網掛け部分）と側鎖カルボキシル基（楕円の網掛け部分）を示している。この図に示すように、β−Ａｓｐ（Ｄβ−Ａｓｐ、Ｌβ−Ａｓｐ）は、ペプチドバックボーンを構成する炭素数がα−Ａｓｐ（Ｄα−Ａｓｐ、Ｌα−Ａｓｐ）よりも１個多い。これらも逆相の液体クロマトグラフで分離することが可能である。

図９は、現在提唱されている、ペプチドのイオン化の際にＡｓｐの側鎖を介して開裂するメカニズムを示している。図８及び図９から分かるように、着目するアミノ酸がＡｓｐであって、該Ａｓｐを含むプリカーサイオンがＡｓｐの側鎖を介した開裂によってフラグメントイオンが生成される場合には、フラグメントイオンを構成するアミノ酸の数が同じであってもフラグメントイオンの開裂のためのエネルギー値が異なるため、異性体間でイオン化する際のピーク強度が異なると考えられる。

以上より、複数のクロマトグラムにおいて、それぞれ同一保持時間に存在するピークの強度比を比較することにより、異性化しているアミノ酸が存在する部位を推定することが可能である。

本発明に係るペプチド解析方法、ペプチド解析装置、及びペプチド解析用プログラムによれば、煩雑な作業を行うことなく、タンパク質又はペプチドを構成するアミノ酸の一部において異性化が生じている否かを確認することができる、

本発明に係るペプチド解析方法を実施するペプチド解析装置の一実施例の概略構成図。 本実施例のペプチド解析装置におけるペプチド解析処理の手順を示すフローチャート。 ４種類の異性体ペプチドを含む試料の実測ＭＲＭクロマトグラムを示す図。 図３に示す領域Ａの拡大図。 ４種類の異性体ペプチドを含む試料のＳＩＭクロマトグラムを示す図。 図３に示すＭＲＭクロマトグラムの各ピークにおける相対強度を示す図。 第２フラグメントイオンを構成するアミノ酸配列を示す図。 アスパラギン酸の異性体のピーク強度の関係を示す図。 アスパラギン酸の側鎖を介した開裂メカニズムの説明図。

本発明に係るペプチド解析方法の一実施例について、添付図面を参照して説明する。図１は、本実施例に係るペプチド解析方法を実施するペプチド解析装置の概略構成図である。
図１に示すように、ペプチド解析装置は、液体クロマトグラフ部（ＬＣ部）１０と質量分析部（ＭＳ／ＭＳ部）２０とを含む液体クロマトグラフ質量分析システム（「ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム」という）である。

ＬＣ部１０は、移動相が貯留された移動相容器１１と、移動相を吸引して一定流量で送給するポンプ１２と、移動相中に予め用意された所定量の試料を注入するインジェクタ１３と、試料に含まれる各種化合物を時間方向に分離するカラム１４と、を含む。なお、ＬＣ部１０が複数の移動相の組成を連続的に変化させながら試料に含まれる化合物を分離する、いわゆるグラジエント分離を行う場合は、移動相容器１１及びポンプ１２はそれぞれ２個以上設けられる。

ＭＳ／ＭＳ部２０は、タンデム四重極型質量分析装置から成り、大気圧であるイオン化室２１と図示しない高性能の真空ポンプにより真空排気される高真空の分析室２４との間に、段階的に真空度が高められた第１、第２中間真空室２２、２３を備えた多段差動排気系の構成である。イオン化室２１には、試料溶液に電荷を付与しながら噴霧するエレクトロスプレーイオン化用プローブ２５が設置され、イオン化室２１と次段の第１中間真空室２２との間は細径の加熱キャピラリ２６を通して連通している。第１中間真空室２２と第２中間真空室２３との間は頂部に小孔を有するスキマー２８で隔てられ、第１中間真空室２２と第２中間真空室２３にはそれぞれ、イオンを収束させつつ後段へ輸送するためのイオンガイド２７、２９が設置されている。分析室２４には、多重極イオンガイド３２が内部に設置されたコリジョンセル３１を挟み、イオンを質量電荷比に応じて分離する前段四重極マスフィルタ３０と、同じくイオンを質量電荷比に応じて分離する後段四重極マスフィルタ３３、さらにはイオン検出器３４が設置されている。ＣＩＤガス供給部３５はコリジョンセル３１の内部にアルゴン、窒素などのＣＩＤガスを供給するものである。また電源部３６は、エレクトロスプレイイオン化用プローブ２５、イオンガイド２７、２９、３２、四重極マスフィルタ３０、３３などにそれぞれ所定の電圧を印加する。

データ処理部４０は、機能ブロックとして、データ収集部４１、データ記憶部４２、グラフ作成部４３、定量分析部４４等を備える。入力部５２や表示部５３が付設された制御部５０は、液体クロマトグラフ部１０のポンプ１２やインジェクタ１３、質量分析装置２０の電源部３６やＣＩＤガス供給部３５などの各部の動作をそれぞれ制御する。なお、制御部５０及びデータ処理部４０の機能の少なくとも一部は、パーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該コンピュータに予めインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアをコンピュータ上で実行することにより実現することができる。

本実施例のＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムにおける基本的なＭＳ／ＭＳ測定動作は次の通りである。
まず、ポンプ１２は移動相容器１１から移動相を吸引して一定流量で以てカラム１４に送給する。インジェクタ１３から一定量の試料液が移動相中に導入されると、移動相の流れに乗って試料はカラム１４に導入され、カラム１４を通過する間に試料中の各種化合物は時間方向に分離されてカラム１４出口から溶出し、ＭＳ／ＭＳ部２に導入される。

ＭＳ／ＭＳ部２０において、エレクトロスプレイイオン化用プローブ２５にカラム１４からの溶出液が到達すると、該プローブ２５の先端において電荷が付与されながら溶出液が噴霧される。噴霧により形成された帯電液滴は付与された電荷による静電気力の作用によって分裂しながら微細化され、その過程で溶媒は気化し化合物由来のイオンが飛び出す。

こうして生成されたイオンは加熱キャピラリ２６を通して第１中間真空室２２に送られ、イオンガイド２７で収束されてスキマー２８頂部の小孔を経て第２中間真空室２３に送られる。そして、化合物由来のイオンはイオンガイド２９で収束されて分析室２４に送られ、前段四重極マスフィルタ３０の長軸方向の空間に導入される。なお、イオン化法はエレクトロスプレイイオン化法に限らず、大気圧化学イオン化法や大気圧光イオン化法などを用いてもよいことは当然である。

ＭＳ／ＭＳ部２０においてＭＳ／ＭＳ分析を行う際には、前段四重極マスフィルタ３０及び後段四重極マスフィルタ３３の各ロッド電極に電源部３６からそれぞれ所定の電圧（高周波電圧と直流電圧とが重畳された電圧）が印加され、コリジョンセル３１内にはＣＩＤガス供給部３５から連続的に又は間欠的にＣＩＤガスが供給される。これにより、前段四重極マスフィルタ３０に送り込まれた各種イオンの中で、前段四重極マスフィルタ３０の各ロッド電極に印加されている電圧に応じた特定の質量電荷比を有するイオンのみが該フィルタ３０を通過し、プリカーサイオンとしてコリジョンセル３１に導入される。コリジョンセル３１内でプリカーサイオンはＣＩＤガスに衝突して開裂し、各種のプロダクトイオンが生成される。生成された各種プロダクトイオンが後段四重極マスフィルタ３３に導入されると、後段四重極マスフィルタ３３の各ロッド電極に印加されている電圧に応じた特定の質量電荷比を有するプロダクトイオンのみが該フィルタ３３を通過し、イオン検出器３４に到達して検出される。イオン検出器３４はパルスカウント型検出器を用いることができ、この場合、入射したイオンの数に応じた個数のパルス信号を検出信号として出力する。
イオン検出器３４の検出信号はデータ処理部４０に入力され、マススペクトルやマスクロマトグラムが作成されるとともに、後述するようなペプチド解析処理などが実行される。

一般的なＬＣ−ＭＳ／ＭＳと同様、本実施例のシステムでも、ＭＳ／ＭＳ測定のモードとして、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）測定、プロダクトイオンスキャン測定、プリカーサーイオンスキャン測定、ニュートラルロススキャン測定が用意されている。
ＭＲＭ測定では、前段四重極マスフィルタ３０及び後段四重極マスフィルタ３３でそれぞれ所定の質量電荷比のイオンのみを通過させてＭＳ／ＭＳ測定が行われ、これにより、目的化合物由来の特定のプリカーサイオンに対する特定のプロダクトイオンが検出される。ＭＲＭ測定では、プリカーサイオンの質量電荷比（m/z）とプロダクトイオンの質量電荷比（m/z）とを１組とするチャンネルを複数設定した測定を行うことができ、プリカーサイオンの質量電荷比とプロダクトイオンの質量電荷比の組を「ＭＲＭトランジション」という。以下に説明するペプチド解析処理では、ＭＳ／ＭＳ測定としてＭＲＭ測定が使用される。

以下、上記ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを用いて実施されるペプチド解析処理について説明する。図２はこの処理の手順を示すフローチャートである。

あるタンパク質又はペプチドについてその一部のアミノ酸が異性化しているか否かを解析する場合、測定者はまず、標準ペプチドを用いて、上述のＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを用いてＭＲＭモードでＭＳ／ＭＳ測定する際の測定条件の検討を行う（ステップＳ１）。なお、標準ペプチドとは、解析対象のタンパク質又はペプチドがＭＳ／ＭＳ部２０に導入されてイオン化される際に開裂が生じて生成される、構造が既知のペプチドであり、異性化していることが予想されるアミノ酸に関する複数種の異性体が含まれるものをいう。

例えばあるペプチドについて、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）が異性化していることが予想される場合は、アスパラギン酸の複数種類の異性体（例えば４種類の異性体（Ｄα-Asp、Ｄβ-Asp、Ｌα-Asp、Ｌβ-Asp））をそれぞれ１種類ずつ含む複数種類のペプチドが標準ペプチドに含まれることとなる。

このような標準ペプチドを用いてＭＲＭモードで、複数のＭＲＭトランジションを測定条件とするＭＳ／ＭＳ測定を実行すると、複数のＭＲＭトランジションの各値についてＭＲＭクロマトグラムが得られるから、各ＭＲＭクロマトグラムにおいて現れる複数のピークを抽出し、各ピークが現れた時間（保持時間）、及び複数のＭＲＭクロマトグラムの同一の保持時間に現れたピークの強度比をデータ記憶部４２に登録する（ステップＳ２）。
なお、異性化ペプチドの解析に際して、既に決まった保持時間やピーク強度比を測定条件として用いる場合は、上述の処理は省略することができる。

次に、解析対象のタンパク質又はペプチドを含む実試料について、上述のＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを用いた解析処理の開始が指示されると、標準ペプチドと同様に、ＭＲＭモードで、複数のＭＲＭトランジションを測定条件とするＭＳ／ＭＳ測定を実行し、それによって得られたデータを収集し、データ記憶部４２に格納する（ステップＳ３）。そして、測定が終了すると、グラフ作成部４３によりデータが処理されて複数のＭＲＭトランジションの各値についてクロマトグラムが作成されるとともに、作成されたクロマトグラムについて波形処理が行われ、ピークが抽出される（ステップＳ４）。

続いて、ＭＲＭトランジションの各値について作成されたクロマトグラムのピーク保持時間とピーク強度の関係を示すピークテーブルを作成し（ステップＳ５）、複数のクロマトグラムのそれぞれにおいて同じ保持時間に現れたピークを紐付ける（ステップＳ６）。そして、紐付けたピークの強度比を、標準ペプチドのピーク強度比と照合し（ステップＳ７）、両強度比の差が許容範囲を超えていれば（ステップＳ８にてＮｏ）、異性化ペプチドが存在しないと推定し（ステップＳ１３）、その結果を出力する（ステップＳ１２）。
一方、紐付けられたピークの強度比と標準ペプチドのピーク強度比の差が許容範囲内であれば（ステップＳ８においてＹｅｓ）、紐付けられたピークの保持時間を標準ペプチドについて得られたピークの保持時間と照合し（ステップＳ９）、その差が許容範囲内であれば、標準ペプチドと同じ種類の異性体（上述のＡｓｐの例では４種類の異性体）が実試料に含まれていると推定してその結果を出力する（ステップＳ１１、Ｓ１２）。また、許容範囲を超えているときは、標準ペプチドと同じではないが、実試料に異性体が含まれていると推定してその結果を出力する（ステップＳ１４、Ｓ１２）。

次に、アスパラギン酸を含むペプチドについて、該アスパラギン酸の異性化について具体的に解析を行った例を説明する。
ここでは、アスパラギン酸を含むペプチドとして、アミノ酸配列が「TVLDSGISEVR」である１１個のアミノ酸から成るペプチドを用いた。この試料ペプチドは、水晶体に存在するタンパク質の一種であるクリスタリン（Crystallin）に含まれ、白内障を発症した患者においてＤ体からＬ体に変化することが指摘されているアスパラギン酸の複数の異性体を含むペプチドの混合物である。
測定に使用した装置は以下の通りである。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ：株式会社島津製作所製 LCMS-8060
カラム： L-column 2 metal free, 3 μm, 150 x 2.0 mm （一般財団法人化学物質評価研究機構）製 カタログ番号731020

（１）アミノ酸配列が「TVLDSGISEVR」であるペプチドについて、アスパラギン酸（Asp、記号D)がそれぞれＬα-Ａｓｐ、Ｌβ-Ａｓｐ、Ｄα-Ａｓｐ、Ｄβ-Ａｓｐである４種類の異性体を準備する。これらの４種類の異性体のペプチドは、アスパラギン酸以外のアミノ酸は同一の立体構造を有している。そして、準備した４種類の異性体をそれぞれ2mgずつ秤量し、これを50%メタノールに溶解して5mg/mLのストック溶液を調製する。

（２）４種類のストック溶液を混合し、この混合液を10%ＡＣＮにて希釈して各ペプチドの濃度が0.5μm/mLになるように調製し、これを試料とした。
（３）この試料を、0.2μL（カラムあたりの各異性体ペプチドの重量：0.1ng）ずつＬＣ部１０に導入してＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を実行する。
このときのＬＣ部１０における測定条件を表１に、ＭＳ／ＭＳ測定の測定条件を表２に示す。表１に示すように、ここでは、移動相Ａと移動相Ｂの組成を連続的に変化させながら試料に含まれるペプチドを分離するグラジエント分離を行っている。

表２に示す測定条件のうちＭＲＭトランジションの各値は、プリカーサイオンの質量電荷比（m/z）とプロダクトイオンの質量電荷比（m/z）の値の組を示している。なお、前段四重極マスフィルタ３０の各ロッドに印加する電圧値と後段四重極マスフィルタ３３の各ロッドに印加する電圧値をＭＲＭトランジションとしても良い。この測定事例では、プリカーサイオンの質量電荷比は５種類の測定条件y5〜y9に共通であり、アミノ酸配列が「TVLDSGISEVR」であるペプチドをプリカーサイオンとして前段四重極マスフィルタ３０を通過させる条件に相当する。同じペプチドであっても、価数の違いにより、プリカーサイオンの質量電荷比が異なっていてもよい。一方、各測定条件y5〜y9の後段四重極マスフィルタ３３の各ロッドに印加する電圧値は、それぞれ図７に示すアミノ酸配列のペプチド（図７において、記号y5〜y9の右横に示すアミノ酸配列のうち灰色の長方形で色づけられた５〜９個のアミノ酸からなるペプチド）をプロダクトイオンとして後段四重極マスフィルタ３３を通過させる条件に相当する。

図３に、上記サンプルの測定結果であるＭＲＭクロマトグラムを示し、図４に、図３において矩形枠で囲んだ領域の拡大図を示す。なお、図５は、ＳＩＭモードでＭＳ／ＭＳ測定を行うことにより得られたマスクロマトグラムを示す。

図３から分かるように、表２に示すＭＲＭトランジションの各値で得られたＭＲＭクロマトグラムは、いずれも４個のピークを有している。これら４個のピークは、ＳＩＭモードのＭＳ／ＭＳ測定で得られたマスクロマトグラムで観測されたピークと同じである（図５参照）。そして、各ＭＲＭクロマトグラムで観測される４個のピークは、他のＭＲＭクロマトグラムで観測される４個のピークと同じ保持時間に存在していることから、これらのピークは試料に含まれる４個の異性体ペプチドであると判断することができる。本発明者の解析によると、図３に示すＭＲＭクロマトグラムで観察される４個のピークは、左側から順に、Ｌβ-Ａｓｐを含むペプチド、Ｌα-Ａｓｐを含むペプチド、Ｄβ-Ａｓｐを含むペプチド、Ｄα-Ａｓｐを含むペプチドに対応することが分かっている。

また、図６は、ＭＲＭトランジションの各値について得られたＭＲＭクロマトグラムで観察される４個のピーク、具体的には、左側から順に、Ｄα-Ａｓｐを含むペプチド、Ｄβ-Ａｓｐを含むペプチド、Ｌα-Ａｓｐを含むペプチド、Ｌβ-Ａｓｐを含むペプチドに対応するピークの相対強度を示している。ここでは、ＳＩＭモードでＭＳ／ＭＳ測定したときに得られたマスクロマトグラムにおいて観察された４個のピークに対する面積比を相対強度としている。
図６に示すように、各異性体ペプチドに対応するピーク毎に、５個の測定条件に対応するピーク強度比が少しずつ異なり、特にＡｓｐ（Ｄ）とセリン（記号Ｓ）の間で開裂が生じる測定条件y7で得られたＭＲＭクロマトグラムのピーク強度と、Ａｓｐとロイシン（記号Ｌ）の間で開裂が生じる測定条件y8で得られたＭＲＭクロマトグラムのピーク強度の比（y8/y7）が、４種類の異性体ペプチドにおいて異なることが分かる。従って、ピーク強度比y8/y7を指標とすることにより、異性体ペプチドが存在すること、及び異性化が生じている箇所（この例ではＡｓｐ）を推定することが可能であることが検証できた。

図４は、図３のベースライン付近（Ａの部分）を拡大したものである。ここには、標準ペプチドとして準備した４種類の異性体ペプチドの中に、不純物として含まれていたもののピークが検出されている。これらのピークについても５個の測定条件に対応するピークが検出されている。したがって、これらの小さいピークについても異性体ペプチドであることを推測することができる。この場合、これらは標準ペプチドを用意せずに対象ピークが異性体ペプチドであることを推測可能であった。したがって、図２に示すフローチャートのステップＳ１、ステップＳ２を省略した場合においても異性体ペプチドの存在を推測することが可能であることが検証できた。

なお、上記実施例は本発明の一例に過ぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変更したり拡張したりすることが可能である。例えば上記実施例では液体クロマトグラフを用いたが、ガスクロマトグラフを用いても良い。

１０…液体クロマトグラフ部
１４…カラム
２０…質量分析部
３０…前段四重極マスフィルタ
３１…コリジョンセル
３２…多重極イオンガイド
３３…後段四重極マスフィルタ
３４…イオン検出器
３５…ＣＩＤガス供給部
３６…電源部
４０…データ処理部
４１…データ収集部
４２…データ記憶部
４３…グラフ作成部
４４…定量分析部
５０…制御部
５２…入力部
５３…表示部

Claims (5)

1. ＭＳ／ＭＳ測定が可能なクロマトグラフ質量分析装置を用いて、タンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸の異性化を解析するためのペプチド解析方法であって、
   a) 解析目的であるタンパク質又はペプチドを含む試料をクロマトグラフによって時間的に分離する工程と、
   b) 該分離された試料に含まれるタンパク質又はペプチドがイオン化して生じるプリカーサイオン、該プリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して形成される複数種のフラグメントイオンに応じた複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定を実行する測定実行工程と、
   c) 前記ＭＲＭ測定により得られたデータに基づき、前記複数のＭＲＭトランジションの各値におけるクロマトグラムを作成する工程と、
   d) 前記複数のクロマトグラムの各々についてピークを検出するピーク検出工程と、
   e) 前記複数のクロマトグラムの各々に複数のピークが検出された場合であって、前記複数のクロマトグラムに共通に、複数のピークがそれぞれ同一保持時間に存在する状態にあるときは、前記解析目的であるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸が異性化していると判断し、前記状態にないときは、前記解析目的であるタンパク質又はペプチドのアミノ酸がいずれも異性化していないと判断する工程
   とを備えることを特徴とするペプチド解析方法。
2. 請求項１に記載のペプチド解析方法において、
   前記複数のクロマトグラムの同一保持時間に存在するピークの強度比を比較することにより、異性化しているアミノ酸が存在する部位を推定する異性化部位推定工程を
   有することを特徴とする、ペプチド解析方法。
3. 請求項１又は２に記載のペプチド解析方法において、
   保持時間を第１軸、強度を第２軸とする座標軸に前記複数のクロマトグラムを表示する表示工程を
   有することを特徴とする、ペプチド解析方法。
4. ＭＳ／ＭＳ測定が可能なクロマトグラフ質量分析装置を含み、タンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸の異性化を解析するためのペプチド解析装置であって、
   a) 解析目的であるタンパク質又はペプチドを含む試料をクロマトグラフによって時間的に分離し、その分離された試料に含まれるタンパク質又はペプチドがイオン化して生じるプリカーサイオン、該プリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して形成される複数種のフラグメントイオンに応じた複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定を実行するように前記クロマトグラフ質量分析装置を動作させる分析制御部と、
   b) 前記ＭＲＭ測定により得られたデータに基づき、前記複数のＭＲＭトランジションの各値におけるクロマトグラムを作成するクロマトグラム作成部と、
   c) 前記複数のクロマトグラムの各々についてピークを検出するピーク検出部と、
   d) 前記複数のクロマトグラムの各々に複数のピークが検出された場合であって、前記複数のクロマトグラムに共通に、複数のピークがそれぞれ同一保持時間に存在する状態にあるときは、前記解析目的であるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸が異性化していると判断し、前記状態にないときは、前記解析目的であるタンパク質又はペプチドのアミノ酸がいずれも異性化していないと判断する異性化判断部
   とを備えることを特徴とするペプチド解析装置。
5. タンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸の異性化を解析するために、ＭＳ／ＭＳ測定が可能なクロマトグラフ質量分析装置の動作を制御するとともに該装置で得られたデータを処理する、コンピュータ上で動作するプログラムであって、
   a) 解析目的であるタンパク質又はペプチドを含む試料をクロマトグラフによって時間的に分離し、その分離された試料に含まれるタンパク質又はペプチドがイオン化して生じるプリカーサイオン、該プリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して形成される複数種のフラグメントイオンに応じた複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定を実行するように前記クロマトグラフ質量分析装置を動作させる分析制御機能部と、
   b) 前記ＭＲＭ測定により得られたデータに基づき、前記複数のＭＲＭトランジションの各値におけるクロマトグラムを作成し、前記複数のクロマトグラムの各々に複数のピークが検出された場合において、前記複数のクロマトグラムに共通に、複数のピークがそれぞれ同一保持時間に存在する状態にあるときは、前記解析目的であるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸が異性化していると判断し、前記状態にないときは、前記解析目的であるタンパク質又はペプチドのアミノ酸がいずれも異性化していないと判断する異性化判断機能部
   とを備えることを特徴とするペプチド解析用プログラム。

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