JP6641841B2

JP6641841B2 - ヒトパルボウイルスｂ１９抗原の測定方法

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Publication number: JP6641841B2
Application number: JP2015190821A
Authority: JP
Inventors: 然顧; 金子　敦; 敦金子; 克己青柳
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Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2020-02-05
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Also published as: JP2017067513A

Description

本発明は、ヒトパルボウイルスB19抗原の免疫測定方法に関する。

ヒトパルボウイルスB19は、パルボウイルス科パルボウイルス属に属する一本鎖DNAウイルスである。ウイルス粒子は正２０面体構造であり、カプシドタンパク質のVP-1（83 kDa）及びVP-2（58 kDa）が1:9の比率でカプシドを構成している。エンベロープは有していない。パルボウイルスB19感染による疾患・症状として、伝染性紅斑（りんご病）、関節炎、胎児水腫や流産等が知られている。

検体中のヒトパルボウイルスB19抗原を簡便かつ感度良く測定する手法として、pH3.5以下の酸性条件下で検体を処理してから抗ヒトパルボウイルスB19抗体による免疫測定を行なう手法が知られている（特許文献１）。また、これよりも若干pHが高い酸性条件下、グアニジンで検体を処理してから免疫測定を行なう手法も知られている（特許文献２）。

検体中の病原体由来抗原を免疫学的手法により測定する方法においては、感染者体内で中和抗体等の抗原物質に対する抗体が生じている場合、検体中に存在する宿主由来の抗体が抗原を測定するための抗体と競合し、抗原が宿主由来抗体との間でも複合体を形成してしまい、結果として測定値が低下してしまうことがある。このことは、検体中に微量にしか含まれない抗原を測定しようとする場合に特に大きな問題となり得る。特許文献１や特許文献２の方法は、ヒトパルボウイルスB19抗原と宿主由来抗体との間の複合体形成による測定値の低下をある程度改善することができるが、更に改善の余地があった。

特許文献３には、検体中のC型肝炎ウイルス（HCV）抗原の免疫測定において、検体を酸性化剤と特定構造の陽イオン性界面活性剤とで前処理することにより、体内でのウイルス量が少ないHCVのウイルス抗原の検出感度を高める手法が開示されている。この検体処理方法では、酸性化剤での処理により検体中の宿主由来抗体を失活させ、酸処理によって生じる沈殿や白濁を抑制する目的で特定構造の陽イオン界面活性剤を添加する。HCVはエンベロープを有するウイルスであり、特許文献２にも記載される通り、エンベロープを有するウイルスの場合、ウイルス抗原を検出するためには、前処理によりエンベロープ膜を強力に破壊し、膜内の抗原タンパク質を曝露させる必要がある。特許文献３には、当該処理方法がヒトパルボウイルスに対しても適用可能であるとする記載がごく一部にあるものの、対象ウイルスは脂質膜（すなわちエンベロープ）を有するウイルスであるものと明記されており、実施例にもHCVの検出しか記載されていない。

特許第4449171号特許第4855126号特許第4744298号

上記した通り、ヒトパルボウイルスB19のようにエンベロープを持たないウイルスの抗原タンパク質の免疫測定において、検体中の宿主由来抗体による測定値の低下をさらに改善することが求められている。本発明は、ヒトパルボウイルスB19の免疫測定においてこの問題を解決できる手段を提供することを目的とする。

本願発明者らは、ヒトパルボウイルスB19抗原の免疫測定方法のさらなる感度向上を目的として鋭意研究した結果、pH3.5以下の酸性条件下で特定の界面活性剤にて検体を処理した後に抗体との反応に付すことにより、免疫測定に用いる抗体と宿主由来抗体との間の競合による測定値の低下を抑制し、検出感度をさらに高めることができることを見出し、本願発明を完成した。

すなわち、本発明は、下記(１)〜(４)の少なくともいずれかの界面活性剤を含む処理液にて、pH3.5以下の酸性条件で検体を処理することを含む、ヒトパルボウイルスB19抗原の免疫測定方法を提供する。
(１) 分子内に炭素数１０以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する両性界面活性剤
(２) 分子内に炭素数１０以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する陽イオン性界面活性剤
(３) 分子内に炭素数９以上のアルキル基と第三級アミドとを有する非イオン性界面活性剤
(４) 分子内にステロイド骨格と第四級アンモニウムとを有する両性界面活性剤

さらに、本発明は、上記(１)〜(４)の少なくともいずれかの界面活性剤を含む検体処理液と、抗ヒトパルボウイルスB19抗体又はその抗原結合性断片とを含む、ヒトパルボウイルスB19抗原の免疫測定キットを提供する。

本発明によれば、エンベロープを持たないヒトパルボウイルスB19の抗原タンパク質の免疫測定において、検出に用いる抗体と競合する中和抗体等の宿主由来抗体が検体中に存在する場合であっても、宿主由来抗体と測定対象抗原との間で形成された複合体を解離し、測定値の低下を防止することができる。本発明によれば、従来のパルボウイルスB19抗原の免疫測定法よりもさらに検出感度を高めることができる。

本発明では、ヒトパルボウイルスB19抗原を測定すべき検体を、pH3.5以下の酸性条件下で、特定の界面活性剤を含む処理液にて処理する。使用される界面活性剤は、下記の(１)〜(４)の少なくともいずれかである。
(１) 分子内に炭素数１０以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する両性界面活性剤
(２) 分子内に炭素数１０以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する陽イオン性界面活性剤
(３) 分子内に炭素数９以上のアルキル基と第三級アミドとを有する非イオン性界面活性剤
(４) 分子内にステロイド骨格と第四級アンモニウムとを有する両性界面活性剤

(１)の両性界面活性剤において、アルキル基は好ましくは直鎖アルキル基である。アルキル基の炭素数は１２以上であることがより好ましい。(１)の界面活性剤の好ましい例としては、CH₃-(CH₂)_n-N⁺(CH₃)₂-[(CH₂)₃-SO₃ ^-]（nは９以上の整数）で表される構造の両性界面活性剤を挙げることができ、具体例として下記表１に示す界面活性剤を挙げることができるが、これらに限定されない。

(２)の陽イオン性界面活性剤において、アルキル基は好ましくは直鎖アルキル基である。アルキル基の炭素数は１２以上であることがより好ましい。(２)の界面活性剤の好ましい例としては、CH₃-(CH₂)_n-N⁺(CH₃)₃・Br^-、及びCH₃-(CH₂)_n-N⁺(CH₃)₃・Cl^-（いずれもnは９以上の整数）で表される陽イオン性界面活性剤を挙げることができ、具体例として下記表２に示す界面活性剤を挙げることができるが、これらに限定されない。

(３)の非イオン性界面活性剤において、アルキル基は好ましくは直鎖アルキル基である。(３)の界面活性剤の好ましい例としては、MEGA-10（n-Decanoyl-N-methylglucamide）およびMEGA-12（n-Dodecanoyl-N-methylglucamide）を挙げることができる。MEGA-10がより好ましい。MEGA-10は、下記の構造を有する非イオン性界面活性剤である。MEGA-10は、炭素数９の直鎖アルキル基と第三級アミドとを分子中に含み、上記した(１)及び(２)の好ましい具体例と類似した構造を有している。MEGA-12も、炭素数１１の直鎖アルキル基と第三級アミドとを分子中に含み、上記した(１)及び(２)の好ましい具体例と類似した構造を有している。

(４)の両性界面活性剤の好ましい例としては、CHAPS（3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate）およびCHAPSO （3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonate）を挙げることができる。CHAPSがより好ましい。CHAPSは、下記構造を有する両性界面活性剤であり、分子内に第四級アンモニウムを含む-N⁺(CH₃)₂-[(CH₂)₃-SO₃ ^-]構造を有する両性界面活性剤であるという点で、上記した(１)の好ましい具体例と共通した特徴を有している。CHAPSOも、分子内に第四級アンモニウムを含む-N⁺(CH₃)₂-[CH₂-CHOH-CH₂-SO₃ ^-]構造を有する両性界面活性剤であるという点で、上記した(１)の好ましい具体例と非常に類似した特徴を有している。

(１)〜(４)の界面活性剤の中でも好ましく用いることができる界面活性剤としては、C12APS、C14APS、C16APS、C12TAB、C14TAB、C12TAC、及びC14TACを挙げることができ、とりわけ本発明ではC12APSを特に好ましく用いることができる。

上記した(１)〜(４)の界面活性剤の処理液中の濃度は、0.01%〜5.0%程度、例えば0.01%〜3.0%程度、又は0.05%〜2.5%程度であればよい。(１)〜(４)の界面活性剤を複数組み合わせて用いる場合には、各界面活性剤が上記の濃度であってよいが、合計で10%程度以下とすることが望ましい。

本発明においては、上記した(１)〜(４)の界面活性剤による処理に加え、さらにポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系の非イオン性界面活性剤、及びポリソルベート系の非イオン性界面活性剤から選択される少なくとも一種による検体処理を行ってもよい。上記(１)〜(４)のいずれかの界面活性剤とこれらの非イオン性界面活性剤を組み合わせて用いることで、免疫測定の感度をさらに高めることができる。組み合わせて使用し得るこれらの非イオン性界面活性剤の処理液中濃度は、(１)〜(４)の界面活性剤と同様でよい。処理液中にこれらの非イオン性界面活性剤をさらに添加しておけば作業工程が簡便であるが、先にこれらの非イオン性界面活性剤と検体を混合してから上記処理液による処理を行ったり、あるいは上記処理液による処理の後にこれらの非イオン性界面活性剤を添加してもよい。

ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤には、Triton X-100、Triton X-305、Triton X-405、Triton X-705、Nonidet P-40等の非イオン系界面活性剤が包含される。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤は、Triton系界面活性剤とも呼ばれる。

ポリソルベート系界面活性剤には、ポリソルベート20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、商品名Tween20）、ポリソルベート40（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、商品名Tween40）、ポリソルベート60（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、商品名Tween60）、ポリソルベート65（ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、商品名Tween65）、ポリソルベート80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、商品名Tween80）、ポリソルベート85（ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、商品名Tween85）等の非イオン系界面活性剤が包含される。ポリソルベート系界面活性剤は、Tween系界面活性剤、又はポリオキシエチレンソルビタン系界面活性剤とも呼ばれる。

ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤及びポリソルベート系界面活性剤の中で好ましい具体例としては、TritonX-705、ポリソルベート20、及びポリソルベート80等を挙げることができるが、これらに限定されない。

あるいはまた、上記した(１)〜(４)の界面活性剤による処理に加え、さらに変性剤による検体処理を行ってもよい。変性剤の具体例としては、グアニジン、グアニジン塩、グアニジン誘導体、及び尿素を挙げることができる。上記(１)〜(４)のいずれかの界面活性剤と変性剤を組み合わせて用いた場合にも、免疫測定の感度をさらに高めることができる。グアニジン塩の具体例としては、これらに限定されないが、グアニジン塩酸塩、グアニジン炭酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジンリン酸塩、グアニジンスルファミン酸塩等を挙げることができる。グアニジン誘導体の具体例としては、これらに限定されないが、グアニジノ安息香酸、グアニジノグルタル酸、グアニジノコハク酸、グアニジノ酢酸、グアニジノプロピオン酸、グアニジノベンズイミダゾール等を挙げることができる。変性剤の処理液中濃度は、0.5M〜5M程度でよい。変性剤もまた、処理液中にさらに添加しておいてもよいし、上記処理液による処理よりも先に又は後に変性剤処理を実施してもよい。

本発明において、pH3.5以下の酸性条件下で検体を処理するとは、処理中の検体溶液（すなわち、検体と処理液を混合した溶液）がpH3.5以下であることを意味する。処理中の検体溶液のpHは、例えば、pH3.0程度以下、又はpH2.8程度以下としてもよい。処理中の検体溶液をこのような酸性条件にするために使用可能な酸は特に限定されず、無機酸でも有機酸でも使用可能である。例えば、塩酸、硫酸、酢酸、クエン酸等の酸を単独又は複数組み合わせて使用することができる。また、処理中の検体溶液を酸性条件にするために、例えば、適切なpHに調整した、グリシン塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の酸性緩衝液を用いてもよい。処理液中に適当な量の酸又は酸性緩衝液を加えてもよいし、処理液とは別に検体に酸又は酸性緩衝液を混合してもよい。

処理液は、上記の界面活性剤を所定の濃度で含んでいる限り、その他の成分は特に限定されない。市販の免疫測定キット等において使用されている検体希釈液に上記した界面活性剤を添加し、処理中の検体溶液のpHが上記した通りの酸性条件となるように酸又は酸性緩衝液を添加して調製することができる。あるいは、酸又は酸性緩衝液は、上記した通り処理液と別個に検体に添加してもよい。

処理液による検体の処理は、抗体との反応の前に実施する。検体処理時の温度は０℃〜５０℃であればよく、通常は室温付近での処理が好ましい。処理時間は通常１０秒〜１０分間程度であるが、pHの値や処理温度に応じて処理時間を適宜調節してよい。

処理液と検体を混合して検体を処理した後、検体溶液をアルカリ性溶液で中和して中性付近にpHを調整する。抗体との反応の前に中和してもよいし、抗体との反応と同時に中和を行なってもよい。例えば、抗体液のpHを高め（例えばpH8.5〜pH10.0程度）に設定することで、酸性化された処理済み検体と抗体液との混合により、抗体反応と同時に中和を行なうことができる。

処理済み検体中のヒトパルボウイルスB19抗原の免疫測定に用いる抗ヒトパルボウイルスB19抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。一般にはモノクローナル抗体が好ましく用いられる。また、抗体に代えて、Fab'、F(ab')₂、scFv等の抗原結合性断片を使用することもできる。抗ヒトパルボウイルスB19抗体は公知であり、市販のキットでも用いられている。そのような公知の抗体を好ましく用いることができる。あるいは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗原結合性断片の作製方法は周知であるので、ヒトパルボウイルスB19抗原を免疫原として用いて抗ヒトパルボウイルスB19抗体又はその抗原結合性断片を調製し、免疫測定に使用してもよい。免疫原として用いるヒトパルボウイルスB19抗原タンパク質は、例えば特開平7-147986号を参照して作製することができる。あるいは、ヒトパルボウイルスに感染したヒトの血清等から抽出精製して得ることもできる。

本明細書において、「ヒトパルボウイルスB19抗原」という語には、カプシドタンパク質であるVP-1及びVP-2が包含される。ヒトパルボウイルスB19抗原を検出するための抗ヒトパルボウイルスB19抗体としては、特に限定されないが、ウイルス粒子中に占める存在割合が高いVP-2に対する抗VP-2抗体を用いることが好ましい。

本発明におけるヒトパルボウイルスB19抗原の免疫測定は、競合法、サンドイッチ法等の公知の免疫測定法により実施することができる。中でも本発明ではサンドイッチ法を好ましく採用できる。サンドイッチ免疫測定の具体例を挙げると、化学発光酵素免疫測定法（chemiluminescent enzyme immunoassay; CLEIA）、酵素結合免疫吸着法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA）、ラジオイムノアッセイ、電気化学発光免疫測定法等の各種の手法がある。本発明においてはいずれの手法を用いてもよい。

サンドイッチ測定系においては、通常、２種類の抗体又はその抗原結合性断片のうちの一方を固相に固定化した固相抗体とし、他方を標識物質により標識した標識抗体として使用する。本発明に従い処理した処理済み検体中では、パルボウイルスB19抗原は大部分がモノマーとして存在していると考えられるため、サンドイッチ法で用いる固相抗体と標識抗体は、B19抗原の異なる部位を認識するものを用いることが望ましい。

固相は特に限定されず、公知のサンドイッチ免疫測定系で使用されている固相と同様でよい。固相の材質の具体例としては、ポリスチレン、ポリエチレン、セファロース等が挙げられるが、これらに限定されない。固相の物理的形状は本質的に重要ではない。使用する固相は、その表面への抗体の固定化が容易で、測定中に形成される免疫複合体と未反応の成分を容易に分離できるものであることが好ましい。特に、通常の免疫測定法に使用されるプラスチックプレートや磁性粒子が好ましい。取り扱い、保存、および分離の容易性等の観点から、前述のような材質の磁性粒子を使用することが最も好ましい。これらの固相への抗体の結合は当業者に周知の常法によって行なうことができる。

標識物質も特に限定されず、公知の免疫測定系で使用されている標識物質と同様のものを用いることができる。具体例としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、染色物質、放射性物質などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、パーオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等、公知のものを用いることができるが、これに限定されるものではない。

サンドイッチ免疫測定の手順を簡単に記載すると、まず、処理済み検体を固相抗体と反応させ、洗浄してB/F分離した後、標識抗体と反応させる。再度洗浄してB/F分離した後、標識抗体からのシグナル（蛍光、発光、発色等）を検出する。標識物質として酵素を使用した場合には、適当な基質を添加して反応させ、酵素反応により生じるシグナルを検出すればよい。ヒトパルボウイルスB19抗原を種々の濃度で含む濃度既知の標準試料について免疫測定を行ない、標識からのシグナルの量と標準試料中の抗源濃度との相関関係をプロットして検量線を作成しておけば、検体中のヒトパルボウイルスB19抗原の量を定量的に測定することができる。

なお、上記は2ステップ法による手順の説明であるが、処理済み検体と固相抗体と標識抗体とを同時に反応させる、1ステップ法を用いてもよい。

本発明の方法に供される検体は、典型的にはヒトから分離された検体である。検体提供者がヒトパルボウイルスB19に感染していた場合に該ウイルスの抗原を含むと予想される試料であれば特に限定されず、例えば血清、血漿、輸血用の血液などの血液由来の試料、血漿分画製剤等を挙げることができる。

本発明の免疫測定を実施するための免疫測定キットは、上記した(１)〜(４)の少なくともいずれかの界面活性剤を含む検体処理液と、抗ヒトパルボウイルスB19抗体又はその抗原結合性断片とを含む。該キットの検体処理液は、処理中の検体溶液のpHが上記した通りの酸性条件となるように酸又は酸性緩衝液を含んでいてもよいし、あるいは酸性緩衝液等の酸溶液を検体処理液とは別個に含んでいてもよい。また、該キットは、上記した通りの変性剤や、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系の非イオン性界面活性剤及びポリソルベート系の非イオン性界面活性剤から選択される少なくとも一種を検体処理液中にさらに含んでいてもよいし、又は、検体処理液とは別個に含み、検体処理時に適宜添加して用いることとしてもよい。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

＜抗パルボウイルス抗体固相化粒子の調製＞
10 mM MES緩衝液（pH5.0）中で磁性粒子0.01g/mLに、マウス抗パルボウイルスB19モノクローナル抗体Prv334抗体0.2mg/mLを添加し、25℃で１時間ゆるやかに攪拌しながらインキュベートした。反応後、磁性粒子を磁石で集磁し、粒子を洗浄液（50mMトリス緩衝液、150mM NaCl、2.0%BSA、pH 7.2）にて洗浄し、抗パルボウイルス抗体固相化粒子を得た。測定時には、抗パルボウイルス抗体固相化粒子を粒子希釈液（400mMトリス緩衝液、1 mM EDTA2Na、0.1% NaN₃、2.0% BSA、pH 9.0）に懸濁した。

＜アルカリホスファターゼ標識抗体の調製＞
脱塩したアルカリホスファターゼ（ALP）とN-(4-マレイミドブチリロキシ)-スクシンイミド（GMBS）（終濃度0.3mg/mL）を混合し、30℃で１時間静置してマレイミド化を行った。次いで、カップリング用反応液（100mM リン酸緩衝液、1 mM EDTA2Na、pH 6.3）中で、Fab'化したマウス抗パルボウイルスB19モノクローナル抗体VP2-312抗体と、マレイミド化ALPを１：１のモル比で混合し、25℃で1時間反応させた。Superdex200 10/300 (GE社製)のカラムクロマトグラフィーを用いて、精製用緩衝液(100 mM トリス緩衝液、150 mM NaCl、0.1% NaN₃、pH8.0)で、流速0.5 mL/minで主要ピークを分取して精製し、アルカリホスファターゼ標識抗体を得た。測定時には、アルカリホスファターゼ標識抗体を標識体希釈液（50 mM Tris緩衝液、100mM NaCl、0.3 mM ZnCl₂、1 mM MgCl₂、0.1% NaN₃、2.0% BSA、pH 7.2）に懸濁した。

＜パルボウイルスB19抗原の測定＞
前処理液20μLと試料100μLを反応槽に分注し攪拌後37℃で6.5分間インキュベーションした。その後、抗体固相化粒子50μLを分注し、攪拌した。その後、37℃で8分間インキュベーションし、B/F分離・洗浄を行った。酵素標識抗体50μLを反応槽に分注し、攪拌後37℃で8分間インキュベーションし、B/F分離・洗浄を行った。その後、化学発光基質である3-(2'-スピロアダマンタン)-4-メトキシ-4-(3''-ホスホリルオキシ)フェニル-1,2-ジオキセタン・2ナトリウム塩（AMPPD）を含むルミパルス基質液200μLを反応槽に分注し、攪拌後37℃で4分間インキュベーションした後、発光量をルミノメーターで測定した。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルスプレストII（富士レビオ社製））にて行った。

１．各種界面活性剤の効果の比較
下記表５に示す各種の界面活性剤を前処理液に添加し、サンプルの前処理を行なった。前処理液のpHは、前処理中のサンプル溶液がpH2.8となるように、グリシン塩酸緩衝液で適宜調整した。サンプルは、ヒト精製不活化抗原をTris緩衝液（50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA2Na, 0.1 % NaN₃, 2.0% BSA, pH 7.2）に溶解させたものを陽性サンプルとして用いた。また、試薬に使用される抗体とバッティングする抗体を含む検体のモデルとして、陽性サンプルに阻害抗体を添加したものを用いた。阻害抗体として、パルボウイルスB19抗原との結合に関し固相抗体Prv334と競合し得る２種類のモノクローナル抗体（抗体１、抗体２）を用いた。ルミパルスプレストIIでのカウント数より、以下の式で結合分離率を算出し、各界面活性剤の効果を評価した。

結合分離率（％）＝(阻害抗体を添加した陽性サンプルのカウント値)／(阻害抗体非添加の陽性サンプルのカウント値)×１００

結果を表５に示す。C12TAB、C12APS、C14APS、C16APSを添加した酸性の前処理液でサンプルを処理した場合、抗体の結合分離率が大幅に向上した。

２．前処理中のpHが及ぼす影響の検討
前処理中のpHが界面活性剤の効果に及ぼす影響を評価した。界面活性剤としてC12APSを使用した。前処理液中の界面活性剤の濃度は2%とした。サンプルとして、陰性サンプル（NC）（Tris緩衝液）、陽性サンプル（PC）、及び陽性サンプルに阻害抗体を添加したサンプルを用いた。阻害抗体として、上記した抗体１及び抗体２に加え、標識抗体VP2-312の方と競合し得るモノクローナル抗体（抗体３）を用いた。

結果を表６に示す。表６には、各添加条件において測定されたカウント値と、カウント値から算出した結合分離率と、非添加条件の結合分離率に対する各添加条件の結合分離率の比率（％）を示す。検討したpH1.9〜3.5の全ての条件において、C12APSの添加により結合分離率が向上した。pHを低くしていくと結合分離率がより向上する傾向があった。

３．界面活性剤のアルキル鎖長の検討
界面活性剤のアルキル鎖の鎖長が結合分離率に及ぼす影響を評価した。下記表７に示す界面活性剤を検討した。処理液中の界面活性剤濃度は2%とし、処理中のpHは2.4とした。サンプルは上記２．と同様のものを用いた。

結果を表７に示す。アルキル鎖の炭素数が１０個以上の界面活性剤で、結合分離率の向上効果が認められた。また陽イオン性界面活性剤も同様に効果を示すことが分かった。

４．実検体での界面活性剤の効果の確認
ヒト血清検体を用いて界面活性剤の効果を評価した。血清検体は、BBI社より購入した3321-146-2（BBI2、1.71×10¹¹ IU/mL）を使用した。この検体をルミパルス用希釈液で10ⁿ （n=3〜8）倍に希釈したサンプルを測定した。阻害抗体は抗体１〜３を混合して使用し、混合した抗体の終濃度が100μg/mLとなるように添加した。この抗体濃度は、ヒト血中に生じる特異的IgG量と大きく変わらない量である。界面活性剤はC12APSを使用し、前処理液中に2%となるように添加した。前処理中の検体溶液のpHは2.4となるように調整した。なお、界面活性剤と阻害抗体を共に添加していない条件において、あらかじめ複数の陰性検体と陽性検体とを測定し、得られたカウント値から、カットオフ値を算出した。本測定系では、カウント値がカットオフ値5500以上であれば、陽性検体と判定することができる。

結果を表８に示す。表中のDNA価はパルボウイルスのDNA価（IU/mL）である。阻害抗体を添加すると、界面活性剤非添加の場合、感度が約100倍程度低下するのに対し、C12APSの添加により、阻害抗体存在下でも、阻害抗体を添加していない場合と同程度の感度を有していた。つまり、阻害抗体存在下では、特定の界面活性剤の添加により感度が100倍に上昇した。これにより実際のヒト血清検体でも本技術の効果が得られることが確認された。

５．MEGA8、MEGA10、CHAPSの効果の検討
両性界面活性剤のCHAPS、非イオン性界面活性剤のMEGA8及びMEGA10の効果を評価した。界面活性剤は前処理液中に濃度2%となるように添加した。前処理中のpHは2.4とした。サンプルは上記２．と同様のものを用いた。

結果を表９に示す。非イオン性界面活性剤では、MEGA10で結合分離率の顕著な向上が認められた。CHAPS（両性イオン界面活性剤）では、パルボウイルスB19への結合部位が標識抗体とバッティングする抗体３を添加した場合に顕著な効果が認められた。

６．C12APS＋非イオン性界面活性剤の効果の検討
C12APSに非イオン性界面活性剤を組み合わせて用いた場合の効果を評価した。処理液中のC12APS濃度は2%とし、これにさらに非イオン性界面活性剤を濃度2%となるように添加した。前処理中のpHは2.4とした。サンプルは上記２．と同様の５種に加え、各阻害抗体を１０倍量で陽性サンプルに添加したもの（抗体１×10、抗体２×10、抗体３×10）を用いた。

結果を表１０に示す。C12APSに非イオン性界面活性剤を組み合わせて使用すると、結合分離率がさらに向上した。

７．C12APS＋変性剤の効果の検討
C12APSに変性剤を組み合わせて用いた場合の効果を評価した。変性剤として、尿素(2M、4M)及びグアニジン(4M)を用いた。前処理中のpHは2.8とした。サンプルは上記６．と同様のものを用いた。

結果を表１１に示す。C12APSに変性剤を組み合わせて使用すると、結合分離率がさらに向上した。

８．界面活性剤の濃度の検討
前処理液中に添加する界面活性剤の濃度を検討した。界面活性剤としてC12APSを使用し、前処理液中の添加濃度は下記表１２の通り0.1%〜2.0%とした。前処理中のpHは2.4とした。サンプルは上記２．と同様のものを用いた。

結果を表１２に示す。0.1%〜2.0%の全ての条件で結合分離率が向上した。前処理液中に界面活性剤が0.1%以上の濃度で存在すれば向上効果が得られると考えられる。結合分離率は界面活性剤の濃度依存的に高まることが確認された。

９．（比較例）尿素の効果の検討
酸性条件下で界面活性剤に代えて尿素を単独で用いることの効果を確認した。前処理中のpHが2.4となるように調整した前処理液に、下記表１３に示す濃度で尿素を添加した。サンプルは上記２．と同様のものを用いた。

結果を表１３に示す。尿素を4M以上の濃度で使用すると陽性サンプルであってもカウント値が大幅に低下してしまった。カウント値が維持された2M尿素の添加では結合分離率の向上効果は認められなかった。

Claims

下記(１)〜(４)の少なくともいずれかの界面活性剤を含む処理液にて、pH3.5以下の酸性条件で検体を処理することを含む、ヒトパルボウイルスB19抗原の免疫測定方法。
(１) 分子内に炭素数１０以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する両性界面活性剤
(２) 分子内に炭素数１０以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する陽イオン性界面活性剤
(３) 分子内に炭素数９以上のアルキル基と第三級アミドとを有する非イオン性界面活性剤
(４) 分子内にステロイド骨格と第四級アンモニウムとを有する両性界面活性剤
前記(１)〜(３)におけるアルキル基が直鎖アルキル基である、請求項１記載の方法。
前記(１)の両性界面活性剤が、C12APS、C14APS、及びC16APSから選択される界面活性剤である、請求項１又は２記載の方法。
前記(２)の陽イオン性界面活性剤が、C12TAB、C14TAB、C16TAB、C12TAC、C14TAC、及びC16TACから選択される界面活性剤である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
前記(３)の非イオン性界面活性剤がMEGA-10であり、前記（４）の両性界面活性剤がCHAPSである、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
検体をポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤及びポリソルベート系界面活性剤から選択される少なくとも一種の非イオン性界面活性剤で処理することをさらに含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも一種の非イオン性界面活性剤が、TritonX-705、ポリソルベート20、及びポリソルベート80から選択される少なくとも１種である、請求項６記載の方法。
検体を変性剤で処理することをさらに含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
変性剤がグアニジン、グアニジン塩、グアニジン誘導体、及び尿素から選択される少なくとも一種である、請求項８記載の方法。
免疫測定がサンドイッチ法により行なわれる、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
下記(１)〜(４)の少なくともいずれかの界面活性剤を含む検体処理液と、抗ヒトパルボウイルスB19抗体又はその抗原結合性断片とを含む、ヒトパルボウイルスB19抗原の免疫測定キット。
(１) 分子内に炭素数１０以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する両性界面活性剤
(２) 分子内に炭素数１０以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する陽イオン性界面活性剤
(３) 分子内に炭素数９以上のアルキル基と第三級アミドとを有する非イオン性界面活性剤
(４) 分子内にステロイド骨格と第四級アンモニウムとを有する両性界面活性剤
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤及びポリソルベート系界面活性剤から選択される少なくとも一種の非イオン性界面活性剤を、前記検体処理液中にさらに含むか、又は前記検体処理液とは別個に含む、請求項１１記載のキット。