JP6525199B2 - インスリンの検出方法、および、インスリンの検出キット - Google Patents

Description

本発明は、インスリンの検出方法、および、インスリンの検出キットに関する。

インスリンは、血中のグルコース濃度（血糖値）を制御するペプチドホルモンである。食後などに上昇する血糖値に呼応して膵臓のβ細胞からインスリンが分泌されると、筋肉細胞や脂肪細胞などがインスリンを感知し、これらの細胞によってグルコースが吸収される。そして、その結果、血糖値が低下する。

生体内におけるインスリンのシグナル伝達機構については多くの研究がなされており、インスリンの構造や、インスリンが結合するインスリンレセプターの構造について、様々なことが明らかになっている。

インスリンレセプターは、２つのαサブユニット、および、２つのβサブユニットを含むタンパク質である。更に詳細に、αサブユニットの各々は、細胞の外側に配置される領域であるとともに、インスリンが結合する領域である。また、αサブユニットの各々は、α−ＣＴセグメント、および、Ｌ１ドメインを含み、これらの２つのドメインが、インスリンに結合する。一方、βサブユニットの各々は、細胞の内側に配置される領域であるとともに、インスリンがαサブユニットに結合した時に、細胞内で様々なシグナルを発生させる領域である。また、βサブユニットの各々は、膜貫通領域と、細胞外ドメインの一部とを含んでおり、当該膜貫通領域の作用によって、インスリンレセプターは、細胞内で膜タンパク質として存在することができる（例えば、非特許文献１、および、図８参照）。

糖尿病の患者は、インスリンの分泌量が減少したり、インスリンの効果が低下したりすることによって、血糖値の制御を十分に行うことができない状態にある。それ故に、糖尿病の治療法の開発のため、および、健康維持のために、インスリンを検出するための技術、および、インスリンの濃度を測定するための技術の開発が進められている。

例えば、このような技術として、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：固相酵素免疫検定法）を利用した技術を挙げることができる（例えば、非特許文献２〜４参照）。しかしながら、ＥＬＩＳＡを利用した技術は、洗浄などの煩雑な操作が必要である、および、抗体を作製する必要がある、等の多くの問題を抱えており、薬剤開発におけるハイスループット検出や、ＰＯＣＴ（Point of Care Testing：その場における検査）には不向きである。また、洗浄などの操作を必要としないホモジニアスアッセイ法も開発されているが、当該方法は、事前に、抗インスリン抗体とシグナル生産部位とを化学的に結合し、当該結合体を精製する必要があるという問題を抱えている。それ故に、より簡便な技術の開発が求められている。

このような状況下にあって、ＬＲＥＴ（luminescence resonance energy transfer：発光共鳴エネルギー転移）、より具体的にはＢＲＥＴ（Bioluminescence Resonance Energy Transfer：生物発光共鳴エネルギー転移）を利用して、インスリンレセプターの活性化（換言すれば、インスリンレセプターとインスリンとの結合）を検出する技術の開発が進められている（例えば、非特許文献５〜７参照）。

非特許文献５〜７に記載の技術では、２つのαサブユニット、および、２つのβサブユニットを有する、完全な形態のインスリンレセプターを用いている。そして、一方のβサブユニットにはＲＬｕｃ（Renilla Luciferase）が連結され、他方のβサブユニットにはＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）が連結されており、αサブユニットにインスリンが結合すると、ＲＬｕｃとＹＦＰとの間で発光共鳴エネルギー転移が生じ、その結果、ＹＦＰが蛍光を発する。そして、当該蛍光を検出することによって、インスリンレセプターの活性化（換言すれば、インスリンレセプターとインスリンとの結合）が検出される。

John G. Menting et al., "How insulin engages its primary binding site on the insulin receptor" Nature, 10 January 2013, Vol.493, p241-245 Makoto Shigeto et. al., "First Phase of Glucose-Stimulated Insulin Secretion From MIN6 Cells Does Not Always Require Extracellular Calcium Influx" J Pharmacol Sci 101, p293-302(2006) Eiji Yamato et. al., "Microarray Analysis of Novel Candidate Genes Responsible for Glucose-Stimulated Insulin Secretion in Mouse Pancreatic β Cell Line MIN6" PLOS ONE / 1439181894901_0.org April 2013, Vol.8, Issue.4, e61211 Miyazaki J. et. al., "Establishment of a Pancreatic β Cell Line That Retains Glucose-Inducible Insulin Secretion: Special Reference to Expression of Glucose Transporter Isoforms., MIN6 cell line" Endocrinology, 127, p126-132(1990) Nicolas Boute et. al., "Monitoring the Activation State of the Insulin Receptor Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer" Molecular Pharmacology, Vol.60, No.4, p640-645(2001) Tarik Issad et. al., "A homogenous assay to monitor the activity of the insulin receptor using Bioluminescence Resonance Energy Transfer" Biochemical Pharmacology, 64, p813-817(2002) Christophe Blanquart et. al., "Monitoring the Activation State of the Insulin-Like Growth Factor-1 Receptor and its Interaction with Protein Tyrosine Phosphatase 1B Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer" Molecular Pharmacology, Vol.68, No.3, p885-894(2005)

しかしながら、上述の非特許文献５〜７に記載の従来技術は、簡便にインスリンを検出できないという問題点を有している。

具体的に、非特許文献５〜７に記載の従来技術では、完全な形態のインスリンレセプター、換言すれば、膜タンパク質であるインスリンレセプターを用いている。それ故に、非特許文献５〜７に記載の従来技術は、（Ｉ）膜タンパク質であるインスリンレセプターを精製するための煩雑な操作が必要であるという問題点、（ＩＩ）膜タンパク質であるインスリンレセプターを精製したとしても、精製の純度が低いという問題点、（ＩＩＩ）膜タンパク質であるインスリンレセプターは、変性し易く、取り扱いが難しいという問題点、などを有している。

本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、簡便にインスリンを検出できるインスリンの検出方法、および、インスリンの検出キットを提供することにある。

本発明のインスリンの検出方法は、上記課題を解決するために、試料と、インスリンレセプターのα−ＣＴセグメントを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第１のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させた第１の複合体と、インスリンレセプターのＬ１ドメインを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第２のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させた第２の複合体と、を含む溶液から、上記発光物質と上記蛍光物質との間で生じる発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光を検出する蛍光検出工程を含み、上記第１のポリペプチドに発光物質が連結されている場合には、上記第２のポリペプチドに蛍光物質が連結されており、上記第１のポリペプチドに蛍光物質が連結されている場合には、上記第２のポリペプチドに発光物質が連結されていることを特徴としている。

本発明のインスリンの検出方法では、上記溶液における、上記第１の複合体の濃度（Ｍ１）、および、上記第２の複合体の濃度（Ｍ２）が、５０≦Ｍ２／Ｍ１≦２００の関係を満たすことが好ましい。

本発明のインスリンの検出方法では、上記第１の複合体は、上記第１のポリペプチドのアミノ末端に上記発光物質または上記蛍光物質が連結されたものであることが好ましい。

本発明のインスリンの検出方法では、上記第２の複合体は、上記第２のポリペプチドのカルボキシル末端に上記発光物質または上記蛍光物質が連結されたものであることが好ましい。

本発明のインスリンの検出方法では、上記第１の複合体、および、上記第２の複合体は、リンカーによって互いに結合して、第３の複合体を形成していることが好ましい。

本発明のインスリンの検出方法では、上記第３の複合体は、支持体の表面に結合していることが好ましい。

本発明のインスリンの検出キットは、上記課題を解決するために、インスリンレセプターのα−ＣＴセグメントを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第１のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させた第１の複合体と、インスリンレセプターのＬ１ドメインを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第２のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させた第２の複合体と、を備えており、上記発光物質および上記蛍光物質は、当該発光物質と当該蛍光物質との間で生じる発光共鳴エネルギー転移によって蛍光を発生させるものであり、上記第１のポリペプチドに発光物質が連結されている場合には、上記第２のポリペプチドに蛍光物質が連結されており、上記第１のポリペプチドに蛍光物質が連結されている場合には、上記第２のポリペプチドに発光物質が連結されていることを特徴としている。

本発明のインスリンの検出キットでは、上記第１の複合体、および、上記第２の複合体は、リンカーによって互いに結合して、第３の複合体を形成していることが好ましい。

本発明のインスリンの検出キットは、上記第３の複合体が表面に結合している支持体を備えていることが好ましい。

本発明は、抗体の作製作業、膜タンパク質の精製作業、変性し易い膜タンパク質の保存作業、等の煩雑な作業を必要としないので、簡便にインスリンを検出することができるという効果を奏する。

本発明に用いる第１の複合体および第２の複合体は、純度高く精製され得る。それ故に、本発明は、夾雑物が少ない状態でインスリンを検出することができるという効果を奏する。つまり、本発明は、夾雑物の影響を受けること無く、インスリンを検出することができるという効果を奏する。

本発明の実施例における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のポリアクリルアミドゲルの染色像である。 本発明の実施例において、第１の複合体の量と第２の複合体の量との比率を変えた場合の、一定のインスリン濃度下におけるＢＲＥＴ効率の値をプロットしたグラフである。 本発明の実施例において、インスリン濃度の値に対してＢＲＥＴ効率の値をプロットしたグラフである。 本発明の実施例において、生体からインスリンを分泌させた場合の、ＢＲＥＴ効率の変化を示すグラフである。 本発明の実施例における、発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光の測定結果を示すグラフである。 本発明の実施例における、発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光の測定結果を示すグラフである。 本発明の実施例における、発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光の測定結果を示すグラフである。 インスリンレセプターの構造の概略を示す図である。 （ａ）は、本発明の実施例における、精製前のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した後のポリアクリルアミドゲルの染色像であり、（ｂ）は、本発明の実施例における、精製後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した後のポリアクリルアミドゲルの染色像である。 本発明の実施例における、発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光の測定結果を示すグラフである。 （ａ）および（ｂ）は、本発明の実施例において、インスリン濃度の値に対してＢＲＥＴ効率の値をプロットしたグラフである。 本発明の実施例における、発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光の測定結果を示すグラフである。 本発明の実施例における、発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光の測定結果を示すグラフである。 本発明の実施例における、センサー細胞およびインスリン分泌細胞の共培養の像である。 本発明の実施例における、インスリンが存在しない場合のセンサー細胞が示すＢＲＥＴ効率の変化を示すイメージデータである。 本発明の実施例における、インスリンが存在する場合のセンサー細胞が示すＢＲＥＴ効率の変化を示すイメージデータである。 （ａ）は、本発明の実施例における、インスリンが存在しない場合のセンサー細胞のイメージデータと、ＢＲＥＴ効率の平均値の算出に用いた領域を示し、（ｂ）は、本発明の実施例における、インスリンが存在しない場合のセンサー細胞が示す上記領域内のＢＲＥＴ効率の平均値の変化を数値化したグラフであり、（ｃ）は、本発明の実施例における、インスリンが存在する場合のセンサー細胞のイメージデータと、ＢＲＥＴ効率の平均値の算出に用いた領域を示し、（ｄ）は、本発明の実施例における、インスリンが存在する場合のセンサー細胞が示す上記領域内のＢＲＥＴ効率の平均値の変化を数値化したグラフである。

本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。

〔１．インスリンの検出方法〕
本実施の形態のインスリンの検出方法は、試料と、インスリンレセプターのα−ＣＴセグメントを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第１のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させた第１の複合体と、インスリンレセプターのＬ１ドメインを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第２のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させた第２の複合体と、を含む溶液から、上記発光物質と上記蛍光物質との間で生じる発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光を検出する蛍光検出工程を含んでいる。以下に、各構成について説明する。

〔１−１．試料〕
上記試料は、インスリンを含むか否か試験される、および／または、インスリンをどの程度の量含むか試験される、試験対象である。それ故に、本実施の形態のインスリンの検出方法は、インスリンの定量方法であり得る。

上記試料がインスリンを含んでいれば、当該インスリンを介して、α−ＣＴセグメントとＬ１ドメインとが複合体を形成する。α−ＣＴセグメントとＬ１ドメインとが複合体を形成すれば、α−ＣＴセグメントに連結されている発光物質（または、蛍光物質）と、Ｌ１ドメインに連結されている蛍光物質（または、発光物質）とが、接近することになる。発光物質と蛍光物質とが接近すれば、発光物質から蛍光物質に向かって光が照射されるとともに、発光物質と蛍光物質との間で発光共鳴エネルギー転移が生じ、その結果、蛍光物質から蛍光が発生する。そして、当該蛍光を検出することによって、試料中に含まれるインスリンを検出、および／または、定量することができる。

上記試料の具体的な構成は、特に限定されず、人工的に作製されたサンプル（例えば、糖尿病治療薬などの薬剤）であってもよいし、生体から採取されたサンプルであってもよい。

〔１−２．第１の複合体〕
上記第１の複合体は、インスリンレセプターのα−ＣＴセグメントを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第１のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させたものである。

後述する第２の複合体において、第２のポリペプチドに発光物質が連結されている場合には、当該第１の複合体において、第１のポリペプチドには蛍光物質が連結されている。一方、第２の複合体において、第２のポリペプチドに蛍光物質が連結されている場合には、当該第１の複合体において、第１のポリペプチドには発光物質が連結されている。上記構成であれば、α−ＣＴセグメントとＬ１ドメインとが複合体を形成したときに、発光物質と蛍光物質とが接近できるので、効率よく蛍光を発生させることができる。

上記第１の複合体の構成成分である第１のポリペプチドは、インスリンレセプターのα−ＣＴセグメントを含んでいるポリペプチドである。α−ＣＴセグメントは、インスリンレセプターの細胞外ドメインであるαサブユニットの部分領域であって、インスリンに結合する能力を有しているとともに、膜貫通領域を含んでいない。なお、本発明におけるα−ＣＴセグメントの具体的な構成は特に限定されず、周知のあらゆるα−ＣＴセグメントであり得る。

また、上記第１の複合体の構成成分である第１のポリペプチドは、インスリンレセプターのβサブユニットを含んでいないポリペプチドである。βサブユニットは、インスリンレセプターの細胞内ドメインであって、膜貫通領域と、細胞外ドメインの一部とを含んでいる。そして、当該膜貫通領域の作用によって、インスリンレセプターは、細胞内で膜タンパク質として存在し得る。なお、本発明におけるβサブユニットの具体的な構成は特に限定されず、周知のあらゆるβサブユニットであり得る。

上述したように、第１のポリペプチドは、膜貫通領域を含んでいない。換言すれば、第１の複合体は、膜貫通領域を含んでいない。それ故に、第１の複合体は、可溶性タンパク質（換言すれば、非膜タンパク質）であり得るので、簡単に純度高く精製可能であり、取り扱いが容易であり、かつ、容易にインスリンおよび第２の複合体と複合体を形成することができる。

なお、本明細書中において、膜貫通領域とは、膜タンパク質が細胞膜上に配置されたときに、細胞膜の内部に埋め込まれるように配置される、膜タンパク質内の部分領域を意図する。多くの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸によって形成された構造、更に具体的には、疎水性アミノ酸によって形成されたαへリックス構造を有しているが、本明細書における膜貫通領域は、当該構造に限定されない。

上記第１の複合体の構成成分である第１のポリペプチドは、インスリンレセプターのα−ＣＴセグメントからなるものであってもよいし、インスリンレセプターのα−ＣＴセグメント以外の構成を含むものであってもよい。

第１のポリペプチドが、インスリンレセプターのα−ＣＴセグメント以外の構成を含む場合、当該構成は、膜貫通領域を含まない限り、如何なる構成であってもよい。当該構成としては、例えば、α−ＣＴセグメントと、発光物質または蛍光物質とを連結させるリンカーであってもよい。なお、当該リンカーは、ペプチド性のリンカーであってもよいし、非ペプチド性のリンカー（例えば、架橋剤）であってもよい。

第１のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させる場合、第１のポリペプチドのアミノ末端に発光物質または蛍光物質を連結させてもよいし、第１のポリペプチドのカルボキシル末端に発光物質または蛍光物質を連結させてもよい。

第１の複合体の構造を安定化させて、より良くインスリンの検出を行うという観点からは、第１の複合体が第１のポリペプチドのアミノ末端に発光物質または蛍光物質が連結されたものであることが好ましい。上記構成であれば、第１の複合体および第２の複合体に含まれる発光物質と蛍光物質との間の距離を短くして、効率よく発光共鳴エネルギー転移を起こすことができる。

更に具体的には、第１のポリペプチドのアミノ末端に発光物質を連結させる場合には、後述する第２のポリペプチドのカルボキシル末端に蛍光物質を連結させることが好ましく、第１のポリペプチドのアミノ末端に蛍光物質を連結させる場合には、後述する第２のポリペプチドのカルボキシル末端に発光物質を連結させることが好ましい。

第１のポリペプチドに連結させる発光物質および蛍光物質は、発光共鳴エネルギー転移によって蛍光を発生させ得るものであればよく、特に限定されないが、各々、発光タンパク質および蛍光タンパク質であることが好ましい。当該構成であれば、第１の複合体を１つの融合タンパク質（具体的には、第１のポリペプチドと、発光タンパク質または蛍光タンパク質との融合タンパク質）として形成できるので、周知の方法（例えば、融合タンパク質をコードしたポリヌクレオチドが挿入された発現ベクターを、所望の宿主に導入し、当該宿主内で、融合タンパク質を発現させる方法）によって、簡便に第１の複合体を作製することができる。更に、当該構成であれば、第１のポリペプチドと、発光物質または蛍光物質とを化学結合を介して連結させる操作や、連結した後の第１の複合体を精製する操作を不要にすることができる。

本明細書における発光物質は、発光現象に関わるあらゆる物質であり得る。例えば、酵素と基質との反応によって発光する場合には、発光物質は、酵素であっても良いし、当該酵素の基質であっても良い。より良くインスリンを検出するという観点から、発光物質は、酵素であることが好ましい。

発光物質の例としては、例えば、ルシフェラーゼを挙げることができる。ルシフェラーゼの例としては、例えば、ホタル由来のルシフェラーゼ、ウミシイタケ由来のルシフェラーゼ、および、トゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）由来のルシフェラーゼを挙げることができる。トゲオキヒオドシエビ由来のルシフェラーゼの例としては、ＮａｎｏＬｕｃ（Ｎｌｕｃ）（登録商標）、terbium chelate diethylenetriaminepentacetate-carbostyril 124−maleimidopropionic hydrazide （Tb-DTPA-cs124-EMPH）（例えば、Elise Burmeister Getz et al., Biophysical Journal, Volume 74, May 1998, p2451-2458参照）を挙げることができる。

蛍光物質の例としては、例えば、周知の蛍光タンパク質（例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、および、ＫｉｋｕｍｅＧＲ）を挙げることができる。

また、蛍光物質の例として、ＴＭＲ、ｄｉＡｃＦＡＭ、Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎを挙げることができる。これらの蛍光物質は、ＮａｎｏＬｕｃ（Ｎｌｕｃ）（登録商標）との間で生じる発光共鳴エネルギー転移によって蛍光を発生させることができる。また、蛍光物質の例として、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５を挙げることができる。これらの蛍光物質は、ホタル由来のルシフェラーゼとの間で生じる発光共鳴エネルギー転移によって蛍光を発生させることができる。

〔１−３．第２の複合体〕
上記第２の複合体は、インスリンレセプターのＬ１ドメインを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第２のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させたものである。

上述した第１の複合体において、第１のポリペプチドに蛍光物質が連結されている場合には、当該第２の複合体において、第２のポリペプチドには発光物質が連結されている。一方、第１の複合体において、第１のポリペプチドに発光物質が連結されている場合には、当該第２の複合体において、第２のポリペプチドには蛍光物質が連結されている。上記構成であれば、α−ＣＴセグメントとＬ１ドメインとが複合体を形成したときに、発光物質と蛍光物質とが接近できるので、効率よく蛍光を発生させることができる。

上記第２の複合体の構成成分である第２のポリペプチドは、インスリンレセプターのＬ１ドメインを含んでいるポリペプチドである。Ｌ１ドメインは、インスリンレセプターの細胞外ドメインであるαサブユニットの部分領域であって、インスリンに結合する能力を有しているとともに、膜貫通領域を含んでいない。なお、本発明におけるＬ１ドメインの具体的な構成は特に限定されず、周知のあらゆるＬ１ドメインであり得る。

また、上記第２の複合体の構成成分である第２のポリペプチドは、インスリンレセプターのβサブユニットを含んでいないポリペプチドである。βサブユニットは、インスリンレセプターの細胞内ドメインであって、膜貫通領域と、細胞外ドメインの一部とを含んでいる。そして、当該膜貫通領域の作用によって、インスリンレセプターは、細胞内で膜タンパク質として存在し得る。なお、本発明におけるβサブユニットの具体的な構成は特に限定されず、周知のあらゆるβサブユニットであり得る。

上述したように、第２のポリペプチドは、膜貫通領域を含んでいない。換言すれば、第２の複合体は、膜貫通領域を含んでいない。それ故に、第２の複合体は、可溶性タンパク質（換言すれば、非膜タンパク質）であり得るので、簡単に純度高く精製可能であり、取り扱いが容易であり、かつ、容易にインスリンおよび第１の複合体と複合体を形成することができる。

上記第２の複合体の構成成分である第２のポリペプチドは、インスリンレセプターのＬ１ドメインからなるものであってもよいし、インスリンレセプターのＬ１ドメイン以外の構成を含むものであってもよい。

第２のポリペプチドが、インスリンレセプターのＬ１ドメイン以外の構成を含む場合、当該構成は、膜貫通領域を含まない限り、如何なる構成であってもよい。当該構成としては、例えば、Ｌ１ドメインと、発光物質または蛍光物質とを連結させるリンカーであってもよい。なお、当該リンカーは、ペプチド性のリンカーであってもよいし、非ペプチド性のリンカー（例えば、架橋剤）であってもよい。

第２のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させる場合、第２のポリペプチドのアミノ末端に発光物質または蛍光物質を連結させてもよいし、第２のポリペプチドのカルボキシル末端に発光物質または蛍光物質を連結させてもよい。

第２の複合体の構造を安定化させて、より良くインスリンの検出を行うという観点からは、第２の複合体は、第２のポリペプチドのカルボキシル末端に発光物質または蛍光物質が連結されたものであることが好ましい。上記構成であれば、第１の複合体および第２の複合体に含まれる発光物質と蛍光物質との間の距離を短くして、効率よく発光共鳴エネルギー転移を起こすことができる。

更に具体的には、第２のポリペプチドのカルボキシル末端に発光物質を連結させる場合には、上述した第１のポリペプチドのアミノ末端に蛍光物質を連結させることが好ましく、第２のポリペプチドのカルボキシル末端に蛍光物質を連結させる場合には、上述した第１のポリペプチドのアミノ末端に発光物質を連結させることが好ましい。

第２のポリペプチドに連結させる発光物質および蛍光物質は、発光共鳴エネルギー転移によって蛍光を発生させ得るものであればよく、特に限定されないが、各々、発光タンパク質および蛍光タンパク質であることが好ましい。当該構成であれば、第２の複合体を１つの融合タンパク質（具体的には、第２のポリペプチドと、発光タンパク質または蛍光タンパク質との融合タンパク質）として形成できるので、周知の方法（例えば、融合タンパク質をコードしたポリヌクレオチドが挿入された発現ベクターを、所望の宿主に導入し、当該宿主内で、融合タンパク質を発現させる方法）によって、簡便に第２の複合体を作製することができる。

第２のポリペプチドに連結させる発光物質および蛍光物質としては、第１のポリペプチドに連結させ得る発光物質および蛍光物質として説明したものと同じものを用いることができる。これら発光物質および蛍光物質の具体例については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。

〔１−４．第１の複合体、および、第２の複合体の実施形態の一例〕
第１の複合体、および、第２の複合体は、各々が分離した物質であってもよいが、リンカーによって互いに結合して一体化された、第３の複合体を形成していてもよい。

第１の複合体および第２の複合体がリンカーによって互いに結合していれば、第１の複合体と第２の複合体とが（換言すれば、α−ＣＴセグメントとＬ１ドメインとが）、常に近くに存在することができる。この場合、例えば、α−ＣＴセグメントを含む第１の複合体にインスリンが結合すれば、当該インスリンに対して、Ｌ１ドメインを含む第２の複合体も効率よく結合することができる。その結果、インスリン濃度が低い場合であっても、発光共鳴エネルギー転移を効率よく生じさせ、その結果、効率よく蛍光物質から蛍光を発生させることができる。

この場合、リンカーが結合する第１の複合体内の領域と、リンカーが結合する第２に複合体内の領域とは、特に限定されない。例えば、（ｉ）第１の複合体内の発光物質または蛍光物質と、第２の複合体内の第２のポリペプチドとを、リンカーによって結合してもよいし、（ｉｉ）第１の複合体内の発光物質または蛍光物質と、第２の複合体内の発光物質または蛍光物質とを、リンカーによって結合してもよいし、（ｉｉｉ）第１の複合体内の第１のポリペプチドと、第２の複合体内の第２のポリペプチドとを、リンカーによって結合してもよいし、（ｉｖ）第１の複合体内の第１のポリペプチドと、第２の複合体内の発光物質または蛍光物質とを、リンカーによって結合してもよい。より構造が安定した第３の複合体を実現するという観点からは、上述した（ｉ）〜（ｉｖ）の中では、（ｉｉｉ）が最も好ましい。

リンカーは、第１の複合体と第２の複合体とを結合させ得るものであればよく、その具体的な構成は、特に限定されない。リンカーとしては、例えば、ポリペプチドを挙げることができる。ポリペプチドのリンカーを用いれば、第３の複合体を１つのタンパク質（例えば、第１の複合体と、リンカーと、第２の複合体との融合タンパク質）として構成することができる。そして、当該構成であれば、周知の方法にて当該融合タンパク質の発現ベクターを作製し、当該発現ベクターを所望の宿主に導入することによって、融合タンパク質を容易に作製することができる。

リンカーとしてポリペプチドを用いる場合、当該リンカーを構成するアミノ酸の数は特に限定されない。より低濃度のインスリンの濃度を測定するという観点からは、リンカーを構成するアミノ酸の数は、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、２５個以上、２６個以上、２７個以上、２８個以上、２９個以上、３０個以上、３１個以上、３２個以上、３３個以上、または、３４個以上であることが好ましい。これらの場合、リンカーを構成するアミノ酸の数の上限値は、特に限定されない（例えば、１００、または、１００以上の任意の整数）。

リンカーが短すぎると（例えば、リンカーを構成するアミノ酸の数が１９個以下）、インスリンが存在しなくても発光物質と蛍光物質との間の距離が短く保たれ、発光物質と蛍光物質との間で発光共鳴エネルギー転移が生じ、その結果、蛍光が発生する。つまり、リンカーが短すぎると、インスリンを検出する際のバックグラウンドの蛍光の強度が上昇する傾向を示す。それ故に、感度良くインスリンを検出するという観点から、リンカーは、上述した長さを有するものであることが好ましい。

リンカーとしてポリペプチドを用いる場合、当該リンカーを構成するアミノ酸の種類は、特に限定されない。より低濃度のインスリンの濃度を測定するという観点から、リンカーは、立体構造の自由度が高いアミノ酸によって構成されていることが好ましい。より具体的に、リンカーは、（ｉ）脂肪酸の側鎖を有するアミノ酸である、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸；水酸基を含む側鎖を有するアミノ酸である、セリン、スレオニンおよびチロシンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸；並びに、酸またはアミドを含む側鎖を有するアミノ酸である、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸およびグルタミンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸、によって構成されているものであってもよいし、（ｉｉ）脂肪酸の側鎖を有するアミノ酸である、グリシン、アラニンおよびロイシンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸；水酸基を含む側鎖を有するアミノ酸であるセリン；並びに、酸を含む側鎖を有するアミノ酸であるグルタミン酸によって構成されているものであってもよいし、（ｉｉｉ）グリシン、アラニン、セリン、ロイシンおよびグルタミン酸によって構成されているものであってもよいし、（ｉｖ）「ASSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSAGSGGLE（配列番号１４）」にて示されるポリペプチドを少なくとも一部分として含むものであってもよい。

第３の複合体は、支持体（例えば、ガラス基板、ビーズ、ゲル、細胞、または、細胞外マトリクス）の表面に結合し得る。第１の複合体および第２の複合体を第３の複合体として一体化すれば、第１の複合体と第２の複合体とを、互いにとって良好な配置を保ちながら、支持体の表面に結合させることができる。そして、当該支持体を用いれば、感度良くインスリンを検出することができる。

第３の複合体を支持体の表面に結合させる方法は、特に限定されず、架橋剤によって第３の複合体と支持体とを結合させてもよいし、第３の複合体が備えるタグによって第３の複合体と支持体とを結合させてもよいし、支持体が備えるタグによって第３の複合体と支持体とを結合させてもよい。

第３の複合体を支持体の１つである細胞の表面に結合させる方法としては、特に限定されない。例えば、第３の複合体の発現ベクターを細胞に導入し、第３の複合体を細胞内で発現させることによって、第３の複合体を細胞の表面に結合させてもよい。この場合、後述するタグの作用によって、第３の複合体を細胞の表面に結合させてもよいし、後述するタグの作用によらずに、第３の複合体を細胞の表面に結合させてもよい。

また、第３の複合体と細胞とを混合することによって、第３の複合体を細胞の表面に結合させてもよい。この場合、後述するタグの作用によって、第３の複合体を細胞の表面に結合させてもよいし、後述するタグの作用によらずに、第３の複合体を細胞の表面に結合させてもよい。

後述する実施例に示すように、本発明者は、（ｉ）第３の複合体は、構造的に安定であって、所望の細胞内で大量に発現し得ること、（ｉｉ）第３の複合体に対して人工的にタグ（具体的には、細胞膜に結合するタグ）を結合させた場合、タグが結合した第３の複合体は、構造的に不安定化すること無く、所望の細胞内で大量に発現し得ること、（ｉｉｉ）タグが結合した第３の複合体は、タグの作用によって細胞の表面に存在し、当該細胞の近傍に存在する別の細胞によって生産されるインスリンを検出し得ること、を見出した。それ故に、第３の複合体には、細胞膜に結合するためのタグが結合されていてもよい。

タグは、細胞膜に結合するものであればよく、具体的な構成は特に限定されない。タグは、ポリペプチドであることが好ましい。ポリペプチドのタグを用いれば、第３の複合体とタグとを１つのタンパク質（例えば、第１の複合体と、リンカーと、第２の複合体と、タグとの融合タンパク質）として構成することができる。そして、当該構成であれば、周知の方法にて当該融合タンパク質の発現ベクターを作製し、当該発現ベクターを所望の宿主に導入することによって、宿主の細胞膜に結合している融合タンパク質を容易に作製することができる。

タグの具体例としては、膜タンパク質（例えば、ＰＤＧＦ（platelet-derived growth factor）レセプター、β２ adrenergic receptor（β２ＡＲ）（例えば、John Holleran et al., Fluorogen-Activating Proteins as Biosensors of Cell-Surface Proteins in Living Cells, Journal of the International Society for Advancement of Cytometry, Cytometry PART A, Vol.77A, 776-782, 2010参照）、ＥＧＦ（Epidermal growth factor）レセプター、インスリンレセプター、ＶＧＦ（vascular endothelial cell growth factor）レセプター、ＦＧＦ（fibroblast growth factor）レセプター、または、ＤＤＲ（discodin domain receptor））の膜貫通領域を挙げることができる。

第３の複合体内のタグが結合される箇所は、特に限定されない。ポリペプチドのタグを用いて第３の複合体とタグとを１つのタンパク質として構成する場合には、第３の複合体の構造をより安定化させるという観点から、第３の複合体のアミノ末端またはカルボキシル末端にタグを結合させることが好ましい。

〔１−５．蛍光検出工程〕
上記蛍光検出工程は、試料と、第１の複合体と、第２の複合体と、を含む溶液から、発光物質と蛍光物質との間で生じる発光共鳴エネルギー転移によって減少する光と発生する蛍光とを検出する工程である。

例えば、上記蛍光検出工程において蛍光が検出されれば（または、元来発光物質が有する発光能の減少と、蛍光の増強と、が検出されれば）、試料中にインスリンが含まれていると判定することができる。一方、上記蛍光検出工程において蛍光が検出されなければ（または、元来発光物質が有する発光能の減少と、蛍光の増強と、が検出されなければ）、試料中にインスリンが含まれていないと判定することができる。

上記蛍光検出工程において検出される蛍光の波長は、特に限定されず、発光物質と蛍光物質との組み合わせに応じて、適宜設定することができる。

上記蛍光検出工程において検出される蛍光の波長（ピーク波長：Ａ（ｎｍ））は、発光物質が発する光の波長（ピーク波長：Ｂ（ｎｍ））から離れているほど好ましい。例えば、（Ａ−Ｂ）の絶対値が、５０以上であることが好ましく、６０以上であることが更に好ましく、７０以上であることが更に好ましく、８０以上であることが最も好ましい。当該絶対値の上限は、特に限定されないが、例えば、蛍光検出装置の検出能力を考慮すれば、１００であってもよいし、１５０であってもよい。上記構成であれば、検出される蛍光の強度、および、発光物質が発する光の強度の各々を正確に測定することができるので、より正確にインスリンを検出することができる。

上記溶液中における、第１の複合体の濃度（Ｍ１）、および、第２の複合体の濃度（Ｍ２）は特に限定されないが、第１の複合体と第２の複合体とがリンカーによって互いに結合していない場合には、５０≦Ｍ２／Ｍ１≦２００が好ましく、１００≦Ｍ２／Ｍ１≦２００が更に好ましく、１５０≦Ｍ２／Ｍ１≦２００が更に好ましい。上記構成であれば、溶液中に存在するインスリンの検出感度を上げることができるとともに、溶液中に存在するインスリンの量をより精度よく定量することができる。

上記蛍光検出工程は、検出された蛍光のピーク波長における発光値から、試料中に含まれるインスリンの濃度を算出する、濃度算出工程を含んでいてもよい。更に具体的に上記蛍光検出工程は、検出された蛍光のピーク波長における発光値、および、予め作成された検量線から、試料中に含まれるインスリンの濃度を算出する、濃度算出工程を含んでいてもよい。以下に、濃度算出工程の一例を説明するが、本発明は、当該例に限定されない。

まず、蛍光検出工程に先立って、検量線を作成する。

具体的には、既知の濃度のインスリン、第１の複合体、および、第２の複合体を含む、インスリンの濃度が異なる複数種類のサンプル溶液を準備する。そして、各サンプル溶液について、発光物質と蛍光物質との間で生じる発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光のピーク波長における発光値と、発光物質が発する光のピーク波長における発光値と、を測定する。

次いで、下記計算式（１）にしたがって、各サンプル溶液について、ＢＲＥＴ効率の指標であるＢＲＥＴ Ｕｎｉｔを算出する；
［（発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光のピーク波長における発光値）−（発光物質が発する光のピーク波長における発光値）×Ｃｆ］／（発光物質が発する光のピーク波長における発光値） ・・・・・・計算式（１）
但し、Ｃｆは、同じ実験条件下で、発光物質を含む第１の複合体、または、発光物質を含む第２の複合体のみを用いて得られた、（発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光のピーク波長における発光値）／（発光物質が発する光のピーク波長における発光値）の値である。

次いで、Ｘ−Ｙ座標上で、既知のインスリン濃度をＸ軸に、算出されたＢＲＥＴ ＵｎｉｔをＹ軸にプロットすることによって、検量線を作成することができる。

上記蛍光検出工程では、未知の濃度のインスリンを含む試料と、第１の複合体と、第２の複合体と、を含む溶液から、発光物質と蛍光物質との間で生じる発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光を検出する。そして、当該検出データを上述した計算式（１）に代入することによって、ＢＲＥＴ Ｕｎｉｔを計算する。そして、当該ＢＲＥＴ Ｕｎｉｔの値を検量線に代入することによって、試料に含まれていたインスリンの濃度を決定することができる。

〔２．インスリンの検出キット〕
本実施の形態のインスリンの検出キットは、インスリンレセプターのα−ＣＴセグメントを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第１のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させた第１の複合体と、インスリンレセプターのＬ１ドメインを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第２のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させた第２の複合体と、を備えているものである。

更に、本実施の形態のインスリンの検出キットは、上記発光物質および上記蛍光物質が、当該発光物質と当該蛍光物質との間で生じる発光共鳴エネルギー転移によって蛍光を発生させるものである。

更に、本実施の形態のインスリンの検出キットは、上記第１のポリペプチドに発光物質が連結されている場合には、上記第２のポリペプチドに蛍光物質が連結されており、上記第１のポリペプチドに蛍光物質が連結されている場合には、上記第２のポリペプチドに発光物質が連結されているものである。

上記第１の複合体がポリペプチドである場合には、インスリンの検出キットに備えられている第１の複合体は、第１の複合体をコードするポリヌクレオチドが転写可能に挿入された発現ベクターの形態であってもよい。同様に、上記第２の複合体がポリペプチドである場合には、インスリンの検出キットに備えられている第２の複合体は、第２の複合体をコードするポリヌクレオチドが転写可能に挿入された発現ベクターの形態であってもよい。

本実施の形態のインスリンの検出キットでは、上記第１の複合体、および、上記第２の複合体は、リンカーによって互いに結合して、第３の複合体を形成しているものであってもよい。

上記第１の複合体、リンカー、および、第２の複合体がポリペプチドである場合（換言すれば、第３の複合体が、第１の複合体と、リンカーと、第２の複合体との融合タンパク質である場合）には、インスリンの検出キットには、第３の複合体をコードするポリヌクレオチドが転写可能に挿入された発現ベクターが備えられていてもよい。

本実施の形態のインスリンの検出キットでは、第３の複合体が表面に結合している支持体（例えば、ガラス基板、ビーズ、ゲル、細胞、または、細胞外マトリクス）を備えていてもよい。

上記第１の複合体、リンカー、第２の複合体、および、タグがポリペプチドである場合（換言すれば、第１の複合体と、リンカーと、第２の複合体と、タグとが、１つの融合タンパク質を形成している場合）には、インスリンの検出キットには、当該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが転写可能に挿入された発現ベクターが備えられていてもよい。

上記第１の複合体、第２の複合体、リンカー、および、タグの詳細については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。

本実施例において、所望のポリペプチドを「Ａポリペプチド−Ｂポリペプチド」と記載した場合、当該所望のポリペプチドでは、Ｂポリペプチドのアミノ末端に、Ａポリペプチドが連結されていることを意図する。

＜１．融合タンパク質の作製および精製＞
まず、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」を発現させるためのプラスミド、および、「Ｌ１−ＹＰｅｔ」を発現させるためのプラスミドを作製した。これらの発現プラスミドの作製方法について説明する。

本実施例のαＣＴとしては、配列番号１に示すＤＮＡ配列にてコードされ、かつ、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するαＣＴを用いた。一方、本実施例のＬ１としては、配列番号３に示すＤＮＡ配列にてコードされ、かつ、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＬ１を用いた。

周知の方法にしたがって、Ｎｌｕｃ（ＤＮＡ配列：配列番号５、アミノ酸配列：配列番号６）の発現プラスミドであるｐＮＬ １．１ ［Ｎｌｕｃ］（Promega）を鋳型として用いたＰＣＲによって、ＮｌｕｃをコードしているＤＮＡ配列を増幅し、当該ＤＮＡ配列を、動物細胞用の発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｂ（Life Technologies））内にクローニングした。

次いで、当該動物細胞用の発現プラスミド内にクローニングされたＮｌｕｃをコードしているＤＮＡ配列の３’末端側に、配列番号１に示すＤＮＡ配列をインフレームにて挿入し、融合タンパク質である「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」を発現するためのプラスミドを作製した。なお、当該プラスミドによって発現される「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」は、細胞外分泌シグナル（ＤＮＡ配列：配列番号９、アミノ酸配列：配列番号１０）と、精製を容易にするためのＨｉｓ ｔａｇ（ＤＮＡ配列：配列番号１１、アミノ酸配列：配列番号１２）と、が連結された状態になっている。上記細胞外分泌シグナルの大部分は、融合タンパク質である「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」の精製過程で分解および除去される。

また、周知の方法にしたがって、ＹＰｅｔ（ＤＮＡ配列：配列番号７、アミノ酸配列：配列番号８）の発現プラスミドであるuntargeted Aurora B FRET sensor Kif2 substrate（Addgene plasmid 45215）を鋳型として用いたＰＣＲによって、ＹＰｅｔをコードしているＤＮＡ配列を増幅し、当該ＤＮＡ配列を、動物細胞用の発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｂ（Life Technologies））内にクローニングした。

次いで、当該動物細胞用の発現プラスミド内にクローニングされたＹＰｅｔをコードしているＤＮＡ配列の５’末端側に、配列番号３に示すＤＮＡ配列をインフレームにて挿入し、融合タンパク質である「Ｌ１−ＹＰｅｔ」を発現するためのプラスミドを作製した。なお、当該プラスミドによって発現される「Ｌ１−ＹＰｅｔ」は、細胞外分泌シグナル（ＤＮＡ配列：配列番号９、アミノ酸配列：配列番号１０）と、精製を容易にするためのＨｉｓ ｔａｇ（ＤＮＡ配列：配列番号１１、アミノ酸配列：配列番号１２）と、が連結された状態になっている。上記細胞外分泌シグナルの大部分は、融合タンパク質である「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」の精製過程で分解および除去される。

次いで、上述したプラスミド、および、Expi293 Expression System（Life Technologies）を用いて、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」および「Ｌ１−ＹＰｅｔ」を発現させた。各タンパク質は、分泌シグナルによって培養に用いている培地中へ放出されると共に、分泌シグナル部分は、切断される。

まず、マニュアルに従い、３０ｍＬの培地を用いて培養中のＥｘｐｉ２９３細胞（７．５×１０^７ｃｅｌｌｓ）を、各プラスミドを用いてトランスフェクションした。

トランスフェクションしてから７日後に、培養液の上清を回収した。上清をヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）アフィニティークロマトグラフィー用のバッファー（２０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）に対して透析した後、透析後の上清を、His-Trap EF column（GE healthcare）に供し、透析後の上清に含まれている目的のタンパク質（具体的には、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」および「Ｌ１−ＹＰｅｔ」）をHis-Trap EF columnに吸着させた。その後、イミダゾール濃度勾配法によって、His-Trap FF columnから目的タンパク質を溶出させた。

得られた溶出液をTris-HCl buffer（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐＨ８．０）、または、KREBS-Ringer buffer（Sigma-Aldrich）に対して透析した。

透析後の溶出液中に含まれるタンパク質の濃度をMicro BCA Kit（Thermo Scientific）を用いて決定した後、２００ｎｇのタンパク質に相当する透析後の溶出液（１レーンあたり）を、１２%のポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、溶出液中に含まれる目的タンパク質の純度を確認した。

図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のポリアクリルアミドゲルをQuick-CBB PLUS（Wako）を用いて染めた結果を示す写真である。図１に示すように、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」および「Ｌ１−ＹＰｅｔ」を純度高く精製することができた。

なお、上記と同様の方法にしたがって「αＣＴ−Ｎｌｕｃ」および「ＹＰｅｔ−Ｌ１」を作製したが、取得できた「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」および「Ｌ１−ＹＰｅｔ」の量と比較して、取得できた「αＣＴ−Ｎｌｕｃ」および「ＹＰｅｔ−Ｌ１」の量は、少なかった（図示せず）。

＜２．第１の複合体の濃度、および、第２の複合体の濃度に関する検討＞
KREBS-Ringer Buffer中で、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」（最終濃度０．５μＭ）、「Ｌ１−ＹＰｅｔ」（最終濃度０μＭ、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、３０μＭ、５０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、または、１５０μＭ）、インスリン（Life Technologies、最終濃度１０μＭ）を、合計１００μＬとなるように混合し、２５℃にて３０分間静置した。

その後、上述した混合液に１μＬのNano-Glo Luciferase Assay Substrateを加え、直ちに、波長４４５ｎｍにおける発光値と、波長５２８ｎｍにおける発光値とをマイクロプレートリーダー（Spectra-Max M5, Molecular Devices Japan, Tokyo, Japan）にて測定した。

ＢＲＥＴ効率の指標であるＢＲＥＴ Ｕｎｉｔは、測定した発光値に基づいて、以下の計算式（２）を用いて算出した。

［（波長５２８ｎｍにおける発光値）−（波長４４５ｎｍにおける発光値）×Ｃｆ］／（波長４４５ｎｍにおける発光値） ・・・・・・計算式（２）
但し、Ｃｆは、同じ実験条件下で「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」のみを用いて得られた（波長５２８ｎｍにおける発光値）／（波長４４５ｎｍにおける発光値）の値である。

図２に、試験結果を示す。溶液中に存在するインスリンの検出感度を上げるとともに、溶液中に存在するインスリンの量をより精度よく定量するという観点から、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」の濃度をＭ１、「Ｌ１−ＹＰｅｔ」をＭ２としたとき、５０≦Ｍ２／Ｍ１≦２００が好ましく、１００≦Ｍ２／Ｍ１≦２００が更に好ましく、１５０≦Ｍ２／Ｍ１≦２００が更に好ましく、Ｍ２／Ｍ１＝２００が最も好ましいことが明らかになった。

＜３．インスリンの定量＞
KREBS-Ringer Buffer中で「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」（最終濃度０．５μＭ）、「Ｌ１−ＹＰｅｔ」（最終濃度１００μＭ）、インスリン（Life Technologies、様々な最終濃度）を、合計１００μＬとなるように混合し、２５℃にて３０分間静置した。

その後、上述した混合液に１μＬのNano-Glo Luciferase Assay Substrate（Promega）を加え、直ちに、波長４４５ｎｍにおける発光値と、波長５２８ｎｍにおける発光値とをマイクロプレートリーダー（Spectra-Max M5, Molecular Devices Japan, Tokyo, Japan）にて測定した。

ＢＲＥＴ効率の指標であるＢＲＥＴ Ｕｎｉｔは、測定した発光値に基づいて、上述した計算式（２）を用いて算出した。

図３に試験結果を示す。図３に示すように、本発明であれば、インスリンを精度よく定量できることが明らかになった。

例えば、インスリンの濃度が不明であるサンプルの実測値に基づいてＢＲＥＴ効率を算出すれば、当該ＢＲＥＴ効率の値を図３に例示する検量線に当てはめれば、当該サンプルに含まれるインスリンの濃度を決定することができる。

また、本試験におけるインスリンの検出限界濃度は、８００ｎＭであった。

＜４．生体から分泌されるインスリンの検出＞
マウスインスリノーマＭＩＮ６細胞（非特許文献３および４など参照）を、１０％（ｖ／ｖ）のHeat-inactivated fetal bovine serum（Thermo Scientific）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Wako, Osaka, Japan）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン（Life Technologies）、および、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Life Technologies）を含むdulbecco’s modified eagle’s medium（Life Technologies）中にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で培養した。

平面培養中の１×１０^７ｃｅｌｌｓのＭＩＮ６細胞をトリプシン処理によって回収した後、当該ＭＩＮ６細胞をKREBS-Ringer Bufferを用いて洗浄した。KREBS-Ringer Buffer中に懸濁された洗浄後のＭＩＮ６細胞と、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ」（最終濃度０．５μＭ）および「Ｌ１−ＹＰｅｔ」（最終濃度１００μＭ）と、を混合した。

上述した混合液に対して、Nano-Glo Luciferase Assay Substrate（Promega）を２．５μＬ加えた後、更に、当該混合液に、（ｉ）グルコース（最終濃度０ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、または、２５ｍＭ）を含むKREBS-Ringer Buffer、（ｉｉ）ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ（最終濃度３μＭ）を含むKREBS-Ringer Buffer、または、（ｉｉｉ）ｄｉａｚｏｘｉｄｅ（最終濃度１０μＭ）とグルコース（最終濃度２５ｍＭ）とを含むKREBS-Ringer Buffer、を全量が５０μＬになるように混合した。なお、「ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ」は、インスリンの分泌を促進する試薬であり、「ｄｉａｚｏｘｉｄｅ」は、インスリンの分泌を抑制する試薬である。

その後、直ちに、波長４４５ｎｍにおける発光値と、波長５２８ｎｍにおける発光値とを、マイクロプレートリーダー（Spectra-Max M5, Molecular Devices Japan, Tokyo, Japan）にて１０秒毎に測定した。

ＢＲＥＴ効率の指標であるＢＲＥＴ Ｕｎｉｔは、測定した発光値に基づいて、上述した計算式（２）を用いて算出した。

図４に試験結果を示す。図４に示すように、本発明であれば、生体によって分泌されるインスリンであっても検出できることが明らかになった。

＜５．様々な発光物質、および、様々な蛍光物質を用いた試験＞
非特許文献１（John G. Menting et al., “How insulin engages its primary binding site on the insulin receptor” Nature, 10 January 2013, Vol.493, 241）に基づいて、インスリンレセプターにインスリンが結合したときのα−ＣＴセグメントとＬ１ドメインとの距離を、５ｎｍと予測した。

上述した５ｎｍの距離は、リンカー（アミノ酸配列：GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号１３））によって再現することができる。そして、当該リンカーを介して発光物質と蛍光物質とを直接連結させれば、本発明の第１の複合体および第２の複合体がインスリンを介して複合体を形成した時の、当該複合体内における発光物質および蛍光物質の状態を再現することができる。

そこで、上記リンカーを介して様々な発光物質と様々な蛍光物質とを直接連結した時に、発光共鳴エネルギー転移によって蛍光が発生するか否かを検討した。以下に、具体的な試験方法および試験結果について説明する。

本実施例では、発光物質として発光タンパク質（具体的には、Ｎｌｕｃ）を用い、蛍光物質として蛍光タンパク質（具体的には、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｙｐｅｔ）を用いた。

まず、周知の方法にしたがって、６種類の融合タンパク質（具体的には、「Ｎｌｕｃ−（ＧＧＧＧＳ）_３−ＥＹＦＰ」、「Ｎｌｕｃ−（ＧＧＧＧＳ）_３−Ｖｅｎｕｓ」、「Ｎｌｕｃ−（ＧＧＧＧＳ）_３−ＹＰｅｔ」、「ＥＹＦＰ−（ＧＧＧＧＳ）_３−Ｎｌｕｃ」、「Ｖｅｎｕｓ−（ＧＧＧＧＳ）_３−Ｎｌｕｃ」、「ＹＰｅｔ−（ＧＧＧＧＳ）_３−Ｎｌｕｃ」）の各々を発現するための発現ベクターを作製した。

ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のHeat‐inactivated fetal bovine serum（Thermo Scientific）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン（Life Technologies）、および、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Life Technologies）を含むHam’s F12 Nutrient Mixture（Life Technologies）中にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で培養した。

１×１０^６ｃｅｌｌｓのＣＨＯ−Ｋ１細胞を３．５ｃｍ Ｄｉｓｈへ播種し、翌日、Lipofectamin LTX（Life Technologies）を用いて、２．５μｇの各発現ベクターを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞へトランスフェクションした。

トランスフェクション操作の４８時間後に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を破砕し、発光測定を行った。具体的には、Nano-Glo Luciferase Assay Buffer（Promega）をＰＢＳで２倍希釈したものを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を破砕するための溶解液とした。トランスフェクションを行ったＣＨＯ−Ｋ１細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、上清液を捨て、ＣＨＯ−Ｋ１細胞のペレットを作製した。当該ペレットに上記溶解液を２００μＬ添加し、よく懸濁したものを細胞溶解液として回収した。９６ｗｅｌｌプレートへ細胞溶解液を１００μＬ添加し、当該細胞溶解液へNano-Glo Luciferase Assay Substrate（Promega）を５μＬ混合した後、直ちにマイクロプレートリーダー （Spectra-Max M5, Molecular Devices Japan, Tokyo, Japan）を用いて、４００ｎｍから６００ｎｍの発光スペクトルを測定した。

図５〜図７に、試験結果を示す。図５〜図７に示すデータは、実際に測定された発光値のデータを、発光物質が発する光の発光値（波長４４５ｎｍにおける発光値）で標準化したデータである。更に具体的に、図５〜図７に示すデータにおいて、波長４４５ｎｍ近傍の発光値は、発光物質が発する光の発光値であり、波長５２８ｎｍ近傍の発光値は、発光物質と蛍光物質との間で生じる発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光の発光値である。

図５〜図７から明らかなように、本発明に用いられる発光物質および蛍光物質の具体的な構成は限定されないことが明らかになった。更に、発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光の発光量を大きくするという観点、および、発光物質が発する光の波長と発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光の波長との差を大きくして、より良く蛍光を測定するという観点、からは、発光物質がＮｌｕｃであり蛍光物質がＶｅｎｕｓである組み合わせが好ましく、発光物質がＮｌｕｃであり蛍光物質がＹＰｅｔである組み合わせが更に好ましいことが明らかになった。

また、発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光の発光量を大きくするという観点から、第１の複合体は、第１のポリペプチドのアミノ末端に発光物質または蛍光物質が連結されたものであることが好ましく、第２の複合体は、第２のポリペプチドのカルボキシル末端に発光物質または蛍光物質が連結されたものであることが好ましいことが明らかになった。

＜６．第１の複合体と第２の複合体とを連結させるリンカーに関する試験＞
＜６−１．融合タンパク質の作製＞
まず、第１の複合体と第２の複合体とが、様々なリンカー（具体的には、ＡＳ（ＳＡＧＧ）₆ＳＡＧＳＧＧＬＥ（アミノ酸配列：配列番号１４）、または、ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ（アミノ酸配列：配列番号２５））を介して連結されているポリペプチドを発現するためのプラスミドを作製した。

具体的には、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」（アミノ酸配列：配列番号１５、ＤＮＡ配列：配列番号１６）を発現するためのプラスミド、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」（アミノ酸配列：配列番号１７、ＤＮＡ配列：配列番号１８）を発現するためのプラスミド、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」（アミノ酸配列：配列番号１９、ＤＮＡ配列：配列番号２０）を発現するためのプラスミド、および、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」（アミノ酸配列：配列番号２１、ＤＮＡ配列：配列番号２２）を発現するためのプラスミドを作製した。

なお、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」、および、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」の各々のアミノ末端には、細胞外分泌シグナルが連結され、カルボキシル末端には、Ｍｙｃ ｔａｇおよびＨｉｓ ｔａｇが連結されている。

プラスミド作製方法は、基本的に、上述した＜１．融合タンパク質の作製および精製＞に記載の方法と、周知の方法と、にしたがった。また、上述した＜１．融合タンパク質の作製および精製＞に記載の方法にしたがって、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」、および、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」を作製および精製した。また、上述した＜１．融合タンパク質の作製および精製＞に記載の方法にしたがって、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」、および、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」を作製し、これらについては精製を行わなかった。

上述したタンパク質を、１２%のポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質の純度を確認した。

図９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のポリアクリルアミドゲルをQuick-CBB PLUS（Wako）を用いて染めた結果の一部を示す写真である。更に具体的に、図９（ａ）は、精製前の「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」（図９（ａ）のレーン１）、および、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」（図９（ａ）のレーン２）の試験結果を示し、図９（ｂ）は、精製後の「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」（図９（ｂ）のレーン３）、および、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」（図９（ｂ）のレーン４）の試験結果を示している。

本試試験では「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」、および、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」の各々を純度高く精製することができた。

＜６−２．インスリンの定量＞
「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」、および、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」の各々を用いて、インスリンを定量した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。

（ｉ）「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」の試験方法
Tris-HCl buffer（Ph8.0）（+BSA）中で、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」（最終濃度５０ｎＭ）、および、インスリン（Life Technologies、様々な最終濃度）を、合計１００μＬとなるように混合し、２５℃にて２０分間静置した。

その後、上述した混合液に１μＬのNano-Glo Luciferase Assay Substrate（Promega） を加えて混合し、直ちに、波長４００ｎｍ〜６００ｎｍの発光スペクトル、または、波長４４５ｎｍにおける発光値と波長５２８ｎｍにおける発光値、をマイクロプレートリーダー（Spectra-Max M5, Molecular Devices Japan, Tokyo, Japan）にて測定した。

（ｉｉ）「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」および「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」の試験方法
上述した＜５．様々な発光物質、および、様々な蛍光物質を用いた試験＞に記載の方法にしたがって試験を行い、４００ｎｍから６００ｎｍの発光スペクトルを測定した。

ＢＲＥＴ効率の指標であるＢＲＥＴ Ｕｎｉｔは、測定した発光値に基づいて、以下の計算式（３）を用いて算出した。

［（波長５２８ｎｍにおける発光値）−（波長４４５ｎｍにおける発光値）×Ｃｆ］／（波長４４５ｎｍにおける発光値） ・・・・・・計算式（３）
但し、Ｃｆは、同じ実験条件下で「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」のみを用いて得られた（波長５２８ｎｍにおける発光値）／（波長４４５ｎｍにおける発光値）の値である。

図１０および１１に、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」の試験結果を示す。図１０に示すように、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」であれば、インスリンの濃度に依存して、波長４４５ｎｍにおける発光値に対する波長５２８ｎｍにおける発光値が上がること、換言すれば、インスリンを精度よく定量できることが明らかになった。また、図１１に示すように、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」を用いた場合のインスリン検出限界濃度は、５０ｎＭであった。一方、＜３．インスリンの定量＞の欄にて既に説明したように、第１の複合体と第２の複合体とをリンカーで連結しない場合のインスリン検出限界濃度は、８００ｎＭであった。つまり、第１の複合体と第２の複合体とをリンカーで連結した場合は、第１の複合体と第２の複合体とをリンカーで連結しない場合と比較して、インスリンの検出感度が飛躍的に向上することが明らかになった。

図１２に、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」の試験結果を示す。図１２に示すように、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」であれば、インスリンの存在に依存して、波長４４５ｎｍにおける発光値に対する波長５２８ｎｍにおける発光値が上がることが明らかになった。また、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」の場合には、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」の場合と比較して、同じインスリン濃度における発光値の値が低いこと（換言すれば、インスリンの検出感度が低いこと）が明らかになった。

図１３に、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」の試験結果を示す。図１３に示すように、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」の場合には、インスリンが高濃度存在しても、発光値が上がらないことが明らかになった。なお、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」の場合も、「Ｎｌｕｃ−Ｌ１−ＡＳ（ＧＧＧＧＳ）_３ＬＥ−αＣＴ−ＹＰｅｔ」と同様に、インスリンが高濃度存在しても、発光値が上がり難い傾向を示した（図示せず）。

＜７．センサー細胞＞
＜７−１．センサー細胞の作製＞
上述した「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ」発現させるためのプラスミドにおいて、ＹＰｅｔ遺伝子の３’末端側に、ＰＤＧＦ（platelet-derived growth factor）レセプターの膜貫通領域（以下、ＴＭＲ（Trans-membrane region）とも呼ぶ）をコードするＤＮＡをインフレームにて挿入して、「Ｎｌｕｃ−αＣＴ−ＡＳ（ＳＡＧＧ）_６ＳＡＧＳＧＧＬＥ−Ｌ１−ＹＰｅｔ−ＴＭＲ」（アミノ酸配列：配列番号２３、ＤＮＡ配列：配列番号２４）を発現させるためのプラスミドを作製した。上記プラスミドを制限酵素によって直鎖状にした後、当該プラスミドを常法にしたがって精製した。

Ｈｅｐａ１−６細胞を、２４ｗｅｌｌディッシュに、５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度にて播種した。

（ｉ）直鎖状にされたプラスミド５００ｎｇとＤＭＥＭ培地とを混合した溶液（合計２５μＬ）、および、（ｉｉ）Lipofectamine LTX（Lifetechnologies）２μＬとＤＭＥＭ培地とを混合した溶液（合計２５μＬ）、を作製した。

上述した（ｉ）および（ｉｉ）の溶液を混合し、当該混合溶液を室温（２５℃）で２０分間インキュベートした。

Ｈｅｐａ１−６細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、当該Ｈｅｐａ１−６細胞に、ＤＭＥＭ培地４５０μＬ、および、上記混合溶液５０μＬを添加した。続いて、当該Ｈｅｐａ１−６細胞を、３７℃で４８時間培養した。

その後、Ｈｅｐａ１−６細胞を、ＦＢＳ（１０％）およびＧ４１８（１０００μｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にて１週間以上培養し、安定的に形質転換されたＨｅｐａ１−６細胞株を取得した。

＜７−２．センサー細胞を用いたインスリンのイメージング＞
ガラスベースディッシュ（マツナミ ３５ｍｍマルチウェルガラスボトムディッシュ、直径９．５ｍｍ、４ｗｅｌｌ）に、１Ｎ ＮａＯＨ溶液を１００μＬ添加した。当該ガラスベースディッシュを、室温（２５℃）で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄することにより、ガラスベースディッシュの細胞接着面を親水性化した。次に、当該ガラスベースディッシュに、０．１％の濃度にてゼラチンＴｙｐｅ Ｂを含むＰＢＳを１００μＬ添加した後、当該ガラスベースディッシュを、３７℃にて１０分間インキュベートした。その後、ガラスベースディッシュをＰＢＳで１回洗浄した。

常法により培養したＭＩＮ６細胞（インスリン分泌細胞）をＰＢＳで洗浄した後、当該ＭＩＮ６細胞を、マニュアルに従いCellTracker^TM Blue CMF2HC Dye を用いて染色した。センサー細胞、および、ＭＩＮ６細胞の各々を、トリプシン処理によって培養皿から剥離し、各細胞を０．５×１０^５ｃｅｌｌｓずつ混合した後（合計１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、全細胞を上述したガラスベースディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で一晩培養した。

グルコース（最終濃度０ｍＭ、または、２５ｍＭ）を含むKREBS-Ringer buffer １００μＬに、 Nano-Glo Luciferase Assay Substrate １μＬを添加してよく混合し、反応溶液を作製した。

一晩培養した後のセンサー細胞およびＭＩＮ６細胞の混合培養物をＰＢＳで１回洗浄し、当該混合培養物に対して、上述した反応溶液を添加した。

当該混合培養物を直ちに蛍光顕微鏡にセットし、ＦＩＴＣ用のフィルターセットを用いて蛍光観察することによりＹＰｅｔを発現するセンサー細胞を同定し、ＤＡＰＩ用のフィルターセットを用いて蛍光観察することによりCellTracker^TM Blue CMF2HC Dyeで染色されたＭＩＮ６細胞を同定した（図１４参照）。

次に、励起光を遮断し、ＤＡＰＩ用のフィルターを介して観察される画像（Ｎｌｕｃ画像）と、ＦＩＴＣ用のフィルターを介して観察される画像（ＹＰｅｔ画像）とを、１０秒ごとに１時間、４０倍の対物レンズを用いて連続撮影した。取得した各画像からバックグラウンドを取り除いた後、各時間の各ピクセルについて「ＹＰｅｔ画像におけるシグナル強度／Ｎｌｕｃ画像におけるシグナル強度」を算出した。

上述した「ＹＰｅｔ画像におけるシグナル強度／Ｎｌｕｃ画像におけるシグナル強度」を、ＨＣ Ｉｍａｇｅ（浜松ホトニクス）を用いてカラーイメージ化した（図１５、および、図１６参照）。

さらに、細胞が含まれるように領域を設定し、その領域内に含まれるピクセルのシグナル強度の平均値の経時変化をプロットした（図１７参照）。

図１５〜図１７から明らかなように、センサー細胞は、ＭＩＮ６細胞によって分泌されるインスリンを検出することができた。

当該センサー細胞を用いれば、個々の細胞によるインスリンの分泌を検出することができる。例えば、１つの細胞をセンサー細胞によって取り囲んだ状態にてセンサー細胞の挙動を観察すれば、当該１つの細胞によるインスリンの分泌を検出することができる。

当該センサー細胞を用いれば、目的の細胞とセンサー細胞とを共培養することによって、目的の細胞によるインスリンの分泌を、容易に検出することができる。

当該センサー細胞を用いれば、目的の細胞とセンサー細胞とを三次元共培養することによって、より生体に近い環境下におけるインスリンの分泌を検出することができる。

当該センサー細胞を用いれば、センサー細胞を体内に含むキメラマウスを作製することができる。そして、当該キメラマウスを用いれば、より生体に近い環境下におけるインスリンの分泌を検出することができる。

本発明は、インスリンの存在を検出すること、および／または、インスリンの濃度を測定することが必要な、製薬分野および医療機器分野などに広く利用することができる。

Claims (9)

1. 試料と、インスリンレセプターのα−ＣＴセグメントを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第１のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させた第１の複合体と、インスリンレセプターのＬ１ドメインを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第２のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させた第２の複合体と、を含む溶液から、上記発光物質と上記蛍光物質との間で生じる発光共鳴エネルギー転移によって発生する蛍光を検出する蛍光検出工程を含み、
   上記第１のポリペプチドに発光物質が連結されている場合には、上記第２のポリペプチドに蛍光物質が連結されており、上記第１のポリペプチドに蛍光物質が連結されている場合には、上記第２のポリペプチドに発光物質が連結されていることを特徴とするインスリンの検出方法。
2. 上記溶液における、上記第１の複合体の濃度（Ｍ１）、および、上記第２の複合体の濃度（Ｍ２）が、５０≦Ｍ２／Ｍ１≦２００の関係を満たすことを特徴とする請求項１に記載のインスリンの検出方法。
3. 上記第１の複合体は、上記第１のポリペプチドのアミノ末端に上記発光物質または上記蛍光物質が連結されたものであることを特徴とする請求項１または２に記載のインスリンの検出方法。
4. 上記第２の複合体は、上記第２のポリペプチドのカルボキシル末端に上記発光物質または上記蛍光物質が連結されたものであることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のインスリンの検出方法。
5. 上記第１の複合体、および、上記第２の複合体は、リンカーによって互いに結合して、第３の複合体を形成していることを特徴とする請求項１、３または４に記載のインスリンの検出方法。
6. 上記第３の複合体は、支持体の表面に結合していることを特徴とする請求項５に記載のインスリンの検出方法。
7. インスリンレセプターのα−ＣＴセグメントを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第１のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させた第１の複合体と、インスリンレセプターのＬ１ドメインを含み、かつ、インスリンレセプターのβサブユニットを含まない第２のポリペプチドに、発光物質または蛍光物質を連結させた第２の複合体と、を備えており、
   上記発光物質および上記蛍光物質は、当該発光物質と当該蛍光物質との間で生じる発光共鳴エネルギー転移によって蛍光を発生させるものであり、
   上記第１のポリペプチドに発光物質が連結されている場合には、上記第２のポリペプチドに蛍光物質が連結されており、上記第１のポリペプチドに蛍光物質が連結されている場合には、上記第２のポリペプチドに発光物質が連結されていることを特徴とするインスリンの検出キット。
8. 上記第１の複合体、および、上記第２の複合体は、リンカーによって互いに結合して、第３の複合体を形成していることを特徴とする請求項７に記載のインスリンの検出キット。
9. 上記インスリンの検出キットは、上記第３の複合体が表面に結合している支持体を備えていることを特徴とする請求項８に記載のインスリンの検出キット。