JP6595991B2 - キャビテーションを誘発するポリマーナノ粒子 - Google Patents

Description

本明細書に開示される発明は、生物医学音響学（バイオメディカルアコースティックス、biomedical acoustics）の分野に関し、より具体的には、ナノスケールの慣性キャビテーション開始剤、ならびに治療方法および診断方法におけるその用途に関する。

限られた数のキャビテーション剤が知られており、それらとしては、脂質、蛋白質またはポリマーのコーティング内に被包されたミクロンサイズの気体（マイクロバブル、微小気泡）が挙げられる。マイクロバブルは、超音波などの適用された音波の負圧サイクルの間に拡大する。具体的な泡のサイズに対して負圧の振幅が十分に大きければ、泡は負圧サイクルの間に不安定に成長した後、波の正圧サイクルの間に崩壊する。周囲の液体の慣性効果の下でのほぼ即時の崩壊は機械的衝撃波を生成し、通常、広帯域のアコースティックエミッションが付随する。この慣性キャビテーションのプロセスは、様々な生物医学的および非生物医学的応用において有用であることが示されている。生物医学的応用としては、組織破砕、熱アブレーション、薬物送達の標的化および促進、超音波血栓溶解療法（sonothrombolysis）、および診断的超音波イメージングが挙げられる。非生物医学的応用としては、音化学（sonochemistry）、音融合（sonofusion）、水処理、および材料特性を特徴付けるための超音波の使用（WO 2011/036475に開示されるものなど）が挙げられる。

純粋な液体中で慣性キャビテーションを達成するには、液体の引張強度を克服できる非常に大きな圧力振幅（通常、GPaのオーダー）が必要である。予め存在する空きスペースを液体中に導入することで、慣性キャビテーションを開始するのに必要な圧力振幅（慣性キャビテーション閾値としても知られる。）は有意に低下する。この閾値は、超音波の励起周波数、泡のサイズ、および周囲液体の特性に依存する（R. E. Apfel and C. K. Holland, "GAUGING THE LIKELIHOOD OF CAVITATION FROM SHORT-PULSE, LOW-DUTY CYCLE DIAGNOSTIC ULTRASOUND," Ultrasound in Medicine and Biology, vol. 17, pp. 179-185, 1991）。このことは、所与の周波数にて励起される所与の液体において、空洞サイズが慣性キャビテーション閾値の最も重要な決定因子であることを意味する。

遊離の泡は、迅速に分解することから、キャビテーション核形成剤として通常使用されない。従って、表面活動安定化剤が泡の寿命を増加させるために使用されてきた。それ故、いくつかの剤が潜在的なキャビテーション核としてこれまでに提案されており、これらは慣性キャビテーション閾値を低下させるために媒体内に人為的に導入することができる。最もよく使われる剤は界面活性剤（脂質または蛋白質の殻など）により安定化されたマイクロバブルであり、該界面活性剤は通常、周囲媒体中の溶解度が低い気体を被包する。表面の隙間またはインクルージョンに気体を捕捉できる固体粒子もまた、潜在的なキャビテーション核形成剤として記述されてきた。

マイクロバブルおよび固体粒子は共に、通常少なくとも数ミクロンのサイズである。しかしながら、サブミクロンのキャビテーション核、または有意な浮力もしくは沈降特性を示さない核を必要とする多くの用途がある。例えば、液体中での均一なキャビテーションを達成するには、長期にわたって浮遊状態を維持できる剤が必要であろうが、これは浮揚性マイクロバブルおよび沈降性マイクロ粒子のいずれでも不可能である。例えば生物医学分野において、血管は通常8ミクロン以上の直径であるが、血管壁を裏打ちする上皮細胞間の密着結合は、正常組織において100 nmより小さく、疾患またはがん組織において100〜800 nmである。従って、マイクロバブルは血管に閉じ込められ、血管周囲の空間やその後の組織層内に浸出することができない。このことは血管から離れた組織の治療を目的とする、薬物送達などの治療的用途において特に制限となる。

この為、ナノスケールのキャビテーション剤がこれらの制限に対処するために提案されてきた。それらとしては、ナノ液滴（nanodroplets）（US20100178305、US20110177005）、ポリマーナノバブル（WO 2013 055791）、表面ナノバブルを捕捉するレイヤー・バイ・レイヤービーズ構築物（WO 2012/066334、およびKwan et al., Proceedings of Meetings on Accoustics, vol. 19, 075031 (2013)に開示されたものなど）が挙げられる。

このような既知のナノスケールのキャビテーション剤の全体サイズを制御することは可能であるが、このような剤に存在するガスボイド（gas voids）のサイズは、様々な理由から予測および制御が難しいことがある。ナノ液滴は、超音波などにより引き起こされる周囲圧力の低下時に蒸発するように設計されている。その結果、ナノ液滴は本質的に蒸気バブルであり、気泡よりも崩壊が難しい。ナノ液滴は注入後に凝集する傾向もあり、また温度の変動に非常に敏感である。このことは、キャビテーション核の性質およびサイズを知ることや制御することができないことを意味する。ポリマーナノバブルは、該ナノバブルを完全に取り囲む硬くて薄い殻により安定化されるが、該殻は、慣性キャビテーションが生じ得る前に破裂しなければならず、慣性キャビテーション閾値の増加をもたらす。レイヤー・バイ・レイヤー固体ナノ粒子は、製造時の信頼性に課題があり、全体の粒子サイズを調節できたとしても、ガスボイドのサイズを直接に制御できない。

従って、容易に製造することができ、ガスボイドのサイズを要求に応じて変更し、かつ厳密に制御することができ、その結果として慣性キャビテーション閾値を有意に低下させることができる、ナノスケールのキャビテーション開始剤を提供する必要性が存在する。

本発明は、音響的に調節可能なナノ粒子を提供する。該ナノ粒子は、カップ形状の周囲の中に部分的に被包された（encapsulated）ガスポケット（gas pocket）を有する。該ナノ粒子は、ナノスケールのガスのポケットがキャビテーションのプロセスの一部分として拡大するのを依然として可能としながら該ポケットを安定化することにより、臨床的に妥当なレベルまで慣性キャビテーション閾値を減少させることができる。この特徴は、既存のマイクロバブル技術を単純にナノスケールにスケールダウンしても見られないであろう。更には、カップの空洞のサイズ、従ってナノバブルのサイズを正確に制御することができ、それにより特有の音響環境に応答するように調節されたナノスケールのキャビテーション開始剤を製造することができる。

即ち、本発明は、ナノ粒子であって、該ナノ粒子は、
空洞を有するカップ、および
該空洞中に存在するガスポケット
を含み、該ガスポケットが該カップに部分的に被包されている（encapsulated）、前記ナノ粒子を提供する。

通常、該ナノ粒子は、単一のカップ、およびこれに対応して単一のガスポケットを有する。従って、該ナノ粒子は、通常、ナノカップのアレイまたは複数のナノカップの集塊よりもむしろ、個体のナノカップである。単一のカップを有するナノ粒子は、空洞サイズ、従って達成されるキャビテーション効果について、より高い程度の制御を提供する。従って、単一カップのナノ粒子は、超音波によりキャビテーションを誘発した時に、応答のより高い予測可能性を提供する。一つの実施形態において、該ナノ粒子は、空洞を有するカップの形態のナノ粒子であって、ガスポケットが該空洞中に存在し、該ガスポケットが該カップに部分的に被包されている。

本発明はまた、該カップ形状のナノ粒子の製造方法を提供し、該方法は、
シード粒子を提供すること、
通常該シード粒子の表面上で重合を行うことにより、該シード粒子を部分的に被覆して、空洞を有するカップを提供すること、
該カップを乾燥すること、および、
気体を該カップに提供して該空洞内に該気体のポケットを作ることを含み、最後の２つのステップは、通常、適切な気体中（例えば空気中）で該カップを乾燥することにより行われる。

該方法は、適切なサイズのシード粒子を用いることにより該ガスポケットのサイズを正確に制御することが可能であり、従って本発明のナノ粒子を製造するための信頼でき、かつ再現可能な技術を提供する。

本発明のある実施形態において、該ナノ粒子は薬物送達用媒体（drug delivery vehicles）として機能する。この実施形態は、治療薬の標的化と、そして重要なことに、刺激に応答して誘発される治療薬の「オンデマンド」の放出の両方を可能とする。

外的刺激により誘発されるナノ粒子からの治療剤の放出を実現することは大きな課題である。これの具体的な応用は腫瘍への薬物送達であり、治療的に妥当な濃度の薬物を血管系を超えて腫瘍領域に送達することの実現は治療効果の鍵である。放出誘発のための外的刺激として超音波は特にふさわしい。何故なら、超音波は、MHz範囲における数十cmからkHz範囲における数メートルまでに及ぶ距離に容易に伝わることができるからである。超音波誘発性の薬物放出のためにいくつかのアプローチが提案されている。通常、これらの方法は、100〜400 nmの粒子はがん集団に蓄積するという増進した透過および保持（the enhanced permeation and retention: EPR）効果を利用する。従って、超音波誘発性の薬物送達は、周囲媒体の熱的および／または機械的変化に敏感である、腫瘍に蓄積するために十分に小さいナノ粒子を利用する。例えば、熱感受性リポソームは、42℃より高い温度でそのペイロードを放出するが、多量のエネルギーが患者に送られることを必要とする。あるいは、音感受性リポソームは、慣性キャビテーションによる機械的破壊の存在下で薬物を放出する。残念なことに、キャビテーション核（これは血管系に制限されている。）および腫瘍に位置するリポソームの非局在化が、この送達スキームの効果を制限する。代替的に、ナノ液滴が、腫瘍内に蓄積するキャビテーション核として提案されている。しかしながら、これらの粒子は、液滴が準安定の熱力学的状態にあることに起因して内在的に不安定である。最終的に、これらの粒子は熱変動に非常に敏感であり、適所に行く前の蒸発および合体を生じる。

従って、利用可能な解決手段は、低エネルギーの超音波励起に応答して「オンデマンド」で誘発性の放出を実現できる所望のナノ粒子を提供していない。しかしながら、本発明は、キャビテーションの際にナノ粒子から放出される薬物を提供することにより、このような誘発性の放出を提供する。

従って、本発明は、放出剤を含む本発明のナノ粒子であって、キャビテーションの際に該放出剤が該ナノ粒子から分離されるものを提供する。該放出剤は、通常、薬物（例えば治療的または診断的物質）である。

一部の実施形態において、該放出剤は、該空洞中に存在する薬物層として提供され、該薬物層は、通常、例えば、該カップの内側表面を被覆する。このような実施形態において、該ガスポケットは「プラグ」として機能し、水または血漿に曝露された時にただちに該薬物が放出されることから該薬物を保護し、これにより正常組織に対する非特異的な全身性の効果が低減される。例えば超音波の適用により、該ガスポケットのキャビテーションが誘発された時に、該空洞は「プラグを外される」（unplugged）ことができ、そして該薬物が放出されることができる。代替的には、超音波に曝露された時の治療薬の迅速な放出のために、薬物を該カップの構造内（例えばポリマーカップ内）に組み込むことができ、あるいは該カップの外側表面に被覆することができる。これらの実施形態において、例えば薬物の生理学的標的の領域に超音波を適用することにより、キャビテーションを局所的に誘発することができるので、該ナノ粒子は標的化された薬物送達の方法において用いることができる。

本発明はまた、ヒトまたは動物対象の治療または診断の方法における使用のための本明細書に記載のナノ粒子を提供し、該方法は、例えば該対象を超音波に曝露することにより、該対象においてキャビテーションを誘発することを含む。

本発明はまた、ヒトまたは動物対象の治療または診断の方法を提供し、該方法は、本明細書に記載のナノ粒子を投与すること、および、例えば該対象を超音波に曝露することにより、該対象においてキャビテーションを誘発することを含む。

本発明はまた、ヒトまたは動物対象の治療または診断のための医薬の製造における本明細書に記載のナノ粒子の使用を提供し、該治療または診断は、例えば該対象を超音波に曝露することにより、該対象においてキャビテーションを誘発することを含む。

本発明はまた、本明細書に記載の複数のナノ粒子、および任意に担体または希釈剤、典型的には医薬的に許容される担体または希釈剤（例えば、液体媒体）を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、該組成物中の該ナノ粒子は、実質的に単分散である。例えば、それらは、0.20以下（例えば、0.19以下、0.18以下、0.17以下、0.16以下、または0.15以下）の多分散性（polydispersisity）インデックス（PDI）を有し得る。該液体媒体は、水性のものであり得る。

図１は本発明による典型的なナノカップの描写である。 図2は実施例1において製造された半球状ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像（TEM）である。挿入図は、TEM画像から再構成された半球状ナノ粒子の3次元モデルである。 図3は、実施例1で用いたシード粒子および製造された結果物である半球状ナノ粒子のサイズ分布を示す。 図4は、実施例1により製造された集団における測定された空洞サイズのサイズ分布と共に半球状ナノ粒子の空洞形状を示す。 図5は、異なる粒子および空洞の直径を有する本発明のナノ粒子のいくつかのバッチの慣性キャビテーション閾値の平均を示す。 図6は、本発明によるナノカップを製造するための方法を模式的に描写する。 図7aは、本発明による小さい、中間の、および大きいナノカップの粒子サイズを示し、図7bは同じナノカップの空洞サイズを示す。図7cおよびdはこれらのナノカップのキャビテーション（caviation）閾値を示す。 図8は本発明のナノカップのキャビテーション効果を実証する図であり、(a) 単独で組織ミミックを通して流した場合、(b) SonoVue（登録商標）マイクロバブル（平均直径5ミクロン、Braccoより入手可能）と共に組織ミミックを通して流した場合、および(c) 本発明の蛍光ナノカップと共に組織ミミックを通して流した場合の、組織ミミック内の超音波に曝露された蛍光薬物モデルの蛍光画像を比較している。図8dは、より高い振幅の超音波での本発明のナノカップのキャビテーション効果を示す。 図9は、乾燥および再懸濁されておらず従ってガスポケットを含まないナノカップと比較した、本発明によるガスポケットを含むナノカップを用いて達成されたキャビテーション効果の比較を示す。 図10は、0.5 MHzおよび1.6 MHzの両方におけるキャビテーション感受性リポソームからの超音波により誘発される薬物放出を達成するためのナノカップの使用を示す。達成された放出は、ミクロンサイズのキャビテーション誘発剤（Sonovue, Bracco）を用いて得られる放出と同等である。 図11は、ナノカップは静脈投与後に安定であり、従来の診断的超音波システムを用いて腫瘍においてキャビテーションを開始させ、リアルタイムでマッピングできることを立証する。

ナノカップ
本明細書において使用される場合、ナノ粒子は、1 nm〜1000 nmのサイズを有する任意の粒子である。ナノ粒子のサイズは、通常、ナノ粒子の平均直径（図1におけるs）である。直径は、通常、電子顕微鏡により決定される。複数のナノカップが組成物中に存在する場合、通常、キュムラント平均をナノ粒子のサイズとする。これは動的光散乱により決定することができる。

本明細書において使用される場合、用語「部分球状」とは、球体の部分を形成する形状を表す。用語「部分球状」としては、球状キャップ、半球、および赤道より上で上部を切断した球体（即ち、球状キャップに補完的な球体の部分）などの形状が挙げられる。実質的に部分球状としては、回転楕円体（スフェロイド）の部分を形成する形状、およびくぼみや突起などの不規則性を有する球体または回転楕円体の部分などの形状が挙げられる。

部分球状でないカップを本発明のナノ粒子において用いることができ、あらゆるカップ形状、即ちガスポケットを部分的に被包できる空洞を有する形状を用いることができる。ナノ粒子の表面上の浅いまたは小さいくぼみ／欠陥（indentations/imperfections）、例えば、約5 nm未満（通常、約10 nm未満、または約20 nm未満）の深さを有し、かつ／または、約5 nm未満（通常、約10 nm未満、または約20 nm未満）の開口を有するくぼみ／欠陥は、一般にガスポケットを被包できず、従って本明細書において使用されるキャビティとは考えない。従って、単一の空洞を有するナノ粒子は、その表面上にそのような小さい／浅い欠陥またはくぼみを含んでいてもよい。

本明細書において使用される場合、カップにより部分的に被包されたガスポケットは、通常、カップにより被包されたその表面の部分（任意に、カップとガスポケットとの間に存在する1以上の層を有する。）と、カップにより被包されておらず、ナノ粒子が存在し得る媒体（例えば、液体媒体）に曝露され得るその表面の部分とを有するガスポケットである。

本明細書において使用される場合、空洞の開口のサイズは、カップの縁において測定される空洞の最大寸法であり（図1におけるp）、通常、ガスポケットの被包された部分とガスポケットの被包されていない部分との間の境界を形成するカップの部分である。実質的に部分球状の空洞の場合、開口は実質的に円形であり、そのサイズは開口の直径として測定される。空洞の開口のサイズは、透過型電子顕微鏡により決定することができる。

本明細書において使用される場合、カップの壁の厚さとは、空洞に面するカップの表面上の一点から、カップを通って、カップの反対表面上の一点までの最短距離をいう（図1におけるw）。カップの壁の厚さは、透過型電子顕微鏡により決定することができる。

本明細書において使用される場合、カップの深さとは、カップの縁のレベルからカップの底までの最大距離をいう（図1におけるd）。カップの深さは、透過型電子顕微鏡により決定することができる。

一部の実施形態において、厚さは、カップ内で変動してもよく、あるいは複数のカップを含む組成物においてカップ毎に異なっていてもよく、この場合、平均を決定することができる。一部の実施形態において、厚さは、カップ内で、または複数のカップを含む組成物においてカップ毎に、均一または実質的に均一であってもよい。

本明細書において使用される場合、用語「実質的に均一な厚さ」は、最小厚さよりも25%以下だけ大きい（例えば、20%以下だけ大きい、15%以下だけ大きい、10%以下だけ大きい、または5%以下だけ大きい）最大厚さを有する形状に関する。

本発明のナノ粒子は、通常、少なくとも60 nmまたは少なくとも100 nm、かつ最大1000 nm（例えば、最大500 nmまたは最大300 nm）のサイズを有する。例えば、ナノ粒子は60〜500 nmまたは100〜300 nmのサイズを有し得る。

ナノ粒子が腫瘍の治療方法において使用される実施形態において、ナノ粒子の具体的なサイズは、増進した透過および保持（EPR）効果により腫瘍組織における蓄積を向上させるために望ましいものであり得る。腫瘍組織は、異常な形状および構造を有する新生血管系を含むことがあり、これは異常な分子および流体の輸送動態をもたらす。これにより、約100〜500 nm（例えば100〜300 nm）のサイズのナノ粒子を、正常組織において蓄積するよりもはるかに多く腫瘍組織において蓄積させることができる。従って、100〜500 nm（例えば100〜300 nm）のナノ粒子サイズが望ましいものであり得、これは腫瘍の治療方法における使用において特にそうである。

ガスポケットを含む空洞の望ましいサイズおよび形状は、慣性キャビテーションを開始させるために必要な疎密波の圧力振幅を最小化するために、使用される超音波周波数（通常、0.5 MHz〜5.0 MHzの範囲内）により決定される。5 MPa未満（例えば、3 MPa以下、2.5 MPa以下、または2 MPa以下）の超音波の圧力振幅が好ましく、0.5 MPaもの低さの超音波の圧力振幅により、ナノカップの存在下で2 MHzもの高さの周波数において大規模な慣性キャビテーションを生じさせることができる。

空洞は、通常、実質的に部分球状であり、例えば実質的に半球状または半球状である。空洞は、通常、50〜900 nm（例えば、少なくとも50 nm、100 nm、または少なくとも200 nm、および、700 nm以下、600 nm以下、または400 nm以下）の開口サイズ（p）（実質的に部分球状の空洞の場合には開口の直径）を有する。空洞は、例えば、50〜400 nmまたは100〜600 nmであってよい。当業者は、ナノ粒子を製造するための本明細書に開示される方法に基づいて、所望の超音波のパラメータを補完するために適切な空洞の形状およびサイズを選択し、所望の空洞の形状およびサイズを有するナノ粒子を製造することができるであろう。

ナノ粒子のサイズに対する開口のサイズの比（図1において比p:s）は、通常、1:3〜5:6、例えば1:2〜2:3である。

空洞は、通常、30 nmより大きい、好ましくは50 nmより大きい深さを有する。例えば、空洞は、通常、60〜500 nm、例えば80〜400 nmの深さを有する。

より大きいサイズ（例えば、30 nmより大きい、好ましくは50 nmより大きい深さ、および／または50 nm以上の開口）を有する空洞は、より大きなキャビテーション効果を引き起こすことができるという利点を有する。

カップの壁の厚さ（w）は、通常、10〜100 nm（例えば、30〜70 nmまたは約50 nm）である。カップの壁の厚さは、ナノ粒子を製造するための本明細書に開示される方法に基づいて、選択して正確に制御することができる。カップの壁の厚さは、通常、単一のナノ粒子内、および本発明の組成物におけるナノ粒子毎の両方において、実質的に均一である。壁の厚さは、通常、全体的なカップサイズの一定の割合である。

カップは、通常、ポリマー材料から形成されているが、ナノカップに成形できる任意の固体材料から形成されていてもよいであろう。従って、カップは、通常、ポリマーを含み、好ましくは、カップは本質的にポリマーから構成されている。

例えば、カップは、乳化重合処理で形成できるポリマーから形成されていてもよい。好適なポリマーとしては、ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）、ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）（pHEMA）、ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）、ポリスチレンおよびジビニルベンゼン、およびメチルメタクリレート／2-ヒドロキシエチルメタクリレート共重合体などの共重合体、ならびにポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（PNIPAM）などのpHまたは温度応答性ポリマーが挙げられる。他の好適なポリマーとしては、ポリ無水物に分類されるポリマーが挙げられるが、これに限定されない。

PNIPAMなどのpHまたは温度応答性ポリマーは、ナノカップ内に被包された薬物の放出、および／または標的（例えば腫瘍）における該薬物の取り込みを増進させるために使用することができる。pH応答性ポリマーは腫瘍治療の文脈において好ましいことがある。pHは、（例えば、血管に対して遠位である低酸素領域において）健常組織におけるよりも腫瘍においてより低いことがあるためである。温度応答性ポリマーは、ハイパーサーミアまたは切除治療（高密度焦点式超音波（HIFU）、マイクロ波、無線周波数（RF）またはレーザーなど）と共に使用するために好ましいことがある。

一部の実施形態において、カップは架橋ポリマーから形成されている。ポリマーの架橋は、重合の前にまたは重合の間にモノマー混合物中に架橋剤を導入することにより達成することができる。好適な架橋剤としては、ジビニルベンゼン（DVB）またはビニルシランが挙げられる。架橋は、ジスルフィド結合領域の形態でポリマー中に存在することもできる。ジスルフィド結合領域は、チオール化学を用いて導入することができる。架橋ポリマーを用いてナノ粒子に剛性を与えてもよい。剛性は、例えば、キャビテーションの間にカップが破裂するのを低減または防止するために望ましいことがある。架橋の程度は、ラマン分光法または核磁気共鳴分光法などの様々な分光学的方法、またはポリマー膨潤技術により決定し得る。

ポリマーのカップは、2以上（例えば、2つまたは3つ）の異なるモノマー単位から形成されたポリマーを含んでもよい。ポリマーは、モノマー混合物を共重合することにより、および／または、共重合または架橋剤により連結された1以上のプレポリマーを提供することにより、提供されてもよい。

カップは、通常、生体適合性であり、即ち、医学的療法または診断方法のレシピエントまたは受益者におけるいかなる治療的に許容できない局所的または全身性の影響を引き起こすことなく、該療法または診断に関する所望の機能を行うことができるものである。

ガスポケット中に存在する気体は特に限定されないが、通常、空気、窒素、酸素、パーフルオロプロパンなどのパーフルオロカーボン、またはこれらの混合物である。

ガスポケットは、空洞と同じサイズおよび形状であってもよい。例えば、空洞がその開口において直径dを有する半球であれば、ガスポケットは直径dの半球であってもよい。代替的には、ガスポケットは空洞より大きくてもよく、即ち、それはカップの縁から突出していてもよい。それは、カップの深さの10%以上（例えば、20%以上、50%以上、80%以上、または100%以上）の距離をカップの縁から突出していてもよい。カップの深さ、およびガスポケットが突出し得る程度は、透過型電子顕微鏡を用いて決定することができる。一部の実施形態において、空洞は、半径rの曲率を有する部分球状または実質的に部分球状であり、ガスポケットは半径rを有する球体である。この実施形態の実施例において、空洞は、その開口において直径dを有する半球であり、ガスポケットは半径1/2 dの球体である。

本発明のナノカップの具体的な利点は、調節可能なキャビテーション開始剤を提供するために空洞サイズを制御し得ることである。従って、本発明のナノカップは、通常、予測可能かつ再現可能な空洞の開口サイズを有する。従って、予測可能な空洞の開口サイズを有するこのようなナノカップは調節可能なナノカップである。

ナノカップの製造方法
ナノ粒子は、シード乳化重合（seeded emulsion polymerisation）技術によりカップを形成し、任意にカップの空洞に薬物層を形成し、そして気体の存在下でカップを乾燥してガスポケットを導入することにより、製造することができる。

空洞のサイズおよび形状は、用いるシード粒子を選択することにより選択し、正確に制御することができる。従って、シード乳化重合技術は、通常、空洞の所望のサイズおよび形状と補完的なサイズおよび形状を有するシード粒子を使用する。例えば、部分球状の空洞を有するカップを製造するために、球状シード粒子を用いることができる。より大きいシード粒子を用いることでより大きい空洞を形成することができ、同様に、より小さいシード粒子を用いることでより小さい空洞を作ることができる。用いられるシード粒子は、通常、50〜900 nm（例えば、少なくとも50または少なくとも100 nm、かつ最大600 nm、最大400 nm、または最大300 nm）のサイズを有する。

乳化重合は、通常、シード粒子、モノマー、および任意に架橋剤を好適な媒体（水など）中で混合し、混合して乱流条件を作り、そして過硫酸カリウムなどの好適な開始剤を加えることにより行われる。好適な期間、好適な温度にて乳化重合反応を継続させる。当業者は、用いる具体的な反応混合物のために適切な温度および時間のパラメータを選択することができるが、通常、重合は70〜90℃の温度で4〜6時間（例えば、約80℃で約5時間）行われる。

重合は、通常、フリーラジカル重合プロセスである。シード粒子上に被覆されるポリマーは、シード粒子と共重合する固体または液体のポリマーであってよい。

カップが2以上のモノマー単位から形成される場合、異なるモノマーを重合の開始時に乳化重合に提供してもよいし、あるいは1以上のモノマーを重合プロセスの途中で提供してもよい。代替的には、1以上のモノマー単位を前重合し、重合の開始時または重合の途中のいずれかにおいてプレポリマーを重合混合物に提供してもよい。通常、該モノマーまたはプレポリマーの1以上は、シード粒子に対してより大きい親和性を有し得る。従って、主にカップの内側表面上に形成される1つのモノマー単位（即ち、シード粒子に対してより大きい親和性を有するモノマー）、および主にカップの外側表面上の異なるモノマー単位を有するカップを重合は提供し得る。これは、内側表面および外側表面において異なる表面特性を有するカップを提供し得る。

ポリマーナノカップの場合、シード粒子は、通常、ナノカップの内側表面に化学的に結合したままであり、シード粒子材料は、通常、それ自体がカップに組み込まれている。全ての利用可能なシード粒子が完全に反応する場合、従って、除去する必要があるシード粒子は残らない。大きい凝集体および小さい副生成物は、遠心およびろ過により除去される。ナノカップの最終的な形状、サイズ、および形成の成功は、グリッド面の複数の傾斜角にて取得した透過型電子顕微鏡像（TEM）により確認することができ、図2の挿入図に示すように該顕微鏡像は3次元モデルに再構成することができる。

カップの壁の厚さは、反応混合物中に存在するシード粒子の量に対するモノマー混合物の量を選択することにより制御できる。シード粒子の数に対してモノマーの量を増やすと、生じるカップの壁の厚さは増大し、シード粒子の数に対してモノマーの量を減らすと、生じるカップの壁の厚さは減少する。また、カップの壁の厚さは、重合を行う期間を変更することにより調節することができ、即ち、十分な反応物がある場合には、より長い反応時間はより厚いカップをもたらす。

乳化重合を行った後、あらゆる過剰なポリマーを除去するために、例えば遠心により、生成物を洗浄することができる。洗浄後、生成物は、通常、乾燥前に水などの好適な媒体中に懸濁される。

生成物は、凍結乾燥または空気乾燥などの任意の好適な技術により乾燥することができる。凍結乾燥の場合、凍結保護剤は通常用いられない。空気乾燥は好ましく、例えば高温において、またはデシケーター中で行うことができる。空気乾燥は、12-36時間（例えば24時間）にわたって行うことができる。一つの実施形態において、空気乾燥は、40〜50℃の温度で6〜18時間（例えば約12時間）、次いでデシケーター中で18-24℃で15時間行われる。

空気中で乾燥する場合、本発明のナノ粒子におけるガスポケットは、空気のガスポケットとなる。所望の気体中で乾燥工程を行うことにより、代替的な気体をガスポケットのために用いることができる。例えば、乾燥を空気中で行うことができ、空気のガスポケットを有する生じたナノ粒子を真空に供して空気のガスポケットを除去し、そして所望の気体と接触させて所望の気体の新たなガスポケットを導入することができる。気体雰囲気中でナノカップを乾燥することにより、必要なガスポケットがカップの空洞内に提供される。乾燥前にはガスポケットは存在しない。

乾燥したナノカップを水溶液などの液体媒体中に再懸濁してもよい。好適な溶液としては、希釈グルコース溶液（例えば、0.5-10%、好ましくは1-8%、例えば約5%のグルコース溶液）が挙げられる。通常、粒子の分散を最大化するために、溶液はその後に混合される。乾燥したナノカップは再懸濁時にガスポケットを保持する。従って、乾燥工程によりガスポケットが空洞中に存在するという点で、気体雰囲気中で乾燥されて再懸濁されたナノカップは溶液中で直接的に形成されたナノカップとは異なる。

ナノカップの再懸濁後、凝集した物体を除去するために溶液はろ過されることが好ましい。シリンジろ過（例えば1〜5 μm、通常1.5〜3 μm）を用いて微粒子を除去してもよい。これは、存在するナノ粒子をろ過限界未満のナノ粒子サイズを有するものに制限する。粗いろ過とその後のシリンジろ過との組み合わせを用いてもよい。

例えば輸送の容易さのため、乾燥形態のナノカップが所望される場合、再懸濁およびろ過工程を割愛することができる。乾燥したナノカップは、通常、使用前に再懸濁され、生じるサイズ分布に応じて懸濁液をろ過してもよい。

図6は、本発明によるナノカップの製造方法を模式的に描写したものである。図6a)は、共重合体で被覆された個々のテンプレート粒子を示し、該共重合体は球状粒子の膨潤および変形を誘発する。生じたナノカップは乾燥され、懸濁されて空洞中に気体を捕捉する。図6b)は、ナノ粒子システムのための慣性キャビテーションのための提案するメカニズムをダイアグラムで表したものである。最初に、泡が空洞内で安定化される。十分な負圧により、泡は空洞の口上に広がることができ、ついには粒子から離れる。慣性キャビテーションが起こるためには、離れた泡が、周囲媒体の慣性の下で最終的に崩壊する前に、不安定的に成長しなければならない。

薬物送達用媒体としてのナノカップ
本発明のナノ粒子は、例えば、空洞内、カップ内、またはカップの外側表面上に、放出剤（典型的には薬物）を組み込むことにより、薬物送達用媒体として使用してもよい。放出剤は、通常、カップの外側表面上、カップ内、またはカップの内側表面上、空洞内に層を形成し得る。本明細書でいう放出剤とは、キャビテーション時にナノ粒子から放出される物質である。通常、放出剤は薬物であり、即ち、治療的または診断的な、例えば医薬物質または生物学的物質である。通常、放出剤は、ヒトまたは動物対象の治療または診断において有用な物質である。本明細書の記載は、ナノ粒子中に存在する薬物または薬物層に言及する。しかしながら、例えば非医学的用途において使用された時に、キャビテーション時に放出されることが有用である代替的な物質もまた、放出剤として用いてもよいことが理解されるべきである。従って、薬物または薬物層へのいかなる言及も、適切であれば、代替的な放出剤または放出剤層に置き換えられることが企図される。

薬物層が空洞中またはカップ内に存在する実施形態において、薬物の性質は特に限定されず、治療方法において有用であり得るあらゆる薬物を使用し得る。親水性薬物は好ましい。特定の薬物としては、以下に限定されないが、ドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン、ダウノルビシン、およびオキシロプラチンなどの抗がん薬、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（rt-PA）などの血栓溶解剤、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、サルサレートなどの抗炎症剤、またはゲルダナマイシンまたはペニシリンなどの抗生物質が挙げられる。薬物がカップの外側上に組み込まれる場合、薬物は、通常、投与時の溶解を回避する様式でカップに結合できるように選択される。従って、薬物はキャビテーション時にのみ放出される。

ナノ粒子は、2以上の異なる薬物を含んでもよい。例えば、一つの薬物は空洞内に提供され、別個の異なる薬物はカップの外側表面上に提供されてもよい。例えば超音波に曝露されると、2つの薬物は放出時に組み合わせられる。従って、ナノ粒子は、併用療法を提供するため、または、例えば超音波への曝露後にナノ粒子媒体から放出された時に標的部位においてのみ混合する2つの薬物の同時の放出を提供するための手段として有用であり得る。

薬物層の追加は、カップの形成前（例えば、シード粒子中）、カップの形成中、またはカップの形成後に行うことができる。薬物層の組み込みのタイミングは、ナノカップ上でのその配置をもたらすことになる。例えば、薬物を有したシード粒子は、カップの空洞中に薬物を配置することになる。重合中の薬物の追加は、カップ内に薬物を配置することになる。カップの形成後の薬物の追加は、カップの外側表面（即ち、ガスポケットに面していない表面）上に薬物を配置することになる。

薬物層の厚さは、薬物の量および位置に依存する。薬物がカップ自体の中に組み込まれている場合、薬物層の厚さは、カップの壁の厚さにより制約されることになる。空洞内に存在する薬物の場合、薬物層は、空洞の深さ未満であるはずであり、それによりガスポケットが少なくとも部分的に空洞により被包されて存在することが可能となる。薬物層の厚さの制御は、重合の時間および薬物反応物の量を調節することにより達成することができる。薬物の担持は薬物放出特性を用いて測定される。

ナノカップの用途
本発明のナノ粒子は、組織破砕、熱アブレーション、音化学、音融合、排水処理などの慣性キャビテーションが所望されるあらゆる状況において単独で用いることができる。例えば、本発明のナノ粒子は、治療転帰を達成するために慣性キャビテーションを用いて局所的な組織アブレーションおよび／または除去を引き起こすことを伴う方法において用いることができる。このような方法としては、例えば、腫瘍の治療、および心疾患の治療における心臓組織の除去が挙げられる。

代替的には、本発明のナノ粒子は、薬物または診断剤（例えば、GdベースのMRI造影剤などのMRI造影剤、または蛍光造影剤）などの他の剤と組み合わせて用いることができる。本発明のナノ粒子は、ナノ粒子および他の剤を併用投与することにより、または、薬物（例えば、カップの空洞中の薬物層）を含むナノ粒子の場合には薬物製剤自体の一部としてナノ粒子を用いることにより、生体内で標的に他の剤を送達するために用いることができる。

別個の剤が用いられる場合、本発明のナノ粒子は、別個の剤と共に単一の組成物において投与されてもよいし、あるいは別個の組成物として投与されてもよい。2つの組成物が用いられる場合、これらは同時にまたは別々に投与してもよい。同時または実質的に同時の投与が好ましい。ナノ粒子および別個の剤の投与後に超音波を適用することにより、キャビテーションが引き起こされる。これは細胞内への剤の輸送を促進する。このようにしてキャビテーションを用いて細胞内への活性物質の輸送を促進することの具体的な利点は、選択した位置に超音波を適用することで、これらの選択された位置においてのみ活性物質を細胞内に輸送できるということである。

本発明の一つの態様において、別個の剤は、音感受性リポソームに被包される。このような音感受性リポソームは、慣性キャビテーションの存在下で剤を放出できる。従って、本発明のナノ粒子をリポソームと併用投与し、所望の位置においてキャビテーションを引き起こすために超音波を適用し、これに対応して所望の位置において活性物質の放出を引き起こし得る。

上述した通り、本発明の代替的な態様において、活性物質はナノ粒子自体の中に組み込んでもよい。この場合、キャビテーションは、ナノ粒子から剤を放出するため、ならびに細胞内への活性物質の輸送を補助するための両方の作用を有し得る。

他の剤と組み合わせて用いられる場合、ナノ粒子は、例えば従来の超音波イメージングまたは慣性キャビテーションの受動音響的マッピング（WO 2010 052494）を用いて、生体内における薬物分布のリアルタイムのトラッキングおよびマッピングを提供することもできる。

キャビテーションを達成するために用いる超音波は特に限定されず、0.5 MHz〜5.0 MHzの範囲内の任意の周波数を用いることができる。周波数は、調節されたナノ粒子にマッチしたものであろう。これにより、キャビテーションを達成するために必要とされる超音波の圧力をより小さくすることができる。用いられる超音波の圧力振幅は、通常、5 MPa未満（例えば、3 MPa以下）である。

ナノカップの組成物
ナノ粒子は組成物（例えば、医薬組成物）として提供されてもよい。これは、乾燥形態（例えば粉末として）で複数のナノ粒子を単独で含む組成物、または医薬的に許容される担体または希釈剤と共にナノ粒子を含む組成物のいずれかであってもよい。通常、担体または希釈剤と共に提供される組成物は、ナノ粒子の懸濁液を含む液体組成物として提供される。該医薬組成物は、通常、最大85 wt%の本発明のナノ粒子を含む。より典型的には、該医薬組成物は、最大50 wt%の本発明のナノ粒子を含む。好ましい医薬組成物は無菌であり、かつ発熱物質を含まない。

乾燥形態で複数のナノ粒子を含む組成物は、通常、使用前に好適な液体、例えば水溶液中に再懸濁される。

複数のナノ粒子を含む組成物は、通常、実質的に均一であるナノ粒子を含む。これは、キャビテーションに対してより大きな制御が達成され、従って音響的チューニングが向上するという利点を有する。ナノ粒子の組成物の好ましい多分散性インデックスは0.2である。これは、通常、動的光散乱法により決定される。複数のナノ粒子を含む組成物の平均粒子サイズは、本明細書においてモーダル平均（即ち、粒子の最大数により表示される粒子サイズ）として定義される。本発明の好ましい態様において、組成物中のナノ粒子の少なくとも50%は、平均の50 nm以内の粒子サイズを有する。より好ましくは、ナノ粒子の少なくとも60%、70%、または80%は、平均の50 nm以内の粒子サイズを有する。更により好ましくは、組成物中のナノ粒子の少なくとも50%は、平均の20 nm以内の粒子サイズを有する。より好ましくは、ナノ粒子の少なくとも60%、70%、または80%は、平均の20 nm以内の粒子サイズを有する。動的光散乱法を用いて、組成物内の粒子サイズのばらつきを決定してもよい。

複数のナノ粒子を含む組成物の平均空洞サイズ（空洞の開口のサイズ，p）は、本明細書においてモーダル平均（即ち、粒子の最大数により表示される空洞サイズ）として定義される。本発明の好ましい態様において、組成物中のナノ粒子の少なくとも50%は、平均の50 nm以内の空洞サイズを有する。より好ましくは、ナノ粒子の少なくとも60%、70%、または80%は、平均の50 nm以内の空洞サイズを有する。更により好ましくは、組成物中のナノ粒子の少なくとも50%は、平均の20 nm以内の空洞サイズを有する。より好ましくは、ナノ粒子の少なくとも60%、70%、または80%は、平均の20 nm以内の空洞サイズを有する。動的光散乱法を用いて、組成物内の空洞の開口のサイズのばらつきを決定してもよい。

本発明のナノ粒子は、治療方法の性質に応じて任意の好適な経路、例えば、経口（シロップ、錠剤、カプセル、ロゼンジ、制御放出製剤、速溶解製剤などとして）、局所（クリーム、軟膏、ローション、鼻腔用スプレー、またはエアロゾルなどとして）、注射（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腫瘍内など）、経皮（例えば、パッチ、ゲル、またはインプラントの適用による)、または吸入（乾燥粉末、溶液、分散物など）により投与されてよい。

例えば、固体経口形態は、本発明のナノ粒子と共に、希釈剤（例えば、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチまたはポテトスターチ）、潤滑剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、および／またはポリエチレングリコール）、結合剤（例えば、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン）、凝集阻害剤（例えば、でんぷん、アルギン酸、アルギン酸塩、またはデンプングリコール酸ナトリウム）、発泡剤、染料、甘味料、湿潤剤（レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩など）、ならびに、一般に、医薬製剤において用いられる無毒性かつ医薬的に不活性の物質を含有してもよい。このような医薬製剤は、公知の方法、例えば、混合、造粒、打錠、糖衣、またはフィルムコーティングプロセスにより製造することができる。

好ましくは、担体または希釈剤と共に提供される組成物は液体分散物である。経口投与のための液体分散物は、シロップ、乳液、および懸濁液であってもよい。懸濁液は好ましい。シロップ、乳液、および懸濁液は担体として例えばサッカロース、またはグリセリンおよび／またはマンニトールおよび／またはソルビトールと共にサッカロースを含有してもよい。グルコースは好ましい担体である。例えば、ナノ粒子はグルコース溶液（例えば、最大10 wt%のグルコース、例えば約5 wt%のグルコースを含むグルコース溶液）中の懸濁液として提供されてもよい。

懸濁液および乳液は担体として例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含有してもよい。筋肉内注射のための懸濁液または溶液は、活性化合物と共に、医薬的に許容される担体、例えば、無菌の水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール（例えばプロピレングリコール）、および所望により好適な量の塩酸リドカインを含有してもよい。

注射または点滴用の溶液は担体として例えば無菌の水を含有してもよく、あるいは好ましくは、該溶液は無菌の、水性の、等張の食塩水の形態であってもよい。

治療または診断方法の部分として投与される薬物含有ナノ粒子の量は、例えば、ナノ粒子中に存在する薬物の種類および量に依存するであろう。従って、本発明の薬物含有ナノ粒子の用量は、通常、単独で投与される場合にはナノ粒子中に存在する薬物の用量と同等またはそれ未満であり、即ち、ナノ粒子中に存在する薬物の量は、通常、遊離の形態で投与されるであろう量と同じまたはそれ未満である。本発明の薬物含有ナノ粒子の用量は、例えば、上述した本発明の剤において見られる向上した薬物動態を補完するために、遊離の薬物と同等の量より少なくてもよく、例えば、95%以下、85%以下、80%以下、75%以下、70%以下、65%以下、60%以下、55%以下、または50%以下である。

本発明のナノ粒子および別の剤が別々に投与される実施形態では、2つの剤を同じ医薬組成物中で一緒に投与してもよいし、あるいは、同一または異なる経路により、別々の投与、同時投与、併用投与または順次投与を意図する異なる組成物中で投与してもよい。

単独で用いられる場合に投与されるナノ粒子の量は、当業者により決定され得るような任意の適切な用量であり得る。

以下の非限定的な実施例により本発明を説明する。

実施例１
半球状カップを有するナノ粒子（ナノカップ（NC）としても知られる。）を以下のプロトコールに従って製造した。

10 wt%の300 nm ポリスチレン（ラテックスとしても知られる）ナノ粒子（2 ml）を、ろ過した脱イオン水（34 ml）と混合した。生じた混合物を100 mlの丸底フラスコ中で30分間窒素ガスによりバブリングした。丸底フラスコを還流冷却器に装着し、80℃の水浴中に置いた。以下のモノマーを撹拌下で順番に加えた: 851 μl MMA、85 μl HEMA、および533 μl 80 v/v% DVB。3.5 mg/ml 過硫酸カリウム（KPS）溶液（1.704 ml）を窒素ガスにより脱気した。KPS溶液を加えた。反応を5時間維持した後、15000 RPMで30分間遠心することにより反応混合物を3回洗浄した。半球状カップを有する生じたナノ粒子を、ろ過した脱イオン水中に懸濁した。ナノカップのTEMおよびサイズ分布を図2および3に示す。

NC分散物をペトリ皿上に置き、約40〜50℃に一晩加熱した。次にディッシュを乾燥チャンバー内に24時間置いた。半球状カップおよび空気のガスポケットを有する生じたナノ粒子を、ろ過した脱イオン水中に懸濁した。

図5は、異なる粒子および空洞の直径を有する本発明のナノ粒子のいくつかのバッチの慣性キャビテーション閾値の平均を示す。実施例1のナノカップを、0.2 mm円筒チューブ内に閉じ込めながら200の独立したHIFUバースト（0.5 MHz 10サイクルのサイン波）に20 Hzのレートにて曝露することにより結果を得た。アコースティックエミッションを15 MHzのトランスデューサ（受動的キャビテーション検出器としても知られる）により測定した。受信した信号を25xに増幅し、RFノイズの影響を減少させ、12ビットDAQカードを用いてデジタル記録した。駆動周波数の影響を取り除くために、2 MHzのハイパスフィルターにより信号をデジタルフィルタリングした。生じた電圧のトレースのそれぞれを周波数ドメインのノッチフィルタリングした調波に変換し、広帯域成分を調べた。単一のパルスについて広帯域成分（パワーとして測定される）が水を満たしたチューブのそれよりも3倍大きい場合に、キャビテーション事象が生じたものとした。従って、慣性キャビテーションの確率は、200の伝送したバーストのうちの慣性キャビテーション事象のパーセンテージである。
完全に均一な分布のシステムについては、慣性キャビテーション曲線の確率はヘビサイト関数（即ち、0〜100%に及ぶステップ関数）になるはずである。しかしながら、完全な分布からの逸脱は確率曲線を歪ませ、線形の増加を生じさせる。集団内の異なる空洞は、異なるキャビテーション閾値を有するであろう。従って、個々の空洞の慣性キャビテーション閾値は、サンプル中のサイズの集団を慣性キャビテーションの確率に対して比較することにより推測できる。

実施例２
実施例1のプロトコールに従って製造したナノカップを以下の通りに乾燥し、再懸濁することにより空洞内に気体成分を提供した。

水中のナノ粒子の懸濁液を大きいペトリ皿中60℃で一晩空気乾燥した。次に、ドライケーキを液体媒体（DI水または5%グルコースなど）中に懸濁し、8時間まで厳密に混合して粒子の分散を最大化させた。106 μmおよび32 μmの粗い（course）ろ過の組み合わせを用いて、分散しないミリメートルサイズの凝集物を除去した。2.7 μmおよび1.6 μmのシリンジろ過（Whatman, GE Healthcare Life Sciences, UK）を用いて、必要に応じてミクロの凝集物を除去した。

実施例３
3つの異なるサイズのナノカップを実施例1のプロトコールに従って製造し、実施例2に従って乾燥および再懸濁した。サイズのばらつきは、以下の通りに異なるサイズのポリスチレンシードナノ粒子を用いることにより達成された。
小さいナノ粒子: 100 nm ポリスチレンシード
中間のナノ粒子: 300 nm ポリスチレンシード
大きいナノ粒子: 460 nm ポリスチレンシード

実施例1に従って製造したナノカップのサイズ分布を動的光散乱法により決定した。結果を図7aに示す。図7aは、用いた殻サイズのばらつきにより、小さい粒子サイズの分布を有し、かつよく制御された粒子サイズを有するナノカップを製造できることを実証している。

図7bは、透過型電子顕微鏡像から測定した、小さい、中間の、および大きいナノカップの空洞サイズのサイズ分布を示す。図7cおよび7dは、0.5 MHz（c）および1.6 MHz（d）において実験的に決定され、数値的に予測された、小さい、中間の、および大きいナノカップの慣性キャビテーション閾値を示す。

実験的に決定された慣性キャビテーション閾値（白丸）は、半球状空洞の修正Rayleigh-Plessetモデルにより予測された慣性キャビテーション閾値（灰色の十字架）と合致することが示される。

実施例４
蛍光薬物モデル、および実施例2の方法を用いて作製した蛍光(9-アントラセニルメチルメタクリレート)ナノカップを連続的にチャネルを通して流しながら、2.2 MPa (5%デューティサイクル)、1.6 MHzの中心周波数にて5分間、1 wt% アガロースを含む組織ミミックを超音波に曝露した。用いた蛍光薬物モデルは、テトラメチルローダミン - 40kDa デキストランであった。超音波の適用後にチャネルに対して半径方向に組織ミミックをスライスし、薬物モデルの蛍光画像を可視化した。図8cは、超音波曝露後の最初の組織チャネルから離れる薬物の移動を示す。薬物の移動は、ナノカップへの超音波の適用により引き起こされるキャビテーション効果により媒介される。

図8aは、ナノカップを省略した対応する実施例を示し、図8bは、本発明のナノカップをSonoVueマイクロバブル (平均直径5ミクロン、Braccoより入手可能）に置換した対応する実施例を示す。図8dは、4 MPa、1.5%のデューティサイクルおよび1.6 MHzの中心周波数にて超音波に曝露した本発明の蛍光ナノカップを用いた対応する実施例を示す。図8において、白い点線はHIFUの焦点の縁を示し、(a)における灰色の点線はフローベッセルの縁を表す。白い矢印は超音波の方向を示す。全てのイメージにおいて、モデル薬物および蛍光ナノカップを各イメージ中に矢印で標識している。スケールバーは1 mmを表し、これは全てのイメージに適用される。

実施例5
(a) 本発明によるガスポケットを有するナノカップ、および(b)ガスポケットを有しないナノカップの特性を比較するために、2種類のナノカップを作製した。実施例1のプロトコールに従ってナノカップを作製した。一部のナノカップは乾燥しなかった。他のものは実施例2に従って乾燥し、再懸濁した。

図9aは、0.5 MHzの中心周波数にて超音波に曝露した、乾燥および再懸濁した300 nm ポリスチレンシード粒子（白四角）、乾燥および再懸濁しないナノカップ（黒三角）、および乾燥および再懸濁したナノカップ（白丸）の慣性キャビテーションの確率を示す。

図9bおよびcは、慣性キャビテーション閾値より上（b）および下（c）のナノカップから達成されたキャビテーションのパワーを示す。トータルのパワーを広帯域成分（慣性キャビテーション源により生成されたシグナルを示す。）および調波成分（安定なキャビテーション源により生成されたシグナルを示す。）に分割した。

実施例6
S. Graham, R. Carlisle, J. Choi, M. Stevenson, A. Shah, R. Myers, K. Fisher, M.-B. Peregrino, L. Seymour, and C. C. Coussios, "Inertial cavitation to non-invasively trigger and monitor intratumoral release of drug from intravenously delivered liposomes," Journal of Controlled Release, vol. 178, pp. 101-107, 2014に記載されるように、丸底フラスコ中の2クロロホルム: 1メタノール中でDSPE、コレステロール、DSPC、およびDSPE-PEGを65:25:3:7の比で混合することにより（DSPEリポソーム）、キャビテーション感受性リポソーム内に被包したルシフェリンを作製した。

グルコースのみの存在下での0.5 MHzまたは1.6 MHzのいずれかの超音波へのリポソーム（平均直径140 nm）の曝露は放出を生じなかった。Sonovue（登録商標）（SV）マイクロバブル（平均直径5ミクロン、Braccoより入手可能）の存在下でのリポソームの曝露は、両周波数においてほぼ完全な放出を生じた。ナノカップ（NC）（平均直径300 nm、上記実施例1および2に記載の通りに製造した）の存在下でのリポソームの曝露は、0.5 MHzにおいてSVと同等の放出を生じ、1.6 MHzにおいては放出はわずかに劣っていた。結果を図10に示す。

これは、生物医学的超音波周波数範囲にわたってナノリポソームと同等のサイズのキャビテーション誘発性粒子を用いてキャビテーション介在性の放出を実現することが可能であることを実証する。マイクロバブルと異なり、ナノカップは、漏れやすい腫瘍血管系（上皮結合間隙100〜800 nm）を超えてリポソームと共に腫瘍内の蓄積に成功できる。

実施例7
Balb/cマウスにCT-26マウス結腸直腸癌細胞を皮下移植した。ナノカップ（NC）を連続的に静脈注射した。超音波でキャビテーションを誘発した。図11aは、体積100〜300 mm³の腫瘍（点線により輪郭を付した）を示す（従来のBモードイメージ上に重ね合わせたPassive Acoustic Mappingによりマッピングした）。図11aの上列は、腫瘍における2 MHzの超音波の単一のバースト後のキャビテーションのマッピングを示し、2列目は腫瘍全体にわたる超音波の複数のバースト後の累積のキャビテーション活性を示す。図11bのグラフは、各注入後の腫瘍におけるキャビテーションのレベルの増加を立証しており、NCが腫瘍内の蓄積に成功していることを示している。

Claims (36)

1. 複数のナノ粒子、および、液体媒体である医薬的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物であって、各ナノ粒子は、
   空洞を有するカップ、および
   該空洞中に存在するガスポケット
   を含み、該ガスポケットは該カップにより部分的に被包されており、かつ、該ナノ粒子は該カップ中に存在する単一のガスポケットを有する単一のカップを含む、前記医薬組成物。
2. 該カップが実質的に部分球状である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 該カップが実質的に半球状である、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 該カップが実質的に均一な壁の厚さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. 該カップが10〜100 nmの壁の厚さを有する、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 該カップが30〜70 nmの壁の厚さを有する、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 該空洞が実質的に部分球状である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. 該空洞の開口が50〜900 nmである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
9. 該空洞の開口が50〜400 nmである、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 該ナノ粒子が60〜500 nmのサイズである、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 該カップおよび該空洞の両方が実質的に部分球状であり、該カップが10〜100 nmの実質的に均一な壁の厚さを有し、かつ該空洞の開口が50〜900 nmの直径を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
12. 該空洞の開口が50〜400 nmのサイズである、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 該カップが50 nmより大きい深さを有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. 該カップがポリマーを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 該ポリマーが2以上の異なるモノマー単位から作られており、一つのモノマー単位は主に該カップの内側表面に存在し、かつ別のモノマー単位は主に該カップの外側表面に存在する、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 該ポリマーがメチルメタクリレート（MMA）および2-ヒドロキシエチルメタクリレート（HEMA）の共重合体である、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
17. 該ポリマーが架橋ポリマーである、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
18. 該ポリマーがフリーラジカル重合反応において架橋剤としてジビニルベンゼンを用いることにより得られるものである、請求項１６に記載の医薬組成物。
19. 該ナノ粒子が1以上の放出剤を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
20. 放出剤が、該カップ内、該カップの外側表面上、および／または該カップの該空洞中に存在する、請求項１９に記載の医薬組成物。
21. 該ナノ粒子が該カップの該空洞中に第1の放出剤を含み、かつ該カップの外側表面上に第2の放出剤を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
22. １以上の放出剤が薬物である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
23. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物を製造するための方法であって、該方法は、
    シード粒子を提供すること、
    好ましくは該シード粒子の表面上で重合を行うことにより、該シード粒子を部分的に被覆して、空洞を有するカップを提供すること、
    該カップを乾燥すること、
    該カップに気体を提供して、該空洞内に該気体のポケットを作ること、および
    該ナノ粒子を液体媒体中で再懸濁すること
    を含む、前記方法。
24. 該カップを乾燥する工程および該カップに気体を提供する工程が、該カップを空気中で乾燥することにより行われる、請求項２３に記載の方法。
25. 該シード粒子が、該シード粒子の存在下で乳化重合を行うことにより被覆され、該重合が1以上のモノマーおよび／またはプレポリマー、および任意に架橋剤を用いて行われる、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 該架橋剤がジビニルベンゼンである、請求項２５に記載の方法。
27. 該重合がフリーラジカル重合である、請求項２６に記載の方法。
28. 該シード粒子が100〜600 nmの直径を有する、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 該ナノ粒子が1以上の放出剤を含み、かつ、該方法が、(a) 該シード粒子上に被覆として、および／または(b) 重合中に、および／または(c) 該カップの外側表面上に、放出剤を提供することを更に含む、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 2以上の異なる放出剤が提供される、請求項２９に記載の方法。
31. 該組成物が、0.2以下の多分散性インデックスを有するナノ粒子を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
32. ヒトまたは動物対象に超音波を曝露することを含む該対象の治療または診断方法において使用するための剤であって、該剤が請求項１〜２２および３１のいずれか１項に記載の医薬組成物を活性剤として含む、前記剤。
33. 該超音波が5 MPa未満の圧力振幅を有する、請求項３２に記載の剤。
34. 該方法が腫瘍の治療方法である、請求項３２または３３に記載の剤。
35. 該ナノ粒子が請求項２２に記載されるものであり、超音波に曝露されると、該薬物またはそれぞれの薬物が該ナノ粒子から放出される、請求項３３〜３４のいずれか１項に記載の剤。
36. 該ナノ粒子が請求項２１に記載されるものであり、該ナノ粒子が超音波に曝露されると、該第1の放出剤および該第2の放出剤が混合する、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の剤。