JP6576374B2 - 集団検出によるアリコート選別 - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
本願は、２００９年４月１３日に出願された米国仮特許出願６１／１６８，８９２号の利益を主張し、この米国仮特許出願は、あらゆる目的のために本明細書中に明確に参考として援用される。

政府支援の研究または開発の下で行われた発明に対する権利に関する陳述
該当なし
コンパクトディスクで提出した「配列表」、表またはコンピュータプログラムリスト附表への参照
該当なし

発明の背景
体液は、液体中の生体粒子による複合懸濁液である。例えば、血液は、血漿および細胞（赤血球、白血球、血小板）を包含し、これらの細胞は、血液の約５５％を占める。血漿は、大半が水であり、タンパク質、イオン、ビタミン、酵素、ホルモン、ならびに他の化学物質を、体内の細胞へと移動させる。

赤血球は、サイズが約６〜８μｍであり、細胞に酸素を供給するのに用いられる。白血球は、直径が約１０〜１３μｍであり、免疫系の一部として外来のウイルスおよび細菌に対して抗戦することにより、身体を疾患から防御する。血小板は、１．５〜３μｍと細胞で最も小さく、血餅を形成することにより出血を停止させる。

血液に加えて、唾液、涙液、尿、脳脊髄液のほか、各種の内臓（例えば、肺）と接触する他の体液などの流体は、細胞と生体粒子との混合物を含有する。具体的な体液（例えば、血液）中に存在する細胞および生体粒子の種類および量は、その生物の健康についての情報を明らかにし、感染個体の場合は、その疾患の診断および予後診断についての情報を明らかにする。

一部の細胞または生体粒子は、血液細胞の名目濃度と比較して、希少量で存在する。それらの生起が希少であるにもかかわらず、これらの細胞または生体粒子は、体内で生じて個体の健康状態を変化させる重大事象と複雑に結びつく場合がある。これらの細胞を一般に、「希少細胞」と称する。

例えば、原発性腫瘍から癌細胞が播種されることは、癌患者における再発の確率および生存の比率を統御する重要な因子である。癌細胞が制御されない形で増殖し、互いに対して接着する能力を喪失するにつれ、それらは、血液循環およびリンパ液循環中に侵入して全身を循環する場合がある。これらの細胞は一般に、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）、循環癌細胞（ＣＣＣ）、循環上皮細胞（ＣＥＣ）、潜伏腫瘍細胞（ＯＴＣ）、または充実性腫瘍に対する直接の生検により得られる標本と対照的なこれらの細胞の移動的性質を指し示す他の類似の呼び換えとして称される。ＣＴＣは、すべての主要な癌：前立腺癌、卵巣癌、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、腎癌、肺癌、膵臓癌、および他の癌に罹患する患者の血液中において検出されている。

このようにして、体液中に存在するＣＴＣをカウントする検査が開発され、癌患者に予後診断を提供する際の一助となっている。「ＣＴＣ検査」はまた、具体的な治療（例えば、放射線療法または化学療法）プロトコールが患者に奏効したかどうかをモニタリングするのにも用いることができる。ＣＴＣ検査の結果に基づき、癌患者は、健康保険が支給されない場合であることが多い、さらなる不要で高価な診断検査および治療、例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンまたは陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャンを最小限とするか、または有効でない薬物治療を短縮することにより、費用があまりかからないようにすることが可能となりうる。

しかし、末梢血中におけるＣＴＣの存在は極めて低濃度であり、単核細胞１０^６〜１０^７個当たり腫瘍細胞１個のオーダーであると推定され、これは、末梢血０．５ｍｌ〜５ｍｌ当たり腫瘍細胞１個と同等の濃度である。このような低濃度では、少なくとも１個のＣＴＣを９９．９９５％の確実性で検出するために、推定１億個の単核細胞を伴う試料をスクリーニングしなければならない。典型的には細胞８００個／秒の速度で走査する自動式デジタル顕微鏡（ＡＤＭ）など、従来の技法を用いるなら、このサイズの試料を完全に走査するのに１８時間が要求されることから、臨床で用いるには費用および時間の面で非実用的となるであろう。

例えば、従来のフローサイトメトリーを用いて、血液試料中におけるＣＴＣの存在または量を決定することができる。しかし、フローサイトメトリーは、細胞が一列の直線状に構成されることを要請し、既存の技法を用いては、２つの細胞を同時に検出しても正確には解釈できないため、各細胞を１個ずつ検出する。フローサイトメトリーでは、所与の任意の時点において、単一の粒子だけを照射するように、レーザービームを集光する。例えば、非蛍光細胞が、フローサイトメーターにより検出可能となるように構成された蛍光細胞と同時に検出容量を横切る場合であれば、このフローサイトメーターにとって不可視である非蛍光細胞も、蛍光細胞と同じ流跡へと方向づけられるであろう。フローサイトメトリーでは、解釈の誤りを回避するため、検出容量中において２つの細胞が重複することを回避するのに十分な細胞間距離を可能とするように、細胞懸濁液を希釈または緩徐化することが日常的である。最新のフローサイトメーターの分取上限は、検体１００，０００個／秒である。

したがって、フローサイトメトリーは、希少細胞を検出または回収するのに適さない。細胞を一度に１個ずつ（直列的に）検出し、各細胞の流跡について判定を行うことは、莫大な個数の細胞を解析する場合、時間を取りすぎる。例えば、１０ミリリットルの血液は、約１００億個の細胞を含有しているので、最新のフローサイトメーターの最高分取速度である、１秒当たり細胞１００，０００個では、１０ｍＬの含量を完全に分取するのに、１００，０００秒間または２８時間を要するであろう。希少細胞の場合、統計学的に有意な数の希少細胞を捕集するには、７〜１５ｍＬの血液が要求されることが多く、フローサイトメーターを用いて希少細胞を回収することは、臨床資源を非実用的な形で浪費することであり、極めて高額の検査費用に転換しうる。

したがって、流体試料中における希少粒子および希少細胞を検出および定量化するための単純で費用／時間効果の高い技法が必要とされている。流体試料において希少粒子を検出するための方法および装置を提供することにより、本発明は、これらおよび他の必要を満たす。

他の態様にもまして、本発明は、アリコートを選別することにより、大容量の流体を迅速に走査して、所望の生体粒子を検出および／または定量化するための方法および装置を提供する。一態様では、用いられる、集団判定のためのアリコート選別（「ｅＤＡＲ」）と称する概念が、体液（ｂｉｏｆｌｕｉｄ）中における希少細胞を検出するのに特に有用である。

一態様では、本発明は、流体試料中における希少粒子を検出する方法であって、該流体試料のアリコートにおいて希少粒子の存在または不在を検出するステップと；該希少粒子の存在または不在に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；該割り当てられた値に基づき、該アリコートの流動または捕集を方向づけるステップとを含む方法を提供する。

第２の実施形態では、本発明は、生物学的流体中に希少粒子の存在を伴う状態について、被験体に診断または予後診断を提供する方法であって、該生物学的流体のアリコートにおいて該希少粒子の存在または不在を検出するステップと；該希少粒子の存在または不在に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；該割り当てられた値に基づき、該被験体に診断または予後診断を提供するステップとを含む方法を提供する。

第３の態様では、本発明は、流体試料において希少試料を検出するためのデバイスであって、少なくとも第１の流入路と；少なくとも２つの流出路と；該流体試料のアリコートにおいて１以上の希少粒子を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と；該アリコートの流動を方向づける機械装置と；該アリコート中における該希少粒子の存在、不在、内容、組成、または量に基づき、該アリコートに値を割り当てることが可能なコンピュータであって、該検出器ならびに該アリコートの流動を方向づける該機械装置と通信するコンピュータとを含むデバイスを提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
流体試料中における希少粒子を検出する方法であって、
（ａ）該流体試料のアリコートにおいて希少粒子の存在または不在を検出するステップと；
（ｂ）該希少粒子の存在または不在に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；
（ｃ）該割り当てられた値に基づき、該アリコートの流動または捕集を方向づけるステップと
を含む方法。
（項目２）
前記希少粒子の存在を検出する前記ステップが、
（ｉ）検出試薬を該検出試薬および希少粒子を含む複合体へと転換するのに適する条件下において、前記流体試料を、該検出試薬と接触させるサブステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成された複合体の存在または不在を、該流体試料のアリコートにおいて検出するサブステップと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記希少粒子の存在を検出する前記ステップが、
（ｉ）外部の電磁放射線源により前記アリコートを探査するサブステップと；
（ｉｉ）前記希少粒子の蛍光を検出するサブステップと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
希少粒子の存在を検出する前記ステップが、該希少粒子の生物発光または化学発光を検出する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記希少粒子が、希少細胞である、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記アリコートが、１つを超える希少粒子を含有する、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記流体試料が、生物学的流体である、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
各々が異なる特異性を有する、識別が可能となる複数の検出試薬を、該複数の検出試薬および複数の希少粒子を含む複数の複合体へと転換するのに十分な条件下において、前記流体試料を、該複数の検出試薬と同時に接触させる、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記複数の複合体を同時に検出する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記検出試薬が、異なる波長の蛍光により識別が可能となる、項目８または９に記載の方法。
（項目１１）
前記アリコートが希少粒子を含有すれば第１の値を該アリコートに割り当てるか、または該アリコートが希少粒子を含有しなければ第２の値を該アリコートに割り当てる、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記第１の値が、前記アリコート中における前記希少粒子の本質または該アリコート中における該希少粒子の濃度のいずれかに依存する、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記割り当てられた値が同じ値を有する複数のアリコートを併せてプールする、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記検出するステップを、生物学的試料が、流路を連続的に流動する間に実施する、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記検出ステップの前に、前記流体試料の１つを超えるアリコートを物理的に分離する、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記検出ステップの前に、前記アリコートを、別個の流路またはチャンバーへと区分する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
生物学的流体中に希少粒子の存在を伴う状態について、被験体に診断または予後診断を提供する方法であって、
（ａ）検出試薬を該検出試薬および希少粒子を含む複合体へと転換するのに適する条件下において、前記被験体に由来する生物学的流体を、該検出試薬と接触させるステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）で形成された複合体の存在または不在を、該生物学的流体のアリコートにおいて検出するステップと；
（ｃ）ステップ（ａ）で形成された複合体の存在または不在に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；
（ｄ）該割り当てられた値に基づき、該被験体に診断または予後診断を提供するステップと
を含む方法。
（項目１８）
流体試料において希少粒子を検出するための装置であって、
（ａ）少なくとも第１の流入路と；
（ｂ）少なくとも２つの流出路と；
（ｃ）該流体試料のアリコートにおいて１以上の希少粒子を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と；
（ｄ）該アリコートの流動を方向づける機械装置と；
（ｅ）該アリコートにおける該希少粒子の存在、不在、本質、組成、または量に基づき、該アリコートに値を割り当てることが可能なコンピュータであって、該検出器および該アリコートの流動を方向づける該機械装置と通信するコンピュータと
を含む装置。
（項目１９）
前記機械装置により、前記アリコートの流動を、該アリコートが希少粒子を含有すれば第１の流出路へと方向づけるか、または該アリコートが希少粒子を含有しなければ第２の流出路へと方向づける、項目１８に記載の装置。
（項目２０）
前記機械装置により、希少粒子を含有するアリコートの流動を、前記希少粒子の本質、組成、または量に応じて、複数の流出路のうちの１つへと方向づける、項目１８または１９に記載の装置。
（項目２１）
前記アリコートの流動を方向づける前記機械装置が、電極、磁気エレメント、音響エレメント、または電気作動型エレメントを含む、項目１８から２０のいずれか一項に記載の装置。
（項目２２）
前記アリコートの流動を方向づける前記機械装置が、１以上の電気作動型バルブまたは電気作動型ピストンを含み、前記バルブまたはピストンが、第１の接合部で前記第１の流入路および前記２つの流出路と交わる、少なくとも第１の方向の流路における液体の流動を制御する、項目１８から２０のいずれか一項に記載の装置。
（項目２３）
前記検出器が、カメラ、電子増倍管、電荷結合素子（ＣＣＤ）による画像センサー、光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）、および相補性金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）による画像センサーからなる群から選択される、項目１８から２２のいずれか一項に記載の装置。
（項目２４）
前記アリコートを探査するための電磁放射線源をさらに含む、項目１８から２３のいずれか一項に記載の装置。

図１は、アリコート中における複数の粒子の同時検出、およびアリコートの方向を示す図である。 図２は、ｅＤＡＲで用いられてシグナル対ノイズ比を改善する、開口部を伴う遮蔽を示す図である。 図３は、ｅＤＡＲで用いられてシグナル対ノイズ比を改善する、緊密な間隔の開口部を伴う遮蔽を示す図である。 図４は、単一の流路と、２つのレーザーと、３つの検出器とからなるｅＤＡＲ装置を示す図である。 図５は、３つの流路と、１つのレーザーと、１つの検出器とからなるｅＤＡＲ装置を示す図である。 図６は、３つの流路と、１つのレーザーと、３つの検出器とからなるｅＤＡＲ装置を示す図である。 図７は、５つの流路と、１つのレーザーと、３つの検出器とからなるｅＤＡＲ装置を示す図である。 図８は、ｅＤＡＲ（上側パネル）および市販の機器（Ｖｅｒｉｄｅｘ製ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ；下側パネル）を用いて、血液に由来する循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）カウントを比較したことを示す図である。 図９Ａ〜Ｃは、各種の照明下において、ｅＤＡＲを用いて患者血液から捕獲した癌細胞の光学的画像を示す（矢印によりＣＴＣを示す）図である。図９Ａは、赤血球中におけるＣＴＣの明視野画像である。図９Ｂは、パンサイトケラチンの存在を表示する蛍光画像である。図９Ｃは、ＣＤ４５の不在を表示する蛍光画像であり、これにより、白血球をＣＴＣとして偽同定する可能性が除外される。 図１０Ａ〜Ｄは、通常の癌細胞から識別される癌幹細胞の光学的画像を示す図である。矢印は、癌幹細胞（ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）を指し示す。図１０Ａは、Ａｌｅｘａ ４８８−抗ＣＤ４４抗体（緑色）を検出する蛍光画像（５００〜５４０ｎｍ）であり；図１０Ｂは、Ａｌｅｘａ ６４７−抗ＣＤ２４抗体（赤色）を検出する蛍光画像（６４５〜７００ｎｍ）であり；図１０Ｃは、明視野画像である。図１０Ｄは、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞を表示する合成画像（矢印により、癌幹細胞を指し示す）である。 図１１Ａ〜Ｄは、懸濁液をアリコート分割するためのデバイス１１１０の作動を例示する図である。 図１２Ａ〜Ｃは、接合部１２４０で接合される５つの流路（１２１１、１２１２、１２１３、１２１４、および１２１５）を伴う、懸濁液をアリコート分割するために用いられるデバイス１２１０を例示する図である。 図１３は、接合部１１１６（または１２４０）の上流および下流の異なる位置に配置された２つのアバランシェ光ダイオード（ＡＰＤ）から捕集された蛍光シグナルを示す図である。プロット１３１０が、検出容量１１４０（または１２７０）のアリコート中おいてＥｐＣＡＭ分子の存在を検出するように構成された第１のＡＰＤからのシグナルトレース１３１１を示すのに対し、プロット１３２０は、流路１１１４（または１２１４）内におけるＥｐＣＡＭ分子の存在を検出するように構成された第２のＡＰＤからのシグナルトレース１３２１を示す。 図１４は、ｅＤＡＲを用いて、回収された癌細胞の百分率をパルス長の関数として例示する、プロット１４１０を示す図である。トレース１４２０は、パルス幅が１０ミリ秒以下の場合、１００％の癌細胞が適正な流路に捕集されたことを示す。 図１５は、回収された希少細胞の百分率を流入流速の関数として表示するトレース１５２０を伴う、プロット１５１０を示す図である。 図１６は、検出容量に到達する前に、不混和相により分離される別々の水性アリコートを用いて生体粒子を封入したことを例示する図である。

Ｉ．概観
一態様では、本発明は、流体試料中における希少粒子を検出および／または回収するための方法および装置を提供する。本明細書では、この態様において具体化される概念を、「集団判定のためのアリコート選別」または「ｅＤＡＲ」と称する。一実施形態では、ｅＤＡＲ法を、（ｉ）流体試料のアリコートにおいて希少粒子の存在または不在を検出するステップ；（ｉｉ）希少粒子の存在または不在により、該アリコートを選別するステップ；および（ｉｉｉ）該割り当てられた選別に基づき、該全アリコートの流動または捕集を方向づけるステップとして特徴づけることができる。

希少細胞を見出す場合、ｅＤＡＲは、速度において驚嘆すべき利点をもたらす。この例として、所望の希少細胞１０個を含有する１０ｍＬの細胞懸濁液について考察する。この場合、懸濁液容量のうちの約９９．９９９９％は、所望の希少細胞を１個も含有しない。フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ等など、既存の技法は、全懸濁液容量内に含有されるすべての細胞を直列的に無差別走査し、その結果、ほぼすべての時間が、所望の細胞を含有しない、懸濁液容量の９９．９９９９％の走査に費やされる。ｅＤＡＲは、懸濁液をアリコート分割することにより、全懸濁液の迅速で高レベルのスクリーニングを可能とする。細胞が、実際に希少であれば、大半のアリコートは、所望の細胞を含有しない。一実施形態では、これらのアリコートをヌルとして選別し、第１の流路を介して廃棄する。これに対し、希少細胞を確かに含有する少数のアリコートは非ゼロとして選別し、別個の流路またはチャンバーに捕集する。

このように、ｅＤＡＲは、従来のフローサイトメトリーとは異なる。フローサイトメトリーは、（１）粒子列を含有するシース流を用いることにより、生体粒子を、単一の縦列で（すなわち、列中において１個ずつ）流動させるステップと；（２）生体粒子を一度に１個だけ検出するステップと；（３）検出された生体粒子の流跡を決定するステップとにより作動する。検出された生体粒子が所望の場合は、例えば、各種の方法のうちの１つによりその生体粒子を方向づけ、特定の流跡に従わせ、捕集容器に到達させる。検出された生体粒子が所望でない場合は、その生体粒子を異なる流跡に方向づけ、異なる捕集容器に到達させる。

従来のフローサイトメトリーとは対照的に、ｅＤＡＲは、流体のアリコート（すなわち三次元細分）全体を探査して、アリコート全体に集団判定を行う。直列化（流体の１Ｄ細分であり、この結果、生体粒子は、単一の列に配列される）または平面化（流体の２Ｄ細分であり、この結果、生体粒子は、平面内における複数の平行列に配列される）と異なり、アリコート分割は、はるかにより高度のスループットをもたらす。フローサイトメトリーは、その検出器が、単一の細胞または単一の細胞平面に由来するシグナルだけを捕集するように構成されているため、アリコートを解析することは不可能である。フローサイトメーターで用いられる検出器には、検出点または検出平面の外部にある生体粒子が完全に不可視であり、その結果、生体粒子が、該検出点または検出平面の外部へと移動することを防止するために、シース流、誘導緩衝液、または他の流体力学的または幾何学的な絞込み機構が必要となる。ｅＤＡＲでは、１つを超える生体粒子平面または生体粒子層に及ぶアリコートの全体を解析する。ｅＤＡＲでは、単一の検出点または検出平面とは対照的に、アリコートの全体から発生するシグナルを解析する。

ｅＤＡＲは、希少細胞を検出または単離する既存の方法を上回る著明な高感度をもたらす。ｅＤＡＲの検出構成要素は、アリコート内の全体で発生した単一の光子も検出することが可能であり、したがって、検出可能な特徴を呈する生体粒子を逸することがない。アリコートの選別は、所望の生体粒子を完全に欠くと選別されるアリコートだけを排除するように構成されているため、偽陰性率が極めて低い。

本発明による実施形態は、体液から癌細胞または癌幹細胞を捕捉して癌の予後診断を提供すること；Ｇｉａｒｄｉａ属またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属などの寄生虫を捕捉して水質モニタリングを行うこと；マラリアに感染した赤血球を捕捉してマラリアの診断を行うこと；リンパ球および白血球を捕捉してＨＩＶのモニタリングを行うこと；母体血液中の胎児細胞を捕捉して疾患のスクリーニングを行うこと；幹細胞を捕捉して治療を行うこと；プリオン感染細胞を捕捉してプリオン関連疾患（例えば、狂牛病）のスクリーニングを行うことを含め、生物学および疾患の診断における多種多様な適用において用いることができる。

マラリアに加えて、本主題内容は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の診断およびモニタリングにおけるＣＤ４＋ Ｔリンパ球（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）のモニタリングにも用いることができる。ＣＤ４＋ Ｔリンパ球の絶対カウントは、抗レトロウイルス治療、およびＨＩＶ感染患者における日和見感染予防を開始するための基準として用いることができる。白血球（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｓ）（白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ））の部分集団であるＣＤ４＋ Ｔリンパ球の減少は、免疫学的防御の低下と強く相関する。すべてのＨＩＶ感染者において、３〜６カ月ごとにＣＤ４＋ Ｔリンパ球（ＣＤ４＋ Ｔ
細胞）レベルをモニタリングすることは、適切な治療戦略を開始し、治療の有効性を評価するための方法として、米国ＣＤＣの公衆衛生局により推奨されている。

一部の検査室では、３つの検査法による全白血球カウント、リンパ球である白血球の百分率、ならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞であるリンパ球の百分率の積を用いて、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の絶対数が確立されている。ＦＡＣＳＣｏｕｎｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）など、単一のプラットフォームによるフローサイトメーターは、開発途上国では市販されていないか、または携帯用デバイスとしては市販されていない。本主題内容による実施形態は、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球を、他の白血球およびＲＢＣから迅速に識別するのに用いることができる。

本発明による実施形態が対象とする、分離、濃縮、および／または単離のさらなる可能な適用には、母体血液中における胎児細胞をモニタリングして、遺伝子障害の診断およびプリオンの検出を出生前に行うことが含まれる。プリオンは、核酸を改変する手順による不活化に耐性である、低分子の感染性タンパク質粒子を包含する。加えて、本主題内容による実施形態は、胎児細胞、または他のマイクロ生体粒子もしくはナノ生体粒子に対して用いることもできる。

ＩＩ．定義
本明細書で用いられる「流体試料」とは、対象の希少粒子を含有する場合もあり、含有しない場合もある、任意の液体を指す。ある実施形態では、流体試料が、生物学的流体試料、例えば、血液試料、血漿試料、唾液試料、尿試料、リンパ試料、脊髄液試料などでありうる。他の実施形態では、試料が、環境流体試料、例えば、湖沼、河川、海洋、池、小河川、湧水、沼沢、貯水池などに由来する流体試料である。さらに他の実施形態では、試料が、水試料、例えば、海水脱塩処理場、浄水場、貯水池、湧水、小河川、氷水流、貯水塔、または飲用水の水源として意図されうる他の水源に由来する水試料でありうる。

本明細書で用いられる「希少粒子」とは、流体試料中に低レベルで存在する細胞または高分子を指す。ある実施形態では、希少粒子が、細胞、タンパク質、タンパク質複合体、核酸、核タンパク質複合体、炭水化物、代謝物、異化生成物などでありうる。ある実施形態では、粒子が、流体試料において、該流体中における全粒子集団の約１０％未満、または該流体中における全粒子集団の約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、約０．０１％未満、またはさらに低い％の濃度で存在する場合、その粒子を希少であると考えることができる。さらに他の実施形態では、希少粒子が、流体試料において、該流体中における全粒子集団の約１０^３分の１未満、または該流体中における全粒子集団の約１０^４分の１、１０^５分の１、１０^６分の１、１０^７分の１、１０^８分の１、１０^９分の１、１０^１０分の１、１０^１１分の１、１０^１２分の１以下で存在しうる。

具体的な実施形態では、希少粒子が、希少細胞である。希少細胞は、有核細胞の場合もあり、無核細胞の場合もある。希少細胞には、悪性の表現型を発現している細胞；母体の末梢血中における胎児細胞などの胎児細胞、腫瘍から血液または他の体液中へと流出した腫瘍細胞などの腫瘍細胞；ＨＩＶに感染した細胞、被験体の遺伝子をトランスフェクトした細胞など、ウイルスに感染した細胞；および自己反応性障害に罹患する被験体の末梢血中に存在する、Ｔ細胞またはＢ細胞の異常な亜型が含まれるがこれらに限定されない。

本明細書で用いられる「集団判定」とは、粒子集団内または粒子群内における特徴の存在または不在の検出に基づいてなされる判定を指す。ある実施形態では、複数の粒子を含有する流体試料のアリコート中における単一の特徴的粒子の存在または不在に基づき、集団判定がなされる。単一粒子の存在または不在に基づいてなされる集団判定は、アリコートの全体に（すなわち、アリコート中に存在するすべての粒子に）適用されることが重要である。

本明細書で用いられる「アリコート」とは、解析される流体試料の全容量のうちの一部を指す。アリコートは、三次元空間を占め、その中の粒子は、組織化されることなく、無作為に分布している。アリコートは、厚さが有限であり、粒子は、識別可能な層をなすことなく、厚さ方向に分布することが可能である。本発明の文脈では、アリコートを、細分化することなく、その全体において解析する。二次元空間を示唆し、流体力学的絞込みを用いることが典型的な現行の細胞分取法（例えば、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ等）を説明するのに用いられる、シート、リボン、平面、または類似の用語は、アリコートと考えられない。

ある実施形態では、アリコートが、より大量の流体試料の画分、例えば、流体試料の約１／２、または流体試料の約１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０以下からなる場合がある、ある実施形態では、アリコートが、例えば、流体試料の約１０％、または流体試料の約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．５％、約０．１％、約０．０５％、約０．０１％、０．００１％、またはさらに低い％からなる場合がある。したがって、本明細書で記載されるｅＤＡＲ法により検討または処理される流体は、例えば、少なくとも約２つのアリコート、または少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１００万、２００万、３００万、４００万、５００万、６００万、７００万、８００万、９００万、１，０００万以上のアリコートへと分割できる。当業者であれば、流体試料を区分するアリコートの数は、流体中において予測される希少粒子の数、および該流体試料の全容量に依存することを理解するであろう。

ある実施形態では、アリコートの容量が、例えば、約０．１ｎＬ〜約１０ｍＬ、または約１ｎＬ〜約１ｍＬ、または約１ｎＬ〜約１００μＬ、または約１ｎＬ〜約１０μＬ、または約１ｎＬ〜約１μＬ、または約１ｎＬ〜約１００ｎＬでありうる。

本明細書で用いられる「選別」という用語は、類別することにより、アリコートの定量的特性、定性的特性、または重要性を評価することを指す。一実施形態では、アリコートを、ヌル（例えば、アリコートにおいて希少粒子が検出されない場合）または非ゼロ（例えば、アリコートにおいて少なくとも１つの希少粒子が検出される場合）に選別することができる。一実施形態では、選別が二分法でありうる。他の実施形態では、例えば、アリコート中における希少粒子の濃度、アリコート中における希少粒子の本質（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、アリコート中における複数の異なる希少粒子の本質などと相関するさらなる類型によりアリコートを選別することができる。このように、例えば、約１〜１０、約１１〜２０、約１〜５０、約５１〜１００、約１〜１００、約１０１〜２０１等の濃度範囲に基づき、任意の数の類型を割り当てることができる。これらの選別には、所定の定量的類型の数もしくは定性的類型の数（例えば、０、１、２、３、４、５等）のうちの１つに対応する任意の数、またはアリコート中における希少粒子の数もしくは概数の実際の値に対応する数が割り当てられる。

本明細書で用いられる「検出可能な特徴」とは、希少粒子に随伴する特性、例えば、該希少粒子に内在的であるか、または該希少粒子に結合させるかもしくはコンジュゲートした検出可能部分に随伴する、感光特性、電気活性特性、生物活性特性、もしくは磁性特性を指す。

感光特性の例には、例えば、生体粒子の形態（粒子のサイズ、粒度、細胞内構造）、により一般的に誘導される、光の強度（光の反射、散乱、屈折、透過、または吸収）、蛍光、免疫蛍光などの変化が含まれる。

電気活性特性の例には、例えば、電荷、酸化状態、スピン状態、キャパシタンス、コンダクタンス、誘電特性、電気泳動における移動性、または分極率の変化が含まれる。

生物活性特性の例には、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼなどの酵素、および、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）、ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノジエチルベンゾチアゾリンスルホネート）、クロロナフトール（ｃｈｌｏｒｎａｐｈｔｈｏｌ）、ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）、ｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ブロモクロロインドリルホスフェート−ニトロブルーテトラゾリウム）などが含まれるがこれらに限定されない、これらの化学発光基質、発色（ｃｏｌｏｍｅｔｒｉｃ）基質、または化学蛍光基質との検出可能な相互作用が含まれる。

ある実施形態では、希少粒子を検出するのに用いうる部分には、ナノ粒子、マイクロビーズ、抗体およびそれらの断片、蛍光性抗体、磁性ナノ粒子、ポリマー分子、色素分子、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（例えば、アプタマー）、脂質分子、タンパク質分子などが含まれるがこれらに限定されない。

本明細書で用いられる「抗体」とは、抗原に特異的に結合してこれを認識する、免疫グロブリン遺伝子またはその断片に由来するフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認知されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ定常領域遺伝子、ラムダ定常領域遺伝子、アルファ定常領域遺伝子、ガンマ定常領域遺伝子、デルタ定常領域遺伝子、イプシロン定常領域遺伝子、およびミュー定常領域遺伝子のほか、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖として分類される。重鎖は、ガンマ鎖、ミュー鎖、アルファ鎖、デルタ鎖、またはイプシロン鎖として分類され、これらにより、免疫グロブリンのクラスである、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥがそれぞれ定められる。典型的には、抗体の抗原結合領域が、結合の特異性およびアフィニティーにおいて最も重要である。抗体は、ポリクローナルの場合もあり、モノクローナルの場合もあり、血清に由来する場合もあり、ハイブリドーマに由来する場合もあり、組換えによりクローニングされる場合もあり、また、キメラの場合もあり、霊長動物化される場合もあり、ヒト化される場合もある。

例示的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、四量体を含む。各四量体は、各対が、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と、１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）とを有する、２つの同一のポリペプチド鎖対からなる。各鎖のＮ末端は、抗原認識の主因となる、約１００〜１１０以上のアミノ酸による可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。

抗体は、例えば、完全な免疫グロブリンとして、または各種のペプチダーゼで消化することにより生成される、多数の十分に特徴づけされた断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域内のジスルフィド結合の下方において抗体を消化し、それ自体、ジスルフィド結合により軽鎖がＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１へと連結されたＦａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’_２をもたらす。Ｆ（ａｂ）’_２を軽度の還元条件下で還元して、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を切断し、これにより、Ｆ（ａｂ）’_２二量体をＦａｂ’単量体へと転換することができる。Ｆａｂ’単量体とは、本質的に、ヒンジ領域の一部を伴うＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年）を参照されたい）。完全抗体の消化との関連で、各種の抗体断片が定義されているが、化学的に、または組換えＤＮＡ法を用いることにより、このような抗体断片を新規に合成しうることを、当業者は理解するであろう。したがって、本明細書で用いられる抗体という用語はまた、全抗体を改変することにより作製される抗体断片、または組換えＤＮＡ法を用いて新規に合成される抗体断片（例えば、単鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレイライブラリーを用いて同定される抗体断片（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）を参照されたい）も包含する。

一実施形態では、抗体を、標識または検出可能な部分にコンジュゲートする。

本明細書で用いられる「標識」または「検出可能部分」とは、分光分析的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段により検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識には、放射性核種、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）、ロダミン、テキサスレッド、イソチオシアン酸テトラメチルローダミン（ｔｅｔｒａｒｈｏｄｉｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコエリトリン等）、腫瘍関連プロテアーゼにより活性化される自己消光性蛍光化合物、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが含まれるがこれらに限定されない。

ある実施形態では、検出試薬を還流させて、単離細胞を選択的に標識することもでき、これらを目立たせることもできる。このような試薬の例には、蛍光分子、免疫蛍光分子、色素コンジュゲート分子（抗体、ｆａｂ断片、アプタマー、ポリマー、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、またはこれらの組合せなど）、磁性化合物、電気活性化合物、生物活性化合物、または感光性化合物が含まれるがこれらに限定されない。例は、上皮癌性細胞内における細胞骨格に不可欠な構成要素であるサイトケラチンと反応する染色剤を用いることである。他の色素の例には、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲートマウス抗ヒト上皮抗体（ＨＥＡ）およびフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ＣＤ４５抗体が含まれる。色素コンジュゲート抗体の他の例には、パンサイトケラチン抗体であるＡ４５Ｂ／Ｂ３、ＡＥ１／ＡＥ３、またはＣＡＭ５．２（サイトケラチン８（ＣＫ８）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、またはサイトケラチン１９（ＣＫ１９）を認識するパンサイトケラチン抗体）、ならびに乳癌抗原ＮＹ−ＢＲ−１（また、Ｂ７２６Ｐ、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、アンキリン反復ドメイン３０Ａとしても公知である）；Ｂ３０５ＤアイソフォームＡまたはＣ（Ｂ３０５Ｄ−ＡまたはＢ３０５Ｄ−Ｃ；また、抗原Ｂ３０５Ｄとしても公知である）；ヘルメス抗原（また、抗原ＣＤ４４、ＰＧＰ１としても公知である）；Ｅ−カドヘリン（また、ウボモルリン、カドヘリン１、ＣＤＨ１としても公知である）；癌胎児性抗原（ＣＥＡ；また、ＣＥＡＣＡＭ５または癌胎児性抗原関連細胞接着分子５としても公知である）；β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏｔｏｐｈｉｎ）（β−ＨＣＧ；また、ＣＧＢ、絨毛性（Ｃｈｒｏｎｉｃ）ゴナドトロピン、βポリペプチドとしても公知である）；カテプシンＤ（また、ＣＴＳＤとしても公知である）；ニューロペプチドＹ受容体Ｙ３（また、ＮＰＹ３Ｒ；リポ多糖会合タンパク質３（ＬＡＰ３）融合体としても公知である）；ケモカイン（ＣＸＣモチーフ受容体４；ＣＸＣＲ４）；癌遺伝子ＥＲＢＢ１（また、ｃ−ｅｒｂＢ−１、上皮細胞増殖因子受容体、ＥＧＦＲとしても公知である）；Ｈｅｒ−２ Ｎｅｕ（また、ｃ−ｅｒｂＢ−２またはＥＲＢＢ２としても公知である）；ＧＡＢＡ受容体Ａパイ（π）ポリペプチド（また、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡ−Ａ受容体パイ（π）ポリペプチド（ＧＡＢＡ Ａ（π）、γ−アミノ酪酸Ａ型受容体パイ（π）サブユニット）、または ＧＡＢＲＰとしても公知である）；ｐｐＧａｌＮａｃ−Ｔ（６）（また、β−１−４−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ６、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ６、ＧａｌＮＡｃＴ６、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ６、またはＧＡＬＮＴ６としても公知である）；ＣＫ７（また、サイトケラチン７、サルコレクチン、ＳＣＬ、ケラチン７、またはＫＲＴ７としても公知である）；ＣＫ８（また、サイトケラチン８、ケラチン８、またはＫＲＴ８としても公知である）；ＣＫ１８（また、サイトケラチン１８、ケラチン１８、またはＫＲＴ１８としても公知である）；ＣＫ１９（また、サイトケラチン１９、ケラチン１９、または ＫＲＴ１９としても公知である）；ＣＫ２０（また、サイトケラチン２０、ケラチン２０、またはＫＲＴ２０としても公知である）；Ｍａｇｅ（また、黒色腫抗原ファミリーＡ亜型またはＭＡＧＥ−Ａ亜型としても公知である）；Ｍａｇｅ３（また、黒色腫抗原ファミリーＡ３、またはＭＡＧＡ３としても公知である）；肝細胞増殖因子受容体（また、ＨＧＦＲ、乳頭状腎細胞癌遺伝子２、ＲＣＣＰ２、原癌遺伝子ｍｅｔ、またはＭＥＴとしても公知である）；Ｍｕｃｉｎ−１（また、ＭＵＣ１、癌抗原１５．３、（ＣＡ１５．３）、癌抗原２７．２９（ＣＡ２７．２９）；ＣＤ２２７抗原、エピシアリン、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）、ラッカセイ反応性尿ムチン（ＰＵＭ）、腫瘍関連糖タンパク質１２（ＴＡＧ１２）としても公知である）；嚢胞性疾患体液粗タンパク質（また、ＧＣＤＦＰ−１５、プロラクチン誘導性タンパク質、ＰＩＰとしても公知である）；ウロキナーゼ受容体（また、ｕＰＲ、ＣＤ８７抗原、プラスミノーゲン活性化因子受容体ウロキナーゼ型、ＰＬＡＵＲとしても公知である）；ＰＴＨｒＰ（副甲状腺ホルモン関連タンパク質；また、ＰＴＨＬＨとしても公知である）；ＢＳ１０６（また、Ｂ５１１Ｓ、低分子乳房上皮ムチン、またはＳＢＥＭとしても公知である）；プロスタテイン様リポフィリンＢ（ＬＰＢ、ＬＰＨＢ；また、抗原ＢＵ１０１、セクレトグロビンファミリー１−Ｄメンバー２、ＳＣＧＢ１−Ｄ２としても公知である）；マンマグロビン２（ＭＧＢ２；また、マンマグロビンＢ、ＭＧＢＢ、ラクリグロビン（ＬＧＢ）、リポフィリンＣ（ＬＰＣ、ＬＰＨＣ）、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１、またはＳＣＧＢ２Ａ１としても公知である）；マンマグロビン（ＭＧＢ；また、マンマグロビン１、ＭＧＢ１、マンマグロビンＡ、ＭＧＢＡ、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー２、またはＳＣＧＢ２Ａ２としても公知である）；哺乳動物セリンプロテアーゼ阻害剤（マスピン、また、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤クレードＢ（オボアルブミン）メンバー５、またはＳＥＲＰＩＮＢ５としても公知である）；前立腺上皮特異性Ｅｔｓ転写因子（ＰＤＥＦ；また、ステライルアルファモチーフ指向ドメイン含有ｅｔｓ転写因子、またはＳＰＤＥＦとしても公知である）；腫瘍関連カルシウムシグナル伝達性転写因子１（また、結腸直腸癌抗原ＣＯ１７−１Ａ、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、４０ｋＤａの上皮糖タンパク質（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮特異性抗原（ＥＳＡ）、消化管腫瘍関連抗原７３３−２（ＧＡ７３３−２）、ＫＳ１／４抗原、第４染色体膜構成要素表面マーカー１（Ｍ４Ｓ１）、ＭＫ−１抗原、ＭＩＣ１８抗原、ＴＲＯＰ−１抗原、またはＴＡＣＳＴＤ１としても公知である）；テロメラーゼ逆転写酵素（また、テロメラーゼ触媒サブユニット、またはＴＥＲＴとしても公知である）；トレフォイル因子１（また、乳癌エストロゲン誘導性配列、ＢＣＥＩ、消化管トレフォイルタンパク質、ＧＴＦ、ｐＳ２タンパク質、またはＴＦＦ１としても公知である）；葉酸；またはトレフォイル因子３（また、腸トレフォイル因子、ＩＴＦ、ｐ１．Ｂ；またはＴＦＦ３としても公知である）に対する色素コンジュゲート抗体が含まれるがこれらに限定されない。

抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」という語句、または、希少粒子、例えば、タンパク質、核酸、もしくは細胞に言及する場合における「〜と特異的に（または選択的に）免疫反応性である」という語句は、異種粒子集団および他の生物学的物質中におけることが多い希少粒子の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定のイムノアッセイ条件下において、特定の抗体は、具体的な希少粒子に、バックグラウンドの少なくとも２倍の強さで、およびより典型的には、バックグラウンドの１０〜１００倍超の強さで結合する。このような条件下における抗体に対する特異的な結合には、具体的な粒子に対するその特異性について選択された抗体が要求される。例えば、選択された抗原と特異的に免疫反応性であるが、他のタンパク質とは免疫反応性でないポリクローナル抗体だけを得るように、ポリクローナル抗体を選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を除外することにより達成することができる。

一態様では、本発明は、試料流体中において１以上の希少生体粒子を検出する方法であって、ａ）前記試料流体の１以上のアリコートを探査するステップと；ｂ）単回の測定により、前記１以上のアリコートの各々において、前記１以上の希少生体粒子の存在または不在を検出するステップであって、前記１以上のアリコートのうちの少なくとも１つが、複数の生体粒子を含むステップと；ｃ）前記１以上の希少生体粒子の存在または不在に基づき、前記アリコートを選別するステップとを含む方法を提供する。ある実施形態では、希少生体粒子が、細胞である。ある実施形態では、希少生体粒子が、蛍光標識細胞である。

本明細書で記載される方法の一部の実施形態では、単回の測定により複数のパラメータが検出される。具体的な実施形態では、複数のパラメータが、異なる蛍光色である。

本明細書で記載される方法のある実施形態では、前記生体粒子またはそれらの組合せを含めた試料中における細胞の凝集を防止する化合物である、抗凝固剤を添加することにより、試料流体を安定化させる。

一部の実施形態では、アリコートの選別が二分法であり、例えば、アリコートが希少粒子を含有しない場合は、該アリコートに値「０」が割り当てられ、アリコートが希少粒子を含有する場合は、値「１」が割り当てられる。他の実施形態では、選別が二分法ではなく、例えば、アリコート中に存在する希少粒子の数、または試料中における希少粒子の本質に基づいて値が割り当てられる。ある実施形態では、コンピュータおよび選別アルゴリズムであるソフトウェアにより選別が実施される。

一部の実施形態では、本明細書で記載される方法が、アリコートを、それらの選別に基づいて流すステップをさらに含む。例えば、アリコートに割り当てられた値に基づき、アリコートの流動または捕集を方向づける。ある実施形態では、外部場を用いることにより、または流動を撹乱させることによりこれを達成する。

ある実施形態では、方法が、前記選別が同様であるアリコートを捕集および／またはプールすることにより、希少生体粒子を濃縮するステップを含みうる。

本明細書で記載される方法の一部の実施形態では、希少生体粒子が、癌細胞、癌幹細胞、Ｇｉａｒｄｉａ属、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、マラリアに感染した赤血球、リンパ球、白血球、胎児細胞、幹細胞、およびプリオン感染細胞からなる群から選択される。

別の態様では、本発明は、試料流体中における１以上の希少生体粒子を検出するデバイスであって、ａ）１以上のアリコートの各々において１以上の希少生体粒子の存在または不在を検出する１以上の検出器であって、前記１以上のアリコートのうちの少なくとも１つが、複数の生体粒子を含む検出器と；ｂ）前記１以上の希少生体粒子の存在または不在に基づき、前記アリコートを選別するためのソフトウェアを伴うコンピュータとを含むデバイスを提供する。一実施形態では、選別が二分法である。デバイスを用いて複数種類の生体粒子を検出する他の実施形態では、選別が非二分法である。

ある実施形態では、デバイスが、前記選別に基づき、前記アリコートを流すための流路をさらに含みうる。ある実施形態では、抗凝固化合物、希少生体粒子に優先的に結合する化合物、生体粒子の凝集を防止する化合物、またはこれらの組合せにより流路を処理する。

ある実施形態では、デバイスが、前記生体粒子の流跡を追跡および操作するための電極をさらに含みうる。他の実施形態では、デバイスが、磁性粒子を結合させた生体粒子を分離するための磁性エレメントをさらに含みうる。他の実施形態では、デバイスが、前記生体粒子の流跡を追跡および操作するための音響エレメントをさらに含みうる。

本明細書で記載されるデバイスおよび装置のある実施形態では、デバイスが、カメラ、電子増倍管、電荷結合素子（ＣＣＤ）による画像センサー、光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）、または相補性金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）による画像センサーから選択される１以上の検出器を含む。

本明細書で記載されるデバイスおよび装置のある実施形態では、デバイスが、前記試料流体の１以上のアリコートを探査するための１以上の線源をさらに含みうる。例えば、電磁放射線源である。具体的な実施形態では、探査するための１以上の線源が、レーザー（固体レーザー、ダイオード励起レーザー、イオンレーザー、または色素レーザー）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、ランプ、アーク放電、磁気パルス、または天然光から選択される。生体粒子が化学発光または生体発光などの発光を呈するさらに他の実施形態では、アリコートを探査するための線源が要求されない。

ＩＩＩ．実施形態
Ａ．検出方法
一態様では、本発明は、流体試料中における希少粒子を検出する方法であって、（ａ）該流体試料のアリコートにおいて希少粒子の存在または不在を検出するステップと；（ｂ）該希少粒子の存在または不在に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；（ｃ）該割り当てられた値に基づき、該アリコートの流動または捕集を方向づけるステップとを含む方法を提供する。

一実施形態では、該希少粒子の存在を検出する該ステップが、（ｉ）検出試薬を該検出試薬および希少粒子を含む複合体へと転換するのに適する条件下において、該流体試料を、該検出試薬と接触させるサブステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成された複合体の存在または不在を、該流体試料のアリコートにおいて検出するサブステップとを含む。

ある実施形態では、検出試薬が、標識抗体または未標識抗体、ｆａｂ断片、アプタマー、ポリマー、ナノ粒子、マイクロビーズ、蛍光抗体、磁性ナノ粒子、ポリマー分子、色素分子、アプタマー、脂質分子、タンパク質分子などを含みうる。

別の実施形態では、該希少粒子の存在を検出する該ステップが、（ｉ）外部の電磁放射線源により該アリコートを探査するサブステップと；（ｉｉ）該希少粒子の蛍光を検出するサブステップとを含む。

一実施形態では、希少粒子が、蛍光標識細胞を含みうる。ある実施形態では、蛍光標識細胞が、蛍光タンパク質を発現させる細胞、または蛍光検出試薬により標識されている細胞を含みうる。例えば、赤色蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質を一過性にまたは安定的に発現させる細胞である。

希少粒子が内在的な化学発光または生物発光を呈するさらに別の実施形態では、希少粒子の存在を検出するステップが、該希少粒子の生物発光または化学発光を検出するステップを含む。

ある実施形態では、希少粒子が、細胞、タンパク質、タンパク質複合体、核酸、核タンパク質複合体、炭水化物、代謝物、異化生成物などでありうる。一実施形態では、希少粒子が、細胞である。具体的な実施形態では、細胞が、癌細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、癌幹細胞、癌表面抗原、例えば、ＣＤ４４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１４０ｂ、またはこれらの組合せからなる群から選択される表面抗原を提示する癌細胞でありうる。

ＣＤ４４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ６４、またはＣＤ１４０ｂが含まれうるがこれらに限定されないバイオマーカーに選択的に結合する他の試薬を還流させることにより、癌幹細胞を、通常の癌細胞から識別することができる。

希少粒子が癌細胞である、ある実施形態では、希少細胞を有するものとして同定されたアリコート内に含有される細胞を、さらに個別に分析することができる。例えば、従来のフローサイトメトリーまたはｅＤＡＲを介して、これらの細胞をさらに区分または分取することができ、所望の細胞を分析して、細胞機構の機能不全の原因を理解することができる。各細胞内の内容物を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ配列、代謝物、脂質、炭水化物、タンパク質含量などについて個別に解析することができる。

他の実施形態では、希少細胞が、寄生虫細胞または寄生虫生物体、例えば、Ｇｉａｒｄｉａ属種またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属種、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属種に感染した赤血球、ＨＩＶに感染したリンパ球または白血球、母体血液中における胎児細胞、幹細胞、プリオン感染細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞などでありうる。

一実施形態では、流体試料が、１つを超える種類の希少粒子、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種類以上の希少粒子を含みうる。したがって、ある実施形態では、各々が異なる特異性を有する、識別が可能となる複数の検出試薬を、前記検出試薬および複数の希少粒子を含む複数の複合体へと転換するのに十分な条件下において、流体試料を、前記複数の検出試薬と同時に接触させる。一部の実施形態では、例えば、１つを超える探査デバイスおよび／または１つを超える検出デバイスを含むｅＤＡＲ装置を用いることにより、複数の複合体を同時に検出する。

例えば、２つの希少粒子を同時に検出する場合は、各希少粒子を、それらの各々が２つの検出デバイスのうちの１つにより検出されうる、識別が可能となる検出試薬と接触させることができる。さらに、検出試薬が蛍光部分を含む場合は、２つの探査デバイス（例えば、異なる蛍光部分の励起波長に対応する異なる波長の放射を生じる２つのレーザー）を用いることができ、２つの異なる検出デバイスにより、それぞれの蛍光放射を検出することができる。したがって、一実施形態では、異なる波長の蛍光により、検出試薬が弁別可能となる。

さらに別の実施形態では、２つ以上の希少粒子を、順次検出することができる。例えば、一実施形態では、方法が、第１の希少粒子をｅＤＡＲ装置の第１の場所で検出し、第２の希少細胞をｅＤＡＲ装置の第２の場所で検出するステップを含みうる。このように、第１および第２の粒子が在中するアリコートを、第１の検出ステップの後で流すこともでき、第２の検出ステップの後で流すこともでき、両方の検出ステップの後で流すこともできる。

本発明のある実施形態では、細胞集団から特徴を検出することが、同時的になされる場合もあり、ある時間にわたり累積的になされる場合もある。例えば、特徴の検出は、生体粒子集団を含有する大量のアリコートから一度に（「同時的」に）生じうる。

方法が同時的方式で実施されるある実施形態では、生体粒子を、速度が可変的な流動により移送することができる。例として述べると、生体粒子に検出容量中を横切らせるとき、これらを一定の流動により移送することができる。代替的に、細胞に検出容量中を横切らせるとき、流動を停止させることもでき、減速させることもでき、加速させることもできる。検出容量の上流または下流において、以下：バルブ、泡沫、電場、磁場、光場、空気圧源、固体粒子、膜、不混和性の液滴、重力差、または流路の表面張力を変化させるコーティングのうちの１つにより、流動を制御することができる。

本明細書で記載される方法の一部の実施形態では、検出ステップを、流体試料が流路を連続的に流動する間に実施する。ある実施形態では、別々のアリコートを物理的に分離せず、光学的な検出ステップにより規定する、すなわち、アリコートを、検出が生起する瞬間に検出容量中に存在する粒子集団として規定することができる。

ある実施形態では、検出イベントを、検出容量のサイズおよび流体試料の流速の両方に依存する、規則的な頻度で生起させる。例えば、具体的な装置の検出容量が１０μＬであり、流体試料が１００μＬ／秒の速度で該装置内を流動する場合、異なるアリコートは、０．１秒間ごと、または１０Ｈｚの速度で検出される。

ある実施形態では、装置の形状および処理される流体の容量に応じて、別々のアリコートに検出容量中を横切らせる速度が、０．１ｋＨｚ〜１００ＭＨｚである。別の実施形態では、別々のアリコートに検出容量中を横切らせる速度が、約１０Ｈｚ〜約１０ＭＨｚである。他の実施形態では、別々のアリコートに検出容量中を横切らせうる頻度が、約０．１ｋＨｚ〜約１００ＭＨｚ、または約１ｋＨｚ〜約１０ＭＨｚ、または約１ｋＨｚ〜約５ＭＨｚ、または約１ｋＨｚ〜約１ＭＨｚである。ある実施形態では、別々のアリコートに検出容量中を横切らせる頻度が、少なくとも約０．１ｋＨｚ、または少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、もしくは９００ｋＨｚ、または少なくとも約１ＭＨｚ、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ＭＨｚでありうる。

本明細書で記載される方法の他の実施形態では、細胞集団から特徴を検出することが、単一細胞のオーダーにある少量の検出容量から、ある時間にわたり（「累積的」に）生じうるが、流動を用いることにより、検出容量中を複数の細胞に横切らせることもできる。ｅＤＡＲの累積的方式は、単一の生体粒子から生じる逐次的なシグナルまたはフレームを低速度で重ね合わせることとは異なる；単一の生体粒子を低速度で重ね合せても、生体粒子集団は構成されない。同時的判定および累積的判定のいずれにおいても、判定が行われるのは、特徴が細胞集団から検出された後に限られる。

本明細書で記載される方法のさらに他の実施形態では、検出前に、アリコートを物理的に分離することができる。これは、例えば、試料流体を、空気または連続的な油性不混和流体相により分離された別々の水性アリコートへと、例えば、液滴へと区分することにより達成することができる。

一実施形態では、水性アリコートを分離するのに用いられる不混和相には、有機相、油、鉱油および大豆油などの天然油、ＡＲ−２０油、ＡＳ−４油、ＰＤＭＳ油などのシリコーン油、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔおよびペルフルオロデカリン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｒｄｅｃａｌｉｎ）などのフッ化油、ヘキサデカンおよびアセトフェノンなどの有機溶媒、蝋、空気、またはガスが含まれうる。

ある実施形態では、不混和相が、連続相（すなわち、別々のアリコートの全体を取り囲む）の場合もあり、分断相（すなわち、別々のアリコート間の空隙だけを占め、これらのアリコートを完全には取り囲まない）の場合もある。

例えば、図１６は、別々のアリコートの全体を取り囲む不混和相（１６４２）を例示する。

一実施形態では、別々のアリコートが、液滴である。別の実施形態では、別々のアリコートが、栓流である。

一実施形態では、別々のアリコートを、流路と流体連絡したｅＤＡＲ装置上の流路において逐次的に形成することができる。

ある実施形態では、別々のアリコートを、ｅＤＡＲ装置の外部で形成させるが、流路と流体連絡したチューブ、ポート、または接続部を介して、該装置の流路へと流動させることができる。

一実施形態では、細胞懸濁液または不混和相に界面活性剤を添加して、別々のアリコートを安定化させることができる。界面活性剤には、アルブミン（ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）、Ｓｐａｎ ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノデシルエーテル、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＤＤＡＰＳ）などの両性イオン性界面活性剤、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム（ＡＯＴ）などの陰イオン性界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）などの陽イオン性界面活性剤、ならびにシリコーンベースの界面活性剤、ＰＥＧ化界面活性剤、およびフッ素化界面活性剤が含まれうる。

さらに別の実施形態では、検出ステップの前に、流体試料をアリコートに区分し、ｅＤＡＲ装置の別個の流路またはチャンバーへと物理的に分離することができる。次いで、後続の検出ステップを、並行的に（すなわち、複数の検出デバイスまたは単一の検出デバイスを同時に用いて）実施することもでき、例えば、別々のアリコートを、１以上の検出容量内へと逐次的に方向づけることにより、逐次的に実施することもできる。

本発明の一部の実施形態では、希少粒子を検出する前に、流体試料、例えば、生物学的流体試料を安定化させることができる。ある実施形態では、クエン酸、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、またはエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）などの抗凝固剤；メチロール、ホルムアルデヒド、ジアゾリジニル尿素（ｄｉａｚｏｌｉｎｉｄｉｎｙｌ ｕｒｅａ）、イミダゾリジニル尿素、メテナミン、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはグリオキサールなどのアミンまたはアミドのヒドロキシメチル誘導体などのアルデヒドなどが含まれるがこれらに限定されない試薬により流体を安定化させることができる。

本発明のさらに他の実施形態では、本明細書で記載される方法を、所望のアリコートを流した後で生起する副次的な過程とさらに組み合わせることができる。本明細書で記載される方法と組み合わせうる過程および／または機能の例には、例えば、細胞内容物（例えば、細胞内に封入されたＤＮＡ、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、脂質、代謝物、炭水化物、またはタンパク質）を同定するための選択的な反応が含まれる。これらの反応には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、等温ＰＣＲ、ＤＮＡの後成的状態を決定するための反応、マイクロＲＮＡ含量およびｓｉＲＮＡ含量を決定するための、単一分子によるハイブリダイゼーション反応、またはアプタマー（ＤＮＡの短鎖）選択反応が含まれる。

ある実施形態では、本明細書で記載される方法を、アリコートまたは細胞の単離を行った後のアッセイプロトコールとさらに組み合わせることができる。本明細書で記載される方法と組み合わせうるアッセイの非限定的な例には、ＲＮＡの抽出（増幅を伴う抽出または増幅を伴わない抽出）、ｃＤＮＡの合成（逆転写）、遺伝子のマイクロアレイ、ＤＮＡの抽出、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（単独ＰＣＲ、ネスト化ＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ、またはリンカー−アダプターＰＣＲ）、またはＤＮＡメチル化解析など、核酸ベースの方法；蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、細胞培養、または比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）研究などのサイトメトリー法；電気泳動、サザンブロット解析、または酵素結合免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの化学的アッセイ法；マイクロＲＮＡ含量およびｓｉＲＮＡ含量を決定するためのアッセイ；ＤＮＡ／ＲＮＡ含量を決定するためのアッセイ；脂質含量を決定するためのアッセイ；炭水化物含量を決定するためのアッセイ；代謝物含量を決定するためのアッセイ；タンパク質含量を決定するためのアッセイ；ならびに機能的細胞アッセイ（例えば、アポトーシスアッセイ、細胞泳動アッセイ、細胞増殖アッセイ、細胞分化アッセイ等）などが含まれる。

さらに別の実施形態では、本明細書で記載される方法を、フローサイトメトリーとさらに組み合わせ、例えば、選択されたアリコート中に存在する希少粒子をさらに区分または単離することができる。一実施形態では、本明細書で記載される方法に用いられるｅＤＡＲデバイスの流路を、フローサイトメーターと流体連絡させることができる。ある実施形態では、ｅＤＡＲとフローサイトメトリーとを組み合わせることにより、選択されたアリコートをさらに検討するか、または直列的に分取し、希少粒子または希少細胞の集団をさらに濃縮することができる。本明細書で記載される方法のある実施形態では、この構成により、上流において希少粒子または希少細胞を大まかに分取し、希少粒子または希少細胞を含有するアリコートだけを、フローサイトメトリーなど、下流の過程へと方向づけることが可能となり、これは、時間集約的、費用集約的、および／または労働集約的である。

ある実施形態では、本明細書で記載されるｅＤＡＲ装置を用いて、本明細書で記載される方法を実施することができる。

１．有利な特色
上述の通り、一つには、個々の細胞または粒子ではなく、全アリコートの集団検出および集団選別のために、ｅＤＡＲ法は、現在用いられている従来のフローサイトメトリー法よりはるかに迅速かつ廉価である。ｅＤＡＲ法の改良には、複数の特色が寄与している。

例えば、本明細書で記載される方法の一実施形態では、アリコートが、１つを超える粒子、細胞、または蛍光実体を含む。この点で、単一の細胞もしくは粒子、または細胞もしくは粒子の二次元シートではなく、複数の細胞または粒子を含有する別々の容量を同時に探査することができる。

本明細書で記載される方法の関連する実施形態では、流体のうちの粒子または細胞を、検出スポットまたは検出容量へと直列的に（すなわち、重複して存在させることなく、順々に）導入する必要がない。関連する実施形態では、粒子を単一の列または単一のシートの形で、検出スポットまたは検出容量へと導入する必要がない。したがって、本明細書で記載される方法の一実施形態では、単一のアリコート中における複数の生体粒子に、流路の断面または断面容量、例えば、探査容量および／または検出容量を、同時に流過させることができる。

本明細書で記載される方法の一実施形態では、生体粒子を単一の列に絞り込んで探査および／または検出するための、シース流、誘導緩衝液、または他の流体力学的もしくは幾何学的な絞込み機構を必要としない。

本明細書で記載される方法の一実施形態では、個々の生体粒子を分取する代わりに、全アリコートの選別スキームまたは値割当てスキームを用いる。

本明細書で記載される方法の一実施形態では、粒子集団または細胞集団が、例えば、より大量の流体試料の単一のアリコートとして、同時に検出される。関連する実施形態では、アリコートについてなされる判定が、該アリコート内に含有される粒子集団または細胞集団の全体に及ぶ。さらに別の関連する実施形態では、アリコート内において同時に検出される粒子集団または細胞集団が、粒子集団または細胞集団として維持される。

２．アリコートの選別
本明細書で記載される方法の一実施形態では、アリコートに、アリコートが希少粒子を含有すれば第１の値、またはアリコートが希少粒子を含有しなければ第２の値を割り当てる。ある実施形態では、選別（すなわち、値の割当て）が二分法である。例えば、少なくとも１つの希少粒子を含有する各アリコートに値１を割り当てる一方で、希少粒子を含有しない各アリコートには値０を割り当てる。

本明細書で記載される方法の別の実施形態では、アリコート中に存在する希少粒子の量により、アリコートに値を割り当てる。例えば、４個の希少粒子を含有するアリコートには、値４を割り当てる。代替的に、４個の粒子を含有するアリコートには、特定の希少粒子量の範囲、例えば、粒子０〜５個、１〜１０個、４〜６個等に対応する値を割り当てることもできる。

単一の流体試料中に複数種類の希少粒子が存在する、本明細書で記載される方法のさらに別の実施形態では、アリコート中における任意の希少粒子の本質により、該アリコートに値を割り当てる。例えば、流体試料が、２つの希少粒子であるＡおよびＢを含有する場合、ＡまたはＢのいずれも含有しないアリコートには値０を割り当てることができ、Ａだけを含有するアリコートには値１を割り当てることができ、Ｂだけを含有するアリコートには値２を割り当てることができ、ＡおよびＢの両方を含有するアリコートには値３を割り当てることができる。したがって、本明細書で記載される方法の一実施形態では、単一の流体試料中に複数種類の希少粒子が存在する場合、選別（すなわち、値の割当て）は、二分法ではない。

ある実施形態では、ヌル以外の割当て値が、希少粒子の本質または希少粒子の濃度に依存しうる。

ある実施形態では、割当て値が同じである複数のアリコートを、併せてプールするかまたは併せて流す。

本発明の方法の一実施形態では、アリコートを選別するか、またはこれに値を割り当てるには、能動的な判定が要請される。ある実施形態では、コンピュータ、コントローラー、集積回路を伴うチップ、プリント基板、電子素子、ソフトウェア、および／またはアルゴリズムを用いて、アリコートを選別するか、またはこれに値を割り当てる。

３．アリコートの流れおよび流体の流動
本発明のある実施形態では、アリコートの流動または捕集を方向づけることが、該アリコートに割り当てられた値に基づく。例えば、流体試料中に単一種類の希少粒子が存在する実施形態では、ヌルの値または値「０」を割り当てられたアリコートを、第１の流路へと方向づける（流す）または排出口へと方向づけ、正の値または値「１」を割り当てられたアリコートを、第２の流路または捕集チャンバーへと方向づけることができる。

流体試料中に複数種類の希少粒子が存在する、本発明の他の実施形態では、アリコート中に存在する希少粒子の具体的な組成に基づき、該アリコートを流すことができる。一実施形態では、希少粒子を含有しないアリコートを、第１の流路または排出口へと方向づけることができ、第１の種類の希少粒子を含有するアリコートを第２の流路または第１の捕集チャンバーへと方向づけることができ、第２の種類の希少粒子を含有するアリコートを第３の流路または第２の捕集チャンバーへと方向づけることができる。

ある実施形態では、複数種類の希少粒子を含有するアリコートを、具体的な流路または捕集チャンバーへと方向づけることができる。代替的に、アリコートを混合チャンバーまたは希釈チャンバーへと方向づけ、その後、希少細胞が、異なるサブアリコートへと区分されるように、混合または希釈されたアリコートを、サブアリコートへとさらに区分することができる。次いで、希少細胞を互いから分離しうるように、サブアリコート中の希少細胞を再度検出することができる。

本明細書で記載される方法の一実施形態では、外部場を用いることにより、または流動を撹乱させることにより、流すステップ（すなわち、アリコートの流動または捕集を方向づけるステップ）を実施することができる。

本発明の一態様では、アリコートが選別されたら、外部場を用いて、アリコートの方向づけを変化させることができる。外部場には、電場、磁場、動電力、電気泳動力、誘電泳動力、流体力、重力、空気圧式力、または光学力が含まれる。代替的に、空気、不混和性有機液体、またはマイクロビーズなど、細胞懸濁液と混和しない物質を導入することにより、流動の撹乱を外部から導入することもできる。

ある実施形態では、例えば、機械的原理（例えば、外部のシリンジ式ポンプ、空気式膜ポンプ、振動式膜ポンプ、真空デバイス、遠心力、および毛細管作用）；電気的原理または磁気的原理（例えば、電気浸透圧流、動電式ポンプ、圧電／超音波式ポンプ、磁気流体プラグ、電気流体力学式ポンプ、および磁気流体力学式ポンプ）；熱力学的原理（例えば、気泡発生／相変化誘導による容量拡張）；表面湿潤原理（例えば、エレクトロウェッティング、化学的に、熱的に、ならびに放射線により誘導される表面張力勾配）などに基づいて作動する方法およびデバイスが含まれるがこれらに限定されない、流体力学的な流体圧を誘導する方法およびデバイスにより、流動を送達することができる。

さらに他の実施形態では、自重送液、表面張力（毛細管作用など）、静電力（動電流）、遠心流（コンパクトディスク上に基質を配置し、回転させる）、磁気力（振動するイオンにより流動が引き起こされる）、磁気流体力学力および真空または圧力差により供給される流体駆動力を介して、流体を送達するかまたは流すことができる。

ある実施形態では、流体力学的流体圧または流体駆動力を誘導する方法およびデバイスに関して列挙したデバイスなどの流体流制御デバイスを、本主題内容の流入ポートまたは流出ポートと連結することができる。一例では、注入および排出の一方または両方に複数のポートをもたらし、１以上のポートを、流体流制御デバイスに連結する。

Ｂ．診断および予後診断の方法
一態様では、本発明が、流体試料、例えば、血液試料などの生物学的流体中に希少粒子の存在を伴う状態について、被験体に診断または予後診断を提供する方法を提供する。

一実施形態では、方法が、（ａ）生物学的流体のアリコートにおいて希少粒子の存在または不在を検出するステップと；（ｂ）該希少粒子の存在または不在に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；（ｃ）該割り当てられた値に基づき、該アリコートの流動または捕集を方向づけるステップとを含む。

別の実施形態では、方法が、（ａ）検出試薬を該検出試薬および希少粒子を含む複合体へと転換するのに適する条件下において、該被験体に由来する生物学的流体を、該検出試薬と接触させるステップと；（ｂ）ステップ（ａ）で形成された複合体の存在または不在を、該生物学的流体のアリコートにおいて検出するステップと；（ｃ）ステップ（ａ）で形成された複合体の存在または不在に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；（ｄ）該割り当てられた値に基づき、該被験体に診断または予後診断を提供するステップとを含む。

別の実施形態では、該希少粒子の存在を検出する該ステップが、（ｉ）外部の電磁放射線源により該アリコートを探査するサブステップと；（ｉｉ）該希少粒子の蛍光を検出するサブステップとを含む。

１００年を超える以前から、医師らには、細胞を血液中に流出させることにより癌が拡大することが知られてきた。血液が、これらの癌細胞を内臓から内臓へと移送し、癌が転移する。これらの遊離腫瘍細胞を、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と称する。一態様では、本発明が、末梢血から癌細胞をカウントおよび単離する正確な方法をもたらす。

天文学的な数の赤血球および白血球もまた存在するため、血液中のＣＴＣを正確に検出することは、極めて困難であることが分かっている。最大で５０億個の赤血球と、５００万個の白血球とが共存して、単一のＣＴＣを覆い隠しているので、ＣＴＣを検出することの問題は、文字通り、干し草の中で１本の針を見つけ出すことの問題である。

血液中における癌細胞の数を正確にカウントすることにより、本発明は、癌が拡大する過程についてのリアルタイムにおけるスナップショットをもたらす。ＣＴＣ血液検査を、従来の予後診断ツール（例えば、リンパ節の状態、腫瘍サイズ、および腫瘍の形態学的特色）から最も顕著に差別化するものは、ＣＴＣ血液検査を用いて、癌治療が有効であるかどうかについて、早期のフィードバックを提供しうるということである。６カ月にわたり化学療法を受けている患者は、３〜４週間ごとにＣＴＣカウントを測定され；このカウントが依然として高値であれば、癌専門医は、現行の治療が有効でないとみなし、新規の薬物を処方することができる。患者の観点から述べると、ＣＴＣ検査を受けることにより、（１）薬物１種類当たり、約３，０００ドル／月〜１０，０００ドル／月の費用がかかる場合がある、有効でない化学療法を排除することにより、実質的な節約が得られ、（２）それが遅きに失する前に、有効な治療を見出す貴重な機会が与えられる。これらの理由だけでも、癌専門医が、日常的に高価な放射線画像走査（例えば、ＣＴまたはＭＲＩ）を処方するのに十分な程度に重要である。しかし、一態様では、本発明が、放射線画像走査より安価で、安全で、より再現性が高い、迅速で廉価なＣＴＣ検査を提供し、かつ、放射線画像走査より正確ではないまでも、同程度に正確な予後診断情報を、これより６週間早く提供する。現在のところ、同様の利点をもたらすバイオマーカー検査はなされていない。

癌細胞の検出に高感度であるため、本明細書で説明される方法は、それらの濃度が、競合する技法の検出下限に達する前に癌細胞を検出する可能性をもたらす。これは、本明細書で記載される方法が、競合する技法より早期に有意味な結果をもたらしうることを意味する。結果として、癌専門医は、例えば、本明細書で記載される方法の使用を、癌の症状をまだ呈していない一般公衆に定期的に処方することにより、本技法の使用を病期ＩＶの転移性癌に限定することなく、その使用を早期診断（すなわち、病期ＩＩＩ、病期ＩＩ、病期Ｉ、または転移性癌、または前癌性状態の診断）へと拡張することができる。一般に、健康者は、血液中にＣＴＣを有さず；本発明を用いて、癌が疑われない患者においてＣＴＣがいくらかでも検出されれば、さらなる検査（例えば、ＣＴ、ＭＲＩ）を処方して、腫瘍を位置特定し、状態を確認することができる。

別の実施形態では、本発明を用いて単離された腫瘍細胞を、さらに部分集団解析（例えば、遺伝子型または表現型による）にかけ、標的化治療を進めることができる。例として述べると、単離された腫瘍細胞を、特定の薬物標的に結合する蛍光抗体と共にインキュベートして、薬物標的の存在または発現度を決定することができる。薬物標的の発現が確認されたら、癌専門医は、その発現を標的とするように特異的に開発された薬物からの選択を確信することができる。一例では、単離された腫瘍細胞を、Ｈｅｒ２受容体に特異的に結合する蛍光抗体と共にインキュベートして、ＣＴＣを流出させる乳房腫瘍がＨｅｒ２陽性であるかどうかを決定することができる。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）は、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現による機能を標的化および遮断するようにデザインされているので、単離された腫瘍細胞が、高度なＨｅｒ２発現を呈する場合、癌専門医は、この薬物を処方することができる。ＢＣＲ−ＡＢＬまたはＰＤＧＦＲ（薬物Ｇｌｅｅｖｅｃにより標的とされる）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎにより標的とされる）、ＥＦＧＲ（Ｉｒｅｓｓａ、Ｔａｒｃｅｖａにより標的とされる）、ＲＡＲアルファ（ＡＴＲＡにより標的とされる）、エストロゲン受容体（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎにより標的とされる）、アロマターゼ（Ｌｅｔｒａｚｏｌｅにより標的とされる）、アンドロゲン受容体（Ｆｌｕｔａｍｉｄｅ、Ｂｉｃｌｕｔａｍｉｄｅにより標的とされる）、ＣＤ２０（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂにより標的とされる）、ＶＥＧＦ受容体（Ａｖａｓｔｉｎにより標的とされる）を含めた他の公知の薬物標的もまた同様に、適切な化学療法レジメンを処方する前に、単離された腫瘍細胞からスクリーニングすることができる。

特定の実施形態では、希少粒子が、癌細胞または循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）である。他の実施形態では、希少細胞が、寄生虫細胞または寄生虫生物体、例えば、Ｇｉａｒｄｉａ属種またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属種、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属種に感染した赤血球、ＨＩＶに感染したリンパ球または白血球、母体血液中における胎児細胞、幹細胞、プリオン感染細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞などでありうる。

一実施形態では、マラリアを診断する方法であって、本明細書で記載されるｅＤＡＲ法および／またはｅＤＡＲ装置を用いて、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属種に感染した赤血球を検出するステップを含む方法が提供される。

別の実施形態では、ＨＩＶ感染を診断する方法であって、本明細書で記載されるｅＤＡＲ法および／またはｅＤＡＲ装置を用いて、ＨＩＶウイルスに感染したリンパ球または白血球を検出するステップを含む方法が提供される。

さらに別の実施形態では、プリオンに関連する疾患を診断する方法であって、本明細書で記載されるｅＤＡＲ法および／またはｅＤＡＲ装置を用いて、ヒトまたは他の動物（例えば、ウシ）に由来する生物学的流体中においてプリオンを検出するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、プリオンに関連する疾患は、狂牛病である。

１．癌の診断
具体的な一実施形態では、方法が、本明細書で記載されるｅＤＡＲ法および／またはｅＤＡＲ装置を用いて、被験体に由来する血液試料において循環腫瘍細胞を検出するステップを含む。ある実施形態では、被験体が、病期Ｉ、病期ＩＩ、病期ＩＩＩ、または病期ＩＶの癌を有すると既に診断されている患者でありうる。癌を有すると既に診断されている患者に由来する血液試料においてＣＴＣが検出されるある実施形態では、この患者が、転移性癌を有するとさらに診断される可能性がある。

一実施形態では、充実性腫瘍を有すると既に診断されている被験体において、転移性癌を診断する方法であって、（ａ）該被験体に由来する血液試料のアリコートにおいてＣＴＣの存在または不在を検出するステップと；（ｂ）該ＣＴＣの存在または不在に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；（ｃ）該割り当てられた値に基づき、該アリコートの流動または捕集を方向づけるステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、血液試料中におけるＣＴＣの不在が、転移性癌を有さない被験体と相関する。別の実施形態では、血液試料中における少なくとも１つのＣＴＣの存在が、転移性癌を有する被験体と相関する。さらに別の実施形態では、血液中における少なくとも基準数のＣＴＣの存在が、転移性癌を有する被験体と相関する。一部の実施形態では、方法が、（ｄ）血液試料においてＣＴＣが検出されなければ、被験体が転移性癌を有さないと診断するか、または血液試料において少なくとも１つのＣＴＣが検出されれば、被験体が転移性癌を有すると診断するステップをさらに含みうる。

関連する実施形態では、癌を有すると診断された被験体をモニタリングする方法であって、本明細書で記載されるｅＤＡＲ法を用いて、被験体に由来する血液試料のアリコートにおいてＣＴＣの存在または不在を検出するステップを含む方法が提供される。ある実施形態では、転移性癌への癌の進行について、例えば、１年に少なくとも１回、１年に少なくとも２回、または１年に少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の定期的な間隔で、患者をモニタリングすることができる。一部の実施形態では、１カ月に約１回、または１カ月に少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上にわたり、被験体をモニタリングすることができる。一実施形態では、血液試料中におけるＣＴＣの不在が、転移性癌を有さない被験体と相関する。別の実施形態では、血液試料中における少なくとも１つのＣＴＣの存在が、転移性癌を有する被験体と相関する。さらに別の実施形態では、血液中における少なくとも基準数のＣＴＣの存在が、転移性癌を有する被験体と相関する。一部の実施形態では、方法が、（ｄ）血液試料においてＣＴＣが検出されなければ、転移性癌を有さないものとして被験体を診断するか、または血液試料において少なくとも１つのＣＴＣが検出されれば、転移性癌を有するものとして被験体を診断するステップをさらに含みうる。

血液試料においてＣＴＣが検出される実施形態では、方法が、ＣＴＣを含有するものとして同定される１以上のアリコートをさらなる解析にかけ、１以上のＣＴＣ細胞の１以上の特徴を同定するステップをさらに含みうる。例えば、ＣＴＣを含有するアリコートまたはアリコートのプールを、１以上の癌特異的表面抗原に特異的な、１以上の検出試薬と接触させることができる。ＣＴＣの表面上に、どの癌特異的抗原が存在するかを決定することにより、発現した表面抗原を標的とするように治療をデザインすることができる。それについてアッセイしうる癌特異的表面抗原の非限定的な例には、ＢＣＲ−ＡＢＬまたはＰＤＧＦＲ（薬物Ｇｌｅｅｖｅｃにより標的とされる）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎにより標的とされる）、ＥＦＧＲ（Ｉｒｅｓｓａ、Ｔａｒｃｅｖａにより標的とされる）、ＲＡＲアルファ（ＡＴＲＡにより標的とされる）、エストロゲン受容体（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎにより標的とされる）、アロマターゼ（Ｌｅｔｒａｚｏｌｅにより標的とされる）、アンドロゲン受容体（Ｆｌｕｔａｍｉｄｅ、Ｂｉｃｌｕｔａｍｉｄｅにより標的とされる）、ＣＤ２０（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂにより標的とされる）、ＶＥＧＦ受容体（Ａｖａｓｔｉｎにより標的とされる）などが含まれるがこれらに限定されない。したがって、ある実施形態では、方法が、ＣＴＣ上において存在する特異的な表面抗原の検出に基づき、標的化療法を被験体に割り当てるステップをさらに含みうる。

ある実施形態では、本明細書で提供されるｅＤＡＲ法を用いて、例えば、識別が可能となる形で標識された複数の検出試薬を、ＣＴＣの表面上において存在する癌特異的抗原を伴う複合体へと転換するのに適する条件下において、プールされたアリコートを、該検出試薬と接触させ、複数の検出デバイスを用いて該複合体を検出することにより、さらなる解析を実施することができる。

他の実施形態では、最初のｅＤＡＲ法を、従来のフローサイトメトリー法または免疫化学法（例えば、免疫ブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ｘＭＡＰ多重アッセイ法等）と組み合わせることにより、さらなる解析を実施することができる。ある実施形態では、ＣＴＣを検出するのに用いられるｅＤＡＲデバイスを、第２のデバイスまたは手段と流体連絡させて、さらなる解析を実施することができる。

被験体が転移性癌を有すると診断する実施形態では、方法が、転移性癌のための治療を被験体に割り当てるステップをさらに含みうる。

別の具体的な実施形態では、方法が、癌を有する被験体を診断する方法であって、該被験体から採取された血液試料においてＣＴＣを検出するステップを含む方法が提供される。例えば、かつて癌を有すると診断されたことのない被験体に由来する血液試料においてＣＴＣを検出するステップである。一部の実施形態では、被験体が、癌を有するかまたは発生させる危険性が高い可能性があり、例えば、被験体が、癌の家族歴を有するか、喫煙者であるか、または他の形で発癌物質（すなわち、アスベスト、ベンゼン、カドミウム、ラドン、放射線など）に曝露されている可能性がある。

したがって、ある実施形態では、かつて癌を有すると診断されたことのない被験体をモニタリングする方法であって、（ａ）該被験体に由来する血液試料のアリコートにおいて、ＣＴＣの存在または不在を検出するステップと；（ｂ）該ＣＴＣの存在または不在に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；（ｃ）該割り当てられた値に基づき、該アリコートの流動または捕集を方向づけるステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、血液試料中におけるＣＴＣの不在が、転移性癌を有さない被験体と相関する。別の実施形態では、血液試料中における少なくとも１つのＣＴＣの存在が、癌を有する被験体と相関する。さらに別の実施形態では、血液中における少なくとも基準数のＣＴＣの存在が、癌または転移性癌を有する被験体と相関する。一部の実施形態では、方法が、（ｄ）血液試料においてＣＴＣが検出されなければ、癌を有さないものとして被験体を診断するか、または血液試料において少なくとも１つのＣＴＣが検出されれば、癌を有するものとして被験体を診断するステップをさらに含みうる。

ある実施形態では、ＣＴＣの存在または不在を検出するステップを、上記で説明した通りに、例えば、（ｉ）検出試薬を前記検出試薬および希少粒子を含む複合体へと転換するのに適する条件下において、被験体に由来する生物学的流体を、該検出試薬と接触させるステップ；および（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成された複合体の存在または不在を、該生物学的流体のアリコートにおいて検出するステップにより、または（ｉ）外部の電磁放射線源により該アリコートを探査するステップ；および（ｉｉ）該希少粒子の蛍光を検出するステップにより実施することができる。

２．予後診断を提供する方法
一態様では、本発明が、生物学的流体中に希少粒子の存在を伴う疾患または状態について、予後診断を提供する方法を提供する。一実施形態では、方法が、（ａ）被験体に由来する生物学的試料のアリコートにおいて希少粒子の存在または不在を検出するステップと；（ｂ）該希少粒子の存在または不在に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；（ｃ）該割り当てられた値に基づき、該アリコートの流動または捕集を方向づけるステップと；（ｄ）該試料において希少粒子が検出されなければ予後良好の診断を下し、該試料において希少粒子が検出されれば予後不良の診断を提供するステップとを含む。

他の実施形態では、アリコート中における希少粒子の量または内容に基づき、該アリコートに値を割り当てる。これらの実施形態のうちのあるものでは、試料中における希少粒子の量に基づき、予後良好または予後不良の診断を提供する。例えば、一実施形態では、試料中における希少粒子の量が所定の基準値未満であれば予後良好の診断を下し、試料中における希少粒子の量が基準値以上であれば予後不良の診断を提供する。

ある実施形態では、所定の基準値が、具体的な療法が奏効する可能性、または全生存期間もしくは無病生存期間が、ある期間、例えば、少なくとも６カ月間、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０年間以上にわたる可能性と連関しうる。

ある実施形態では、希少粒子の存在または不在を検出するステップを、上記で説明した通りに、例えば、（ｉ）検出試薬を前記検出試薬および希少粒子を含む複合体へと転換するのに適する条件下において、被験体に由来する生物学的流体を、該検出試薬と接触させるステップ；および（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成された複合体の存在または不在を、該生物学的流体のアリコートにおいて検出するステップにより、または（ｉ）外部の電磁放射線源により該アリコートを探査するステップ；および（ｉｉ）該希少粒子の蛍光を検出するステップにより実施することができる。

ある実施形態では、本明細書で記載される方法を用いて、希少粒子を伴う任意の疾患について予後診断を提供することができる。一実施形態では、マラリアについて予後診断を提供する方法であって、本明細書で記載されるｅＤＡＲ法および／またはｅＤＡＲ装置を用いて、個体に由来する血液試料においてＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属種に感染した赤血球の数を決定するステップと、該血液試料において検出される感染赤血球の総数が所定の基準値未満であれば予後良好の診断を提供するか、または該試料において検出される感染赤血球の総数が基準値以上であれば予後不良の診断を提供するステップとを含む方法が提供される。

別の実施形態では、ＨＩＶ感染について予後診断を提供する方法であって、本明細書で記載されるｅＤＡＲ法および／またはｅＤＡＲ装置を用いて、個体に由来する血液試料においてＨＩＶウイルスに感染したリンパ球または白血球の数を決定するステップと、該血液試料において検出される感染細胞の総数が所定の基準値未満であれば予後良好の診断を提供するか、または該試料において検出される感染細胞の総数が基準値以上であれば予後不良の診断を提供するステップとを含む方法が提供される。

さらに別の実施形態では、プリオンに関連する疾患について予後診断を提供する方法であって、本明細書で記載されるｅＤＡＲ法および／またはｅＤＡＲ装置を用いて、被験体に由来する生物学的流体試料においてプリオンの数を決定するステップと、該試料において検出されるプリオンの総数が所定の基準値未満であれば予後良好の診断を提供するか、または該試料において検出されるプリオンの総数が基準値以上であれば予後不良の診断を提供するステップとを含む方法が提供される。

ある実施形態では、所定の基準値が、特定の療法が奏効する可能性、または全生存期間もしくは無病生存期間が、ある期間、例えば、少なくとも６カ月間、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０年間以上にわたる可能性と連関しうる。

特定の実施形態では、本発明が、充実性腫瘍を有すると診断された被験体について予後診断を提供する方法を提供する。一実施形態では、方法が、（ａ）該被験体に由来する血液試料のアリコートにおいてＣＴＣの存在または不在を検出するステップと；（ｂ）該ＣＴＣの存在または不在に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；（ｃ）該割り当てられた値に基づき、該アリコートの流動または捕集を方向づけるステップと；（ｄ）ＣＴＣが検出されなければ予後良好の診断を下し、ＣＴＣが検出されれば予後不良の診断を提供するステップとを含む。

別の実施形態では、転移性癌を有すると診断された被験体について予後診断を提供する方法であって、（ａ）該被験体に由来する血液試料のアリコートにおいてＣＴＣの存在または不在を検出するステップと；（ｂ）該アリコートにおいて検出されたＣＴＣの数に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；（ｃ）該割り当てられた値に基づき、該アリコートの流動または捕集を方向づけるステップと；（ｄ）該血液試料において検出されるＣＴＣの総数が所定の基準値未満であれば予後良好の診断を下し、該試料において検出されるＣＴＣの総数が基準値以上であれば予後不良の診断を提供するステップとを含む方法が提供される。

ある実施形態では、所定の基準値が、特定の療法が奏効する可能性、または全生存期間もしくは無病生存期間が、ある期間、例えば、少なくとも６カ月間、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０年間以上にわたる可能性と連関しうる。

３．疾患の進行または治療の奏効についてのモニタリング
別の態様では、本発明が、疾患の進行または治療の奏効についてモニタリングする方法であって、本明細書で記載されるｅＤＡＲ法および／またはｅＤＡＲ装置を用いて、流体試料において希少粒子を検出するステップを含む方法を提供する。

一実施形態では、方法が、（ａ）初回に被験体から採取した第１の生物学的試料の複数のアリコートにおいて、希少粒子の存在または不在を検出するステップと；（ｂ）該希少粒子の存在、不在、量、または内容に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；（ｃ）該第１の試料に由来するすべてのアリコートについて、合計値を決定するステップと；（ｄ）２回目に被験体から採取した第２の生物学的試料の複数のアリコートにおいて、希少粒子の存在または不在を検出するステップと；（ｅ）該希少粒子の存在、不在、量、または内容に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；（ｆ）該第２の試料に由来するすべてのアリコートについて、合計値を決定するステップと；（ｇ）該第１の試料に割り当てられた合計値を、該第２の試料に割り当てられた合計値と比較し、該第１の試料と比較して、該第２の試料に割り当てられた値が増大していれば、疾患の進行および／もしくは治療の奏効不良と相関し、かつ／または該第１の試料と比較して、該第２の試料に割り当てられた値が減少していれば、疾患の退縮および／もしくは治療の奏効と相関するステップとを含む。

ある実施形態では、割り当てられた値に基づき、アリコートを具体的な流路またはチャンバーへとさらに方向づけ（流し）、捕集、さらなる濃縮、またはさらなる解析を行うことができる。

ある実施形態では、疾患を診断するか、または治療レジメを開始した後に、定期的なベースで、疾患の進行または治療の奏効についてモニタリングする方法を用いることができる。例えば、１年に少なくとも１回、１年に少なくとも２回、または１年に少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０回以上にわたり、被験体から試料を捕集することができる。一部の実施形態では、１カ月に約１回、または１カ月に少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上にわたり、被験体をモニタリングすることができる。

疾患の進行または治療の奏効不良が見出されるある実施形態では、方法が、治療を割り当てるステップ、用量レジメを増大させるステップ、治療レジメを変更するステップなどをさらに含みうる。

ある実施形態では、希少粒子を伴う疾患または状態が、癌、マラリア、ＨＩＶ／エイズ、プリオン関連疾患などである。
Ｃ．水質をモニタリングする方法
別の態様では、本明細書で記載されるｅＤＡＲ法および／またはｅＤＡＲ装置を用いて、水試料において、１以上の希少粒子による汚染物質を検出することにより水質をモニタリングする方法を、本発明が提供する。

一実施形態では、方法が、（ａ）水源から採取された試料のアリコートにおいて水汚染物質の存在または不在を検出するステップと；（ｂ）該アリコート中における水汚染物質の存在、不在、量、または内容に基づき、該アリコートに値を割り当てるステップと；（ｃ）該割り当てられた値に基づき、該アリコートの流動または捕集を方向づけるステップであって、該方法において検出されるすべてのアリコートに割り当てられた合計値に基づき、該水源の水質を判定するステップとを含む。

ある実施形態では、水源が、湖沼、貯水プール、河川、小河川、また他の天然の水体でありうる。これらの実施形態のうちのあるものでは、水を検査して、人間が生む活動または物質が水体に対して現在もしくは未来において及ぼす影響を判定もしくは予測するか、または該水体を用いて人口に飲用水を供給することの妥当性もしくは安全性を評価することができる。

他の実施形態では、水源が、浄水場の貯水プールもしくは池、貯水池、貯水塔、または人口に飲用水を供給することを目的とする他の捕集された水体でありうる。これらの実施形態のうちのあるものでは、水を検査して、該水体を用いて人口に飲用水を供給することの妥当性または安全性を評価することができる。

ある実施形態では、本明細書で記載される方法を用いて、例えば、浄水場または貯水塔もしくは貯水池において、人口に飲用水を供給するのに用いられる水源の水質を定期的にモニタリングすることができる。このような実施形態では、１年に少なくとも１回、１年に少なくとも２回、または１年に少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０回以上にわたり、水源をモニタリングすることができる。一部の実施形態では、１カ月に約１回、または１カ月に少なくとも約２、３、４、５回以上にわたり、被験体をモニタリングすることができる。さらに他の実施形態では、１週間に少なくとも１回、もしくは１週間に少なくとも約２、３、４、５、６回以上、または少なくとも毎日、もしくは１日に少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上にわたりに水を検査することができる。

他の実施形態では、自然災害（例えば、ハリケーン、津波、または地震）、事故、またはテロ行為の後における水体を用いて人口に飲用水を供給することの妥当性または安全性を判定するのに、本明細書で記載される方法を用いることができる。

水の安全性または水質を検査またはモニタリングする方法は、水汚染物質、例えば、Ｇｉａｒｄｉａ属種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属種などの寄生虫、または少量でも存在すると公衆衛生に対して危険性を示す有機もしくは無機の他の水汚染物質である希少粒子の検出を含みうる。

Ｄ．装置
一態様では、本発明が、生物学的流体中において希少粒子を検出するデバイスを提供する。

一実施形態では、デバイスが、（ａ）少なくとも第１の流入路と；（ｂ）少なくとも２つの流出路と；（ｃ）生物学的流体のアリコートにおいて１以上の希少粒子を検出することが可能な少なくとも１つの検出器と；（ｄ）該アリコートの流動を方向づける機械装置と；（ｅ）該アリコート中における該希少粒子の存在、不在、内容、組成、または量に基づき、該アリコートに値を割り当てることが可能な選別デバイスであって、検出器、ならびに該アリコートの流動を方向づける機械装置と通信するコンピュータとを含む。

一部の実施形態では、装置が、アリコートを探査するための線源をさらに含む。希少粒子または細胞が、化学発光または生物発光を内因的に呈する他の実施形態では、装置が、アリコートを探査するための線源を要求しない場合がある。

ある実施形態では、本明細書で記載される装置が、希少細胞に対する不用意の損傷を最小化するデザインの特色を伴う、壁面により封入され、かつ／または基板上に微細加工された流路を含む。希少細胞に対する不用意な損傷を減少させることにより、患者に誤った診断または予後診断を下しうる偽陰性率が低下する。米国特許出願第２００７／００３７１７２号および同第２００８／０２４８４９９号で説明される通り、流路は、わずかでもストレスまたは損傷を伴う生体細胞を除外するよう、流体力学的にデザインされた開口部を伴う流路をさらに含みうる。前述の特許出願において、一次元（「１−Ｄ」）開口部を伴う流路として言及されるこのような流路は、細胞除外過程において細胞が受ける流体力学的圧力を軽減し、したがって、細胞溶解の可能性を低下させる。１−Ｄ開口部を伴う流路を、米国特許第２００８／０３１８３２４号において説明される「流出式濾過」構成に従ってアレイ型に戦略的に配置して、流動をさらに方向転換することもでき、区分することもでき、減衰させることもでき、分散させることもでき、その結果として、除外の瞬間において細胞が受ける衝撃力を軽減することができる。ｅＤＡＲ装置が、医療デバイスの製造を規制する法規に準拠するように、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０２４２６において説明される手順に従うＵＶキュアリング処理を用いて、医療デバイスグレードのポリマーである生体適合性の基質材料から、流路を封入する壁面を加工することができる。

１．アリコートの流動を方向づける機械装置
ある実施形態では、流動を方向づける機械装置により、アリコートが希少粒子を含有すれば、該アリコートの流動を第１の流出路へと方向づけ、アリコートが希少粒子を含有しなければ、これを第２の流出路へと方向づける。

別の実施形態では、流動を方向づける機械装置により、希少粒子を含有するアリコートの流動を、該希少粒子の本質、組成、または量に応じて、複数の流出路のうちの１つへと方向づける。

ある実施形態では、アリコートの流動を方向づける機械装置が、電極、磁気エレメント、音響エレメント、電気作動型エレメント、電場、または磁場を含む。

さらに他の実施形態では、アリコートの流動を方向づける機械装置が、１以上の電気作動型バルブまたは電気作動型ピストンを含み、該バルブまたはピストンが、第１の接合部で第１の流入路および２つの流出路と交わる、少なくとも第１の方向の流路における液体の流動を制御する。

一実施形態では、ソレノイドピストンが、電気作動型ソレノイドバルブの部分構成要素である。別の実施形態では、ソレノイドピストンが、鋳造成形によりデバイス内に埋め込まれる。さらに別の実施形態では、埋め込まれたソレノイドピストンを、チューブを介して流体連絡するソレノイドバルブで置き換えることができる。

具体的な一実施形態では、本明細書で記載される装置が、粒子、アリコート、または流体試料の流跡または流動を追跡および／または走査するための１以上の電極を含みうる。ある実施形態では、電極により、誘電泳動またはエレクトロウェッティングなどの現象に基づき、アリコートの分離を増強することができる。

ある実施形態では、本発明の装置が、粒子、アリコート、または流体試料の流跡または流動を追跡および／または走査するための１以上の音響エレメントを含みうる。ある実施形態では、音響エレメントを用いて、音響エネルギー（すなわち、音響泳動、超音波、またはメガソニック波）により、選択粒子または選択細胞の流跡を操作し、圧締圧力波に対する細胞の反応に基づき、細胞の分離を改善することができる。

別の実施形態では、本明細書で記載される装置が、磁気粒子に結合するか、またはこれが結合する希少粒子または希少細胞を分離するための磁気エレメントをさらに含みうる。ある実施形態では、磁気エレメントにより、粒子または細胞に結合したマイクロ磁気粒子またはナノ磁気粒子の磁気感受性に基づき、アリコート、粒子、または細胞の分離を増強することができる。

ある実施形態では、本明細書で記載される装置が、流体圧力の変化、流速の変化、または電気浸透圧流の変化を用いて、選択粒子または選択細胞の流跡を操作することを含みうる。

２．検出デバイス
ある実施形態では、検出器が、カメラ、電子増倍管、電荷結合素子（ＣＣＤ）による画像センサー、光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）、および相補性金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）による画像センサーからなる群から選択される。

ある実施形態では、本明細書で記載される装置が、選択細胞の運動を追跡するか、またはアリコート中に存在する選択粒子もしくは選択細胞を数え上げる、光検出器、電子検出器、音響検出器、または磁気検出器を含みうる。

一部の実施形態では、本明細書で記載される装置または方法により、蛍光（単色または多色）顕微鏡法による画像化を、明視野顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、ＤＩＣ（微分干渉顕微鏡）、暗視野顕微鏡、ホフマン顕微鏡、または位相差顕微鏡が含まれるがこれらに限定されない各種の構成に組み込むことができる。

一部の実施形態では、本明細書で記載される装置が、複数の検出デバイス、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の検出デバイスを含みうる。本発明の方法、例えば、１つを超える希少粒子もしくは希少細胞が流体試料中に存在するか、１つを超える細胞マーカーを用いて異なる細胞種類を弁別するか、または複数の検出試薬が同時に検出される方法を実施するには、複数の検出デバイスが必要となる場合がある。３．探査デバイス
ある実施形態では、本明細書で記載される装置が、アリコート中に存在する検出可能部分を探査するかまたは励起させるための線源をさらに含みうる。ある実施形態では、探査するための線源が、例えば、レーザー（固体レーザー、ダイオード励起レーザー、イオンレーザー、または色素レーザー）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、ランプ、アーク放電、磁気パルス、または天然光源から選択される。

一部の実施形態では、本明細書で記載される装置が、複数の探査デバイス、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の検出デバイスを含みうる。本発明の方法、例えば、１つを超える希少粒子もしくは希少細胞が流体試料中に存在するか、１つを超える細胞マーカーを用いて異なる細胞種類を弁別するか、または複数の検出試薬が同時に検出される方法を実施するには、複数の探査デバイスが必要となる場合がある。

４．選別デバイス
ある実施形態では、コンピュータ、コントローラー、集積回路を伴うチップ、プリント基板、電子素子、ソフトウェア、アルゴリズム、またはこれらの組合せから選別デバイスを選択することができる。

５．流路およびチャンバー
ある実施形態では、本明細書で記載される装置が、１以上の流入路（すなわち、アリコートを検出容量に取り込むための流路）、および１以上の流出路（すなわち、アリコートを検出容量から取り出すための流路）を含め、複数の流路を含みうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される装置が、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００本以上の流入路と、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００本以上の流出路との組合せを含みうる。

ある実施形態では、装置が、主要流路に連結されて、さらなる流体を注入し、局所的な速度を変化させる複数の流路を含みうる。

一実施形態では、本明細書で記載される装置が、ポリマー材料（ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリウレタンメタクリレート（ＰＵＭＡ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレン、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、パリレン、ポリ塩化ビニル、フルオロエチルプロピレン、レキサン、ポリスチレン、環状オレフィンコポリマー、ポリウレタン、ポリエステルカーボネート、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリアクリレート、ポリカプロラクトン、ポリケトン、ポリフタルアミド、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリスルホン、エポキシポリマー、耐熱プラスチック、フルオロポリマー、およびポリフッ化ビニリデン、ポリアミド、ポリイミド）、無機材料（ガラス、石英、ケイ素、ＧａＡｓ、窒化ケイ素）、融合シリカ、セラミック、ガラス（有機）、金属、および／または他の材料、ならびにこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない材料から加工された壁面により封入された流路またはチャンバーを含みうる。

ある実施形態では、壁面材料を、多孔性膜、毛、金属（例えば、ステンレス鋼またはＭｏｎｅｌ鋼）、ガラス、紙、または合成物質（例えば、ナイロン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、パリレン、および各種のポリエステル）、焼結ステンレス鋼および他の金属による繊維織物または不織繊維（布またはメッシュなど）、ならびにアルミナ、シリカ、または炭素などの多孔性無機材料により加工することができる。

ある実施形態では、本明細書で記載される装置が、化学的分子または生体分子により前処理された流路またはチャンバーを含みうる。例えば、流体試料中における粒子の会合を防止または軽減する抗凝固化合物、流体試料中における粒子、例えば希少粒子もしくは細胞に優先的に結合する化合物、または流体試料中における粒子の凝集または集合を防止または軽減する化合物により流路またはチャンバーを処理することができる。

一実施形態では、抗凝固化合物、循環腫瘍細胞に優先的に結合する化合物、または細胞の粘着を防止する化合物により流路表面またはチャンバー表面を処理することができる。

ある実施形態では、流路表面またはチャンバー表面を化学修飾して、選択細胞、選択粒子、または選択分子の保湿を増強することもでき、これらの吸着を助長することもできる。表面修飾のための化学物質には、トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）、（トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン、クロロジメチルオクチルシラン、オクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）、またはγ−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ｍｅｔｈｙａｃｒｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｏｘｙ−ｓｉｌａｎｅ）などのシラン；アクリル酸、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エポキシポリ（ジメチルアクリルアミド）（ＥＰＤＭＡ）、またはＰＥＧ−モノメトキシアクリレートなどのポリマー；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ベースの界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＴＡＣ）、セチルトリエチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、またはＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（ＰＢ）などの界面活性剤；ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）またはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）などのセルロース誘導体；エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、またはトリエタノールアミンなどのアミン；ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）またはＴｅｆｌｏｎを含有するフッ素含有化合物などのフッ素含有化合物が含まれうるがこれらに限定されない。

６．バックグラウンドを軽減するための手段
ある実施形態では、本明細書で記載される装置が、過剰なバックグラウンドシグナルを軽減し、かつ／またはシグナル対ノイズ比を改善するための手段をさらに含みうる。過剰なバックグラウンドシグナルを軽減し、シグナル対ノイズ比を増大させることにより、希釈率の大きなアリコートに由来する微弱なシグナルであっても正確に検出しうるので、検出の感度が増強される。言い換えれば、シグナル対ノイズ比が向上するほど、走査しうるアリコートは大量となる。直接的な結果として、走査を必要とするアリコートがより少数（しかしより大量）となるので、これに対応して、流体のスループットが増大する。

一実施形態では、バックグラウンドシグナルを軽減するための手段が、遮蔽を含む。遮蔽は、周期的な間隔を伴う場合であれ、これを伴わない場合であれ、任意の方向に配置された、任意の形態またはサイズの、任意の数の開口部からなりうる。例えば、図３は、検出容量と、検出可能な特徴により選択的に検出することを可能とする検出器との間に配置された一連の開口部（３１１）を含有する遮蔽（３０１）を例示する。

ある実施形態では、遮蔽が、ある波長の光を選択的に透過させる光エレメント、例えば、低域フィルター、高域フィルター、もしくは帯域フィルター、または音響−光変調器、空間−光変調器、光チョッパー、加工型ホログラム、物理的開口部、またはガルバノスキャナーを含みうる。

他の実施形態では、遮蔽が、磁場の透過を選択的に防止する磁気エレメントからなりうる。

一部の実施形態では、シグナル対ノイズ比を同様に上昇させる他のデバイスを、遮蔽の代わりに、または遮蔽と共に用いることができる。例えば、ある実施形態では、ロックイン増幅器、走査検出器、変調型探査器もしくは変調型検出器、または周波数もしくは強度を変調させる任意の装置から選択されるデバイスを用いて、シグナル対ノイズ比を増大させることができる。

さらに他の実施形態では、内部に直接組み込まれた遮蔽の空間修飾機能を伴う検出器を、本明細書で記載される装置と共に用いることができる。ある実施形態では、別個の遮蔽が存在しない。他の実施形態では、別個の遮蔽もまた存在する。遮蔽機能が組み込まれた検出器の非限定的な例には、個々の光ダイオードまたはカメラの選択ピクセルのシグナルが除去または保持されうるような光ダイオードアレイまたは空間的ピクセル化を伴うカメラが含まれる。

７．さらなるエレメント
ある実施形態では、本発明で示される装置が、本明細書で記載されるｅＤＡＲ法と組み合わせる形で、アッセイ、過程、または検査を実施するのに有用なさらなるエレメントをさらに含みうる。

一実施形態では、本明細書で記載される装置が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）など、オンチップでの細胞アッセイを実施するための、１以上の耐熱エレメントをさらに含みうる。

さらに他の実施形態では、本明細書で記載される装置が、例えば、電気泳動または電気クロマトグラフィーなど、オンチップでの化学アッセイを実施するための１以上の電極をさらに含みうる。

別の実施形態では、本明細書で記載される装置が、フィルターエレメントをさらに含みうる。具体的な実施形態では、フィルターエレメントが、マイクロポスト、マイクロインパクター、マイクロシーブ、生体粒子より小さな開口部を伴う流路、生体粒子がそこに流入することは防止するが、流体にはそれを介して該生体粒子の周囲を流動し続けることを可能とするような開口部を伴う流路（「１−Ｄ流路」）、マイクロビーズ、多孔性膜、壁面からの突出部、接着性コーティング、毛、金属（例えば、ステンレス鋼またはＭｏｎｅｌ鋼）、ガラス、紙、もしくは合成物質（例えば、ナイロン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、パリレン、およびポリエステル）、焼結ステンレス鋼もしくは他の金属による繊維織物もしくは不織繊維（布またはメッシュなど）、またはアルミナ、シリカ、もしくは炭素などの多孔性無機材料の形態でありうる。

例えば、図１６は、所望の生体粒子を保持しながら、流体部分の流過を選択的に可能とする、流出路（１６２１）などの流路に配置されうるフィルターエレメント（１６２２）を例示する。

さらに別の実施形態では、本明細書で記載される装置を、従来のフローサイトメーターと組み合わせることができる。

例えば、図１６は、希少細胞１６０２を含有する別々のアリコート１６６１が、さらに検討されるかまたは直列的に（細胞１個ずつ）分取されるような、従来のフローサイトメーター（フィルターエレメント１６２２を伴う場合であれ、伴わない場合であれ）と流体連絡させうる流出路（１６２１）を例示する。

ＩＶ．実施例
（Ａ．実施例１）
流体中における希少粒子を検出または定量化するための、単一の流入ポートおよび流出ポートを伴うｅＤＡＲ装置の例である。

図４は、細胞懸濁液をアリコート分割するデバイス（４１１）、探査デバイス（４２１および４２２）、検出デバイスまたは画像化デバイス（４３１、４３２、および４３３）、ならびに選別デバイス（コンピュータであるが図示しない）からなるｅＤＡＲ装置の例を示す。この具体例では、細胞懸濁液をアリコート分割するデバイス（４１１）が、壁面内に格納される流路（４１４）と、流体ポート（４１２および４１３）とからなりうる。レーザーを探査デバイスとして用いる。光ダイオード、光電子増倍管、またはカメラを伴う倒立顕微鏡を検出デバイスとして用いる。遮蔽（４５１）を、流路（４１４）と、検出デバイス（４３１、４３２、および４３３）との間の経路に配置する。コンピュータは、検出デバイスからシグナルを受容し、アルゴリズムによりアリコートを選別する。次いで、コンピュータは、選別の値（すなわち、流体試料中における希少粒子の存在、不在、量、内容、または組成）に基づき、アリコートを適正な流路へと方向づける。図４は、３つの検出デバイス（４３１、４３２、および４３３）および２つの探査デバイス（４２１および４２２）を例示するが、実際のｅＤＡＲは、１つの検出デバイスおよび１つの探査デバイスだけからなる場合もあり、複数の検出デバイスおよび探査デバイスからなる場合もある。

図４に例示される装置の一使用では、探査デバイス（４２１および４２２）が、倒立顕微鏡内へと方向づけられる、４８８ｎｍの固体ダイオード励起レーザーと、６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザーとからなった。２つのレーザービームは、該顕微鏡の対物レンズに入射する前に、１０対１のアスペクト比を有する、視準された楕円形のビームを形成するように、円筒形の光学素子を用いて成形された。半波長板および偏光ビームスプリッターの組合せを用いるならば、鏡により個別に光を誘導して、空間的に共局在化された励起領域を創出しながら、各ビームの強度を調整しうるであろう。生体粒子からの蛍光は、２つのダイクロイックミラーにより３つの波長帯へと分光された後、帯域フィルター内を透過し、３つの単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ；４３１、４３２、および４３３）へと再集光される。第１のＳＰＡＤは、波長が５６０〜６１０ｎｍの範囲内にある蛍光を捕集し、第２のＳＰＡＤは、６４５〜７００ｎｍの範囲内にある蛍光を捕集し、第３のＳＰＡＤは、５００〜５４０ｎｍの範囲内にある蛍光を捕集した。ＳＰＡＤの出力は、カウンター／タイマーボードを伴うコンピュータへと方向づけ、複数のアルゴリズムにより解析した。

（Ｂ．実施例２）
流体中における希少粒子を検出または定量化するための２つの流出ポートを伴うｅＤＡＲ装置である。

図５は、細胞懸濁液をアリコート分割するデバイス（５１０）、探査デバイス（５２１）、検出デバイスまたは画像化デバイス（５３１）、選別デバイス（コンピュータであるが図示しない）、および割り当てられた選別によりアリコートを方向づける装置からなるｅＤＡＲ装置を例示する。この装置はまた、単一の流入ポート（５１１）、２つの流出ポート（５１２および５１３）、ならびに単一の地点で接合されて流体をアリコート分割する３つの流路（５１４）も包含する。レーザーを探査デバイス（５２１）として用い、光ダイオード、光電子増倍管、またはカメラを伴う倒立顕微鏡を検出デバイス（５３１）として用いる。遮蔽（５５１）を、流路（５１４）と、検出デバイス（５３１）との間に配置する。コンピュータは、検出デバイスからシグナルを受容し、アルゴリズムによりアリコートを選別する。次いで、デバイスは、割り当てられた選別に従い、電気的手段、磁気的手段、流体力学的手段、または空気的手段を用いて、アリコートを流出口５１２または流出口５１３へと方向づける。

単一の探査デバイスおよび単一の検出デバイスを伴う、上記で説明したｅＤＡＲ装置に加え、複数の探査デバイスおよび複数の検出デバイスを、本明細書で説明されるｅＤＡＲ装置と共に用いることもできる。例えば、図６は、１つの探査デバイス（６４０）および３つの検出デバイス（６５０、６５１、および６５２）を伴うｅＤＡＲ装置を例示する。

（Ｃ．実施例３）
流体中における希少粒子を検出または定量化するための複数の流入ポートおよび／または流出ポートを伴うｅＤＡＲ装置である。

本発明の各種の態様では、ｅＤＡＲ装置が、複数の流入ポートおよび／または流出ポートからなる場合がある。例えば、図７は、５つのポート（７１１、７１２、７１３、７１４、および７１５）、ならびに単一の地点で接合される５つの流路７１６を伴う、懸濁液をアリコート分割するデバイス（７１０）を例示する。流入口として１以上のポートを用いることができ；流出口として１以上のポートを用いることができる。例えば、２つのポートを流入ポートとして用い、３つのポートを流出ポートとして用いるように装置を用いることもでき、１つのポートを流入ポートとして用い、４つのポートを流出ポートとして用いる等のように装置を用いることもできる。原理的に述べると、デバイス（７１０）は、任意の数の流入口および流出口、ならびに任意の数の流路を含有しうる。これらの流路は、１つを超える地点で接合することができ、該接合点の周囲に流入口または流出口を配置する必要はない。

（Ｄ．実施例４）
ｅＤＡＲを用いた、乳癌患者の血液中における循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出である。

単回の穿刺により、病期ＩＶの転移性乳癌患者に由来する新鮮な静脈穿刺血を３本の別個の試験管へと引き入れた。皮膚穿刺に由来する上皮細胞による汚染の可能性を回避するため、第１の血液部分（第１の試験管）を廃棄した。第２の部分を、安定化試薬を含有するＶｅｒｉｄｅｘ製ＣｅｌｌＳａｖｅ試験管内へと捕集し、Ｖｅｒｉｄｅｘ製ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムを用いて循環腫瘍細胞を検出した。第３の部分は、ＥＤＴＡ抗凝固剤を含有する捕集試験管へと捕集し、ｅＤＡＲを用いる別個の解析を行った。

第３の部分は、酵素、固定化剤、透過性試薬、およびパンサイトケラチン、ＣＤ４５、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的とする蛍光抗体と共にインキュベートした。循環腫瘍細胞陽性の同定を、パンサイトケラチンおよびＥｐＣＡＭを発現するが、ＣＤ４５は発現しない細胞と定義する。ＣＤ４５は、白血球共通抗原として一般に公知であり、白血球を表示する。３つの抗体すべてと結合する検体は、タンパク質凝集の結果であることが多い偽陽性とみなす。

略述すると、７．６ｐｓｉを供給して流動を駆動する圧縮空気源を用いて、５〜１０ｍＬの抗体標識した血液試料に、約１０〜５００μＬ／分の流速で、実施例１において説明したｅＤＡＲ装置内を流動させた。ｅＤＡＲ装置は、連続流動（同時）モードで作動させた。これらの実験では、幅２００μｍ×高さ５０μｍのマイクロ流路を用いた。標識抗体複合体を探査するために、４８８ｎｍおよび６３３ｎｍの線共焦点励起ビームを与え、これにより、厚さ約５〜１０μｍの光シートが照射された。したがって、線共焦点検出容量は、約２００μｍ（幅）×５０μｍ（高さ）×１０μｍ（厚さ）の寸法を有し、約０、１ｎＬの検出容量を与えた。３つのＳＰＡＤ検出デバイスは、１０，０００Ｈｚのサンプリング速度で作動させ、４５０〜６１０ｎｍ、６４５〜７００ｎｍ、および５００〜５４０ｎｍで細胞から発生する蛍光シグナルを検出するように構成した。この速度では、各アリコートが、１ｎＬから５０ｎＬのオーダーであり、５〜２５０個の白血球および５，０００〜２５，０００個の赤血球を含有すると推定された。したがって、５〜１０ｍＬの試料の場合、５００μＬ／分の流速で試料を処理するのに、１０〜２０分間を要した。このようにして処理された５ｍＬの試料は、各々が５０ｎＬの容量を有する１０，０００個のアリコートへと等分される。

したがって、２つの流出路を有するｅＤＡＲ装置を用いる場合、フィルターを用いず、わずか１０分間で、２００個のＣＴＣを含有する５ｍＬの試料を１０μＬの容量へと縮減することができる。ｅＤＡＲ装置を、さらにフローサイトメーターと液体連絡させたならば、フローサイトメトリーを行う前に、ｅＤＡＲステップを実装することにより、５ｍＬの試料中に存在する２００個のＣＴＣ細胞すべてを、通常時間のわずか２％でカウントし、かつ／または個々に単離することができるであろう。

図８は、Ｖｅｒｉｄｅｘ製ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステム（下側パネル）およびｅＤＡＲ（上側パネル）を用いて、病期ＩＶの乳癌患者に由来する２７例の血液試料（異なる検査日に複数の患者から採取した試料）によるＣＴＣカウントを示す。容易に見て取れる通り、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムを用いたところ、大半の患者試料が、ＣＴＣカウント０を記録した。これに対し、同じ患者の血液採取物をｅＤＡＲで解析したところ、その５０％超が、２００〜４００ＣＴＣカウントを含有することが判明した。これは、市販のＶｅｒｉｄｅｘ製ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムを用いる場合と比較して、ｅＤＡＲを用いることによる感度が１００倍を超えることを十分に裏付ける。ｅＤＡＲが高感度であることは、アリコートの選別および遮蔽の使用により、ＣＴＣとバックグラウンドとが正確に識別されることによる。

これもまた図８に示す通り、ｅＤＡＲにより解析した患者試料の１００％がＣＴＣの存在を表示したのに対し、Ｖｅｒｉｄｅｘ製ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムにより解析した患者試料でなんらかのＣＴＣの存在を表示したのは、そのうちの４０％に過ぎなかった。これは、ｅＤＡＲにより与えられる偽陰性率が著明に低いことを裏付けた。ＣＴＣ検査における偽陰性率が高ければ、転移についての予後診断が不正確となり、既存の治療レジメンが十分であるという偽の安全保障感を患者に抱かせる場合がある。

このｅＤＡＲ法により検出されたＣＴＣの例示的画像を、図９に与える。略述すると、この図は、各種の照射下においてｅＤＡＲを用いて患者血液から捕獲した癌細胞の光学的画像を示す（矢印によりＣＴＣを示す）。図９Ａは、赤血球中におけるＣＴＣの明視野画像である。図９Ｂは、パンサイトケラチンの存在を示す蛍光画像である。図９Ｃは、ＣＤ４５の不在を表示する蛍光画像であり、これにより、白血球をＣＴＣとして偽同定する可能性がなくなる。

（Ｅ．実施例５）
癌細胞集団中における癌幹細胞の検出である。

ｅＤＡＲにより分離された癌細胞をさらに解析して、生物学的流体中における部分集団を識別することができる。特定のタンパク質を標的とするさらなる蛍光抗体で還流することにより、一部の癌細胞を、他の癌細胞から区別することができる。例えば、ＣＤ４４タンパク質を発現するが、ＣＤ２４タンパク質を発現しない癌細胞は、それらが転移の可能性の高さと連関するために、近年、癌幹細胞と呼ばれている。他のタンパク質は、各種の細胞形質を伴いうる。

例えば、図１０は、乳癌幹細胞の同定を裏付ける（矢印により示す）。略述すると、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）を、Ａｌｅｘａ ４８８−抗ＣＤ４４抗体（陽性）およびＡｌｅｘａ ６４７−抗ＣＤ２４抗体（陰性）により標識した。図１０Ａは、Ａｌｅｘａ ４８８−抗ＣＤ４４抗体（緑色）を検出する蛍光画像（５００〜５４０ｎｍ）であり；図１０Ｂは、Ａｌｅｘａ ６４７−抗ＣＤ２４抗体（赤色）を検出する蛍光画像（６４５〜７００ｎｍ）であり；図１０Ｃは、明視野画像である。図１０Ｄは、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−を示す合成画像（矢印により、癌幹細胞を表示する）である。癌細胞のうち約２５％が、ＣＤ４４を発現するが、ＣＤ２４を発現せず、これにより、癌幹細胞の基準を満たすことが判明した。このように、ｅＤＡＲを用いて、生物学的流体中における癌細胞の部分集団を区別することができる。

（Ｆ．実施例６）
ｅＤＡＲによる、別々のアリコートを用いる検出である。

本明細書で記載される方法の一実施例では、検出ステップの前に、不混和相により分離される別々の水性アリコートを用いることによりｅＤＡＲを作動させ、生体粒子を封入することができる。図１６は、このようにして作動するｅＤＡＲ装置を例示する。例えば、所望されない細胞（１６０１）を含有する細胞懸濁液と、所望される希少細胞１６０２を含有する細胞懸濁液とを、不混和相（１６４２）により互いに分離される別々のアリコート（１６３１、１６４１、１６５１、１６６１）へと区分する。流路（１６０３）内を左から右へと流動するように、別々のアリコートを方向づける。アリコート１６４１が検出容量（１６０４；円筒形の輪郭）を横切ると、別々のアリコート（１６４１）内に封入された複数の細胞が同時に検出される。所望の細胞が検出されなければ、別々のアリコート（１６４１）をヌルと選別し、流路１６１１へと方向づける（例えば、アリコート１６５１を参照されたい）。所望される希少細胞がいくらかでも検出されれば、別々のアリコートを非ゼロと選別し、流路１６２１へと方向づける（例えば、アリコート１６６１を参照されたい）。

一実施形態では、フィルターエレメント１６２２を流路１６２１内に配置して、所望の生体粒子を保持しながら、流体部分を選択的に流過させることができる。一実施形態では、ｅＤＡＲ装置を従来のフローサイトメーターと組み合わせることができる。例えば、図１６では、希少細胞１６０２を含有する別々のアリコート１６６１を、さらに検討するかまたは直列的に（一度に細胞１個ずつ）分取するように、流路１６２１を、従来のフローサイトメーター（フィルターエレメント１６２２を伴うものであれ、伴わないものであれ）と流体連絡させることができる。

不混和相（１６４２）は、図１６に例示する通り、連続相（すなわち、別々のアリコートを完全に取り囲む）の場合もあり、分断相（すなわち、不混和相１６４２が、別々のアリコート間の空隙だけを占め、アリコートを完全には取り囲まない）の場合もある。

（Ｇ．実施例７）
本発明の一態様を用いる一例として述べると、１０ｍＬの細胞懸濁液が含有する所望の希少細胞が、所望されない細胞１００億個中にわずか９個である場合、その最も単純な形態によるｅＤＡＲであれば、１０のアリコート中に含有される所望の細胞に由来する特徴を検出することが要請されるであろう。所望の細胞は９個しか存在しないので、少なくとも１つのアリコートは所望の細胞を欠くであろうし、ヌルと選別され、即座に廃棄される可能性がある。廃棄された部分に含有される所望されない細胞は、個々にスクリーニングする必要がなくなるであろう。結果として、アリコートが１０だけである場合、全容量のうち少なくとも１／１０は即座に廃棄され、所望されない細胞のうちの１／１０（廃棄された容量中に含有される）は、個々に検出する必要がなくなるであろう。全体的に述べると、所望されない細胞１０億個は、１回の判定で集団として排除される。検体７０，０００個／秒の超高速で作動する最新式の細胞分取装置の場合なら、この１回の判定により、１，０００，０００，０００／７０，０００＝１４，３００秒間または４時間が結果として節約される。この結果、時間効率が著明に増大する。

上記で提示した想定に従い、１０ｍＬの細胞懸濁液を各々１００μＬずつの１００アリコートへと区分するとすれば、細胞懸濁液の容量全体で含有する所望の細胞が９個だけなので、少なくとも９１の部分は、所望の細胞を含有しないことになるであろう。したがって、走査を１００回実施し、判定を１００回行うだけで、９１アリコート×１００μＬ＝９．１ｍＬを即座に排除することができる。廃棄された部分内に含有される細胞は９１億個となるであろう、または所望されない細胞のうちの９１％が、１００回以内の判定で排除される。

（Ｈ．実施例８）
図１は、同時モードで作動させながら、アリコートにおいて希少粒子の特徴を検出する、本発明の具体的な実施形態を例示する。略述すると、流路（１０３）内を左から右へと流動するように、所望されない細胞（１０１）を含有する細胞懸濁液と、所望される希少細胞（１０２）を含有する細胞懸濁液とを方向づける。所与の時点において、複数の細胞が、影を付けた円筒により囲まれる検出容量（１０４）を横切る可能性があり、これらを同時に検出することができる。所望の細胞が検出されなければ、検出容量と等量のアリコートをヌルと選別し、流路１１１へと方向づける。所望の細胞がいくらかでも検出されれば、アリコートを非ゼロと選別し、流路１２１へと方向づける。

場合によって、フィルターエレメント（１２２）を、流路１２１内に配置して、所望の生体粒子を保持しながら、流体部分を選択的に流過させることができる。フィルターエレメントは、マイクロポスト、マイクロインパクター、マイクロシーブ、生体分子より小さな開口部を伴う流路、生体粒子がそこに流入することは防止するが、流体にはそれを介して該生体粒子の周囲を流動し続けることを可能とするような開口部を伴う流路（「１−Ｄ流路」）、マイクロビーズ、多孔性膜、壁面からの突出部、接着性コーティング、毛、金属（例えば、ステンレス鋼またはＭｏｎｅｌ鋼）、ガラス、紙、もしくは合成物質（例えば、ナイロン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、パリレン、およびポリエステル）、焼結ステンレス鋼もしくは他の金属による繊維織物もしくは不織繊維（布またはメッシュなど）、またはアルミナ、シリカ、もしくは炭素などの多孔性無機材料の形態でありうる。

（Ｉ．実施例９）
同時モードで作動するｅＤＡＲの別の例では、方法が、さらに、過剰なバックグラウンドシグナルを軽減し、シグナル対ノイズ比を改善するように、アリコートを選択的に遮蔽することからなる場合がある。図２は、検出容量と、検出可能な特徴により選択的に検出することを可能とする検出器との間に配置された一連の開口部（２１２）を含有する遮蔽（２１１）の使用を例示する。遮蔽（２１１）を用いてもなお、複数の生体粒子を同時に検出することができる。過剰なバックグラウンドシグナルを軽減し、シグナル対ノイズ比を増大させることにより、希釈率の大きなアリコートに由来する微弱なシグナルであっても正確に検出しうるので、検出の感度が増強される。言い換えれば、シグナル対ノイズ比が向上するほど、走査しうるアリコートは大量となる。直接的な結果として、走査を必要とするアリコートがより少数（しかしより大量）となるので、これに対応して、流体のスループットが増大する。所望の生体粒子が検出されなければ、検出容量と等量のアリコートをヌルと選別し、流路２２１へと方向づける。所望の生体粒子がいくらかでも検出されれば、アリコートを非ゼロと選別し、流路２２２へと方向づける。

（Ｊ．実施例１０）
デバイス７１０（図７）の拡大例示である図１１パネルＡは、接合部１１１６で接合される５つの流路（１１１１、１１１２、１１１３、１１１４、および１１１５）を伴う、懸濁液をアリコート分割するためのデバイス１１１０を例示する。流路１１１１、１１１２、１１１３が流体を接合部１１１６へと移送したのに対し、流路１１１４および１１１５は、流体を接合部１１１６から移送した。ソレノイドピストン１１２０を流路１１１１の上部に配置し、ソレノイドピストン１１２１を流路１１１２の上部に配置した。ソレノイドピストン１１２０および１１２１は、ピストン１１２０および１１２１を、流路１１１１および１１１２内の流体から分離する、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）によるエラストマー膜上に押し下げられるように構成した。

図１１パネルＡは、デバイス１１１０を作動させて、懸濁液をアリコート分割することを例示する。ソレノイドピストン１１２０を、流路１１１１の上部にあるＰＤＭＳ膜上へと押し下げることにより、流路１１１１を閉鎖した。同時に、流体に流路１１１２内を接合部１１１６へと流過させるように、ソレノイドピストン１１２１を構成した。結果として、流入路１１１２内において希少細胞を含有する血液を、左側の流出路１１１４（パネルＢ：０ミリ秒を参照されたい）へと転導した。アリコート１１３０を、右側の流出路１１１５へと方向づけるには、ソレノイドピストン１１２０を流路１１１１の上部にあるＰＤＭＳ膜から引き抜く一方で、ソレノイドピストン１１２１を、流路１１１２の上部にあるＰＤＭＳ膜へと押し下げた。この結果、希少細胞を含有する血液のアリコート１１３０が、右側の流出路１１１５へと方向づけられた（パネルＣ：５ミリ秒；およびパネルＤ：１０ミリ秒）。説明したソレノイドピストンを用いるアリコートの方向転換は、５ミリ秒の短時間しか要求しなかった。

（Ｋ．実施例１１）
図１２パネルＡは、接合部１２４０で接合される５つの流路（１２１１、１２１２、１２１３、１２１４、および１２１５）を伴う、懸濁液をアリコート分割するのに用いられるデバイス１２１０を例示する。流路１２１１、１２１２、１２１３が流体を接合部１２４０へと移送したのに対し、流路１２１４および１２１５は、流体を接合部１２４０から移送した。ソレノイドバルブ１２２０は、チューブ１２２１を介して、流路１２１１と流体連絡されたポート１２１６へと接続し、ソレノイドバルブ１２２２は、チューブ１２２３を介して、流路１２１２と流体連絡されたポート１２１７へと接続した。

ソレノイドバルブ１２２０および１２２２は、電気シグナルまたはコンピュータシグナル（例えば、ＴＴＬシグナル）により閉鎖または開放するように作動させた。ソレノイドバルブ１２２２の開放を維持しながらソレノイドバルブ１２２０を閉鎖したところ、流入路１２１３内において希少細胞を含有する血液のアリコート１２６０が、左側の流出路１２１４へと転導された（パネルＢ：０ミリ秒を参照されたい）。ソレノイドバルブ１２２２の閉鎖を維持しながらソレノイドバルブ１２２０を開放したところ、流入路１２１３内において希少細胞を含有する血液のアリコート１２６０が、右側の流出路１２１５へと転導された（パネルＣ：２ミリ秒を参照されたい）。ソレノイドバルブ１２２０および１２２２の組合せを用いるアリコートの方向転換は、２ミリ秒の短時間で、アリコートを１つのチャネルから別のチャネルへと流すことができた。

（Ｌ．実施例１２）
ｅＤＡＲデバイスの能力を検査するため、以下の手順により、血液と癌細胞との混合物を調製した：１×１０^６個／ｍＬのＭＣＦ−７細胞を、２０μＬの蛍光ＥｐＣＡＭ抗体で標識した。次いで、この細胞混合物を、Ｉｓｏｔｏｎ血液希釈剤で１×１０^５細胞／ｍＬへと希釈した。次いで、１０μＬの希釈した細胞混合物を、２ｍＬのヒト全血液に添加し、アリコート分割デバイス内を流過させた。別段に表示しない限り、アリコート分割デバイス内における流速は、３０μＬ／分の名目速度であった。

図１３は、接合部１１１６（または１２４０）の上流および下流における異なる位置に配置される２つのアバランシェ光ダイオード（ＡＰＤ）から捕集された蛍光シグナルを示す。プロット１３１０が、検出容量１１４０（または１２７０）のアリコートにおいてＥｐＣＡＭ分子の存在を検出するように構成された第１のＡＰＤからのシグナルトレース１３１１を示すのに対し、プロット１３２０は、流路１１１４（または１２１４）内におけるＥｐＣＡＭ分子の存在を検出するように構成された第２のＡＰＤからのシグナルトレース１３２１を示す。シグナルピーク１３１２が、シグナルピーク１３２２と実質的に合致したことから、アリコートの流れが適正であり、その結果、希少細胞の回収率が高かったことが表示される。

ｅＤＡＲデバイスの能力をさらに精査するため、ソレノイドバルブ（１２２０、１２２２）またはソレノイドピストン（１１２０、１１２１）が閉鎖または開放を維持する時間の長さ（「パルス長」）を調整しながら、適正な流路へと方向づけられた癌細胞の数をカウントし、次いで、これを捕集（「回収」）した。適正な流路に捕集された希少細胞の数を、検出容量１１４０または１２７０においてＡＰＤにより検出された希少細胞の数で除することにより、回収百分率を計算した。図１４のプロット１４１０は、回収された癌細胞の百分率を、パルス長の関数として示す。トレース１４２０は、パルス幅が１０ミリ秒以下の場合、１００％の癌細胞が適正な流路に捕集されたことを示す。パルス幅が増大するにつれて、トレース１４２０が減少したことから、細胞が誤った流路へと失われたことが表示される。

流入路１１１３（または１２１３）の流速を調整することにより、本発明者らはまた、回収率が最適化されうるであろうことも観察した。図１５は、回収された希少細胞の百分率を流入流速の関数として表示するトレース１５２０を伴うプロット１５１０を示す。流速が３０μＬ／分未満の場合、回収率は８９〜１００％であった。しかし、流速が増大するにつれ回収率が低下したことから、誤った流路への希少細胞の喪失が増大したことが表示される。

本明細書で説明される実施例および実施形態は、例示だけを目的とするものであり、当業者には、例示の観点における各種の改変または変更が示唆され、これらは、本出願の精神および視野ならびに付属の特許請求の範囲の内に包含されるものとすることが理解される。本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的で、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。

Claims (56)

1. 流体試料において希少粒子をアッセイするための装置であって、
   （ａ）少なくとも１つの流入路と；
   （ｂ）少なくとも１つの流出路と；
   （ｃ）少なくとも１つの検出器と；
   （ｄ）流体のアリコートの流動を方向づけることが可能な機械装置であって、前記アリコートが、三次元空間全体に無作為に分布した複数の粒子を含有する、機械装置と；
   （ｅ）前記アリコートにおける前記希少粒子の存在、不在、本質、組成、または量に基づき、前記アリコートに値を割り当てることが可能なコンピュータであって、前記検出器および前記アリコートの流動を方向づける前記機械装置と通信し、アッセイプロトコールを実施するように構成されるコンピュータと
   を含む装置。
2. 少なくとも２つの流出路を含む、請求項１に記載の装置。
3. 前記コンピュータは、前記流体試料のアリコートを、前記複数の粒子の中に希少粒子が存在すれば第１の流出路に向けて方向付けるように前記機械装置に指示し、そして、前記コンピュータは、前記流体試料のアリコートを、前記複数の粒子に希少粒子が存在しなければ第２の流出路に向けて方向付けるように前記機械装置に指示する、請求項１または２に記載の装置。
4. 前記少なくとも１つの検出器は、前記流入路内の検出点において、前記希少粒子の存在、不在、本質、組成、または量を検出するように構成され、そして、前記検出点では、前記流入路の断面積が複数の粒子を包含するのに十分なサイズである、請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。
5. フローサイトメーターをさらに含む請求項１から４のいずれか一項に記載の装置であって、前記フローサイトメーターが、前記流出路のうち一つと流体連絡している、装置。
6. 前記機械装置により、前記アリコートの流動を、前記アリコートが希少粒子を含有すれば第１の流出路へと方向づけるか、または前記アリコートが希少粒子を含有しなければ第２の流出路へと方向づける、請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
7. 前記機械装置により、希少粒子を含有する前記アリコートの流動を、前記希少粒子の本質、組成、または量に応じて、１つの流出路へと方向づける、請求項１から６のいずれか一項に記載の装置。
8. 前記アリコートの流動を方向づける前記機械装置が、電極、磁気エレメント、音響エレメント、または電気作動型エレメントを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
9. 前記アリコートの流動を方向づける前記機械装置が、１以上の電気作動型バルブまたは電気作動型ピストンを含み、前記バルブまたはピストンが、第１の接合部で前記流入路および前記流出路と交わる少なくとも第１の方向の流路における流動を制御することにより、前記アリコートの流動を方向づける、請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
10. 前記流体試料のアリコートからの粒子の流動を方向づけるように構成された前記機械装置の下流に配置された、希少粒子または細胞の集団を濃縮するように構成された第２の機械装置を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の装置。
11. 前記装置が、第１の検出器の上流に、流体力学的な絞り込み機構を含まないことを条件とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の装置。
12. 前記流出路が、前記流入路と流体連絡している、請求項１から１１のいずれか一項に記載の装置。
13. 前記流入路と流体連絡した、チューブ、ポート、または接続部を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の装置。
14. 前記流体試料の複数のアリコートが、前記装置の外部で形成され、前記流入路と流体連絡した、前記チューブ、前記ポート、または前記接続部を介して、前記装置の前記流入路へと流動する、請求項１３に記載の装置。
15. 複数の流路を含む請求項１から１４のいずれか一項に記載の装置であって、前記流体試料の複数のアリコートが、前記複数の流路へと物理的に分離される、装置。
16. 前記機械装置が、前記流体試料の複数のアリコートを並行的に方向づけることができる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の装置。
17. 前記希少粒子が、前記流体試料中の全粒子集団の１０^３分の１未満を構成する低レベルで前記流体試料中に存在する細胞または高分子である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の装置。
18. 前記検出器が画像化デバイスを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の装置。
19. 前記検出器が１つを超える検出デバイスを含むか、または、前記検出器が単一の検出デバイスを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の装置。
20. 前記検出器が、カメラ、電子増倍管、電荷結合素子（ＣＣＤ）による画像センサー、光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）、および相補性金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）による画像センサーからなる群から選択されるか；または、光検出器、電子検出器、音響検出器、もしくは磁気検出器を含むか；または、蛍光顕微鏡法による画像化を組み込む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の装置。
21. 前記アリコートを探査するための電磁放射線源を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の装置。
22. 前記検出器が、前記流体試料の複数のアリコート中の前記希少粒子の存在または不在を並行的に検出することができる、請求項１から２１のいずれか一項に記載の装置。
23. 前記検出器が、前記流体試料の複数のアリコート中の前記希少粒子を並行的に画像化することができる、請求項１から２２のいずれか一項に記載の装置。
24. 複数のアリコートにおけるアリコートが別々の容量を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の装置。
25. 前記希少粒子が希少細胞である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の装置。
26. 前記希少細胞が癌細胞である、請求項２５に記載の装置。
27. 前記アリコートが１つを超える希少粒子を含有する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の装置。
28. 前記流体試料が生物学的流体である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の装置。
29. 流体試料中における希少粒子をアッセイするための方法であって、
    （ａ）前記流体試料のアリコートにおいて希少粒子の存在または不在を検出するステップであって、前記アリコートが、三次元空間全体に無作為に分布した複数の粒子を含有する、ステップと；
    （ｂ）前記アリコートにおける前記希少粒子の存在または不在に基づき、前記アリコートに値を割り当てるステップと；
    （ｃ）前記割り当てられた値に基づき、前記アリコートの流動を方向づける機械装置を使用して、前記アリコートの流動または捕集を方向づけるステップと
    （ｄ）前記粒子の集団またはその部分について、フローサイトメトリー、ＲＮＡの抽出（増幅を伴う抽出または増幅を伴わない抽出）、ｃＤＮＡの合成（逆転写）、遺伝子のマイクロアレイ、ＤＮＡの抽出、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（単独ＰＣＲ、ネスト化ＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ、またはリンカー−アダプターＰＣＲ）、ＤＮＡメチル化解析、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、細胞培養、または比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）研究、電気泳動、サザンブロット解析、または酵素結合免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、マイクロＲＮＡ含量およびｓｉＲＮＡ含量を決定するためのアッセイ、ＤＮＡ／ＲＮＡ含量を決定するためのアッセイ、脂質含量を決定するためのアッセイ、タンパク質含量を決定するためのアッセイ、あるいは、機能的細胞アッセイを実施するステップと
    を含む方法。
30. 前記アリコートにおける１以上の前記希少粒子の存在または不在に基づき、前記アリコートの第２の割り当てられた値を割り当てるステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記アリコートの第２の割り当てられた値に基づき、前記流動を方向づけるステップをさらに含む、請求項２９または３０に記載の方法。
32. 第１または第２の割り当てられた値に基づき、前記アリコートを捕集するステップをさらに含む、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記検出するステップが、
    （ｉ）検出試薬を前記検出試薬および希少粒子を含む複合体へと転換するのに適する条件下において、前記流体試料を、前記検出試薬と接触させるステップと；
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成された複合体の存在または不在を、前記流体試料のアリコートにおいて検出するステップと
    を含む、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法であって、
    （ｉ）検出試薬を前記検出試薬および希少粒子を含む複合体へと転換するのに適する条件下において、被験体に由来する生物学的流体を、前記検出試薬と接触させるステップであって、前記希少粒子が前記生物学的流体中に低レベルで存在する細胞または高分子である、ステップと；
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成された複合体の存在または不在を、前記生物学的流体のアリコートにおいて検出するステップと；
    （ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で形成された複合体の存在または不在に基づき、前記アリコートに値を割り当てるステップと
    を含む方法。
35. 前記希少粒子を、識別可能な検出試薬と接触させる、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記アリコートが希少粒子を含有すれば第１の値を前記アリコートに割り当てるか、または前記アリコートが希少粒子を含有しなければ第２の値を前記アリコートに割り当てる、請求項２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記第１の値が、前記希少粒子の本質または前記アリコート中における前記希少粒子の濃度のいずれかに依存する、請求項３６に記載の方法。
38. 前記割り当てられた値が同じ値を有する複数のアリコートを併せてプールする、請求項２９から３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記検出するステップを、前記流体試料が、流路を連続的に流動する間に実施する、請求項２９から３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記方向づけるステップが、前記流体試料の複数のアリコートの流動を並行的に方向づけることが可能な機械装置を使用することを含む、請求項２９から３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記検出するステップの前に、前記流体試料の複数のアリコートを物理的に分離する、請求項２９から４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記検出するステップの前に、前記複数のアリコートにおけるアリコートを、別個の流路またはチャンバーへと区分する、請求項２９から４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記検出するステップが、
    （ｉ）外部の電磁放射線源により前記アリコートを探査するステップと；
    （ｉｉ）前記希少粒子の蛍光を検出するステップと
    を含む、請求項２９から４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記検出するステップが、１つを超える探査デバイス、検出デバイス、もしくはその組み合わせを使用することを含むか、または、前記検出するステップが、単一の探査デバイス、検出デバイス、もしくはその組み合わせを使用することを含む、請求項２９から４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記検出するステップが、前記希少粒子の生物発光または化学発光を検出することを含む、請求項２９から４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記検出試薬が、異なる波長の蛍光により識別可能である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
47. 各々が異なる特異性を有する、識別可能な複数の検出試薬を、前記識別可能な複数の検出試薬および複数の希少粒子を含む複数の複合体へと転換するのに十分な条件下において、前記流体試料を、前記識別可能な複数の検出試薬と同時に接触させる、請求項２９から４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 複数の複合体を並行的に検出する、請求項２９から４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記検出するステップが、前記流体試料の複数のアリコート中の前記希少粒子の存在または不在を並行的に検出することを含む、請求項２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 前記検出するステップが、前記流体試料の複数のアリコート中の前記希少粒子を並行的に画像化することを含む、請求項２９から４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記希少粒子が、前記流体試料中の全粒子集団の１０^３分の１未満を構成する低レベルで前記流体試料中に存在する細胞または高分子である、請求項２９から５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 複数のアリコートにおけるアリコートが別々の容量を含む、請求項２９から５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 前記希少粒子が、希少細胞である、請求項２９から５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記希少細胞が癌細胞である、請求項５３に記載の方法。
55. 前記アリコートが、１つを超える希少粒子を含有する、請求項２９から５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記流体試料が、生物学的流体である、請求項２９から５５のいずれか一項に記載の方法。