JP6574119B2 - ノロウイルス不活化評価方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ノロウイルス不活化評価方法に関する。
従来、ウイルスに対する消毒薬の有効性を評価するためには、感染力のあるウイルスの量を定量的に測定する必要があり、一般に簡便で定量性の高い培養細胞を用いる方法が採用されている。感染力を有するウイルスは細胞に感染するが、消毒薬などで不活化されて感染力を失ったウイルスは細胞に感染できない。したがって、その感染したウイルス量を測定することで消毒薬の効果を判定するのである。
しかし、ヒトノロウイルスの場合、これまでに培養できる細胞が見つかっておらず、上記の方法では消毒薬の有効性を評価することができない。そのため、ノロウイルスの消毒薬による不活化効果は、ヒトノロウイルスと同じカリシウイルス科に属し、細胞培養が可能なネコカリシウイルスを代用することによって判断する方法が知られている（例えば、非特許文献１、２参照）。
また、近年ではヒトノロウイルスと同じノロウイルス属に属するマウスノロウイルスの培養が可能となったことから、マウスノロウイルスを用いた消毒薬による不活化効果の評価方法も採用されている（例えば、非特許文献３参照）。
平成１９年度国立薬品食品衛生研究所報告書「ウイルス不活化条件に関する調査」
岩崎稔ら、新薬と臨床 Ｊ．Ｎｅｗ Ｒｅｍ．＆ Ｃｌｉｎ． Vol.54 No.8（２００５）、ｐ９６９−９７３
清水優子ら、環境感染誌、Vol.24 No.6（２００９）、ｐ３８８−３９４
しかしながら、上記の方法はいずれも培養細胞を用いて当該培養細胞に感染したウイルス量を測定するものであり、培養細胞にウイルスを接種した後、当該培養細胞を数日間培養させる必要があった。そのため、ウイルスの不活化評価に時間がかかってしまうことが課題となっていた。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたもので、培養細胞を培養させる手間をかけることなく評価することができるノロウイルス不活化評価方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、請求項１に記載の発明は、
ノロウイルスの不活化評価方法であって、
前記ノロウイルスと構造的かつ抗原的に同等であるノロウイルス様粒子を抗原とし、
前記ノロウイルス様粒子と結合した抗体を定量することにより前記ノロウイルスの不活化を評価し、
前記抗体を定量する際、前記ノロウイルス様粒子の分散液にアルコールを含有するウエットワイパーのシート絞り液を加えた希釈検体を用いることを特徴とするノロウイルス不活化評価方法。
ノロウイルスの不活化評価方法であって、
前記ノロウイルスと構造的かつ抗原的に同等であるノロウイルス様粒子を抗原とし、
前記ノロウイルス様粒子と結合した抗体を定量することにより前記ノロウイルスの不活化を評価し、
前記抗体を定量する際、前記ノロウイルス様粒子の分散液にアルコールを含有するウエットワイパーのシート絞り液を加えた希釈検体を用いることを特徴とするノロウイルス不活化評価方法。
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、
前記抗体の定量は、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法によって行うことを特徴とする。
前記抗体の定量は、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法によって行うことを特徴とする。
本発明によれば、培養細胞を培養させる手間をかけることなく評価することができるノロウイルス不活化評価方法を提供することができる。
以下、本発明の実施形態であるノロウイルス不活化評価方法を詳細に説明する。但し、発明の範囲は、図示例に限定されない。
［検体の調製］
まず、ノロウイルス不活化評価の対象となる検体の調整について説明する。
ｒＮＶ-ＶＬＰｓ（recombinant Norovirus-Virus Like Particles；ノロウイルス様粒子）分散液と等量の試験検体液を接触させ、例えば、１０秒後、３０秒後、２分後、及び１０分後に所定量のサンプルをマイクロピペットで採取し、それぞれのサンプルにＬＰ希釈液を加えて希釈検体とする。
ここで、ｒＮＶ-ＶＬＰｓ分散液とは、ｒＮＶ-ＶＬＰｓを生理食塩水（０．９ｗ／ｖ％）で希釈し、１０分間ミキシングしたものである。
試験検体液とは、アルコールを含有するウエットワイパーのシート絞り液等である。
まず、ノロウイルス不活化評価の対象となる検体の調整について説明する。
ｒＮＶ-ＶＬＰｓ（recombinant Norovirus-Virus Like Particles；ノロウイルス様粒子）分散液と等量の試験検体液を接触させ、例えば、１０秒後、３０秒後、２分後、及び１０分後に所定量のサンプルをマイクロピペットで採取し、それぞれのサンプルにＬＰ希釈液を加えて希釈検体とする。
ここで、ｒＮＶ-ＶＬＰｓ分散液とは、ｒＮＶ-ＶＬＰｓを生理食塩水（０．９ｗ／ｖ％）で希釈し、１０分間ミキシングしたものである。
試験検体液とは、アルコールを含有するウエットワイパーのシート絞り液等である。
［ノロウイルス不活化評価の原理］
次に、ノロウイルス不活化評価方法の原理について説明する。
本発明の実施形態であるノロウイルス不活化評価方法は、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）サンドイッチ法を原理としている。
ＥＬＩＳＡサンドイッチ法は、一次抗体（捕獲抗体）を固相化したマイクロプレートに検体を添加し、抗原・抗体反応を生じさせ、さらに酵素標識抗体を添加し、抗原・抗体反応を生じさせ、酵素活性を測定することにより、検体中の抗原を検出するものである。
次に、ノロウイルス不活化評価方法の原理について説明する。
本発明の実施形態であるノロウイルス不活化評価方法は、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）サンドイッチ法を原理としている。
ＥＬＩＳＡサンドイッチ法は、一次抗体（捕獲抗体）を固相化したマイクロプレートに検体を添加し、抗原・抗体反応を生じさせ、さらに酵素標識抗体を添加し、抗原・抗体反応を生じさせ、酵素活性を測定することにより、検体中の抗原を検出するものである。
［ノロウイルス不活化評価方法］
次に、ノロウイルス不活化評価方法について説明する。
本発明の実施形態であるノロウイルス不活化評価方法では、まず、一次抗体（捕獲抗体）をマイクロプレート（例えば、９６ウェルプレート）の各ウェルの表面に吸着（固相化）させる。ここで、一次抗体とは、抗原（ノロウイルス様粒子）を捉えるために使われる抗体である。
次に、ノロウイルス不活化評価方法について説明する。
本発明の実施形態であるノロウイルス不活化評価方法では、まず、一次抗体（捕獲抗体）をマイクロプレート（例えば、９６ウェルプレート）の各ウェルの表面に吸着（固相化）させる。ここで、一次抗体とは、抗原（ノロウイルス様粒子）を捉えるために使われる抗体である。
次いで、一次抗体が固相化されたマイクロプレートの各ウェルに一定順序、一定時間間隔で上記の各希釈検体を所定量滴加し、当該マイクロプレートをプレート用ミキサーで数秒間撹拌する。そして、マイクロプレートの上面をラップ等で覆い、一次抗体に抗原が結合するまで（例えば、４０分間）、２０〜３０℃でマイクロプレートを静置する。
次いで、マイクロプレートの各ウェルの反応液を、上記の各希釈検体を滴加したときと同一順序・同一時間間隔で吸引除去する。そして、各ウェルに所定量の洗浄液を滴加し、プレート用ミキサーで数秒間撹拌した後、洗浄液を吸引除去する。そして、各ウェルに、上記の各希釈検体を滴加したときと同一順序・同一時間間隔で酵素標識抗体液を所定量滴加し、プレート用ミキサーで数秒間撹拌する。そして、マイクロプレートの上面をラップ等で覆い、さらに全体をアルミ箔等で覆うか、又は遮光容器に収納して遮光し、所定時間（例えば、２０分間）、２０〜３０℃でマイクロプレートを静置する。
次いで、マイクロプレートの各ウェルの反応液を、上記の各希釈検体を滴加したときと同一順序・同一時間間隔で吸引除去する。そして、各ウェルに所定量の洗浄液を滴加し、プレート用ミキサーで数秒間撹拌した後、洗浄液を吸引除去する。そして、各ウェルに、上記の各希釈検体を滴加したときと同一順序・同一時間間隔で基質液を所定量滴加し、プレート用ミキサーで数秒間撹拌する。そして、マイクロプレートの上面をラップ等で覆い、さらに全体をアルミ箔等で覆うか、又は遮光容器に収納して遮光し、所定時間（例えば、４０分間）、２０〜３０℃でマイクロプレートを静置する。
次いで、マイクロプレートの各ウェルに、上記の各希釈検体を滴加したときと同一順序・同一時間間隔で反応停止液を所定量滴加する。そして、反応停止液の滴加後所定時間（例えば、３０分）以内にオートリーダー（波長４５０ｎｍ）で各ウェルの呈色液の吸光度を測定し、抗原であるノロウイルス様粒子の残存量を定量することによって、ノロウイルスの不活化効果を擬似的に評価する。
次に、本発明の実施形態であるノロウイルス不活化評価方法を下記の実施例によって具体的に説明する。
＜実施条件＞
下記の実施条件の下、希釈検体１と希釈検体２の２種類の検体についてノロウイルス不活化評価を行った。
抗原；ノロウイルス抗原キットＮＶ−ＡＤ（デンカ生研株式会社製）に付属のノロウイ ルス用粒子
１次抗体；抗ＮＶ−ＧＩ及びＧＩＩモノクローナル抗体（マウス）
希釈検体１；アルコールを含有するウエットワイパーＡ（ｐＨ６．０、ＰＨＭＢ、塩化 ベンザルコニウム含有）（市販品）のシート絞り液を上記検体の調整法に より調整したもの
希釈検体２；アルコールを含有するウエットワイパーＢ（ｐＨ９．５、ＰＨＭＢ、塩化 ベンザルコニウム含有）（エリエールプロダクト株式会社製；エリエール 除菌できるアルコールタオルウイルス除去用）のシート絞り液を上記検体 の調整法により調整したもの
酵素標識抗体液；ペルオキシダーゼ標識抗ＮＶ抗原ポリクローナル抗体(ウサギ)及び (マウス)並びにペルオキシダーゼ標識抗ＮＶ−ＧＩＩモノクローナル 抗体(マウス)を含む溶液
基質液；３, ３’, ５, ５’−テトラメチルベンジン(ＴＭＢ)、過酸化水素 (０．００９ｗ/ｖ％)を含む溶液
反応停止液；０．３ｍｏｌ/Ｌ硫酸
下記の実施条件の下、希釈検体１と希釈検体２の２種類の検体についてノロウイルス不活化評価を行った。
抗原；ノロウイルス抗原キットＮＶ−ＡＤ（デンカ生研株式会社製）に付属のノロウイ ルス用粒子
１次抗体；抗ＮＶ−ＧＩ及びＧＩＩモノクローナル抗体（マウス）
希釈検体１；アルコールを含有するウエットワイパーＡ（ｐＨ６．０、ＰＨＭＢ、塩化 ベンザルコニウム含有）（市販品）のシート絞り液を上記検体の調整法に より調整したもの
希釈検体２；アルコールを含有するウエットワイパーＢ（ｐＨ９．５、ＰＨＭＢ、塩化 ベンザルコニウム含有）（エリエールプロダクト株式会社製；エリエール 除菌できるアルコールタオルウイルス除去用）のシート絞り液を上記検体 の調整法により調整したもの
酵素標識抗体液；ペルオキシダーゼ標識抗ＮＶ抗原ポリクローナル抗体(ウサギ)及び (マウス)並びにペルオキシダーゼ標識抗ＮＶ−ＧＩＩモノクローナル 抗体(マウス)を含む溶液
基質液；３, ３’, ５, ５’−テトラメチルベンジン(ＴＭＢ)、過酸化水素 (０．００９ｗ/ｖ％)を含む溶液
反応停止液；０．３ｍｏｌ/Ｌ硫酸
図１に示す評価結果のとおり、ウエットワイパーＡのシート絞り液についても、ウエットワイパーＢのシート絞り液についても、ｒＮＶ-ＶＬＰｓ（ノロウイルス様粒子）分散液と接触してから１０秒経過以降にノロウイルス様粒子の不活化効果が確認された。
また、ウエットワイパーＢのシート絞り液については、ｒＮＶ-ＶＬＰｓ分散液と接触してから１０秒経過した段階でほぼ全てのノロウイルス様粒子の不活化効果が確認された。
これに対して、ウエットワイパーＡのシート絞り液については、ｒＮＶ-ＶＬＰｓ分散液と接触してから１０秒経過した段階で３１％、３０秒経過した段階で１８％の活性なノロウイルス様粒子が残存し、ほぼ全てのノロウイルス様粒子が不活化するまで１０分かかることが確認された。
また、ウエットワイパーＢのシート絞り液については、ｒＮＶ-ＶＬＰｓ分散液と接触してから１０秒経過した段階でほぼ全てのノロウイルス様粒子の不活化効果が確認された。
これに対して、ウエットワイパーＡのシート絞り液については、ｒＮＶ-ＶＬＰｓ分散液と接触してから１０秒経過した段階で３１％、３０秒経過した段階で１８％の活性なノロウイルス様粒子が残存し、ほぼ全てのノロウイルス様粒子が不活化するまで１０分かかることが確認された。
また、図１に示す評価結果は、図２に示すネコカリシウイルスを用いた消毒薬による不活化効果と高い相関性を有することが確認された。つまり、ノロウイルスと構造的かつ抗原的に同等であるノロウイルス様粒子を抗原とし、上記ＥＬＩＳＡサンドイッチ法によって当該ノロウイルス様粒子と結合した抗体を定量することで、ノロウイルスの不活化評価方法が確立できることを示している。これにより、培養細胞を培養させる手間をかけることなく評価することができるノロウイルス不活化評価方法を提供することができる。
なお、図２に示す不活化効果は、上述したように、ヒトノロウイルスと同じカリシウイルス科に属し、細胞培養が可能なネコカリシウイルスを代用することによって判断する従来の方法（上記非特許文献２；図１ ネコカリシウイルスに対する薬液の効果参照）によって導出されたものである。
なお、図２に示す不活化効果は、上述したように、ヒトノロウイルスと同じカリシウイルス科に属し、細胞培養が可能なネコカリシウイルスを代用することによって判断する従来の方法（上記非特許文献２；図１ ネコカリシウイルスに対する薬液の効果参照）によって導出されたものである。
以上、本発明を実施形態に基づいて具体的に説明してきたが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で変更可能である。
Claims (2)
- ノロウイルスの不活化評価方法であって、
前記ノロウイルスと構造的かつ抗原的に同等であるノロウイルス様粒子を抗原とし、
前記ノロウイルス様粒子と結合した抗体を定量することにより前記ノロウイルスの不活化を評価し、
前記抗体を定量する際、前記ノロウイルス様粒子の分散液にアルコールを含有するウエットワイパーのシート絞り液を加えた希釈検体を用いることを特徴とするノロウイルス不活化評価方法。 - 前記抗体の定量は、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法によって行うことを特徴とする請求項１に記載のノロウイルス不活化評価方法。
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