JP6564781B2 - 液体サンプル中で細菌を検出し、その濃度を決定するための方法および容器 - Google Patents

Description

この発明は、流体サンプル（試料）中の粒子の検出および定量化に関し、より特定的には、液体サンプル、特に、尿サンプル中において細菌（bacteria）を検出して、その濃度を決定するための方法および装置に関する。

従来、尿サンプル中で細菌を検出し、そして評価するために多くの方法が使われている。たとえば、尿沈渣を評価する際に用いる自動化した分析器があり、それらは主に、フローセルを通して流れる液体サンプルを利用し、フローサイメトリ(flow cytometry)または流動粒子の画像分析のどちらかを用いる。アメリカ合衆国特許第８,７８９,１８１号（オールセン等）（特許文献１）およびアメリカ合衆国特許出願公開第２０１２/０２４４５１９号(オールセン等）（特許文献２）で開示された光学セクショニング（optical sectioning：光学切片法）を含めて、実施されるかもしれない異なるタイプの流体画像捕捉方法がある。

あるいは、尿サンプル中での細菌の検出と評価のための他の従来の方法は、明視野顕微鏡を使う医療技術者によって導入される手動的観察を含む。具体的には、尿顕微鏡検査のためのこの標準的な方法は、遠心分離機で液体サンプルを遠心脱水し、沈渣物ペレットだけを残して、上澄みを捨てることを含む。次いで、ペレットは再懸濁され、顕微鏡を用いてカバーグラスの下の顕微鏡スライド上で評価される。この方法では、流体の深さが非常に浅い。従来の２２×２２ミリのカバーグラスを有する３０マイクロリットルの分取量（aliquot）のためには、深さはおよそ６０ミクロンであり、そして間隔は、より深い流体チャネルが提供する３次元体積より、２次元の間隔に限定される。このような方法は、もちろん、医療技術者にとっても時間がかかり、そして面倒で、そして細菌の小さいサイズと明視野顕微鏡の限界のために、サンプル中に存在する細菌を数量化する際に、しばしば間違った結果に導く。

撮像技術を使う尿沈渣分析は、小さい非細菌の破片の存在下における尿サンプル中で細菌を検出しなければならない。細菌の大きさは、空気結合の明視野顕微鏡を使った撮像技術の検出の限界に近いおよそ１ミクロンなので、この要件は課題を提起する。この制約で、細菌は見えるが、各々の細菌がそのサイズのために単一の画素だけで表わされるので、幾何学的な特性が決定できない。この限界は、細菌と小さい破片（非細菌）粒子と間の相違を決定するのを難しくしている。この問題はまた、標準的な明視野顕微鏡にも存在していて、そこでは、技術者にとって、４００倍にしても、特定の粒子を細菌なのかどうか識別することは困難であり得る。流体内の粒子のサイズおよび位置の均一性を評価すること、および細菌の指標であるコロニー形成を含んで、使われる他の技術がある。もし、細菌の存在を確認しなければならないなら、明視野顕微鏡または定量培養下で評価される、乾燥、染色したスライドのような代替技術が、細菌の存在を確認するために採用される。

アメリカ合衆国特許第８,７８９,１８１号 アメリカ合衆国特許出願公開第２０１２/０２４４５１９号

従来の技術に伴う上述の困難性は、破片で満たされた尿環境中においてもっと信頼できる細菌検出技術を要求している。

この発明の目的は、バルク流体（bulk fluid）中の細菌を評価する方法を提供することである。

この発明の他の目的は、非細菌（non-bacteria）から細菌を区別するための手段として細菌の特性を使用する方法を提供することである。

この発明のさらに他の目的は、尿媒体中の細菌を検出するための、高感度で選択的な方法を提供することである。

この発明のさらに他の目的は、細菌をカウントしようとすることに代えて、細菌の濃度（concentration）を推定するために、細菌間の平均間隔を決定する方法を提供することである。

この発明のなおも他の目的は、尿サンプルの中の細菌の濃度の決定の助けとなるように、尿サンプル中において細菌を小さい破片（debris）粒子から分離する消耗ないし消費可能（consumable：以下、消耗可能とする）素子を提供することである。

この発明の１つの形態に従えば、液体サンプル（liquid sample）中の細菌を検出して、その濃度を決定するための方法は、液体サンプルの体積（volume）を含む、好ましくは消耗可能(すなわち、廃棄可能)容器を通して、所定の視野でかつ所定の焦点面深さまたは角度において、かつ非細菌の破片がサンプル中において容器の底に沈澱（settle）するのを許容する時間期間の経過後、１つまたはそれ以上の光学セクション（optical section）を撮影するステップを含む。所定の時間期間が経過した後、細菌は液体サンプル中に自動整列（auto arrange）して、液体サンプルの大部分の実質的に全体に亘って(ある場合には、液体サンプルを保持した消耗可能容器の表面の近くの無菌ゾーン（no bacteria zone）を除いて）、３次元で均一に間隔が開けられているラティス状（lattice-like）のグリッドパターンを形成することがわかった。このようにして、自動整列した細菌の体積を通る光学セクションが、そのセクションに存在している細菌の数量を決定するために使われる。容器によって保持された液体サンプルの全体積を知ることによって、その光学セクションに存在している決定した細菌から、含まれている体積内の全細菌数の少なくとも近似を計算できる。

この発明の方法を実施するのを助けるために、特定の構造が非細菌の「破片」を細菌から分離するのを助ける、液体サンプルを保持するための消耗可能容器を開示する。１つの形態では、消耗可能容器は、凹（recessed）底部を含み、それは非凹（unrecessed）底部に隣接する。非細菌の破片は、液体サンプルから凹底部に沈澱する。流体撮像装置の光学システムの焦点面は、沈澱しなかった細菌だけが検出されるように、容器の非凹底部のレベルまたは近くに設定されている。

この発明の他の形態では、液体サンプルを保持する消耗可能容器は、周期的に間隔を隔てていて、容器底部から上方に延びかつ部分的に保持された液体サンプルの体積に及ぶ、１つまたはそれ以上の突起、または「減速バンプ」を有する、比較的長いチャネルを規定する。突起は、自動整列した、流体の深さの中で高い、細菌のような粒子だけを、チャネルを流下し続けさせる。隣接する突起の間の領域は、特定の密度範囲の粒子が蓄積する取り調べ（interrogation）のための領域を提供する。

この発明のこれらおよび他の目的、特徴と利点は添付の図面に関連して読まれるべき、その例示的な実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

図１Ａは、他の細菌を含まない尿サンプル（図１Ａ）中での細菌の自由体図（free body diagrams）（絵入りのイラスト）であり、各々の細菌に関する力およびこれらの力が隣接する細菌とどのように相互作用するか、そしてそれらの力が細菌を自動整列させて液体サンプル内の懸濁液中に留まるということの理解を容易にするのを助ける。 図１Ｂは、他の細菌が存在する尿サンプル（図１Ｂ）中での細菌の自由体図（free body diagrams）（絵入りのイラスト）であり、各々の細菌に関する力およびこれらの力が隣接する細菌とどのように相互作用するか、そしてそれらの力が細菌を自動整列させて液体サンプル内の懸濁液中に留まるということの理解を容易にするのを助ける。 図２は、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための、この発明の方法を実施するのを助ける、この発明に従って形成された消耗可能容器の第１実施例の単純化した断面図である。 図３は、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための、この発明の方法を実施するのを助ける、この発明に従って形成された消耗可能容器の第２実施例の単純化した断面図である。 図４は、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための、この発明の方法を実施するのを助ける、この発明に従って形成された消耗可能容器の第３実施例の単純化した断面図である。 図５は、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための、この発明の方法を実施するのを助ける、上面開口微量定量プレート井戸（open-topped microtiter plate well）の形態の、この発明に従って形成された、消耗可能容器の第４の実施例の単純化した断面図である。 図６は、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための、この発明の方法を実施するのを助ける、この発明に従って形成された、消耗可能容器の第５実施例の単純化した上面図であり、その容器は、液体サンプルがそこを通る毛細管の流れを促進する複数の流路チャネルを含む。 図７は、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための、この発明の方法を実施するのを助ける、この発明に従って形成された、消耗可能容器の第６実施例の単純化した断面図である。 図８は、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための、この発明の方法を実施するのを助ける、この発明に従って形成された、消耗可能容器の第７実施例の単純化した断面図である。 図９は、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための、この発明の方法を実施するのを助ける、この発明に従って形成された、消耗可能容器の第８実施例の単純化した断面図である。 図１０Ａは、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための、この発明の方法を実施するのを助ける、この発明に従って形成された、消耗可能容器の第９実施例の単純化した上面図であり、その容器は、容器の底部に形成された、複数の品質保証形状を有する。 図１０Ｂは、図１０Ａの線１０Ｂ−１０Ｂに沿った断面図である。 図１１Ａは、ポリマー（polymer）基板および関連の細菌の自由体図（絵入りのイラスト）、および尿サンプル中において、それぞれに関連する力である。 図１１Ｂは、ポリマー（polymer）基板および関連の細菌の自由体図（絵入りのイラスト）、および尿サンプル中において、それぞれに関連する力である。 図１２は、自動整列した状態における細菌のための２次元のモデルの上面図である。 図１３Ａは、完全にラティス構造を充填する不完全な細菌での自動整列状態の細菌についての２次元モデルの上面図である。 図１３Ｂは、図１３Ａに示すより増加した細菌濃度での自動整列状態の細菌についての２次元モデルの上面図である。 図１４は、自動整列状態における細菌についての３次元モデルの側面図である。 図１５は、流体バルク中の細菌なしに、サイズを変えた脂質を含む代表的なサンプルを示す、倒立明視野顕微鏡の画像である。 図１６は、流体のバルク中の細菌なしに、破片を含む代表的なサンプルを示す、倒立明視野顕微鏡の画像である。 図１７Ａは、容器が尿サンプルでちょうど満たされたときにサンプル容器中に存在する４つの粒子のタイプ（細菌、形成要素（formed elements）、脂質および破片）の各々を示す理論的なヒストグラムモデルのオーバレイであり、縦軸が容器の深さをミクロン（μｍ）で表わし、横軸が４つの粒子の細胞カウントを表す。 図１７Ｂは、容器が尿サンプルでちょうど満たされ、粒子の一部が沈澱した後に幾らか時間が経過したときにサンプル容器中に存在する４つの粒子のタイプ（細菌、形成要素、脂質および破片）の各々を示す理論的なヒストグラムモデルのオーバレイであり、縦軸が容器の深さをミクロン（μｍ）で表わし、横軸が４つの粒子の細胞カウントを表す。 図１８Ａは、画像が閾値処理される前の、流体バルクにおける細菌の明視野顕微鏡の手を加えていない画像である。 図１８Ｂは、この発明に従うオブジェクトカウント分析のために、閾値処理された後の、図１８Ａで示した画像である。 図１９Ａはこの発明に従うピクセル間隔を決定するために、図１８Ｂに示したものと同様の、閾値処理された画像の他の例であり、図１９Ｂは、最も近い隣のものまでの間隔を示す後処理線を有する図１９Ａで示した閾値処理された画像の拡大した部分である。 図２０Ａは、縦軸としての周波数および横軸としてのグレースケール値を有し、この発明の方法に従って流体バルクを通して細菌の分布を決定するための決定値としてのひずみ度を図示する、尿サンプル（より明るいオブジェクト用）とその関連するヒストグラムの写真画像であり、図２０Ｂは、縦軸としての周波数および横軸としてのグレースケール値を有し、この発明の方法に従って流体バルクを通して細菌の分布を決定するための決定値としてのひずみ度を図示する、尿サンプル（より暗いオブジェクト用）とその関連するヒストグラムの他の写真画像である。 図２１は、容器が尿サンプルでちょうど満たされたとき（図１７Ａ参照）と時間が経過する（図１７Ｂ参照）前との間の時間にサンプル容器中に存在する４つの粒子のタイプ（細菌、形成要素、脂質および破片）の各々を示す、図１７Ａおよび図１７Ｂに示したものと同様の、理論的なヒストグラムモデルのオーバレイであり、粒子の分離は始まっているが完了していない状態を図示していて、縦軸が容器の深さをミクロン（μｍ）で表わし、横軸が４つの粒子の細胞カウントを表す。 図２２Ａは、尿サンプルを保持している容器の中で３つの深さ（２００、４００および６００ミクロン）の各々で実行したこの発明に従うピクセル間隔論理での細菌（桿菌：rods）の滴定のための校正曲線のグラフであり、そこでは縦軸がピクセル間隔平均を表し、横軸はサンプルの中で細菌の濃度を表す。 図２２Ｂは、尿サンプルを保持している容器の中で３つの深さ（２００、４００および６００ミクロン）の各々で実行したこの発明に従うピクセル間隔論理で細菌（球菌：cocci）の滴定のために校正曲線のグラフであり、縦軸がピクセル間隔の標準偏差を表し、横軸はサンプルの中での細菌の濃度を表す。 図２３Ａは、尿サンプル中における細菌を非細菌から区別するために使用されるこの発明に従った４つのアルゴリズムアプローチの統合を図示するグラフであり、細菌を混ぜた非晶質の破片を有する細菌の濃度のために、そこでは縦軸が応答を表し、横軸は、オブジェクトカウント平均、密度平均、ひずみ度中央値およびピクセル間隔を表す。 図２３Ｂは、尿サンプル中における細菌を非細菌から区別するために使用されるこの発明に従った４つのアルゴリズムのアプローチの統合を図示するグラフであり、細菌を混ぜた脂質を有する細菌の濃度のために、そこでは縦軸が応答を表し、横軸は、細菌でオブジェクトカウント平均、密度平均、ひずみ度中央値およびピクセル間隔を表す。 図２４は、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための、この発明の方法を実施するのを助ける、この発明に従って形成された、消耗可能容器の第１０実施例の斜視図である。 図２５はこの発明に従って形成され、そして図２４に示される消耗可能容器の第１０実施例の平面図である。 図２６は、この発明に従って形成され、かつ図２４に示される消耗可能容器の第１０実施例の側面図である。 図２７は、この発明に従って形成され、そして図２４に示される消耗可能容器の第１０実施例の底面図である。 図２８は、図２７において参照文字Ａを付した破線の円内に示すこの発明の消耗可能容器の第１０実施例の拡大底面図である。

実験を通して、液体サンプル中の細菌が、非細菌の「破片」から細菌を区別するために使えるかもしれない若干の特性を示すことに気付いた。特に、細菌に関して２つの観察をした。一つは、流体サンプル（fluid sample）のバルクに自動整列する細菌の能力に関係していて、細菌が流体サンプルの大部分に亘って、３次元で均一に離間したラティス状のグリッドパターンを形成することを意味する。加えて、赤血球、白血球、結晶および他の小さい破片を含むマクロ粒子（macro particles）のような、他の粒子が、液体サンプルを保持する容器の底に沈澱するとき、細菌は流体サンプルの大部分において懸濁滞在する傾向がある。さらなる実験と支援理論を通して、前述したことが細菌と非細菌の信頼できる、そして再現可能な特性であって、細菌が液体サンプル中に存在するかどうかを判断する際の、そしてサンプル中の細菌の濃度を決定するための重要な要素として使えるかと信じる。

実験を通して観察された追加の現象は、一般に、尿サンプルのような液体サンプルを保持する消耗可能容器の表面の近くの「無菌ゾーン」の外に、自動整列した細菌がいるということだ。若干の細菌が、学習して、おそらく、表面、特にポリマーの表面に対する反発力のために「反発ないし回避」（（aversion）：以下「反発」）を有する傾向がある。この要因は、液体サンプル中の細菌の存在および濃度を決定するときにもまた、考慮に入れられる。

具体的には、細菌は、一般に、尿サンプルのような液体サンプル全体に均一な粒子サイズで一様な分布を示すことを発見した。この観察は、塊になり不規則な形状を持つ傾向がある尿サンプル中に見い出され得る他の小さい破片粒子と対照的である。その開示が参照によってここに取り入れられる、前述のオールセン等の公開された合衆国出願（合衆国特許出願公開No.２０１１/０２６１１６４）、において開示されたような、顕微鏡撮像法を使うことによって、尿サンプル中の細菌は、合焦面の中で一様に分布されているだけでなく、流体サンプルのバルクまたは大部分の中にも分散されることを見出した。

およそ３分とおよそ９０分、好ましくはおよそ３分からおよそ１０分の間のような、所定の時間期間の後に、細菌が、赤血球、白血球および結晶のような、沈澱した成分から分離して、尿サンプルの体積の大部分全体に、懸濁液の中に留まることが確認された。このような実験で使われる流体撮像装置のカメラの焦点面は、容器の底から１００ミクロンのような、消耗可能容器の底にではなく、流体バルク内になるように設定されている。尿サンプルにおいて実行される光学セクショニングの可視情報が、細菌が流体のバルク内の溶剤中に残っているということ、そしてさらに、容器の底の近くや側面を除いて、細菌が尿サンプルの大部分の全体に自動整列するという、可視的な確認を提供する。容器がポリマー材料から作られるとき、この現象は特に存在する。大部分の非細菌性粒子は、１分間におよそ１００ミクロンの落下速度で沈澱するように見える。

これらは、信頼できる、そして再現可能な方法で細菌を非細菌から分離するために使われて、そして液体サンプル中において細菌を検出して、そして評価して、その濃度を決定するのに使われるかもしれない、重要な差別化要因である。すなわち、これらの２つの事象は、尿サンプルにおける細菌の検出および数量化において、異なる帰結的意味を持つことになる。細菌の自動整列は確実に細菌の存在を検出する手段を提供するが、他方で、無菌ゾーンは、細菌の１つの形状を他の形状から、たとえば桿菌（bacilli）ないし「桿状体：rods」を、球形の細菌ないし球菌（coccus）から、たとえば、連鎖球菌（streptococcus）をブドウ球菌（staphylococcus）から分離する手段を提供する。実験を通して、ブドウ球菌だけではなくプロテウス菌（proteus）、クレブシエラ菌（klebsiella）、腸球菌（enterococcus）、エンテロバクター属（enterobacter）および大腸菌（病原性）（Escherichia coli (E. coli)）の細菌の形態）形態も撮像カメラの焦点面内でだけではなく、尿サンプルの大部分で一様に分散さることを発見した。

自動整列は、ここでは、尿サンプルの３次元のバルク内の細菌の物理的分布を説明するために、この明細書中で使われる用語である。細菌（桿菌および球菌）が流体内で一様に分布する自然な傾向を持つ。運動性がこの分離のための原動力であるように思えない。しかしながら、細菌に自動整列させかつ重力の存在下においてさえ尿サンプルの体積内でのそれらの位置決めを維持させる他の力の存在があるように思える（これらの粒子のための、重力による力は、図１Ａに記述した式に基づいて、約２倍の浮力がある力であり、１０^−１５ニュートンのオーダーである）。

具体的には、図１Ａおよび図１Ｂが尿サンプル中での細菌の自由体図を図示しかつラティス構造の一部として表わされる（均一な分布を表す一般的な間隔は、およそ１０から６０ミクロンの範囲である）。システムに均衡を持続させるためには、上向きおよび下向きの力が一致している必要があり、正味ゼロ（０）の力をもたらし、そして、細菌は安定した均一なラティス構造を維持する。そのようなラティス状の構造は常に最小エネルギの状態に向かう傾向にあり、細菌は、図１Ｂで示すモデルによって規定される最小のラティス構造におけるすべての場所を満たす傾向がある。図１Ｂで、明るい矢印は重力と浮力を表し、そして暗い矢印はゼータ電位力（Zeta Potential forces）を表す。このように、そして図１Ｂで示すように、サンプル中のいくつかの細菌が相互作用を有し、自動整列を生じさせるとともに、沈澱することを妨げることになる。換言すれば、均等な反対の力が、沈澱しないで、自動整列する静止構造を維持する。参考のために、病原性大腸菌は各々およそ２．９から９．５×１０^−１３グラムの範囲の質量を持ち、結果的に、およそ３からおよそ９×１０^−１５ニュートンの重力となる。

図１Ａに示すように、各々の細菌に関連するいくつかの力があり、そしてこれらの力は、各々隣接する細菌の力と相互作用し、システムに均一な均衡を持続させる。具体的には、ｘ方向（Ｆｚｘ）のゼータ電位力が細菌に関連していて、ｙ方向（Ｆｚｙ）のゼータ電位力もまた細菌に作用し、細菌に作用する浮力（Ｆｂ）が、ｇ（重力）を乗じた体積を乗じた流体の密度と等しくなるように決定され、細菌に作用する重力の力（Ｆｇ）がｇ（重力）を乗じた細菌の質量と等しく、そして電界力（Ｆｅ）がさらに細菌と関連する。他のゼータ電位源がなく、Ｆｚがゼロ（０）で、そしてもし電界力Ｆｅもまたゼロ（０）であるなら、細菌に作用する唯一の他の力は浮力と重力であり、このような状況下では、沈澱が起こるはずである。

電気力は一般にゼータ電位に関連する理論によって説明される。ゼータ電位は緩く拘束されるイオンを含む粒子を取り巻く流体領域によって規定される。ゼータ電位はコロイド系（尿などの中の微細に分散した固体と流体）の原動力である。ゼータ電位の大きさは、システムが安定している（粒子が構造を維持する）か、もしくは不安定である（粒子が流体の比重によって沈澱するか浮くか）によって決まる。反イオン（粒子の表面上の結合電荷とは反対の電荷をもつイオン）が一般に数十ナノメートルより大きくない小さい層において細胞を囲むので、システム（細胞と周囲の流体）は巨視的な観点からは電気的に中性である。細菌のための自然の負電荷はエネルギのためのＡＴＰ（adenosine triphosphate：アデノシン三リン酸）変換の一部としての「プロトンポンプ（proton pump）」の役割を果たす細胞の副産物である。実際に細菌はＡＴＰ転送を容易にするためにその膜壁を横切るｐＨ勾配を作ろうとし、そしてこれは細菌の正味の負電荷を生じさせる。イオン化された尿サンプルから見つかったゼータ電位に加えて、多くの電気的活動があり、これは細菌が水環境（または他の非イオン性流体）であり、機能がまだプロトンポンプ（反発力がわずかに減少する）のために存在する場合には重要な検討事項である。流体内で、粒子と反イオンは他の同様の粒子をはね返して、そして分散を持続するように行動をすることができる局所的な電荷を持つ。図１Ａおよび図１Ｂの自由体図で示すように、ゼータ電位は尿コロイド系に対する最大の駆動因子である。粒子の質量がゼータ電位からのかつ粒子が沈澱する力に対して大きいので、尿中の大部分の粒子は、重力による沈澱力に打ち克つ十分なデータ電位を持たない。しかしながら、細菌は小さい粒子質量を持ち、そしてゼータ電位はコロイド系を懸濁状態で保持するのに十分大きい。この発明の方法は、細菌のこの自動整列現象を利用し、そして尿サンプル中において細菌を検出し、評価し、その濃度を決定するためにそれを使う。

具体的には、液体サンプル中の細菌を検出して、そしてその濃度を決定するための方法が、所定の視界でかつ所定の焦点面の深さまたは角度において、そしてサンプル中の非細菌の破片が容器の底に沈澱するのを可能にする（およそ３分からおよそ１０分かそれ以上のような）時間の所定の期間の後に、好ましくは、液体サンプルの体積を含む、消耗可能（すなわち、廃棄可能）、好ましくはポリマー容器を通して、１つまたはそれ以上の光学セクションを撮影するステップを含む。所定時間期間が経過した後、細菌は液体サンプル中で、自動整列し、実質的に液体サンプルの大部分に亘って３次元で均一に間隔を隔てたラティス状のグリッドパターンを形成する（ある場合には、液体サンプルを保持する消耗可能容器のポリマー表面の近くの「無菌ゾーン」を除く）。このようにして、自動整列した細菌の体積を通して光学セクションが、その切片中に存在している細菌の数量を決定するために使われ得る。容器によって保持された液体サンプルの全体積を知ることによって、含まれている体積中での全細菌の少なくとも近似を計算することができる。

前述のオールセン等の合衆国出願公開によって教えられるように、光学セクショニングは、液体サンプルを通して垂直に、体積中の異なる高さで水平に、もしくは液体サンプルを通る垂直または水平に対する角度で、起こる。サンプルのそのような傾斜した光学セクショニングが行われるとき、光学セクショニングの垂直に対する好ましい角度は、およそ７度である。非細菌の「破片」が、所定の時間期間が経過した後、容器の底に沈澱するので、水平の光学セクショニングが、容器の底の上方５０ミクロン、１００ミクロンおよび１５０ミクロンのような種々の深さについて配置されているシステムカメラの焦点面で行われ得る。

容器によって保持された液体サンプルの１つまたはそれ以上の光学セクションが実行されたとき、各々の切片で見いだされる細菌の数が数量化され、そして平均されてもよい。カメラの被写界深度を知ることによって、または別の方法でいえば、切片に現れる細菌が合焦していてかつ細菌がその切片に存在するとして識別され得る光学セクションの深さを知ることによって、そして容器に保持された液体サンプルの体積を知ることによって、サンプルの光学セクションからの細菌の平均数が、液体サンプルの体積を通る幅、深さまたは斜め内の光学セクションの数を乗じられて、容器によって保持されたサンプルの単位体積当たりの全細菌数の少なくとも近似（たとえば、細菌はマイクロリットルあたりのカウント数）をもたらす。決定と計算は撮像装置による方法に従って自動的に実行され、明視野顕微鏡を使用するような従来の方法を使用して一般に行われる医療技術者の側での面倒や手動的な評価を必要としない。

あるいは、再び光学セクショニングを通して、細菌の間の平均の間隔を推定するために、決定が行われてもよい。この平均の粒子間隔は、細菌をカウントしようと試みることの代わりに、容器によって保持された液体サンプルの体積中での細菌濃度を推定する手段として使用される。すなわち、細菌をカウントする必要はないかもしれないが（非細菌が沈澱したという確信を持つために）、単一の焦点面における細菌間の距離を決定するために統計値を使用することができる。距離はついで平均され、自動整列が完全ではないかまたは非細菌ではなく、細菌の少なくとも指標であることを保証するために、異なる焦点深度を見るために、アルゴリズムが用いられ得る。細菌（または他の粒子）の間の平均間隔を決定する方法は、画像内の細菌を表す領域のすべてを評価すること、および同じ焦点面にある粒子の間の光学的距離を決定するために使用され得るそれらの焦点曲線を評価すること（傾斜光学系は合焦（in-focus）のおよび焦点が合っていない（out-of-focus：ピンぼけの）画像のオブジェクトスタックを提供する）を含む。この手順はすべての焦点面に亘って繰り返され、そして粒子の３次元マップが平均の統計値に基づいて生成され得る。

先に述べたとおり、ポリマー材料で形成された容器の表面の近くに位置する「無菌ゾーン」があるように思われる。細菌とまったく同じように、ポリマーが流体媒体中でゼータ電位を持つ。このようなポリマーは、好ましくは、この発明の消耗可能容器が作られる材料であるアクリル系材料、たとえば、ポリ（メチルメタクリレート）ないしＰＭＭＡを含む。

図１１Ａおよび図１１Ｂは、ポリマー基材および関連の細菌の自由体図である。図１１Ａに、細菌およびポリマー表面に関連する力が示される。用語Ｆｚｂは細菌のためのゼータ電位力を表し、用語Ｆｚｐはポリマー表面のためのゼータ電位力を表し、用語Ｆｂは浮力を表し、それはｇ（重力）を乗じた細菌の体積を乗じた流体サンプルの密度と等しく、そして用語Ｆｇは、ｇ（重力）を乗じた細菌の質量と等しい重力を表す。図１１Ａから、等しくかつ反対方向の力が、細菌が沈澱しないで自動整列するのを許容する静的構造を維持するであろうことから明らかである。さらに、消耗可能容器のゼータ電位は、容器の上部および底部の両方において、そしてその側部においても、生じるであろうポリマー表面近傍の「無菌ゾーン」を作る。さらに、桿菌は球菌より大きく、より大きい質量を持ち、重力でゼータ電位に打ち克ち、そして少なくとも部分的な沈澱を有し、あるいは、重力が電気力の多くに打ち克つので、少なくとも異なる「無菌ゾーン」の厚みを示す。

図１１Ｂに示すように、サンプル中のいくつかの細菌が、自動整列を引き起こす相互作用を持ち、そしてポリマー消耗可能容器の表面近くの「無菌ゾーン」を維持する。
したがって、尿サンプル内の細菌から非細菌の破片が一旦分離すると、ポリマー容器の底部（および上部）に近接した焦点面を有する液体サンプルの光学セクショニングが、ポリマー容器の上部および底部から比較的離れた別の光学セクショニングとともに、決定および評価、および幾つかの細菌たとえば大きい質量の桿菌が「無菌ゾーン」を占領し、一方で重力に殆ど打ち克つことができない、小さい質量しか持たない球菌は、「無菌ゾーン」の外の懸濁液の中に留まり、液体サンプルの体積内で自動整列するような、尿サンプル内での異なるタイプの細菌の少なくとも近似へ導く。

図２ないし図１０が、この発明に従って形成される、液体サンプルを保持するための消耗可能容器の種々の形態を図示し、特定の構造は非細菌の「破片」を細菌から分離するのを助け、そして液体サンプル中の細菌を検出し、そしてその濃度を決定するためのこの発明の方法を実行する助けとなる。好ましくは、容器は、消消耗可能製品、すなわち、それが使用後廃棄可能能であり、そしてアクリルＰＭＭＡのような、ポリマー材料から作られる。

図２はこの発明に従って形成された消耗可能容器の単純化した断面図である。図２において、参照文字Ａは容器の上面を表し、参照文字Ｂが容器の底面を表わし、参照文字Ｃが容器によって保持されたれた液体サンプルを通して光学セクションを撮影する撮像システムのカメラの焦点深度を表し、そして参照文字Ｄが容器の底面の細菌ゾーンを表わす。

詳しくいうと、図２の容器は、凹底部およびその凹底部に隣接する非凹底部を含む。非細菌の破片は、凹底部へ液体サンプルから沈澱する。流体撮像装置の光学システムの焦点面は、細菌だけが検出されるように、容器の非凹底部またはその近くに設定される。そのため、光学システムは容器の非凹底部上に存在する粒子をスキャンすることになる。容器底部が光学システムの焦点面より低い分離した領域Ｄを取り込むことは、（適切な沈澱時間を待った後で）カウントするための細菌だけを残して、沈澱した粒子が視野にないという条件を実現する。

図３ないし図５がこの発明の方法での使用のための容器の他の実施例を表し、それは流体中の非細菌から細菌の自然な分離を利用する。すなわち、図３はこの発明に従って形成された容器のもう１つの形態の単純化した断面図である。再び、参照文字Ａは容器の上面を表し、参照文字Ｂが容器の底面を表わし、参照文字Ｃが沈澱粒子のためのカメラの焦点深度を表し、そして参照文字Ｄが細菌のためのカメラの焦点深度を表わす。図３に示された特定の実施例で、容器上、底面は互いに平行であるが、光学的取り調べが流体内の異なる深さにおいて起こる。より重い粒子（「破片」）は液体サンプルから沈澱して容器の底面すなわちカメラの焦点深度である「Ｃ」に存在し、これに対して、自動整列する細菌は、液体サンプルの体積中において容器の底部に比べてより高い位置を占め、「Ｄ」で示すカメラの焦点深度で捕捉される。

図４はこの発明に従って形成された容器のさらに他の実施例の単純化した断面図であり、参照文字Ａが容器の上面を表わし、参照文字Ｂが容器の底面を表わし、参照文字Ｃが沈澱粒子のためのカメラの焦点深度を表し、そして参照文字Ｄが細菌のためのカメラの焦点深度を表わす。図４から分かるように容器は水平に対して傾斜した底面を含み、そのため、固定垂直位置（浅いセクションで容器の傾斜している底面に近い、「Ｃ」で）での取り調べが粒子を検出し、これに対して、固定垂直位置「Ｄ」（これは焦点深度「Ｃ」と同じ焦点面内にあったとしても、実際は傾斜している底面から高いレベルである）での取り調べが液体サンプル中の細菌だけを検出する。

図５は、液体サンプル中の細菌を検出して数量化する方法を実行するための、この発明に従って構成された容器の他の実施例の単純化した側面図である。図５において、参照文字Ａが容器を表わし、参照文字Ｂが沈澱粒子のためのカメラの焦点深度を表し、そして参照文字Ｃが細菌のためのカメラの焦点深度を表わす。図５に示された容器は、好ましくは上面開口微量定量プレート井戸（open-topped, microtiter plate well）であり、その中の液体サンプルの体積の光学セクションを実行するのに使用される光学システムが、流体を異なる深さで取り調べる。「Ｂ」におけるカメラの焦点深度は、井戸の底または近くであり、沈澱した粒子を検出するのに対し、井戸の底の上方に上げられている「Ｃ」でのカメラの焦点深度は、自動整列中にある細菌を検出する。

図６はこの発明に従って構成されて、そして液体サンプル中の細菌を検出してその濃度を決定するための方法を実行するために使われる、容器の他の形態の単純化した上面図である。詳しくいうと、参照文字Ａが容器の左表面を表わし、参照文字Ｂが容器の右表面を表わし、参照文字Ｃが流体流のスタート領域を表わし、参照文字Ｄが、矢印の形で、容器を通る流体流を表し、そして参照文字Ｅが容器中に形成された流体流のチャネル（流路）を表わす。流体流のチャネルは、左右面の間で、容器の上面に向かう容器の底面から上方に垂直に延びる一連の平行プレートによって規定される。容器内の流路チャネルは、隣接するプレートの間に位置し、流体の毛細管流動を促進する。

図６に示された容器の好ましい形態において、平行に配置されたプレートによって規定されるいくつかの流体流のチャネルがあり、容器の左面と容器の右面に近接して内方に形成され、これら左右の流体流チャネルは容器の長さに沿って軸方向に延びる。流体流のスタート領域Ｃの近くで、容器の左面から右面に容器の幅を全体に横切って延び、互いに間隔を隔てられた流体流チャネルがまた平行に配置される。これらのチャネルもまた隣接したプレートによって規定されていて、容器の左右の面に向かう対称的な方向に容器の長手方向の中心から領域Ｃの近傍にまで互いに増加する軸方向の長さで延びる。

そのため、容器に組み込まれた流れの特徴は、表面積を増大（流体体積に対して）し、流体流のためのガイドを提供する。

図６の容器で流体流を促進する代わりの構造が、体積に対して増加した表面積を提供して、毛細管流を促進するために、流体チャネルの寸法（幅および深さ）を減らすことを含むかもしれない。あるいは、チャネルを規定するプレートを形成する材料が、容器を通る毛細管作用を支持する十分な接触角度（親水性）を有するように選ばれるかもしれない。さらに、容器の左右の面上およびそれらの間でチャネルをプレートの表面上の表面処理が、容器を通る流体流を促進するために行われる可能性があり、そのような処理は、プラズマ処理、コロナ処理、表面化学反応あるいは界面活性剤応用を含む。これらの実施例は、容器中へ入りかつ容器を通る流体の流れのために毛細管作用を利用する。容器の中にかつ容器を通る流体流を促進する別の代替の方法は、流体が単に容器上に落下ないし滴下されるオープンシステムまたは流体が機械的に容器に送り込まれるクローズドシステムを含むことが想定されている。

図２で図解された容器への修正の単純化した断面図が図７に示される。参照文字Ａが容器の上面を表わし、参照文字Ｂが容器の非凹底面を表わし、参照文字Ｄが細菌ゾーンを規定する容器の凹底面を表わし、参照文字Ｅが、矢印の形で、容器を通る流体の流れを表し、そして参照文字Ｃは容器底部から上方に延び、容器によって保持された液体サンプル中へ部分的に及ぶ突起を表わす。突起は、参照文字Ｅで示されるような容器を通る軸方向の流体の流れに対して「減速用バンプ」の役割を果たす。（用語「減速用バンプ」がここに発明の全体的な理解を容易にするために使われることは理解されるべきであるが、体積流量が一定であり、断面積は、その「減速用バンプ」においては小さいので、流体は、実際に突起上に速い速度で進行することを理解されたい。参照文字Ｃは、より密度が高い粒子が容器を流下し、「Ｄ」における細菌ゾーンに流入するのを阻止する。したがって、図２に示す容器での場合と同じように、図７に示すこの特定の容器は、「Ｄ」で示す隣接の凹底面が後続する「Ｂ」で示す非凹底面を含み、凹底面は、突起Ｃを越えて流れた後に自動整列における細菌が存在する「トレンチ」を規定する。

好ましくは、図７に示す容器は、流体が流れる、軸方向に貫通した比較的長いチャネルを規定する。容器によって規定されるチャネルを流体が流下するとき、粒子は液体サンプルから沈澱し、そしてより密度が高い粒子は、突起Ｃの前で、チャンネルの始まりで集中し、それほど密度が高くない粒子は容器チャネルのさらに下流に沈澱する。この現象は、サイズによって、またはチャネル内の垂直位置によって要素を分類する、チャネル内の流れの特徴を適用することによって拡大され得る。

すなわち、図７に図解した容器の変形が図８で、凹底面なしで示される。図８で、参照文字Ａが容器の上面を表し、参照文字Ｂが上面に平行な底面を表し、参照文字Ｃが、容器底面から上方に延び、容器によって保持された液体サンプル中へ部分的に及ぶ突起を表し、参照文字Ｄが、矢印によって、容器を通る軸方向の流体の流れの方向を表す。このようにして、図８から分かるように、この発明の特定の容器が、容器の軸方向長さの少なくとも一部に亘って、複数の周期的に間隔を隔てた突起ないし「減速バンプ」を含む。容器の長さに沿って間隔を有して位置されたこれらの突起Ｃは、流体の深さにおいて高い粒子のみを、容器によって規定されたチャネルを下流に続かせ、特定の密度範囲の粒子が蓄積される取り調べのための領域を提供する。

図９は、液体サンプルの中の細菌を検出してその濃度を決定する、この発明の方法を実行するための、容器のさらに他の形態を図解する。図９に示す実施例は、図８における突起Ｃが図９の実施例におけるサイズ違いのフィルタで置き換えられている点を除いて、図８で示すものと類似している。図９で、参照文字Ａが容器の上面を表し、参照文字Ｂが凹部のない容器底面を表し、参照文字Ｄが、矢印によって、図８の容器と同様に流体流のための比較的長いチャネルを規定する、容器を通る軸方向の流体の流れの方向を表し、参照文字Ｃが、突起に代わるフィルタを表す。

すなわち、図９に示すように、複数のフィルタがあり、それらは容器の底面と上面との間に延び、そこを通して、液体サンプルが方向Ｄに流れる。フィルタは、突起が図８の実施例において間隔を隔てられていると同じ態様で、容器の軸方向長さの少なくとも一部に亘って互いに間隔を隔てられる。好ましくは、異なる孔サイズのフィルタが使用される。詳しくいうと、上流のフィルタは好ましくは下流のフィルタより大きい孔サイズを有し、そのために、フィルタは流体流Ｄの方向において、孔サイズが小さくなっている。フィルタは異なる寸法を持つ粒子をブロックし、そのために、このような粒子がフィルタの間の領域で蓄積し、これらの領域は、各領域において蓄積する粒子のタイプを検出し評価するために、光学セクショニングまたは類似の方法で取り調べられる。細菌（１ミクロンの大きさ）のようなより小さい粒子は、全てのフィルタを通過し、容器の下流端の領域で蓄積し、そこでそのような細菌が決定されて、数量化される。

図１０Ａおよび図１０Ｂは、それぞれ、単純化した上面図および断面図であり、品質保証の目的のために、容器の底面中にまたはその上に形成される、複数の間隔を隔てた凹部もしくは突起部、または粒子を図解する。流体の光学的評価は、システムが合焦していて、倍率が適切であり、光学的な特徴が適切に解決されることを保証するために、参照（reference）を含むべきである。これらの特徴（一定の縮尺で描かれてはいない）は、流体サンプル中の標準的な要素を表し、そして焦点参照と、サンプルが、形成要素のない健康な宿主からのものである場合の光学系が正常に機能していることを保証する手段の両方を提供する。図１０Ａおよび図１０Ｂで図解したように、これらの特徴の好ましい実施例は、最適な焦点位置で容器底面にまたはその近くにそれらを組み込むことであろう。このような特徴は形状であってよく、たとえば消耗可能容器が製造されるとき容器の底面に成形されて、組み込まれ得る粗表面を含むかもしれず、あるいは近い製作工程において、特徴が容器上にたとえばレーザで跡がつけられ、または容器の底面上に位置されるたとえば固定のビーズまたはラテックス粒子で形成される。任意のサンプルを光学システムの適切な信頼度で分析することができるような特徴が、最適な焦点に配置される。細菌あるいは他の粒子が検出されない尿サンプルをテストした後の否定的な結果は、品質保証機能だけが確認され、何もないとき、正確であるとして実証される。図１０Ａおよび図１０Ｂにおいて、文字「Ａ」は凹部を表し、文字「Ｂ」は突起を表し、そして文字「Ｃ」が粒子を表す。

図１０で示す容器の単純化した上面図は、このような品質保証特性の１つの可能な実装である。このような突起、凹部あるいは粒子の大きさ、形状、コントラスト、位置および間隔は、関心のある要素の光学的清澄性（optical clarity）と識別力（discrimination）を保証するよう設計される。

液体サンプルの中の細菌を検出してその濃度を決定するためのこの発明の方法を実行するための容器のなおも他の形態を図２４‐図２８で示す。概略的にいうと、容器はハンドル部分４と、そのハンドル部分４から軸方向外方に延びる読取り領域部６（サンプルの撮像が行われるところ）とを有する、長手の部材２の形態である。ハンドル部分４および読取り領域６は、サンプル容器のハウジングを備える。先に説明したサンプル容器の他の実施例におけるように、この特定の実施例もまた、消耗可能成分で製造され、つまり、サンプル容器は使用後、所要の安全プロトコルに従って処分される。

その中に液体サンプルを受けるための入口ポート８が、ハウジングのハンドル部分４の上のハウジングの上面に位置する。入口ポート８は、サンプル容器の読取り領域部分６の長さの少なくとも一部に沿って軸方向に延びる、内部の、長手の、液体サンプル井戸１０と流体連通する。井戸１０は、入口ポート８を通してサンプル容器上に滴下された、尿のような液体サンプル保持し、そして井戸１０に含まれる液体サンプルの撮像が生じるハウジングの上面および／または底面上の領域を規定する。

ハンドル部分４とは逆の軸方向でありかつ井戸１０と連通する、サンプル容器のハウジングの読取り領域部分６の末端に、細菌読取り領域１２が位置する。詳しくいうと、細菌読取り領域１２が液体サンプルを含む井戸１０の端部を構成し、そして、図２に示すサンプル容器（深さが変わる２つのセクションを有する）といくつかの点で類似し、井戸１０の細菌読取り領域部分の軸方向長さに亘って漸増する深さを有し、ハウジングの読取り領域部分６の末端に向かう方向において深さが増す、好ましくは３つまたはそれ以上の隣接セクションを含む。図２４‐図２８に示すサンプル容器を撮像するために使われる流体撮像装置の光学システムは、液体サンプル井戸１０の１つまたはそれ以上のセクション中の粒子だけでなく、細菌読取り領域１２に存在する自動整列した細菌についてもスキャンする。図２に示すサンプル容器の実施例に関して先に述べたように、自動整列しない形成要素のような重い粒子は、井戸の深さに依らず、１つまたはそれ以上のバルクセクション（bulk section：すなわち、流体のバルクを含むサンプル容器井戸１０の中間レベルのセクション）においてカウントするために、底から離れた細菌を残して、井戸１０の底に沈澱する。サンプル容器が充填されるとき、要素（形成要素、細菌、破片、脂質など）の全てが、流体バルク全体にランダムに分散する。細菌は、大部分の形成要素と同じように沈澱しないので、そして形成要素がもはや存在しない流体バルクにおいて、それらはいっそう容易に見られ、区別され得る。自動整列した細菌は、好ましくは、井戸１０の末端で細菌読取り領域１２中において決定される。

井戸１０の細菌読取り領域１２は、好ましくは、３つのセクション、すなわち、第１セクション２２、第１セクション２２に隣接する第２セクション２４および第２セクション２４に隣接しそれに続く第３セクション２６を含み、それらは深さが変わる。詳しくいうと、読取り領域部分６を越える井戸１０の深さは、好ましくは、約２５０ミクロンである。第１セクション２２は、好ましくは、約４５０ミクロンの深さであり、その中に存在している細菌はおよそ２００ミクロンの深さで光学的に読み取られる。第２セクション２４は、好ましくは、約６５０ミクロンの深さであり、その中に存在している細菌はおよそ４００ミクロンの深さで光学的に読み取られる。第３セクション２６は、好ましくは、約８５０ミクロンの深さであり、その中に存在している細菌はおよそ６００ミクロンの深さで光学的に読み取られる。

この発明の十分な理解を容易にするために、先にここで開示した方法を実行するための方法および容器をさらに説明する。

この発明の１つの形態に従えば、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための方法は、液体サンプル中の細菌が自動整列するのを許容する所定時間期間の経過の後、所定の視野でかつ体積中の所定の焦点面ないし角度で、液体サンプルの体積を通して少なくとも１つの光学セクションを撮影するするステップ、およびその少なくとも１つの光学セクション内に存在する細菌の数をカウントするステップを含む。沈澱が完了し、自動整列工程だけが発生している活動である場合かを判断するために、アルゴリズムを作ることができるので、評価のための最適時間を決定するために沈澱現象を監視することもまた可能である。完全な分離まで待つ必要がないが、代わりにサンプルを監視し、沈澱した粒子を処理し、細菌の特性を有するサンプルの一部を評価するだけの予測アルゴリズムを作成することもまた可能である。方法のステップはまた、液体サンプルの体積がその中へ分割されている光学セクションの数を計算するステップを含み、それによって、可能な光学セクションの合計数を決定し、少なくとも１つのセクションに存在する細菌の数に乗ずることによって、液体サンプルの体積内の細菌の合計数の少なくとも近似が決定でき、液体サンプルの体積内の細菌の合計数の少なくとも近似に基づいて液体サンプル内の細菌濃度を決定することができる。

液体サンプル中の細菌が自動整列するのに許容された所定の時間期間は、好ましくは、およそ３分とおよそ１０分かそれ以上の間である。さらに、液体サンプルの体積を通して撮影された少なくとも１つの光学セクションは、好ましくは、体積を通る垂直面に対しておよそ７°の焦点面の角度を有する。あるいは、液体サンプルの体積を通して撮影されたその少なくとも１つの光学セクションは、体積を通る垂直面に対しておよそ０°の焦点面角度（すなわち、焦点面は垂直）、あるいは体積を通る垂直面に対しておよそ９０°（すなわち、焦点面は水平）を有する。もし光学セクションの焦点面が液体サンプルの体積を通って水平に配置されているなら、光学セクションは、好ましくは、液体サンプルの体積の底の上およそ１００ミクロンの焦点面深さを持つ。代わりに、焦点面深さは、大きい沈澱したオブジェクトからハロー（halos：球面収差によって起きるフレア）を取り除くために、５００ミクロンかそれ以上であってもよい（光学系の被写界深度と焦点外の深さの関数）。

この発明の他の形態では、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための方法は、液体サンプル中の細菌が自動整列するのを許容する所定時間期間の経過の後、所定の視界でかつ体積中の１つまたはそれ以上の所定の焦点面深さまたは角度において液体サンプルの体積を通る複数の光学セクションを撮影するステップ、および複数の光学セクションの各々の光学セクション内に存在する細菌の数をカウントするステップを含む。方法のステップはさらに、液体サンプルの体積を通して撮影された光学セクションの数で複数の光学セクションに存在する細菌の合計数を割ることによって、存在する細菌の数の平均を計算し、それによって複数の光学セクションの光学セクション内に存在する細菌の平均数を決定するステップ、液体サンプルの体積がその中に分割された光学セクションの数を計算し、それによって可能な光学セクションの合計数を決定するステップ、可能な光学セクションの合計数を複数の光学セクションの光学セクションに存在する細菌の平均数に乗じ、それによって液体サンプルの体積内の細菌の合計数の少なくとも近似を決定するステップ、および液体サンプルの体積内の細菌の合計数の少なくとも近似に基づいて液体サンプル内の細菌の濃度を決定するステップを含む。

この発明のさらに他の形態では、液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための方法は、液体サンプル中の細菌が自動整列するのを許容する所定時間期間の経過の後、所定の視界でかつ体積中の所定の焦点面深さまたは角度において液体サンプルの体積を通る少なくとも１つの光学セクションを撮影するステップ、および少なくとも１つの光学セクション内に存在する細菌間の平均間隔を決定し、それによって平均細菌間隔を決定するステップを含む。そして、液体サンプルの体積によって占拠された３次元領域が計算され、それによって、３次元の体積決定領域が決定され、その３次元体積決定領域は細菌間の平均間隔で除算され、それによって液体サンプルの体積内の細菌の合計数の少なくとも近似を決定し、液体サンプルの体積内の細菌の合計数の少なくとも近似に基づいて液体サンプル内の細菌の濃度を決定する。

この発明の他の形態では、液体サンプル中の粒子を検出し、液体サンプル中において第１タイプの粒子を少なくとも第２タイプの粒子から区別する方法は、第１タイプの粒子および少なくとも第２タイプの粒子を含む液体サンプルの体積で容器を少なくとも部分的に充填するステップを含み、容器は、液体サンプル中の少なくとも第２タイプの粒子を反発を示させかつ液体サンプル中の第１タイプの粒子を反発を示させない所定の材料から作られた１つの表面を有する。液体サンプル中の粒子の少なくとも第２タイプの粒子は、主に容器の表面に近接している液体サンプルの体積の反発領域を占拠せず、液体サンプルの粒子の第１タイプの粒子は容器の表面に近接している液体サンプルの体積の反発領域を占拠しない。そして、所定の視野でかつ所定の焦点面深さまたは角度において、液体サンプルの体積の反発領域を通る少なくとも１つの光学セクションが撮影される。光学セクションは、容器の表面に近接している液体サンプルの体積の反発領域を占拠し、主として反発領域を占拠しない少なくとも第２の粒子の粒子から区別される、第１タイプの粒子を検出する。

好ましくは、粒子の少なくとも第２タイプの粒子によってそこに反発を引き起こす容器の表面は、アクリル材料、そしてより好ましくは、ポリ（メタクリル酸メチル）poly（methyl methacrylate）（ＰＭＭＡ）から作られる。細菌に反発を起こさせる他の材料は、限定されるものではないが、ポリスチレンおよび環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）を含む。

今、ここに開示されたこの発明の方法を実行するために使われ得る容器の種々の形態をさらに説明する。この発明の１つの形態において、図２に示すように、液体サンプルを保持しかつ液体サンプル中の異なるタイプの粒子を分離するため使用される容器は、凹部と凹部に隣接する非凹部を有する底壁を含む。ただし、容器に保持される液体サンプルの体積内の異なるタイプの粒子は、容器に保持される液体サンプル中で自動整列する第１のタイプおよび液体サンプル中で自動整列しない第２のタイプを含む。容器はそれによって、液体サンプルの体積の第１の深さに位置しかつ容器の底壁の非凹部に垂直に整列する第１ゾーン、および液体サンプルの体積における第２の深さに位置しかつ容器底壁の凹部に垂直に整列する第２ゾーンを規定する。第１タイプの粒子は、自動整列して容器内の第２ゾーンを占拠する傾向があり、第２タイプの粒子は、自動整列しないで容器内の第１ゾーンを占拠する傾向がある。

図８に示すように、上述の液体サンプルの体積を保持するための容器は、さらに、少なくとも１つの突起を含み、その少なくとも１つの突起は、容器底壁の非凹部から上方に延び、少なくとも部分的に、容器によって保持された液体サンプルの体積中に及ぶ。少なくとも１つの突起は底壁の凹部に近接した底壁の非凹部上に位置する。少なくとも１つの突起は、さらに、自動整列して容器の第２ゾーンを占拠する傾向にある第１タイプの粒子を、自動整列せず容器内の第１ゾーンを占拠する傾向にある第２タイプの粒子から分離するように作用する。

代わりに、図８に示すように、液体サンプルの体積を保持しかつ液体サンプルの体積内の異なるタイプの粒子を分離するための、この発明に従って形成された容器は、底壁と、容器の軸方向長さの少なくとも一部に亘って互いに間隔を隔てられる複数の突起とを含む。ただし、容器によって保持された液体サンプルの体積内の異なるタイプの粒子は、容器によって保持された液体サンプルの体積内で自動整列する第１タイプの粒子と液体サンプルの体積内で自動整列しない第２タイプの粒子を含む。突起は容器の底壁から上方に延び、そして少なくとも部分的に、容器によって保持された液体サンプルの体積に及ぶ。突起は第１ゾーンおよびその第１ゾーンに隣接する少なくとも１つの第２ゾーンを規定する。第１タイプの粒子は、自動整列して容器内において第１ゾーンを占拠する傾向にあり、第２タイプの粒子は、自動整列しないで容器内の少なくとも第２ゾーンを占拠する傾向にある。

この発明のさらに他の形態では、図９に示すように、液体サンプルの体積を保持しかつ液体サンプルの体積中において異なるタイプの粒子を分離するのに使用される容器は、底壁と、底壁から上方に延び、少なくとも部分的に、容器によって保持された液体サンプルの体積中に及ぶ少なくとも１つのフィルタとを含む。ただし、容器によって保持された液体サンプルの体積内の異なるタイプの粒子は、第１寸法を示す第１タイプの粒子と第１タイプの粒子が示す第１寸法とは異なる第２寸法を示す第２タイプの粒子を含む。少なくとも１つのフィルタは、第１の軸側と第１の軸側と反対の第２の軸側を有する。容器は、少なくとも１つのフィルタの第１の軸側に隣接して位置する液体サンプルの体積内の第１ゾーン、および少なくとも１つのフィルタの第２の軸側に隣接して位置する液体サンプルの体積内の第２ゾーンを規定する。少なくとも１つのフィルタは、液体サンプルの粒子の第２タイプの粒子が少なくとも１つのフィルタを通って第２ゾーンに通過することを許容する所定の孔サイズを有し、それによって粒子の第１タイプの粒子が容器内の第１ゾーンを占拠する傾向があり、そして粒子の第２タイプの粒子が第２ゾーンを占拠する傾向がある。

図９からわかるように、液体サンプルの体積を保持しかつ液体サンプルの体積中において異なるタイプの粒子を分離するのに使用される容器は、底壁と、容器の軸方向長さの少なくとも一部に亘って互いに間隔を隔てる複数のフィルタとを含む。ただし、容器によって保持された液体サンプルの体積内の異なるタイプの粒子は、第１寸法を示す第１タイプの粒子と第１タイプの粒子が示す第１寸法とは異なる第２寸法を示す第２タイプの粒子を含む。フィルタは底壁から上方へ延び、そして少なくとも部分的に、容器によって保持された液体サンプルの体積に及ぶ。複数のフィルタは少なくとも液体サンプルの体積の中の第１ゾーンと液体サンプルの体積の中の第２ゾーンを規定する。複数のフィルタの各々のフィルタは、次に隣接するフィルタの穴サイズとは異なる孔サイズを有する。フィルタの少なくとも１つは第１タイプの粒子がそれを通過することを許容し、そして第２タイプの粒子がそれを通過することを許容しない孔サイズを持ち、それによって第１タイプの粒子が容器内の第１ゾーンを占拠する傾向があり、そし第２タイプの粒子が容器内の第２ゾーンを占拠する傾向がある。

この発明の別の形態では、図４に示すように、液体サンプルの体積を保持しかつ液体サンプルの体積内において異なるタイプの粒子を検出するのに使用される容器は、底壁と、第１軸端および第１軸端とは反対の第２軸端を含む。ただし、容器によって保持された液体サンプルの体積内の異なるタイプの粒子は、容器によって保持された液体サンプルの体積内において自動整列する第１タイプの粒子と液体サンプル内において自動整列しない第２タイプの粒子を含む。底壁は、第１軸端に比較的近い浅いセクションと第２軸端に比較的近い深いセクションで容器を規定するように傾斜面を有し、そのために、光学撮像装置によって撮影されるかつ液体サンプルの体積中において一定の焦点面深さを有する、容器によって保持された液体サンプルの体積の水平方向に配置され、その焦点面深さは浅いセクションを越えて容器の底壁に近接するように選択されている、光学セクションが、自動整列しない第２タイプの粒子の容器の浅いセクションに整列した光学セクションの一部を検出し、自動整列する第１タイプの粒子の容器の深いセクションに整列した光学セクションの一部を検出する。

図１０Ａおよび図１０Ｂはこの発明に従って形成される容器の他の実施例を図示する。液体サンプルの体積を保持しかつ液体サンプルの体積内において異なるタイプの粒子を検出するのに使用される容器は、底壁と、品質保証のために、底壁に形成されるまたは容器の底壁に近接して位置される、複数の間隔を隔てた凹部、突起部または粒子を含む。ただし、容器によって保持された液体サンプルの体積内の異なるタイプの粒子は、第１タイプの粒子と第２タイプの粒子を含み、第１タイプの粒子は、容器によって保持された液体サンプルの体積内において自動整列するかもしくは第１の寸法を有し、第２タイプの粒子は容器によって保持された液体サンプルの体積内において自動整列しないかもしくは第１タイプの粒子の第１の寸法とは異なる第２の寸法を有する。

この発明に従って形成される容器の他の実施例では、図６に示すように、液体サンプルの体積を保持しかつ液体サンプルの体積内において異なるタイプの粒子を検出するのに使用される容器は、底壁と、複数の平行に配置されかつ間隔を隔てたプレートを含む。ただし、容器によって保持された液体サンプルの体積内の異なるタイプの粒子は、第１タイプの粒子と第２タイプの粒子を含み、第１タイプの粒子は、容器によって保持された液体サンプルの体積内において自動整列するかもしくは第１の寸法を有し、第２タイプの粒子は容器によって保持された液体サンプルの体積内において自動整列しないかもしくは第１タイプの粒子の第１の寸法とは異なる第２の寸法を有する。プレートは、容器の底壁から垂直に上方へ延び、そして少なくとも部分的に容器によって保持された液体サンプルの体積に及び、複数の平行に配置されたプレートの隣接するプレートとともにそれらの間に流体流路チャネルを規定する。好ましくは、容器は対向する横壁、対向する横壁は、底壁につながりかつそこから上方へ延び、および第１の軸側および第１の軸側とは反対の第２の軸側を含む。好ましくは、複数の平行に配置されたプレートのいくつかのプレートは、図６に示すように、容器の長手方向中心から対称の方向において反対の横方向へ向かう外方へ向かって増加する異なる軸方向長さを有する。

細菌の自動整列（auto-alignment）が関連モデルと実験データで実証された。自動整列のモデルは、先に説明した状況への洞察を提供し、そして進歩した処理が、以下に述べるように、非細菌の人工物（artifacts）の存在下での液体サンプル中の細菌を数量化するために使われ得る。具体的な例は、浮く傾向がある脂質と形成要素より遅い速度で沈澱するかもしれない破片の存在を含む。これらの要素が尿中においてどのように挙動するのか、細菌がどのように挙動するのかに関する概念的なモデルに基づいて、各々が、流体バルク中に見える要素への洞察を提供する、いくつかのアルゴリズムアプローチ（algorithm approaches）をもたらす。アルゴリズムアプローチは、それらがどのように尿サンプルのバルク中で非細菌から細菌を区別するのを助けることができるかについての理解を容易にするために記述される。また、統合モデルは、これらの異なるアルゴリズムアプローチが、これらの人工物の存在下においても適切な細菌濃度を与えるために、どのように組み合わせることがかを説明するために示される。

細菌について説明した自動整列理論は、固体物理学の結晶構造モデルに関連付けられている理論にある程度似ている。重要なのは、限定された空間内で細菌が表面電荷をもち、それが反発する態様で他の荷電細菌と相互作用することである（この前提は、細菌がファン・デル・ワールス引力（Van der Waals attractive forces）が相互作用を支配することにとても近くになる条件を無視している）。細菌は限定された環境にあって、互いから離れて無限に動くことができないので、それらは、図１１Ｂで示すように、自身を、全システムが最小のエネルギレベルであるという条件に適応させる。各々の細菌が同じ質量、体積および表面電荷を持つ単純な２次元モデルが図１２で示され、細菌が互いに対して等間隔でそれら自身を整列させることを説明する。

図１２は、サンプル容器、たとえば、消耗可能（disposable：使い捨ての）素子内で細菌要素の数が完全に、かつ均一にラティス状の空間を満たす状況を表している。もし、そのモデルに１を欠いた（one-less）細菌があったなら、結果として生じるモデルは図１３Ａで示す図表のようになる。他方、もし、細菌のカウントが９から１６まで増加したなら、図１３Ｂで示すように、自然な間隔は、システムのためにその最小限-エネルギ状態を提供するために、今、均一に一致するより小さい距離に変えられる。

２次元のモデルが上面図に代えて垂直のプロファイルから評価されるとき、重力と浮力の効果が働き始める。僅に複雑なモデルは、図１３Ａおよび図１３Ｂに示した電気的相互作用を実証し続けるが、物理的特性もまた採り入れる。相違は、サンプル容器の深さ内で上方あるいは下方に動いている間に撮影された各々の水平スライス（horizontal slice）が残りのものと少し違うということである。この条件で、最も低い深さは、レベルの間の最も短い垂直の間隔と同様、細菌の最も高い濃度を持つ。深さ中において、上がるということは、細菌のカウントの減少および深さ方向の間隔の増加を示す。一番高い水平の行は、ラティス構造の不完全な充填のために、カウントと間隔において、最も広い変化を示す。図１４がこのような構造の３次元のモデルの側面図を示す。図１４に示す要素のグミ形状は、粒子の電荷および消耗可能サンプル容器のエッジに関連する電荷を示す。上部領域の細胞の低い濃度は力が弱く、サンプル容器の壁が細胞を中央に向かって押す。

尿サンプルのバルク内での画像が、細菌が、上で述べた単純なモデルに従うことを示している。流体バルク中の細菌を評価することは、重力が、細菌が懸濁したままでいる間に、形成要素の沈澱を早めることを可能にすることによって、赤血球（RBC）、白血球（ＷＢＣ）、上皮細胞（epithelial cells）、円柱（casts）、結晶（crystals）のような形成要素から細菌を分離する簡単な方法を提供する。尿サンプル中の若干の人為的な要素は、毎分およそ１００μｍの標準的な形成要素の沈澱プロファイルを示さない。これらの要素の最も一般的なものは、脂質（lipids）と破片である。

脂質の評価は、それらが細菌と同じ電気的な表面電荷を持っておらず、電磁気的に細菌と相互に作用しないことを示唆する。脂質の密度は尿サンプルより低く、脂質はサンプルの上部に浮く傾向がある。サンプル容器を充填することは、流体全体に脂質をランダムに分散させ、その後時間とともに脂質が上昇する。脂質はまた、およそ細菌のサイズからもっと大きいサイズまで、サイズを大きく変える。脂質濃度が高いとき、おそらく、細菌のためのサンプルを評価するために選択される領域（最も深いゾーンのサンプル容器の底から６５０μｍのような）において、脂質（サイズで細菌に類似しているものを含めて）の有意なレベルがある。脂質と細菌の間の相互作用はついで、細菌が見いだされるであろうサンプル容器の最も上の深さで、最も高いレベルの相互作用を持つ。図１５における画像は流体バルク中で細菌なしで脂質を含む、代表的なサンプルを示す。

破片は、脂質と同様に、破片がより高い密度のゆえに沈澱するであろうけれども、広くさまざまなサイズを持つ。浮力と重力が類似しているが方向においては反対の大きさを持つから、破片の形状および小さいサイズの範囲は、非常に長い沈澱時間を結果的にもたらす。このことは、主としてランダムに分散した破片のプロファイル（破片は荷電されない）を結果的に生じ、それは細菌（細菌は電気力によって制御されるが、同じように、それが最終的な静止位置を規定する）より速くあるいは遅く落ちる可能性を持つ。結局、破片はランダムに分布し、沈澱しまたは浮上する。図１６は、流体バルク中で細菌なしの、代表的な破片含有サンプルを示す。

脂質および細菌は、各々が、それらが浮くか（脂質）、ランダムに分散される（破片）または沈む（破片）かどうかに依存して、流体深さを通して異なる分布を持つ。流体深さを通しての分布は、ついで、自動整列のモデルに従う、細菌からの異なる情報を生成する。異なる深さの評価だけでなく、異なる時間における点が、これらの干渉物質から細菌を区別するために必要なデータを提供する。図１７Ａおよび図１７Ｂは、時間ゼロ（サンプル容器がちょうど充填されたとき）（図１７Ａ）での４つの粒子のタイプの各々を表わす理論的グラフのオーバレイ（overlay）を示し、若干の沈澱が起こった後（図１７Ｂ）は、潜在的な深さの性能を実証する。時間と深さのデータが異なる要素を分離する。

この発明に従った第１の「オブジェクトカウント」のアルゴリズムアプローチが、尿サンプル中において非細菌から細菌を区別するのを助けるために使われ得て、以下に説明する。細菌ゾーンにおける要素の存在を考慮する。画像内に分布する小さいドット（細菌あるいは他の小さい人工物要素を表わす）を可視化することはかなり容易である。決定が流体バルク中で捕捉されるので、合焦面はなく、各々の画像は、画像の各々の部分において（軸オフ角から独立している）、合焦および非合焦要素を持つ。直接的な決定（straight forward measurement）が、画像を閾値処理して背景からオブジェクトを識別することによってなされる（たとえば、各々のピクセルをグレースケール値に変えて、そして次に或る閾値以上のピクセルを白として選択し、残りのピクセルを黒とする）。個別の白領域のすべてをカウントすること（各々の繋がっている白いピクセルが１つの要素と考えられる）が、オブジェクトのカウントをもたらす。生の画像および関連の閾値処理された画像が、それぞれ、図１８Ａおよび図１８Ｂに示される。

オブジェクトカウントは、画像内の粒子の濃度を決定するために使われ得る量的な値を提供する。純粋な細菌サンプルのために、このカウントは、直接、細菌濃度と相関する。他の粒子が細菌と同じ面に存在するとき、オブジェクトカウントは細菌カウントより大きい。無菌で小さい粒子を有するサンプルについて、懸念は（報告されるべきではない場合）、細菌濃度は分析からもたらされるということである。図１７Ｂから、もしサンプルが適切な時間期間の間沈澱が許容されるなら、その濃度が細菌だけである「スイートスポット（sweet spot）」ゾーンがあるかもしれないことがわかる。

この発明に従った第２の「密度」アルゴリズムアプローチは、尿サンプル中において非細菌から細菌を区別するのを助けるために使われ得て、以下に説明する。密度分析が直接オブジェクトカウント分析から続く。相違は、密度評価がすべての黒いピクセルを含んでいる背景に対する閾値処理された要素（白いピクセル）の比率を決定することである（図１８Ｂ参照）。この分析は、カウントと同様、細菌のサイズを考慮に入れる。図１８Ａにおける画像は、図１８Ｂに示されるように、粒子を背景から隔離する閾値処理のような後処理ツールを行なうことによって、密度を決定するために使われ得る。密度が濃度の基準を提供する可能性がある。破片と脂質がさまざまなサイズを持つであろうことを知っていて、画像に存在するそれらを有する影響は、オブジェクトカウントを増やさないで密度を増やす。これらの２つの決定から数量化された値を比較することによって、非細菌の要素が閾値処理された画像の一部であるかどうか識別を開始され得る。

この発明に従った第３の「ピクセル間隔」アルゴリズムアプローチが、尿サンプル中において非細菌から細菌を区別するのを助けるために使われ得て、以下に説明する。ピクセル間隔が流体バルク中における粒子の間の平均距離を決定するように意図される。もし、自動整列の理論に粒子が従うなら、濃度が増加するにつれて、粒子の間の間隔はより小さくなる。距離の標準偏差はまた、自動整列のプロセスが起こったかどうか、あるいは画像中に整列しない他の非細菌の粒子があるかどうかを示す。一般的なアプローチは、図１８Ｂからと同様の閾値処理した画像を探し出し、ついで、粒子間（すなわち、最も近い隣の粒子との）の最短のユークリッド距離を計算することである。図１９Ａおよび図１９Ｂに表わしたように、ピクセル間隔はこれらの距離の平均と標準偏差を計算することによって、決定される。図１９Ｂに示すように、閾値処理した画像は、隣り合う細菌間に後処理線２０を加入することによって修正されていて、その線の長さが、細菌と最も近い隣の細菌との間の間隔を表わす。

理論的なモデルが、細菌のサイズと電荷、サンプル容器の寸法および整列許容時間に基づいてピクセル間隔を記述するために開発され得る。このモデルは経験的なデータを通して確認される。非破片（non-debris）の影響はピクセル間隔モデルの混乱であり、人為的に平均間隔を縮小して、そして標準偏差を拡大するということである。

この発明に従った第４の「ひずみ度」アルゴリズムアプローチが尿サンプル中において非細菌から細菌を区別するのを助けるために使われるかもしれず、以下に説明する。ひずみ度はデータセットの正規性の決定である。図２０Ａおよび図２０Ｂに示すように、正ひずみは、データが右に延びたテイル（tail）を持つことを示し、負ひずみは左に延びたテイルを示す。ひずみ度は、任意の画像のために計算でき、もし、グレースケール値の分布がガウス曲線に従うなら、それはゼロに近いひずみ度を持つ。もし過度のテイルがあるなら、ひずみ度値がそのことを示す。

細菌が通常流体バルクを通して分散されるので、ひずみ度はゼロに近いと期待できる。サンプル容器の底に位置されるとき（沈澱したオブジェクトのために）、合焦バンドおよび非合焦バンドを持つように意図されている軸外画像でさえ、ランダムに分散された粒子を有する流体バルク中の画像は、ゼロに近いひずみ度を持つ。粒子が沈澱するにつれて、それらは、サンプル容器の底の近くでひずみ度を実証し、バルク中では高くは表示されない。同様に、浮くオブジェクトが上部領域のひずみ度を実証し、サンプル容器中では低くは表示されない。

細菌が脂質や破片のような干渉する人工物を有して存在しているとき、上述したこの発明の４つのアルゴリズムは長所と短所を持つ。統合された態様において各々のアプローチの出力の評価が、細菌を数量化して、そして人工物によってその値の潜在的な影響を決定するのに役立つ追加情報を提供する。図１７Ａに示す理論的なモデルを考慮する。図１７Ａで示すように、初めにサンプル中の粒子のすべてが流体バルクを通してランダムに分散される。時間が経過すると、高密度のオブジェクトがいくらかの速度で沈澱し、低密度の粒子がいくらかの速度で浮き、そして細菌が自動整列したグリッド中へ沈澱する。図１７Ｂが、細菌の非細菌からの完全な分離が可能なサンプル容器内に時間と空間があることを実証する。

図１７Ａで示す「充填時間」のグラフと図１７Ｂで示す「沈澱時間」のグラフの間の３番目の時点が、図２１に示すグラフで描かれ、そこでは粒子分離は始まったが完了はしていない。

細菌がすべての説明した３つのタイプの代わりに、汚染物質のサブセットと重なる領域があることが、図１７と図２１から明らかである。この垂直分離は各々の深さで要素に対してこの発明の４つのアルゴリズムアプローチの各々からの影響を決定するために使われ得る。サンプル容器を通して垂直スキャンを行なうことによって、深さの各々のレベルでの要素の影響は濃度を決定するために純粋な細菌滴定と比較することができる。いくつかの深さで評価することによって、異なった人工物要素をデータから抽出することができる。加えて、サンプル容器を充填した後に、異なる時間で垂直のスキャンを行なうことはまた、沈澱／浮上の速度を示す時間的な分離を提供する。これらの入力の全ては、濃度値に影響を与える汚染についての濃度および速度の可能性を決定するために統合され得る。

図２２Ａ（桿菌）および図２２Ｂ（球菌）が示すデータを考慮すると、そこでは、サンプル容器、たとえば、図２４‐図２８に示すような消耗可能（使い捨ての）素子中での標準的な細菌スキャンおよび先に説明したような「ピクセル間隔」の論理での後処理を用いて、細菌の滴定が評価される。平均と標準偏差両方のための曲線は、代表的な井戸適合べき級数曲線（well-fit power series curve）とともに、図２２Ａおよび図２２Ｂにおいてそれぞれ示される。この特定のサンプル容器は各々のゾーンで落ちる細菌ゾーン深さを有するので、各々のゾーンのための分析の深さは異なる（たとえば、容器の底からの６００、４００および２００μｍ）。サンプルが純粋な細菌であり、そして論理に悪影響を及ぼすサンプル中に存在する干渉人工物がないので、曲線はゾーン毎に重なる。自動整列プロセスが進行し、かつシステムが異なる深さで評価するとき（潜在的に変化する理由は、１０^６／ｍｌの濃度で示される）、実現され得る潜在的な時間依存曲線がある。

図２２Ａおよび図２２Ｂで示す校正曲線が与えられると、細菌濃度は「ピクセル間隔」の平均計算に基づく。もし、干渉する要因がなければ、計算は完了する。もし、潜在的な干渉要因があれば、先に説明した残りのアルゴリズムからの同様の曲線の統合が、後続時間での再分析とともに、増加した精度を達成するための多くの情報を提供する。

４つのアルゴリズムの一緒の統合を視覚化する教育的な（instructional）方法（この例は時間的な影響がないと仮定している）が図２３Ａおよび図２３Ｂで示される。この方法は、純粋な細菌の３つの濃度でのアルゴリズム出力の各々についての参照曲線を示す。マーカーを持った暗い線Ａは細菌を含まなかった固有のサンプルを表わす。マーカーを持ったグレーの線Ｂは１０^８球菌／ｍｌが混ぜられた固有のサンプルを表わす。脂質と細菌の両方の場合、固有のサンプルは参照曲線Ｃ、ＤおよびＥから有意な相違を示す。１０^８球菌／ｍｌを混ぜると、曲線Ｂは、対応する参照曲線Ｃにより大きい類似性を示す。もっと多くの明晰性、オブジェクトカウントおよびピクセル間隔の評価を加えることは、両方が自然な参照に非常に近いとき、それらが細菌濃度の良好な表示であることを示す。オブジェクトの密度とひずみ度が、混ぜられた細菌に関連する人工物の影響を示す。この表現は、統合モデルがどのようにこのタイプのデータから作られたかを示している。

量的なモデルが、好ましくは６つの参照データ点、充填からの時間、細菌ゾーンにおける垂直位置、オブジェクトカウント、ピクセル間隔、オブジェクト密度およびひずみ度から、作られ得る。

４つのアルゴリズムの各々について平均値、中央値および標準偏差を評価することが可能であることに留意すべきである。各々の時間と垂直位置（細菌ゾーンに依存する）のために、校正曲線が、平均値、中間値および標準偏差毎に、（一般に、べき級数適合であると期待される）純粋な細菌滴定のために作られ得る。これらの１２の値は、決定からのアルゴリズム論理入力である。適切な深さと時点のための適合モデルは、ついで、サンプル応答に基づいて１２のアルゴリズムの各々から濃度推定を評価するために使われる。１２のアルゴリズムの統合は、サンプルが細菌を含むかどうか特徴付けるためにファジー論理曲線を組み込んだエキスパートシステムによって実行することができる。細菌を含むと決定されるサンプルは、次いで、参照曲線から濃度を予測する。実際の濃度は、特に、人工物がより大きい影響を与える低濃度細菌のためには、２番目のエキスパートファジー論理システムを必要とするかもしれない。このアプローチを使い、そして充填からの時間を考えると、検出の下限は１０^６球菌／ｍｌ未満に低減することが可能である。

前述の説明から明白であるように、この発明の方法は、流体バルク中で細菌を評価することができ、そして細菌の特性を非細菌の「破片」から細菌を区別する手段として使用する。それは、特に尿媒体において、細菌を検出するための高感度でかつ選択的な方法であって、液体サンプルで細菌の濃度を決定するために使用され得る。さらに、この発明の方法の１つの形態に従って、細菌をカウントしようと試みる代わりに、細菌の間の平均間隔が細菌濃度を推定するために計測される。

図２‐図１０で示したこの発明の容器の種々の形態が、流体サンプル中で細菌を検出して、そして数量化して、そして細菌を非細菌の「破片」から分離する方法を実行する助けとなる。

この発明の図示した実施例が添付の図面を参照して説明されたが、この発明がこれらの正確な実施例に限定されるものではなく、この発明の範囲あるいは精神から逸脱することなく、当業者によって、さまざまな他の変更や修正が行われ得るということを理解すべきである。

２ …部材
４ …ハンドル部分
６ …読取り領域
８ …入口ポート
１０ …井戸
１２ …細菌読取り領域
２２ …第１セクション
２４ …第２セクション
２６ …第３セクション

Claims (9)

1. 液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための方法であって、
   前記液体サンプル中の細菌が自動整列するのを許容する所定時間の経過の後、前記液体サンプルの体積において、所定の視野でかつ所定の焦点面深さまたは角度で、前記液体サンプルの前記体積を通して、少なくとも１つの光学セクションを撮影するステップ、
   前記少なくとも１つの光学セクション内に存在する細菌の数をカウントするステップ、
   前記液体サンプルの体積がその中で分割され得る光学セクションの数を計算し、それによって可能な光学セクションの合計数を決定するステップ、
   前記少なくとも１つの光学セクション内に存在する細菌の数に前記可能な光学セクションの合計数を乗じ、それによって前記液体サンプルの前記体積内に存在する細菌の合計数の少なくとも近似を決定するステップ、および
   前記液体サンプルの前記体積内に存在する細菌の合計数の前記少なくとも近似に基づいて、液体サンプル内の細菌の濃度を決定するステップを含む、方法。
2. 前記液体サンプル中の細菌が自動整列するのを許容する前記所定時間は、およそ３分からおよそ９０分の間である、請求項１記載の方法。
3. 前記液体サンプル中の細菌が自動整列するのを許容する前記所定時間は、およそ３分からおよそ１０分の間である、請求項１記載の方法。
4. 前記液体サンプルの前記体積を通して撮影される前記少なくとも１つの光学セクションは、前記体積を通る垂直面に関して、およそ０°から９０°の焦点面角度を有する、請求項１記載の方法。
5. 前記液体サンプルの前記体積を通して撮影される前記少なくとも１つの光学セクションは、前記体積を通る垂直面に関して、およそ０°の焦点面角度を有する、請求項１記載の方法。
6. 前記液体サンプルの前記体積を通して撮影される前記少なくとも１つの光学セクションは、前記体積を通る垂直面に関して、およそ９０°の焦点面角度を有する、請求項１記載の方法。
7. 前記光学セクションは、前記液体サンプルの前記体積の底の上、およそ１００ミクロン、およそ２００ミクロン、およそ４００ミクロン、およそ６００ミクロン、およそ８００ミクロン、およそ１０００ミクロンおよび１２００ミクロンの少なくとも１つの焦点面深さを有する、請求項６記載の方法。
8. 液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための方法であって、
   前記液体サンプル中の細菌が自動整列するのを許容する所定時間の経過の後、前記液体サンプルの体積において、所定の視野でかつ１つまたはそれ以上の所定の焦点面深さまたは角度で、前記液体サンプルの前記体積を通して、複数の光学セクションを撮影するステップ、
   前記複数の光学セクションの各々の光学セクション内に存在する細菌の数をカウントするステップ、
   前記液体サンプルの前記体積を通して撮影された光学セクションの数で前記複数の光学セクションに存在する細菌の合計数を割ることによって、存在する細菌の数の平均を計算し、それによって前記複数の光学セクションの光学セクション内に存在する細菌の平均数を決定するステップ、
   前記液体サンプルの前記体積が分割され得る光学セクションの数を計算し、それによって可能な光学セクションの合計数を計算するステップ、
   前記可能な光学セクションの前記合計数を前記複数の光学セクションの光学セクションに存在する細菌の前記平均数に乗じ、それによって前記液体サンプルの前記体積内の細菌の合計数の少なくとも近似を決定するステップ、および
   前記液体サンプルの前記体積内の細菌の合計数の前記少なくとも近似に基づいて前記液体サンプル内の細菌の濃度を決定するステップを含む、方法。
9. 液体サンプル中の細菌を検出して、その濃度を決定するための方法であって、
   前記液体サンプル中の細菌が自動整列するのを許容する所定時間の経過の後、前記液体サンプルの体積において、所定の視野でかつ所定の焦点面深さまたは角度で、前記液体サンプルの前記体積を通して、少なくとも１つの光学セクションを撮影するステップ、
   前記少なくとも１つの光学セクション内に存在する細菌間の平均間隔を決定し、それによって細菌平均間隔を決定するステップ、
   前記液体サンプルの前記体積によって占拠された３次元領域を計算し、それによって３次元の体積決定領域を決定するステップ、
   前記３次元体積決定領域を細菌間の前記平均間隔で割り、それによって前記液体サンプルの前記体積内の細菌の合計数の少なくとも近似を決定するステップ、および
   前記液体サンプルの前記体積内の細菌の合計数の前記少なくとも近似に基づいて前記液体サンプル内の細菌の濃度を決定するステップを含む、方法。