JP6436777B2

JP6436777B2 - 精神関連疾患の検査方法および検査キット

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Publication number: JP6436777B2
Application number: JP2014543323A
Authority: JP
Inventors: 吉川　武男; 武男吉川; 素子前川; 則夫森; 秀夫松▲崎▼; 中村　和彦; 和彦中村
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Filing date: 2013-10-23
Publication date: 2018-12-12
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Description

本発明は精神関連疾患、特に自閉症スペクトラム障害の検査方法および検査キットに関する。

精神関連疾患である自閉症スペクトラム障害は、病因が不明であるために検査判定および早期発見が困難な場合がある。自閉症スペクトラム障害に対する根治的治療法は確立されていない。そのため患者が社会生活に少しでも良好に適応するために、早期発見にもとづく専門家による可能な限り早期の教育的介入（これを療育という）が、非常に重要である。すなわち、療育の開始時期は早ければ早いほど効果的とされている。しかしながら、自閉症スペクトラム障害患者に対する、客観的かつ生物学的な検査判定基準が存在しない。したがって、現状として自閉症診断は医師が小児患者の行動および症状のみに基づいて行わなければならず、自閉症スペクトラム障害患者の早期確定診断および発見が非常に困難な場合が多い。

ところで、自閉症スペクトラム障害発症のメカニズムに関して、脂質代謝異常が関与する可能性が示唆されている。例えば、常染色体劣性遺伝性疾患として知られるSmith-Lemli-Opitz症候群では、７−デヒドロコレステロール還元酵素の欠損に起因するコレステロール低値および７−デヒドロコレステロール値の上昇が起こるが、この疾患の患者の約半数が自閉性障害を合併することが知られている（非特許文献１）。また、７−デヒドロコレステロール還元酵素を欠損させたマウスでは、ヒト自閉症スペクトラム障害患者と同様にセロトニン伝達系の障害が認められること（非特許文献２）、および自閉症スペクトラム障害患者の場合、血漿または赤血球膜の脂肪酸量に変化が認められること（非特許文献３）、などの報告から、自閉症スペクトラム障害の病態に脂質が関与する可能性が示唆されている。

Tierney et al., Am. J. Med. Genet. 98,, pp.191-200, 2001 Waage-Baudet et al., Int J Dev Neurosci. Dec;21(8) :pp.451-459. 2003 Bell et al.,Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. Jul-Aug;63(1-2):pp.21-25, 2000 Sliwinski et al., Neuro Endocrinol Lett. Aug;27(4):pp.465-471, 2006 Vancassel et al., Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. Jul;65(1):pp.1-7, 2001 Wiest et al., Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. Apr;80(4):221-227, 2009 Sikora et al., Am. J. Med. Genet. 140A: pp.1511-1518, 2006

コレステロールおよび脂肪酸等の、脂質および脂質代謝産物そのものは疾患特異性が低いと予想されるため、自閉症スペクトラム障害の分子マーカーとして用いることは困難である。

本願発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、新たな分子マーカーを用いた自閉症スペクトラム障害の検査方法および検査キットを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰファミリーのうち、ヒトの生体より調製した試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、およびＦＡＢＰ７の量、または当該試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子、およびＦＡＢＰ７遺伝子の発現量が自閉症スペクトラム障害の分子マーカーとして用いることができることを見出した。
すなわち、本発明は以下の何れかの発明を包含する。
１）自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無を検査する方法であって、ヒトの生体より調製した試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つの量を調べるか、当該試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子のうちの少なくとも一つの発現量を調べる検査工程を含む、検査方法。
２）自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無を検査する検査キットであって、ヒトの生体より調製した試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つ、または当該試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子の発現産物、ＦＡＢＰ４遺伝子の発現産物、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現産物およびＦＡＢＰ７遺伝子の発現産物の少なくとも一つを検出するための核酸プローブ、核酸プライマー、核酸アプタマー、抗体またはペプチドプローブを含む、検査キット。

本発明は、自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無を検査する検査方法および検査キットを提供するという効果を奏する。

本発明の実施例１における各年齢群の血清中のＦＡＢＰ４濃度を示すグラフ（上）、ならびに自閉症スペクトラム障害児童群および対照群について各年齢群の人数を示す表（下）である。本発明の実施例１における６〜７歳の年齢群の血清中のＦＡＢＰ４濃度の分布を示す分布図である。本発明の実施例２における各年齢群の血清中のＦＡＢＰ４濃度を示すグラフ（上の図）、ならびに自閉症スペクトラム障害児童群および健常対照群について各年齢群の人数を示す表（下の表）である。本発明の実施例２における４〜６歳の年齢群および７〜８歳の年齢群のそれぞれにおける血清中のＦＡＢＰ４濃度の分布を示す分布図（上の図）、ならびに４〜６歳の年齢群および７〜８歳の年齢群のそれぞれにおける感度、特異度、陽性的中率、および陰性的中率を計算した表（下の表）である。

以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。

〔１．検査方法〕
本発明に係る検査方法は、自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無を検査する方法であって、ヒトの生体より調製した試料（以下「生体試料」と称する場合がある）における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３（fatty acid binding protein3:ＦＡＢＰ３と称する場合がある）、ＦＡＢＰ４（fatty acid binding protein4:ＦＡＢＰ４と称する場合がある）、ＦＡＢＰ５（fatty acid binding protein5:ＦＡＢＰ５と称する場合がある）およびＦＡＢＰ７（fatty acid binding protein7:ＦＡＢＰ７と称する場合がある）のうちの少なくとも一つの量を調べるか、当該試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子のうちの少なくとも一つの発現量を調べる検査工程を含む方法である。

＜自閉症スペクトラム障害＞
本明細書中の「自閉症スペクトラム障害」としては、具体的には広汎性発達障害（ＰＤＤ）、自閉症、およびアスペルガー症候群等が挙げられる。症状として、コミュニケーションの障害、言語発達の障害、こだわりや繰り返し行動および対人関係成立の障害等を呈する。

＜検査＞
本明細書中の「診断する」または「診断」とは、医師によってなされる、患者の徴候および症状に基づく疾患または病態の同定を指す。一方、本明細書中の「検査する」または「検査」とは、医師による同定（診断）を必須としない、検査対象のヒト（「被験者」と称する場合もある）における、自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無の検査を指す。本発明の検査方法によって得られた検査結果は、医師によってなされる診断の一材料になりうる。また、例えば、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰに対し親和性の強い脂肪酸を含む化合物が見出され、さらに、当該化合物をヒトへ投与することが、補充療法につながる場合、本発明の検査は重要な情報を提供し得る。なお、自閉症スペクトラム障害の素因の有無を検査するとは、自閉症スペクトラム障害を既に発症しているか否かとはかかわり無く、将来的に自閉症スペクトラム障害を発症する可能性を検査することも含む概念である。一方、自閉症スペクトラム障害の発症の有無を検査するとは、自閉症スペクトラム障害を発症しているか否かについて検査することを指す。

＜被験者＞
被験者の年齢は低いほど好ましく、例えば血中のＦＡＢＰ４の量を指標とする場合には８歳以下であることが好ましく、７歳以下であることがより好ましく、６歳以下であることがさらに好ましい。より年齢が低い時期に検査を受けることで、自閉症スペクトラム障害の素因を有する、または当該疾患を発症していると早期に判定された被験者は、早期から療育を受けることができる。

＜生体試料＞
生体試料は、被験者から採取される。生体試料の種類としては、特に限定されず、被験者のタンパク質および核酸（遺伝子発現産物としてのｍＲＮＡ）の少なくとも一方を含んでいればよい。生体試料としては、例えば、細胞試料、組織試料、体液試料が挙げられ、中でも体液試料が好ましい。体液試料としては、血液試料、リンパ液試料、髄液試料等が挙げられるが、血液試料およびリンパ液試料が好ましく、血液試料のうち、特に末梢血試料および臍帯血試料が好ましい。末梢血試料は、例えば指先への穿刺等によって容易に採取が可能であるから被験者の負担が少なく、加えて、本発明の検査方法の対象となる分子マーカーを充分に含んでいる。臍帯血試料は出生時に臍帯から容易に採取が可能であり、超早期診断が可能であるという利点を有している。

また、必要に応じて、生体試料は、対照用の試料とするために自閉症スペクトラム障害を有さない健常者からも採取される。対照用の試料は、被験者のものと同種（同じ部位から採取したもの）であることが好ましい。なお、本発明の検査方法を行うに際して予め対照用のデータが準備されている場合には、健常者からの生体試料の採取は行わなくてよい。

採取された生体試料は、必要に応じてタンパク質または核酸を抽出する操作を行ったり、不要な成分を除去する操作を行ってから、検査に供してもよい。例えば、血液試料を用いる場合は、採取した血液から調製した血清または血漿を検査に用いることが好ましい。

また、得られた生体試料は、必要に応じて凍結保存等の、生体試料の種類に適した方法で保存してもよい。生体試料は、保存することにより所望の時期に検査方法の対象となる分子マーカーを測定することができる。なお、保存の際には、採取したままの状態の試料を保存してもよく、また採取した後に調製した試料（例えば血清または血漿）を保存してもよい。

＜検査工程＞
本発明の検査方法は、以下のａ）またはｂ）に示す検査工程を含む。
工程ａ）上記生体試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つの量を調べる、
工程ｂ）上記生体試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子のうちの少なくとも一つの発現量を調べる。

上記工程ａ）または工程ｂ）のいずれを用いるかは、生体試料の種類または被験者の種類（年齢、検査すべき疾患）などの条件に基づき選択されるが、工程ａ）が好ましい。なお、工程ａ）の場合はＦＡＢＰ４の量を調べることが好ましく、工程ｂ）の場合はＦＡＢＰ４遺伝子の発現量を調べることが好ましい。

工程ａ）
工程ａ）は、上記生体試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つのタンパク質の量、より具体的には、生体試料の単位量あたりに含まれるタンパク質の量（例えば、タンパク質の濃度）を測定する工程である。但し、生体試料の単位量あたりに含まれるタンパク質の量を測定するという概念には定量的測定および定性的測定の両方が含まれ、濃度測定の他、対照と比較可能な形式でタンパク質の量を提示することが含まれる。より具体的には、例えば、検量線等を用いて濃度換算する以前の、取得した時点でのデータ比較、またはタンパク質の量が、ある一定の閾値を超えているか否かを示す形式での結果の提示等も含まれる。

ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つのタンパク質の量を測定する方法は特に限定されないが、例えば、ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５またはＦＡＢＰ７に対して特異的な抗体を用いた免疫学的な手法を用いた方法、液体カラムクロマトグラフィーおよび質量分析法などが挙げられる。抗体を用いた方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法、定量ウェスタンブロッティング法、および免疫沈降（Immunoprecipitation）法などが挙げられ、ＥＬＩＳＡ法を用いることが好ましい。ＥＬＩＳＡ法の種類としては、特に限定されないが、いわゆる抗原測定系（生物試料中に含まれる抗原量の測定）である、直接吸着法によるＥＬＩＳＡ、競合法によるＥＬＩＳＡ、サンドイッチ法によるＥＬＩＳＡ、およびマイクロ流路式またはマイクロビーズなどを利用した、微量試料の測定に特化したＥＬＩＳＡ等が挙げられる。

ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５またはＦＡＢＰ７特異的な抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。例えば、ヒトのＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のアミノ酸配列はＮＣＢＩ等の公共データベースより入手可能である。例えばＮＣＢＩのデータベースにおいて、ＦＡＢＰ４の登録番号はＣＡＧ３３１８４／ＮＰ＿００１４３３である。ＦＡＢＰ４の一例は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有している。以上の情報に基づけば、当業者は容易にＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７特異的な抗体を作製するための抗原として適切なアミノ酸配列を決定することができる。

本発明において「抗体」とは、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラス、ならびに抗体の機能的断片を含む形態であることを意図している。当該抗体はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれの天然型抗体も含む概念であり、その他に、遺伝子組換え技術を用いて製造される抗体、ならびに当該抗体の機能的断片を含む。「抗体の機能的断片」とは、前述の抗体の一部分の領域を有し、かつ抗原結合能を有しているもの（結合性断片と同義）を指す。天然型抗体は、特に限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ラクダ、ラマ、ウシ、ニワトリ、サメ、および魚を含む、あらゆる生物種に由来し得る。遺伝子組換え技術を用いて製造される抗体としては、特に限定はされないが、天然型抗体を遺伝子改変して得られるヒト化抗体および霊長類化抗体などのキメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、変異導入抗体およびグラフト結合抗体（例えば、他のタンパク質および放射性標識などがコンジュゲートまたは融合している抗体）が挙げられ、既に遺伝子組換え技術を用いて製造された抗体に対して、上述のように天然型抗体を遺伝子改変する場合と同様の改変を施した抗体も含まれる。また、抗体の機能的断片としては、具体的には例えばＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulphide stabilized Fv）およびｄＡｂ（single domain antibody)等が挙げられる(George et al, Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996)。

さらに、本発明において結合性断片は、対象とするタンパク質に対して反応性を維持する範囲において変異導入された抗体断片も結合性断片の概念として含んでいる。前述の変異導入は、当業者によって適宜選択される、遺伝子改変技術等の公知の技術を用いて行われる。

工程ｂ）
工程ｂ）は、上記生体試料を用いて、当該試料中のＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子のうちの少なくとも一つの発現量を測定する工程である。なお、ＦＡＢＰ３遺伝子とはＦＡＢＰ３をコードしている核酸の総称であり、ＦＡＢＰ４遺伝子とはＦＡＢＰ４をコードしている核酸の総称であり、ＦＡＢＰ５遺伝子とはＦＡＢＰ５をコードしている核酸の総称であり、ＦＡＢＰ７遺伝子とはＦＡＢＰ７をコードしている核酸の総称である。

ＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子のうちの少なくとも一つの発現量の測定方法としては、特に限定されないが、ＰＣＲ法等の核酸増幅技術を用いて所望の核酸（例えば、転写産物たるｍＲＮＡ）を増幅する手法を含む方法であってもよい。核酸増幅技術を用いた方法としては、例えば、定量ＲＴ‐ＰＣＲが挙げられ、直接ｍＲＮＡを検出する方法としてはノーザンブロット法等が挙げられる。あるいは、マイクロアレイ等の核酸チップを用いた、遺伝子の発現量の測定方法等であってもよい。なお、「遺伝子の発現量を測定する」とは、「遺伝子の発現産物（後述する）の量（濃度等）を測定する」と交換可能に用いることができる。

なお、遺伝子の発現量を測定する際に、生体試料に含まれるｍＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡを調製してもよい。ｍＲＮＡとしてのＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子の増幅は、ＮＣＢＩ等の公共データベースより入手可能な塩基配列情報に基づいて行うことができる。例えば、ＮＣＢＩのデータベースにおいてＦＡＢＰ４遺伝子の登録番号はＮＭ＿００１４４２である。ＦＡＢＰ４遺伝子の一例は配列番号２に示す塩基配列を有している。以上の情報に基づけば、当業者は容易にＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子またはＦＡＢＰ７遺伝子を増幅するための適切なプライマーを設計することができる。

＜判定＞
自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無の判定は、上述の工程ａ）または工程ｂ）に示す検査工程により得られた、ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つのタンパク質量、またはＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子のうちの少なくとも一つの発現量を、被験者と対照とで比較することによって行う。
判定の一例では、対照と比較して被験者の生体試料におけるＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５またはＦＡＢＰ７（タンパク質量でも遺伝子の発現量であってもよい）のうちの少なくとも一つの量が有意に低い場合、被験者は、自閉症スペクトラム障害の素因を有しているまたは発症していると判定される。なお、量が有意に低い（少ない）とは、定量的測定による結果であっても定性的測定による結果であってもよく、具体的な数値の比較はもちろん、相対的な量の比較（実際に量を算出する必要は無く、ある基準より高いか低いかを判断する）も含む概念である。

対照試料の上記検査は、被験者の試料の検査と同時に行われてもよく、また別々に行われてもよい。すなわち、被験者の数値と比較される対照試料の数値は、被験者の試料が検査されるときとは異なるときに行われた検査で得られた値であってもよい。また、対照試料の検査は、被験者の検査を行う者自身が行う必要は無く、例えば、既に取得されデータベース等に蓄積されている対照試料の検査値を閾値として用いることもできる。

判定に用いられる対照試料の数値については、健常者個人の試料の数値を直接利用してもよく、一定の人数の健常者の試料の数値を母集団としたときに得られる平均値を利用してもよい。また、カットオフ値をあらかじめ設定しておき、被験者の数値とこのカットオフ値とを比較してもよい。例えば、被験者の生体試料におけるＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つのタンパク質量、または当該試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子のうちの少なくとも一つの発現量がカットオフ値以上である場合には、当該被験者の自閉症スペクトラム障害の発症の可能性が低いと判定することができる。また、被験者より調製した試料におけるＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つのタンパク質量、または当該試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子の少なくとも一つの発現量がカットオフ値より低い場合には、当該被験者の自閉症スペクトラム障害の発症の可能性および危険性を有すると判定することができる。

「カットオフ値」とは、その値を基準として疾患の素因の有無または発症の有無を判定をした場合に、診断感度（有病正診率）および診断特異度（無病正診率）の両方が十分に高い値を指す。例えば、自閉症スペクトラム障害を発症している個体において高い陽性率を示し、かつ、自閉症スペクトラム障害を発症していない個体で高い陰性率を示す値をカットオフ値として設定することができる。

ここで「診断感度」とは、特定の疾患の素因を有している、または特定の疾患を発症している集団に対して検査を行ったときの陽性（異常値）を示す割合（真の陽性の割合）を指す。また、「診断特異度」とは、特定の疾患を罹患していない集団に対して検査を行ったときの陰性（正常値）を示す割合（真の陰性の割合）を指す。また、「陽性的中率」は、検査において陽性を示した被験者のうち、実際に疾患を罹患している個体の割合をさし、陰性的中率は、検査において陰性を示した被験者のうち、実際に疾患を罹患していない個体の割合を意味している。

カットオフ値の算出方法は、当該技術分野において公知のものを用いることができる。例えば、自閉症スペクトラム障害を発症している個体および自閉症スペクトラム障害を発症していない個体より調製した試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つのタンパク質量、または当該試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子のうちの少なくとも一つの発現量を算出し、算出された値における診断感度および診断特異度を求める。以上により得られた値に基づき、市販の好適な解析ソフトを使用してＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を作成する。続いて、当該曲線から、診断感度および診断特異度が可能な限り１００％に近いときの値を求めて、その値をカットオフ値とすることができる。また、例えば多数の健常者より調製した試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つタンパクの、または当該試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子の少なくとも一つの発現量の「平均値＋２標準偏差」をカットオフ値とすることも好ましく、この値を用いれば良好な感度および特異性で自閉症スペクトラム障害を発症している、または発症の危険性があると判定することが可能となる。

例えば、実施例１に示す例では、複数の対照試料から得られた数値（タンパク質濃度）の平均値或いはそれよりやや低い値（すなわち、１５ｎｇ／ｍｌ〜１６ｎｇ／ｍｌ）をカットオフ値とすれば、全ての自閉症スペクトラム障害の発症の危険性、すなわち素因の有無、または発症の有無を検出できることを示す。カットオフ値は一定の年齢ごとにデータを分類して、それぞれの年齢におけるROC曲線を作成して決定しても良い。

〔２．検査キット〕
また、本発明は、自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無を検査する検査キットであって、ヒトの生体より調製した試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つ、または当該試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子の発現産物、ＦＡＢＰ４遺伝子の発現産物、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現産物およびＦＡＢＰ７遺伝子の発現産物の少なくとも一つを検出するための核酸プローブ、核酸プライマー、核酸アプタマー、抗体またはペプチドプローブを含む、検査キットを提供する。

上記発現産物とは、ＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子またはＦＡＢＰ７遺伝子から転写されたｍＲＮＡを指す。本発明の検査キットは、上記ｍＲＮＡが逆転写されてなるｃＤＮＡの形態として検出するものも含む。

また、上記核酸プローブとは、上記発現産物の何れかと特異的に結合する核酸プローブを指し、より具体的にはTaqManプローブ、Invadorプローブ等が挙げられる。上記核酸プライマーとは、上記発現産物としてのｍＲＮＡまたはこれを逆転写したｃＤＮＡを特異的に増幅することができる核酸プライマーを指し、より具体的にはＲＴ‐ＰＣＲ法等の核酸増幅法で用いるプライマーが挙げられる。また、上記核酸アプタマーとは、生体試料中に含まれる脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５またはＦＡＢＰ７のいずれかと特異的に結合する核酸で構成された核酸構築物を指す。

ペプチドプローブとは、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５またはＦＡＢＰ７のいずれかと特異的に結合するペプチド性のプローブを指す。具体的には例えば、ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５またはＦＡＢＰ７と特異的に結合するペプチド配列が挙げられる。

キットに含まれる核酸プローブ、核酸プライマーおよび核酸アプタマーは、天然の核酸の他に、非天然型核酸（ＰＮＡ等）を含んで構成されていてもよい。ペプチドプローブも同様に天然アミノ酸の他に、非天然型アミノ酸を含んで構成されていてもよい。

本発明に係る検査キットは、さらに、必要に応じて、ＰＣＲ等の核酸増幅法に用いる各種試薬および器具（ポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、各ｄＮＴＰおよびピペット等）、試料を調製するための各種試薬および器具（試験管、バッファー等）、核酸増幅断片を解析するための各種試薬および器具（電気泳動ゲル材料およびピペット等）、検査キットの使用説明書、測定の時に用いられる対照用となる試料、測定結果を解析するときに用いられる対照用のデータ、等の少なくとも１つを備えていてもよい。なお、検査キットの使用説明書には、上記〔１．検査方法〕の欄で説明した、本発明に係る検査方法の内容が記録されている。

以上のように、本発明の検査方法および検査キットによれば、これまで医師の主観によるものが大きかった自閉症スペクトラム障害の診断が、生物学的基準を導入した検査に基づいて診断することが可能となることから、診断技術の向上が予想される。また早期に診断することが可能となるため、患者に対し、早期の療育を効果的に行うことができる。また、例えば、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰに対し親和性の強い脂肪酸を含む化合物が見出され、さらに、当該化合物をヒトへ投与することが、補充療法につながる場合、本発明の検査は重要な情報を提供し得る。

〔３．自閉症スペクトラム障害の治療薬のスクリーニング等〕
後述する参考例１に示すような、タンパク質ＦＡＢＰ４をコードする領域にストップコドンが生じる遺伝子の変異を有するヒトから作製した人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、例えば、１）自閉症スペクトラム障害の治療薬のスクリーニング用途、２）自閉症スペクトラム障害の治療薬候補の効果を確認するための疾患モデル細胞、３）疾患発症メカニズムおよび病態の解明のための疾患モデル細胞、等として有用である。

〔４．検査方法によって得られた検査結果の利用〕
上記〔１．検査方法〕の欄で説明した検査方法を行うことによって得られた検査結果は、医師による診断を行う際の診断資料の一つとして利用することができる。また、上記〔１．検査方法〕の欄で説明した検査方法を行うことによって、自閉症スペクトラム障害の発症の危険性が有り（すなわち素因が有り）という検査結果が得られた被験者、または自閉症スペクトラム障害の発症が有りという検査結果が得られた被験者については、必要に応じて医師による診断の結果を伴った上で、治療を行うことができる。ここで、治療の一例としては、医師または医師以外の専門家が行う療育を挙げることができる。

〔５．本発明に係る検査方法を実行するためのシステムの一例〕
上述したような本発明に係る検査方法を実行するために用いられる検査システム、および当該検査システムを用いた検査方法もまた、本発明の範囲内である。下記実施形態では、本発明の一実施形態としての検査システムを構成する各部材が、「ＣＰＵなどの演算手段がＲＯＭやＲＡＭなどの記録媒体に格納されたプログラムコードを実行することによって実現される機能ブロックである」場合を例にして説明するが、同様の処理を行うハードウェアによって実現してもよい。また、処理の一部を行うハードウェアと、当該ハードウェアの制御や残余の処理を行うプログラムコードを実行する上記演算手段とを組み合わせて実現することもできる。さらに、上記各部材のうち、ハードウェアとして説明した部材であっても、処理の一部を行うハードウェアと、当該ハードウェアの制御や残余の処理を行うプログラムコードを実行する上記演算手段とを組み合わせて実現することもできる。なお、上記演算手段は、単体であってもよいし、装置内部のバスや種々の通信路を介して接続された複数の演算手段が共同してプログラムコードを実行してもよい。

本発明にかかる検査システムの一例では、その機能ブロックとして、入力受付部１１Ａ、測定部１１、格納部１２、ＣＰＵ１３、および表示部１４を少なくとも備えている。入力受付部１１Ａは、入力を受付けるインターフェースであり、検査システムと外部機器とを接続するインターフェースとして構成されるか、場合によってはキーボードやマウスなどの入力装置として構成される。検査システムの動作条件等は、例えば、入力受付部１１Ａを介して入力する。測定部１１は、１）被験者から採取した前述の生体試料を受入れるための受容部と、２）生体試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つの量を測定するか、生体試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子のうちの少なくとも一つの発現量を測定するためのシグナル値を得る、測定装置とを備えるように構成されている。測定装置の一例は、ＥＬＩＳＡ法に従って、生体試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つの量、好ましくはＦＡＢＰ４の量を測定するためのシグナル値を得る装置である。格納部１２は、測定装置において測定された、上述したＦＡＢＰ３等のバイオマーカーの濃度の測定するためのシグナル値を受容する測定値受容部１２ａを有する。格納部１２には、さらに、自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無の判定のための基準値（カットオフ値）を格納した基準値格納部１２ｂが含まれても良い（例えば、メモリーとして構成される）。ＣＰＵ１３は、上述したＦＡＢＰ３等のバイオマーカーの濃度の測定するためのシグナル値より濃度値を求める演算部１３ａを有する。ＣＰＵ１３には、さらに自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無の判定のための情報を生成する演算部１３ｂ、および演算部１３ｂからの評価情報を受け取って判定を行う判定部１３ｃとしての機能を有している。表示部１４は、演算部１３ａによる演算処理で得られた測定値を表示する機能、または判定部１３ｃによる判定結果を表示する判定結果表示部１４としての機能を有している（例えば、液晶表示装置または印刷装置として構成される）。なお、この機能ブロックは、ＣＰＵ１３が格納部１２に格納されたプログラムを実行し、入出力回路などの周辺回路を制御することによって実現される。

以下、検査システムの一態様として、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４をバイオマーカーの一つとして自閉症スペクトラム障害を評価するシステムを例示し、検査のプロセスについて具体的に説明する。この検査システムでは、ステップ１として、測定部１１の受容部に生体試料をセットし、測定部１１の測定装置を用いて生体試料におけるＦＡＢＰ４の濃度を自動測定する。なお、ＦＡＢＰ４の濃度測定の方法については、例えば、上述の＜検査工程＞欄の説明における工程ａ）および工程ｂ）に詳細に説明の通りである。次いで、ステップ２として、測定値受容部１２ａが、ステップ１で測定したＦＡＢＰ４の濃度の測定値を受容する（格納する）。次いで、ステップ３として、演算部１３ａが、測定値受容部１２ａに格納されたＦＡＢＰ４の濃度を測定するためのシグナル値から演算処理により測定値を得て、基準値格納部１２ｂに格納された基準値（例えば、カットオフ値）とから、自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無を判定するための評価情報を演算部１３ｂで生成する。次いで、ステップ４として、ステップ３で生成した評価情報に基づいて、判定部１３ｃが自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無を判定する。次いで、ステップ５として、判定部１３ｃが生成した、自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無の判定結果が、表示部１４に表示される。なお、評価情報の生成から判定までのステップ（ステップ３〜４）は、例えば、格納部１２内に格納されている評価用のプログラムを動作させることにより実行可能である。評価用のプログラムは、例えば、上述の＜判定＞欄に記載した判定を行う。より具体的には例えば、測定値受容部１２ａに格納されたＦＡＢＰ４の濃度の測定値と、基準値格納部１２ｂに格納されたカットオフ値とを比較し、比較した結果を評価情報として生成する。そして、ＦＡＢＰ４の濃度の測定値がカットオフ値より低い場合には、被験者の自閉症スペクトラム障害の発症の可能性および危険性を有すると判定する。

〔６．本発明に係る具体的な態様の例示〕
本発明は、一例として、以下の何れかの発明を包含する。
１）自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無を検査する方法であって、ヒトの生体より調製した試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つの量を調べるか、当該試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子、ＦＡＢＰ４遺伝子、ＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ７遺伝子のうちの少なくとも一つの発現量を調べる検査工程を含む、検査方法。
２）検査工程において、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４の量、またはＦＡＢＰ４遺伝子の発現量を調べる、１）に記載の検査方法。
３）上記試料が血液由来の試料である、１）または２）に記載の検査方法。
４）対象となる上記タンパク質の量を調べる、１）〜３）のいずれかに記載の検査方法。５）上記ヒトは８歳以下である、１）〜４）のいずれかに記載の検査方法。
６）上記検査工程において、上記試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３の量、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４の量、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ５の量、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ７の量、ＦＡＢＰ３遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、およびＦＡＢＰ７遺伝子の発現量から選択される少なくとも一つが健常者と比較して低いときに、自閉症スペクトラム障害の素因が有るまたは発症している、と判定する、１）〜５）の何れかに記載の検査方法。
７）上記検査工程において、機能ブロックとして少なくとも入力受付部、測定部、格納部、ＣＰＵ、および表示部、を備えている検査システムを用いて自閉症スペクトラム障害の素因が有るまたは発症している、と判定する６）に記載の検査方法。
８）上記自閉症スペクトラム障害は自閉症である、１）〜７）に記載の検査方法。
９）自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無を検査する検査キットであって、ヒトの生体より調製した試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５およびＦＡＢＰ７のうちの少なくとも一つ、または当該試料におけるＦＡＢＰ３遺伝子の発現産物、ＦＡＢＰ４遺伝子の発現産物、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現産物およびＦＡＢＰ７遺伝子の発現産物の少なくとも一つを検出するための核酸プローブ、核酸プライマー、核酸アプタマー、抗体またはペプチドプローブを含む、検査キット。

以下、参考例および実施例に基づき本発明をより詳細に説明する。

〔参考例１〕
自閉症スペクトラム障害の新たな分子マーカーの候補を探索する目的で、自閉症スペクトラム障害の小児のＤＮＡサンプルを用いてＦＡＢＰ４遺伝子上の変異のスクリーニングを行った。その結果、自閉症スペクトラム障害の２６７家系のうち一家系では、タンパク質ＦＡＢＰ４をコードする遺伝子領域のエキソン３に位置する２９４番目のＧがＡに置換している変異があり、その結果ＦＡＢＰ４のアミノ酸配列において９８番目のトリプトファンを指定するコドンがストップコドンに置換されていることを見出した。

〔実施例１〕
（生体試料の調製）
医師により自閉症を発症していると診断されている６歳から１９歳までの男性１１６名を自閉症児童群（Ａｕｔｉｓｍ（ｎａｔｉｖｅ））とし、健常者である５歳から１９歳までの１２７名を定型発達児童群（ｃｏｎｔｒｏｌ、すなわち対照群）として検査を行った。上記の全員を検査の対象者とし、生体試料を調製した。なお、対象者はすべて、薬物などは投与されていない。

上述の対象者から、肘正中皮静脈、橈骨正中皮静脈または手背静脈等に対する末梢穿刺によって末梢血約６ｃｃを採取した。さらに、採取した末梢血を遠心分離機を用いて遠心し、細胞沈降物から血清を分離した。得られた血清は、検査に用いるまで−８０℃で保存した。

（脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４の濃度の測定）
上述の方法で得られた血清中の脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４濃度は、市販のＥＬＩＳＡキット（HUMAN AFABP ENZYME IMMUNOASSAY KIT、SPI bio）を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。測定は、対象者の血清３０μＬを緩衝液（ＥＬＩＳＡキットに付属のEIA buffer）に１０倍希釈したものを試料とし、そして、自閉症児童群および対照群のそれぞれの群について、さらに、４〜５歳、６〜７歳、８〜９歳、１０〜１１歳、１２〜１３歳、１４〜１５歳、１６〜１７歳および１８〜１９歳の年齢群に分け、各年齢群のＦＡＢＰ４タンパク質濃度の平均値（平均濃度と称する）を算出した。さらに、同じ年齢群の自閉症児童群の平均濃度と、対照群の平均濃度とを、各年齢群（Ａｇｅ）同士について比較し、対照群の平均濃度に対し自閉症児童群の平均濃度が有意な差が見られるかどうか検討した。結果を図１の（上）に示した。なお、自閉症児童群および対照群のそれぞれについて各年齢群に属する人数を、図１の（下）に示した。

（測定結果の分析）
図１に示されるように、７歳以下の自閉症児童群の脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４濃度の平均値は、対照群の平均値と比較して有意に低いことを見いだした。６〜７歳の群について、より詳細に解析するために、６〜７歳の年齢群における個人毎の脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４濃度の値について、対照群対自閉症児童群（ＣｏｎｔｒｏｌｖｓＡｕｔｉｓｍ）の分布図を作成し、Mann-Whitney test（マン・ホイットニー検定）を用いた検定を行った。脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４の濃度１６ｎｇ／ｍｌをカットオフ値とし、人数を計数して感度、特異度、陽性的中率、および陰性的中率を計算した。結果を図２に示した。

（分析結果）
図１および図２の結果から明らかなように、６〜７歳の年齢群において、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４の濃度は、対照群と比較して自閉症児童群が著しく低く、有意な差が見られた。したがって、末梢血中の脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４濃度の値が自閉症スペクトラム障害の早期診断マーカーとして有用であると結論付けた。

〔実施例２〕
（生体試料の調製）
医師により自閉症を発症していると診断されている、４歳から１８歳までの１５２名（１５２名中、女性は１１名）の患者を自閉症児童群（Ａｕｔｉｓｍ（ｎａｔｉｖｅ））とし、４歳から１８歳までの１１９名（１１９名中、女性は２７名）の健常者を定型発達児童群（ｃｏｎｔｒｏｌ、すなわち健常対照群）とした以外は、実施例１における方法と同様に行った。

（脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４の濃度の測定）
上述の方法で得られた血清中の脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４濃度は、実施例１における測定方法と同様の測定方法を用いて測定した。測定は、対象者の血清３０μＬを緩衝液（ＥＬＩＳＡキットに付属のEIA buffer）に１０倍希釈したものを試料とし、そして、自閉症児童群および健常対照群のそれぞれの群について、さらに、４〜６歳、７〜８歳、９〜１０歳、１１〜１２歳、１３〜１４歳、１５〜１６歳および１７〜１８歳の年齢群に分け、各年齢群のＦＡＢＰ４タンパク質濃度の平均値（平均濃度と称する）を算出した。さらに、同じ年齢群の自閉症児童群の平均濃度と、健常対照群の平均濃度とを、各年齢群（Ａｇｅ）同士について比較し、健常対照群の平均濃度に対し自閉症児童群の平均濃度が有意な差が見られるかどうか検討した。結果を図３の上の図に示した。なお、自閉症児童群および健常対照群のそれぞれについて各年齢群に属する人数を、図３の下の表に示した。

（測定結果の分析）
図３に示されるように、４〜６歳および７〜８歳の年齢群それぞれにおける脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４濃度の平均値は、健常対照群の平均値と比較して有意に低いことを見いだした。４〜６歳および７〜８歳の群について、より詳細に解析するために、４〜６歳および７〜８歳の年齢群における個人毎の脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４濃度の値について、健常対照群対自閉症児童群（ＣｏｎｔｒｏｌｖｓＡｕｔｉｓｍ）の分布図を作成し、Mann-Whitney test（マン・ホイットニー検定）を用いた検定を行った。ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を作成し、４〜６歳の年齢群では、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４の濃度１６ｎｇ／ｍｌをカットオフ値とし、７〜８歳の年齢群では、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４の濃度１５．７ｎｇ／ｍｌをカットオフ値とした。これらのカットオフ値に基づき、陽性および陰性の人数を計数して感度、特異度、陽性的中率、および陰性的中率を計算した。また、Area Under the CurveおよびYouden indexの値をそれぞれ求めた。結果を図４に示した。なお、図示しないが、４〜６歳および７〜８歳の年齢群のそれぞれにおいて、健常対照群における男女の個体間でＦＡＢＰ４の濃度に差がないことを、Mann-Whitney test（マン・ホイットニー検定）を用いた検定によって確認している。なお、図示はしないが、４〜６歳および７〜８歳のそれぞれの年齢群において、健常対照群と自閉症群との間でＢＭＩ（Body Mass Index: BMI）に差が無いことを、Mann-Whitney test（マン・ホイットニー検定）を用いた検定によって確認している。

（分析結果）
図４の上の図は、４〜６歳の年齢群および７〜８歳の年齢群のそれぞれにおける血清中のＦＡＢＰ４濃度の分布を示す分布図である。

分布図に基づき、自閉症群および健常対象群それぞれの疾患の有無について、陽性および陰性の人数を計数した。その結果、４〜６歳の年齢群において、自閉症群１５名中、１５名全員が陽性であった。これに対し、健常対照群の２６名中、５名が陽性であり、２１名が陰性であった。また、７〜８歳の年齢群において、自閉症群２３名中、２１名が陽性であり、２名が陰性であった。これに対し、健常対照群の１６名中、７名が陽性、９名が陰性であった。図２の下の表は、これらの結果に基づき計算した、感度、特異度、陽性的中率および陰性的中率の表である。

図３および図４の結果から明らかなように、４〜６歳および７〜８歳の年齢群において、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４の濃度は、健常対照群と比較して自閉症児童群が著しく低く、有意な差が見られた。したがって、末梢血中の脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４濃度の値が自閉症スペクトラム障害の早期診断マーカーとして有用であると結論付けた。

実施例１および２の結果により、小児の血清中のＦＡＢＰ４の値が自閉症スペクトラム障害の診断に役立つ診断マーカーになり得ることが実証された。また、８歳以下の年齢の低い小児において特に顕著に対照に対する有意差が見られるという点において、早期の診断において特に優れたマーカーであるといえる。

本発明は上述した各実施形態および各実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態および異なる実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態等についても本発明の技術的範囲に含まれる。

本発明は、自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無の検査に利用することができる。

Claims

自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無を調べるためにヒトの生体より調製した試料を検査する方法であって、
上記ヒトの生体より調製した試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４の量を調べるか、当該試料におけるＦＡＢＰ４遺伝子の発現量を調べる検査工程を含む、検査方法。
上記ヒトは８歳以下である、請求項１に記載の検査方法。
上記検査工程において、上記試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４の量およびＦＡＢＰ４遺伝子の発現量から選択される少なくとも一つが健常者と比較して低いときに、自閉症スペクトラム障害の素因が有るまたは発症していることを示す、請求項１または２に記載の検査方法。
上記自閉症スペクトラム障害は自閉症である、請求項１〜３の何れか一項に記載の検査方法。
自閉症スペクトラム障害の素因の有無または発症の有無を検査する検査キットであって、
ヒトの生体より調製した試料における脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４、または当該試料におけるＦＡＢＰ４遺伝子の発現産物を検出するための核酸プローブ、核酸プライマー、核酸アプタマー、抗体またはペプチドプローブを含む、検査キット。