JP6420301B2 - 熱循環時のスラグ制御 - Google Patents

Description

本発明は、１つ又は複数のスラグ、液滴、断片、ボーラス等（以下「スラグ」）の位置を制御するシステム及び方法に関する。より詳細には、本発明の態様は、マイクロ流体装置内でのスラグの位置を特定及び制御するシステム及び方法に関する。

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１０年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／３７８，５５８号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の開示は引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。本願はまた、２０１０年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／３７８，７００号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の開示は引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。

化学反応、生物学的反応又は他の反応を行う装置は多くの場合、１つ又は複数の反応物を所望の熱プロファイルに供するのに使用される熱制御素子を有する１つ又は複数のマイクロ流体チャネルを特徴とする。そのような装置の一例として、ＤＮＡ分子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うマイクロ流体装置、又は、患者試料でＰＣＲを行い、次いで、ＰＣＲ産物を用いて、高分解能融解分析を行うことによって遺伝子型決定を行う、マイクロ流体分子診断プラットフォームが挙げられる。ＰＣＲ増幅の記載と、ＰＣＲ増幅及び熱融解分析のための熱制御素子を含む１つの考えられ得るマイクロ流体装置の例とが米国特許出願第１２／１６５，０４３号に提示されており、この米国特許出願は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

そのような装置の、ＰＣＲ増幅及び熱融解分析等の多くの用途では、反応物の様々な状態を示すのに１つ又は複数の蛍光色素が用いられる。例えば、Molecular Probes社製の蛍光色素であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ系等の色素、Idaho Technology Inc.社製のＬＣＧｒｅｅｎ色素、又はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いて、反応物の温度、及び他の化学特性を監視することができる。

例えば、反応物のスラグを熱制御素子の近くに正確に配置するとともにスラグの蛍光を正確に読み取ることによる、反応物の正確な制御及び監視には、チャネル内での各スラグの場所、隣接するスラグ間の境界、又はスラグの他の特徴部を求める必要がある場合がある。個々の試料スラグ（すなわち、スラグ含有反応物）の特定を促す１つの方法は、試料スラグと試料スラグとの間に色素が交互にあるスペーシングスラグ又はブランキングスラグを用いることである。例えば、スペーシングスラグ又はブランキングスラグが第１のカラー色素（例えば、Ａｌｅｘａ Ｒｅｄ又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７である、赤色色素等）を含み得る一方で、試料は第２のカラーの挿入色素（例えば、ＬＣＧｒｅｅｎ又はＳｙｂｒ ｇｒｅｅｎである緑色の挿入色素等）を含む。しかしながら、多くの色素は、温度依存性蛍光を有することが知られている。幾つかの例では、これらの色素の蛍光は、ＰＣＲ増幅及び熱融解分析に通常用いられる温度範囲内でも２倍以上変化し得る。色素は一般的に、加熱されるとその蛍光強度を失う傾向があり、冷却されると蛍光強度を得る傾向がある。

色素の蛍光は、スラグが冷却されると増加し、スラグが加熱されると減少するため、温度依存性色素を含むスラグは、熱循環時に動く（例えば、拡張及び収縮）ように見える場合がある。この見かけの動きは、マイクロ流体装置を通るスラグの流量を制御するためにリアルタイムのフィードバック（信号強度閾値法を用いる画像システム等）が望まれる場合、システムが流体制御（例えば、スラグを熱制御素子と熱接触状態に正確に配置する）を行うとともにスラグを分析するシステム能力を妨げる可能性がある。

したがって、望まれているのは、熱循環時にスラグを正確かつ精密に制御するシステム及び方法である。

一態様では、本発明は、マイクロ流体装置内のスラグの前記位置を制御する方法を含む。一実施の形態では、本方法は、
前記スラグ中の蛍光色素を励起することと、
前記スラグの前記蛍光の画像を取得することと、
前記画像内の対象領域からのデータを処理することと、
前記処理した画像データから前記対象領域内の前記スラグの位置を特定することと、
前記スラグの前記特定した位置に基づいて前記スラグの前記位置を制御することと、
を含むことができる。

更なる実施の形態では、前記スラグ中の蛍光色素を励起する前記ステップは、前記色素の前記蛍光が前記画像の最大強度値を超えるように十分なパワーの光源に前記スラグを曝すことを含むことができる。代替的な実施の形態では、前記スラグ中の蛍光色素を励起する前記ステップは、前記スラグの測定状態に従って励起源の前記出力を変えることを含むことができる。一実施の形態では、前記スラグの前記測定状態は、前記スラグの温度であることができる。また更なる実施の形態では、励起源の前記出力を変えることは、前記励起源の前記パワー入力を変えることを含むことができる。

代替的な実施の形態では、前記スラグ中の蛍光色素を励起する前記ステップは、高強度光源に前記スラグの或る領域を曝すことを含む。別の代替的な実施の形態では、前記方法は、前記スラグの一部を光退色させる前記ステップを更に含むことができる。この実施の形態では、前記スラグの前記一部を特定する前記ステップは、前記スラグの前記光退色させた部分を特定することを含むことができる。一実施の形態では、前記色素は、温度変化に比較的不感応である。

本方法の更なる実施の形態では、前記画像内の対象領域におけるデータを処理する前記ステップは、前記対象領域における最大強度値が前記画像に対して最大強度値にスケーリングされるように前記対象領域における強度値をスケーリングすることを含むことができる。更なる一実施の形態では、前記画像内の対象領域におけるデータを処理する前記ステップは、前記スラグの測定状態に従って前記対象領域における強度値をスケーリングすることを含むことができる。前記測定状態は、本方法の更なる一実施の形態では、温度であることができる。

一実施の形態では、前記対象領域内の前記スラグの位置を特定する前記ステップは、前記画像の２つ以上の波長面の閾値条件を満たす画素を特定することを含むことができる。前記波長面は、幾つかの実施の形態では、カラープレーンであることができる。

一実施の形態では、前記対象領域内の前記スラグの位置を特定する前記ステップは、前記スラグの前記予測された熱膨張についての情報を用いることであって、前記スラグの位置を特定する、用いることを含むことができる。

一実施の形態では、前記対象領域内の前記スラグの位置を特定する前記ステップは、前記対象領域を所定のテンプレート画像と相互相関させることを含むことができる。

一実施の形態では、前記対象領域内の前記スラグの位置を特定する前記ステップは、前記スラグの２つ以上の地点を特定することと、該２つ以上の地点の前記位置を平均化することとを含むことができる。

一実施の形態では、スラグの位置を制御するステップは、スラグの特定された位置から比例制御値、積分制御値及び微分制御値を導く比例−積分−微分制御装置を使用することを含むことができる。代替的に、一実施の形態では、前記スラグの前記位置を制御する前記ステップは、前記スラグの想定状態又は測定状態に基づいて、前記マイクロ流体装置と動作可能に係合する制御素子を調整することを含むことができる。

別の態様では、本発明は、マイクロ流体装置内の流体スラグの前記位置を制御する方法を含み、該方法は、
前記マイクロ流体装置内に、第１の色素を含む第１のスラグを準備するステップと、
前記マイクロ流体装置内に、第２の色素を含む第２のスラグを準備するステップと、
前記マイクロ流体装置内の、前記第１のスラグ及び前記第２のスラグのうちの１つ又は複数を含むことができる前記対象領域の画像を取得するステップと、
前記画像内の対象領域からのデータを処理することと、
前記処理した画像データから、前記対象領域内の前記第１のスラグと前記第２のスラグとの間の境界を特定するステップと、
前記第１のスラグと前記第２のスラグとの間の前記特定した境界に基づいて、前記第１のスラグ及び前記第２のスラグの位置を制御するステップと、
を含むことができる。

一実施の形態では、前記第１のスラグ又は前記第２のスラグのうちの一方は、処理及び／又は分析される生物学的試料を含有する試料スラグであり、前記第１のスラグ又は前記第２のスラグのうちの他方は、処理及び／又は分析される試料を含有しないブランキングスラグである。別の実施の形態では、前記第１の色素は、第１の光波長で蛍光を発する蛍光色素であり、前記第２の色素は、第２の光波長で蛍光を発する蛍光色素である。一実施の形態では、前記方法は、前記第１のスラグ中の前記第１の蛍光色素及び前記第２のスラグ中の前記第２の蛍光色素中の蛍光を励起するステップを更に含むことができる。

本方法の一実施の形態では、前記対象領域内の前記第１のスラグと前記第２のスラグとの間の境界を特定する前記ステップは、前記画像の第１の波長面及び前記画像の第２の波長面の閾値条件を満たす画素を特定することを含むことができる。別の実施の形態では、前記対象領域内の前記第１のスラグと前記第２のスラグとの間の境界を特定する前記ステップは、前記対象領域を所定のテンプレート画像と相互相関させることを含む。

前述した実施の形態のいずれかの更なる実施の形態では、前記スラグは温度変化を受けることができる。

本発明の一態様は、マイクロ流体装置内のスラグの位置を制御する方法を含むことができる。一実施の形態では、本方法は、
マイクロ流体装置内のスラグの画像を取得するステップと、
前記画像内の対象領域からのデータを処理するステップと、
前記処理した画像データから、前記対象領域内の前記スラグの位置を特定するステップと、
前記スラグの前記特定した位置に基づいて前記スラグの前記位置を制御するステップと、
を含むことができる。更なる実施の形態では、前記スラグは蛍光色素を含むことができる。また更なる実施の形態では、前記方法は、前記スラグ中の前記蛍光色素を励起するステップを更に含むことができる。

本発明の一態様は、マイクロ流体装置内のスラグの前記位置を制御するシステムを含むことができる。本システムは、（ａ）１つ又は複数の流体チャネルと、該１つ又は複数の流体チャネル内に１つ又は複数のスラグとを備えるマイクロ流体装置と、
（ｂ）前記１つ又は複数のスラグ内の前記１つ又は複数の蛍光色素を励起するように構成されているスラグ励起装置と、
（ｃ）前記マイクロ流体装置の少なくとも或る対象領域からの光を捕捉するように構成されている光検知ユニットであって、前記対象領域は前記スラグのうちの１つ又は複数を含む、光検知ユニットと、
（ｄ）前記光検知ユニットから情報を受信するように構成されている処理ユニットと、
（ｅ）前記対象領域内の前記１つ又は複数のスラグのうちの１つ又は複数の前記位置を特定するように構成されている位置特定ユニットと、
（ｆ）前記１つ又は複数のスラグの前記特定した位置に基づいて前記マイクロ流体装置内の前記１つ又は複数のスラグを位置決めするように構成されているスラグ制御ユニットと、
を備えることができる。

一実施の形態では、前記スラグ制御ユニットは、前記スラグを移動させるように構成されている流体制御装置と動作可能に係合する比例−積分−微分制御ユニットを含むことができる。別の実施の形態では、前記光検知ユニットはデジタル一眼レフカメラを含むことができる。

別の実施の形態では、１つ又は複数のスラグは１つ又は複数の蛍光色素を含み、本システムは、１つ又は複数のスラグ内の１つ又は複数の蛍光色素を励起するように構成されているスラグ励起装置を更に備えることができる。更なる実施の形態では、前記スラグ励起装置は光源である。

本発明の別の態様は、マイクロ流体装置内の、ブランキングスラグが囲む試料スラグの前記位置を制御する方法を含むことができる。一実施の形態では、本方法は、
蛍光色素を含む第１のブランキングスラグと、蛍光色素を含む第２のブランキングスラグとを準備することであって、前記第１のブランキングスラグ及び前記第２のブランキングスラグは前記試料スラグを囲む、準備することと、
前記ブランキングスラグ中の蛍光色素を励起することと、
前記ブランキングスラグ及び前記試料スラグの画像を取得することであって、前記画像は前記ブランキングスラグの前記蛍光を捕捉する、取得することと、
前記画像内の対象領域からのデータを処理することと、
前記処理した画像データから、前記対象領域内の前記試料スラグの位置を特定することと、
前記試料スラグの前記特定した位置に基づいて前記試料スラグの前記位置を制御することと、
を含むことができる。更なる実施の形態では、前記試料スラグは蛍光色素をほとんど含有しないか又は全く含有しないことができる。代替的には、前記試料スラグは、第１の波長で蛍光する色素を含有することができ、前記第１の試料スラグ及び前記第２の試料スラグはそれぞれ、第２の波長で蛍光する色素を含有することができ、前記第１の波長及び前記第２の波長は異なる。

本発明の別の態様は、マイクロ流体装置内の試料スラグの前記位置を制御する方法であって、
蛍光色素を含む第１のブランキングスラグと、試料スラグとを準備することであって、前記ブランキングスラグは前記試料スラグとの境界面を有する、準備することと、
前記ブランキングスラグ中の蛍光色素を励起することと、
前記ブランキングスラグの少なくとも一部及び前記試料スラグの少なくとも一部の画像を取得することと、
前記画像内の対象領域からのデータを処理することと、
前記処理した画像データから、前記対象領域内の前記試料スラグの位置を特定することと、
前記試料スラグの前記特定した位置に基づいて前記試料スラグの前記位置を制御することと、
を含む、マイクロ流体装置内の試料スラグの前記位置を制御する方法を含むことができる。

更に別の態様では、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅時のスラグの前記位置を制御する方法であって、前記ＰＣＲは、変性ステップと、アニーリングステップと、伸長ステップとを有し、該方法は、
前記スラグ中の蛍光色素を励起することと、
前記スラグの前記蛍光の画像を取得することと、
前記画像のデータを処理することと、
前記処理した画像データから前記スラグの前記位置を特定することと、
前記検出した位置に基づいて前記スラグの前記位置を制御することと、
を含み、
前記変性ステップは、前記画像が取得される期間よりも持続時間が短い、ポリメラーゼ連鎖反応増幅時の流体スラグの前記位置を制御する方法を含む。

更なる実施の形態では、前記アニーリングステップは、前記変性ステップよりも持続時間が長く、前記画像の少なくとも一部は、前記アニーリングステップ時に取得される。更なる実施の形態では、前記画像の約３０％以上は、前記アニーリングステップ時に取得される。また更なる実施の形態では、前記画像の約５０％以上は、前記アニーリングステップ時に取得される。

別の更なる実施の形態では、前記アニーリングステップは長さが約７秒〜約１０秒である。別の実施の形態では、前記スラグの前記蛍光の画像を取得する前記ステップは、１秒当たり約１枚以上の画像取得頻度で行われる。更なる実施の形態では、前記画像取得頻度は、１秒当たり約１枚画像〜１秒当たり約３０枚画像である。

更なる実施の形態では、前記伸長ステップは、前記変性ステップよりも持続時間が長く、前記画像の少なくとも一部は、前記伸長ステップ時に取得される。一実施の形態では、前記画像の約３０％以上は、前記伸長ステップ時に取得される。更に別の実施の形態では、前記画像の約５０％以上は、前記伸長ステップ時に取得される。また更なる実施の形態では、前記伸長ステップは長さが約７秒〜約１０秒である。一実施の形態では、前記画像取得頻度は、１秒当たり約１枚以上である。別の実施の形態では、前記画像取得頻度は、１秒当たり約１枚画像〜１秒当たり約３０枚画像であることができる。

一実施の形態では、画像は前記変性ステップ時には取得されない。別の実施の形態では、前記変性ステップは持続時間が約１秒であり、前記アニーリングステップは持続時間が約８秒であり、前記伸長ステップは持続時間が約１秒である。

本発明の別の態様は、ポリメラーゼ連鎖反応熱サイクル時のスラグの前記位置を制御する方法を含み、該方法は、
変性を可能にするのに十分に高い温度に前記スラグを曝すことを含む変性ステップと、
前記変性温度よりも低くプライマーのアニーリング及び伸長を可能にするのに十分な温度に前記スラグを曝すことを含む、アニーリング／伸長ステップと、
前記熱サイクル時の前記スラグ中の蛍光色素を励起することと、
前記スラグの前記蛍光の画像を取得することと、
前記画像のデータを処理することと、
前記処理した画像データから前記スラグの前記位置を特定することと、
前記検出した位置に基づいて前記スラグの前記位置を制御することと、
を含むことができる。

更なる実施の形態では、前記変性ステップは、前記ＰＣＲ熱サイクル時の、その後の変性ステップ時に、変性を可能にするのに十分に高い第１の温度と、該第１の温度よりも低いが依然として変性を可能にするのに十分に高い第２の温度とに前記スラグを曝すことを含む。また更なる実施の形態では、前記第１の温度は約９５℃以上であり、前記第２の温度は約９０℃以下である。

別の態様では、本発明は、マイクロ流体装置内のスラグの前記位置を制御するシステムを含む。一実施の形態では、本システムは、
（ａ）１つ又は複数の流体チャネルと、該１つ又は複数の流体チャネルと連通する１つ又は複数の熱素子と、前記１つ又は複数の流体チャネル内の１つ又は複数のスラグを備える、マイクロ流体装置であって、前記１つ又は複数のスラグは１つ又は複数の蛍光色素を含む、マイクロ流体装置と、
（ｂ）前記１つ又は複数のスラグ内の前記１つ又は複数の蛍光色素を励起するように構成されているスラグ励起装置と、
（ｃ）前記マイクロ流体装置の少なくとも或る対象領域から或る取得速度で蛍光を捕捉するように構成されている光検知ユニットであって、前記対象領域は前記スラグのうちの１つ又は複数を含む、光検知ユニットと、
（ｄ）前記マイクロ流体装置の前記熱素子を用いて前記スラグの温度を制御するように構成されている温度制御ユニットと、
（ｅ）前記光検知ユニットから情報を受信するように構成されている処理ユニットと、
（ｆ）前記対象領域内の前記１つ又は複数のスラグのうちの１つの前記位置を特定するように構成されている位置特定ユニットと、
（ｇ）前記特定した位置に基づいて前記マイクロ流体装置内の前記スラグを位置決めするように構成されているスラグ制御ユニットと、
を備えることができる。

本システムの更なる一態様では、温度制御ユニットは、第１の持続時間にわたる第１の温度での変性ステップと、第２の持続時間にわたる第２の温度でのアニーリングステップと、第３の持続時間にわたる第３の温度での伸長ステップとに前記スラグを供するように構成されている。

一実施の形態では、変性ステップの持続時間は、画像の取得と取得との間の期間よりも持続時間が短い。一実施の形態では、前記アニーリングステップの前記持続時間は、前記変性ステップの前記持続時間よりも長く、前記画像の少なくとも一部は、前記アニーリングステップ時に取得される。代替的には、別の実施の形態では、前記伸長ステップの前記持続時間は、前記変性ステップの前記持続時間よりも長く、前記画像の少なくとも一部は、前記伸長ステップ時に取得される。

一実施の形態では、前記変性ステップは持続時間が約１秒であり、前記アニーリングステップは持続時間が約８秒であり、前記伸長ステップは持続時間が約１秒である。別の実施の形態では、前記変性ステップは持続時間が約２秒であり、前記アニーリングステップは持続時間が約１．５秒であり、前記伸長ステップは持続時間が約６．５秒である。

本システムの別の実施の形態では、温度制御ユニットは、第１の持続時間にわたる第１の温度での変性ステップと、第２の持続時間にわたる第２の温度でのアニーリング／伸長ステップとをスラグが受けるように構成されている。

別の実施の形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅時の流体スラグの前記位置を制御する方法であって、
前記ＰＣＲは、
変性を可能にするのに十分に高い温度に前記スラグを曝すことを含む、第１の変性ステップと、
プライマーのアニーリング及び伸長を可能にする、前記変性温度よりも低い温度に前記スラグを曝すことを含む、第２のアニーリング／伸長ステップと、
を含む、ポリメラーゼ連鎖反応増幅時の流体スラグの前記位置を制御する方法が提供される。
該方法は、
前記スラグ中の蛍光色素を励起することと、
前記スラグの前記蛍光の画像を取得することと、
前記画像のデータを処理することと、
前記スラグの前記位置を特定することと、
前記検出した位置に基づいて前記スラグの前記位置を制御することと、
を更に含むことができる。本方法の一実施の形態では、画像は前記変性ステップ時には得られない。

本発明の上記の態様及び特徴並びに他の態様及び特徴並びに本発明の種々の実施形態の構造及び用途は、添付図面を参照して以下で述べられる。

本明細書に組み込まれて、本明細書の一部をなす添付図面は、本発明の様々な実施形態を示す。図面中、同様の参照符号が同一の要素又は機能が類似する要素を示す。さらに、参照符号の一番左側の数字は、その参照符号が最初に現れた図面を識別する。

本発明の態様と併せて用いることができるマイクロ流体装置を示す図である。 本発明の態様と併せて用いることができるマイクロ流体装置を用いるシステムの機能ブロック図である。 本発明の実施形態に従って１つ又は複数のスラグを制御するプロセスを示す図である。 本発明の実施形態に従って１つ又は複数のスラグを制御するプロセスを示す図である。 本発明の一実施形態によるマイクロチャネル内のスラグの強度プロファイルを示す図である。 本発明の一実施形態によるマイクロチャネル内のスラグの強度プロファイルを示す図である。 本発明の幾つかの実施形態の例示的なものである色素が充填されたマイクロチャネルのための強度プロファイルを示す図である。 本発明の態様を具現する蛍光色素の温度依存性のプロットである。 本発明の態様を具現する蛍光色素の光退色特性のプロットである。 本発明の態様によるマイクロ流体チップのマイクロ流体チャネル内の蛍光スラグの画像である。 本発明の態様によるマイクロ流体チップのマイクロ流体チャネル内で蛍光を発しているスラグの画像である。 本発明の態様によるマイクロチャネル内のスラグの強度プロファイルを示す図である。 本発明の態様を具現する相互相関のテンプレート画像である。 本発明の態様を具現する或る特定の蛍光色素のための温度の関数としての蛍光強度のプロットである。

一態様では、本発明は、熱循環時に、温度依存性蛍光色素（複数の場合もある）を含み得るスラグを制御するシステム及び方法を提供する。或る特定の非限定的な実施形態では、本発明は、マイクロ流体チャネル内でのスラグの位置を求めるシステムの能力を高めるプロセス及びシステムを含む。

図１は、本発明の態様を実施する上で有用とすることができるマイクロ流体装置１００を示す。他の装置（他のマイクロ流体装置を含む）を本発明に従って用いることができることが当業者によって理解されるであろう。例示的な実施形態では、マイクロ流体装置１００は、基板１０１を横切って延びる複数のマイクロ流体チャネル１０２を備える。各チャネル１０２は、１つ又は複数の流入口１０３（図示の実施形態はチャネル１０２ごとに２つの流入口１０３を示す）と、１つ又は複数の流出口１０５（図示の実施形態はチャネル１０２ごとに１つの流出口１０５を示す）とを備える。本装置の例示的な実施形態では、各チャネルは、（以下で記載するような）ＰＣＲ熱ゾーン１０４を通って延びる第１の部分と、（以下で記載するような）熱融解ゾーン１０６を通って延びる第２の部分とに細分割することができる。

一実施形態では、マイクロ流体装置１００は、マイクロ流体チャネル１０２と関連付けられた薄膜抵抗加熱器１１２の形態の熱制御素子を更に備える。非限定的な一実施形態では、薄膜抵抗加熱器１１２は、そのそれぞれの温度を制御するために、自身の抵抗が測定される白金抵抗加熱器とすることができる。図１に示されている実施形態では、各加熱素子１１２は、２つの加熱器セクション、すなわち、ＰＣＲゾーン１０４内のＰＣＲ加熱器１１２ａのセクションと、熱融解ゾーン１０６内の熱融解加熱器１１２ｂのセクションとを含む。

一実施形態では、マイクロ流体装置１００は、種々の薄膜加熱器１１２ａ及び１１２ｂに接続される複数の加熱器電極１１０を備えることができる。非限定的な実施形態では、加熱器電極１１０は、ＰＣＲセクションリード線１１８と、１つ又は複数のＰＣＲセクション共通リード線１１６ａと、熱融解セクションリード線１２０と、１つ又は複数の熱融解セクション共通リード線１１６ｂとを備えることができる。本発明の一実施形態によれば、別個のＰＣＲセクションリード線１１８は、薄膜ＰＣＲ加熱器１１２ａのそれぞれに接続され、別個の熱融解セクションリード線１２０は、薄膜熱融解加熱器１１２ｂのそれぞれに接続される

図２は、マイクロ流体装置１００のようなマイクロ流体装置を用いる例示的なシステム２００の機能ブロック図を示す。ここでも同様に、本発明の方法は、個々の試料を処理及び分析のために内部で熱循環させるか又は別様に熱操作する任意の装置及びシステムを含む、他の代替的なシステムと併せて有用であることが理解されるであろう。ＤＮＡ試料を調製段階２０２からマイクロ流体装置１００内に投入することができる。調整段階２０２は、試料を調製する（２０４）とともに１つ又は複数の試薬を試料に添加する（２０６）適切な装置を含み得る。試料は、マイクロ流体装置１００に、例えば流入口１０３において投入されると、チャネル１０２を通って、ＰＣＲが行われるＰＣＲゾーン１０４に流入する。すなわち、下記でより詳細に説明されるように、試料は、チャネル１０２内でＰＣＲゾーン１０４に流れる際、ＰＣＲ温度サイクルを複数回受けてＰＣＲ増幅を行われる。次に、試料は、高分解能熱融解プロセスが行われる熱融解ゾーン１０６に流入する。マイクロ流体装置１００への試料の流入は、流量コントローラー２０８によって制御することができる。制御システム２５０が、流量コントローラー２０８と、ＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０と、ＰＣＲ流量モニター２１８と、熱融解ゾーン温度コントローラー２２４と、融解ゾーン蛍光測定システム２３２とを備えることができる。代替的に、制御システムはまた、流量コントローラー２０８、ＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０、熱融解ゾーン流量モニター、熱融解ゾーン温度コントローラー２２４及び／又は熱融解ゾーン蛍光測定システムを備えることができる。ＰＣＲ流量制御モード及び熱融解流量制御モードは、組み合わせても交互に用いてもよい。

ＰＣＲゾーン１０４内の温度は、ＰＣＲゾーン温度制御コントローラー２１０によって制御することができる。プログラムされたコンピューター若しくは他のマイクロプロセッサ又はアナログ温度コントローラーとすることができるＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０は、温度センサー２１４（例えば、ＲＴＤ若しくは薄膜サーミスター、又は薄膜熱電対温度計等）によって求められた温度に基づいて加熱素子２１２（例えば、ＰＣＲ加熱器１１２ａ）に信号を送る。このようにして、ＰＣＲゾーン１０４の温度を、所望レベルに維持するか又は規定シーケンスで循環させることができる。本発明の幾つかの実施形態によれば、ＰＣＲゾーン１０４はまた、（例えば、チャネル温度を９２℃から５５℃に急速に下げるために）冷却素子２１６によって冷却することもでき、この冷却素子もまたＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０によって制御することができる。一実施形態では、冷却素子２１６は例えば、ペルチェ素子、ヒートシンク又は強制対流空冷素子であり得る。

マイクロ流体チャネル１０２を通る試料の流量は、ＰＣＲゾーン流量監視システム２１８によって測定することができる。一実施形態では、流量監視システムは、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許出願公開第１１／５０５，３５８号に示されている蛍光色素撮像／追跡システムとすることができる。一実施形態によれば、ＰＣＲゾーン内のチャネルを励起装置２２０によって励起することができ、試料による蛍光の光を検出装置２２２によって検出することができる。撮像システムの一部を形成する、１つの考えられ得る励起装置及び検出装置の一例が、米国特許出願公開第１１／６０６，００６号及び同第１１／５０５，３５８号に示されており、これらの開示全体は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

例えば、プログラムされたコンピューター若しくは他のマイクロプロセッサ又はアナログ温度コントローラーである、熱融解ゾーン温度コントローラー２２４を用いて、熱融解ゾーン１０６の温度を制御することができる。ＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０の場合のように、熱融解ゾーン温度コントローラー２２４は、例えば、ＲＴＤ、薄膜サーミスター又は薄膜熱電対とすることができる温度センサー２２８によって測定された温度に基づいて加熱部品２２６（例えば、熱融解加熱器１１２ｂ）に信号を送る。さらに、熱融解ゾーン１０６は、冷却素子２３０によって独立して冷却することができる。試料の蛍光サインを、熱融解ゾーン蛍光測定システム２３２によって測定することができる。蛍光測定システム２３２は励起装置２３４によって試料を励起し、試料の蛍光を検出装置２３６によって検出することができる。１つの考えられ得る蛍光測定システムの一例が、米国特許出願公開第１１／６０６，００６号及び同第１１／５０５，３５８号に示されており、これらの開示全体は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

本発明の態様によれば、薄膜加熱器１１２は、加熱器及び温度検出器の双方として機能することができる。したがって、本発明の一実施形態では、加熱素子２１２及び２２６並びに温度センサー２１４及び２２８の機能は、薄膜加熱器１１２によって達成することができる。

一実施形態では、システム２００は、ＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０又は熱融解ゾーン温度コントローラー２２４が送信した制御信号に基づいて、薄膜加熱器１１２ａ及び／又は１１２ｂに出力を送り、それによって、薄膜加熱器１１２ａ及び／又は１１２ｂを昇温させる。制御信号は例えば、パルス幅変調（ＰＷＭ）制御信号とすることができる。加熱器２１２を制御するのにＰＷＭ信号を用いる利点は、ＰＷＭ制御信号を用いれば、要求される種々の温度の全てに対して、加熱器の両端にかけられている同電圧を用いることができることである。別の態様では、制御信号は、振幅変調又は交流電流を利用し得る。加熱器２１２を制御するのに振幅変調される制御信号を用いることは、大きな電圧の段階ではなく連続した緩やかな電圧変化によりスルーレートによる制限が回避されるとともに整定時間が改善されるため、有利である。振幅変調の更なる説明は、２０１０年６月２９日に出願された米国特許出願第１２／８２５，４７６号において見ることができ、この米国特許出願は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

幾つかの実施形態では、加熱器の所望温度は、制御信号のデューティサイクルを変化させることによって達する。非限定的な一例では、ＰＣＲ加熱器内で９５℃を達成するための制御信号のデューティサイクルは約５０％、ＰＣＲ加熱器内で７２℃を達成するための制御信号のデューティサイクルは約２５％、及びＰＣＲ加熱器内で５５℃を達成するための制御信号のデューティサイクルは約１０％であり得る。当業者には明らかであるように、他の実施形態では、他のデューティサイクルを用いることができる。

マイクロ流体装置１００及びシステム２００は、互いに併用することができる。さらに、マイクロ流体装置１００及びシステムは、本発明の方法と併用することができる。例えば、マイクロ流体装置１００を、上述した、流量コントローラー２０８と、温度コントローラー２１０及び２２４と、励起装置２２０、２３４及び検出装置２２２、２３６とともに用いて、本発明の態様に従って、熱循環時にマイクロ流体チャネル１０２を通って移動する温度依存性蛍光色素を含むスラグの位置を特定及び制御することができる。

本発明の非限定的な実施形態では、チャネル内でのスラグの位置は、チャネルに沿った関心領域（ＲＯＩ）を分析することによって求めることができる。幾つかの実施形態では、そのような分析は対象領域の画像分析を含み得る。図３Ａは、本発明の一実施形態に従って、熱循環時にチャネルを通って移動する１つ又は複数のスラグを制御するプロセス３００を示す。幾つかの実施形態では、１つ又は複数のスラグは蛍光色素を含み得る。蛍光色素は幾つかの実施形態では温度依存性であり得る。

図３Ａに示されているように、プロセス３００は、スラグに蛍光を発せさせるステップ３０２で開始することができる。スラグは、スラグ励起光源によって蛍光を発することができ、このスラグ励起光源は、蛍光色素中の蛍光を励起するのに適した任意の光源とすることができる（例えば、レーザー、ＬＥＤ及び特定のランプを含む、十分な強度の光源による励起）。例えば、幾つかの実施形態では、光源は、所定の波長若しくは波長範囲の光又は他の放射線を発することによってマイクロ流体チャネル１０２内でスラグを刺激する励起装置２２０又は励起装置２３４を含み得る。

幾つかの実施形態では、ステップ３０２は飽和法を含み得る。飽和法では、例えば、ブランキングスラグ励起光源の強度を増大させる（例えば、幾つかの実施形態では、励起装置２２０又は励起装置２３４の出力を増大させる）ことによって、ブランキングスラグの蛍光の強度を最大にすることができる。ブランキングスラグの強度も同様に、又は代替的に、ブランキングスラグ内の色素の濃度を増加させることによって増大させることができる。飽和法により、ブランキングスラグは、例えば温度変化又は他の変化に起因して起こり得る蛍光変化にもかかわらずブランキングスラグがセンサーを飽和させるほど非常に明るく蛍光を発する。

非限定的な一例では、センサーを用いてスラグの蛍光を検出することができる。幾つかの実施形態では、センサーは検出装置２２２又は２２６とすることができる。一実施形態では、センサーは、８ビットシステム（すなわち、検知される値が０〜２５５の範囲とすることができる）を含み得る。そのようなセンサーの例として、任意のＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、又は８ビット画像（例えば、ＪＰＥＧファイルフォーマット画像）を出力する他の適切なカメラが挙げられる。そのようなセンサーの一例が、「Optical System for High Resolution Thermal Melt Detection」と題する、同時係属中の出願である米国特許出願公開第６１／３７８，４７１号、及び、この米国特許出願公開の優先権を主張する米国特許出願公開第１３／２２２，４８７号に記載されており、これらの米国特許出願公開の開示全体は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。８ビットセンサーを含む実施形態では、ブランキングスラグ強度は、ブランキングスラグの蛍光が、想定される最も高い反応温度の２５５番目のレベルで検知されるように増大させることができる。より低い温度では、ブランキングスラグの蛍光はセンサーの２５５番目のレベルを超えるが、センサーは依然として２５５番目のレベルの出力を生成する（すなわち、センサーは「飽和」している）。

図４Ａ及び図４Ｂは、種々の温度条件下で（すなわち、図４Ａ及び図４Ｂにおいて示されているように２５℃、４０℃及び９０℃で）、赤色のブランキングスラグ４０２ａ、４０２ｂ及び４０２ｃ、並びに青色／緑色の試料スラグ４０４の非限定的な例の強度プロファイルを示す。図４Ａのプロットは、図４Ｂのプロットよりも低いＬＥＤ電流（すなわち、より低い励起出力）に関するものである。この例では、飽和法は、赤色色素の蛍光が２５℃及び４０℃でセンサーを飽和させるように用いられている。したがって、図４Ａ及び図４Ｂは、飽和法は、想定される反応温度の十分な範囲よりも低い一部の温度でのみ完全飽和となる幾つかの実施形態において用いられ得ることを示す（すなわち、図４Ａ及び図４Ｂの非限定的な例では、センサーの完全飽和は２５℃及び４０℃でのみ生じる）。完全飽和が各温度で要求されるわけではなく、幾つかの実施形態では、ブランキングスラグ４０２ａ〜ｃが試料スラグ４０４と容易に区別することができることを確実にするほど十分に蛍光の強度が増大することが好ましい。

図４Ａ及び図４Ｂはまた、各プロットにおいて表されている最も右のスラグ４０２ｃが均一に加熱されておらず、したがって、その強度プロファイルが均一ではないことを示している。幾つかの実施形態では、このことは、２つの熱制御素子間のスペース（例えば、マイクロ流体装置１００内のマイクロ流体チャネル１０２に沿ったＰＣＲ加熱器１１２ａと熱融解加熱器１１２ｂとの間のスペース）によって引き起こされ得る。図５は、チャネルにわたる不均一な蛍光を示す、チャネル全体を満たす赤色色素（例えば、いかなる試料スラグも有しないマイクロチャネル１０２全体を満たす赤色色素）を含む非限定的な例の流体の強度プロファイルを示す。そのような実施形態では、図５に示されている基準プロファイルのような基準プロファイルを用いて、図４Ａ及び図４Ｂに示されている強度プロファイルのようなスラグ強度プロファイルを正規化することができる。正規化法は、例えば基準プロファイルの除算又は減算に基づき得る。特定の一例では、（図５に示されている基準プロファイルのような）基準プロファイルは、より大きな励起光を示す右側において強度がより大きくなることを示す。スラグプロファイル（例えば、図４Ａ及び図４Ｂに示されているスラグプロファイル）を基準プロファイル（例えば、図５の基準プロファイル）で除算することにより、不均一な励起光によって生じるいかなるスケーリング誤差も補正される。そのような正規化は検出器の不均一性（例えば、ビネット）も補正し得ることが当業者には明らかであろう。

別の非限定的な実施形態では、蛍光色素の温度依存性は、ステップ３０２（すなわち「光変調」）において使用される励起光の強度を変調することによって解消することができる。例えば、赤色ブランキングスラグがレーザー又はＬＥＤによって励起される場合、試料又はブランキングスラグの温度変化にもかかわらず概ね一定の蛍光強度を維持するために、励起源の出力パワーを必要に応じて（例えば、電流及び／又は電圧を調整することによって）増減することができる。例えば、非限定的な実施形態では、色素の蛍光は、反応温度が上がるにつれて減少する可能性がある。これを補償するために、反応温度が上がるにつれて励起源のパワー出力を適切に上げて、概ね一定の蛍光強度を維持することができる。

光変調は、本発明の態様に従って多様な方法で実施することができる。例えば、幾つかの実施形態では、ソフトウェアが色素の温度を求める（例えば、ＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０又は熱融解ゾーン温度コントローラー２２４が対応ゾーンの温度を分かっており、したがって、色素の温度を求めることができる）。非限定的な実施形態では、光パワーは、National Instruments社のＰＸＩ−６２８９及びMeasurement Computing社のＰＣＩ−２５１７が２つの非限定的な例であるデータ取得カードにアナログ出力を用いることによって変化する。別の実施形態では、ハードウェアフィードバックを用いて励起レーザー又はＬＥＤを変調することができる。例えば、回路を用いてマイクロ流体装置のセンサー（例えば、電圧及び電流が測定される抵抗温度検出器）の温度を測定する場合、回路からの信号を入力として用いて、適宜光源（例えば、ＬＥＤ又はレーザー）のパワーを変えることができる。光源のパワー変化は、色素の、図１２に示されている強度プロファイルのような強度プロファイルを用いることによって、計算することができる。光変調は、適切なフィードバック機構を用いることによって達成することができる。１つの考えられ得るフィードバック機構は、スラグ温度の測定値として、ＲＴＤを通る電流を測定することである。適切に変換されたバージョン（スケーリング、反転、オフセット等）の電流を用いて、一定の電流を電源とするＬＥＤを駆動することができる。特定の非限定的な一例では、ＲＴＤは温度が上がるにつれてその電流が下がる（正の抵抗温度係数をとる）。したがって、ＲＴＤ電流の反転測定値を用いてＬＥＤを駆動することができる（すなわち、色素の温度が上がるにつれて減少する蛍光を補償するためにより多くの光を供給するようにより多くの電流を用いてＬＥＤを駆動する）。更に別の実施形態では、温度変化時に概ね一定の蛍光強度を維持するために、励起源を種々のデューティサイクルでオン／オフに切り換える（すなわち、パルス幅変調する）ことができる。例えば、温度の所与の上昇に対して強度が２倍だけ低下する場合、用いられるデューティサイクルは倍増し得る。

別の非限定的な実施形態では、レーザー又は他の適切な結像励起／集光励起源を用いて、スラグが励起ストライプのエリア内で明るく蛍光を発するように複数のマイクロチャネルにわたって励起ストライプを作り出すことができる。一実施形態では、励起ストライプは、励起ストライプ内のスラグの蛍光が変化せず、また、スラグがチャネルの他のエリア内の温度変化にもかかわらず制御下にあるままとすることができるように、名目上一定の温度の小エリア（例えば、熱循環を受けない領域）内に配置することができる。幾つかの実施形態では、集光励起は、上述したように撮像システムを飽和させるのにも用いることができる。

別の実施形態では、レーザー（又は他の適切な結像／集光光源）を用いて、スポット又はストライプを色素に光退色させることができる。スラグ中の蛍光体を集光光源（例えば、レーザー）に曝すことにより破壊することによって、チャネル内をトラッキングすることができる「暗い」スポットを作り出すことができる。このようにして、光退色したスポット又はストライプは、その暗いスポットの蛍光が変化しないため、トラッキングすることができ、また、スラグの位置を特定するのに用いることができる。一実施形態では、光退色したスポット又はストライプの縁は、拡散したスラグの縁よりも鋭利であり、このことは、光退色したスポット又はストライプを用いてスラグの位置を制御する上で役立ち得る。一実施形態では、暗く光退色した領域は温度依存性蛍光を呈さないため、光退色したスポット又はストライプの中心をトラッキングすることができる。

非限定的な一実施形態では、ＰＣＲサイクルは、変性ステップが非常に短いものとなるように調整される。マイクロ流体装置では、変性ステップ／アニーリングステップ／伸張ステップを経る通常のＰＣＲ熱循環時間として、例えば、５秒／５秒／５秒又は１０秒／１０秒／１０秒を挙げることができる。しかしながら、変性ステップだけは、二本鎖ＤＮＡが一本鎖に分離するほど十分に長い必要があるのみである。したがって、非限定的な一例では、変性ステップは、約３秒以下、好ましくは約２秒以下、より好ましくは約１秒以下だけ続き得る。

ＰＣＲ熱循環時間は従来的に、保持（すなわち滞留）時間を用いて規定され、一般的に遷移時間を含まない。本発明の一実施形態では、温度誘発強度変化を、遷移時間及び／又は滞留時間を（幾つかの実施形態では）制限及び／又は（他の実施形態では）延長することによって、最小限に抑えることができる。例えば、変性のための遷移時間及び滞留時間を双方とも制限することができる。実施形態では、変性ステップは持続時間が非常に短いものとすることができ、実施形態によっては瞬時の変性で十分であり得る。非限定的な例の瞬時の特定の変性持続時間に加え、持続時間として、約３秒、２秒、１秒、０．５秒及び０．２５秒を挙げることができる。

一実施形態では、変性期間は、流量監視システムが更新されるか又はマイクロ流体チャネル１０２内でのスラグの画像を取得する頻度（例えば１秒当たり１回）よりも短いものとすることができる。変性ステップを比較的短くすることによって、変性ステップにおいて用いられる極端な温度（それらの温度に対応する極端な強度変化を伴う）では、流量監視のために取得される画像が得られたとしてもその数は少なくなる。本発明の一態様では、このことは、加熱素子からＤＮＡ試料に急速に伝熱される際にマイクロ流体装置によって達成され得る。一実施形態では、マイクロ流体装置１００は、具現される加熱器１１２が急速加熱することが可能であるため、この目的に理想上適している。

実施形態によっては好ましい場合がある、変性時に流量制御画像が取得されないことを確実にするために、流量監視システムの画像取得期間を変性ステップの期間よりも長くすることができる。更なる実施形態では、流量監視プロセス及び／又は画像取得プロセスは、熱サイクルと同期して、ＰＣＲ熱サイクルの変性ステップ時のスラグの画像取得を回避する。

別の非限定的な実施形態では、アニーリングステップは、スラグがアニーリング温度に保持されている間、流量監視システムが更新されるように延長することができる。例えば、非限定的な一実施形態では、アニーリングステップは、約３秒〜約６０秒まで延長することができる。より好ましくは、アニーリングステップは約５秒〜約１５秒である。より好ましくは、アニーリングステップは約５秒〜約１０秒である。これは二重目的、すなわち、第１に、プライマーが付着するのに十分な時間を提供することと、第２に、流量制御システムが主に、最小限に変化する（したがって、スラグの蛍光が最小限に変化する）温度で収集される画像に関して動作することを可能にすることとを果たす。一実施形態では、延長したアニーリングステップは、流量監視システムの更新と更新との間又は画像の取得と取得と間の期間に対して長い。更なる実施形態では、アニーリングステップは、流量制御に使用される画像の大部分がアニーリングステップ時に取得されることを確実にするのに十分に長いものとすることができる。一実施形態では、流量監視システムは、約１枚又は約５枚又は約１０枚又は約１５枚又は約２０枚又は約２５枚又は約３０枚又はそれよりも多い枚数の画像／秒のレートで画像を取得する（したがって、更新する）ことができる。持続時間が約５秒〜約１０秒のアニーリングステップであれば、流量監視に使用するためにアニーリングステップ時に約５枚〜約３００枚の画像の取得が可能であろう。

別の非限定的な実施形態では、伸長ステップは、伸長温度を保持している間、流量監視システムが更新されるように延長することができる。例えば、非限定的な一実施形態では、伸長ステップは、約３秒〜約６０秒まで延長することができる。より好ましくは、伸長ステップは約５秒〜約１５秒である。より好ましくは、伸長ステップは約５秒〜約１０秒である。これは二重目的、すなわち、第１に、ポリメラーゼが伸長するのに十分な時間を提供することと、第２に、流量制御システムが主に、最小限に変化する（したがって、スラグの蛍光が最小限に変化する）温度で収集される画像に関して動作することを可能にすることとを果たし、したがって、これらの画像が一定の強度を有する。一実施形態では、延長した伸長ステップは、流量監視システムの更新と更新との間又は画像の取得と取得と間の期間に対して長い。一実施形態では、伸長ステップは、流量制御に使用される画像の大部分が伸長ステップ時に取得されることを確実にするのに十分に長いものとすることができる。一実施形態では、流量監視システムは、約１枚又は約５枚又は約１０枚又は約１５枚又は約２０枚又は約２５枚又は約３０枚又はそれよりも多い枚数の画像／秒のレートで画像を得る（したがって、更新する）ことができる。持続時間が約５秒〜約１０秒の伸長ステップであれば、流量監視に使用するために伸長ステップ時に約５枚〜約３００枚の画像の取得が可能であろう。

更に別の非限定的な実施形態では、ＰＣＲ時に流体スラグの位置を制御する際に使用される画像の大部分は、アニーリングステップ及び／又は伸長ステップ時に得ることができる。一実施形態では、ＰＣＲ熱サイクル時に流体スラグの位置を制御する際に使用される画像の約３０％以上は、アニーリングステップ及び／又は伸長ステップ時に得られる。更なる実施形態では、流体スラグの位置を制御する際に使用される画像の約３５％又は約４０％又は約４５％又は約５０％以上は、アニーリングステップ及び／又は伸長ステップ時に得られる。

本発明に有用なＰＣＲ熱サイクルの好ましい非限定的な実施形態は、約１秒／８秒／１秒の変性／アニーリング／伸長のＰＣＲサイクルであり、これらの時間は、（遷移時間にかかわらず）各ステップに割り当てられる時間の全長である。この実施形態では、アニーリングステップは、他の２つのステップよりもはるかに長く、これにより、流量制御のために取得される画像の大半をアニーリング温度で取得することが可能になる。この結果、画像取得時のスラグの蛍光強度がほぼ一定となる（すなわち、温度によって著しく変化しない）。

本発明の一実施形態では、流量監視システムは、ＰＣＲ熱サイクルが変性段階、アニーリング段階又は伸長段階のうちの１つ又は複数の段階にある間に画像が取得されないようにプログラムすることができる。

別の実施形態では、２ステップＰＣＲ熱サイクルを用いて、熱循環下でスラグ制御を維持しながらＰＣＲを行うことができる。第１のステップにおいて、変性のために試料を高温に曝すことができる。第２のステップにおいて、プライマーのアニーリング及び伸長のために試料をより低い温度に曝すことができる。一実施形態では、変性ステップは、アニーリングステップ／伸長ステップに比して短いものとすることができる。２ステップＰＣＲは、従来のＰＣＲ熱サイクルプロファイルの場合に一般的であるように、制御システムが、３つではなく（２つの異なるステップにおける温度に起因して）２つの異なる強度にだけ対処すればよいという利点を提供する。

したがって、一実施形態では、２ステップＰＣＲ反応時の流体スラグの位置を制御する方法であって、ＰＣＲが、変性を可能にするのに十分に高い温度にスラグを曝すことを含む第１の変性ステップと、プライマーのアニーリング及び伸長を可能にする、変性温度よりも低い温度にスラグを曝すことを含む第２のアニーリング／伸長ステップとを含み、（ａ）上記スラグ中の蛍光色素を励起することと、（ｂ）上記スラグ中の蛍光の画像を取得することと、（ｃ）上記画像のデータを処理することと、（ｄ）上記スラグの位置を特定することと、（ｅ）検出した位置に基づいて上記スラグの位置を制御することとを含む、２ステップＰＣＲ反応時に流体スラグの位置を制御する方法が提供される。

同様に、上記方法の代替法として又は上記方法と併せて、変性ステップ／アニーリングステップ／伸長ステップの温度を、強度変化を小さくすることによってスラグ制御を改善するように変更することができる。この手法では、種々のＰＣＲ熱サイクルステップの温度は、より同様になるように調整され、したがって、蛍光の温度依存性に起因してステップ間の強度変化が小さくなる。当然のことながら、当業者によって容易に理解されるように、これらの手法には生物学的制限及び熱力学的制限がある。

ＰＣＲ熱サイクルステップ温度を調整する非限定的な一例は、変性温度を下げることである。従来的に、変性温度は、核酸分子の全てが変性することを確実にするために、熱力学的に必要とされる（例えば、９５℃）よりも高く設定される。しかしながら、この結果、変性温度が上がると蛍光強度の範囲が増すため、スラグ制御が低下する可能性がある。一実施形態では、強度変化を小さくするとともにスラグ制御を改善するために、変性温度を下げることができる。非限定的な一実施形態では、変性温度は９０℃以下に下げることができる。必要とされる正確な変性温度は、アッセイに依存し、当業者に自明であるように日常的な実験（又は理論計算）によって求めることができる。別の態様では、試料は、高温（例えば、９５℃）の一期間で「高温開始」して、長鎖核酸（ヒトゲノムＤＮＡ等）を分離してから、第２のより低い変性温度（例えば、９０℃）を用いてＰＣＲサイクルを進めることができる。一実施形態では、「高温開始」は、約３０秒〜約６０秒間に適用され、試料が個々のスラグに形成される前に適用され得る。代替的に、「高温開始」は、試料がスラグに形成された後で適用されてもよい。スラグが形成された後でそのような「高温開始」を用いる結果、温度が一定であり、急変化しないため、画像制御に問題が生じない。より低い変性温度は、幾つかの実施形態では持続時間が非常に短いものとなり得る。幾つかの実施形態では、瞬時の変性で十分であり得る。他の実施形態では、特定の非限定的な例の変性持続時間として、約３秒、約２秒、約１秒、約０．５秒及び約０．２５秒を挙げることができる。

他の非限定的な実施形態では、アニーリング温度及び伸長温度も変更する結果、（生物学的制限及び熱力学的制限内で）強度変化を小さくすることができる。当業者は、そのような変更の制限を容易に理解し、日常的な実験又は計算のみによってそのような変更を行うことができるであろう。アニーリング温度／伸長温度を調整することにより、上述した２ステップＰＣＲプロセスと同様の結果を生むことを可能にすることができる。例えば、一実施形態では、アニーリング温度（ＰＣＲプロセスにおいて用いる３つの温度のうちで最も低い場合が多い）を伸長温度により近くなるように上昇させることができる。これにより、より多くのスラグ制御画像を同様の温度で収集することが可能になり、そのため、温度に起因する強度変化が小さくなる。代替的な実施形態では、伸長温度をアニーリング温度により近くなるように低下させることができる。アニーリングステップ及び／又は伸長ステップの持続時間は、当業者に自明であるように「非理想的な」温度でのより低い活性又はより低い特異性を考慮するように変更（例えば延長）する必要があり得る。例えば、９５℃／５５℃／７２℃の通常のＰＣＲプロトコルを、より高いアニーリング温度（９５℃／６０℃／７２℃）又はより低い伸長温度（９５℃／５５℃／６０℃）を有するように調整することができる。

別の非限定的な実施形態では、温度変化に比較的不感応なブランキングスラグ中に色素を含むことによって、スラグ制御を熱循環時に実現することができる。試料スラグは、温度依存性色素を依然として含有することができる。温度依存性が低い色素の例として、フルオレセイン（正：Fluorescein）、ＨＰＴＳ、ローダミンＢ、スルホローダミン、キトンレッド、テキサスレッド、フロキシンＢ、ＬＤＳ６９８、１−４ＤＨＰＮが挙げられる。温度変化に比較的不感応な蛍光色素の更なる特徴が、「Dual emission laser induced fluorescence for direct planar scalar behavior measurements」（J. Coppetta and B. Rogers著、Experiments in Fluids Vol. 25 (1998)）に記載されており、この文献は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。幾つかの実施形態では、温度不感応性色素もまた光退色しにくい。さらに、好ましい実施形態では、ブランキング色素は、試験材料及び試料材料と化学的に適合性がある（例えば、これらの色素はＰＣＲ、又はそのような素子が用いられる任意の他の反応に影響を及ぼさない）。１つのそのような色素であるスルホローダミン１０１の温度依存性及び光退色特性が、図６及び図７に示されている。図６は、２０℃〜９０℃の３つの温度サイクルにわたって、２５μｇ／ｍｌのスルホローダミン１０１を含有する例示的なスラグの蛍光と、１０μｇ／ｍｌの同じ色素を含有する第２のスラグの蛍光とを示す。その温度範囲にわたって、１０μｇ／ｍｌ試料の場合では蛍光強度は約１１％だけ変化し、２５μｇ／ｍｌ試料の場合では蛍光強度は約５％だけ変化する。したがって、図６は、スルホローダミン１０１が温度変化に比較的不感応な蛍光色素であることを示す。同様に、図７は、０．１Ａ給電ＬＥＤ（５８５／４０フィルターで５９１ｎｍ）への曝露時に１０μｇ／ｍｌのスルホローダミン１０１試料溶液のグラフを示す。この例では、８００秒の期間にわたって、試料中の色素の蛍光は３％だけ減少し、このことはスルホローダミン１０１が耐光退色性であることを示す。

図３Ａ及びプロセス３００を再び参照すると、ステップ３０４において、スラグの画像を取得する。幾つかの実施形態では、ステップ３０４は、検出装置２２２からマイクロ流体チップ１００の画像を取得するＰＣＲゾーン流量監視システム２１８、又は、測定装置２３６からマイクロ流体チップ１００の画像を取得する蛍光測定システム２３２によって行うことができる。非限定的な一実施形態では、画像システムは、デジタル一眼レフ（ＤＳＬＲ）カメラを含み得る。非限定的な例では、ＤＳＬＲカメラは、Canon社の５ＤＭｋＩＩとすることができる。幾つかの実施形態において用いることができる他のＤＳＬＲカメラとして、Canon社のＥＯＳ−１Ｄ Ｍａｒｋ ＩＩＩ、Canon社のＥＯＳ−１Ｄ Ｍａｒｋ ＩＶ又は他のＤＳＬＲカメラが挙げられる。

幾つかの実施形態では、画像システム（imaging system）は、例えばライブビュー機能を用いて静止画（single frame）モード（ＪＰＥＧ又はＲＡＷモード）又は動画モードで動作することができる。幾つかの実施形態では、ＤＳＬＲカメラが提供するデジタルズームを用いて、流量制御のために１つのズーム位置又は画像位置を、また、リアルタイムでのＰＣＲ分析又は熱融解分析等の機能分析を行うために別のズーム位置又は画像位置を提供することができる。

図８は、プロセス３００のステップ３０４において取得することができる、非限定的な例の画像８００を示す。画像８００は、例えばマイクロ流体チャネル１０２のようなチャネルを通って移動中のスラグ（例えばブランキングスラグ４０２）の蛍光を示す。

幾つかの実施形態では、蛍光色素は特定の光波長で蛍光を発することができる。この波長は、任意の領域の電磁スペクトル内のものとすることができるが、上述の画像システムによって検出又は処理することができる領域の電磁スペクトル（例えば、可視スペクトル）内のものであることが好ましい。スラグの特定を容易にするために、或る範囲の波長を含む画像（例えば、フルカラー画像）を、特定の波長範囲においてのみ蛍光を表す、狭帯域の波長を含む画像（例えば、単色画像又はグレースケール画像）に変換することができる。例えば、赤色周波数で強く蛍光する色素を用いる実施形態では、フルカラー２４ビットＲＧＢ画像を、そのＲＧＢ画像の赤色平面のみを用いて８ビットグレースケール画像に変換することができる。

画像８００はまた、各マイクロ流体チャネルにおけるスラグのＲＯＩ８０６を示す。図８の例示的な実施形態では、８つのマイクロ流体チャネルに対応するＲＯＩが示されているが、それらのチャネルのうちの４つのみが蛍光を発するスラグを含有している。各ＲＯＩ８０６の中心８０８が、例えば、ブランキングスラグ４０２の前縁等の、それぞれのスラグの対象位置（target position：標的位置）と位置合わせされている。さらに、図８の非限定的な例では、各ＲＯＩには、ＲＯＩ内の最大強度及び／又は最小強度を示す符号８１０を付すことができる。

幾つかの実施形態では、ＲＯＩサイズ及び対象位置はスラグの所望のサイズに基づいて決まる。好ましくは、ＲＯＩは、実施形態によっては２つ以上のスラグを含むＲＯＩが制御システムを「トリッキング」して間違ったスラグを制御する可能性があるため、２つ以上のスラグを含むほど大きくはないものとする。

図９は、プロセス３００のステップ３０４に従って取得された画像の別の非限定的な例を示す。特に、図９は、上部マイクロチャネル９０２にブランキング色素が充填されている画像９００を示し、上部９０３から６番目のマイクロチャネルは空になっている。画像９００は、１．５アンペアの電流によって給電される１つの赤色励起源と２．１アンペアの電流によって給電される１つの青色励起源とを用いて、２５℃の温度で取得した。この例では、残りの６つのチャネルは、３つのブランキングスラグ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７による）及び３つの試料スラグ（ＬＣＧｒｅｅｎによる）を示す。図９に示されている例では、前述した飽和法を適用して、ＰＣＲゾーン及び熱融解ゾーンの双方において熱循環するスラグを制御する。

図１０は、図９に示されているチャネルのうちの１つに沿ったスラグの強度プロファイルを示す。図１０に示されているように、ブランキングスラグの赤色蛍光によりセンサーが飽和している（すなわち、赤色蛍光の量が、最も高い検出可能な値である２５５を超えている）。

図３Ａ及びプロセス３００を再び参照すると、ステップ３０６において、１つ又は複数の信号処理技術を画像８００のＲＯＩ８０６等のＲＯＩに適用して、各ＲＯＩ内におけるスラグ４０２の可視性を高めることができる。

非限定的な一実施形態では、ステップ３０６における信号処理は正規化プロセスを含む。正規化プロセスの実施形態は、ＲＯＩにおいて観察される考えられ得る範囲の値に基づいて、閾値強度値等の閾値をスケーリングすることを含む。幾つかの実施形態では、この値は、対象領域内で観察される考えられ得る強度範囲に基づいた閾値強度値とすることができる。幾つかの実施形態は、ＲＯＩに対応する、ステップ３０４において取得された画像の画素の蛍光強度値を分析し、ＲＯＩのピーク強度を求め、次いで、そのピーク強度をセンサーの最大強度にするのに必要とされるスケーリング係数Ｓを求める（例えば、８ビット画像では、ＲＯＩの最大強度を２５５までスケーリングするのに必要とされるスケーリング係数Ｓを求める）ことによって実施することができる。幾つかの実施形態では、スケーリング係数Ｓは、ＲＯＩにおいて観察される最大強度でセンサーの最大強度（例えば、８ビットセンサーでは２５５）を除算することによって求めることができる。正規化プロセスは次いで、対象領域全体における強度値をスケーリングし、その後、閾値強度を用いて対象領域内のスラグの縁を求めることができる。

幾つかの実施形態では、閾値強度値はユーザーが設定することができる。これらの実施形態では、ユーザーは、閾値強度値の絶対値を選択することができるか、又は、相対強度値を選択することもでき、相対強度値は例えば、最大強度の或るパーセンテージとすることができる。例えば、最大強度の或るパーセンテージである相対強度値をユーザーが設定する実施形態において、ユーザーがソフトウェアにおいて５０％の閾値を設定する場合、閾値強度は（８ビットシステムでは）１２７となり、その閾値と画素が交わる（すなわち、１２７を下回る値から１２７を上回る値に画素が遷移する）場所でスラグの縁が検出される。正規化プロセスの結果、閾値強度を用いても、スラグの蛍光の絶対強度が変化する（例えば、熱循環により励起パワーが増大する等）にもかかわらずプロセスは影響を受けない。幾つかの実施形態では、閾値が境界判定に過度に影響を及ぼさないように、（例えば、８ビットセンサーシステムにおいて初期の強度値が２５５を超えなければ）非正規化強度値は飽和しないことが好ましい。幾つかの実施形態では、閾値検出方法によってＲＯＩにおいて特定される粒子を、（幾つかの非限定的な例では、ローパス空間フィルター又はノイズ低減フィルターを使用することによって）フィルタリングして、ＲＯＩの縁を平滑化することができ、これにより、塵埃又は他の画像アーチファクトを無視することによってスラグ制御を容易にすることができる。

別の実施形態では、正規化方法はまた、最大強度をスケーリングすることの代替として、又は最大強度をスケーリングすることに加えて、最小強度をスケーリングすることを含むことができる。この場合、ＲＯＩにおいて観察された最大強度と最小強度との間のスパンからスケーリング係数Ｓを計算することができる。この実施形態では、ＲＯＩは、マイクロ流体チャネルに関わる情報（例えば、ＲＯＩがマイクロチャネルの外側のエリアに対応する暗画素を排除するようなサイズになっていること、又は明画素がマイクロ流体チップ上の塵埃によって生じていること）を含むことが好ましい。

さらに、幾つかの実施形態では、制御システム（例えば、システム２００）を、最小スパンがＲＯＩ内にあることを確かめるためにＲＯＩ内の強度スパン（span of intensities）を確認するように構成することができる。この機能は、スラグ制御画像システムが正規化によって「トリッキング」されないことを確実にすることができるため、スラグ縁がＲＯＩ内にあるかどうかを判断するのに有用である。

別の非限定的な実施形態では、正規化は、ＲＯＩの最大強度値を求めるためにＲＯＩの明画素の平均値と、ＲＯＩの最小強度値を求めるためにＲＯＩの暗画素の平均値とを用いることができる。これは例えば、一定の画素数（例えば、平均強度の最も明るい１０画素）を用いるか又はヒストグラムのような強度分布を用いて実施することができる。例えば、強度のヒストグラムを作成することができ、正規化のための最大強度値は明画素の最頻値又は中央値であり得る。逆に、正規化のための最小強度値は暗画素の最頻値又は中央値であり得る。

別の実施形態では、正規化は、最大強度値及び最小強度値を求める目的から対象領域外のエリアを含むことができる。これは、スラグが対象領域よりも小さい場合に好ましいものであり得る。別の実施形態では、正規化は強度値の最大偏差及び標準偏差を用いて適切な閾値を求めることができる。別の非限定的な例では、正規化法は、自動２値化機能を含むNational Instruments社のＬａｂｖｉｅｗソフトウェアを使用することができる。

非限定的な実施形態では、ステップ３０６における信号処理はカラー２値化プロセスを含むことができる。すなわち、幾つかの実施形態では、スラグは、ステップ３０４において取得された画像の２つ以上のカラー平面を用いて縁又はスラグ位置を求めることによって制御することができる。これらの機能部を含む実施形態は、隣接するスラグに用いられているカラーが画像システムに起因して同様であるか又は同様に見える場合（例えば、クロストークの場合）に有用であり得る。National Instruments社のＬａｂｖｉｅｗソフトウェアは、幾つかの実施形態に適切であり得るカラー２値化機能を含む。

更なる実施形態では、他の２値化方法は、ヒストグラム（又は画素強度値の他の計算）を作成し、２つの母集団（例えば、１つはスラグの部分ではない暗画素、１つはスラグの部分である明画素）の画素強度を求め、かつ２つの母集団間の一点（例えば、各母集団の平均画素値間の中途）における閾値を設定することを伴い得る。

別の実施形態では、カラー２値化方法は、２つのカラープレーン（例えば、図９における青色及び赤色）を用いて、スラグ位置の２つの測度、すなわち、試料スラグ（例えば、青色のスラグ）の位置に基づいた測度と、ブランキングスラグ（例えば、赤色のスラグ）の位置に基づいた測度とを得ることを伴い得る。スラグ位置の２つの測度を得ることは、２つの測度を平均化してスラグ位置の最良推定値を求めることができるとともに、２つの測度がスラグ位置に関連した誤差の推定値を与えるため、有利である。スラグ中のＬＣＧｒｅｅｎ色素（この色素は、画像処理システムが緑色の画素及び青色の画素の双方として認識することができる波長で蛍光を発する）を用いる非限定的な実施形態では、青色のカラープレーン及び緑色のカラープレーンを用いて、ＬＣＧｒｅｅｎ色素によりスラグの位置を求めることができる（すなわち、平均化を用いることができる）。実施形態によっては３つ以上のカラープレーンを用いることができる。非限定的な例では、赤色プレーンを用いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７スラグを測定することができ、青色プレーン及び緑色プレーンの双方を用いて、隣接するＬＣＧｒｅｅｎスラグを測定することができる。

そのようなカラー２値化プロセスが有用であり得る場合の非限定的な一例では、試料スラグは主に、色が青色及び緑色の蛍光を発し得るが、赤色の蛍光を発する成分も有し得る。他方で、試料スラグに隣接しているか又は試料スラグの近くのブランキングスラグは主に、赤色の蛍光を発し得るが、幾らか青色成分及び緑色成分の蛍光も発し得る。この場合、ブランキングスラグ及び試料スラグの双方は、各カラープレーンで（例えば、赤色波長、緑色波長及び青色波長のそれぞれで）少なくとも部分的に蛍光を発する。そのような場合は通常、例えばどのスラグが赤色のブランキングスラグであるかをコントローラーが区別することが困難であるため、制御することが困難であろう。幾つかの実施形態では、流量条件及び熱循環条件下でこの困難が増す可能性がある。カラー２値化を適用すれば、試料スラグは、青色の最小値及び／又は緑色の最小値を特定する（specify：規定する）ことによって見つけることができる。さらに、試料スラグは、赤色の最大値を有するように特定することもできる。ブランキングスラグは、赤色の最小値及び／又は青色の最大値及び／又は緑色の最大値を特定することによって見つけることができる。このようにして、全てのカラー情報が用いられ、コントローラーが２つのタイプのスラグを容易に区別することができる。ブランキングスラグと試料スラグとを識別するための特定のカラーの組合せは、特定の実施形態（例えば、どの色素をブランキングスラグ及び試料スラグに用いるか）に応じて決まる。幾つかの実施形態では、この方法は、様々なスラグタイプ（例えば、ブランク、試料Ａ、試料Ｂ等）同士間を見分けるように伸展させることができる。

非限定的な実施形態では、ステップ３０６における信号処理は、温度に基づく強度補正を含む。幾つかの実施形態では、ソフトウェア又は特別に構成されたハードウェアを使用して、システム温度を用いて観察された蛍光強度を補正することができる。この実施形態では、物理的な蛍光強度を（例えば上述した光変調によって）直接操作する必要はない。そうではなく、観察された蛍光強度を測定された温度の関数としてスケーリングすることで、概ね不感温性の蛍光強度を得ることができる。別の実施形態では、閾値は、測定された温度、すなわち分かっている温度に応じて変わり得る。

図３Ａを再び参照すると、ステップ３０８において、スラグの位置を各ＲＯＩ内で特定する。幾つかの実施形態では、ステップ３０８は、各ＲＯＩ内のスラグの、中心の位置、縁の位置又は他の特徴部の位置を特定することを含むことができる。

非限定的な実施形態では、ステップ３０８は、スラグの熱膨張の計算を含む。幾つかの実施形態では、試料液及びブランキング液が、熱循環時、又はそれらの液の濃度(density)変化に起因する他の温度変化時に膨張及び収縮する。一実施形態では、この膨張及び収縮の大きさは、チャネルの断面が一定であるものとする以下の関係式：
に基づいて予測することができる。式１では、ｌ_１は、第１の温度におけるスラグの長さであり、ρ_１は、第１の温度におけるスラグの濃度であり、ρ_２は、第２の温度におけるスラグの濃度であり、Δｌは、第１の温度と第２の温度との間におけるスラグの長さの変化である。非限定的な一例では、加熱は、長さが１４．７５ｍｍであるＰＣＲゾーンに限られ、そのＰＣＲゾーン内のスラグが、５５℃〜９５℃に加熱されると約３６０ミクロン膨張し得る。別の非限定的な例では、加熱は、長さが４．６５ｍｍである熱融解分析ゾーンに限られ、スラグが、６５℃〜９５℃に加熱されると９０ミクロン膨張し得る。第１の温度及び第２の温度におけるスラグの濃度は、スラグを形成するのに用いられる溶媒（例えば、水）の濃度が温度とともに変化することから推定することができる。ここでも同様に、これらのサイズ及び機能ゾーンは、スラグの長さが加熱時にどの程度膨張し得るかを説明するものとして用いられるにすぎず、限定的であることを意図するものではない。

幾つかの実施形態では、膨張する場所は、スラグ縁が熱制御素子（複数の場合もある）に対して制御される場所に関連し得る。例えば、制御位置がＰＣＲゾーンの中心にある場合、膨張は、制御位置の左右両側に均一に分布する（すなわち、膨張は、熱制御素子に沿って分布する）。代替的には、制御位置がＰＣＲゾーンの左側にある場合、膨張は主に、右側で起こる（すなわち、膨張は主に、熱制御素子によって加熱されたＰＣＲゾーンに生じる）。一実施形態では、スラグ制御システムは、ＰＣＲ熱循環等の任意の随伴性熱循環よりもはるかに速い頻度で更新される。

別の実施形態では、スラグの熱膨張を用いてスラグをより良好に制御する。想定されるスラグの熱膨張を計算及び使用することによって、熱膨張に対するシステムの応答を最小限に抑える適切なスラグ検出アルゴリズムを設計することができる。例えば、均一に加熱されるスラグ（例えば、被加熱ゾーンにわたってセンタリングされるスラグ）はその中心が膨張する。したがって、幾つかの実施形態では、スラグの中心をコントローラーが熱膨張に応答しないようにトラッキングすることができる。別の実施形態では、スラグの中心の対向する両側の２つ以上の地点をそれらの平均位置が被加熱ゾーンの中心を表すようにトラッキングすることができるであろう。このようにして、スラグ制御は、等しい量の膨張が両方向で起こる（すなわち、２つの縁が互いから離れることが観察される際に左側への膨張が右側への膨張を無効にし、そのため、２つの縁の平均的な位置は動かない）ため、熱膨張を追随しようとはしない。

幾つかの実施形態では、スラグの中心をトラッキングすることは、強度がどの程度変化するかにかかわらずスラグの中心を特定可能である（すなわち、中心は、温度変化に起因する強度変化にロバスト性がある）ため、好ましい。幾つかの実施形態では、スラグのサイズに対して大きいＲＯＩを用いて、スラグの中心（比較的小さいものであり得る）をトラッキングすることができる。

図３Ａ及びプロセス３００を再び参照すると、非限定的な実施形態では、ステップ３０８は、閾値検出ではなく、例えば、テンプレートを用いて相互相関及び共分散を計算するような、相関法（correlation methods）を含むことができる。相互相関を用いてスラグ境界を求める利点は、閾値法におけるよりも多くの画像情報を用いることができる点である。この方法を用いて、スラグの縁又はスラグ全体を検出することができる。非限定的な一実施形態では、単純な２値画像（一方の側が黒色、他方が白色）を用いてスラグの縁を検出する。テンプレートの黒色側から白色側への遷移がスラグ縁を表す。その場合、黒色／白色のテンプレート画像がスラグ画像と相互相関して、スラグ縁の場所（すなわち、テンプレートとＲＯＩ画像データとの相関が最大又は最小となる位置）を求める。

相互相関のためのそのような方法の一例は、より大きい画像内のより小さい画像（例えば、テンプレート）を検出するための２次元の正規化相互相関（すなわち、画像パターンマッチングである。一実施形態では、テンプレート画像は、２つの暗領域間に１つの明領域を含み、代替的には、２つの暗領域間に１つの輝領域を含んでもよい。そのようなテンプレート画像の使用は、非スラグからスラグへの、又はその逆に、スラグから非スラグへの輝度の変化度にロバスト性があり得る。そのようなテンプレート画像の使用は、実施形態によっては、強度閾値を選択する必要性を省くことができ、したがって、光源強度の変化にロバスト性があるものとすることができる。一連の画像内の複数の移動物体をトラッキングする別の方法として、B. D. Lucas及びT. Kanade著の「An iterative image registration technique with an application to stereo vision」（Proceedings of Imaging Understanding Workshop（121-130 (1981)）、並びに、Bruce D. Lucas著の「Generalized Image Matching by the Method of Differences」（博士論文）（技術報告書、Robotics Institute, Carnegie Mellon University(July, 1984)）に記載されているＬｕｃａｓ−Ｋａｎａｄｅ法を挙げることができ、上記文献はいずれもその全体が、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。一連の画像内の複数の移動オブジェクトをトラッキングする別の例は、B.K.P. Horn及びB.G. Schunck著の「Determining optical flow」（17 Artificial Intelligence（185-203 (1981)）（その全体が、引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているＨｏｒｎ−Ｓｃｈｕｎｃｋ法である。幾つかの実施形態では、２つ以上のスラグを相関させて用いることができる。例えば、図１１に示されているようなテンプレート画像１１００を用いてスラグの中心を制御することができるであろう。図１１は、２つの黒色領域が白色領域を囲んでいる画像であり、その画像とスラグの画像との相関が最大である場所を求めることによって、スラグの画像内における明−暗−明の遷移、したがって、スラグ自体の場所を検出することができる。

別の実施形態では、スラグの長さが可変であるか又は分かっていない場合、半／半テンプレートを使用することができる。そのような半／半テンプレートの画像は、実施形態によっては、半分が明るく半分が暗いものとすることができ、すなわち、テンプレートの半分が暗領域であり、テンプレートの半分が明領域である。各テンプレート領域の長さは、特定される各スラグの想定される最短の長さであるものとする。例示的なテンプレートでは、左半分が黒色、右半分が白色、又はその逆に、左半分が白色、右半分が黒色とすることができる。テンプレートは、マイクロ流体チャネルの全長の画像に対して相互相関している場合、負の値と値との間に相互相関値を生成することができる。相互相関値が１に近い場合、システムは、スラグの左縁が見つかったと判断することができ、相互相関値が−１に近い場合は常に、システムは、右縁が見つかったと判断することができる。そのようなテンプレート画像と画像の相互相関とを用いて、複数のスラグの縁をシステムによって見つけることができる。テンプレートの左半分が白色であり、右半分が黒色である場合、相互相関ベクトルの符号は逆になり得るが、動作原理は同じままである。１つ又は複数のスラグの中間は、それぞれ検出された左縁及び右縁の中点をとることによって見つけることができる。正規化相互相関を用いて複数のスラグを検出するために、非限定的な一実施形態では、２つの画像、すなわち、より小さい画像及びより大きい画像を用いることができる。非限定的な例では、より小さい画像は半分が黒色／半分が白色の画像とすることができ、その場合、特定の明領域又は暗領域の長さは、単一のスラグの想定される最短の長さであり、より大きい画像は、上述したようにマイクロ流体チャネル全体又はＲＯＩ内の長さとすることができる。

図３Ａを再び参照すると、各スラグ４０２の現在位置を求めた後、プロセス３００のステップ３１０において、各スラグ４０２を所望の標的位置に移動させることができる。幾つかの実施形態では、ステップ３０２〜３１０を規定測度（例えば、１Ｈｚ）で繰り返して、スラグの移動のための閉ループ制御システムのための十分なフィードバックを供給することができる。例えば、幾つかの実施形態では、流量コントローラー２０８が、比例−積分−微分（「ＰＩＤ」）制御方式を用いて、所望の標的位置にスラグを駆動するようにポンプに命令することができる。当業者は、用途に応じてＰＩＤ制御の代替制御方式を用いることもできることが理解するであろう。しかしながら、任意の適切な制御方式が本発明と併せて有用であるものとすることができ、例えば、幾つかの実施形態では、ＯＮ／ＯＦＦ制御方式を用いることができる。

幾つかの非限定的な実施形態では、スラグの制御は、スラグの見かけの動きへのシステムの応答を増減することによって変えることができる。一実施形態では、これは、熱サイクル又は熱加熱パターン（例えば、ＰＣＲ熱サイクル）における種々のステップのＰＩＤ制御パラメーターを調整することを含むことができる。例えば、大きい温度変化時にゲインを減らすことができる。別の実施形態では、温度によってはその間、スラグの制御をオフにすることができる。これは、極端な温度、又は短期間維持される温度において好ましいであろう。例えば、迅速なＰＣＲ法では、変性ステップは非常に短いものとすることができる。そのように短い変性ステップの間、スラグのいかなる制御も試行しないようにすることが望ましいであろう。幾つかの実施形態では、これは、反応のこれらの部分の間、画像制御システムによって画像を取得しないことも含み得る。代替的には、これらの部分の間、試料の蛍光を引き出すのに使用される光源をオフにすることができる。

幾つかの実施形態では、制御システムは、ブランキングスラグの前縁の保持と後縁の保持とを交互に行うことによって、マイクロチャネル１０２に沿ってスラグ４０２を移動させる。この交互プロセスにより、「スラグ列」を形成する一連のスラグを制御することができる。幾つかの実施形態では、ＲＯＩ４０６を定常速度で進ませて、チャネル１０２に沿ってスラグ４０２とともにスムーズに移動させる。さらに、幾つかの好ましい実施形態では、各チャネル１０２についての制御プロセスは並行して行うことができる。

幾つかの場合では、本発明の方法の幾つかの態様に用いることができる色素は、温度依存性が強いものであり得る。温度依存性が強い色素の場合、そのような色素における温度により蛍光が減少する傾向があるため、高温で蛍光を測定する場合に或る特定の誤差がもたらされる可能性がある。図１２は、Ａｌｅｘａ ｒｅｄ色素及びＬＣＧｒｅｅｎ色素の場合の、温度の関数としての蛍光強度（すなわち、Ｆ対Ｔ）のプロットである。図１２に示されているように、これらの色素の蛍光は、ＰＣＲ増幅及び熱融解分析に通常用いられる温度範囲に対して２倍以上変化することができる。色素は一般に、加熱されるとその蛍光強度を失い、冷却されると蛍光強度を得る傾向がある。或る特定の高温用途（例えば、ＰＣＲ）では、（例えば、ＰＣＲの変性ステップ時に）高温でスラグの蛍光を測定する必要がある場合がある。幾つかの実施形態では、（例えば、図１２のグラフに表されているようなデータセットを用いて）より低い温度での色素の蛍光と色素の温度との関数関係を導くことによって、また、その関係をより高い温度に外挿することによって、高温での蛍光の減少を考慮することができる。

本発明の別の態様は、マイクロ流体装置内の、ブランキングスラグによって囲まれている試料スラグの位置を制御する方法を含むことができる。一実施形態では、本方法は、蛍光色素を含む第１のブランキングスラグと、蛍光色素を含む第２のブランキングスラグとを準備することであって、第１のブランキングスラグ及び第２のブランキングスラグは試料スラグを囲む、準備することと、第１のブランキングスラグ及び第２のブランキングスラグ中の蛍光色素を励起することと、第１のブランキングスラグ及び第２のブランキングスラグ並びに試料スラグの画像を取得することであって、画像は第１のブランキングスラグ及び第２のブランキングスラグの蛍光を捕捉する、取得することと、画像の対象領域からのデータを処理することと、処理した画像データから、対象領域内の試料スラグの位置を特定することと、試料スラグの特定した位置に基づいて、試料スラグの位置を制御することとを含むことができる。更なる実施形態では、試料スラグは蛍光色素をほとんど含有しないか又は全く含有しないものとすることができる。代替的に、試料スラグは、第１の波長で蛍光を発する色素を含有してもよく、第１の試料スラグ及び第２の試料スラグはそれぞれ、第２の波長で蛍光を発する色素を含有してもよく、第１の波長及び第２の波長は異なる。

代替的には、本発明の別の態様は、マイクロ流体装置内の試料スラグの位置を制御する方法であって、蛍光色素を含むブランキングスラグを準備することであって、ブランキングスラグは試料スラグとの境界面を有する、準備することと、ブランキングスラグ中の蛍光色素を励起することと、ブランキングスラグの少なくとも一部及び試料スラグの少なくとも一部の画像を取得することと、画像内の対象領域からのデータを処理することと、処理した画像データから、対象領域内の試料スラグの位置を特定することと、試料スラグの特定した位置に基づいて試料スラグの位置を制御することとを含む、マイクロ流体装置内の試料スラグの位置を制御する方法を含むことができる。

試料スラグをトラッキングするこれらの方法の実施形態は、図３Ｂと併せて説明することができる。一実施形態の方法３０１では、ステップ３０２は、マイクロ流体チャネル１０２のようなマイクロ流体装置内の試料スラグ４０４を囲む一方又は双方のブランキングスラグ４０２中の蛍光を励起することを含むことができる。更なる実施形態では、ステップ３０２は、試料スラグ中の蛍光を励起しないことを含むことができる。これは、試料スラグ中に蛍光色素をほとんど含まないか又は全く含まないことによって達成することができる。代替的な実施形態では、本方法は、試料スラグ中に含有されている蛍光色素中の蛍光を刺激しない波長の光を用いて、一方又は双方のブランキングスラグ中の蛍光を励起することを含むことができる。別の実施形態では、試料スラグは、ブランキングスラグ中の色素が蛍光を発する光の波長とは著しくことなる波長の光の蛍光を発する蛍光色素を含有することができる。この実施形態では、検出器素子２２２又は２２６は、ブランキングスラグ中の色素が蛍光を発する波長の光だけを検出することができる。幾つかの実施形態では、マイクロ流体装置は、試料スラグに対するブランキングスラグからの蛍光を検出する検出器素子、又は、ブランキングスラグ中の色素及び試料スラグ中の色素中の蛍光を刺激する種々の光源を組み入れることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、試料スラグはチャネル内の暗い部分として表すことができる。

方法３０１のステップ３０５において、画像取得装置が、上述した画像取得方法を用いてチャネル内のブランキングスラグの画像を取得することができる。一実施形態では、試料スラグは、蛍光を発しているブランキングスラグ間に、又は蛍光を発しているブランキングスラグの隣に暗いスラグとして見える。これは、上述した方法により、ステップ３０２において、試料スラグ中の蛍光を刺激しないことによって達成することができる。代替的には、ステップ３０５において、ブランキングスラグの蛍光（試料スラグの蛍光ではない）の画像のみを取得してもよい。これは、ブランキングスラグの波長の蛍光のみを検出する画像検出システムを用いることによって達成することができ、これはここでも同様に、取得した画像内の２つの蛍光を発しているブランキングスラグ間の暗いスポットとして試料スラグを残すという効果を有する。代替的には、ステップ３０５は、試料スラグが、蛍光を発しているブランキングスラグの隣に暗領域として見える、少なくとも一方のブランキングスラグと試料スラグとの境界面を含む、ブランキングスラグのうちの一方の少なくとも一部及び試料スラグの少なくとも一部の画像を取得することによって行ってもよい。

方法３０１のステップ３０６において、画像信号を処理することができる。この実施形態では、信号処理は、本明細書において記載した正規化法、カラー２値化法及び温度依存性蛍光検出法等の、蛍光を発しているブランキングスラグ対暗い試料スラグの可視性を高める方法を含むことができる。ステップ３０８において、試料スラグの位置又はブランキングスラグの位置を検出することができる。試料スラグの位置を検出する場合、蛍光を発しているブランキングスラグ（複数の場合もある）に対して暗い試料スラグの中心又は縁を、上述した方法を用いて検出することができる。代替的には、暗い試料スラグの中心は上述した方法を用いて検出してもよい。画像が、少なくとも一方のブランキングスラグと試料スラグとの境界面を含む、ブランキングスラグのうちの一方の少なくとも一部及び試料スラグの少なくとも一部を含む例では、ステップ３０８は、境界面を検出することと、その境界面をスラグの一方の縁として画定することとを含むことができ、また、その縁をトラッキングすることも含むことができる。最後に、ステップ３１０において、試料スラグの位置を、本出願において前述したスラグ位置を制御する方法のいずれかを用いて、制御することができる。

他の態様では、本発明は、マイクロ流体装置内のスラグの位置を制御するシステムを含むことができる。本システムは、１つ又は複数の流体チャネルを備えるマイクロ流体装置を含むことができる。そのようなマイクロ流体装置の一例は、図１に示されている装置１００であるが、当業者は、本システムは１つ又は複数のチャネルを備える任意のマイクロ流体装置を含むことができることを理解するであろう。本システムはまた、1つ又は複数の流体チャネル内に１つ又は複数のスラグを含むことができる。それらのスラグは、実施形態によっては、試料スラグ４０４、ブランキングスラグ４０２、又は校正スラグ等の他の多様なスラグ、又はマイクロ流体チャネルと適宜併用することができる任意の他の多様なスラグを含むことができる。

本システムの態様は、マイクロ流体装置の少なくとも対象領域から光を捕捉するようになっている光検知ユニットを含むことができる。一実施形態では、この光検知ユニットは、フォトレジスター、デジタル一眼レフ（ＤＳＬＲ）カメラ又は他の光検知装置等の、光信号を受信するとともに、本システムの残りに用いる情報にそれらの光信号を変換するようになっている任意のセンサーとすることができる。幾つかの実施形態では、蛍光検出器２２２又は２３６は光検知ユニットとすることができる。蛍光検出器自体は、フォトレジスター、ＤＳＬＲカメラ等の、光信号を受信するとともに、本システムの残りに用いる情報にそれらの光信号を変換するようになっている任意のセンサーとすることができる。この光検知ユニットは、マイクロ流体装置から、スラグのうちの１つ又は複数を含む関心領域（ＲＯＩ）内の光（反射光、透過光、蛍光等であり得る）を捕捉することができる。

本システムは処理ユニットを更に備えることができる。この処理ユニットは、光検知ユニットから情報を受信するようになっているものとすることができ、好ましくは、そのような情報を位置特定ユニットに送信するようになっている。処理ユニットによって送信された処理された情報を用いて、ＲＯＩ内のスラグの位置を特定する。幾つかの実施形態では、処理ユニット及び位置特定ユニットの双方は、１つ又は複数の適切にプログラムされたコンピューターとすることができる。代替的には、処理ユニットは、光検知ユニットから信号を受信するとともに、そのような情報を、位置特定ユニットとして作用する適切にプログラムされたコンピューターに送信するようになっているか、又は、位置特定ユニットとして作用する適切に設計された回路に、処理された信号を送信するようになっている回路とすることができ、この回路は、マイクロ流体装置内のスラグの位置を特定するようになっている。

位置特定ユニットは、マイクロ流体装置内のスラグの位置を特定する際に有用な情報すなわち信号を作成することができる。位置特定ユニットは、スラグ制御ユニットと通信することができ、スラグ制御ユニットは、特定した位置に基づいてマイクロ流体装置内のスラグを位置決めするようになっている。スラグ制御ユニットは、マイクロ流体装置内のスラグ（単数又は複数）を移動させるようにマイクロ流体装置と動作可能に係合するスラグ移動装置と組み合わさった適切にプログラムされたコンピューター等の複数のコンポーネントを含むことができる。一実施形態では、スラグ移動装置は、マイクロ流体装置と動作可能に係合するポンプとすることができる。しかしながら、スラグ移動装置は、マイクロ流体装置と係合可能であるとともにマイクロ流体装置内のスラグを移動させることが可能な任意の装置とすることができ、その非限定的な例として、シリンジドライバー、ピペッター、蠕動ポンプ又は電気浸透システムが挙げられる。スラグ移動装置は、適切にプログラムされたコンピューターによって制御することができる。スラグ制御ユニットの適切にプログラムされたコンピューターは、位置特定ユニットから情報を受信するように設計されているとともに、スラグが適正に又は不適正に位置決めされたときを特定するようになっている比例−積分−微分制御アルゴリズムを含むことができる。スラグが不適正に位置決めされている場合、アルゴリズムは、マイクロ流体チャネル内のスラグを移動させるようにスラグ移動装置に命令することによってスラグを適正位置に移動させることができる。

一実施形態では、本システムは、１つ又は複数のスラグ内の１つ又は複数の蛍光色素を励起するようになっているスラグ励起装置を更に備えることができる。一実施形態では、スラグ励起装置は、図２に示されているスラグ励起装置２２０又は２３４とすることができる。別の実施形態では、スラグ励起装置は、スラグ内の蛍光色素に蛍光を発せさせるのに十分な強度及び適切な波長の光源とすることができる。その場合、スラグの蛍光は本システムの光検知ユニットによって検出することができる。

一実施形態では、本システムは、マイクロ流体装置内に熱素子を更に備えることができる。非限定的な一実施形態では、これらの熱素子はマイクロチャネル１０２と連通する加熱器１１２とすることができる。更なる実施形態では、本システムは、マイクロ流体装置内のスラグの温度を制御するように構成されている温度制御ユニットを備えることができる。非限定的な一実施形態では、この温度制御ユニットは、温度センサー２１４並びに加熱ユニット２１２及び冷却ユニット２１４と併せて動作することができるＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０を含むことができる。

一実施形態では、温度制御ユニットは、スラグを熱サイクルに供するように構成することができる。そのような熱サイクルの非限定的な一例は、第１の持続時間にわたる第１の温度での変性ステップと、第２の持続時間にわたる第２の温度でのアニーリングステップと、第３の持続時間にわたる第３の温度での伸長ステップとを含む。そのような熱サイクルの非限定的な一例は、持続時間が約１秒である変性ステップと、持続時間が約８秒であるアニーリングステップと、持続時間が約１秒である伸長ステップとを含む。これらのステップに関する温度及び時間は、本発明の他の態様を参照して説明される。

本発明の一実施形態では、変性ステップの持続時間は、画像の取得と取得との間の期間よりも短い持続時間である。代替的には、本発明の別の実施形態では、アニーリングステップの持続時間は、変性ステップの持続時間よりも長く、スラグ制御のために取得される画像の少なくとも一部は、アニーリングステップ時に取得される。

代替的な一実施形態では、伸長ステップの持続時間は、変性ステップの持続時間よりも長く、画像の少なくとも一部は、伸長ステップ時に取得される。

代替的には、本発明の一実施形態では、３ステップ熱サイクルを用いるのではなく、温度制御ユニットは、上記スラグを２ステップサイクルに供するように構成することができる。そのような２ステップサイクルは、第１の持続時間にわたる第１の温度での変性ステップと、第２の持続時間にわたる第２の温度でのアニーリング／伸長ステップとを含むことができる。温度及び時間はここでも同様に、本発明の他の態様を参照して説明される。

本発明の実施形態を、図面を参照して上記で十分に説明した。本発明は、これらの好ましい実施形態に基づいて説明されたが、或る特定の変更、変形、及び代替の構造を、本発明の趣旨及び範囲内で、説明された実施形態に対して実施できることが当業者には明らかであろう。

Claims (6)

1. マイクロ流体装置内の流体スラグの位置を制御する方法であって、
   前記マイクロ流体装置内に、第１の色素を含む第１のスラグを準備することと、
   前記マイクロ流体装置内に、第２の色素を含む第２のスラグを準備することと、
   前記マイクロ流体装置内の前記第１のスラグ及び前記第２のスラグの画像を取得することと、
   前記画像内の対象領域からのデータを処理することと、
   処理した前記データから、閾値条件を満たす画素を特定することによって前記対象領域内の前記第１のスラグと前記第２のスラグとの間の境界を特定することと、
   前記第１のスラグと前記第２のスラグとの間の特定した前記境界に基づいて、前記第１のスラグ及び前記第２のスラグの位置を制御することと、
   を含む、マイクロ流体装置内の流体スラグの位置を制御する方法。
2. 前記第１のスラグ又は前記第２のスラグのうちの一方は、処理及び／又は分析される生物学的試料を含有する試料スラグであり、前記第１のスラグ又は前記第２のスラグのうちの他方は、処理及び／又は分析される試料を含有しないブランキングスラグである、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の色素は、第１の光波長で蛍光を発する第１の蛍光色素であり、前記第２の色素は、第２の光波長で蛍光を発する第２の蛍光色素である、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１のスラグ中の前記第１の蛍光色素及び前記第２のスラグ中の前記第２の蛍光色素中の蛍光を励起するステップを更に含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記対象領域内の前記第１のスラグと前記第２のスラグとの間の前記境界を特定する前記ステップは、前記画像の第１の波長面及び前記画像の第２の波長面の閾値条件を満たす画素を特定することを含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記対象領域内の前記第１のスラグと前記第２のスラグとの間の前記境界を特定する前記ステップは、前記対象領域を所定のテンプレート画像と相互相関させることを含む、請求項５に記載の方法。