JP6495995B2

JP6495995B2 - 脂質粒子および核酸送達キャリア

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Publication number: JP6495995B2
Application number: JP2017212518A
Authority: JP
Inventors: 西川　尚之; 尚之西川; 大野　誠; 誠大野; 杉山　享; 享杉山; 岩木　義英; 義英岩木
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2019-04-03
Anticipated expiration: 2034-07-17
Also published as: JP2018024699A

Description

本発明は、脂質粒子およびその用途に関し、好適には核酸を細胞内に送達するのに有用な脂質粒子および核酸送達キャリアに関する。

核酸医薬は、疾患に対する作用機序が明確で、副作用も少なく、次世代の医薬品として記載されている。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いた核酸医薬は、細胞に存在する標的遺伝子のｍＲＮＡの分解を惹起し、標的遺伝子の発現を阻害することができる。その結果、特定の遺伝子または遺伝子群の異常な発現原因となって生じる疾患・症状を軽減または治療することができる。このようなＲＮＡ干渉を利用した核酸医薬においては、例えば、ｓｉＲＮＡなどの核酸が利用されるが、これらの核酸に機能を発現させるためには、核酸を細胞内に送達することが必要である。

核酸を細胞内に効果的に送達する方法として一般にキャリア（ベクター）が用いられる。キャリア（ベクター）には、ウイルス性キャリアと非ウイルス性キャリアが挙げられる。ウイルス性キャリアは、病原性、免疫原生および細胞毒性の安全性の面で不明点が多いため、安全性の観点から非ウイルス性キャリアの使用が望まれている。

非ウイルス性キャリアとしては、核酸がアニオン性であることから、静電相互作用により核酸を保持できるカチオン性キャリアが用いられる。カチオン性キャリアの例としては、特定構造のカチオン脂質を用いたカチオン性リポソームまたはカチオン性ポリマーを用いた複合体などが一般に知られている。

カチオン性リポソームの例としては、非特許文献１には、カチオン脂質とＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−３−ｓｎ−ホスファチジルエタノールアミン）とポリエチレングリコール脂質からなるリポソームが記載されている。また、特許文献１には、５０ｍｏｌ％から８５ｍｏｌ％のカチオン脂質を含む脂質粒子とともに、第一のカチオン脂質、第二のカチオン脂質、中性脂質、ポリエチレングリコール脂質からなる脂質粒子が記載されている。
さらに、カチオン性ポリマーを用いた複合体についても知られている（非特許文献２）。

また、カチオン脂質を用いたカチオン性キャリアの更なる改良手段として、例えば、特許文献２には、カチオン性脂質とアニオン性脂質を組み合わせた両性リポソームが記載され、特許文献３には両性の両親媒性脂質からなる両性リポソームが記載されている。

国際公開２０１２／０００１０４号パンフレット特開２０１１−２１０２６号公報特表２００５−５１７７３９号公報

ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．６，ｐ２７１，１９９９ＪｏｕｎａｌｏｆＣｏｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ１１４（２００６）ｐ１００−１０９

しかしながら、カチオン脂質を用いたキャリアは細胞毒性が強いものが多く、同様にカチオン性ポリマーを用いた複合体についても細胞毒性が問題であり、キャリアとしては満足のいくものではなかった。カチオン性キャリアの問題を解決する手段として、両性リポソームの検討がなされているが、まだ実用化には至っておらず、十分なものとはいえない。

本発明は、細胞毒性が低く、細胞外で核酸分子を安定に保持することができ、且つ、エンドソームから脱出して速やかに細胞質中で核酸を放出することができる脂質粒子、およびそれを用いた核酸送達キャリアを提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、下記一般式（１）：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、炭素数１０〜２２のアルキル基である）で表される化合物、ステロール、中性脂質及びポリエチレングリコール鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質、および核酸を含む脂質粒子によって、上記課題を解決した脂質粒子を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、課題を解決するための手段は以下の通りである。
［１］下記一般式（１）：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、炭素数１０〜２２のアルキル基である）で表される化合物、ステロール、中性脂質及びポリエチレングリコール鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質、および核酸を含む脂質粒子。
［２］一般式（１）で表される化合物の含有量が２０ｍｏｌ％〜６０ｍｏｌ％である、［１］に記載の脂質粒子。
［３］ステロ−ルの含有量が１０ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％である、［１］または［２］に記載の脂質粒子。
［４］中性脂質及びポリエチレングリコール鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質の含有量が３ｍｏｌ％〜５５ｍｏｌ％である、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の脂質粒子。
［５］ステロールがコレステロールである、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の脂質粒子。
［６］中性脂質がホスファチジルコリンである、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の脂質粒子。
［７］ポリエチレングリコール鎖を有する脂質がポリエチレングリコールで修飾したホスホエタノールアミンである、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の脂質粒子。
［８］下記一般式（１）：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、炭素数１０〜２２のアルキル基である）で表される化合物、ステロール、中性脂質及びポリエチレングリコール鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質、および核酸を含む核酸送達キャリア。

本発明の脂質粒子は、低い細胞毒性を有する。また、本発明の脂質粒子によれば、標的細胞内で効率よく核酸が放出され、非常に良好な薬効を得ることができる。

合成例１における化合物Ａの^１Ｈ−ＮＭＲの図である。合成例１における化合物ＡのＭＳスペクトルの図である。合成例２における化合物Ｂの^１Ｈ−ＮＭＲの図である。合成例２における化合物ＢのＭＳスペクトルの図である。

以下、本発明について詳細に説明する。
本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。

（１）脂質粒子の成分
本発明の脂質粒子は、下記一般式（１）：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、炭素数１０〜２２のアルキル基である）で表される化合物とともに、ステロール、中性脂質およびポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」と称する）鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質、および核酸を含む脂質粒子である。

［一般式（１）で表される化合物］
本発明の脂質粒子は、下記一般式（１）で表される化合物を脂質構成成分として含む。

式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、炭素数１０〜２２のアルキル基を意味し、好ましくは、炭素数１４〜１８のアルキル基であり、より好ましくはヘキサデシル基である。

一般式（１）で表される化合物は、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する。アミノ基は静電的な相互作用により核酸を強く保持することができる。また、イミダゾイル基は、低ｐＨでは、プロトン化して正電荷を有するようになる。したがって、一般式（１）で表される化合物を脂質粒子に導入することにより、脂質粒子と細胞膜またはエンドソーム膜との融合が容易に起こり、標的細胞内で核酸が放出されやすくなる。

一般式（１）で表される化合物は、特に限定されないが、例えば下記の方法により合成することができる。

式中、ＰＧは保護基を表し、Ｘは活性エステルを構成する脱離基を表す。Ｒ^１およびＲ^２は、上記と同様である。

すなわち、適切な保護基により保護されたヒスチジンの活性エステル（Ａ）と、アミン誘導体（Ｂ）を塩基存在下で反応させ、化合物（Ｃ）を得た後、適切な脱保護方法によって、一般式（１）で表される化合物を合成することができる。

ここで、ヒスチジンの活性エステル（Ａ）において使用できる保護基としては、例えば、Ｗ．グリーン（W.Greene）ら、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Protective Groups in Organic Synthesis）第4版、第255〜265頁、2007年、ジョン・ウィリイ・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons,INC.）に記載の保護基などが挙げられる。具体的には、Ｂｏｃ基（tert-ブトキシカルボニル基）、Ｚ基（ベンジルオキシカルボニル基）などが好ましい例として挙げられる。

使用できる活性エステルの例としては、フェニルエステル、トリフルオロフェニルエステル、ペンタフェニルエステル、ヒドロキシスクシンイミドエステルなどを挙げることができ、原料入手性または安定性の観点から、ヒドロキシスクシンイミドエステルが好ましい。

使用できる塩基としては、無機塩基、有機塩基を挙げることができる。無機塩基の例としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムなどを挙げることができ、有機塩基の例としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどを挙げることができる。使用する塩基は、反応に用いるヒスチジンの活性エステル（Ａ）の保護基によって、適切な塩基を用いることが好ましい。

使用できる溶媒としては、特に限定されないが、一般的な有機溶媒を用いることができる。具体的には、エーテル系溶剤、エステル系溶剤、アミド系溶剤、ハロゲン系溶剤を用いることができ、テトラヒドロフランなどのエーテル系溶剤、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン系溶剤が好ましい例として挙げられる。

使用できる脱保護反応としては、例えば、Ｗ．グリーン（W.Greene）ら、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Protective Groups in Organic Synthesis）第4版、第255〜265頁、2007年、ジョン・ウィリイ・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons,INC.）に記載の方法などが挙げられる。

本発明において、一般式（１）で表される化合物としては、式（２）で表される化合物（２−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル−３−（１Ｈ−イミダゾール−５−イル）プロパンアミド）［本明細書中において化合物Ａとも称する］を使用することがより好ましい。

本発明において、一般式（１）で表される化合物の配合量は、脂質粒子の脂質構成成分全量に対して１５ｍｏｌ％〜６０ｍｏｌ％であることが好ましく、２０ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％であるがより好ましい。

［ステロール］
本発明の脂質粒子はステロールを含む。ステロールは、膜流動性を低下させる特性を有するため、本発明の脂質粒子において膜の安定化剤として機能する。
本発明に用いられるステロールとしては、特に限定されないが、コレステロール、フィトステロール（シトステロール、スチグマステロール、フコステロール、スピナステロール、ブラシカステロールなど）、エルゴステロール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル−２’−ヒドロキシエチルエーテル。コレステリル−４’−ヒドロキシブチルエーテルなどを挙げることができる。
本発明において、ステロールの配合量は、脂質粒子の構成成分全量に対して１０ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％であることが好ましく、１５ｍｏｌ％〜３０ｍｏｌ％であることがより好ましい。

［中性脂質およびＰＥＧ鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質］
本発明の脂質粒子は、中性脂質およびＰＥＧ鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質を含む。本発明の脂質粒子では、中性脂質およびＰＥＧ鎖を有する脂質のうち少なくとも一方を含むことにより、本発明の効果を得ることができるが、中性脂質およびＰＥＧ鎖を有する脂質の両方を含むことが好ましい。両方の脂質を含むことで、脂質粒子に対するさらなる安定化効果が予想外にも得られる。

（中性脂質）
本発明に用いられる中性脂質としては、特に限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、セラミドなどが挙げられ、ホスファチジルコリンが好ましい。また、中性脂質としては、単独でも、複数の異なる中性脂質を組み合わせても良い。

ホスファチジルコリンとしては、特に限定されないが、大豆レシチン（ＳＰＣ）、水添大豆レシチン（ＨＳＰＣ）、卵黄レシチン（ＥＰＣ）、水添卵黄レシチン（ＥＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＣ）などが挙げられ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）が好ましい。これらの中でも、相転移温度の観点から、ホスファチジルコリンとしては、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）が好ましい。

ホスファチジルエタノールアミンとしては特に限定されないが、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬｏＰＥ）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ（Ｐｈｙ）ＰＥ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジテトラデシルホスファチジルエタノールアミン、ジヘキサデシルホスファチジルエタノールアミン、ジオクタデシルホスファチジルエタノールアミン、ジフィタニルホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。

スフィンゴミエリンとしては、特に限定されないが、卵黄由来スフィンゴミエリン、牛乳由来スフィンゴミエリンなどが挙げられる。
セラミドとしては、特に限定されないが、卵黄由来セラミド、牛乳由来セラミドなどが挙げられる。

（ＰＥＧ鎖を有する脂質）
本発明に用いられるＰＥＧ鎖を有する脂質としては、特に限定されないが、ＰＥＧ修飾ホスホエタノールアミン、ジアシルグリセロールＰＥＧ誘導体、ジアルキルグリセロールＰＥＧ誘導体、コレステロールＰＥＧ誘導体、セラミドＰＥＧ誘導体などが挙げられ、ＰＥＧ修飾ホスホエタノールアミンが好ましい。
ＰＥＧ鎖の重量平均分子量は、５００〜５０００が好ましく、７５０〜２０００がより好ましい。
ＰＥＧ鎖は分岐していてもよく、ヒドロキシメチル基のような置換基を有していてもよい。

本発明おいて、中性脂質およびＰＥＧ鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質の配合量は、脂質粒子の構成成分全量に対して３ｍｏｌ％〜５５ｍｏｌ％であることが好ましい。

［核酸］
本発明に用いられる核酸としては、公知の任意の形態の核酸が含まれる。核酸の具体例としては、一般的なＲＮＡ、ＤＮＡ、およびそれらの誘導体を挙げることができ、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡであってもよく、二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってもよい。本発明に用いることのできる核酸としては、具体的には、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、デコイ核酸、アプタマーなどを挙げることができる。本発明に用いられる核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡを使用することが好ましい。

本発明で用いられる核酸は、天然型に限定されるものではなく、ヌクレアーゼ耐性など、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成している糖またはリン酸バックボーンなどの少なくとも一部が修飾されているような非天然型であってもよい。
糖部が修飾されている非天然型核酸としては、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチルＲＮＡ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ核酸、架橋型核酸（ＬＮＡ／ＢＮＡ）などが挙げられる。また、糖部をペプチドに置き換えたペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノに置き換えたモルフォリノ核酸なども、非天然型核酸の一例として挙げることができる。
リン酸バックボーンが修飾されている非天然型核酸としては、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体などが挙げられる。

本発明において、核酸の配合量は、脂質粒子の構成成分全量に対してモル比で１：１０〜１：５０００であることが好ましく、１：１００〜１：１０００であることがより好ましい。

（２）脂質粒子
本発明において、脂質粒子とは、脂質から構成される粒子を意味し、特に限定されない。本発明の脂質粒子には、脂質二分子膜より構成される閉鎖小胞体であるラメラ構造を持つリポソームが含まれる。リポソームとしては、多重リポソーム（ＭＬＶ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）、巨大一枚膜リポソームなどの構造が知られているが、特に限定されるものではない。本発明の脂質粒子には、前述のリポソームのような脂質二分子膜構造（ラメラ構造）を持たない、粒子内部も構成成分が詰まった構造を持つ粒子も含まれる。

脂質形成の形態は、電子顕微鏡観察またはエックス線を用いた構造解析などにより確認できる。例えば、Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡観察（ＣｒｙｏＴＥＭ法）を用いた方法により、リポソームのように脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）および内水層を持つ構造、またはリポソームのように脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）および内水層を持たず粒子内部に電子密度が高いコアを持っていることから、脂質をはじめとする構成成分が詰まった構造を有していることを確認できる。エックス線小角散乱（ＳＡＸＳ）測定によっても、脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）の有無を確認できる。

本発明の脂質粒子の粒子径は特に限定されないが、好ましくは１０〜１０００ｎｍであり、より好ましくは５０〜５００ｎｍであり、さらに好ましくは７５〜３５０ｎｍである。脂質粒子の粒子径は、一般的な方法（例えば、動的光散乱法、レーザー回折法など）により測定することができる。

（３）脂質粒子の製造
本発明の脂質粒子は、下記一般式（１）：

（Ｒ^１およびＲ^２は、上記と同様である）で表される化合物、ステロール、および中性脂質およびＰＥＧ鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質、アルコール、およびエステルを含む油相を加熱溶解する工程（ａ）；
工程（ａ）で得た油相と、核酸を含む水相と、を混合する工程（ｂ）；
工程（ｂ）で得た油相および水相を含む混合液（以下、油相−水相混合液と称することがある）を冷却し、脂質粒子を晶出する工程（ｃ）；
工程（ｃ）で得られた油相−水相混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程（ｄ）；により調製される。
得られた脂質粒子の分散液は、必要に応じてサイジングまたは濃縮などを行うことができる。なお、油相とは、一般式（１）で表される化合物、ステロール、中性脂質およびＰＥＧ鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質、アルコール、およびエステルを混合して得られる組成物中に含まれる油性成分を意味する。

工程（ａ）において、油相を加熱する際の温度は、４０〜７０℃であることが好ましく、４５〜６５℃であることがより好ましい。

工程（ｂ）において、水相は、核酸を、水または緩衝液に溶解することで得ることができる。さらには、必要に応じて酸化防止剤などの成分を添加してもよい。水相と油相を混合する比率（質量比）は、３．０：１．０〜１．０：１．０が好ましく、１．６：１．０〜１．１：１．０がより好ましい。

工程（ｂ）において、水相と油相を混合する際の温度は、４０〜７０℃であることが好ましく、４５〜６５℃であることがより好ましい。また、混合する時間は、液全体が均一になっていることが確認できればよく、特に限定されない。また、加熱時間は、液全体の温度が均一に所望の温度になっていることが確認できればよく、特に限定されない。

工程（ｃ）において、油相−水相混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程では、油相−水相混合液の冷却条件は１０〜３０℃が好ましく、１５〜２５℃がより好ましい。

工程（ｄ）において、脂質粒子を晶出させた油相−水相混合液からアルコールおよびエステルを除去する方法としては、特に限定されず、一般的な手法により除去することができる。

本製造法によって得られる脂質粒子は、必要に応じてサイジングを施すことができる。サイジングの方法は、特に限定されないが、エクストルーダーなどを用いて粒子径を小さくすることができる。

（４）脂質粒子の利用
本発明の脂質粒子の一例としては、本発明の脂質粒子をｉｎｖｉｔｒｏで細胞に導入することによって、細胞に核酸（遺伝子）を導入することができる。
また、本発明の脂質粒子に含まれる核酸として、医薬用途を有する核酸を使用する場合には、本発明の脂質粒子は、核酸医薬として生体に投与することができる。

本発明の脂質粒子を核酸医薬として使用する場合には、本発明に脂質粒子は単独で、または薬学的に許容される投与媒体（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液）と混合して、生体に投与することができる。薬学的に許容される担体との混合物中における脂質粒子の濃度は特に限定されず、一般的には０．０５質量％から９０質量％とすることができる。また、本発明の脂質粒子を含む核酸医薬には、薬学的に許容される他の添加物質、例えばｐＨ調製緩衝剤、浸透圧調整剤などを添加してもよい。

本発明の脂質粒子を含む核酸医薬をｉｎｖｉｖｏで投与する際の投与経路は特に限定されず、任意の方法で投与することができる。投与方法としては、経口投与、非経口投与（関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉投与など）が挙げられる。本発明の脂質粒子を含む核酸医薬は、疾患部位に直接注射することにより投与することもできる。

本発明の脂質粒子の剤形は、特に限定されないが、経口投与を行う場合には、本発明の脂質粒子は、適当な賦形剤と組み合わせて、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、懸濁剤、シロップ剤などの形態で使用することができる。また、非経口投与に適した製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および等張滅菌注射剤、懸濁化剤、溶解補助剤、粘稠化剤、安定化剤または保存料などの添加剤を適宜含めることができる。

（５）核酸送達キャリア
本発明によれば、下記一般式（１）：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、上記と同様である）で表される化合物、ステロール、中性脂質およびＰＥＧ鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質、および核酸を含む脂質粒子は、核酸送達キャリア（以下、本発明の核酸送達キャリアと称することがある）として用いることができる。本発明の核酸送達キャリアは、標的細胞内で効率よく核酸が放出され、非常に良好な薬効を得ることができ、非常に有用である。すなわち、本発明によれば、一般式（１）で表される化合物と、ステロールと、中性脂質およびＰＥＧ鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種と、核酸と、を含む核酸送達キャリアを提供することができる。

本発明の核酸送達キャリアは、例えば、核酸と混合して、得られた脂質粒子を細胞にｉｎｖｉｔｒｏでトランスフェクション等をすることにより、細胞に核酸を導入することができる。また、本発明の核酸送達キャリアは、核酸医薬における核酸送達キャリアとしても有用である。

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
また、本発明において、コレステロールは、ディッシュマン社製コレステロールＨＰを、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）は、日油社製ＣＡＴＳＯＭＥ−ＭＣ６を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール修飾ホスホエタノールアミン、ＰＥＧ鎖分子量：２０００）は、日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＤＳＰＥ−０２０ＣＮを、使用した。

［合成例１：式（１）で表される化合物（化合物Ａ）の合成］
第一工程
テトラヒドロフラン230mLに、ジヘキサデシルアミン23gおよびトリエチルアミン5.52gを加え、攪拌しながらBoc-His(1-Boc)-OSU 24.6gを添加し、室温で１時間攪拌し、50℃で５時間攪拌した。その後、テトラヒドロフランを減圧留去し、反応物にクロロホルム450mLおよび水200mLを加えた。有機層を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、１０％クエン酸水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル=5/1〜3/1）で精製し、油状物の保護体24gを得た。

第二工程
トリフルオロ酢酸35ｍLに、第一工程で得られた保護体21.7gを少しずつ加え、室温で24時間攪拌した。その後、飽和炭酸水素ナトリウム40gを含む水溶液600mLに徐々に添加し、１時間攪拌した。得られた反応液にクロロホルム500mLを加え、有機層を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=10/1）で精製し、無色固体の化合物Ａを11.6g得た。化合物の同定は、NMRおよびMSにより行った。

［合成例２：比較用化合物（化合物Ｂ）の合成］
反応容器に、Ｎ−アセチル−ヒスチジン3.00g、ジメチルアセトアミド225mL、トリエチルアミン4.2ｍLを取り、内温25℃で攪拌した。更に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩2.92gを加え、内温45℃で攪拌して均一溶液とした。ジヘキサデシルアミン7.09gを加え、内温45℃で８時間攪拌した。反応混合物を冷却した後、酢酸エチルで有機層を抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、下記式で表される化合物Ｂを1.11g得た。

［実施例１］
（コアセルベーション法）
油相の調製
Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物Ａ、コレステロール、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（以下、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を、２６／２６／４４／４のモル比となるように、それぞれ３７ｍｇ、３０ｍｇ、３３ｍｇ、２０ｍｇ量り取り、エタノールを０．３ｍＬ、酢酸エチルを０．７ｍＬ加えて溶解させ、油相を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述の工程で得た油相に、後述のｓｉＲＮＡ５ｍｇを滅菌水０．２６３ｍＬで溶解した核酸水溶液０．２５ｍＬ、さらに滅菌水を１．０ｍＬ添加し、５５℃で１０分間過熱した。その後攪拌しながら室温で放冷した。つづいて１００ｍＭヒスチジン溶液を用いて室温で透析し、エタノール／酢酸エチル混合溶液を除去した。得られた溶液をエクストルーダー（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ社製ＭｉｎｉＥｘｔｒｕｄｅｒ）を用い、０．４μｍフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子（以下、核酸保持脂質粒子と称することがある）を得た。

［実施例２〜４、６／比較例１、２］
実施例２〜４、６、比較例１、２は、それぞれ表１に示す処方にて、実施例１と同様の方法で調製し、目的とする脂質粒子分散液を得た。

細胞における標的ｍＲＮＡ残存率の評価
実施例１〜４、６、比較例１、２について、以下の手法によりｍＲＮＡ残存率の評価を行った。

（１）脂質粒子の細胞へのトランスフェクション
0.9×10³個のTOV112D細胞（ヒト卵巣癌細胞株）を播種した２４穴プレートに対し、翌日、培地を２００μＬのOpti-MEM（登録商標）に交換した。次に、３００ｎＭになるようにOpti-MEM（登録商標）で希釈した実施例１〜４、６、比較例１、２で調製したリポソーム分散液を２４穴プレートに１００μＬ添加し、最終濃度を１００ｎＭになるように調整した（全液量300μｌ）。その後、５％ＣＯ_２インキュベーター中で２４時間から４８時間培養した。

（２）全ＲＮＡ抽出
培養後、RNeasy Mini Kit(QIAGEN社、登録商標)を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出した。抽出後の全ＲＮＡ濃度の吸光度を測定後、RNA濃度が５ｎｇ／μLとなるようにRNase free水で希釈した。

（３）定量ＰＣＲ反応
逆転写反応とＰＣＲ反応はQUANTIFAST PROBE RTPCR KIT(QIAGEN社、登録商標)を用いて行った。用いたsiRNA遺伝子に対するプライマー/プローブはTaqMan Gene expression assay(ABI、登録商標)を使用し、Mx3000P（アジレント・テクノロジー株式会社、登録商標）を用いて定量PCRを実施した。ＰＣＲのコンディションは５０℃ ３０分;９５℃ １５分; ９４℃ １５秒;６０℃ ３０秒 (40 サイクル)とした。内部標準はTaqMan Encogeneous Control Human ACTB(ABI、登録商標)を使用した。得られたデータは△△CT法を用いトランスフェクション未処理に対する相対定量でｍＲＮＡ残存率として算出した。

［実施例５］
実施例５は、脂質粒子への細胞のトランスフェクション時に、opti-MENを１０％血清の入ったopti-MENに交換して実施する以外は、実施例１と同様に実施した。

ｓｉＲＮＡは以下の配列のものを使用した。
５’−ＧＵＵＣＡＧＡＣＣＡＣＵＵＣＡＧＣＵＵ−３’（ｓｅｎｓｅ鎖）（配列番号１）
３’−ＣＡＡＧＵＣＵＧＧＵＧＡＡＧＵＣＧＡＡ−５’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖）（配列番号２）

示す実施例１〜６、比較例１、２を使用した場合におけるｍＲＮＡ産生抑制率を表１に示す。

表１に示すように、実施例１〜６に示すリポソーム分散液は、非常に高いｍＲＮＡの産生抑制効果を示し、細胞外（血中）で核酸分子を安定に保持することができ、速やかに細胞質中で核酸を放出して標的細胞内で効率よく核酸本来の機能を発揮させることができることを見出した。

Claims

下記一般式（１）：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、炭素数１４〜１８のアルキル基である）で表される化合物、コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、重量平均分子量５００〜５０００のポリエチレングリコール鎖を有する脂質、および核酸を含む脂質粒子であって、
前記の重量平均分子量５００〜５０００のポリエチレングリコール鎖を有する脂質が、ポリエチレングリコール修飾ホスホエタノールアミン、ジアシルグリセロールポリエチレングリコール誘導体、ジアルキルグリセロールポリエチレングリコール誘導体、又はセラミドポリエチレングリコール誘導体であり、
一般式（１）で表される化合物の含有量が１５ｍｏｌ％〜６０ｍｏｌ％であり、
コレステロールの含有量が１０ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％であり、
粒子径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍである、脂質粒子。
核酸の配合量が、脂質粒子の構成成分全量に対してモル比で１：１０〜１：５０００である、請求項１に記載の脂質粒子。
粒子径が７５ｎｍ〜３５０ｎｍである、請求項１または２に記載の脂質粒子。
ジパルミトイルホスファチジルコリン及びポリエチレングリコール鎖を有する脂質の含有量が３ｍｏｌ％〜５５ｍｏｌ％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の脂質粒子。
一般式（１）で表される化合物の含有量が２０ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の脂質粒子。
コレステロールの含有量が１５ｍｏｌ％〜３０ｍｏｌ％である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の脂質粒子。
前記ポリエチレングリコール鎖の重量平均分子量が７５０〜２０００である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の脂質粒子。
ポリエチレングリコール鎖を有する脂質がポリエチレングリコール修飾ホスホエタノールアミンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の脂質粒子。
核酸の配合量が、脂質粒子の構成成分全量に対してモル比で１：１００〜１：１０００である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の脂質粒子。
下記一般式（１）：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、炭素数１４〜１８のアルキル基である）
で表される化合物、コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、重量平均分子量５００〜５０００のポリエチレングリコール鎖を有する脂質、および核酸を含む核酸送達キャリアであって、
前記の重量平均分子量５００〜５０００のポリエチレングリコール鎖を有する脂質が、ポリエチレングリコール修飾ホスホエタノールアミン、ジアシルグリセロールポリエチレングリコール誘導体、ジアルキルグリセロールポリエチレングリコール誘導体、又はセラミドポリエチレングリコール誘導体であり、
一般式（１）で表される化合物の含有量が１５ｍｏｌ％〜６０ｍｏｌ％であり、
コレステロ−ルの含有量が１０ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％であり、
粒子径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍである、核酸送達キャリア。