JP6463577B2

JP6463577B2 - 改変キメラ抗原受容体（ｃａｒ）ｔ細胞のヒト応用

Info

Publication number: JP6463577B2
Application number: JP2016514063A
Authority: JP
Inventors: ローレンスジェイ．エヌ．クーパー，; 宏基鳥飼; リンザン，; ヘレンハルズ，; フェンワン−ヨハンニング，; レンカハートン，; サイモンオリバレス，; ジャナニクリシュナマーシー，
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2014-05-14
Publication date: 2019-02-06
Anticipated expiration: 2034-05-14
Also published as: KR20160007653A; CN105408473B; JP2021090444A; EP2997134A4; JP2016525881A; EP3974520A1; JP2019047830A; US20170224798A1; WO2014186469A2; KR20200044884A; EP3783098A1; US11786582B2; DK2997134T3; CN112795594B; CN112795594A; WO2014186469A3; AU2021200029C1; AU2021200029A1; US20220062396A1; ES2828982T3

Description

本願は、２０１３年５月１４日出願の米国仮特許出願第６１／８２３，２５３号の利益を主張するものであり、その全教示内容は、参照することで本明細書に組み込まれる。

本発明は、米国防総省により与えられた契約番号Ｗ８１ＸＷＨ−１１−１−０００２−０１の下での政府支援に基づいて達成されたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有するものである。
配列表の組み込み

３７キロバイト（ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定したサイズ）であって２０１４年５月１４日に作成された「ＵＴＦＣ．Ｐ１２２２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、電子申請により本願に添付して提出され、引用により本明細書に組み込まれる。

本発明は、広義には、医薬、免疫学、細胞生物学、及び分子生物学の分野に関する。ある態様では、本発明の分野は、免疫療法に関する。特に、本発明は、臨床等級キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の作製及びそのような細胞を用いた治療法に関する。
遺伝子治療を免疫療法と組み合わせることで臨床等級Ｔ細胞の効力を改善し、（ｉ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の認識に優れた可能性、（ｉｉ）注入後の持続性、（ｉｉｉ）腫瘍部位に移動する可能性、及び（ｉｖ）腫瘍微小環境内のエフェクター機能を再循環させる能力を持つ生物学的製剤を遺伝子操作することができる。遺伝子治療と免疫療法とのそのような併用により、Ｂ系統抗原に対するＴ細胞の特異性を再指向することができ、Ｂ細胞悪性腫瘍が進行した患者は、そのような腫瘍特異的Ｔ細胞の注入から恩恵を受ける（Ｊｅｎａら、２０１０；Ｔｉｌｌら、２００８；Ｐｏｒｔｅｒら、２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、２０１１；Ｃｏｏｐｅｒ及びＢｏｌｌａｒｄ、２０１２；Ｋａｌｏｓら、２０１１；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら、２０１０；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら、２０１２；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、２０１３）。ヒト応用に設計されたＴ細胞の遺伝子操作のほとんどのアプローチは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の安定発現用のレトロウイルス及びレンチウイルスを使用してきた（Ｊｅｎａら、２０１０；Ｅｒｔｌら、２０１１；Ｋｏｈｎら、２０１１）。このアプローチは、現行の医薬品製造管理及び品質管理基準（ｃＧＭＰ）に準拠しているが、限られた数の生産施設からの臨床等級組み換えウイルスの生産及びリリースに依存しているため高価になり得る。血液悪性腫瘍及び固形腫瘍に対して特異性を持つ遺伝子組み換えされた臨床等級Ｔ細胞製品を生成するための新しい方法が必要である。

Ｊｅｎａｅｔａｌ．，ＲｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇＴ−ｃｅｌｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｂｙｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇａｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ，１１６：１０３５−１０４４，２０１０．Ｔｉｌｌｅｔａｌ，Ａｄｏｐｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｉｎｄｏｌｅｎｔｎｏｎ−ＨｏｄｇｋｉｎｌｙｍｐｈｏｍａａｎｄｍａｎｔｌｅｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａｕｓｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄａｕｔｏｌｏｇｏｕｓＣＤ２０−ｓｐｅｃｉｆｉｃＴｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，１１２：２２６１−２２７１，２００８．Ｐｏｒｔｅｒｅｔａｌ，Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄＴｃｅｌｌｓｉｎｃｈｒｏｎｉｃｌｙｍｐｈｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６５：７２５−７３３，２０１１．Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓｅｔａｌ，ＳａｆｅｔｙａｎｄｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅｏｆａｄｏｐｔｉｖｅｌｙｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄａｕｔｏｌｏｇｏｕｓＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄＴｃｅｌｌｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｒｅｌａｐｓｅｄｏｒｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｒｅｆｒａｃｔｏｒｙＢ−ｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａｓ．Ｂｌｏｏｄ，１１８：４８１７−４８２８，２０１１．ＣｏｏｐｅｒａｎｄＢｏｌｌａｒｄ，ＧｏｏｄＴｃｅｌｌｓｆｏｒｂａｄＢｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，１１９：２７００−２７０２，２０１２．Ｋａｌｏｓｅｔａｌ，Ｔｃｅｌｌｓｗｉｔｈｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｈａｖｅｐｏｔｅｎｔａｎｔｉｔｕｍｏｒｅｆｆｅｃｔｓａｎｄｃａｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｍｏｒｙｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｄｖａｎｃｅｄｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，３：９５ｒａ７３，２０１１．Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒｅｔａｌ，ＥｒａｄｉｃａｔｉｏｎｏｆＢ−ｌｉｎｅａｇｅｃｅｌｌｓａｎｄｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｙｍｐｈｏｍａｉｎａｐａｔｉｅｎｔｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈａｕｔｏｌｏｇｏｕｓＴｃｅｌｌｓｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｔｏｒｅｃｏｇｎｉｚｅＣＤ１９．Ｂｌｏｏｄ，１１６：４０９９−４１０２，２０１０．Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒｅｔａｌ，Ｂ−ｃｅｌｌｄｅｐｌｅｔｉｏｎａｎｄｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓｏｆｍａｌｉｇｎａｎｃｙａｌｏｎｇｗｉｔｈｃｙｔｏｋｉｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｏｘｉｃｉｔｙｉｎａｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｏｆａｎｔｉ−ＣＤ１９ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ− ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄＴｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，１１９：２７０９−２７２０，２０１２．Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓｅｔａｌ，ＳａｆｅｔｙａｎｄｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅｏｆａｄｏｐｔｉｖｅｌｙｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄａｕｔｏｌｏｇｏｕｓＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄＴｃｅｌｌｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｒｅｌａｐｓｅｄｏｒｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｒｅｆｒａｃｔｏｒｙＢ−ｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａｓ．Ｂｌｏｏｄ，１１８：４８１７−４８２８，２０１１．Ｅｒｔｌｅｔａｌ，ＣｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒＴｃｅｌｌｓ：ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｆｒｏｍａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡＡｄｖｉｓｏｒｙＣｏｍｍｉｔｔｅｅＳｙｍｐｏｓｉｕｍｈｅｌｄＪｕｎｅ１５，２０１０．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，７１：３１７５−３１８１，２０１１．Ｋｏｈｎｅｔａｌ，ＣＡＲｓｏｎｔｒａｃｋｉｎｔｈｅｃｌｉｎｉｃ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９：４３２−４３８，２０１１．

第１の実施形態では、対象から（Ｔ細胞またはＴ前駆細胞を含む）細胞の試料を得ることと；細胞のゲノムに組み込むことが可能な、キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることと；Ｔ細胞応答をもたらすために、対象にトランスジェニック細胞の有効量を投与することとを含む、疾患を有するヒト対象においてＴ細胞応答をもたらす方法を提供する。

従って、いくつかの態様では、実施形態の方法は、（ａ）対象から細胞の試料を得ることと、ここで、試料は、Ｔ細胞またはＴ前駆細胞を含む；（ｂ）細胞を、トランスポゾンフランクキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡとＣＡＲをコードするＤＮＡを細胞のゲノム中に組み込むのに有効なトランスポゼースとでトランスフェクトし、トランスジェニックＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団を提供することと；（ｃ）必要に応じて、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖を選択的に高める培地中でトランスジェニックＣＡＲ細胞の集団をｅｘｖｉｖｏにて培養することと、ここで、トランスジェニックＣＡＲＴ細胞は培養され、仮にそうであったとしても、２１日以下である；（ｄ）Ｔ細胞応答をもたらすために、対象にトランスジェニックＣＡＲ細胞の有効量を投与することとを含む。従って、いくつかの態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞は、２１日未満、例えば、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日未満またはそれ未満でｅｘｖｉｖｏで培養される。ある態様では、ＣＡＲ細胞は、３〜５日以下でｅｘｖｉｖｏで培養される。さらに別の態様では、本方法の工程（ａ）〜（ｄ）（即ち、細胞試料を得ることからＣＡＲＴ細胞を投与することまで）は、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以下で完了する。

別の態様では、実施形態による疾患を有するヒト対象においてＴ細胞応答をもたらす方法は、（ａ）対象から細胞の試料を得ることと、ここで、試料は、Ｔ細胞またはＴ前駆細胞を含み、対象から得た際に、約２０〜２００ｍｌの初期容量を有する；（ｂ）細胞を、トランスポゾンフランクキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡとＣＡＲをコードするＤＮＡを細胞のゲノム中に組み込むのに有効なトランスポゼースとでトランスフェクトし、トランスジェニックＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団を提供することと；（ｃ）必要に応じて、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖を選択的に高める培地中でトランスジェニックＣＡＲ細胞の集団をｅｘｖｉｖｏにて培養することと；（ｄ）Ｔ細胞応答をもたらすために、対象にトランスジェニックＣＡＲＴ細胞の有効量を投与することとを含む。例えば、対象からの細胞の試料は、約２００ｍｌ未満の末梢血液または臍帯血の試料であってもよい。いくつかの態様では、試料は、アフェレーシスにより回収してもよい。しかしながら、ある好適な態様では、試料は、アフェレーシスを伴わない方法（例えば、静脈穿刺）により回収される。さらに別の態様では、細胞の試料は、約１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、または２５ｍｌ未満の初期容量を有する（例えば、細胞の試料は、対象から得た際に、約５０〜２００ｍｌ、５０〜１００ｍｌ、または１００〜２００ｍｌの初期容量を有する）。

別の実施形態では、ＨＥＲＶ−Ｋのエンベロープタンパク質を標的にする発現ＣＡＲを含む単離トランスジェニック細胞を提供する。ある態様では、細胞は、細胞のゲノム中に組み込まれたＣＡＲをコードするＤＮＡ（例えば、トランスポゾン反復配列によりフランクされたＣＡＲＤＮＡ）を含む。例えば、ＣＡＲ配列は、モノクローナル抗体６Ｈ５のＣＤＲ配列（例えば、ＣＤＲ１〜６）またはモノクローナル抗体６Ｈ５のｓｃＦｖ配列を含み得る。いくつかの態様では、ＨＥＲＶ−Ｋ標的ＣＡＲは、配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号４に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列）。ある態様では、実施形態の細胞（例えば、ヒトＨＥＲＶ−Ｋ標的ＣＡＲ細胞）は、ＨＥＲＶ−Ｋ発現がんを有する対象の治療に用いることができる（または、対象において免疫応答をもたらす）。

さらに別の実施形態では、発現ＣＡＲ及び発現膜結合型ＩＬ−１５を含む単離トランスジェニック細胞を提供する。例えば、いくつかの態様では、膜結合型ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの間の融合タンパク質を含む。さらに別の態様では、膜結合型ＩＬ−１５は、配列番号６（本明細書において「ｍＩＬ１５」と呼ばれる）に少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書でさらに詳述されるように、場合によっては、膜結合型ＩＬ−１５は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、染色体外またはエピソームベクター）によりコードされる。ある態様では、細胞は、細胞のゲノム中に組み込まれた膜結合型ＩＬ−１５をコードするＤＮＡ（例えば、トランスポゾン反復配列によりフランクされたコードＤＮＡ）を含む。ある態様では、実施形態の細胞（例えば、膜結合型サイトカインを発現するヒトＣＡＲ細胞）は、低レベルの標的抗原を有する対象、例えば、微小残存病変（本明細書でさらに詳述される）を持つ対象の治療に用いることができる（対象において免疫応答をもたらす）。

いくつかの態様では、実施形態の方法は、キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）、場合によっては、トランスポゼースをコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトすることに関する。細胞をトランスフェクトする方法は、当業者には周知であるが、ある態様では、高効率のトランスフェクション方法、例えば、エレクトロポレーションを用いる。例えば、ヌクレオフェクション装置を用いて核酸を細胞に導入してもよい。好ましくは、トランスフェクション工程は、細胞を、遺伝毒性を引き起こす、及び／または、治療対象においてウイルス配列を含む細胞に対する免疫応答を引き起こす可能性のあるウイルスに感染または形質導入することを伴わない。

実施形態の別の態様は、ＣＡＲをコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクトすることに関する。広範囲のＣＡＲ構築物及びそれらの発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、本明細書でさらに詳述される。例えば、いくつかの態様では、ＣＡＲ発現ベクターは、プラスミド、直鎖発現ベクター、またはエピソームなどのＤＮＡ発現ベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、付加配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡシグナル、及び／または１つ以上のイントロンなどの、ＣＡＲを促進する配列を含む。好適な態様では、ＣＡＲコード配列は、トランスポゼースの存在により、トランスフェクト細胞のゲノム中にコード配列を組み込むことができるように、トランスポゾン配列によりフランクされる。

上で詳述したように、ある態様では、細胞は、トランスフェクト細胞のゲノム中にＣＡＲコード配列の組み込みを促進するトランスポゼースでさらにトランスフェクトされる。いくつかの態様では、トランスポゼースは、ＤＮＡ発現ベクターとして提供される。しかしながら、好適な態様では、トランスポゼースは、トランスポゼースの長期発現がトランスジェニック細胞で起きないように、発現可能ＲＮＡまたはタンパク質として提供される。例えば、いくつかの態様では、トランスポゼースは、ｍＲＮＡ（例えば、キャップ及びポリＡ尾部を含むｍＲＮＡ）として提供される。任意のトランスポゼース系を実施形態に従って使用してもよい。しかしながら、いくつかの態様では、トランスポゼースは、サケ科型Ｔｃ１様トランスポゼース（ＳＢ）である。例えば、トランスポゼースは、いわゆる「スリーピングビューティ」トランスポゼースであり得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４８９，４５８号を参照されたい。ある態様では、トランスポゼースは、酵素活性が増した遺伝子操作酵素である。トランスポゼースのいくつかの具体例としては、限定的ではないが、ＳＢ１０、ＳＢ１１、またはＳＢ１００ｘトランスポゼースが挙げられる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭａｔｅｓら、２００９を参照されたい）。例えば、方法には、ＳＢ１０、ＳＢ１１、またはＳＢ１００ｘトランスポゼースをコードするｍＲＮＡを持つ細胞のエレクトロポレーションを伴い得る。

さらに別の態様では、実施形態のトランスジェニックＣＡＲ細胞は、Ｔ細胞の増殖及び／または生存を刺激する膜結合型サイトカインを発現するための発現ベクターをさらに含む。特に、そのようなサイトカインを含むＣＡＲ細胞は、サイトカイン発現により提供されるシミュレーションにより、活性化及び増殖細胞（ＡａＰＣ）または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を有するｅｘｖｉｖｏ培養をほとんどあるいは全くせずに増殖及び／または持続することができる。同様に、そのようなＣＡＲ細胞は、ＣＡＲにより認識された多量の抗原が存在しない場合でも（例えば、寛解期のがん患者またはで微小残存病変を持つ患者の場合と同様）、ｉｎｖｉｖｏで増殖することができる。いくつかの態様では、ＣＡＲ細胞は、サイトカインの表面発現をもたらすために、Ｃγサイトカイン及びエレメント（例えば、膜貫通領域）を発現するためのＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターを含む。例えば、ＣＡＲ細胞は、膜結合型バージョンのＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２１を含み得る。いくつかの態様では、サイトカインは、サイトカインコード配列をサイトカインの受容体と融合させることで膜につながれる。例えば、細胞は、ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質（例えば、配列番号６の配列を含むタンパク質）を発現するためのベクターを含み得る。さらに別の態様では、膜結合型Ｃγサイトカインをコードするベクターは、ＣＡＲ細胞のゲノム中に組み込まれたベクターまたは染色体外ベクター（例えば、エピソームベクター）などのＤＮＡ発現ベクターである。さらに別の態様では、膜結合型Ｃγサイトカインの発現は、プロモーター活性を誘導または抑制することでＣＡＲ細胞中のサイトカインの発現（かつ、それによるＣＡＲ細胞の増殖）を制御することができるように、誘導性プロモーター（例えば、薬剤誘導性プロモーター）の制御下である。

実施形態の態様は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、またはＴ前駆細胞を含む患者から試料を得ることに関する。例えば、場合によっては、試料は、臍帯血試料、末梢血液試料（例えば、単核球分画）、または多能性細胞を含む対象からの試料である。いくつかの態様では、対象からの試料を培養し、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成することができ、これらの細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＴ細胞の作製に用いられる。細胞試料は、対象から直接培養してもよいし、あるいは使用前に凍結保存していてもよい。いくつかの態様では、細胞試料を得ることは、細胞試料を回収することを含む。他の態様では、試料は、第三者により得られる。さらに別の態様では、対象からの試料を処理して、試料中のＴ細胞またはＴ前駆細胞を精製または濃縮することができる。例えば、試料を、勾配精製、細胞培養選択、及び／または細胞選別（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を介して）することができる。

いくつかの態様では、実施形態の方法は、抗原提示細胞を得ること、作製すること、または用いることをさらに含む。例えば、抗原提示細胞は、樹状細胞、活性化及び増殖細胞（ＡａＰＣ）、または不活性化（例えば、照射）人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であってもよい。そのようなａＡＰＣの作製方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書でさらに詳述される。従って、いくつかの態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞は、ＣＡＲ細胞集団を増殖させるために、限られた時間のあいだｅｘｖｉｖｏで不活性化ａＡＰＣと共培養される。ＣＡＲ細胞をａＡＰＣと共培養する工程は、例えば、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）及び／またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含む培地で行ってもよい。いくつかの態様では、共培養することは、ＣＡＲ細胞対不活性化ａＡＰＣの比率が約１０：１〜約１：１０；約３：１〜約１：５；または約１：１〜約１：３で行われる。例えば、ＣＡＲ細胞とａＡＰＣとの共培養は、約１：１、約１：２、または約１：３の比率であってもよい。

いくつかの態様では、ＡａＰＣまたはａＡＰＣなどの、ＣＡＲ細胞を培養するための細胞は、特異的ポリペプチドを発現するために遺伝子操作され、ＣＡＲ細胞の増殖を高める。例えば、細胞は、（ｉ）トランスジェニックＣＡＲ細胞上で発現したＣＡＲにより標的とされる抗原；（ｉｉ）ＣＤ６４；（ｉｉ）ＣＤ８６；（ｉｉｉ）ＣＤ１３７Ｌ；及び／または（ｖ）ａＡＰＣの表面上で発現した膜結合型ＩＬ−１５を含み得る。いくつかの態様では、ＡａＰＣまたはａＡＰＣは、ＡａＰＣまたはａＡＰＣの表面上で発現したＣＡＲ結合抗体またはその断片を含む。好ましくは、本方法で用いられるＡａＰＣまたはａＡＰＣは、感染性物質について試験し、該感染性物質を含まないことが確認され、及び／または、不活性化及び非増殖性について試験し、不活性化及び非増殖性であることが確認される。

ＡａＰＣまたはａＡＰＣの増殖により培養中にＣＡＲ細胞の数または濃度を増すことができるが、この処理は、人手が掛かり、かつ高価である。さらに、いくつかの態様では、治療を必要とする対象には、できるだけ短時間でランスジェニックＣＡＲ細胞を再注入すべきである。従って、いくつかの態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞をｅｘｖｉｖｏ培養すること（ｃ）は、１４日以下、７日以下、または３日以下である。例えば、ｅｘｖｉｖｏ培養（例えば、ＡａＰＣまたはａＡＰＣの存在下で培養）は、トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団の１倍加未満で行ってもよい。さらに別の態様では、トランスジェニック細胞は、ＡａＰＣまたはａＡＰＣの存在下でｅｘｖｉｖｏ培養されない。

さらに別の態様では、実施形態の方法は、細胞のトランスフェクション（工程（ｂ））または細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖（工程（ｃ））の後にＣＡＲ発現Ｔ細胞の細胞集団を濃縮する工程を含む。例えば、濃縮工程は、例えば、ＣＡＲまたはＣＡＲ結合抗体に結合した抗原を用いた細胞の選別（例えば、ＦＡＣＳを介して）を含み得る。さらに別の態様では、濃縮工程は、非Ｔ細胞の枯渇またはＣＡＲ発現を欠いた細胞の枯渇を含む。例えば、ＣＤ５６^＋細胞は、培養集団から枯渇してもよい。さらに別の態様では、ＣＡＲ細胞の試料は、細胞を対象に投与する場合に保存される（または培養で維持される）。例えば、試料は、後々の増殖または分析用に凍結保存してもよい。

ある態様では、実施形態のトランスジェニックＣＡＲ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体及び／または内因性ＨＬＡを発現するために不活性化される。例えば、Ｔ細胞は、内因性α／βＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を排除するために遺伝子操作してもよい。特定の実施形態では、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、ＴＣＲの発現を排除するために遺伝子改変される。いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いてＣＡＲ発現Ｔ細胞のＴ細胞受容体α／βを破壊する。ある態様では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＴ細胞受容体αβ鎖は、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いてノックアウトされる。

本明細書でさらに詳述されるように、実施形態のＣＡＲ細胞は、広範囲の疾患及び病態の治療に用いることができる。本質的に、特定の抗原の特異的発現または増強発現を伴う任意の疾患は、ＣＡＲ細胞を抗原に標的化することで治療することができる。例えば、自己免疫疾患、感染症、及びがんは、本発明の方法及び／または組成物で治療することができる。これらには、原発性がん、転移性がん、再発がん、治療に対して感受性のがん、治療に対して難治性のがん（例えば、化学療法難治性のがん）が含まれる。がんは、血液、肺、脳、結腸、前立腺、乳房、肝臓、腎臓、胃、頸部、卵巣、睾丸、下垂体、食道、脾臓、皮膚、骨など（例えば、Ｂ細胞リンパ腫または黒色腫）であってもよい。がん治療の場合、ＣＡＲ細胞は通常、がん細胞抗原（腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）としても知られる）を標的にする。

さらに別の態様では、実施形態のトランスジェニックＣＡＲ細胞は、微小残存病変を有する対象（例えば、ごく少量のＣＡＲ標的抗原を有する対象）、例えば、明らかな寛解期にあるがん患者の治療に用いてもよい。新規の高感度診断技術を用いて、がん関連抗原（またはがん細胞）を、明らかながん症状を示さない患者で検出することができる。そのような患者は、抗原標的ＣＡＲ細胞を用いて残存疾患を排除するために本方法により治療してもよい。好適な実施形態では、残存疾患を標的にするためのトランスジェニックＣＡＲ細胞は、これらの細胞が標的抗原に対して少量にもかかわらずｉｎｖｉｖｏ増殖する能力を保持するため、膜結合型増殖性サイトカインの発現をさらに含む。

実施形態のプロセスを利用して、種々の腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ＣＤ１２３、ｃ−ｍｅｔ、ＧＤ２）に対するＣＡＲ^＋Ｔ細胞を（例えば、臨床試験用に）製造することができる。この技術を用いて生成されたＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、白血病（ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ）、感染症、及び／または固形腫瘍を持つ患者の治療に用いることができる。例えば、実施形態の方法は、細胞増殖性疾患、真菌病原体、ウイルス感染、細菌感染、または寄生感染の治療に用いることができる。標的となり得る病原体には、限定されるが、マラリア原虫、トリパノソーマ、アスペルギルス、カンジダ、ＨＳＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、またはエボラ病原体が挙げられる。実施形態のＣＡＲ細胞により標的とされ得る抗原のさらなる例としては、限定的ではないが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３，ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒα、κ鎖、λ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、またはＶＥＧＦＲ２が挙げられる。ある態様では、実施形態の方法は、ＣＤ１９またはＨＥＲＶ−Ｋ発現細胞を標的にすることに関する。例えば、ＨＥＲＶ−Ｋ標的ＣＡＲ細胞は、モノクローナル抗体６Ｈ５のｓｃＦｖ配列を含むＣＡＲを含み得る。さらに別の態様では、実施形態のＣＡＲは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１などのサイトカインまたはその組み合わせと共役または融合することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団から細胞の有効量を提供する工程を含む方法で、病状がある個体を、２回以上、いくつかの態様では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ以上の日にちを空けて治療することを提供する。特定の実施形態では、がんは、リンパ腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、またはＢ細胞関連自己免疫疾患である。

さらに別の実施形態では、配列番号１に少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ１９標的ＣＡＲを含む単離または組み換えポリペプチドを提供する。関連する実施形態では、ＣＤ１９標的ＣＡＲをコードする（例えば、配列番号１に８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列をコードする）単離または組み換えポリヌクレオチド配列を提供する。例えば、いくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列は、（ＣＤ−１９標的ＣＡＲをコードする）配列番号３、または（ＣＤ−１９標的ＣＡＲ、発現制御配列、及び隣接トランスポゾン反復をコードする）配列番号４に８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。さらに別の実施形態では、ＣＤ１９標的ＣＡＲをコードするポリペプチド及び／または実施形態のＣＤ１９標的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。例えば、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＴ前駆細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。当業者であれば、上記のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または宿主細胞のいずれかを本明細書で詳述される方法に従って使用してもよいことが認識されるであろう。

さらに別の実施形態では、配列番号４に少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨＥＲＶ−Ｋ標的ＣＡＲを含む単離または組み換えポリペプチドを提供する。関連する実施形態では、ＨＥＲＶ−Ｋ標的ＣＡＲをコードする（例えば、配列番号４に８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列をコードする）単離または組み換えポリヌクレオチド配列を提供する。例えば、いくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列は、（ＨＥＲＶ−Ｋ標的ＣＡＲ、発現制御配列、及び隣接トランスポゾン反復をコードする）配列番号５に８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。さらに別の実施形態では、ＨＥＲＶ−Ｋ標的ＣＡＲをコードするポリペプチド及び／または実施形態のＨＥＲＶ−Ｋ標的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。例えば、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＴ前駆細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。当業者であれば、上記のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または宿主細胞のいずれかを本明細書で詳述される方法に従って使用してもよいことが認識されるであろう。

さらに別の実施形態では、配列番号６に少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む膜結合型ＩＬ−１５を含む単離または組み換えポリペプチドを提供する。関連する実施形態では、膜結合型ＩＬ−１５をコードする（例えば、配列番号６に８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列をコードする）単離または組み換えポリヌクレオチド配列を提供する。例えば、いくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列は、（膜結合型ＩＬ−１５、発現制御配列、及び隣接トランスポゾン反復）配列番号７に８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。さらに別の実施形態では、膜結合型ＩＬ−１５をコードするポリペプチド及び／または実施形態の膜結合型ＩＬ−１５をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。例えば、宿主細胞は、Ｔ細胞、Ｔ前駆細胞、またはａＡＰＣであり得る。好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。当業者であれば、上記のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または宿主細胞のいずれかを本明細書で詳述される方法に従って使用してもよいことが認識されるであろう。

本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲において本明細書中で使用される場合、「を含む」という語と組み合わせて使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１であるかまたは１より大きいことを意味し得る。

特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみに言及することが明確に示されない限りまたは代替物が相互に排他的でない限り、「及び／または」という意味のために使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／または」を指す定義を支持する。本明細書中で使用される場合、「別の」は、少なくとも２番目またはそれ以降を意味し得る。

本出願を通じて、「約」という用語は、値が、値を測定するために使用される装置、方法に対する固有の誤差変動または研究対象物の間に存在する変動を含むことを指すために使用される。

本発明のその他の目的、特性、及び長所は、以下の詳細な説明から明らかになろう。しかしながら、詳細な説明及び具体例は本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、この詳細な説明から本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び改変が当業者にとって明らかとなろうから、単なる例示に過ぎないことを理解されたい。

以下の図面は本明細書の一部を形成し、かつ本発明のある態様をさらに実証するために含まれる。本明細書中に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することによって、本発明がより詳細に理解されよう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ｉｎｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）細胞の試料を対象から得ることと、ここで、前記試料は、Ｔ細胞またはＴ前駆細胞を含む；
（ｂ）前記細胞を、トランスポゾンフランクキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡと前記ＣＡＲをコードする前記ＤＮＡを前記細胞のゲノム中に組み込むのに有効なトランスポゼースとでトランスフェクトし、トランスジェニックＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団を提供することと；
（ｃ）必要に応じて、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖を選択的に高める培地中で前記トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団をｅｘｖｉｖｏにて培養することと、ここで、前記トランスジェニックＣＡＲＴ細胞は培養され、仮にそうであったとしても、１８日以下である、
を含む、前記方法。
（項目２）
ｉｎｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）細胞の試料を対象から得ることと、ここで、前記試料は、Ｔ細胞またはＴ前駆細胞を含み、前記対象から得た際に、約２０〜２００ｍｌの初期容量を有する；
（ｂ）前記細胞を、トランスポゾンフランクキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡと前記ＣＡＲをコードする前記ＤＮＡを前記細胞のゲノム中に組み込むのに有効なトランスポゼースとでトランスフェクトし、トランスジェニックＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団を提供することと；
（ｃ）必要に応じて、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖を選択的に高める培地中で前記トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団をｅｘｖｉｖｏにて培養することと
を含む、前記方法。
（項目３）
工程（ｂ）前に前記試料中のＴ細胞を精製または濃縮することをさらに含む項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記試料中のＴ細胞を濃縮することが、単核球分画を回収することを含む項目３に記載の方法。
（項目５）
前記トランスジェニックＣＡＲＴ細胞が、１４日以下で培養される項目１または２に記載の方法。
（項目６）
工程（ａ）乃至（ｃ）のプロセスが、１８日以下で完了する項目１または２に記載の方法。
（項目７）
前記細胞試料が、前記対象から得た際に、約２０〜２００ｍｌの初期容量を有する項目１に記載の方法。
（項目８）
前記細胞試料が、前記対象から得た際に、約５０〜２００ｍｌ、５０〜１００ｍｌ、または１００〜２００ｍｌの初期容量を有する項目２または７に記載の方法。
（項目９）
前記細胞試料が、凍結保存試料である項目１または２に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞試料が、臍帯血由来である項目１または２に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞試料が、前記対象からの末梢血液試料である項目１または２に記載の方法。
（項目１２）
前記細胞試料をアフェレーシスにより得た項目１または２に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞試料を静脈穿刺により得た項目１または２に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞試料が、Ｔ細胞の亜集団である項目１または２に記載の方法。
（項目１５）
前記トランスジェニックＣＡＲ細胞が、内因性Ｔ細胞受容体及び／または内因性ＨＬＡを発現するために不活性化される項目１または２に記載の方法。
（項目１６）
前記細胞試料を得ることが、前記細胞を第三者から得ることを含む項目１または２に記載の方法。
（項目１７）
工程（ｂ）において、ＣＡＲをコードするＤＮＡを前記Ｔ細胞にエレクトロポレートすることを含む項目１または２に記載の方法。
（項目１８）
工程（ｂ）において、前記細胞をウイルスに感染または該ウイルスで形質導入することを伴わない項目１または２に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞をトランスフェクトすることが、膜結合型Ｃγサイトカインをコードする核酸で前記細胞をトランスフェクトすることをさらに含む項目１または２に記載の方法。
（項目２０）
前記膜結合型Ｃγサイトカインが、膜結合型のＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２１である項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記膜結合型Ｃγサイトカインが、ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質である項目１９に記載の方法。
（項目２２）
ＣＡＲをコードする前記ＤＮＡが、プラスミドである項目１または２に記載の方法。
（項目２３）
前記トランスポゼースが、ＤＮＡ発現ベクターとして提供される項目１または２に記載の方法。
（項目２４）
前記トランスポゼースが、ｍＲＮＡとして提供される項目１または２に記載の方法。
（項目２５）
前記ｍＲＮＡが、キャップド及び／またはポリＡ尾部を含む項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記トランスポゼースが、ポリペプチドまたは発現可能ＲＮＡとして提供される項目１または２に記載の方法。
（項目２７）
前記トランスポゼースが、サケ科型Ｔｃ１様トランスポゼース（ＳＢ）である項目１または２に記載の方法。
（項目２８）
前記トランスポゼースが、ＳＢ１１またはＳＢ１００ｘトランスポゼースである項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記トランスジェニックＣＡＲ細胞を培養すること（ｃ）が、前記ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖を刺激する樹状細胞または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の存在下で前記トランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することを含み得る項目１または２に記載の方法。
（項目３０）
前記ａＡＰＣが、トランスジェニックＫ５６２細胞である項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ａＡＰＣが、（ｉ）前記トランスジェニックＣＡＲ細胞上で発現した前記ＣＡＲにより標的とされる抗原；（ｉｉ）ＣＤ６４；（ｉｉ）ＣＤ８６；（ｉｉｉ）ＣＤ１３７Ｌ；及び／または（ｖ）前記ａＡＰＣの表面上で発現した膜結合型ＩＬ−１５を含む項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記ａＡＰＣが、前記ａＡＰＣの表面上で発現したＣＡＲ結合抗体またはその断片を含む項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記ａＡＰＣが、Ｔ細胞を活性化または共刺激する付加分子を含む項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記付加分子が、膜結合型Ｃγサイトカインを含む項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記ａＡＰＣが不活性化される項目２９に記載の方法。
（項目３６）
前記ａＡＰＣが照射される項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記ａＡＰＣが、感染性物質について試験し、該感染性物質を含まないことが確認された項目２９に記載の方法。
（項目３８）
ａＡＰＣの存在下で前記トランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することが、ＩＬ−２１及び／またはＩＬ−２を含む培地中で前記トランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することを含む項目２９に記載の方法。
（項目３９）
ａＡＰＣの存在下で前記トランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することが、約１０：１〜約１：１０（ａＡＰＣに対するＣＡＲ細胞）の比率で前記細胞を培養することを含む項目２９に記載の方法。
（項目４０）
前記トランスジェニック細胞を培養すること（ｃ）が、７、１４、２１、２８、３５、または４２日以下である項目１または２に記載の方法。
（項目４１）
前記トランスジェニック細胞を培養すること（ｃ）が、前記トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団の１倍加未満をもたらす項目１または２に記載の方法。
（項目４２）
前記トランスジェニック細胞を培養すること（ｃ）が、前記トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団の少なくとも１倍加をもたらす項目１または２に記載の方法。
（項目４３）
前記トランスジェニック細胞が、ａＡＰＣの存在下でｅｘｖｉｖｏ培養されない項目１または２に記載の方法。
（項目４４）
工程（ｂ）または工程（ｃ）の後にＣＡＲ発現Ｔ細胞の前記細胞集団を濃縮することをさらに含む項目１または２に記載の方法。
（項目４５）
前記濃縮することが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記濃縮することが、ＣＡＲ発現細胞を選別することを含む項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記濃縮することが、常磁性粒子上でＣＡＲ発現細胞を選別することを含む項目４６に記載の方法。
（項目４８）
ＣＡＲ発現細胞を選別することが、ＣＡＲ結合抗体の使用を含む項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記濃縮することが、ＣＤ５６ ^＋細胞の枯渇を含む項目４４に記載の方法。
（項目５０）
前記トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団の試料を凍結保存することをさらに含む項目１または２に記載の方法。
（項目５１）
前記ＣＡＲが、がん細胞抗原を標的にする項目１または２に記載の方法。
（項目５２）
前記がん細胞抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２がん胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒα、κ鎖、λ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３の組み合わせ、またはＨＥＲ１−ＨＥＲ２の組み合わせである項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記がん細胞抗原が、ＣＤ１９であり、前記ＣＡＲが、ＣＤ１９標的ＣＡＲである項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記ＣＡＲが、配列番号１に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ１９標的ＣＡＲである項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ＣＡＲが、ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープタンパク質標的ＣＡＲである項目５２に記載の方法。
（項目５６）
前記ＣＡＲが、モノクローナル抗体６Ｈ５のｓｃＦｖ配列を含む項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ＣＡＲが、病原体抗原を標的にする項目１または２に記載の方法。
（項目５８）
前記病原体が、真菌病原体、ウイルス性病原体、または細菌性病原体である項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記病原体が、マラリア原虫、トリパノソーマ、アスペルギルス、カンジダ、ＨＳＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、またはエボラ病原体である項目５７に記載の方法。
（項目６０）
項目１または２に記載の方法により作製されたＴ細胞組成物。
（項目６１）
疾患を有するヒト対象においてＴ細胞応答をもたらす項目６０に記載の組成物。
（項目６２）
前記疾患が、細胞増殖性疾患である項目６１に記載の組成物。
（項目６３）
前記細胞増殖性疾患が、自己免疫疾患であり、前記ＣＡＲが、前記自己免疫細胞を標的にする項目６１に記載の組成物。
（項目６４）
前記細胞増殖性疾患が、がんであり、前記ＣＡＲが、がん細胞抗原を標的にする項目６２に記載の組成物。
（項目６５）
前記対象が、以前に抗がん治療を経験している項目６１に記載の組成物。
（項目６６）
前記対象が、寛解期であるかまたは、前記対象が、前記がんの症状がないが、検出可能ながん細胞を含む項目６１に記載の組成物。
（項目６７）
前記疾患が、病原体により引き起こされる感染性疾患であり、前記ＣＡＲが、病原体抗原を標的にする項目６１に記載の組成物。
（項目６８）
ＨＥＲＶ−Ｋのエンベロープタンパク質を標的にする発現キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）を含む単離トランスジェニック細胞。
（項目６９）
前記細胞が、ヒト細胞である項目６８に記載の単離細胞。
（項目７０）
前記ＣＡＲをコードするＤＮＡを、前記細胞のゲノム中に組み込む項目６８に記載の単離細胞。
（項目７１）
前記ＣＡＲが、配列番号４に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む項目６８に記載の単離細胞。
（項目７２）
前記ＣＡＲをコードするＤＮＡが、トランスポゾン反復配列によりフランクされる項目６８に記載の単離細胞。
（項目７３）
配列番号５に少なくとも約９０％同一である組み込みＤＮＡ配列を含む項目６８に記載の単離細胞。
（項目７４）
前記ＣＡＲが、モノクローナル抗体６Ｈ５のＣＤＲ配列を含む項目６８に記載の単離細胞。
（項目７５）
前記ＣＡＲが、モノクローナル抗体６Ｈ５のｓｃＦｖ配列を含む項目７３に記載の単離細胞。
（項目７６）
前記ＣＡＲが、配列番号４のアミノ酸配列を含む項目７３に記載の単離細胞。
（項目７７）
前記対象に項目６８に記載のトランスジェニック細胞の有効量を投与することを含む、疾患を有するヒト対象においてＴ細胞応答をもたらす方法。
（項目７８）
発現キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）及び発現膜結合型ＩＬ−１５を含む単離トランスジェニック細胞であって、
前記膜結合型ＩＬ−１５が、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの間の融合タンパク質を含む、前記単離トランスジェニック細胞。
（項目７９）
前記細胞が、ヒト細胞である項目７８に記載の単離細胞。
（項目８０）
前記膜結合型ＩＬ−１５が、配列番号６に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む項目７８に記載の単離細胞。
（項目８１）
前記膜結合型ＩＬ−１５が、配列番号６のアミノ酸配列を含む項目８０に記載の単離細胞。
（項目８２）
配列番号７に少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む項目７８に記載の単離細胞。
（項目８３）
配列番号７のポリヌクレオチド配列を含む項目８２に記載の単離細胞。
（項目８４）
前記ＣＡＲをコードするＤＮＡを、前記細胞のゲノム中に組み込む項目７８に記載の単離細胞。
（項目８５）
前記膜結合型ＩＬ−１５をコードするＤＮＡが、染色体外要素を含む項目７８に記載の単離細胞。
（項目８６）
前記膜結合型ＩＬ−１５をコードするＤＮＡを、前記細胞のゲノム中に組み込む項目７８に記載の単離細胞。
（項目８７）
前記対象に項目７８に記載のトランスジェニック細胞の有効量を投与することを含む、疾患を有するヒト対象においてＴ細胞応答をもたらす方法。
（項目８８）
前記疾患が、がんであり、前記ＣＡＲが、がん細胞抗原を標的にする項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記対象が、以前に抗がん治療を経験している項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記対象が、寛解期である項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記対象が、前記がんの症状がないが、検出可能ながん細胞を含む項目８９に記載の方法。
（項目９２）
配列番号１；配列番号４、または配列番号６に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチド。
（項目９３）
配列番号１に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ１９標的ＣＡＲを含む項目９２に記載のポリペプチド。
（項目９４）
配列番号１のアミノ酸配列を含む項目９３に記載のポリペプチド。
（項目９５）
配列番号４に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＨＥＲＶ−Ｋ標的ＣＡＲを含む項目９２に記載のポリペプチド。
（項目９６）
配列番号４のアミノ酸配列を含む項目９５に記載のポリペプチド。
（項目９７）
配列番号６に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む膜結合型ＩＬ−１５を含む項目９２に記載のポリペプチド。
（項目９８）
配列番号６のアミノ酸配列を含む項目９７に記載のポリペプチド。
（項目９９）
配列番号１；配列番号４、または配列番号６に少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目１００）
配列番号２；配列番号３；配列番号５、または配列番号７に少なくとも９０％同一である配列を含む項目９９に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０１）
項目９２〜９８に記載のポリペプチドまたは項目９９〜１００に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
（項目１０２）
前記細胞が、Ｔ細胞、Ｔ前駆細胞、またはａＡＰＣである項目１０１に記載の宿主細胞。
（項目１０３）
疾患を有するヒト対象においてＴ細胞応答をもたらす方法であって、
（ａ）前記対象から細胞の試料を得ることと、ここで、前記試料は、Ｔ細胞またはＴ前駆細胞を含む；
（ｂ）前記細胞を、トランスポゾンフランクキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡと前記ＣＡＲをコードする前記ＤＮＡを前記細胞のゲノム中に組み込むのに有効なトランスポゼースとでトランスフェクトし、トランスジェニックＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団を提供することと；
（ｃ）必要に応じて、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖を選択的に高める培地中で前記トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団をｅｘｖｉｖｏにて培養することと、ここで、前記トランスジェニックＣＡＲＴ細胞は培養され、仮にそうであったとしても、１８日以下である；
（ｄ）Ｔ細胞応答をもたらすために、前記対象に前記トランスジェニックＣＡＲＴ細胞の有効量を投与することと
を含む、前記方法。
（項目１０４）
疾患を有するヒト対象においてＴ細胞応答をもたらす方法であって、
（ａ）前記対象から細胞の試料を得ることと、ここで、前記試料は、Ｔ細胞またはＴ前駆細胞を含み、前記対象から得た際に、約２０〜２００ｍｌの初期容量を有する；
（ｂ）前記細胞を、トランスポゾンフランクキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡと前記ＣＡＲをコードする前記ＤＮＡを前記細胞のゲノム中に組み込むのに有効なトランスポゼースとでトランスフェクトし、トランスジェニックＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団を提供することと；
（ｃ）必要に応じて、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖を選択的に高める培地中で前記トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団をｅｘｖｉｖｏにて培養することと；
（ｄ）Ｔ細胞応答をもたらすために、前記対象に前記トランスジェニックＣＡＲＴ細胞の有効量を投与することと
を含む、前記方法。

ＰＢ及びＵＣＢからＣＡＲ^＋Ｔ細胞を電気穿孔し、増殖させるプロセスの概要を述べる工程である。図２。ＰＢからの遺伝子改変Ｔ細胞の特性化。（Ａ）遺伝子導入の効率を評価するため、第１の刺激サイクル０日目でのＥＧＦＰの発現（Ｂ）エレクトロポレーションからおおよそ２４時間後、（Ｃ）ａＡＰＣ上で共培養してから２８日後での、ＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋、及びＣＤ４^＋Ｔ細胞上のフローサイトメトリーにより評価された際のＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９ＲＣＤ２８）の発現。同様のＣＡＲ発現が、ＵＣＢ由来Ｔ細胞で観察された。（Ｄ）ＣＡＲ発現の動態。図２。ＰＢからの遺伝子改変Ｔ細胞の特性化。（Ａ）遺伝子導入の効率を評価するため、第１の刺激サイクル０日目でのＥＧＦＰの発現（Ｂ）エレクトロポレーションからおおよそ２４時間後、（Ｃ）ａＡＰＣ上で共培養してから２８日後での、ＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋、及びＣＤ４^＋Ｔ細胞上のフローサイトメトリーにより評価された際のＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９ＲＣＤ２８）の発現。同様のＣＡＲ発現が、ＵＣＢ由来Ｔ細胞で観察された。（Ｄ）ＣＡＲ発現の動態。図２。ＰＢからの遺伝子改変Ｔ細胞の特性化。（Ａ）遺伝子導入の効率を評価するため、第１の刺激サイクル０日目でのＥＧＦＰの発現（Ｂ）エレクトロポレーションからおおよそ２４時間後、（Ｃ）ａＡＰＣ上で共培養してから２８日後での、ＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋、及びＣＤ４^＋Ｔ細胞上のフローサイトメトリーにより評価された際のＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９ＲＣＤ２８）の発現。同様のＣＡＲ発現が、ＵＣＢ由来Ｔ細胞で観察された。（Ｄ）ＣＡＲ発現の動態。ＰＢ由来ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の増殖。組み換えヒト可溶性ＩＬ−２及びＩＬ−２１の存在下で、γ照射ａＡＰＣ上での反復共培養によるＰＢ由来のＣＤ３^＋及びＣＡＲ^＋Ｔ細胞の数的増殖率。上向き矢印は、各刺激サイクルの開始を示すγ照射ａＡＰＣの追加を示す。ＵＣＢ由来ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、同様の数的増殖率を示す。ＰＢ及びＵＣＢ由来のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を遺伝的に改変し、増殖させるため、ＳＢ及びａＡＰＣ系を用いた製造プロセスの概略。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、組み換えヒト可溶性ＩＬ−２及びＩＬ−２１の存在下で、ＳＢ由来超らせんＤＮＡプラスミドの電気導入及びそれに続くＫ５６２由来ａＡＰＣ（クローン＃４）上での共培養により生成された。図５。ａＡＰＣの採取及び特性化。（Ａ、Ｂ）Ｓｅｐａｘ減容。ＶｕｅＬｉｆｅバッグ中で増殖させたａＡＰＣクローン＃４を、ＳｅｐａｘＩＩのＣＳ−４９０．１キットを用いて採取した。Ｓｅｐａｘ採取（Ｓ、ｎ＝４）をマニュアル（Ｍ、ｎ＝１）手順と比較した。平均のプロセス前後の細胞カウント（４．９×１０^８対５×１０^８）は、Ｓｅｐａｘシステムを用いて同様であった。（Ｃ）ａＡＰＣ（クローン＃４）の表現型。Ｋ５６２ａＡＰＣ及びＫ５６２親対照上でＥＧＦＰ（ｍＩＬ−１５−ＥＧＦＰ）と共発現させたＣＤ１９、ＣＤ６４、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、及び膜結合型バージョンのＩＬ−１５（改変ＩｇＧ４Ｆｃ領域に融合したペプチド）の発現を示すフローサイトメトリー分析。図５。ａＡＰＣの採取及び特性化。（Ａ、Ｂ）Ｓｅｐａｘ減容。ＶｕｅＬｉｆｅバッグ中で増殖させたａＡＰＣクローン＃４を、ＳｅｐａｘＩＩのＣＳ−４９０．１キットを用いて採取した。Ｓｅｐａｘ採取（Ｓ、ｎ＝４）をマニュアル（Ｍ、ｎ＝１）手順と比較した。平均のプロセス前後の細胞カウント（４．９×１０^８対５×１０^８）は、Ｓｅｐａｘシステムを用いて同様であった。（Ｃ）ａＡＰＣ（クローン＃４）の表現型。Ｋ５６２ａＡＰＣ及びＫ５６２親対照上でＥＧＦＰ（ｍＩＬ−１５−ＥＧＦＰ）と共発現させたＣＤ１９、ＣＤ６４、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、及び膜結合型バージョンのＩＬ−１５（改変ＩｇＧ４Ｆｃ領域に融合したペプチド）の発現を示すフローサイトメトリー分析。図５。ａＡＰＣの採取及び特性化。（Ａ、Ｂ）Ｓｅｐａｘ減容。ＶｕｅＬｉｆｅバッグ中で増殖させたａＡＰＣクローン＃４を、ＳｅｐａｘＩＩのＣＳ−４９０．１キットを用いて採取した。Ｓｅｐａｘ採取（Ｓ、ｎ＝４）をマニュアル（Ｍ、ｎ＝１）手順と比較した。平均のプロセス前後の細胞カウント（４．９×１０^８対５×１０^８）は、Ｓｅｐａｘシステムを用いて同様であった。（Ｃ）ａＡＰＣ（クローン＃４）の表現型。Ｋ５６２ａＡＰＣ及びＫ５６２親対照上でＥＧＦＰ（ｍＩＬ−１５−ＥＧＦＰ）と共発現させたＣＤ１９、ＣＤ６４、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、及び膜結合型バージョンのＩＬ−１５（改変ＩｇＧ４Ｆｃ領域に融合したペプチド）の発現を示すフローサイトメトリー分析。臨床等級ＣＤ１９特異的Ｔ細胞を生成するプロセスの概略。ＭＣＢ（ＰＡＣＴ）及びＷＣＢ（ＭＤＡＣＣ）をＫ５６２由来ａＡＰＣ（クローン＃４）に対して生成した。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を生成するために、ａＡＰＣをバッグ中で数値的に増殖させ、ＳｅｐａｘＩＩシステムを用いて採取し、照射（１００Ｇｙ）し、後々の使用のために凍結保存した。ＣＤ１９特異的Ｔ細胞は、以下のように製造した；ＰＢＭＣは、ＳｅｐａｘＩＩシステム及び凍結保存を用いて健常ドナーアフェレーシス製品から単離した。その後、ＰＢＭＣを解凍し、ＳＢＤＮＡプラスミド（ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲトランスポゾン、ＳＢ１１トランスポゼース）をヌクレオフェクターＳｙｓｔｅｍを用いて電気穿孔し、サイトカイン（ＩＬ−２及びＩＬ−２１）と共に、解凍した照射ａＡＰＣ上で２８日の培養期間にわたって共培養し、凍結保存した。図７。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型。（Ａ）エレクトロポレーションした次の日（培養１日目）及びＣＤ１９^＋ａＡＰＣが欠如したａＡＰＣクローン＃４上で共培養してから２８日後のＴ細胞上のＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲの発現（Ｂ）ＣＤ３−ζ特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析によるＣＡＲ発現。全細胞溶解物を還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥでランした。分子量マーカー（Ｍ）、親Ｊｕｒｋａｔ細胞（レーン１）、ＣＤ１９ＲＣＤ２８^＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（レーン２）、ＣＡＲ^ｎｅｇ陰性対照一次Ｔ細胞（レーン３）、及びＣＤ１９ＲＣＤ２８^＋Ｔ細胞（レーン４）。（Ｃ）経時的な培養におけるリンパ球ゲート内のＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋ＣＡＲ^＋、及びＣＤ８^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の発現率。各記号は、別の実験を表し；実線は、３つの検証実験の平均である。（Ｄ）共培養の最後（ｄ２８）におけるＣＡＲ^＋Ｔ細胞上のメモリー／ナイーブ、接着、活性化、細胞溶解、及び枯渇マーカーの免疫表現型。図７。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型。（Ａ）エレクトロポレーションした次の日（培養１日目）及びＣＤ１９^＋ａＡＰＣが欠如したａＡＰＣクローン＃４上で共培養してから２８日後のＴ細胞上のＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲの発現（Ｂ）ＣＤ３−ζ特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析によるＣＡＲ発現。全細胞溶解物を還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥでランした。分子量マーカー（Ｍ）、親Ｊｕｒｋａｔ細胞（レーン１）、ＣＤ１９ＲＣＤ２８^＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（レーン２）、ＣＡＲ^ｎｅｇ陰性対照一次Ｔ細胞（レーン３）、及びＣＤ１９ＲＣＤ２８^＋Ｔ細胞（レーン４）。（Ｃ）経時的な培養におけるリンパ球ゲート内のＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋ＣＡＲ^＋、及びＣＤ８^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の発現率。各記号は、別の実験を表し；実線は、３つの検証実験の平均である。（Ｄ）共培養の最後（ｄ２８）におけるＣＡＲ^＋Ｔ細胞上のメモリー／ナイーブ、接着、活性化、細胞溶解、及び枯渇マーカーの免疫表現型。図７。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型。（Ａ）エレクトロポレーションした次の日（培養１日目）及びＣＤ１９^＋ａＡＰＣが欠如したａＡＰＣクローン＃４上で共培養してから２８日後のＴ細胞上のＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲの発現（Ｂ）ＣＤ３−ζ特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析によるＣＡＲ発現。全細胞溶解物を還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥでランした。分子量マーカー（Ｍ）、親Ｊｕｒｋａｔ細胞（レーン１）、ＣＤ１９ＲＣＤ２８^＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（レーン２）、ＣＡＲ^ｎｅｇ陰性対照一次Ｔ細胞（レーン３）、及びＣＤ１９ＲＣＤ２８^＋Ｔ細胞（レーン４）。（Ｃ）経時的な培養におけるリンパ球ゲート内のＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋ＣＡＲ^＋、及びＣＤ８^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の発現率。各記号は、別の実験を表し；実線は、３つの検証実験の平均である。（Ｄ）共培養の最後（ｄ２８）におけるＣＡＲ^＋Ｔ細胞上のメモリー／ナイーブ、接着、活性化、細胞溶解、及び枯渇マーカーの免疫表現型。図７。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型。（Ａ）エレクトロポレーションした次の日（培養１日目）及びＣＤ１９^＋ａＡＰＣが欠如したａＡＰＣクローン＃４上で共培養してから２８日後のＴ細胞上のＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲの発現（Ｂ）ＣＤ３−ζ特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析によるＣＡＲ発現。全細胞溶解物を還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥでランした。分子量マーカー（Ｍ）、親Ｊｕｒｋａｔ細胞（レーン１）、ＣＤ１９ＲＣＤ２８^＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（レーン２）、ＣＡＲ^ｎｅｇ陰性対照一次Ｔ細胞（レーン３）、及びＣＤ１９ＲＣＤ２８^＋Ｔ細胞（レーン４）。（Ｃ）経時的な培養におけるリンパ球ゲート内のＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋ＣＡＲ^＋、及びＣＤ８^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の発現率。各記号は、別の実験を表し；実線は、３つの検証実験の平均である。（Ｄ）共培養の最後（ｄ２８）におけるＣＡＲ^＋Ｔ細胞上のメモリー／ナイーブ、接着、活性化、細胞溶解、及び枯渇マーカーの免疫表現型。図８。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の増殖動態及び再指向特異性。遺伝子改変Ｔ細胞をａＡＰＣクローン＃４と２８日間共培養した。各刺激サイクル（７日）の最後に、細胞を計数し、ＣＡＲ及びＣＤ３の発現用に染色した。３つの検証ラン（Ｖ１、Ｖ２、及びＶ３）を行い、グラフは、経時的に推定された（Ａ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞、（Ｃ）総生細胞を表す。矢印は、培養にａＡＰＣを追加したことを示す。（Ｄ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞による４時間クロム遊離アッセイを用いてＣＤ１９^ｎｅｇＥＬ−４のバックグラウンド溶解と比較したＣＤ１９^＋標的（Ｄａｕｄｉβ_２ｍ、ＮＡＬＭ−６、ＣＤ１９^＋ＥＬ−４）の溶解。３つの検証ランの平均±標準偏差を表す。図８。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の増殖動態及び再指向特異性。遺伝子改変Ｔ細胞をａＡＰＣクローン＃４と２８日間共培養した。各刺激サイクル（７日）の最後に、細胞を計数し、ＣＡＲ及びＣＤ３の発現用に染色した。３つの検証ラン（Ｖ１、Ｖ２、及びＶ３）を行い、グラフは、経時的に推定された（Ａ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞、（Ｃ）総生細胞を表す。矢印は、培養にａＡＰＣを追加したことを示す。（Ｄ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞による４時間クロム遊離アッセイを用いてＣＤ１９^ｎｅｇＥＬ−４のバックグラウンド溶解と比較したＣＤ１９^＋標的（Ｄａｕｄｉβ_２ｍ、ＮＡＬＭ−６、ＣＤ１９^＋ＥＬ−４）の溶解。３つの検証ランの平均±標準偏差を表す。図８。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の増殖動態及び再指向特異性。遺伝子改変Ｔ細胞をａＡＰＣクローン＃４と２８日間共培養した。各刺激サイクル（７日）の最後に、細胞を計数し、ＣＡＲ及びＣＤ３の発現用に染色した。３つの検証ラン（Ｖ１、Ｖ２、及びＶ３）を行い、グラフは、経時的に推定された（Ａ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞、（Ｃ）総生細胞を表す。矢印は、培養にａＡＰＣを追加したことを示す。（Ｄ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞による４時間クロム遊離アッセイを用いてＣＤ１９^ｎｅｇＥＬ−４のバックグラウンド溶解と比較したＣＤ１９^＋標的（Ｄａｕｄｉβ_２ｍ、ＮＡＬＭ−６、ＣＤ１９^＋ＥＬ−４）の溶解。３つの検証ランの平均±標準偏差を表す。図８。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の増殖動態及び再指向特異性。遺伝子改変Ｔ細胞をａＡＰＣクローン＃４と２８日間共培養した。各刺激サイクル（７日）の最後に、細胞を計数し、ＣＡＲ及びＣＤ３の発現用に染色した。３つの検証ラン（Ｖ１、Ｖ２、及びＶ３）を行い、グラフは、経時的に推定された（Ａ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞、（Ｃ）総生細胞を表す。矢印は、培養にａＡＰＣを追加したことを示す。（Ｄ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞による４時間クロム遊離アッセイを用いてＣＤ１９^ｎｅｇＥＬ−４のバックグラウンド溶解と比較したＣＤ１９^＋標的（Ｄａｕｄｉβ_２ｍ、ＮＡＬＭ−６、ＣＤ１９^＋ＥＬ−４）の溶解。３つの検証ランの平均±標準偏差を表す。図９。ＳＢ系に関連する安全性プロフィール。（Ａ）蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ−ＦＩＳＨ）アッセイを用いて細胞のテロメア長を測定した。２８日目の主要Ｔ細胞集団（Ｖ１及びＶ２、ＣＤ８^＋Ｔ細胞；Ｖ３、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を０日目からのＴ細胞のミルテニーカラム精製サブセットとそれぞれ比較した。（Ｂ）ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲに特異的なプライマー及びプローブを用いて、２８日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞からのゲノムＤＮＡを増殖させた。ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて、ＣＤ１９ＲＣＤ２８標的コピー数の相対量（ＲＱ）分析を判断した。これは、参照としてＦＩＳＨ分析から１ゲノム当たりＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ及び正規化群として内因性ＲＮａｓｅＰが１つ組み込まていることが知られている。（Ｃ）２８日目及び３５日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＴＣＲＶβ分析。データは、０日目の非操作対照と比較したＣＡＲ^＋Ｔ細胞の３つの検証ランの平均±標準偏差を示す。（Ｄ）ＳＢ１１トランスポゼース組み込みの欠如を示すゲノムＰＣＲ。ＳＢ１１またはＧＡＰＤＨプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）を増殖させた。ＳＢ１１プライマーを用いて増殖させたＣＡＲ陰性対照Ｔ細胞（レーン５）及びＣＡＲ^＋Ｔ細胞（レーン７）；ＧＡＰＤＨプライマーを用いて増殖させたＣＡＲ陰性対照Ｔ細胞（レーン６）、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（レーン８）、及びＳＢ１１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（レーン４）。ＳＢ１１プライマーを用いて増殖させた、ＳＢ１１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ／ＳＢ１１−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ）（レーン３）及び線状化プラスミドであるｐＫａｎ−ＣＭＶ−ＳＢ１１（レーン２）を陽性対照として用いた。（Ｅ）３つの検証ランからのＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＧバンド核型の構造的または数値変化は全くない。検証２からの代表的な展開を示す。図９。ＳＢ系に関連する安全性プロフィール。（Ａ）蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ−ＦＩＳＨ）アッセイを用いて細胞のテロメア長を測定した。２８日目の主要Ｔ細胞集団（Ｖ１及びＶ２、ＣＤ８^＋Ｔ細胞；Ｖ３、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を０日目からのＴ細胞のミルテニーカラム精製サブセットとそれぞれ比較した。（Ｂ）ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲに特異的なプライマー及びプローブを用いて、２８日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞からのゲノムＤＮＡを増殖させた。ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて、ＣＤ１９ＲＣＤ２８標的コピー数の相対量（ＲＱ）分析を判断した。これは、参照としてＦＩＳＨ分析から１ゲノム当たりＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ及び正規化群として内因性ＲＮａｓｅＰが１つ組み込まていることが知られている。（Ｃ）２８日目及び３５日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＴＣＲＶβ分析。データは、０日目の非操作対照と比較したＣＡＲ^＋Ｔ細胞の３つの検証ランの平均±標準偏差を示す。（Ｄ）ＳＢ１１トランスポゼース組み込みの欠如を示すゲノムＰＣＲ。ＳＢ１１またはＧＡＰＤＨプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）を増殖させた。ＳＢ１１プライマーを用いて増殖させたＣＡＲ陰性対照Ｔ細胞（レーン５）及びＣＡＲ^＋Ｔ細胞（レーン７）；ＧＡＰＤＨプライマーを用いて増殖させたＣＡＲ陰性対照Ｔ細胞（レーン６）、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（レーン８）、及びＳＢ１１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（レーン４）。ＳＢ１１プライマーを用いて増殖させた、ＳＢ１１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ／ＳＢ１１−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ）（レーン３）及び線状化プラスミドであるｐＫａｎ−ＣＭＶ−ＳＢ１１（レーン２）を陽性対照として用いた。（Ｅ）３つの検証ランからのＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＧバンド核型の構造的または数値変化は全くない。検証２からの代表的な展開を示す。図９。ＳＢ系に関連する安全性プロフィール。（Ａ）蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ−ＦＩＳＨ）アッセイを用いて細胞のテロメア長を測定した。２８日目の主要Ｔ細胞集団（Ｖ１及びＶ２、ＣＤ８^＋Ｔ細胞；Ｖ３、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を０日目からのＴ細胞のミルテニーカラム精製サブセットとそれぞれ比較した。（Ｂ）ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲに特異的なプライマー及びプローブを用いて、２８日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞からのゲノムＤＮＡを増殖させた。ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて、ＣＤ１９ＲＣＤ２８標的コピー数の相対量（ＲＱ）分析を判断した。これは、参照としてＦＩＳＨ分析から１ゲノム当たりＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ及び正規化群として内因性ＲＮａｓｅＰが１つ組み込まていることが知られている。（Ｃ）２８日目及び３５日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＴＣＲＶβ分析。データは、０日目の非操作対照と比較したＣＡＲ^＋Ｔ細胞の３つの検証ランの平均±標準偏差を示す。（Ｄ）ＳＢ１１トランスポゼース組み込みの欠如を示すゲノムＰＣＲ。ＳＢ１１またはＧＡＰＤＨプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）を増殖させた。ＳＢ１１プライマーを用いて増殖させたＣＡＲ陰性対照Ｔ細胞（レーン５）及びＣＡＲ^＋Ｔ細胞（レーン７）；ＧＡＰＤＨプライマーを用いて増殖させたＣＡＲ陰性対照Ｔ細胞（レーン６）、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（レーン８）、及びＳＢ１１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（レーン４）。ＳＢ１１プライマーを用いて増殖させた、ＳＢ１１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ／ＳＢ１１−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ）（レーン３）及び線状化プラスミドであるｐＫａｎ−ＣＭＶ−ＳＢ１１（レーン２）を陽性対照として用いた。（Ｅ）３つの検証ランからのＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＧバンド核型の構造的または数値変化は全くない。検証２からの代表的な展開を示す。図９。ＳＢ系に関連する安全性プロフィール。（Ａ）蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ−ＦＩＳＨ）アッセイを用いて細胞のテロメア長を測定した。２８日目の主要Ｔ細胞集団（Ｖ１及びＶ２、ＣＤ８^＋Ｔ細胞；Ｖ３、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を０日目からのＴ細胞のミルテニーカラム精製サブセットとそれぞれ比較した。（Ｂ）ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲに特異的なプライマー及びプローブを用いて、２８日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞からのゲノムＤＮＡを増殖させた。ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて、ＣＤ１９ＲＣＤ２８標的コピー数の相対量（ＲＱ）分析を判断した。これは、参照としてＦＩＳＨ分析から１ゲノム当たりＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ及び正規化群として内因性ＲＮａｓｅＰが１つ組み込まていることが知られている。（Ｃ）２８日目及び３５日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＴＣＲＶβ分析。データは、０日目の非操作対照と比較したＣＡＲ^＋Ｔ細胞の３つの検証ランの平均±標準偏差を示す。（Ｄ）ＳＢ１１トランスポゼース組み込みの欠如を示すゲノムＰＣＲ。ＳＢ１１またはＧＡＰＤＨプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）を増殖させた。ＳＢ１１プライマーを用いて増殖させたＣＡＲ陰性対照Ｔ細胞（レーン５）及びＣＡＲ^＋Ｔ細胞（レーン７）；ＧＡＰＤＨプライマーを用いて増殖させたＣＡＲ陰性対照Ｔ細胞（レーン６）、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（レーン８）、及びＳＢ１１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（レーン４）。ＳＢ１１プライマーを用いて増殖させた、ＳＢ１１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ／ＳＢ１１−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ）（レーン３）及び線状化プラスミドであるｐＫａｎ−ＣＭＶ−ＳＢ１１（レーン２）を陽性対照として用いた。（Ｅ）３つの検証ランからのＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＧバンド核型の構造的または数値変化は全くない。検証２からの代表的な展開を示す。図９。ＳＢ系に関連する安全性プロフィール。（Ａ）蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ−ＦＩＳＨ）アッセイを用いて細胞のテロメア長を測定した。２８日目の主要Ｔ細胞集団（Ｖ１及びＶ２、ＣＤ８^＋Ｔ細胞；Ｖ３、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を０日目からのＴ細胞のミルテニーカラム精製サブセットとそれぞれ比較した。（Ｂ）ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲに特異的なプライマー及びプローブを用いて、２８日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞からのゲノムＤＮＡを増殖させた。ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて、ＣＤ１９ＲＣＤ２８標的コピー数の相対量（ＲＱ）分析を判断した。これは、参照としてＦＩＳＨ分析から１ゲノム当たりＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ及び正規化群として内因性ＲＮａｓｅＰが１つ組み込まていることが知られている。（Ｃ）２８日目及び３５日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＴＣＲＶβ分析。データは、０日目の非操作対照と比較したＣＡＲ^＋Ｔ細胞の３つの検証ランの平均±標準偏差を示す。（Ｄ）ＳＢ１１トランスポゼース組み込みの欠如を示すゲノムＰＣＲ。ＳＢ１１またはＧＡＰＤＨプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）を増殖させた。ＳＢ１１プライマーを用いて増殖させたＣＡＲ陰性対照Ｔ細胞（レーン５）及びＣＡＲ^＋Ｔ細胞（レーン７）；ＧＡＰＤＨプライマーを用いて増殖させたＣＡＲ陰性対照Ｔ細胞（レーン６）、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（レーン８）、及びＳＢ１１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（レーン４）。ＳＢ１１プライマーを用いて増殖させた、ＳＢ１１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ／ＳＢ１１−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ）（レーン３）及び線状化プラスミドであるｐＫａｎ−ＣＭＶ−ＳＢ１１（レーン２）を陽性対照として用いた。（Ｅ）３つの検証ランからのＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＧバンド核型の構造的または数値変化は全くない。検証２からの代表的な展開を示す。ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲトランスポゾンの生成。コドン最適化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＳＢＤＮＡプラスミドｐＴ−ＭＮＤＵ３−ＥＧＦＰを含むＣＤ１９ＲＣＤ２８ｍｚ（ＣｏＯｐ）／ｐＥＫベクター（Ｓｉｎｇｈら、２００８；Ｈｏｌｌｉｓら、２００６）を、ＳｐｅＩ＆ＮｈｅＩ及びＳｐｅＩ＆ＮｒｕＩで消化し、ＣＡＲ及びＥＧＦＰ断片をそれぞれ放出させた。その後、ＥＧＦＰ欠失ｐＴ−ＭＮＤＵ３ベクターをＣＡＲ断片に連結させ、ＣＤ１９ＲＣＤ２８ｍｚ（ＣｏＯｐ）／ｐＴ−ＭＮＤＵ３ベクターを生成した。さらに、カナマイシン耐性遺伝子と、ｐＥＫベクターのＡｓｅＩ＆ＰａｃＩ消化により得られたＣｏｌＥ１複製起点とを、ＳａｌＩ＆ＺｒａＩ消化ＣＤ１９ＲＣＤ２８ｍｚ（ＣｏＯｐ）ｐＴ−ＭＮＤＵ３ベクターに連結させ、プレＣＤ１９ＲＣＤ２８ｍｚ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯを作成した。最後の工程で、ＮｈｅＩ＆ＮｓｉＩによる消化を用いて、プレＣＤ１９ＲＣＤ２８ｍｚ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯからのＭＮＤＵ３プロモーターを放出し、ＸｈｏＩ＆ＮｈｅＩを用いてｐＶｉｔｒｏ４ベクターから得られたｈＥＦ−１ａプロモーター断片に置換し、最終ベクターＣＤ１９ＲＣＤ２９ｍｚ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯを生成した。ＳＢ１１トランスポゼースの生成。ＳＢトランスポゼースベクターｐＣＭＶ−ＳＢ１１をＰｖｕＩＩで消化し、遺伝子をコードするＣＭＶプロモーター／エンハンサー及びＳＢトランスポゼースを含有する断片を放出した、これをカナマイシン耐性遺伝子及びｐＥＫベクターからのＣｏｌＥ１複製起点を含有する断片に連結させ、ｐＫａｎ−ＣＭＶ−ＳＢ１１ベクターを生成した。ＣＤ１９発現プラスミドであるΔＣＤ１９ＣｏＯｐ−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ／ｐＳＢＳＯの概略。プラスミドＣｏＯｐＣＤ１９ＲＣＤ２８／ｐＳＢＳＯからのＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲをコードするＤＮＡ断片を、Ｆ２Ａリンカー（アミノ酸、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；［Ｓｚｙｍｃｚａｋら、２００４；Ｙａｎｇら、２００８；Ｋｉｍら、２０１１］）を介してコドン最適化（ＧＥＮＥＡＲＴ）切断ＣＤ１９（ΔＣＤ１９、［Ｓｅｒｒａｎｏら、２００６；Ｍａｈｍｏｕｄら、１９９９］）に融合したネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）［ｐＳｅｌｅｃｔ−Ｎｅｏ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）からクローンしたＰＣＲ］をコードするＤＮＡ断片と交換し、ΔＣＤ１９ＣｏＯｐ−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ／ｐＳＢＳＯを生成した。ＥＦ１αプロモーター、伸長因子−１αプロモーター；ＮｅｏＲ、ネオマイシン耐性遺伝子；ｂＧＨｐＡｎ、ウシ増殖ホルモンからのポリアデニル化シグナル；ＣｏｌＥ１、ｏｒｉ；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性遺伝子；ＩＲ、ＳＢ逆位／重複配列。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の数的増殖率。遺伝子改変Ｔ細胞を７日間の刺激サイクルでａＡＰＣと共培養し、全体、ＣＤ３^＋、及びＣＡＲ^＋Ｔ細胞の各刺激サイクルの最後に、各検証ランからの週間倍数増殖率を算出した。平均倍数増殖を示す（ｎ＝３）。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の再指向特異性。標準４時間クロミウムアッセイにおける３つの検証ラン（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３）で生成したＣＡＲ^＋Ｔ細胞によるＣＤ１９^＋腫瘍標的（Ｄａｕｄｉβ_２ｍ、ＮＡＬＭ−６、ＣＤ１９^＋ＥＬ−４）のＣＤ１９特異的溶解。ＣＡＲ^ｎｅｇ対照に対するバックグラウンド自己溶解は、１．５％であった。染色体異常に関する安全性。検証ラン（Ｖ１及びＶ３）から生成したＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＧバンド核型の構造的または数値変化は全くない。図１６。（Ａ）アイソタイプＩｇＧ２ａ対照染色（一番下のパネル）と比較した際の、ＨＥＲＶ−Ｋ発現（一番上のパネル）の強度（０〜３で採点）を変えた腫瘍細胞（２００Ｘ）の代表的な写真。（Ｂ）点状で細胞膜（実線矢印）に隣接するＨＥＲＶ−Ｋ染色またはより広範な細胞質染色（点線矢印）を示す腫瘍細胞（４００Ｘ）の写真。（Ｃ）各患者のＨ指数を表すドットプロットは、良性組織と腫瘍組織との間の有意差（ｐ＜０．０２６７）を示した。（Ｄ）悪性腫瘍と転移性腫瘍との間には有意差は見られなかった。良性腫瘍と悪性腫瘍または転移性腫瘍との間には有意差が見られた。図１６。（Ａ）アイソタイプＩｇＧ２ａ対照染色（一番下のパネル）と比較した際の、ＨＥＲＶ−Ｋ発現（一番上のパネル）の強度（０〜３で採点）を変えた腫瘍細胞（２００Ｘ）の代表的な写真。（Ｂ）点状で細胞膜（実線矢印）に隣接するＨＥＲＶ−Ｋ染色またはより広範な細胞質染色（点線矢印）を示す腫瘍細胞（４００Ｘ）の写真。（Ｃ）各患者のＨ指数を表すドットプロットは、良性組織と腫瘍組織との間の有意差（ｐ＜０．０２６７）を示した。（Ｄ）悪性腫瘍と転移性腫瘍との間には有意差は見られなかった。良性腫瘍と悪性腫瘍または転移性腫瘍との間には有意差が見られた。図１６。（Ａ）アイソタイプＩｇＧ２ａ対照染色（一番下のパネル）と比較した際の、ＨＥＲＶ−Ｋ発現（一番上のパネル）の強度（０〜３で採点）を変えた腫瘍細胞（２００Ｘ）の代表的な写真。（Ｂ）点状で細胞膜（実線矢印）に隣接するＨＥＲＶ−Ｋ染色またはより広範な細胞質染色（点線矢印）を示す腫瘍細胞（４００Ｘ）の写真。（Ｃ）各患者のＨ指数を表すドットプロットは、良性組織と腫瘍組織との間の有意差（ｐ＜０．０２６７）を示した。（Ｄ）悪性腫瘍と転移性腫瘍との間には有意差は見られなかった。良性腫瘍と悪性腫瘍または転移性腫瘍との間には有意差が見られた。図１６。（Ａ）アイソタイプＩｇＧ２ａ対照染色（一番下のパネル）と比較した際の、ＨＥＲＶ−Ｋ発現（一番上のパネル）の強度（０〜３で採点）を変えた腫瘍細胞（２００Ｘ）の代表的な写真。（Ｂ）点状で細胞膜（実線矢印）に隣接するＨＥＲＶ−Ｋ染色またはより広範な細胞質染色（点線矢印）を示す腫瘍細胞（４００Ｘ）の写真。（Ｃ）各患者のＨ指数を表すドットプロットは、良性組織と腫瘍組織との間の有意差（ｐ＜０．０２６７）を示した。（Ｄ）悪性腫瘍と転移性腫瘍との間には有意差は見られなかった。良性腫瘍と悪性腫瘍または転移性腫瘍との間には有意差が見られた。図１７。（Ａ）ＳＢプラスミドをコードするＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ。（Ｂ）ＣＤ３^＋ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１日目及び３５日目のＣＡＲ（Ｆｃ）発現を表すフロープロット。フロープロットのクオドラントパーセンテージは、右上隅である。ＣＡＲ、キメラ抗原受容体。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と非特異的ＣＤ−１９ＣＡＲ^＋Ｔ細胞との間の全細胞増殖における有意差はない。（Ｄ）２１日目まで、全てのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ細胞は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞である。（Ｅ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、細胞１個当たり２個未満の組み込みを有することが、ＣＡＲ組み込み分析により示される。データは、３通りで行った３人の異なるドナーによる２つの独立した実験の平均を表す。（Ｆ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型は、高レベルのグランザイムＢを産生するＣＤ３^＋ＣＤ５６^＋ＣＤ４５ＲＯ^ｈｉＣＤ４５ＲＡ^ｌｏＣＤ２７^＋ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ細胞である。全てのデータは、４人のドナーの平均を表す。図１７。（Ａ）ＳＢプラスミドをコードするＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ。（Ｂ）ＣＤ３^＋ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１日目及び３５日目のＣＡＲ（Ｆｃ）発現を表すフロープロット。フロープロットのクオドラントパーセンテージは、右上隅である。ＣＡＲ、キメラ抗原受容体。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と非特異的ＣＤ−１９ＣＡＲ^＋Ｔ細胞との間の全細胞増殖における有意差はない。（Ｄ）２１日目まで、全てのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ細胞は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞である。（Ｅ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、細胞１個当たり２個未満の組み込みを有することが、ＣＡＲ組み込み分析により示される。データは、３通りで行った３人の異なるドナーによる２つの独立した実験の平均を表す。（Ｆ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型は、高レベルのグランザイムＢを産生するＣＤ３^＋ＣＤ５６^＋ＣＤ４５ＲＯ^ｈｉＣＤ４５ＲＡ^ｌｏＣＤ２７^＋ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ細胞である。全てのデータは、４人のドナーの平均を表す。図１７。（Ａ）ＳＢプラスミドをコードするＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ。（Ｂ）ＣＤ３^＋ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１日目及び３５日目のＣＡＲ（Ｆｃ）発現を表すフロープロット。フロープロットのクオドラントパーセンテージは、右上隅である。ＣＡＲ、キメラ抗原受容体。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と非特異的ＣＤ−１９ＣＡＲ^＋Ｔ細胞との間の全細胞増殖における有意差はない。（Ｄ）２１日目まで、全てのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ細胞は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞である。（Ｅ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、細胞１個当たり２個未満の組み込みを有することが、ＣＡＲ組み込み分析により示される。データは、３通りで行った３人の異なるドナーによる２つの独立した実験の平均を表す。（Ｆ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型は、高レベルのグランザイムＢを産生するＣＤ３^＋ＣＤ５６^＋ＣＤ４５ＲＯ^ｈｉＣＤ４５ＲＡ^ｌｏＣＤ２７^＋ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ細胞である。全てのデータは、４人のドナーの平均を表す。図１７。（Ａ）ＳＢプラスミドをコードするＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ。（Ｂ）ＣＤ３^＋ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１日目及び３５日目のＣＡＲ（Ｆｃ）発現を表すフロープロット。フロープロットのクオドラントパーセンテージは、右上隅である。ＣＡＲ、キメラ抗原受容体。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と非特異的ＣＤ−１９ＣＡＲ^＋Ｔ細胞との間の全細胞増殖における有意差はない。（Ｄ）２１日目まで、全てのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ細胞は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞である。（Ｅ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、細胞１個当たり２個未満の組み込みを有することが、ＣＡＲ組み込み分析により示される。データは、３通りで行った３人の異なるドナーによる２つの独立した実験の平均を表す。（Ｆ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型は、高レベルのグランザイムＢを産生するＣＤ３^＋ＣＤ５６^＋ＣＤ４５ＲＯ^ｈｉＣＤ４５ＲＡ^ｌｏＣＤ２７^＋ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ細胞である。全てのデータは、４人のドナーの平均を表す。図１７。（Ａ）ＳＢプラスミドをコードするＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ。（Ｂ）ＣＤ３^＋ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１日目及び３５日目のＣＡＲ（Ｆｃ）発現を表すフロープロット。フロープロットのクオドラントパーセンテージは、右上隅である。ＣＡＲ、キメラ抗原受容体。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と非特異的ＣＤ−１９ＣＡＲ^＋Ｔ細胞との間の全細胞増殖における有意差はない。（Ｄ）２１日目まで、全てのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ細胞は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞である。（Ｅ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、細胞１個当たり２個未満の組み込みを有することが、ＣＡＲ組み込み分析により示される。データは、３通りで行った３人の異なるドナーによる２つの独立した実験の平均を表す。（Ｆ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型は、高レベルのグランザイムＢを産生するＣＤ３^＋ＣＤ５６^＋ＣＤ４５ＲＯ^ｈｉＣＤ４５ＲＡ^ｌｏＣＤ２７^＋ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ細胞である。全てのデータは、４人のドナーの平均を表す。図１７。（Ａ）ＳＢプラスミドをコードするＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ。（Ｂ）ＣＤ３^＋ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１日目及び３５日目のＣＡＲ（Ｆｃ）発現を表すフロープロット。フロープロットのクオドラントパーセンテージは、右上隅である。ＣＡＲ、キメラ抗原受容体。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と非特異的ＣＤ−１９ＣＡＲ^＋Ｔ細胞との間の全細胞増殖における有意差はない。（Ｄ）２１日目まで、全てのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ細胞は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞である。（Ｅ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、細胞１個当たり２個未満の組み込みを有することが、ＣＡＲ組み込み分析により示される。データは、３通りで行った３人の異なるドナーによる２つの独立した実験の平均を表す。（Ｆ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型は、高レベルのグランザイムＢを産生するＣＤ３^＋ＣＤ５６^＋ＣＤ４５ＲＯ^ｈｉＣＤ４５ＲＡ^ｌｏＣＤ２７^＋ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ細胞である。全てのデータは、４人のドナーの平均を表す。図１８。（Ａ）アイソタイプ対照（青色）と比較した腫瘍細胞表面上のＨＥＲＶ−Ｋ抗原発現（赤色）のヒストグラム表現。（Ｂ）無ＤＮＡ対照Ｔ細胞（点線）と比較した、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（実線）の希釈を変化させた黒色腫瘍標的の標準４時間ＣＲＡ。データは、２つの独立した実験からプールした４人の健康なドナー（各ドナーの３重測定のの平均）からの平均±標準偏差である。ボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡを、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と無ＤＮＡ対照細胞との間で、（Ｂ）及び（Ｃ）で行った。ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＣＲＡ、クロム遊離アッセイ；Ｅ：Ｔ、エフェクター対標的の比率。（Ｄ）標的によるインキュベーション時のＣＡＲ^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生。ＰＭＡ−イオノマイシンを陽性対照として用いる。図１８。（Ａ）アイソタイプ対照（青色）と比較した腫瘍細胞表面上のＨＥＲＶ−Ｋ抗原発現（赤色）のヒストグラム表現。（Ｂ）無ＤＮＡ対照Ｔ細胞（点線）と比較した、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（実線）の希釈を変化させた黒色腫瘍標的の標準４時間ＣＲＡ。データは、２つの独立した実験からプールした４人の健康なドナー（各ドナーの３重測定のの平均）からの平均±標準偏差である。ボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡを、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と無ＤＮＡ対照細胞との間で、（Ｂ）及び（Ｃ）で行った。ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＣＲＡ、クロム遊離アッセイ；Ｅ：Ｔ、エフェクター対標的の比率。（Ｄ）標的によるインキュベーション時のＣＡＲ^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生。ＰＭＡ−イオノマイシンを陽性対照として用いる。図１８。（Ａ）アイソタイプ対照（青色）と比較した腫瘍細胞表面上のＨＥＲＶ−Ｋ抗原発現（赤色）のヒストグラム表現。（Ｂ）無ＤＮＡ対照Ｔ細胞（点線）と比較した、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（実線）の希釈を変化させた黒色腫瘍標的の標準４時間ＣＲＡ。データは、２つの独立した実験からプールした４人の健康なドナー（各ドナーの３重測定のの平均）からの平均±標準偏差である。ボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡを、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と無ＤＮＡ対照細胞との間で、（Ｂ）及び（Ｃ）で行った。ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＣＲＡ、クロム遊離アッセイ；Ｅ：Ｔ、エフェクター対標的の比率。（Ｄ）標的によるインキュベーション時のＣＡＲ^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生。ＰＭＡ−イオノマイシンを陽性対照として用いる。図１９。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の特異性。（Ａ）ＨＥＲＶ−Ｋ抗原（黒色）を人工的に発現するＥＬ４細胞のヒストグラムを、ＨＥＲＶ−Ｋ^ｎｅｇＥＬ４親（青色）及びアイソタイプ対照染色（オレンジ色）と共にプロットした。（Ｂ）Ｅ：Ｔ比率を変えたＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞による親と比較した際に、抗原を発現するＥＬ４細胞の殺傷が有意な増加（ｐ＜０．００１）したことが、４時間ＣＲＡにより示された。（Ｃ）免疫ブロットアッセイを行い、スクランブルｓｈＲＮＡで処理したＡ８８８親またはＡ８８８と比較した際に、Ａ８８８細胞においてＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ特異的ｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンが示された。下部パネルは、アクチンタンパク質発現を対照として示す。（Ｄ）Ａ８８８ＨＥＲＶ−ＫＫＤ細胞、Ａ８８８親（Ａ８８８Ｐ）、及びＡ８８８スクランブル対照（Ａ８８８ｓｃｒａ）によるＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＣＲＡにより、Ｔ細胞による有意な抗原特異的殺傷が示された。全てのデータは、３通りで行った３人の異なるドナーによる２つの独立した実験の平均を表す。ボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡを（Ｂ）に用いて、ＥＬ４親とＨＥＲＶ−Ｋ^＋ＥＬ４を比較し、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを（Ｃ）に用いて、Ａ８８８ＫＤと、Ａ８８８Ｐ及びＡ８８８ｓｃｒａとを比較した。図１９。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の特異性。（Ａ）ＨＥＲＶ−Ｋ抗原（黒色）を人工的に発現するＥＬ４細胞のヒストグラムを、ＨＥＲＶ−Ｋ^ｎｅｇＥＬ４親（青色）及びアイソタイプ対照染色（オレンジ色）と共にプロットした。（Ｂ）Ｅ：Ｔ比率を変えたＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞による親と比較した際に、抗原を発現するＥＬ４細胞の殺傷が有意な増加（ｐ＜０．００１）したことが、４時間ＣＲＡにより示された。（Ｃ）免疫ブロットアッセイを行い、スクランブルｓｈＲＮＡで処理したＡ８８８親またはＡ８８８と比較した際に、Ａ８８８細胞においてＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ特異的ｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンが示された。下部パネルは、アクチンタンパク質発現を対照として示す。（Ｄ）Ａ８８８ＨＥＲＶ−ＫＫＤ細胞、Ａ８８８親（Ａ８８８Ｐ）、及びＡ８８８スクランブル対照（Ａ８８８ｓｃｒａ）によるＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＣＲＡにより、Ｔ細胞による有意な抗原特異的殺傷が示された。全てのデータは、３通りで行った３人の異なるドナーによる２つの独立した実験の平均を表す。ボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡを（Ｂ）に用いて、ＥＬ４親とＨＥＲＶ−Ｋ^＋ＥＬ４を比較し、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを（Ｃ）に用いて、Ａ８８８ＫＤと、Ａ８８８Ｐ及びＡ８８８ｓｃｒａとを比較した。図１９。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の特異性。（Ａ）ＨＥＲＶ−Ｋ抗原（黒色）を人工的に発現するＥＬ４細胞のヒストグラムを、ＨＥＲＶ−Ｋ^ｎｅｇＥＬ４親（青色）及びアイソタイプ対照染色（オレンジ色）と共にプロットした。（Ｂ）Ｅ：Ｔ比率を変えたＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞による親と比較した際に、抗原を発現するＥＬ４細胞の殺傷が有意な増加（ｐ＜０．００１）したことが、４時間ＣＲＡにより示された。（Ｃ）免疫ブロットアッセイを行い、スクランブルｓｈＲＮＡで処理したＡ８８８親またはＡ８８８と比較した際に、Ａ８８８細胞においてＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ特異的ｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンが示された。下部パネルは、アクチンタンパク質発現を対照として示す。（Ｄ）Ａ８８８ＨＥＲＶ−ＫＫＤ細胞、Ａ８８８親（Ａ８８８Ｐ）、及びＡ８８８スクランブル対照（Ａ８８８ｓｃｒａ）によるＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＣＲＡにより、Ｔ細胞による有意な抗原特異的殺傷が示された。全てのデータは、３通りで行った３人の異なるドナーによる２つの独立した実験の平均を表す。ボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡを（Ｂ）に用いて、ＥＬ４親とＨＥＲＶ−Ｋ^＋ＥＬ４を比較し、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを（Ｃ）に用いて、Ａ８８８ＫＤと、Ａ８８８Ｐ及びＡ８８８ｓｃｒａとを比較した。図１９。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の特異性。（Ａ）ＨＥＲＶ−Ｋ抗原（黒色）を人工的に発現するＥＬ４細胞のヒストグラムを、ＨＥＲＶ−Ｋ^ｎｅｇＥＬ４親（青色）及びアイソタイプ対照染色（オレンジ色）と共にプロットした。（Ｂ）Ｅ：Ｔ比率を変えたＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞による親と比較した際に、抗原を発現するＥＬ４細胞の殺傷が有意な増加（ｐ＜０．００１）したことが、４時間ＣＲＡにより示された。（Ｃ）免疫ブロットアッセイを行い、スクランブルｓｈＲＮＡで処理したＡ８８８親またはＡ８８８と比較した際に、Ａ８８８細胞においてＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ特異的ｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンが示された。下部パネルは、アクチンタンパク質発現を対照として示す。（Ｄ）Ａ８８８ＨＥＲＶ−ＫＫＤ細胞、Ａ８８８親（Ａ８８８Ｐ）、及びＡ８８８スクランブル対照（Ａ８８８ｓｃｒａ）によるＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＣＲＡにより、Ｔ細胞による有意な抗原特異的殺傷が示された。全てのデータは、３通りで行った３人の異なるドナーによる２つの独立した実験の平均を表す。ボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡを（Ｂ）に用いて、ＥＬ４親とＨＥＲＶ−Ｋ^＋ＥＬ４を比較し、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを（Ｃ）に用いて、Ａ８８８ＫＤと、Ａ８８８Ｐ及びＡ８８８ｓｃｒａとを比較した。図２０。１５時間にわたるＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の活性を判断するため、標的細胞及びエフェクター細胞を、Ｓｙｔｏｘ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、死細胞染色）と共に１：５の比率で培地中に載置した。エフェクター細胞を持つ各標的の５０枚の画像を、この期間に７分刻みで記録した。（Ａ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を持つＨＥＲＶ−Ｋ^＋黒色腫細胞（Ａ８８８及びＡ３７５）及びＨＥＲＶ−Ｋ陰性対照（ＨＥＫ２９３親）細胞を表す写真は、種々の時点である。緑色に変わった細胞は、死細胞として記録し、蛍光の強度を測定した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）標的細胞の平均蛍光強度を表す。上側の線は、死細胞を表すが、下側の線は、生細胞の基礎強度を表す。（Ｅ）プロットは、ＨＥＫ２９３親細胞と比較した１５時間時点での平均蛍光強度における有意差（^＊ｐ＜０．０５）を表す。データは、各々が５０枚の画像を持つ２つの独立した実験の平均を表す。テューキーのポスト検定による一元配置ＡＮＯＶＡを行った。図２０。１５時間にわたるＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の活性を判断するため、標的細胞及びエフェクター細胞を、Ｓｙｔｏｘ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、死細胞染色）と共に１：５の比率で培地中に載置した。エフェクター細胞を持つ各標的の５０枚の画像を、この期間に７分刻みで記録した。（Ａ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を持つＨＥＲＶ−Ｋ^＋黒色腫細胞（Ａ８８８及びＡ３７５）及びＨＥＲＶ−Ｋ陰性対照（ＨＥＫ２９３親）細胞を表す写真は、種々の時点である。緑色に変わった細胞は、死細胞として記録し、蛍光の強度を測定した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）標的細胞の平均蛍光強度を表す。上側の線は、死細胞を表すが、下側の線は、生細胞の基礎強度を表す。（Ｅ）プロットは、ＨＥＫ２９３親細胞と比較した１５時間時点での平均蛍光強度における有意差（^＊ｐ＜０．０５）を表す。データは、各々が５０枚の画像を持つ２つの独立した実験の平均を表す。テューキーのポスト検定による一元配置ＡＮＯＶＡを行った。図２０。１５時間にわたるＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の活性を判断するため、標的細胞及びエフェクター細胞を、Ｓｙｔｏｘ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、死細胞染色）と共に１：５の比率で培地中に載置した。エフェクター細胞を持つ各標的の５０枚の画像を、この期間に７分刻みで記録した。（Ａ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を持つＨＥＲＶ−Ｋ^＋黒色腫細胞（Ａ８８８及びＡ３７５）及びＨＥＲＶ−Ｋ陰性対照（ＨＥＫ２９３親）細胞を表す写真は、種々の時点である。緑色に変わった細胞は、死細胞として記録し、蛍光の強度を測定した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）標的細胞の平均蛍光強度を表す。上側の線は、死細胞を表すが、下側の線は、生細胞の基礎強度を表す。（Ｅ）プロットは、ＨＥＫ２９３親細胞と比較した１５時間時点での平均蛍光強度における有意差（^＊ｐ＜０．０５）を表す。データは、各々が５０枚の画像を持つ２つの独立した実験の平均を表す。テューキーのポスト検定による一元配置ＡＮＯＶＡを行った。図２０。１５時間にわたるＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の活性を判断するため、標的細胞及びエフェクター細胞を、Ｓｙｔｏｘ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、死細胞染色）と共に１：５の比率で培地中に載置した。エフェクター細胞を持つ各標的の５０枚の画像を、この期間に７分刻みで記録した。（Ａ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を持つＨＥＲＶ−Ｋ^＋黒色腫細胞（Ａ８８８及びＡ３７５）及びＨＥＲＶ−Ｋ陰性対照（ＨＥＫ２９３親）細胞を表す写真は、種々の時点である。緑色に変わった細胞は、死細胞として記録し、蛍光の強度を測定した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）標的細胞の平均蛍光強度を表す。上側の線は、死細胞を表すが、下側の線は、生細胞の基礎強度を表す。（Ｅ）プロットは、ＨＥＫ２９３親細胞と比較した１５時間時点での平均蛍光強度における有意差（^＊ｐ＜０．０５）を表す。データは、各々が５０枚の画像を持つ２つの独立した実験の平均を表す。テューキーのポスト検定による一元配置ＡＮＯＶＡを行った。図２０。１５時間にわたるＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の活性を判断するため、標的細胞及びエフェクター細胞を、Ｓｙｔｏｘ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、死細胞染色）と共に１：５の比率で培地中に載置した。エフェクター細胞を持つ各標的の５０枚の画像を、この期間に７分刻みで記録した。（Ａ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を持つＨＥＲＶ−Ｋ^＋黒色腫細胞（Ａ８８８及びＡ３７５）及びＨＥＲＶ−Ｋ陰性対照（ＨＥＫ２９３親）細胞を表す写真は、種々の時点である。緑色に変わった細胞は、死細胞として記録し、蛍光の強度を測定した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）標的細胞の平均蛍光強度を表す。上側の線は、死細胞を表すが、下側の線は、生細胞の基礎強度を表す。（Ｅ）プロットは、ＨＥＫ２９３親細胞と比較した１５時間時点での平均蛍光強度における有意差（^＊ｐ＜０．０５）を表す。データは、各々が５０枚の画像を持つ２つの独立した実験の平均を表す。テューキーのポスト検定による一元配置ＡＮＯＶＡを行った。図２１。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｖｏ抗腫瘍活性。（Ａ）実験の概略。（Ｂ）３日目〜２５日目のマウスの代表的な画像。（Ｃ）ｍＫａｔｅ^＋ｒＲＬｕｃ^＋ＨＥＲＶ−Ｋ^＋Ａ３７５−ＳＭ腫瘍由来のＢＬＩ、及び（Ｄ）ｍＫａｔｅ^＋腫瘍転移性ｆｏｃｉを表す赤色ドットを持つ肝臓組織の事後分析。データは、平均±標準偏差（ｎ＝１グループ当たり５〜６匹のマウス）である。ボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡ（Ｄ）による統計を、処理マウスと未処理マウスとの間で行った。^＊＊Ｐ＜０．０１及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＡＮＯＶＡ、分散分析；ＢＬＩ、生物発光イメージング；ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＩＬ、インターロイキン。図２１。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｖｏ抗腫瘍活性。（Ａ）実験の概略。（Ｂ）３日目〜２５日目のマウスの代表的な画像。（Ｃ）ｍＫａｔｅ^＋ｒＲＬｕｃ^＋ＨＥＲＶ−Ｋ^＋Ａ３７５−ＳＭ腫瘍由来のＢＬＩ、及び（Ｄ）ｍＫａｔｅ^＋腫瘍転移性ｆｏｃｉを表す赤色ドットを持つ肝臓組織の事後分析。データは、平均±標準偏差（ｎ＝１グループ当たり５〜６匹のマウス）である。ボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡ（Ｄ）による統計を、処理マウスと未処理マウスとの間で行った。^＊＊Ｐ＜０．０１及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＡＮＯＶＡ、分散分析；ＢＬＩ、生物発光イメージング；ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＩＬ、インターロイキン。図２１。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｖｏ抗腫瘍活性。（Ａ）実験の概略。（Ｂ）３日目〜２５日目のマウスの代表的な画像。（Ｃ）ｍＫａｔｅ^＋ｒＲＬｕｃ^＋ＨＥＲＶ−Ｋ^＋Ａ３７５−ＳＭ腫瘍由来のＢＬＩ、及び（Ｄ）ｍＫａｔｅ^＋腫瘍転移性ｆｏｃｉを表す赤色ドットを持つ肝臓組織の事後分析。データは、平均±標準偏差（ｎ＝１グループ当たり５〜６匹のマウス）である。ボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡ（Ｄ）による統計を、処理マウスと未処理マウスとの間で行った。^＊＊Ｐ＜０．０１及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＡＮＯＶＡ、分散分析；ＢＬＩ、生物発光イメージング；ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＩＬ、インターロイキン。図２１。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｖｏ抗腫瘍活性。（Ａ）実験の概略。（Ｂ）３日目〜２５日目のマウスの代表的な画像。（Ｃ）ｍＫａｔｅ^＋ｒＲＬｕｃ^＋ＨＥＲＶ−Ｋ^＋Ａ３７５−ＳＭ腫瘍由来のＢＬＩ、及び（Ｄ）ｍＫａｔｅ^＋腫瘍転移性ｆｏｃｉを表す赤色ドットを持つ肝臓組織の事後分析。データは、平均±標準偏差（ｎ＝１グループ当たり５〜６匹のマウス）である。ボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡ（Ｄ）による統計を、処理マウスと未処理マウスとの間で行った。^＊＊Ｐ＜０．０１及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＡＮＯＶＡ、分散分析；ＢＬＩ、生物発光イメージング；ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＩＬ、インターロイキン。図２１。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｖｏ抗腫瘍活性。（Ａ）実験の概略。（Ｂ）３日目〜２５日目のマウスの代表的な画像。（Ｃ）ｍＫａｔｅ^＋ｒＲＬｕｃ^＋ＨＥＲＶ−Ｋ^＋Ａ３７５−ＳＭ腫瘍由来のＢＬＩ、及び（Ｄ）ｍＫａｔｅ^＋腫瘍転移性ｆｏｃｉを表す赤色ドットを持つ肝臓組織の事後分析。データは、平均±標準偏差（ｎ＝１グループ当たり５〜６匹のマウス）である。ボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡ（Ｄ）による統計を、処理マウスと未処理マウスとの間で行った。^＊＊Ｐ＜０．０１及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＡＮＯＶＡ、分散分析；ＢＬＩ、生物発光イメージング；ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＩＬ、インターロイキン。図２２。（Ａ）２９個の正常臓器からの組織部位上のＨＥＲＶ−Ｋ抗原発現の代表的な写真（２００Ｘ）を示す。これらの組織のいずれにも染色が観察されなかったため、Ｈ指数は０として算出した。（Ｂ）種々の臓器及び異なる患者からの悪性腫瘍組織のＨ指数をドットプロットで示す。図２２。（Ａ）２９個の正常臓器からの組織部位上のＨＥＲＶ−Ｋ抗原発現の代表的な写真（２００Ｘ）を示す。これらの組織のいずれにも染色が観察されなかったため、Ｈ指数は０として算出した。（Ｂ）種々の臓器及び異なる患者からの悪性腫瘍組織のＨ指数をドットプロットで示す。図２３。（Ａ）ＣＤ４^＋対ＣＤ８^＋ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の増殖を示す。（Ｂ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞対無ＤＮＡ対照細胞における種々の遺伝子の発現を表すｎＣｏｕｎｔｅｒ分析。赤色は高発現を示すが、緑色は低ｍＲＮＡレベルを示す。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞中で高発現した遺伝子のＩｎｇｅｎｕｉｔｙＰａｔｈｗａｙ解析。図２３。（Ａ）ＣＤ４^＋対ＣＤ８^＋ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の増殖を示す。（Ｂ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞対無ＤＮＡ対照細胞における種々の遺伝子の発現を表すｎＣｏｕｎｔｅｒ分析。赤色は高発現を示すが、緑色は低ｍＲＮＡレベルを示す。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞中で高発現した遺伝子のＩｎｇｅｎｕｉｔｙＰａｔｈｗａｙ解析。図２３。（Ａ）ＣＤ４^＋対ＣＤ８^＋ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の増殖を示す。（Ｂ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞対無ＤＮＡ対照細胞における種々の遺伝子の発現を表すｎＣｏｕｎｔｅｒ分析。赤色は高発現を示すが、緑色は低ｍＲＮＡレベルを示す。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞中で高発現した遺伝子のＩｎｇｅｎｕｉｔｙＰａｔｈｗａｙ解析。黒色腫及びＣＤ１９特異的腫瘍標的並びにＣＤ１９ＣＡＲ^＋Ｔ細胞で４時間標準ＣＲＡを行った。全てのデータは、６人のドナーの平均で行い、かつボンフェローニのポスト検定による二元配置ＡＮＯＶＡを用いて分析した２つの独立した実験を表す。ｈＥＦ−１αプロモーター下のＨＥＲＶ−Ｋ抗原及びＣＭＶプロモーター下のネオマイシン耐性遺伝子をコードする二方向ＳＢプラスミド。腫瘍細胞表面上でＨＥＲＶ−Ｋ抗原（赤色）と係合したＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ（緑色）を表す。図２７。（Ａ）ネオマイシン耐性遺伝子を持つｍｙｃ−ｆｆＬｕｃをコードするＳＢプラスミド。（Ｂ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及びＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ｆｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞の全細胞増殖。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ｆｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞によるＡ３７５ＳＭ及びＥＬ４親細胞の４時間ＣＲＡ。（Ｄ）ｆｆＬｕｃ活性を表すマウス画像。（Ｅ）腫瘍細胞イメージング用にＲＬｕｃ及びｍＫａｔｅをコードするレンチウイルスプラスミド。図２７。（Ａ）ネオマイシン耐性遺伝子を持つｍｙｃ−ｆｆＬｕｃをコードするＳＢプラスミド。（Ｂ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及びＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ｆｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞の全細胞増殖。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ｆｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞によるＡ３７５ＳＭ及びＥＬ４親細胞の４時間ＣＲＡ。（Ｄ）ｆｆＬｕｃ活性を表すマウス画像。（Ｅ）腫瘍細胞イメージング用にＲＬｕｃ及びｍＫａｔｅをコードするレンチウイルスプラスミド。図２７。（Ａ）ネオマイシン耐性遺伝子を持つｍｙｃ−ｆｆＬｕｃをコードするＳＢプラスミド。（Ｂ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及びＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ｆｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞の全細胞増殖。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ｆｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞によるＡ３７５ＳＭ及びＥＬ４親細胞の４時間ＣＲＡ。（Ｄ）ｆｆＬｕｃ活性を表すマウス画像。（Ｅ）腫瘍細胞イメージング用にＲＬｕｃ及びｍＫａｔｅをコードするレンチウイルスプラスミド。図２７。（Ａ）ネオマイシン耐性遺伝子を持つｍｙｃ−ｆｆＬｕｃをコードするＳＢプラスミド。（Ｂ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及びＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ｆｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞の全細胞増殖。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ｆｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞によるＡ３７５ＳＭ及びＥＬ４親細胞の４時間ＣＲＡ。（Ｄ）ｆｆＬｕｃ活性を表すマウス画像。（Ｅ）腫瘍細胞イメージング用にＲＬｕｃ及びｍＫａｔｅをコードするレンチウイルスプラスミド。図２７。（Ａ）ネオマイシン耐性遺伝子を持つｍｙｃ−ｆｆＬｕｃをコードするＳＢプラスミド。（Ｂ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及びＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ｆｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞の全細胞増殖。（Ｃ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ｆｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞によるＡ３７５ＳＭ及びＥＬ４親細胞の４時間ＣＲＡ。（Ｄ）ｆｆＬｕｃ活性を表すマウス画像。（Ｅ）腫瘍細胞イメージング用にＲＬｕｃ及びｍＫａｔｅをコードするレンチウイルスプラスミド。図２８Ａ及び２８Ｂ。ｍＩＬ１５の概略。Ａ）スリーピングビューティ発現プラスミドの成分である逆方向反復によりフランクされるｍＩＬ１５構築物。ｍＩＬ１５ムテインは、フレキシブルなセリン−グリシンリンカーによるＩＬ−１５と全長ＩＬ−１５Ｒαの融合である。Ｂ）ｍＩＬ１５の発現タンパク質構造を表す概略。図２８Ａ及び２８Ｂ。ｍＩＬ１５の概略。Ａ）スリーピングビューティ発現プラスミドの成分である逆方向反復によりフランクされるｍＩＬ１５構築物。ｍＩＬ１５ムテインは、フレキシブルなセリン−グリシンリンカーによるＩＬ−１５と全長ＩＬ−１５Ｒαの融合である。Ｂ）ｍＩＬ１５の発現タンパク質構造を表す概略。図２９Ａ及び２９Ｂ。５回の刺激サイクル後、ａＡＰＣ上でのｅｘｖｉｖｏ増殖後の遺伝子改変Ｔ細胞中のＣＡＲ及びｍＩＬ１５発現。Ａ）５人のドナー代表的な試料の発現。Ｂ）遺伝子改変Ｔ細胞中の表示マーカー（ＣＡＲ及び／またはｍＩＬ１５）の発現。図２９Ａ及び２９Ｂ。５回の刺激サイクル後、ａＡＰＣ上でのｅｘｖｉｖｏ増殖後の遺伝子改変Ｔ細胞中のＣＡＲ及びｍＩＬ１５発現。Ａ）５人のドナー代表的な試料の発現。Ｂ）遺伝子改変Ｔ細胞中の表示マーカー（ＣＡＲ及び／またはｍＩＬ１５）の発現。ｐＳＴＡＴ５のフォスフローを介したｍＩＬ１５の機能性の検証。基礎及びＩＬ−１５媒介リン酸化を得るために、特に断りのない限り、無血清及び無サイトカイン条件における細胞の５時間インキュベーション。代表的なプロット（ｎ＝６）。ａＡＰＣ上で４回の刺激サイクル後のｍＩＬ１５の共発現の有無に関わらないＣＡＲ^＋Ｔ細胞の推定カウント。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を可溶性ＩＬ−２及びＩＬ−２１（標準培養条件）またはＩＬ−１５及びＩＬ−２１（可溶性サイトカイン対照）で培養し、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞をＩＬ−２１で培養した。データは、平均±標準偏差であり、ｎ＝４である。図３２Ａ及び３２Ｂ。ｅｘｖｉｖｏ増殖させたｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型及び特異的溶解能。Ａ）ａＡＰＣ上で４回刺激した後の特定のＴ細胞マーカー、活性化マーカー、及び分化関連マーカーの表面発現率。水平ラインは、平均値を示す。^＊Ｐ＝０．０４７、対応有ｔ検定、ｎ＞４。Ｂ）４時間クロム遊離アッセイからのＣＤ１９^＋またはＣＤ１９^ｎｅｇ標的のａＡＰＣ上で５回刺激した後のＣＡＲ^＋Ｔ細胞（左側パネル）及びｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（右側パネル）の特異的溶解。データは、平均±標準偏差として表し、ｎ＝３である。図３２Ａ及び３２Ｂ。ｅｘｖｉｖｏ増殖させたｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型及び特異的溶解能。Ａ）ａＡＰＣ上で４回刺激した後の特定のＴ細胞マーカー、活性化マーカー、及び分化関連マーカーの表面発現率。水平ラインは、平均値を示す。^＊Ｐ＝０．０４７、対応有ｔ検定、ｎ＞４。Ｂ）４時間クロム遊離アッセイからのＣＤ１９^＋またはＣＤ１９^ｎｅｇ標的のａＡＰＣ上で５回刺激した後のＣＡＲ^＋Ｔ細胞（左側パネル）及びｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（右側パネル）の特異的溶解。データは、平均±標準偏差として表し、ｎ＝３である。図３３。ＡＩＣＤに対して機能的に適格かつ耐性を保持するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｔｒｏ長期持続性。Ａ）４回のａＡＰＣ刺激の後にＥｘｖｉｖｏ増殖させたｍＩＬ１５^＋／−ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、長期ｉｎｖｉｔｒｏ持続性を評価し、かつ６０＋日にわたる増殖動態を観察するために、抗原再刺激から離脱させた。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、いずれの外因性サイトカインサポートも受けなかったが、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、無サイトカイン、ＩＬ−２、またはＩＬ−１５を受けた。データは、平均±標準偏差の対数であり、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ＲＭＡＮＯＶＡ、ｎ＝３である。Ｂ）抗原暴露後７５日を超える生存Ｔ細胞を、無標的、ＣＤ１９^＋／−ＥＬ４、ＣＤ１９^＋Ｎａｌｍ−６、またはＬＡＣと６時間インキュベーションすることによる抗原応答性について試験した。ＩＦＮγ細胞内染色のフローサイトメトリーによる分析を行った。代表的なフロープロットを示し、ｎ＝３である。Ｃ）離脱後７５日の生存Ｔ細胞を、前述したようにａＡＰＣと１：１で刺激して試験し、培地は、離脱培養メンテナンス^＋ＩＬ−２１の追加中に用いたサイトカイン（あるとすれば）で補充した。８日後、Ｔ細胞をアネキシンＶで染色し、刺激培養における生細胞対アポトーシス／壊死細胞の割合を判断した。代表的なフロープロットを示し、ｎ＝３である。図３３。ＡＩＣＤに対して機能的に適格かつ耐性を保持するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｔｒｏ長期持続性。Ａ）４回のａＡＰＣ刺激の後にＥｘｖｉｖｏ増殖させたｍＩＬ１５^＋／−ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、長期ｉｎｖｉｔｒｏ持続性を評価し、かつ６０＋日にわたる増殖動態を観察するために、抗原再刺激から離脱させた。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、いずれの外因性サイトカインサポートも受けなかったが、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、無サイトカイン、ＩＬ−２、またはＩＬ−１５を受けた。データは、平均±標準偏差の対数であり、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ＲＭＡＮＯＶＡ、ｎ＝３である。Ｂ）抗原暴露後７５日を超える生存Ｔ細胞を、無標的、ＣＤ１９^＋／−ＥＬ４、ＣＤ１９^＋Ｎａｌｍ−６、またはＬＡＣと６時間インキュベーションすることによる抗原応答性について試験した。ＩＦＮγ細胞内染色のフローサイトメトリーによる分析を行った。代表的なフロープロットを示し、ｎ＝３である。Ｃ）離脱後７５日の生存Ｔ細胞を、前述したようにａＡＰＣと１：１で刺激して試験し、培地は、離脱培養メンテナンス^＋ＩＬ−２１の追加中に用いたサイトカイン（あるとすれば）で補充した。８日後、Ｔ細胞をアネキシンＶで染色し、刺激培養における生細胞対アポトーシス／壊死細胞の割合を判断した。代表的なフロープロットを示し、ｎ＝３である。図３３。ＡＩＣＤに対して機能的に適格かつ耐性を保持するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｔｒｏ長期持続性。Ａ）４回のａＡＰＣ刺激の後にＥｘｖｉｖｏ増殖させたｍＩＬ１５^＋／−ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、長期ｉｎｖｉｔｒｏ持続性を評価し、かつ６０＋日にわたる増殖動態を観察するために、抗原再刺激から離脱させた。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、いずれの外因性サイトカインサポートも受けなかったが、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、無サイトカイン、ＩＬ−２、またはＩＬ−１５を受けた。データは、平均±標準偏差の対数であり、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ＲＭＡＮＯＶＡ、ｎ＝３である。Ｂ）抗原暴露後７５日を超える生存Ｔ細胞を、無標的、ＣＤ１９^＋／−ＥＬ４、ＣＤ１９^＋Ｎａｌｍ−６、またはＬＡＣと６時間インキュベーションすることによる抗原応答性について試験した。ＩＦＮγ細胞内染色のフローサイトメトリーによる分析を行った。代表的なフロープロットを示し、ｎ＝３である。Ｃ）離脱後７５日の生存Ｔ細胞を、前述したようにａＡＰＣと１：１で刺激して試験し、培地は、離脱培養メンテナンス^＋ＩＬ−２１の追加中に用いたサイトカイン（あるとすれば）で補充した。８日後、Ｔ細胞をアネキシンＶで染色し、刺激培養における生細胞対アポトーシス／壊死細胞の割合を判断した。代表的なフロープロットを示し、ｎ＝３である。図３４Ａ乃至３４Ｃ。長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、二又のＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋／−表現型になる。Ａ）４刺激からのｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、及び最後の抗原刺激後に７５日間持続するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７集団の代表的なフロープロット、ｎ＝７。Ｂ）（Ａ）からの集団サブセットの頻度。^＊＊＊Ｐ＜０．００１及び^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ＲＭＡＮＯＶＡ、ｎ＝７。Ｃ）４刺激からのｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、及び最後の抗原刺激後に７５日間持続するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＣＣＲ７^ｎｅｇ及びＣＣＲ７^＋におけるアネキシンＶレベルを示す代表的なヒストグラム、ｎ＝３。ヒストグラムは、非特異的ＣＣＲ７染色を避けるためにリンパ球集団上でゲートされる。図３４Ａ乃至３４Ｃ。長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、二又のＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋／−表現型になる。Ａ）４刺激からのｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、及び最後の抗原刺激後に７５日間持続するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７集団の代表的なフロープロット、ｎ＝７。Ｂ）（Ａ）からの集団サブセットの頻度。^＊＊＊Ｐ＜０．００１及び^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ＲＭＡＮＯＶＡ、ｎ＝７。Ｃ）４刺激からのｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、及び最後の抗原刺激後に７５日間持続するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＣＣＲ７^ｎｅｇ及びＣＣＲ７^＋におけるアネキシンＶレベルを示す代表的なヒストグラム、ｎ＝３。ヒストグラムは、非特異的ＣＣＲ７染色を避けるためにリンパ球集団上でゲートされる。図３４Ａ乃至３４Ｃ。長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、二又のＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋／−表現型になる。Ａ）４刺激からのｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、及び最後の抗原刺激後に７５日間持続するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７集団の代表的なフロープロット、ｎ＝７。Ｂ）（Ａ）からの集団サブセットの頻度。^＊＊＊Ｐ＜０．００１及び^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ＲＭＡＮＯＶＡ、ｎ＝７。Ｃ）４刺激からのｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、及び最後の抗原刺激後に７５日間持続するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＣＣＲ７^ｎｅｇ及びＣＣＲ７^＋におけるアネキシンＶレベルを示す代表的なヒストグラム、ｎ＝３。ヒストグラムは、非特異的ＣＣＲ７染色を避けるためにリンパ球集団上でゲートされる。図３５Ａ乃至３５Ｄ。グラフは、フローサイトメトリー分析によるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の追加の特性化を示す。図３５Ａ、１〜２年間の抗原再刺激のない培養下にあった３人の健常ドナー（染色後１０日でＰＫＨ希釈）からのＷＤ−ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の恒常的増殖レベル（一番上のパネル）、及びａＡＰＣによる抗原再刺激時のこれらの細胞の増殖能（一番下のパネル）。図３５Ｂ、染色体分析に提出された長期離脱ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（ＣＤ３及びｍＩＬ１５表面発現）の表現型。まず、表現型検査及び染色体分析用に提出前に、離脱Ｔ細胞をａＡＰＣで再刺激した。図３５Ｃ、抗原再刺激及び外因性サイトカインの不在下においてｉｎｖｉｔｒｏで長期間（１．５〜２．４６年）持続するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の正常核型（Ｇ−バンディング）結果。４人の健常ドナーからの代表的な分裂中期展開を示す。図３５Ｄ、Ｋ５６２ａＡＰＣを用いた細胞の刺激後のメモリー動態。図３Ｅ、ＣＡＲ及びｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１対２刺激によるメモリー動態。図３５Ａ乃至３５Ｄ。グラフは、フローサイトメトリー分析によるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の追加の特性化を示す。図３５Ａ、１〜２年間の抗原再刺激のない培養下にあった３人の健常ドナー（染色後１０日でＰＫＨ希釈）からのＷＤ−ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の恒常的増殖レベル（一番上のパネル）、及びａＡＰＣによる抗原再刺激時のこれらの細胞の増殖能（一番下のパネル）。図３５Ｂ、染色体分析に提出された長期離脱ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（ＣＤ３及びｍＩＬ１５表面発現）の表現型。まず、表現型検査及び染色体分析用に提出前に、離脱Ｔ細胞をａＡＰＣで再刺激した。図３５Ｃ、抗原再刺激及び外因性サイトカインの不在下においてｉｎｖｉｔｒｏで長期間（１．５〜２．４６年）持続するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の正常核型（Ｇ−バンディング）結果。４人の健常ドナーからの代表的な分裂中期展開を示す。図３５Ｄ、Ｋ５６２ａＡＰＣを用いた細胞の刺激後のメモリー動態。図３Ｅ、ＣＡＲ及びｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１対２刺激によるメモリー動態。図３５Ａ乃至３５Ｄ。グラフは、フローサイトメトリー分析によるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の追加の特性化を示す。図３５Ａ、１〜２年間の抗原再刺激のない培養下にあった３人の健常ドナー（染色後１０日でＰＫＨ希釈）からのＷＤ−ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の恒常的増殖レベル（一番上のパネル）、及びａＡＰＣによる抗原再刺激時のこれらの細胞の増殖能（一番下のパネル）。図３５Ｂ、染色体分析に提出された長期離脱ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（ＣＤ３及びｍＩＬ１５表面発現）の表現型。まず、表現型検査及び染色体分析用に提出前に、離脱Ｔ細胞をａＡＰＣで再刺激した。図３５Ｃ、抗原再刺激及び外因性サイトカインの不在下においてｉｎｖｉｔｒｏで長期間（１．５〜２．４６年）持続するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の正常核型（Ｇ−バンディング）結果。４人の健常ドナーからの代表的な分裂中期展開を示す。図３５Ｄ、Ｋ５６２ａＡＰＣを用いた細胞の刺激後のメモリー動態。図３Ｅ、ＣＡＲ及びｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１対２刺激によるメモリー動態。図３５Ａ乃至３５Ｄ。グラフは、フローサイトメトリー分析によるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の追加の特性化を示す。図３５Ａ、１〜２年間の抗原再刺激のない培養下にあった３人の健常ドナー（染色後１０日でＰＫＨ希釈）からのＷＤ−ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の恒常的増殖レベル（一番上のパネル）、及びａＡＰＣによる抗原再刺激時のこれらの細胞の増殖能（一番下のパネル）。図３５Ｂ、染色体分析に提出された長期離脱ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（ＣＤ３及びｍＩＬ１５表面発現）の表現型。まず、表現型検査及び染色体分析用に提出前に、離脱Ｔ細胞をａＡＰＣで再刺激した。図３５Ｃ、抗原再刺激及び外因性サイトカインの不在下においてｉｎｖｉｔｒｏで長期間（１．５〜２．４６年）持続するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の正常核型（Ｇ−バンディング）結果。４人の健常ドナーからの代表的な分裂中期展開を示す。図３５Ｄ、Ｋ５６２ａＡＰＣを用いた細胞の刺激後のメモリー動態。図３Ｅ、ＣＡＲ及びｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１対２刺激によるメモリー動態。図３５Ａ乃至３５Ｄ。グラフは、フローサイトメトリー分析によるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の追加の特性化を示す。図３５Ａ、１〜２年間の抗原再刺激のない培養下にあった３人の健常ドナー（染色後１０日でＰＫＨ希釈）からのＷＤ−ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の恒常的増殖レベル（一番上のパネル）、及びａＡＰＣによる抗原再刺激時のこれらの細胞の増殖能（一番下のパネル）。図３５Ｂ、染色体分析に提出された長期離脱ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（ＣＤ３及びｍＩＬ１５表面発現）の表現型。まず、表現型検査及び染色体分析用に提出前に、離脱Ｔ細胞をａＡＰＣで再刺激した。図３５Ｃ、抗原再刺激及び外因性サイトカインの不在下においてｉｎｖｉｔｒｏで長期間（１．５〜２．４６年）持続するｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の正常核型（Ｇ−バンディング）結果。４人の健常ドナーからの代表的な分裂中期展開を示す。図３５Ｄ、Ｋ５６２ａＡＰＣを用いた細胞の刺激後のメモリー動態。図３Ｅ、ＣＡＲ及びｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１対２刺激によるメモリー動態。長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が分化の程度が低いＴ細胞サブセットと関連した特徴を示すことが、分子プロファイリングにより示される。４刺激からｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞間で著しく特異的に発現した全ての遺伝子、及び離脱条件を通じて持続するものは、遺伝子オントロジー情報に基づいて広義のカテゴリー下で機能的に分類される。カテゴリー内の遺伝子は、持続性離脱ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞における上方または下方調節に基づいて区分される。長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が低分化状態を示すことが、Ｔ細胞分化状態と関連する転写因子の検証により示される。一番上のパネル：選択特異的発現遺伝子（Ｔｃｆ−７、Ｂｌｉｍｐ−１、及びＴ−ｂｅｔ）を細胞内染色により検証し、フローサイトメトリーにより分析した。代表的なフロープロットを示し、ｎ＝５である。一番下のパネル：ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システム出力からの正規化ｍＲＮＡコピー数。図３８。長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が低分化を示すことが、Ｔ細胞分化状態と関連する表面マーカーの検証により示される。一番上のパネル：選択特異的発現遺伝子であるＩＬ−７Ｒａ及びＣＣＲ７を染色により検証し、フローサイトメトリーにより分析した。^＊Ｐ＝０．０１５６及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１、それぞれ、１−テイルドウィルコクソン・マッチドペア・サインド・ランク検定及び対応有１−テイルドＴ検定。代表的なフロープロットを示し、ｎ＝５〜７である。一番下のパネル：ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システム出力からの正規化ｍＲＮＡコピー数、ｎ＝３。図３８。長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が低分化を示すことが、Ｔ細胞分化状態と関連する表面マーカーの検証により示される。一番上のパネル：選択特異的発現遺伝子であるＩＬ−７Ｒａ及びＣＣＲ７を染色により検証し、フローサイトメトリーにより分析した。^＊Ｐ＝０．０１５６及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１、それぞれ、１−テイルドウィルコクソン・マッチドペア・サインド・ランク検定及び対応有１−テイルドＴ検定。代表的なフロープロットを示し、ｎ＝５〜７である。一番下のパネル：ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システム出力からの正規化ｍＲＮＡコピー数、ｎ＝３。図３８。長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が低分化を示すことが、Ｔ細胞分化状態と関連する表面マーカーの検証により示される。一番上のパネル：選択特異的発現遺伝子であるＩＬ−７Ｒａ及びＣＣＲ７を染色により検証し、フローサイトメトリーにより分析した。^＊Ｐ＝０．０１５６及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１、それぞれ、１−テイルドウィルコクソン・マッチドペア・サインド・ランク検定及び対応有１−テイルドＴ検定。代表的なフロープロットを示し、ｎ＝５〜７である。一番下のパネル：ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システム出力からの正規化ｍＲＮＡコピー数、ｎ＝３。図３８。長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が低分化を示すことが、Ｔ細胞分化状態と関連する表面マーカーの検証により示される。一番上のパネル：選択特異的発現遺伝子であるＩＬ−７Ｒａ及びＣＣＲ７を染色により検証し、フローサイトメトリーにより分析した。^＊Ｐ＝０．０１５６及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１、それぞれ、１−テイルドウィルコクソン・マッチドペア・サインド・ランク検定及び対応有１−テイルドＴ検定。代表的なフロープロットを示し、ｎ＝５〜７である。一番下のパネル：ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システム出力からの正規化ｍＲＮＡコピー数、ｎ＝３。図３９。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞によるＩＬ−２産生能力の獲得。Ａ）４刺激及び刺激しないかまたはリンパ球活性化カクテル（ＬＡＣ）で６時間活性化されたかいずれかの後、細胞内ＩＬ−２染色をし、フローサイトメトリーにより分析した持続性抗原離脱ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（ＷＤ−ｍＩＬ１５−ＣＡＲ）のＩＬ−２細胞内染色の代表的なヒストグラム。Ｂ）（Ａ）からのＩＬ−２を産生するＬＡＣ刺激Ｔ細胞の頻度。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎ＝６、対応有ｔ検定。図３９。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞によるＩＬ−２産生能力の獲得。Ａ）４刺激及び刺激しないかまたはリンパ球活性化カクテル（ＬＡＣ）で６時間活性化されたかいずれかの後、細胞内ＩＬ−２染色をし、フローサイトメトリーにより分析した持続性抗原離脱ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（ＷＤ−ｍＩＬ１５−ＣＡＲ）のＩＬ−２細胞内染色の代表的なヒストグラム。Ｂ）（Ａ）からのＩＬ−２を産生するＬＡＣ刺激Ｔ細胞の頻度。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎ＝６、対応有ｔ検定。図４０Ａ乃至４０Ｄ。腫瘍抗原が豊富な環境におけるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｖｏ持続性及び抗腫瘍活性。Ａ）実験の概略。Ｂ）Ｎａｌｍ−６腫瘍導入後のマウスに養子導入したｍＩＬ１５^＋／−ＣＡＲ^＋ｆｆｌｕｃ^＋Ｔ細胞由来のＢＬＩ（ｎ＝５）。Ｃ）ヒトＣＤ３で染色によるヒトＴ細胞の存在について１４日目の脾臓（一番上のパネル）及び骨髄（一番下のパネル）の分析、及びフローサイトメトリーによる検出。代表的なフロープロット（ｎ＝５）。Ｄ）ＣＤ３^＋及びＣＤ１９^＋細胞の存在についてフローサイトメトリーによる末梢血液の分析。マウスＣＤ４５^＋細胞をゲートアウトした後に得られた頻度。データは、個々のマウス及び平均±標準偏差を示す。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、１元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３〜５。図４０Ａ乃至４０Ｄ。腫瘍抗原が豊富な環境におけるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｖｏ持続性及び抗腫瘍活性。Ａ）実験の概略。Ｂ）Ｎａｌｍ−６腫瘍導入後のマウスに養子導入したｍＩＬ１５^＋／−ＣＡＲ^＋ｆｆｌｕｃ^＋Ｔ細胞由来のＢＬＩ（ｎ＝５）。Ｃ）ヒトＣＤ３で染色によるヒトＴ細胞の存在について１４日目の脾臓（一番上のパネル）及び骨髄（一番下のパネル）の分析、及びフローサイトメトリーによる検出。代表的なフロープロット（ｎ＝５）。Ｄ）ＣＤ３^＋及びＣＤ１９^＋細胞の存在についてフローサイトメトリーによる末梢血液の分析。マウスＣＤ４５^＋細胞をゲートアウトした後に得られた頻度。データは、個々のマウス及び平均±標準偏差を示す。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、１元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３〜５。図４０Ａ乃至４０Ｄ。腫瘍抗原が豊富な環境におけるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｖｏ持続性及び抗腫瘍活性。Ａ）実験の概略。Ｂ）Ｎａｌｍ−６腫瘍導入後のマウスに養子導入したｍＩＬ１５^＋／−ＣＡＲ^＋ｆｆｌｕｃ^＋Ｔ細胞由来のＢＬＩ（ｎ＝５）。Ｃ）ヒトＣＤ３で染色によるヒトＴ細胞の存在について１４日目の脾臓（一番上のパネル）及び骨髄（一番下のパネル）の分析、及びフローサイトメトリーによる検出。代表的なフロープロット（ｎ＝５）。Ｄ）ＣＤ３^＋及びＣＤ１９^＋細胞の存在についてフローサイトメトリーによる末梢血液の分析。マウスＣＤ４５^＋細胞をゲートアウトした後に得られた頻度。データは、個々のマウス及び平均±標準偏差を示す。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、１元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３〜５。図４０Ａ乃至４０Ｄ。腫瘍抗原が豊富な環境におけるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｖｏ持続性及び抗腫瘍活性。Ａ）実験の概略。Ｂ）Ｎａｌｍ−６腫瘍導入後のマウスに養子導入したｍＩＬ１５^＋／−ＣＡＲ^＋ｆｆｌｕｃ^＋Ｔ細胞由来のＢＬＩ（ｎ＝５）。Ｃ）ヒトＣＤ３で染色によるヒトＴ細胞の存在について１４日目の脾臓（一番上のパネル）及び骨髄（一番下のパネル）の分析、及びフローサイトメトリーによる検出。代表的なフロープロット（ｎ＝５）。Ｄ）ＣＤ３^＋及びＣＤ１９^＋細胞の存在についてフローサイトメトリーによる末梢血液の分析。マウスＣＤ４５^＋細胞をゲートアウトした後に得られた頻度。データは、個々のマウス及び平均±標準偏差を示す。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、１元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３〜５。図４１Ａ乃至４１Ｅ。低抗原環境におけるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の持続性及び抗腫瘍効果のＩｎｖｉｖｏモデル評価。Ａ）実験の概略。Ｂ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞またはｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のいずれかの養子導入を受けた後、Ｔ細胞生着の６日後にＣＤ１９^＋Ｎａｌｍ−６腫瘍注入したマウスのＴ細胞（ｆｆＬｕｃ^＋）ＢＬＩ。Ｃ）Ｎａｌｍ−６負荷の縦方向ＢＬＩモニタリング。画像は、Ｎａｌｍ−６細胞由来ｒＬｕｃ活性からの光子束を表す。Ｄ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、または無Ｔ細胞のいずれかで処理したマウスの経時的な腫瘍光束（ｒＬｕｃ）。データは、平均±標準偏差である。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝４〜５。Ｅ）採取した組織及び血液の分析。ここで、ヒトＴ細胞（ヒトＣＤ３^＋）及びＮａｌｍ−６腫瘍細胞（ヒトＣＤ１９^＋）をフローサイトメトリーにより検出した。Ｅ）低腫瘍モデルを用いて、マウスの長期生存について９８日目まで評価した。実験条件は、低腫瘍モデルについて前述したのと同様に行い、ｍＩＬ１５−ＣＡＲＴ細胞（ｎ＝７）、ＣＡＲＴ細胞（ｎ＝８）、または無Ｔ細胞（ｎ＝８）でマウスを生着した後、ＮＡＬＭ−６腫瘍抗原投与を行った。括弧内の分数は、９８日目までのマウス生存の割合を表す。^＊Ｐ＝０．０４５（ｍＩＬ１５−ＣＡＲ対ＣＡＲＴ細胞治療）、ログランク（マンテル・コックス）。図４１Ａ乃至４１Ｅ。低抗原環境におけるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の持続性及び抗腫瘍効果のＩｎｖｉｖｏモデル評価。Ａ）実験の概略。Ｂ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞またはｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のいずれかの養子導入を受けた後、Ｔ細胞生着の６日後にＣＤ１９^＋Ｎａｌｍ−６腫瘍注入したマウスのＴ細胞（ｆｆＬｕｃ^＋）ＢＬＩ。Ｃ）Ｎａｌｍ−６負荷の縦方向ＢＬＩモニタリング。画像は、Ｎａｌｍ−６細胞由来ｒＬｕｃ活性からの光子束を表す。Ｄ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、または無Ｔ細胞のいずれかで処理したマウスの経時的な腫瘍光束（ｒＬｕｃ）。データは、平均±標準偏差である。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝４〜５。Ｅ）採取した組織及び血液の分析。ここで、ヒトＴ細胞（ヒトＣＤ３^＋）及びＮａｌｍ−６腫瘍細胞（ヒトＣＤ１９^＋）をフローサイトメトリーにより検出した。Ｅ）低腫瘍モデルを用いて、マウスの長期生存について９８日目まで評価した。実験条件は、低腫瘍モデルについて前述したのと同様に行い、ｍＩＬ１５−ＣＡＲＴ細胞（ｎ＝７）、ＣＡＲＴ細胞（ｎ＝８）、または無Ｔ細胞（ｎ＝８）でマウスを生着した後、ＮＡＬＭ−６腫瘍抗原投与を行った。括弧内の分数は、９８日目までのマウス生存の割合を表す。^＊Ｐ＝０．０４５（ｍＩＬ１５−ＣＡＲ対ＣＡＲＴ細胞治療）、ログランク（マンテル・コックス）。図４１Ａ乃至４１Ｅ。低抗原環境におけるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の持続性及び抗腫瘍効果のＩｎｖｉｖｏモデル評価。Ａ）実験の概略。Ｂ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞またはｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のいずれかの養子導入を受けた後、Ｔ細胞生着の６日後にＣＤ１９^＋Ｎａｌｍ−６腫瘍注入したマウスのＴ細胞（ｆｆＬｕｃ^＋）ＢＬＩ。Ｃ）Ｎａｌｍ−６負荷の縦方向ＢＬＩモニタリング。画像は、Ｎａｌｍ−６細胞由来ｒＬｕｃ活性からの光子束を表す。Ｄ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、または無Ｔ細胞のいずれかで処理したマウスの経時的な腫瘍光束（ｒＬｕｃ）。データは、平均±標準偏差である。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝４〜５。Ｅ）採取した組織及び血液の分析。ここで、ヒトＴ細胞（ヒトＣＤ３^＋）及びＮａｌｍ−６腫瘍細胞（ヒトＣＤ１９^＋）をフローサイトメトリーにより検出した。Ｅ）低腫瘍モデルを用いて、マウスの長期生存について９８日目まで評価した。実験条件は、低腫瘍モデルについて前述したのと同様に行い、ｍＩＬ１５−ＣＡＲＴ細胞（ｎ＝７）、ＣＡＲＴ細胞（ｎ＝８）、または無Ｔ細胞（ｎ＝８）でマウスを生着した後、ＮＡＬＭ−６腫瘍抗原投与を行った。括弧内の分数は、９８日目までのマウス生存の割合を表す。^＊Ｐ＝０．０４５（ｍＩＬ１５−ＣＡＲ対ＣＡＲＴ細胞治療）、ログランク（マンテル・コックス）。図４１Ａ乃至４１Ｅ。低抗原環境におけるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の持続性及び抗腫瘍効果のＩｎｖｉｖｏモデル評価。Ａ）実験の概略。Ｂ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞またはｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のいずれかの養子導入を受けた後、Ｔ細胞生着の６日後にＣＤ１９^＋Ｎａｌｍ−６腫瘍注入したマウスのＴ細胞（ｆｆＬｕｃ^＋）ＢＬＩ。Ｃ）Ｎａｌｍ−６負荷の縦方向ＢＬＩモニタリング。画像は、Ｎａｌｍ−６細胞由来ｒＬｕｃ活性からの光子束を表す。Ｄ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、または無Ｔ細胞のいずれかで処理したマウスの経時的な腫瘍光束（ｒＬｕｃ）。データは、平均±標準偏差である。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝４〜５。Ｅ）採取した組織及び血液の分析。ここで、ヒトＴ細胞（ヒトＣＤ３^＋）及びＮａｌｍ−６腫瘍細胞（ヒトＣＤ１９^＋）をフローサイトメトリーにより検出した。Ｅ）低腫瘍モデルを用いて、マウスの長期生存について９８日目まで評価した。実験条件は、低腫瘍モデルについて前述したのと同様に行い、ｍＩＬ１５−ＣＡＲＴ細胞（ｎ＝７）、ＣＡＲＴ細胞（ｎ＝８）、または無Ｔ細胞（ｎ＝８）でマウスを生着した後、ＮＡＬＭ−６腫瘍抗原投与を行った。括弧内の分数は、９８日目までのマウス生存の割合を表す。^＊Ｐ＝０．０４５（ｍＩＬ１５−ＣＡＲ対ＣＡＲＴ細胞治療）、ログランク（マンテル・コックス）。図４１Ａ乃至４１Ｅ。低抗原環境におけるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の持続性及び抗腫瘍効果のＩｎｖｉｖｏモデル評価。Ａ）実験の概略。Ｂ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞またはｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のいずれかの養子導入を受けた後、Ｔ細胞生着の６日後にＣＤ１９^＋Ｎａｌｍ−６腫瘍注入したマウスのＴ細胞（ｆｆＬｕｃ^＋）ＢＬＩ。Ｃ）Ｎａｌｍ−６負荷の縦方向ＢＬＩモニタリング。画像は、Ｎａｌｍ−６細胞由来ｒＬｕｃ活性からの光子束を表す。Ｄ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、または無Ｔ細胞のいずれかで処理したマウスの経時的な腫瘍光束（ｒＬｕｃ）。データは、平均±標準偏差である。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝４〜５。Ｅ）採取した組織及び血液の分析。ここで、ヒトＴ細胞（ヒトＣＤ３^＋）及びＮａｌｍ−６腫瘍細胞（ヒトＣＤ１９^＋）をフローサイトメトリーにより検出した。Ｅ）低腫瘍モデルを用いて、マウスの長期生存について９８日目まで評価した。実験条件は、低腫瘍モデルについて前述したのと同様に行い、ｍＩＬ１５−ＣＡＲＴ細胞（ｎ＝７）、ＣＡＲＴ細胞（ｎ＝８）、または無Ｔ細胞（ｎ＝８）でマウスを生着した後、ＮＡＬＭ−６腫瘍抗原投与を行った。括弧内の分数は、９８日目までのマウス生存の割合を表す。^＊Ｐ＝０．０４５（ｍＩＬ１５−ＣＡＲ対ＣＡＲＴ細胞治療）、ログランク（マンテル・コックス）。低抗原環境におけるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の持続性及び抗腫瘍効果のＩｎｖｉｖｏモデル評価。Ａ）実験の概略。Ｂ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞またはｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のいずれかの養子導入を受けた後、Ｔ細胞生着の６日後にＣＤ１９^＋Ｎａｌｍ−６腫瘍注入したマウスのＴ細胞（ｆｆＬｕｃ^＋）ＢＬＩ。Ｃ）Ｎａｌｍ−６負荷の縦方向ＢＬＩモニタリング。画像は、Ｎａｌｍ−６細胞由来ｒＬｕｃ活性からの光子束を表す。Ｄ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、または無Ｔ細胞のいずれかで処理したマウスの経時的な腫瘍光束（ｒＬｕｃ）。データは、平均±標準偏差である。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝４〜５。Ｅ）採取した組織及び血液の分析。ここで、ヒトＴ細胞（ヒトＣＤ３^＋）及びＮａｌｍ−６腫瘍細胞（ヒトＣＤ１９^＋）をフローサイトメトリーにより検出した。Ｅ）低腫瘍モデルを用いて、マウスの長期生存について９８日目まで評価した。実験条件は、低腫瘍モデルについて前述したのと同様に行い、ｍＩＬ１５−ＣＡＲＴ細胞（ｎ＝７）、ＣＡＲＴ細胞（ｎ＝８）、または無Ｔ細胞（ｎ＝８）でマウスを生着した後、ＮＡＬＭ−６腫瘍抗原投与を行った。括弧内の分数は、９８日目までのマウス生存の割合を表す。^＊Ｐ＝０．０４５（ｍＩＬ１５−ＣＡＲ対ＣＡＲＴ細胞治療）、ログランク（マンテル・コックス）。図４２Ａ乃至４２Ｅ。抗原に依存しないｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の持続性及び保持機能。Ａ）実験の概略。Ｂ）腫瘍抗原の不在下においてＣＡＲ＋及びｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞で処理したマウスのｆｆＬｕｃ＋Ｔ細胞のＢＬＩ。Ｃ）フローサイトメトリーにより検出した際の、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋腫瘍細胞の骨髄、脾臓、及び末梢血液の分析。代表的なフロープロット（左側パネル）及びヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のプロット頻度（右側パネル）を示す。データは、平均±標準偏差として表し、ｎ＝５である。^＊＊Ｐ＝０．００２７（骨髄）、^＊＊Ｐ＝０．００８１（脾臓）、ｎｓ＝無有意、対応なしｔ検定。Ｄ）Ｔ細胞光束（ｆｆｌｕｃ）の縦方向プロット。バックグラウンド発光（灰色陰影）は、ｆｆｌｕｃ＋Ｔ細胞を受けていないマウスから得た光束で定義した。データは、平均±標準偏差として表し、ｎ＝５である。^＊Ｐ＝０．０１２８、^＊＊Ｐ^＋０．００２３１、対応なしｔ検定。Ｅ）脾臓、肝臓、または骨髄から単離した細胞を、ａＡＰＣ上でｅｘｖｉｖｏ増殖させ、ＣＤ１９−及びＣＤ１９＋標的（前述したように）に応答した細胞内ＩＦＮγ産生を評価するための十分な細胞数を生成した。３つの組織源及び４匹のマウスからｎ＝７である。ヒストグラムをＣＤ３上でゲートした。図４２Ａ乃至４２Ｅ。抗原に依存しないｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の持続性及び保持機能。Ａ）実験の概略。Ｂ）腫瘍抗原の不在下においてＣＡＲ＋及びｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞で処理したマウスのｆｆＬｕｃ＋Ｔ細胞のＢＬＩ。Ｃ）フローサイトメトリーにより検出した際の、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋腫瘍細胞の骨髄、脾臓、及び末梢血液の分析。代表的なフロープロット（左側パネル）及びヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のプロット頻度（右側パネル）を示す。データは、平均±標準偏差として表し、ｎ＝５である。^＊＊Ｐ＝０．００２７（骨髄）、^＊＊Ｐ＝０．００８１（脾臓）、ｎｓ＝無有意、対応なしｔ検定。Ｄ）Ｔ細胞光束（ｆｆｌｕｃ）の縦方向プロット。バックグラウンド発光（灰色陰影）は、ｆｆｌｕｃ＋Ｔ細胞を受けていないマウスから得た光束で定義した。データは、平均±標準偏差として表し、ｎ＝５である。^＊Ｐ＝０．０１２８、^＊＊Ｐ^＋０．００２３１、対応なしｔ検定。Ｅ）脾臓、肝臓、または骨髄から単離した細胞を、ａＡＰＣ上でｅｘｖｉｖｏ増殖させ、ＣＤ１９−及びＣＤ１９＋標的（前述したように）に応答した細胞内ＩＦＮγ産生を評価するための十分な細胞数を生成した。３つの組織源及び４匹のマウスからｎ＝７である。ヒストグラムをＣＤ３上でゲートした。図４２Ａ乃至４２Ｅ。抗原に依存しないｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の持続性及び保持機能。Ａ）実験の概略。Ｂ）腫瘍抗原の不在下においてＣＡＲ＋及びｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞で処理したマウスのｆｆＬｕｃ＋Ｔ細胞のＢＬＩ。Ｃ）フローサイトメトリーにより検出した際の、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋腫瘍細胞の骨髄、脾臓、及び末梢血液の分析。代表的なフロープロット（左側パネル）及びヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のプロット頻度（右側パネル）を示す。データは、平均±標準偏差として表し、ｎ＝５である。^＊＊Ｐ＝０．００２７（骨髄）、^＊＊Ｐ＝０．００８１（脾臓）、ｎｓ＝無有意、対応なしｔ検定。Ｄ）Ｔ細胞光束（ｆｆｌｕｃ）の縦方向プロット。バックグラウンド発光（灰色陰影）は、ｆｆｌｕｃ＋Ｔ細胞を受けていないマウスから得た光束で定義した。データは、平均±標準偏差として表し、ｎ＝５である。^＊Ｐ＝０．０１２８、^＊＊Ｐ^＋０．００２３１、対応なしｔ検定。Ｅ）脾臓、肝臓、または骨髄から単離した細胞を、ａＡＰＣ上でｅｘｖｉｖｏ増殖させ、ＣＤ１９−及びＣＤ１９＋標的（前述したように）に応答した細胞内ＩＦＮγ産生を評価するための十分な細胞数を生成した。３つの組織源及び４匹のマウスからｎ＝７である。ヒストグラムをＣＤ３上でゲートした。図４２Ａ乃至４２Ｅ。抗原に依存しないｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の持続性及び保持機能。Ａ）実験の概略。Ｂ）腫瘍抗原の不在下においてＣＡＲ＋及びｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞で処理したマウスのｆｆＬｕｃ＋Ｔ細胞のＢＬＩ。Ｃ）フローサイトメトリーにより検出した際の、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋腫瘍細胞の骨髄、脾臓、及び末梢血液の分析。代表的なフロープロット（左側パネル）及びヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のプロット頻度（右側パネル）を示す。データは、平均±標準偏差として表し、ｎ＝５である。^＊＊Ｐ＝０．００２７（骨髄）、^＊＊Ｐ＝０．００８１（脾臓）、ｎｓ＝無有意、対応なしｔ検定。Ｄ）Ｔ細胞光束（ｆｆｌｕｃ）の縦方向プロット。バックグラウンド発光（灰色陰影）は、ｆｆｌｕｃ＋Ｔ細胞を受けていないマウスから得た光束で定義した。データは、平均±標準偏差として表し、ｎ＝５である。^＊Ｐ＝０．０１２８、^＊＊Ｐ^＋０．００２３１、対応なしｔ検定。Ｅ）脾臓、肝臓、または骨髄から単離した細胞を、ａＡＰＣ上でｅｘｖｉｖｏ増殖させ、ＣＤ１９−及びＣＤ１９＋標的（前述したように）に応答した細胞内ＩＦＮγ産生を評価するための十分な細胞数を生成した。３つの組織源及び４匹のマウスからｎ＝７である。ヒストグラムをＣＤ３上でゲートした。図４２Ａ乃至４２Ｅ。抗原に依存しないｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の持続性及び保持機能。Ａ）実験の概略。Ｂ）腫瘍抗原の不在下においてＣＡＲ＋及びｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞で処理したマウスのｆｆＬｕｃ＋Ｔ細胞のＢＬＩ。Ｃ）フローサイトメトリーにより検出した際の、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋腫瘍細胞の骨髄、脾臓、及び末梢血液の分析。代表的なフロープロット（左側パネル）及びヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のプロット頻度（右側パネル）を示す。データは、平均±標準偏差として表し、ｎ＝５である。^＊＊Ｐ＝０．００２７（骨髄）、^＊＊Ｐ＝０．００８１（脾臓）、ｎｓ＝無有意、対応なしｔ検定。Ｄ）Ｔ細胞光束（ｆｆｌｕｃ）の縦方向プロット。バックグラウンド発光（灰色陰影）は、ｆｆｌｕｃ＋Ｔ細胞を受けていないマウスから得た光束で定義した。データは、平均±標準偏差として表し、ｎ＝５である。^＊Ｐ＝０．０１２８、^＊＊Ｐ^＋０．００２３１、対応なしｔ検定。Ｅ）脾臓、肝臓、または骨髄から単離した細胞を、ａＡＰＣ上でｅｘｖｉｖｏ増殖させ、ＣＤ１９−及びＣＤ１９＋標的（前述したように）に応答した細胞内ＩＦＮγ産生を評価するための十分な細胞数を生成した。３つの組織源及び４匹のマウスからｎ＝７である。ヒストグラムをＣＤ３上でゲートした。ｍＲＮＡとして提供されるＳＢトランスポゼースを用いたＣＡＲＴ細胞作製用のプロトコルの一例を示す概略。有効量の活性ＣＡＲＴ細胞は、２週間またはそれ以内（例えば、１６日）で作製することができた。図４４Ａ乃至４４Ｄ。図４４Ａ、ＣＡＲを安定的に発現するＴ細胞の百分率が、９日目（８．３％）〜１６日目（６６．２％）に有意に増加することを示すグラフ（左側パネル）及びフローサイトメトリーヒストグラム（右側パネル）。図４４Ｂ、Ｔ細胞が急速に増殖し、エレクトロポレーション後１６日目に２０倍に増加することを示すグラフ。図４４Ｃ、１６日目のＴ細胞を用いたクロム遊離アッセイからの結果を示すグラフ。作製されたＣＡＲＴ細胞は、標的細胞に対してＣＤ−１９特異的細胞毒性をもたらした（左側パネル）。本質的に、非改変Ｔ細胞には細胞毒性活性が見られなかった（右側パネル）。図４４Ｄ、エレクトロポレーション後９日目（左側パネル）及び１７日目（右側パネル）のセントラルメモリーＴ細胞数（Ｔｃｍ）を示すフローサイトメトリーヒストグラム。これらの研究用の細胞は、＃Oとして指名されたドナーから得、ＳＢ１１ｍＲＮＡをエレクトロポレーションで用いた。図４４Ａ乃至４４Ｄ。図４４Ａ、ＣＡＲを安定的に発現するＴ細胞の百分率が、９日目（８．３％）〜１６日目（６６．２％）に有意に増加することを示すグラフ（左側パネル）及びフローサイトメトリーヒストグラム（右側パネル）。図４４Ｂ、Ｔ細胞が急速に増殖し、エレクトロポレーション後１６日目に２０倍に増加することを示すグラフ。図４４Ｃ、１６日目のＴ細胞を用いたクロム遊離アッセイからの結果を示すグラフ。作製されたＣＡＲＴ細胞は、標的細胞に対してＣＤ−１９特異的細胞毒性をもたらした（左側パネル）。本質的に、非改変Ｔ細胞には細胞毒性活性が見られなかった（右側パネル）。図４４Ｄ、エレクトロポレーション後９日目（左側パネル）及び１７日目（右側パネル）のセントラルメモリーＴ細胞数（Ｔｃｍ）を示すフローサイトメトリーヒストグラム。これらの研究用の細胞は、＃Oとして指名されたドナーから得、ＳＢ１１ｍＲＮＡをエレクトロポレーションで用いた。図４４Ａ乃至４４Ｄ。図４４Ａ、ＣＡＲを安定的に発現するＴ細胞の百分率が、９日目（８．３％）〜１６日目（６６．２％）に有意に増加することを示すグラフ（左側パネル）及びフローサイトメトリーヒストグラム（右側パネル）。図４４Ｂ、Ｔ細胞が急速に増殖し、エレクトロポレーション後１６日目に２０倍に増加することを示すグラフ。図４４Ｃ、１６日目のＴ細胞を用いたクロム遊離アッセイからの結果を示すグラフ。作製されたＣＡＲＴ細胞は、標的細胞に対してＣＤ−１９特異的細胞毒性をもたらした（左側パネル）。本質的に、非改変Ｔ細胞には細胞毒性活性が見られなかった（右側パネル）。図４４Ｄ、エレクトロポレーション後９日目（左側パネル）及び１７日目（右側パネル）のセントラルメモリーＴ細胞数（Ｔｃｍ）を示すフローサイトメトリーヒストグラム。これらの研究用の細胞は、＃Oとして指名されたドナーから得、ＳＢ１１ｍＲＮＡをエレクトロポレーションで用いた。図４４Ａ乃至４４Ｄ。図４４Ａ、ＣＡＲを安定的に発現するＴ細胞の百分率が、９日目（８．３％）〜１６日目（６６．２％）に有意に増加することを示すグラフ（左側パネル）及びフローサイトメトリーヒストグラム（右側パネル）。図４４Ｂ、Ｔ細胞が急速に増殖し、エレクトロポレーション後１６日目に２０倍に増加することを示すグラフ。図４４Ｃ、１６日目のＴ細胞を用いたクロム遊離アッセイからの結果を示すグラフ。作製されたＣＡＲＴ細胞は、標的細胞に対してＣＤ−１９特異的細胞毒性をもたらした（左側パネル）。本質的に、非改変Ｔ細胞には細胞毒性活性が見られなかった（右側パネル）。図４４Ｄ、エレクトロポレーション後９日目（左側パネル）及び１７日目（右側パネル）のセントラルメモリーＴ細胞数（Ｔｃｍ）を示すフローサイトメトリーヒストグラム。これらの研究用の細胞は、＃Oとして指名されたドナーから得、ＳＢ１１ｍＲＮＡをエレクトロポレーションで用いた。図４５Ａ及び４５Ｂ。図４５Ａ、９日目（上側パネル）及び１５日目（下側パネル）のＴ細胞を用いたクロム遊離アッセイからの結果を示すグラフ。作製されたＣＡＲＴ細胞は、標的細胞に対してＣＤ−１９特異的細胞毒性をもたらした（左側パネル）。本質的に、非改変Ｔ細胞には細胞毒性活性が見られなかった（右側パネル）。改変Ｔ細胞は、異なるＣＡＲ陽性細胞数にかかわらず、同様の効率で９日目及び１５日目にＣＤ１９陽性標的細胞を殺傷する。図４５Ｂ、電気穿孔細胞内のＣＡＲコピー数（左側パネル）及びＣＡＲ発現（右側パネル）を示すグラフ。ＣＡＲＤＮＡコピー数は、１５日目から２２日目に１．５から０．９に減少し、その時点以後は安定していることを結果は示している。これらの研究用の細胞は、＃１として指名されたドナーから得、ＳＢ１００ｘｍＲＮＡをエレクトロポレーションで用いた。図４５Ａ及び４５Ｂ。図４５Ａ、９日目（上側パネル）及び１５日目（下側パネル）のＴ細胞を用いたクロム遊離アッセイからの結果を示すグラフ。作製されたＣＡＲＴ細胞は、標的細胞に対してＣＤ−１９特異的細胞毒性をもたらした（左側パネル）。本質的に、非改変Ｔ細胞には細胞毒性活性が見られなかった（右側パネル）。改変Ｔ細胞は、異なるＣＡＲ陽性細胞数にかかわらず、同様の効率で９日目及び１５日目にＣＤ１９陽性標的細胞を殺傷する。図４５Ｂ、電気穿孔細胞内のＣＡＲコピー数（左側パネル）及びＣＡＲ発現（右側パネル）を示すグラフ。ＣＡＲＤＮＡコピー数は、１５日目から２２日目に１．５から０．９に減少し、その時点以後は安定していることを結果は示している。これらの研究用の細胞は、＃１として指名されたドナーから得、ＳＢ１００ｘｍＲＮＡをエレクトロポレーションで用いた。エレクトロポレーション後の細胞生存率を示すフローサイトメトリーデータ。ＤＮＡ／ｍＲＮＡでエレクトロポレーション後、全細胞数はまず減少し（１日目及び２日目）、その後、細胞は増殖し始める。セロメーターカウントによれば、細胞数は、エレクトロポレーション後２日目に５９％〜７６％まで減少する（生存率２４〜４１％）。

所望の特異性を有するように遺伝子改変されたＴ細胞を受けた患者における抗腫瘍効果が、臨床試験により実証されている。ここで、ｃＧＭＰに従って抗原特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を製造する新規のアプローチについて詳述する。システムは、トランスポゾン及びトランスポゼースシステムＣＡＲ遺伝子組み込と併用して、高効率のトランスフェクションシステムを用いる。臨床等級ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が追加のウイルス配列を好ましくは含むべきではないため、これらの非ウイルスアプローチは、ウイルス媒介形質導入に代わる方法として著しい利点を有する。高品質のｃＧＭＰＣＡＲＴ細胞は、スリーピングビューティまたはｐｉｇｇｙＢａｃ由来などのトランスポゾンシステム由来のＤＮＡプラスミドの電気導入、及びａＡＰＣ上の遺伝子改変Ｔ細胞の増殖により達成した。これらの標的抗原（例えば、ＣＤ１９）に特異性を示したＣＡＲ^＋Ｔ細胞を臨床的に魅力的な数に増殖することが、本アプローチによりもたらされた。重要なのは、臨床試験で用いるためにＦＤＡにより確立された放出基準を細胞が満たしたことである。ウイルス媒介形質導入による遺伝毒性、及びウイルスの使用による免疫原性が、これらの方法により回避される。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に依存しない細胞表面腫瘍関連抗原を認識し、殺傷、増殖、及びサイトカイン産生用の遺伝子改変Ｔ細胞を活性化するために１つ以上のシグナル伝達分子を用いる（Ｊｅｎａら、２０１０）。ＣＡＲを発現するＴ細胞の養子導入は、複数の臨床試験で効果を発揮している。臨床等級遺伝子改変Ｔ細胞を製造するためにモジュラーアプローチを用いることが可能である。ある実施形態では、本明細書で開示されているプラットフォーム技術は、（ｉ）エレクトロポレーション装置（例えば、ヌクレオフェクター）を用いた非ウイルス遺伝子導入、（ｉｉ）転位（例えば、ＳＢトランスポゾン、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４８９，４５８号を参照されたい）、（ｉｉｉ）エンドドメインを介して伝達するＣＡＲ（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３−ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３−ζ、または他の組み合わせ）、（ｉｖ）抗原認識ドメインを細胞表面に連結させる可変長の細胞外ドメインを持つＣＡＲ、場合によっては、（ｖ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞ロバストかつ数値的に増殖させることが可能な、Ｋ５６２由来の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）（Ｓｉｎｇｈら、２００８；Ｓｉｎｇｈら、２０１１；Ｈｕａｎｇら、２０１２）を含む。

いくつかの実施形態では、現時点で開示されたプロセスを用いて、末梢血液及び／または臍帯血由来のＴ細胞を遺伝的に改変し、ａＡＰＣを用いてｉｎｖｉｔｒｏで数値的に増殖させることが可能なＣＡＲを発現することができる（Ｓｉｎｇｈら、２００８；Ｓｉｎｇｈら、２０１１）。このプロセスは、ＤＮＡプラスミド産生、エレクトロポレーション、解凍済γ照射マスターバンクａＡＰＣの使用が比較的容易なことにより、細胞及び遺伝子治療に対する影響があり、かつ、フェーズＩ／ＩＩ試験用の現行の医薬品製造管理及び品質管理基準（ｃＧＭＰ）に従って動作する施設に容易に移すことができる。Ｔ細胞を製造する開示の方法は、（ｉ）ウイルス形質導入または（ｉｉ）裸のＤＮＡエレクトロポレーションを使用せずに、ＰＢＭＣ／ＬＣＬフィーダー層上で急速に増殖する点において少なくとも特有である。一例として、ＨＬＡに依存せずにＣＤ１９を認識するＣＡＲの強制発現を介してＣＤ１９を標的にする方法を開示する。これらのＴ細胞は、無菌状態、表現型、生存率、及び細胞数で定義した放出基準を満たす。電気穿孔した／増殖させたＴ細胞が、メモリー／ナイーブ集団中でＣＡＲを発現し、正常核型の保存ＴＣＲＶβレパートリーを有し、かつＣＡＲ依存的にＣＤ１９^＋腫瘍標的を認識し溶解することが可能であることが、処理中試験により分かった。

組み換えＧＭＰ級のウイルスのおおよそ１／１０のコストでＤＮＡ種を臨床等級に作製することができるため、非ウイルスプラスミドの電気導入は、形質導入の魅力的な代替選択肢である。組み込み効率を改善するため、発明者らは、ヒト応用のためのスリーピングビューティ（ＳＢ）トランスポゾン及びトランスポゼースを適合させた（Ａｒｏｎｏｖｉｃｈら、２０１１；Ｈａｃｋｅｔｔら、２０１０；Ｉｚｓｖａｋら、２０１０；Ｋｅｂｒｉａｅｉら、２０１２；Ｗｉｌｌｉａｍｓ、２００８）。さらに、発明者らは、ＣＡＲの発現を強制するためにｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン／トランスポゼースシステムを使用した（Ｍａｎｕｒｉら、２０１０）。発明者のＳＢ系は、注目の遺伝子（例えば、指定ＣＤ１９ＲＣＤ２８などの第２世代ＣＤ１９特異的ＣＡＲ導入遺伝子）及びトランスポゼース（例えば、ＳＢ１１）のトランスポゾンコーディングを含む２つのＤＮＡプラスミドを使用し、これにより、導入遺伝子を標的細胞ゲノム中のＴＡジヌクレオチド反復に挿入する（Ｇｅｕｒｔｓら、２００６；Ｉｖｉｃｓら、１９９７；Ｉｚｓｖａｋ及びＩｖｉｃｓ、１９９７）。治療潜在力を改善するため、発明者の第２世代ＣＡＲ（Ｋｏｗｏｌｉｋら、２００６）は、これによりＴ細胞増殖を維持し、ｉｎｖｉｖｏでエフェクター機能が再循環されるという見込みで、ＣＤ２８及びＣＤ３−ζを介してシグナルを送る。さらに、細胞外長さが変わり、かつ異なるエンドドメインシグナル伝達モチーフを持つＣＡＲは、ＳＢ系を用いて発現することができる。

Ｔ細胞を回収するため、ＣＡＲ、Ｋ５６２ａＡＰＣ（クローン＃４）を安定的に発現する組み込み体を開発し、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、膜結合型バージョンのインターロイキン（ＩＬ）−１５（改変ＩｇＧ４Ｆｃ領域に融合したペプチドまたはＩＬ−１５受容体αに融合したサイトカインペプチド）、及びＣＤ６４（Ｆｃ−γ受容体１）などの共刺激分子と共に所望の抗原（例えば、ＣＤ１９）を発現し、ＣＡＲ媒介増殖を維持することが可能なＴ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで選択した。この強力な技術により、ヒト応用に適した臨床的に意義のある数（最大１０^１０）のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の製造が可能となった。必要に応じて、より大きな数の遺伝子改変Ｔ細胞を生成するために追加の刺激サイクルを実施することができる。さらに、より少数のＣＡＲ^＋Ｔ細胞が必要な場合、エレクトロポレーション及び増殖のアプローチにより、より少数のキュベットを用い、かつ、ａＡＰＣ（各刺激サイクルの開始時に追加）上で０回、１回、またはそれ以上の増殖ラウンドで数値的に増殖させたＴ細胞のサブセットのみを繰り越すことで規模を小さくすることができる。一般に、増殖させたＴ細胞の少なくとも９０％がＣＡＲを発現し、注入用に凍結保存される。さらに、このアプローチを利用して、導入されたＣＡＲの特異性を、ａＡＰＣ上のＣＡＲにより認識された腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現と対合させることで多様な腫瘍型に対するＴ細胞を生成することができる。ｅｘｖｉｖｏ増殖プラットフォームは、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及びγδ Ｔ細胞の製造にも適合されている。

第２世代ＣＡＲを発現するＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖には、幹細胞／メモリー／ナイーブ表現型を持つ細胞が含まれ、再指向特異性の３つの特徴を示す。まず、遺伝子改変Ｔ細胞は、ＣＤ１９^＋標的を特異的に溶解する。第２に、遺伝子改変Ｔ細胞は、ＣＤ１９^＋刺激細胞に応答してサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）を産生する。第３に、遺伝子改変Ｔ細胞は、全てＣＡＲ依存的にＣＤ１９^＋刺激に応答して増殖する（Ｓｉｎｇｈら、２０１１；Ｓｉｎｇｈら、２００８）。ａＡＰＣ及び組織培養環境（例えば、ＩＬ−２１の追加）は、造血幹細胞移植後に注入するための患者−及びドナー−由来ＣＤ１９特異的Ｔ細胞を生成するために改変されている（Ｓｉｎｇｈら、２０１１；Ｓｉｎｇｈら、２００８）。発明者らは、静脈穿刺により簡単に得られた末梢血液からＣＡＲ^＋Ｔ細胞を作製することができ、これにより、アフェレーシスにより単核球を得るコスト、不快感、及び不便さを回避する。少数の単核球から多数のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を生じる能力は、同種臍帯血移植後にＴ細胞を注入するのに特に魅力的である。サイズの小さいかつ匿名の新生児ドナーは、後の時点でこの個体への再アクセスを不可能にし、限られた数の採取単核球しか、造血障害を避けるためにＴ細胞製造用の出発物質として入手できない。さらに、製造プロセスの進歩には、取り扱いを最小限にするために、完全閉鎖型のＷＡＶＥバイオリアクターと連結した高スループットエレクトロポレーション装置が含まれる。

本製造アプローチには、作業負荷を軽減するための処理及び培養システム、並びに無菌状態の破損に対する対抗手段の実施が含まれる。この目的のために、発明者らは、フラスコではなくバイオリアクター及び／またはバッグ内でＴ細胞をγ照射ａＡＰＣと共培養した。この遷移は、一般に、エレクトロポレーションしてから１４日後に生じる。さらに、原材料としてのａＡＰＣをバイオリアクター及び／またはバッグ内で数値的に増殖させ、発明者らは、凍結保存用にａＡＰＣを処理するためにＳｅｐａｘ装置を適合させた。Ｓｅｐａｘ採取手順は、マニュアル処理により要求される追加の遠心分離工程を軽減するため、大量の培養培地（＞９００ｍＬ）を用いる際に自動化よりもさらなる利点を有する。
Ｉ．定義

本明細書で使用する場合、用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、例えば、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体のことを言い、特定の免疫エフェクター細胞の上に人工特異性を移植する遺伝子操作された受容体を包含する。ＣＡＲを用いて、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に与えることで、多数の特異的Ｔ細胞を、例えば、養子細胞療法で用いるために生成することができる。特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞の特異性を、例えば、腫瘍関連抗原に仕向ける。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通領域、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。特定の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ膜貫通領域及びエンドドメインに融合した、モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合を含む。他のＣＡＲ設計の特異性は、受容体（例えば、ペプチド）のリガンド由来またはデクチンなどのパターン認識受容体由来であってもよい。特定の実施形態では、Ｂ系列分子であるＣＤ１９に特異的なＣＡＲを用いることによりＴ細胞の特異性を再指向することで悪性腫瘍Ｂ細胞を標的にすることができる。場合によっては、抗原認識ドメインの間隔を改変することで、活性化誘発性の細胞死を減少させることができる。場合によっては、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、及び／またはＯＸ４０などの、追加の共刺激シグナル伝達用ドメインを含む。場合によっては、分子は、共刺激分子を含むＣＡＲ、イメージング（例えば、陽電子放射断層撮影法）用のレポーター遺伝子、プロドラッグの追加時にＴ細胞を条件付きでアブレーションする遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体と共発現させることができる。

本明細書で使用する場合、用語「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」とは、いくつかの細胞では、該ＴＣＲは、ガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖からなるが、アルファ（α）及びベータ（β）鎖のヘテロダイマーからなるＴ細胞上のタンパク質受容体のことを言う。本発明の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲを含む任意の細胞、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及びガンマデルタＴ細胞上で改変されていてもよい。

用語「腫瘍関連抗原」及び「がん細胞抗原」とは、本明細書では交換可能に使用される。それぞれの場合において、用語は、がん細胞により特異的または優先的に発現されるタンパク質、糖タンパク質、または糖質のことを言う。
ＩＩ．キメラ抗原受容体

本明細書中で使用される場合、用語「抗原」とは、抗体またはＴ細胞受容体に結合することが可能な分子である。抗原はさらに、体液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答を誘導し、Ｂ及び／またはＴリンパ球の産生をもたらすことができる。

本発明の実施形態は、核酸、例えば、１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通領域、及び細胞外ドメインを含む、免疫原性（ｈＣＡＲ）を減らすためヒト化されているＣＡＲを含む抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする核酸を伴う。ある実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原間の共用空間からなるエピトープを認識してもよい。デクチン−１などのパターン認識受容体を用いて、糖鎖抗原に対する特異性を引き出してもよい。ある実施形態では、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、及び／またはその抗原結合断片を含み得る。別の実施形態では、その特異性は、受容体に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）由来である。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原を補足することで、その特定の抗原に対する特異性を持つ受容体を提供する抗原受容体（例えば、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメインで見られる短アミノ酸配列である。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。抗原受容体は一般に、２つのポリペプチド鎖からなるため、抗原と接触することが可能な各抗原受容体には６つのＣＤＲが存在し、重鎖及び軽鎖の各々は、３つのＣＤＲを含有する。免疫グロブリン及びＴ細胞受容体と関連する配列変異のほとんどは、ＣＤＲで見つかるため、これらの領域は、超可変ドメインと言われることもある。これらのうち、ＣＤＲ３は、ＶＪ（重鎖及びＴＣＲ αβ鎖の場合におけるＶＤＪ）領域の組み換えによりコードされるため、最も大きな可変性を示す。

ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者に対する細胞性免疫療法を高めるためのヒト遺伝子であると考えられる。特定の実施形態では、本発明は、全長ＣＡＲｃＤＮＡまたはコード領域を含む。抗原結合領域またはドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ鎖の断片を含み得、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１０９，３０４号に記載されるものである。断片は、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインであってもよい。さらに特定の実施形態では、断片は、ヒト細胞内で発現するためのヒトコドン使用頻度を最適化する配列によりコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。

配置は、ダイアボディまたはマルチマーなどの多重結合であってもよい。マルチマーは、軽鎖及び重鎖の可変部分を、Ｗｉｎｔｅｒｓによりダイアボディと言われているものに交差対合させることで最も形成されやすい。構築物のヒンジ部分は、完全に欠失しているものから、第１システインが維持されているもの、セリン置換ではなくプロリン、第１システインまで切断されているものまで多数の代替選択肢を有し得る。Ｆｃ部分は、欠失していてもよい。安定であり及び／または二量化する任意のタンパク質は、この目的を果たし得る。Ｆｃドメインの１つのみ、例えば、ヒト免疫グロブリンからのＣＨ２またはＣＨ３ドメインのいずれかを使用してもよい。二量化を改善するために改変されているヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を使用してもよい。免疫グロブリンのヒンジ部分のみを使用してもよい。ＣＤ８αの一部分を使用してもよい。

本発明のキメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体が中に入れられている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも１つを活性化する役割を担っている。用語「エフェクター機能」とは、分化細胞の特殊化した機能のことを言う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であってもよい。ナイーブ、メモリー、またはメモリー型のＴ細胞におけるエフェクター機能は、抗原依存性増殖を含む。従って、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを形質導入し、特殊化した機能を行うように細胞を仕向けるタンパク質の部分のことを言う。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられるが、多くの場合、細胞内ポリペプチド全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分の利用を見出す程度まで、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを依然として形質導入する限り、無傷鎖の代わりに使用してもよい。従って、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。例としては、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖またはその任意のホモログ（例えば、エータ、デルタ、ガンマ、またはイプシロン）、ＭＢ１鎖、Ｂ２９、ＦｃＲＩＩＩ、ＦｃＲＩ、及びシグナル伝達分子の組み合わせ、例えば、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８、ＣＤ２７、４-１ＢＢ、ＤＡＰ−１０、ＯＸ４０、及びその組み合わせ、並びに他の同様の分子及び断片が挙げられる。活性化タンパク質ファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分、例えば、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩを使用してもよい。これらの代替膜貫通及び細胞内ドメインを用いたｃＴＣＲの開示については、Ｇｒｏｓｓら（１９９２）、Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら（１９９３）、Ｍｏｒｉｔｚら（１９９４）、Ｈｗｕら（１９９５）、Ｗｅｉｊｔｅｎｓら（１９９６）、及びＨｅｋｅｌｅら（１９９６）を参照されたい。好ましい実施形態では、ヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインを活性化に用いた。

抗原特異的細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＩｇＧ_４Ｆｃヒンジ及びＦｃ領域などの膜貫通領域により結合してもよい。代替物としては、ヒトＣＤ４膜貫通領域、ヒトＣＤ２８膜貫通領域、膜貫通ヒトＣＤ３ζドメイン、またはシステイン変異ヒトＣＤ３ζドメイン、もしくはＣＤ１６及びＣＤ８及びエリスロポエチン受容体などの他のヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質からの他の膜貫通領域が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ核酸は、膜貫通領域及び改変ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインなどの他の共刺激受容体をコードする配列を含む。他の共刺激受容体としては、限定的ではないが、１つ以上のＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられる。ＣＤ３ζ主導の一次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激受容体により提供された追加のシグナルは、Ｔ細胞の完全活性化にとって重要であり、ｉｎｖｉｖｏ持続性、及び養子免疫療法による治療の成功を改善するのに役立ち得る。

特定の実施形態では、本発明は、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を組み込んだ単離核酸セグメント及び発現カセットに関する。本発明のベクターは、主として、調節真核生物プロモーター、例えば、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、またはユビキチンプロモーターの制御下で、所望の遺伝子を免疫細胞、好ましくはＴ細胞に送達するように設計されている。ベクターは、他には何の理由がなくとも、これらのｉｎｖｉｔｒｏ操作を促進するための選択可能なマーカーを含んでいてもよい。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＤＮＡ鋳型からｉｎｖｉｔｒｏ転写したｍＲＮＡから発現することができる。

キメラ抗原受容体分子は、組み換えであり、抗原に結合する能力と、これらの細胞質尾部に存在する免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介して活性化シグナルを形質導入する能力の両方により区別される。抗原結合部分（例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）から生成）を利用した受容体構築物は、ＨＬＡに依存しない形で標的細胞表面上の天然抗原に結合する「万能」であるという追加の利点を有する。例えば、いくつかの研究所は、ＣＤ３複合体のゼータ鎖（ζ）、Ｆｃ受容体ガンマ鎖、及びｓｋｙチロシンキナーゼの細胞内部分をコードする配列に融合したｓｃＦｖ構築物について報告している（Ｅｓｈｈａｒら、１９９３；Ｆｉｔｚｅｒ−Ａｔｔａｓら、１９９８）。ＣＴＬによる腫瘍認識及び溶解を含む再指向Ｔ細胞エフェクター機構は、いくつかのマウス及びヒト抗原−ｓｃＦｖ：ζ系で裏付けられている（Ｅｓｈｈａｒ、１９９７；Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７；Ｂｒｏｃｋｅｒら、１９９８）。

今まで、キメラ抗原受容体の構築には、非ヒト抗原結合領域が一般に用いられる。マウスモノクローナル抗体などの非ヒト抗原結合領域を用いることの潜在的な問題は、ヒトエフェクター機能性の欠如と、腫瘍塊に貫通できないことである。言い換えると、そのような抗体は、補体依存性の溶解を媒介するか、または抗体依存性細胞毒性もしくはＦｃ受容体媒介食作用を介してヒト標的細胞を溶解して、ＣＡＲを発現する細胞を破壊することができない場合がある。さらに、非ヒトモノクローナル抗体は、異種タンパク質としてヒト宿主により認識されるため、そのような異種抗体を繰り返し注入することで、有害な過敏性反応をもたらす免疫応答を誘導することができる。マウスに基づくモノクローナル抗体では、これは、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答と呼ばれることが多い。従って、ヒト抗体はマウス抗体ほど強いＨＡＭＡ応答を引き起こさないため、ヒト抗体の使用がより好ましい。同様に、ＣＡＲ内にヒト配列を使用することで、免疫介在性認識を回避できることにより、受容者に存在し、かつ、ＨＬＡとの関連において処理抗原を認識する内因性Ｔ細胞を排除することができる。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗原結合領域を含むａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通領域、及びｃ）細胞外ドメインを含む。

特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内受容体シグナル伝達ドメインには、例えば、ＣＤ３のゼータ鎖、Ｆｃγ ＲＩＩＩ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２を単独もしくはＣＤ３ゼータと組み合わせた、Ｔ細胞抗原受容体複合体のものが挙げられる。特定の実施形態では、細胞内ドメイン（細胞質ドメインとも呼ばれる）は、１つ以上のＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ−２Ｒβ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２Ｒα／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、及びＣＤ４０の一部または全部を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインにおける内因性Ｔ細胞受容体複合体のどこか一部を用いる。いわゆる第３世代ＣＡＲは、例えば、相加もしくは相乗効果のために一緒に融合した少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインを有するので、１つまたは複数の細胞質ドメインを使用してもよい。

キメラ抗原受容体のある実施形態では、受容体（抗原結合領域を含む細胞外ドメインとも呼ばれる）の抗原特異的部分は、腫瘍関連抗原、またはデクチン−１などのパターン認識受容体により認識された糖鎖抗原を含む病原体特異的抗原結合ドメインを含む。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面上で発現する限り任意の種類であってもよい。腫瘍関連抗原の例示実施形態としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓなどが挙げられる。ある実施形態では、ＣＡＲは、膜結合型サイトカインと共発現させて、少量の腫瘍関連抗原が存在する場合の持続性を改善することができる。例えば、ＣＡＲは、膜結合型ＩＬ−１５と共発現させることができる。

ある実施形態では、ＨＡ−１、スルビビン、ＷＴ１、及びｐ５３などの細胞内腫瘍関連抗原を標的にしてもよい。これは、ＨＬＡとの関連において細胞内腫瘍関連抗原から説明した処理ペプチドを認識する万能Ｔ細胞上で発現したＣＡＲにより達成することができる。さらに、万能Ｔ細胞を遺伝子改変し、ＨＬＡとの関連において細胞内処理腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞−受容体ペアを発現してもよい。

病原体は、任意の種類であってもよいが、特定の実施形態では、病原体は、例えば、真菌、細菌、またはウイルスである。例示ウイルス病原体としては、アデノウイルス科、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＳＶ、ウイルスのＨＨＶ科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パポバウイルス科、ポリオーマウイルス、ラブドウイルス科、及びトガウイルス科のものが挙げられる。例示病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、おたふく風邪、麻疹、水痘、エボラ、及び風疹を引き起こす。例示病原性真菌としては、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス、ヒストプラスマ、ニューモシスチス、及びスタキボトリスが挙げられる。例示病原性細菌としては、連鎖球菌、シュードモナス菌、シゲラ、カンピロバクター、ブドウ球菌、ヘリコバクター、大腸菌、リケッチア、バチルス、ボルデテラ、クラミジア、スピロヘータ、及びサルモネラが挙げられる。一実施形態では、病原体受容体であるデクチン−１を用いて、菌類の細胞壁の糖鎖構造を認識するＣＡＲを生成してもよい。デクチン−１の特異性に基づいてＣＡＲを発現するように遺伝子改変されたＴ細胞は、アスペルギルス及び標的菌糸増殖を認識することができる。別の実施形態では、ＣＡＲは、ウイルス決定因子（例えば、ＣＭＶ及びＥｂｏｌａからの糖タンパク質）を認識してウイルス感染及び病変を遮断する抗体に基づいて作ることができる。

いくつかの実施形態では、病原性抗原は、ＣＡＲの細胞外ドメインが真菌病原体の細胞壁の糖質パターンを、例えば、デクチン−１を介して認識するアスペルギルス糖鎖抗原である。

本発明によるキメラ免疫受容体は、組み換えＤＮＡ技術を用いて作製するのが好ましいが、当該技術分野において周知の任意の手段により作製することができる。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸配列は、標準技術の分子クローニング（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー補助ライゲーション、酵母及び細菌からのｓｃＦｖライブラリー、部位特異的突然変異誘発法など）により調製し、完全コード配列に組み立てることができる。得られたコード領域は、発現ベクターに挿入し、適切な発現宿主同種Ｔ細胞株を形質転換するのに用いることができる。

本明細書中で使用される場合、核酸構築物または核酸配列もしくはポリヌクレオチドは、Ｔ細胞に形質転換するかまたは導入して、転写され、翻訳されて、産物（例えば、キメラ抗原受容体）を産生することができるＤＮＡ分子を意味するものである。

本発明で用いられる例示核酸構築物（ポリヌクレオチド）では、プロモーターは、本発明のキメラ受容体をコードする核酸配列に作動可能に連結される、即ち、キメラ受容体をコードするＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡの転写を促進するように位置している。プロモーターは、ゲノム起源であっても、または合成により生成してもよい。Ｔ細胞で用いられる種々のプロモーターは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｍａｒｏｄｏｎら（２００３）により開示されたＣＤ４プロモーター）。プロモーターは、構造性または誘導性であってよく、ここで、誘導は、例えば、特定の細胞型または特定の成熟レベルと関連する。あるいは、多数の周知のウイルスプロモーターも適している。対象プロモーターとしては、β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０前期及び後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、及びフレンド脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーターが挙げられる。プロモーターは、エンハンサーと関連していても関連していなくてもよく、ここで、エンハンサーは、特定のプロモーターと自然に関連していてもよく、あるいは異なるプロモーターと関連していてもよい。

キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡソース、ｃＤＮＡソースから得てもよく、または合成してもよく（例えば、ＰＣＲ経由）、もしくはその組み合わせでもよい。イントロンがｍＲＮＡを安定させ、Ｔ細胞特異的発現をもたらすことが分かっているため、ゲノムＤＮＡのサイズ及びイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡまたはその組み合わせを使用するのが望ましい場合もある（Ｂａｒｔｈｅｌ及びＧｏｌｄｆｅｌｄ、２００３）。ｍＲＮＡを安定させるために内因性または外因性の非コード領域を使用するのがさらに有利な場合もある。

本発明のキメラ抗原受容体の発現には、キメラ受容体のＮ末端成分をコードする核酸配列の、自然に存在している、つまり内因性の転写開始領域を使用して、標的宿主内でキメラ受容体を生成することができる。あるいは、外因性の転写開始領域を使用することで、構造性または誘導性の発現が可能になり、ここで、発現は、標的宿主、所望の発現レベル、標的宿主の性質などに応じて制御することができる。

同様に、キメラ受容体を表面膜に仕向けるシグナル配列は、キメラ受容体のＮ末端成分の内因性シグナル配列であってもよい。必要に応じて、場合によっては、この配列を異なるシグナル配列に交換するのが望ましい場合もある。しかしながら、選択されたシグナル配列は、キメラ受容体がＴ細胞の表面上に存在するように、Ｔ細胞の分泌経路に適合していなくてはならない。

同様に、終端領域は、キメラ受容体のＣ末端成分をコードする核酸配列の、自然に存在している、つまり内因性の転写終端領域により提供してもよい。あるいは、終端領域は、異なるソース由来であってもよい。大部分において、終端領域のソースは、組み換えタンパク質の発現に重要であるとは一般的に考えず、広範囲の終端領域を、発現に悪影響を及ぼすことなく用いることができる。

当業者が理解するように、場合によっては、ＣＡＲ中の抗原結合ドメインの末端のアミノ酸のいくつか、例えば、通例的には１０個以下、より通例的には５個以下の残基は、欠失していてもよい。少数のアミノ酸、通例的には１０個以下、より通例的には５個以下の残基を境界に導入するのが望ましい場合もある。アミノ酸の欠失または挿入は、便利な制限部位の提供、操作し易さ、発現レベルの改善など構築の必要性の結果であってもよい。さらに、１つ以上のアミノ酸の異なるアミノ酸への置換について、通例的には、任意の１つのドメインでは約５個を超えるアミノ酸を置換しないが、同様の理由で発生し得る。

本発明によるキメラ受容体をコードするキメラ構築物は、従来の方法で調製してもよい。大部分において、天然の配列を使用してもよいため、種々の成分を適正に連結することができるように、天然遺伝子を適宜、単離して、操作してもよい。従って、キメラ受容体のＮ末端及びＣ末端タンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子の望ましくない部分の欠失をもたらす適当なプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することで単離することができる。あるいは、クローン遺伝子の制限酵素による消化物を使用して、キメラ構築物を生成してもよい。いずれの場合でも、鈍端であるかまたは、相補的オーバーラップを持つ制限部位を提供するように、配列を選択することができる。

キメラ構築物を調製するための種々の操作をｉｎｖｉｔｒｏで行うことができ、特定の実施形態では、キメラ構築物は、標準の形質転換またはトランスフェクション方法を用いて、適当な宿主内でクローニング及び発現するようにベクターに導入する。従って、各操作後、ＤＮＡ配列の連結から得られた構築物をクローンし、ベクターを単離し、配列をスクリーニングすることで、配列が所望のキメラ受容体をコードすることを保証する。制限分析、シークエンシングなどにより配列をスクリーニングしてもよい。

本発明のキメラ構築物は、がんを有するかまたはがんを有すると疑われる対象における腫瘍のサイズを減少させるかまたは、腫瘍の増殖もしくは再増殖を防ぐことで、これらの対象に応用される。従って、本発明はさらに、本発明のキメラ構築物を対象の単離Ｔ細胞に導入し、形質転換Ｔ細胞を対象に再導入することで、対象の腫瘍を減少もしくは排除する抗腫瘍応答をもたらす、対象の腫瘍の増殖を減少させるかまたは腫瘍形成を防ぐ方法に関する。使用してもよい適切なＴ細胞としては、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）、または破壊する必要があるＴ細胞受容体を持つ任意の細胞が挙げられる。当該技術分野では既知のように、これらの細胞を対象から単離するには、種々の方法がすぐに利用できる。例えば、細胞表面マーカー発現を用いるか、あるいは市販のキット（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩｌｌからのＩＳＯＣＥＬＬ（商標））を用いることである。

キメラ構築物は、裸のＤＮＡとして対象自身のＴ細胞に導入するか、または適切なベクターに導入することができると考えられる。裸のＤＮＡを用いたエレクトロポレーションによってＴ細胞を安定的にトランスフェクトする方法は、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照されたい。裸のＤＮＡは、一般に、発現用に正しく配向したプラスミド発現ベクターに含有される本発明のキメラ受容体をコードするＤＮＡのことを言う。裸のＤＮＡを用いることで、本発明のキメラ受容体を発現するＴ細胞の産生に要する時間が短縮されることが有利である。

あるいは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）を使用して、キメラ構築物をＴ細胞に導入してもよい。本発明の方法により使用される適切なベクターは、対象のＴ細胞で複製しない。ウイルスに基づく多数のベクターが知られており、細胞で維持されるウイルスのコピー数は、細胞の生存率を維持する程度に十分低い。例示ベクターとしては、本明細書で開示されているｐＦＢ−ｎｅｏベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））のみならず、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ、またはＢＰＶに基づくベクターが挙げられる。

トランスフェクトまたは形質導入Ｔ細胞が、所望の調節及び所望のレベルで表面膜タンパク質としてキメラ受容体を発現できることが確認されると、キメラ受容体が所望のシグナル誘導をもたらすように宿主細胞内で機能的であるかどうか判断することができる。次に、形質導入Ｔ細胞を対象に再導入するかまたは投与して、対象の抗腫瘍応答を活性化させる。投与し易くするため、本発明による形質導入Ｔ細胞を、さらに医薬的に許容され得る適当な担体または希釈剤と共に、医薬組成物にしてもよいし、あるいはｉｎｖｉｖｏ投与に適当なインプラントにしてもよい。そのような組成物またはインプラントを作製する手段は、当該技術分野において記載されている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ編（１９８０）を参照されたい）。必要に応じて、形質導入Ｔ細胞を、カプセル、溶液、注射液、吸入剤、またはエアロゾルなどの半固体または液状の調製物に、これらの各々の投与経路用に通常の方法で製剤化してもよい。当該技術分野において周知の手段を利用して、組成物が標的組織または臓器に到達するまで、組成物の放出及び吸収を防ぐかまたは最小限にする、あるいは組成物の持続放出を保証することができる。しかしながら、キメラ受容体を発現する細胞を無効にしない医薬的に許容される形態を用いるのが望ましい。従って、形質導入Ｔ細胞を、平衡塩類溶液、好ましくは、ハンクス液、または生理食塩水を含有する医薬組成物にすることが望ましい。
ＩＩＩ．実施形態に関する方法及び組成物

ある態様では、本発明は、ｈＣＡＲをコードするＤＮＡ構築物を含有する発現ベクターでＴ細胞をトランスフェクトすることと、その後、必要に応じて、抗原陽性細胞、組み換え抗原、または受容体に対する抗体で細胞を刺激して、細胞を増殖させることとを含む、抗原特異的再指向Ｔ細胞を作製及び／または増殖させる方法を含む。

別の態様では、エレクトロポレーション、または裸のＤＮＡを用いた他の非ウイルス遺伝子導入（限定的ではないが、ソノポレーションなど）によってＴ細胞を安定的にトランスフェクトし、再指向させる方法を提供する。ほとんどの研究者らは、異種遺伝子をＴ細胞に運搬するためにウイルスベクターを使用している。裸のＤＮＡを用いることで、再指向Ｔ細胞を産生するのに必要な時間を短縮することができる。「裸のＤＮＡ」とは、発現用に正しく配向した発現カセットまたはベクターに含有されるキメラＴ細胞受容体（ｃＴＣＲ）をコードするＤＮＡを意味する。本発明のエレクトロポレーション方法は、キメラＴＣＲ（ｃＴＣＲ）を発現し、その表面上にそれを運搬する安定したトランスフェクタントを作製する。

「キメラＴＣＲ」とは、Ｔ細胞により発現され、かつ、細胞内シグナル伝達、膜貫通、及び細胞外ドメインを含む受容体のことを意味し、ここで、細胞外ドメインは、ＭＨＣ非制限方式で、通常その方式ではＴ細胞受容体に結合しない抗原に特異的に結合することができる。Ｔ細胞を適切な条件下にて抗原で刺激することで、細胞の増殖（増殖）及び／またはＩＬ−２の産生がもたらされる。即時応用可能なＣＤ１９−及びＨＥＲＶ−Ｋ特異的キメラ受容体の例は、キメラＴＣＲの例である。しかしながら、本方法は、他の標的抗原に特異的なキメラＴＣＲ、例えば、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ（Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら、１９９３）、ＥＲＢＢ２（Ｍｏｒｉｔｚら、１９９４）、葉酸結合タンパク質（Ｈｗｕら、１９９５）、腎細胞がん（Ｗｅｉｔｊｅｎｓら、１９９６）、及びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９４）に特異的なキメラＴＣＲによるトランスフェクションに適用可能である。他の細胞表面標的抗原としては、限定的ではないが、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、メソテリン、ＲＯＲ１、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＤ５６、ＧＤ２、ＧＤ３、アルファフェトプロテイン、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＩＬ−１１Ｒα、κ鎖、λ鎖、ＣＤ７０、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＥＧＦＲ、及び変異体、上皮腫瘍抗原などが挙げられる。

ある態様では、Ｔ細胞は、ヒト末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）由来のＴ細胞などの一次ヒトＴ細胞であり、ここで、ＰＢＭＣは、Ｇ−ＣＳＦ、骨髄、または臍帯血で刺激後に回収した。条件には、ｍＲＮＡ及びＤＮＡの使用、及びエレクトロポレーションが含まれる。トランスフェクション後、細胞を直ちに注入してもよいし、あるいは保存してもよい。ある態様では、トランスフェクション後、細胞を何日間、何週間、または何カ月もｅｘｖｉｖｏでバルク集団として増殖させ、約１、２、３、４、５日以内、またはそれ以上の期間以内で細胞に遺伝子導入してもよい。別の態様では、トランスフェクション後、トランスフェクタントをクローンし、クローンには、単一に組み込まれたかまたはエピソームに保持された発現カセットまたはプラスミドが存在することが示され、キメラ受容体をｅｘｖｉｖｏで増殖発現させる。増殖用に選択されたクローンは、標的細胞を発現するＣＤ１９を特異的に認識して溶解する能力を示している。組み換えＴ細胞は、ＩＬ−２、または共通ガンマ鎖（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、及び他のもの）に結合する他のサイトカインで刺激することにより増殖させてもよい。組み換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞で刺激することにより増殖させてもよい。組み換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞上で増殖させてもよく、あるいはＴ細胞表面上でＣＤ３を架橋するＯＫＴ３などの抗体で増殖させてもよい。組み換えＴ細胞のサブセットは、人工抗原提示細胞上で欠失させてもよく、あるいはＴ細胞表面上でＣＤ５２に結合するキャンパスなどの抗体で増殖させてもよい。別の態様では、遺伝子改変細胞は、凍結保存してもよい。

注入後のＴ細胞増殖（生存）は、（ｉ）ＣＡＲに特異的なプライマーを用いたｑ−ＰＣＲ；（ｉｉ）ＣＡＲに特異的な抗体を用いたフローサイトメトリー；及び／または（ｉｉｉ）可溶性ＴＡＡにより評価してもよい。

本発明の実施形態は、再指向免疫Ｔ細胞を用いて、ＣＤ１９特異的な細胞表面エピトープを持つＢ細胞を含むＢ細胞悪性腫瘍またはＢ細胞疾患を標的にすることにも関する。Ｂ細胞はＴ細胞に対して免疫刺激性抗原提示細胞として機能し得るため、悪性Ｂ細胞は、再指向Ｔ細胞の優れた標的である。ヒトまたはヒト化ＣＡＲを持つドナー由来のＣＤ１９特異的Ｔ細胞による養子療法の抗腫瘍活性を支持する前臨床研究には、（ｉ）ＣＤ１９^＋標的の再指向殺傷、（ｉｉ）ＣＤ１９^＋標的／刺激細胞と共にインキュベーション後のサイトカインの再指向分泌／発現、及び（ｉｉｉ）ＣＤ１９^＋標的／刺激細胞と共にインキュベーション後の持続増殖が含まれる。

本発明のある実施形態では、ＣＡＲ細胞を、それを必要とする個体、例えば、がんまたは感染を有する個体に送達する。その後、細胞が個体の免疫系を強化し、それぞれのがんまたは病原性細胞を攻撃する。場合によっては、個体には、抗原特異的ＣＡＲＴ細胞を１回以上の用量で提供する。抗原特異的ＣＡＲＴ細胞を２回以上の用量で個体に提供する場合、投与間隔は、個体内で増殖できるのに十分な時間でなければならず、特定の実施形態では、投与間隔は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、またはそれ以上の日数である。

キメラ抗原受容体と機能的ＴＣＲが欠けたものの両方を含むように改変された同種Ｔ細胞のソースは、任意の種類であってもよく、特定の実施形態では、細胞は、例えば、臍帯血、末梢血液、ヒト胚性幹細胞、または誘導多能性幹細胞のバンクから得る。治療効果に適切な用量は、１用量当たり、例えば、好ましくは、一連の投薬サイクルで少なくとも１０^５または約１０^５〜約１０^１０細胞である。一例の投薬計画は、用量を段階的に増加させる、０日目に少なくとも約１０^５細胞で始め、例えば、患者内の用量漸増計画法を開始する数週間以内に約１０^１０細胞の標的用量まで漸増増加させる４回の１週間投薬サイクルからなる。適当な投与方式には、静脈内、皮下、腔内（例えば、レザバー接近装置による）、腹腔内、及び腫瘍塊中への直接注射が含まれる。

本発明の医薬組成物を単独で、またはがんの治療に有用な他の既知の薬剤との組み合わせで使用してもよい。単独の送達であろうが、他の薬剤との組み合わせの送達であろうが、本発明の医薬組成物を、種々の経路を介して、哺乳動物、特に、ヒトの身体の種々の部位に送達し、特定の効果を得ることができる。当業者には、投与には２つ以上の経路を使用してもよいが、特定の経路が別の経路よりもより即時かつより効果的な反応をもたらし得ることが分かるであろう。例えば、黒色腫の治療には、吸入よりも皮内送達を使用することが有利であり得る。局所または全身送達は、製剤を体腔に塗布または点滴、エアロゾルの吸入または送気を含む投与、あるいは筋肉内、静脈内、門脈内、肝内、腹膜、皮下、または皮内投与を含む非経口導入により達成できる。

本発明の組成物は、単位投薬形態で提供してもよく、ここで、各投薬単位、例えば、注射液には、所定量の組成物が、単独で、または他の活性剤との適当な組み合わせで含まれる。本明細書で使用する場合、用語「単位投薬形態」とは、ヒト及び動物対象に対する単位投薬として適当な物理的に離散した単位のことを言い、各単位には、本発明の組成物を、必要に応じて医薬的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と関連して所望の効果をもたらすのに十分な量に計算された所定量で、単独で、または、他の活性剤との組み合わせで含まれる。本発明の新規の単位投薬形態の仕様は、特定の対象において医薬組成物と関連する特定の薬力学に依存する。

長期の特異的な抗腫瘍応答が確立されて、腫瘍のサイズを減少させるかまたはそのような治療が不在下であればもたられるであろう腫瘍増殖または再増殖を排除するように、有効量または十分な数の単離形質導入Ｔ細胞が組成物に存在し、対象に導入されることが望ましい。形質導入Ｔ細胞が存在しない以外は同一条件の場合と比較した際、対象に再導入された形質導入Ｔ細胞の量により、腫瘍サイズを１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％減少させることが望ましい。

従って、投与される形質導入Ｔ細胞の量は、投与経路を考慮すべきであり、十分な数の形質導入Ｔ細胞が導入されて所望の治療応答を達成するようにすべきである。さらに、本明細書に記載の組成物に含まれる各活性剤の量（例えば、接触する各細胞当たりの量またはある体重当たりの量）は、異なる用途で変わり得る。一般に、形質導入Ｔ細胞の濃度は、治療される対象に提供するのに十分でなければならず、少なくとも約１×１０^６〜約１×１０^９個の形質導入Ｔ細胞が望ましく、約１×１０^７〜約５×１０^８個の形質導入Ｔ細胞がさらにより望ましいが、上、例えば、５×１０^８個の細胞を超える、または下、例えば、１×１０^７個の細胞未満のいずれかの任意の適切な量を利用してもよい。投薬スケジュールは、既知の細胞ベース療法に基づいてよく（例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、１９８７；米国特許第４，６９０，９１５号を参照されたい）、または代替の持続注入戦略を用いてもよい。

これらの価値は、本発明の実施に本発明の方法を最適化する際に医師によって利用される形質導入Ｔ細胞の範囲についての一般的なガイダンスを提供することである。そのような範囲の本明細書の記載は、決して、特定の用途で保証され得るようなより多くの量またはより少ない量の成分の使用を不可能にするものではない。例えば、実際の用量及びスケジュールは、組成物を他の医薬組成物と組み合わせて投与するのかどうかに応じて、または薬物動態、薬物の体内動態、及び代謝における個体差に応じて変化し得る。当業者であれば、特定の状況の緊急事態に従って任意の必要な調節を容易に行えるであろう。
ＩＶ．例示のヒトＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体Ｔ細胞

ＣＤ１９、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面糖タンパク質は、Ｂ細胞関連悪性腫瘍の抗体療法に潜在的に魅力のある標的である。この抗原は、造血幹細胞には存在せず、健康な個体では、その存在は、Ｂ系列及び恐らくはいくつかの濾胞樹状細胞に排他的に限定される（Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎら、１９９５）。実際には、この抗原は、Ｂ芽細胞に発達中の最も初期の認識可能なＢ系列細胞からのＢ細胞に存在しているが、プラズマ細胞に成熟時には失われている。さらに、ＣＤ１９は、細胞表面からは分離されず、悪性形質転換中にはほとんど失われない（Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎら、１９９５）。タンパク質は、最も悪性のＢ系列細胞、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を持つ患者からの細胞上で発現される（Ｕｃｋｕｎら、１９８８）。ＣＤ１９は、ＣＤ２１及びＣＤ８１と結合してＢ細胞共受容体として主に働く。活性化時に、ＣＤ１９の細胞質尾部がリン酸化されることで、Ｓｒｃ科キナーゼ及びＰＩ−３キナーゼの補充による結合を招く。

一態様では、実施形態の組成物及び方法は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通領域、及びヒトＣＤ１９結合領域を含む細胞外ドメインを含む、ヒトＣＤ１９特異的キメラＴ細胞受容体（またはキメラ抗原受容体、ＣＡＲ）ポリペプチド（ｈＣＤ１９ＣＡＲと指定）に関する。別の態様では、ＣＤ１９結合領域は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである。結合領域は、野生型アミノ酸配列に少なくともせいぜい約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。細胞内ドメインは、ヒトＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含み得、ヒトＣＤ２８細胞内セグメントをさらに含み得る。ある態様では、膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域である。

別の態様では、本発明の組成物は、上述のポリペプチドをコードする核酸を含む。ある態様では、核酸配列は、ヒトコドン使用に最適化される。

さらに別の態様では、本発明の組成物は、本明細書に記載のポリペプチドを発現する細胞を含む。Ｔ細胞は、ｈＣＤ１９ＣＡＲポリペプチドをコードする発現カセットを含み得る。発現カセットは、トランスポゾン、またはヒトトランスポゾン、もしくはその組み換え変異体などの非ウイルスベクターに含まれ得る。発現カセットは、ウイルスベクターまたはその組み換え変異体に含まれ得る。発現カセットは、ゲノム的に組み込まれても、またはエピソームに保持されても、あるいはｍＲＮＡから発現してもよい。

さらに別の態様では、本発明は、発現カセットを細胞に導入することを含む、ヒトＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞の作製方法を含み、ここで、発現カセットは、ヒト細胞外ＣＤ１９結合ドメイン、膜貫通領域、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドをコードする。本方法は、ＣＤ１９^＋細胞、組み換えＣＤ１９、または受容体に対する抗体で細胞を刺激し、該細胞にサイトカインを増殖させる、殺傷させる、及び／または作製させることをさらに含み得；例えば、細胞を刺激して、ＣＤ１９^＋人工抗原提示細胞を増殖するかまたは増殖させてもよい。

ある態様では、本発明は、病態の治療に十分なヒトＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現する組み換え細胞の量を患者に注入することを含む、内因性ＣＤ１９を発現する細胞と関連するヒト疾患病態の治療方法を含み、ここで、ヒトＣＤ１９特異的ＣＡＲは、ヒトＣＤ１９細胞外結合ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。病態は、例えば、リンパ腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、またはＢ細胞関連自己免疫疾患であり得る。

本発明は、ヒトＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体（ｈＣＤ１９ＲＣＤ２８またはｈＣＡＲ）の生成に関する。ある態様では、ｈＣＡＲを発現する組み換え細胞は、ｉｎｖｉｖｏ持続性及び抗腫瘍効果が改善されている。ヒトｈＣＡＲは、マウスＣＤ１９特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来のｓｃＦｖセグメントを含むマウスｈＣＡＲと比較して免疫原性が減少している。抗腫瘍効果は、ＣＤ１９に特異的な状態にした遺伝子改変細胞によって増すことができる。一般に、Ｔ細胞特異性は、ｈＣＡＲをコードする発現カセットの電気移送により達成される。

ｈＣＡＲは、ＣＤ３−ζ由来活性化ドメインなどの活性化エンドドメインを１つ以上含むキメラ受容体であってもよい。追加のＴ細胞活性化モチーフとしては、限定的ではないが、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０、ＤＡＰ１０、及び４−１ＢＢが挙げられる。ある態様では、活性化ドメインは、ＣＤ２８膜貫通及び／または活性化ドメインも含み得る。別の態様では、ヒト細胞及び対象中での発現用にコドン最適化されたｈＣＡＲコード領域及び／または発現カセットは、例えば、一実施形態では、ＣＤ１９特異的ヒト抗体のＶＨ及びＶＬ配列から得たｓｃＦｖ領域は、ｈＣＡＲのＣＤ１９結合セグメントに組み込まれる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１０９，３０４号を参照されたい）。別の実施形態では、ｈＣＡＲ発現カセットは、エピソームに保持されるかまたは、組み換え細胞のゲノム中に組み込まれる。ある態様では、発現カセットは、インテグラーゼ機構、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはトランスポゾン機構などの非ウイルスベクターを用いて組み込むことが可能な核酸に含まれる。別の実施形態では、発現カセットは、トランスポゾンベースの核酸に含まれる。特定の実施形態では、発現カセットは、強化非ウイルス遺伝子導入用にトランスポゾン及びトランスポゼースを利用する２成分スリーピングビューティ（ＳＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ系の一部である。

組み換えｈＣＡＲ発現細胞を数値的に増殖させて、臨床的に意味のある数にしてもよい。そのような増殖の一例には、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を用いる。組み換えｈＣＡＲ発現細胞は、フローサイトメトリー及びウエスタンブロット分析により検証し同定することができる。ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現する組み換えｈＣＡＲ発現Ｔ細胞は、標的細胞を発現するＣＤ１９を認識し殺傷することができる。別の態様では、ｈＣＡＲは、免疫原性の防止を助けるために移植障壁にわたって注入することができる万能細胞中で発現することができる。ｈＣＡＲは、細胞毒性の場合には、Ｔ細胞のイメージング（例えば、陽電子放射断層撮影法、ＰＥＴ）および条件的な消失用のヒト遺伝子と共に使用してもよい。本発明の組み換え細胞を、ＣＤ１９特異的細胞療法で使用してもよい。
Ｖ．例示のＨＥＲＶ標的キメラ抗原受容体Ｔ細胞

ヒトゲノム計画中に、ヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）と名付けられた一連の古代レトロウイルスが、ヒトゲノム全体の８．５％を形成するヒトゲノム中に安定して組み込まれることが発見された。ＨＥＲＶのうち、ＨＥＲＶ−Ｋは、多発性硬化症及び関節リウマチのような種々の自己免疫疾患と共に黒色腫、乳がん、卵巣がん、奇形がん、及び前立腺がんに関与する発がん対立遺伝子変異体として見出された（Ｂｕｓｃｈｅｒら、２００５；Ｄｒｅｙｆｕｓ、２０１１；Ｓｅｉｆａｒｔｈら、１９９５）。ＨＥＲＶ−Ｋの発がん性は、エンベロープ（ｅｎｖ）及びＧＡＧタンパク質（Ｒｅｃ）により寄与される。ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープタンパク質が、正常皮膚細胞上ではなく腫瘍細胞表面上で排他的に発現することが最近の研究により分かった（Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇら、２００８；Ｌｉら、２０１０）。ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープタンパク質の発現は、より侵攻性が低く局在型Ｉの黒色腫よりも、より侵攻性が高く転移型ＩＩＩ及び型ＩＶの黒色腫で増えることが分かった（Ｂｕｓｃｈｅｒら、２００５；Ｈａｈｎら、２００８；Ｓｅｒａｆｉｎｏら、２００９）。黒色腫細胞上のＨＥＲＶ−Ｋエンベロープタンパク質のこの選択的な発現は、難治性または転移性の黒色腫を持つ患者に対する治療戦略として利用することができる。転移性黒色腫を持つ患者は、化学療法、放射線、及び手術などの従来の治療に抵抗性を示すために予後が悪い（Ｂｈａｔｉａら、２００９）。従って、治療結果を改善するために新規の標的治療戦略が必要である。

黒色腫に対するＴ細胞療法を生成するため、発明者らは、そのゲノムは何百万年も前にヒトに安定して組み込まれたＨＥＲＶ由来のＴＡＡを標的にした。ＨＥＲＫ−Ｋを標的にするため、ＣＤ１９特異的ＣＡＲの抗原結合細胞外ドメインを抗ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ特異的モノクローナル抗体の単鎖抗体（ｓｃＦｖ）配列に置換することでエンベロープタンパク質に特異的なＣＡＲを発現するように、Ｔ細胞を遺伝子操作した。この新規のＣＡＲは、ＳＢ系中にトランスポゾンとしてクローンした。ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ特異的ＣＡＲ及びＳＢトランスポゼースをコードするＤＮＡプラスミドを一次ヒトＴ細胞に電気的に導入させ、遺伝子改変ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ及び所望のＴ細胞共刺激分子を発現する照射人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）上で選択的に増殖させた。γ照射ａＡＰＣ上で共培養後、９５％のＣＤ３^＋Ｔ細胞がＣＡＲを発現し、これらのＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞とは異なり、ｉｎｖｉｔｒｏでＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ^＋腫瘍標的を特異的に殺傷することができたが、ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ⁻腫瘍標的を特異的に殺傷することはできなかった。これらのＣＡＲ^＋Ｔ細胞の特異性は、ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ⁻ＥＬ４親細胞と比較して優先的に殺傷された抗原陰性ＥＬ４マウス細胞中でＨＥＲＶ−Ｋエンベロープタンパク質を発現することで証明され、Ａ８８８−ｍｅｌ細胞上のｓｈＲＮＡ（ＨＥＲＶ−ＫエンベロープＲＮＡに対する特異的標的）によるＨＥＲＶ−Ｋノックダウンにより、親と比較して殺傷力が減少した。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、肺から肝臓へのｉｎｖｉｖｏでのＡ３７５高転移性（ＳＭ）腫瘍細胞の腫瘍増殖及び転移を減少させることにも成功した。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を受けた腫瘍を持つマウスは、腫瘍のみのマウス群よりも長く生き、かつより健康的であった。従って、活性レトロウイルスを標的にするＴ細胞は、臨床試験の翻訳にも魅力的なアプローチを用いて、黒色腫の免疫療法として用いることができる。

腫瘍認識にはＭＨＣ複合体に依存しているため、黒色腫細胞のクローン進化により、ＴＣＲ療法が効かなくなる場合がある。ＣＡＲは、ＴＣＲベースＴ細胞療法とは異なり、ＭＨＮから独立した方法で細胞死を媒介することで黒色腫細胞のクローン進化を克服することができる。ＨＥＲＶ−Ｋ抗原は、腫瘍細胞表面上でしか発現せず、正常細胞上では発現されない。従って、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、任意の有害な副作用を伴うことなく腫瘍細胞を特異的に標的にし、破壊することができる。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を注入することで、微小残存病変から巨大腫瘍、従来の治療では難治性の疾患までがんスペクトルに沿った多くのステージでＨＥＲＶ−Ｋ^＋悪性腫瘍を治療し得る。

ＨＥＲＶ−Ｋは、多くの腫瘍型、例えば、限定的ではないが、黒色腫（Ｍｕｓｔｅｒら、２００３；Ｂｕｓｃｈｅｒら、２００５；Ｌｉら、２０１０；Ｒｅｉｃｈｅら、２０１０；Ｓｅｒａｆｉｎｏら、２００９）、乳がん（Ｐａｔｉｅｎｃｅら、１９９６；Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇら、２００３；Ｓｅｉｆａｒｔｈら、１９９５）、卵巣がん（Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇら、２００７）、リンパ腫（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ−Ｇａｌｉｎｄｏら、２００８）、及び奇形がん（Ｂｉｅｄａら、２００１；Ｌｏｗｅｒら、１９９３）上で発現される。さらに、感染細胞、例えば、ＨＩＶにより感染したもの（Ｊｏｎｅｓら、２０１２）もＨＥＲＶ−Ｋを発現する。これは、ＨＥＲＶ−Ｋを標的にする１つのＣＡＲ設計を用いて、種々のがん及び感染を治療することができるという魅力的な機会を提供する。
ＶＩ．最小残存疾患を標的にするためのキメラ抗原受容体Ｔ細胞を共発現する例示の膜結合ＩＬ−１５

成人及び小児のＢ系列急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）の化学療法治療は、薬物耐性の残存疾患により、それぞれ６５％及び２０％の疾患再発率を有する。特に予後不良群においてＢ−ＡＬＬ再発する頻度が高いことで、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を用いた免疫ベース療法の使用が促進されている。この療法は、残存白血病細胞または微小残存病変を根絶して無病生存率を改善するためにドナー移植片に存在する同種反応性細胞に依存している。移植Ｔ細胞が同種ＨＳＣＴ後に残存Ｂ−ＡＬＬを標的にする能力を強化するためにドナーリンパ球注入が用いられているが、そのような患者に対するこの治療アプローチは、１０％未満の寛解率であり、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の頻度及び重症度から高度の罹患率及び死亡率と関連する。これらの難治性悪性腫瘍の再発における共通の致死問題では、ＨＳＣＴ後に末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）由来Ｔ細胞を用いた養子療法を用いて、ドナーＴ細胞の特異性を腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に再標的化することで、抗腫瘍効果または移植片対白血病（ＧＶＬ）効果を増すことができる。

標的抗原に特異的なＣＡＲの製剤が多数開発されており、ＣＤ１９特異的ＣＡＲが、Ｂ−ＡＬＬの細胞表面上のＣＤ１９抗原を標的にする。ＣＡＲ^＋細胞の長期持続性を観察し、異なる臨床試験プロトコルにわたって患者内の持続的応答を達成するには、ＣＡＲベース療法の治療効果を妨げる重大な問題が残されている。

現在、ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、腫瘍抗原と出くわした時にだけ発生する、ＣＡＲ経由の生存シグナル伝達を得ることに依存している。これらのＣＡＲ改変Ｔ細胞を巨大病変を持つ患者に注入する臨床状況では、ＣＡＲを介して十分な活性化及び生存シグナル伝達を提供するのに十分な腫瘍抗原が存在する。しかしながら、再発したＢ−ＡＬＬを持つ患者は、ＨＳＣＴに続いて骨髄機能廃絶化学療法で調子を整えている事が多く、微小残存病変（ＭＲＤ）が存在している。この場合、患者は、腫瘍量が低く、微小レベルのＴＡＡが、注入されたＴ細胞を支持するのに必要なＣＡＲ媒介シグナル伝達を著しく制限してしまい、その結果、治療潜在力が損なわれる。Ｔ細胞持続性を改善するための別のＣＡＲに依存しない手段は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞の生着を改善することが期待されている。

共通ガンマ鎖受容体科（γＣ）におけるサイトカインは、リンパ球機能、生存、及び増殖に重要なＴ細胞における重要な共刺激分子である。ＩＬ−１５は、養子療法に望ましいいくつかの特性を有する。ＩＬ−１５は、長寿命メモリー細胞傷害性Ｔ細胞の生存を支持し、腫瘍常在細胞の機能的抑制を軽減することで定着腫瘍の根絶を促進し、かつＡＩＣＤを阻害する恒常性サイトカインである。

ＩＬ−１５は、組織特異的であり、病的状態下でのみ、血清または全身において任意のレベルで観測される。周囲環境に分泌される他のγＣサイトカインとは異なり、ＩＬ−１５は、産生細胞によってＩＬ−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα）との関連においてＴ細胞にトランス提示される。このサイトカインをＴ細胞及び他の応答細胞に送達する機構の特有さは：（ｉ）高度に標的化かつ局所化されること、（ｉｉ）ＩＬ−１５の安定性及び半減期を増すこと、及び（ｉｉｉ）可溶性ＩＬ−１５により達成されるよりも質的に異なるシグナル伝達を生成することである。

一実施形態では、本発明は、例えば、微小残存病変（ＭＲＤ）を示す白血病患者を治療する目的で、ｉｎｖｉｖｏで長寿命の可能性を持つキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞の生成方法を提供する。全体として、この方法には、サイトカインなどの可溶性分子がどのように細胞表面に融合して治療潜在力を増すことができるかが述べられている。この方法の核心は、ＣＡＲＴ細胞をインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）のヒトサイトカインムテイン（これ以降、ｍＩＬ１５と呼ぶ）で共改変することに依存している。ｍＩＬ１５融合タンパク質は、フレキシブルなセリン−グリシンリンカーを介して全長ＩＬ１５受容体アルファに融合したＩＬ−１５のコドン最適化ｃＤＮＡ配列からなる。このＩＬ−１５ムテインは、（ｉ）ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表面へのｍＩＬ１５発現を制限し、ｉｎｖｉｖｏ環境にてサイトカインが非標的に拡散するのを限定することで、外因性可溶性サイトカイン投与が毒性をもたらすような安全性プロフィールを潜在的に改善することと；及び（ｉｉ）ＩＬ−１５Ｒαとの関連においてＩＬ−１５が存在し、生理的に適切かつ定性的なシグナル伝達を模倣するのみならず、サイトカイン半減期を延長させるためにＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ複合体を安定化及び再利用するような形で設計された。ｍＩＬ１５を発現するＴ細胞は、注入後のＴ細胞の生存に重要なサイトカインシグナル伝達を持続的に支持することができる。非ウイルススリーピングビューティ系遺伝子改変及びその後の臨床応用可能なプラットフォーム上でのｅｘｖｉｖｏ増殖により生成されたｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞により、腫瘍量が高い、低い、または腫瘍量が無いマウスモデルに注入後の持続性が強化されたＴ細胞注入産物が得られた。さらに、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、腫瘍量が高いまたは低いモデルの両方においても抗腫瘍効果の改善を実証した。

高腫瘍量モデルにおけるＣＡＲ^＋Ｔ細胞上のｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の持続性及び抗腫瘍活性が改善されたことで、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、腫瘍量が有病率している活動性疾患を持つ白血病患者の治療において、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞よりもより有効であり得ることを示す。従って、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、広い意味の応用における養子療法において、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞に取って代わることができる。ＣＡＲを介した生存シグナル伝達に依存せずにｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が生存する能力により、腫瘍抗原の欠如にかかわらず、これらの改変Ｔ細胞を注入後に持続させることができる。その結果、これにより、特に、骨髄機能廃絶化学療法及び造血幹細胞移植を受けた患者のＭＲＤ治療設定において治療効果に最も大きな影響を生成することが予想される。これらの患者は、これらのＭＲＤを治療し、再発予防のために、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と共に養子Ｔ細胞移入を受けるであろう。

ｍＩＬ１５などの膜結合型サイトカインは、広範囲にわたる影響を持つ。膜結合型ＩＬ−１５に加えて、他の膜結合型サイトカインが考えられる。膜結合型サイトカインは、ヒト応用に用いる細胞の活性化及び増殖と関連する他の分子の細胞表面発現に拡張することもできる。これらとしては、限定的ではないが、サイトカイン、ケモカイン、及びヒト応用に用いる細胞の活性化及び増殖に寄与する他の分子が挙げられる。

ｍＩＬ１５などの膜結合型サイトカインは、ヒト応用のための細胞の調製にｅｘｖｉｖｏで使用してもよく、かつ、ヒト応用に用いる注入細胞（例えば、Ｔ細胞）上であってもよい。例えば、膜結合型ＩＬ−１５は、例えば、Ｋ５６２由来の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）上で発現して、Ｔ細胞及びＮＫ細胞（のみならず他の細胞）を刺激して活性化及び／または増殖させることができる。ａＡＰＣ上でｍＩＬ１５により活性化／増殖させたＴ細胞の集団には、遺伝子改変リンパ球だけでなく、腫瘍浸潤リンパ球、及び他の免疫細胞が含まれる。これらのａＡＰＣは注入されない。これに対し、ｍＩＬ１５（及び他の膜結合型分子）は、注入されるＴ細胞及び他の細胞上で発現することができる。

ＣＡＲ改変Ｔ細胞によるＭＲＤ治療の治療効果は、Ｔ細胞の養子導入後の持続性の欠如により妨げられる。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が腫瘍抗原に関わらずにｉｎｖｉｖｏで長期生存できる能力は、ＭＲＤを持つ患者の治療に大きな可能性を示している。この場合、ＭＲＤ患者に対する現在のアプローチが不十分であるため、ＭＲＤを支持するｍＩＬ１５及び持続性Ｔ細胞は、ニーズに対応するであろう。ＭＲＤを持つ患者に注入されるＴ細胞及び他のリンパ球の持続性は、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を越えて適用する。持続的治療効果を達成する場合、悪性腫瘍、感染、または自己免疫疾患の治療及び予防に用いられる任意の免疫細胞は、長期にわたって持続できなければならない。従って、Ｔ細胞を活性化させて、内因性Ｔ細胞受容体または導入免疫受容体由来のシグナルよりも持続させることは、養子免疫療法の多くの態様において重要である。従って、膜結合型サイトカインの発現を用いて、種々の病的状態に対して注入されたＴ細胞及び他の免疫細胞の治療潜在力及び持続性を増すことができる。

発明者らは、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞上でＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα（ｍＩＬ１５）の膜結合型融合タンパク質として発現されるＩＬ−１５のムテインを生成した。ｍＩＬ１５構築物を、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（０日目）と共に、スリーピングビューティＤＮＡトランスポゾンプラスミドとしての一次ヒトＴ細胞中に共電気導入した。ＣＤ１９^＋人工抗原提示細胞及び補充ＩＬ−２１上での共培養により、臨床的に意義のある数のｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が生成された。遺伝子改変Ｔ細胞中のＩＬ−１５受容体複合体を介したシグナル伝達は、ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）のリン酸化により検証され、これらのＴ細胞により、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と等しいＣＤ１９^＋腫瘍標的の再指向特異的溶解が実証された。さらに、抗原離脱後、ｍＩＬ１５により生成されたシグナル伝達により、特異的細胞表面マーカー、転写因子、及びＩＬ−２の分泌能力を含むメモリー関連特性を有する低分化／若々しい表現型のＴ細胞の有病率が増した。これらの特徴は、ｉｎｖｉｖｏで長期持続する能力を示したＴ細胞サブセットと相関しているため、養子導入で用いたＴ細胞に望ましい特性である。播種ＣＤ１９^＋白血病を有する免疫不全ＮＳＧマウスでは、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、持続性及び抗腫瘍効果の両方が実証されたが、そのＣＡＲ^＋Ｔ細胞対応物は、ＴＡＡの存在にかかわらず、有意な持続性を維持できなかった。ｍＩＬ１５^＋／−ＣＡＲ^＋Ｔ細胞をまず６日間生着した後、播種ＣＤ１９^＋白血病を導入した予防マウス（ＮＳＧ）モデルでは、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のみが、持続するのみならず腫瘍生着を防止することがわかった。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が、ＴＡＡからの刺激に依存せずに持続することができたかどうか試験するため、ｍＩＬ１５^＋／−ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、腫瘍のないＮＳＧマウスに養子導入した。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のみが、外因性サイトカインサポートまたはＣＤ１９ＴＡＡの存在がないｉｎｖｉｖｏ環境で持続することができた。ｍＩＬ１５がＣＡＲ^＋Ｔ細胞上で共発現されることで、ＴＡＡまたは外因性サイトカインサポートの必要なくｉｎｖｉｖｏ持続性を強化できたことが、これらのデータにより実証される。要するに、このサイトカイン融合分子は：（ｉ）ｐＳＴＡＴ５を介して刺激性シグナルを提供することでｉｎｖｉｖｏのＴ細胞持続性を増す一方、腫瘍特異的機能性を維持し、（ｉｉ）メモリー様表現型を促進するＴ細胞サブセットを維持し、（ｉｉｉ）ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏでのＴ細胞増殖及び持続性に対する臨床等級ＩＬ−２の必要性及びコストを排除し、（ｉｖ）臨床等級可溶性ＩＬ−１５の必要性を軽減する。
ＶＩＩ．免疫系及び免疫療法

いくつかの実施形態では、内科的疾患は、特異的免疫応答を引き起こす再指向Ｔ細胞の移動によって治療される。本発明の一実施形態では、Ｂ細胞系統悪性腫瘍または疾患は、特異的免疫応答を引き起こす再指向Ｔ細胞の移動によって治療される。従って、免疫応答の基本的な理解が必要である。

養子免疫系の細胞は、リンパ球と呼ばれる白血球の型である。Ｂ細胞及びＴ細胞は、主要型のリンパ球である。Ｂ細胞及びＴ細胞は、同じ多能性造血幹細胞由来であり、活性化されるまで互いに区別ができない。Ｂ細胞は、体液性免疫応答において大きな役割を果たすが、Ｔ細胞は、細胞媒介免疫応答と密接に関わっている。Ｂ細胞及びＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるこれらの細胞表面上の特殊な受容体の存在によって、Ｂ細胞及びＮＫ細胞などの他のリンパ球型から区別することができる。ほとんど全ての他の脊椎動物では、Ｂ細胞及びＴ細胞は、骨髄の幹細胞により産生される。Ｔ細胞は、胸腺に入り、そこで成熟することが、Ｔ細胞の名前の由来である。ヒトでは、おおよそ１％〜２％のリンパ球プールが、１時間毎に再循環して、抗原特異的リンパ球の機会を最適にし、二次リンパ組織内のこれらの特異的抗原を見つける。

Ｔリンパ球は、骨髄の造血幹細胞から生じ、一般に、胸腺に移動して成熟する。Ｔ細胞は、これらの膜（Ｔ細胞受容体）上で独特の抗原結合受容体を発現し、これは、他の細胞の表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と関連した抗原しか認識できない。Ｔヘルパー細胞及びＴ細胞傷害性細胞として知られる少なくとも２つのＴ細胞集団がある。Ｔヘルパー細胞及びＴ細胞傷害性細胞は、それぞれ、膜結合型糖タンパク質ＣＤ４及びＣＤ８の表示によって主に区別される。Ｔヘルパー細胞は、免疫系のＢ細胞、Ｔ細胞傷害性細胞、マクロファージ、及び他の細胞の活性化に不可欠な種々のリンホカインを分泌する。これに対し、抗原−ＭＨＣ複合体を認識するＴ細胞傷害性細胞は、増殖し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。ＣＴＬは、細胞溶解をもたらす物質を産生することで、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞などの、本体を表示している抗原の細胞を排除する。ナチュラルキラー細胞（即ち、ＮＫ細胞）は、自然免疫系の主成分を構成する細胞傷害性リンパ球の型である。ＮＫ細胞は、ウイルスに感染した腫瘍及び細胞の拒絶に主要な役割を果たす。細胞は、標的細胞をアポトーシスにより死滅させるパーフォリン及びグランザイムと呼ばれるタンパク質の細胞質の小顆粒を放出することで殺傷する。

マクロファージ、Ｂリンパ球、及び樹状細胞を含む抗原提示細胞は、特定のＭＨＣ分子の発現により区別される。ＡＰＣは、抗原を内在化し、その抗原の一部を、これらの細胞の外膜上のＭＨＣ分子と共に再発現する。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、多数の遺伝子座を持つ大きな遺伝子複合体である。ＭＨＣ遺伝子座は、クラスＩ及びクラスＩＩＭＨＣと呼ばれる２つの主要なクラスのＭＨＣ膜分子をコードする。Ｔヘルパーリンパ球は、一般に、ＭＨＣクラスＩＩ分子と関連する抗原を認識し、Ｔ細胞傷害性リンパ球は、ＭＨＣクラスＩ分子と関連する抗原を認識する。ＭＨＣは、ヒトではＨＬＡ複合体、マウスではＨ−２複合体と呼ばれる。

Ｔ細胞受容体、即ち、ＴＣＲは、Ｔリンパ球（またはＴ細胞）の表面に見られ、一般に、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と結合した抗原の認識に関与する分子である。ＴＣＲは、Ｔ細胞の９５％においてアルファ鎖及びベータ鎖からなるヘテロダイマーであるが、Ｔ細胞の５％は、ガンマ鎖及びデルタ鎖からなるＴＣＲを有している。抗原及びＭＨＣに対するＴＣＲの関与は、関連した酵素、共受容体、および特殊化したアクセサリー分子によって媒介された一連の生化学的事象を通して、結果的にそのＴリンパ球の活性化を招く。免疫学では、ＣＤ３抗原（「ＣＤ」とは、ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎの略である）は、哺乳動物では４本の異なる鎖（ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及び２本のＣＤ３ε）からなるタンパク質複合体であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖として知られる分子と関連してＴリンパ球中で活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、及びＣＤ３分子は、ＴＣＲ複合体を共に含む。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの関連性の高い細胞表面タンパク質である。ＣＤ３鎖の膜貫通領域は、負に帯電しており、それにより、これらの鎖は正に帯電したＴＣＲ鎖（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）と関連することができる特徴を持つ。ＣＤ３分子の細胞内尾部には、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ、即ち、略してＩＴＡＭとして知られる単一保存モチーフが含まれ、これは、ＴＣＲのシグナル伝達能力に必須である。

ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化に必要な共刺激シグナルを提供するＴ細胞上で発現した分子の１つである。ＣＤ２８は、Ｂ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）に対する受容体である。トール様受容体リガンドより活性化される場合、Ｂ７．１発現は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）で上方調節される。抗原提示細胞上のＢ７．２発現は、構造性である。ＣＤ２８は、ナイーブＴ細胞上で構造的に発現される唯一のＢ７受容体である。ＴＣＲに加えてＣＤ２８を介した刺激により、強力な共刺激シグナルをＴ細胞にもたらし、種々のインターロイキン（特に、ＩＬ−２及びＩＬ−６）を産生することができる。

ヒト疾患に対する治療的介入として抗原特異的Ｔ細胞を単離し増殖させる戦略は、臨床試験で実証されている（Ｒｉｄｄｅｌｌら、１９９２；Ｗａｌｔｅｒら、１９９５；Ｈｅｓｌｏｐら、１９９６）。

Ｂ細胞は、Ｔ細胞の免疫刺激性抗原提示細胞として機能し得るため、悪性Ｂ細胞は、再指向Ｔ細胞の優れた標的になると思われる（Ｇｌｉｍｃｈｅｒら、１９８２）。リンパ腫は、そのリンパ節指向性のおかげで、Ｔ細胞媒介の認識及び排除において解剖学的に理想的な位置にある。注入されたＴ細胞がリンパ節に多数局在化することは、ＨＩＶ特異的ＣＤ８^＋ＣＴＬクローンの注入を受けたＨＩＶ患者で裏付けられている。これらの患者では、リンパ節生検材料の評価により、注入されたクローンは、リンパ節のおおよそ２％〜８％のＣＤ８^＋細胞を構成したことが分かった。構造性プロモーター（接着分子）が、循環しているＴ細胞をリンパ節に戻るように仕向け、ｉｎｖｉｔｒｏ増殖により下方調節されるので、リンパ節ホーミングは、この構造性プロモーター下でＬ選択分子をコードするｃＤＮＡ構築物にＴ細胞を共トランスフェクトすることでさらに改善され得る（Ｃｈａｏら、１９９７）。本発明は、上述のような組み換えヒトＣＤ１９特異的ＣＡＲ発現細胞の治療有効量を患者に注入することを含む、内因性ＣＤ１９を発現する細胞と関連するヒト疾患病態の治療方法を提供し得る。内因性ＣＤ１９を発現する細胞と関連するヒト疾患病態は、リンパ腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、及びＢ細胞関連自己免疫疾患からなる群から選択され得る。

白血病は、血液または骨髄のがんであり、血液細胞、通例的には、白血球細胞（白血球）の異常増殖（増殖による産生）を特徴とする。血液学的腫瘍と呼ばれる大きな群の疾患の一部である。白血病は、一連の疾患を包含する幅広い用語である。白血病は、臨床的及び病理的に急性型及び慢性型に分けられる。

急性白血病は、幼若血液細胞の急速な増加を特徴とする。そのような密集によって骨髄は健常な血液細胞を産生できなくなる。急性型の白血病は、小児及び若年成人で起こり得る。実際には、米国において、いずれの他の型の悪性腫瘍疾患よりもより一般的な小児の死亡原因である。急性白血病は、悪性腫瘍細胞が急速に進行及び集積し、その後、血流に乗って身体の他の臓器に広がってしまうため緊急治療を要する。この疾患は、脳神経まひを時折引き起こすが、中枢神経系（ＣＮＳ）の関与はまれである。慢性白血病は、比較的成熟しているがやはり異常な血液細胞の過剰な蓄積により区別される。通常、進行に数ヶ月から数年かかり、細胞は正常細胞よりもさらに高い率で生成され、血液中の異常な白血球細胞が増加する。慢性白血病は、高齢者に生じるのがほとんどであるが、理論的にはどの年齢層でも起こり得る。急性白血病は直ちに治療しなければならないが、慢性型では、療法の効果を最大限にするため治療前にしばらくの間モニタリングすることがある。

さらに、この疾患は、通常ではリンパ球を形成に進む種類の骨髄細胞でがん性変化が発生したことを示すリンパ性またはリンパ芽球性、及び、通常では赤血球、白血球の一種、及び血小板の形成に進む種類の骨髄細胞でがん性変化が発生したことを示す骨髄性または骨髄に分類される（リンパ球様細胞対骨髄細胞を参照されたい）。

急性リンパ性白血病（急性リンパ芽球性白血病またはＡＬＬとしても知られる）は、若年小児における最も一般的な種類の白血病である。この疾患には、成人、特に６５歳以上の成人もかかる。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）には、５５歳以上の成人が最も頻繁にかかる。これはしばしば、より若い成人も発症するが、小児はほとんどかからない。急性骨髄性白血病（急性骨髄性白血病またはＡＭＬとしても知られる）は、小児よりも成人に、より一般的に生じる。この種類の白血病は、以前は、「急性非リンパ性白血病」と呼ばれていた。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、主に成人に生じる。非常に少数の小児もこの疾患を発症する。

リンパ腫は、リンパ球（脊椎動物免疫系における種類の白血球細胞）で起こる種類のがんである。リンパ腫には多くの種類がある。米国立衛生研究所によれば、リンパ腫は、米国におけるがんの全症例中約５％を占め、特に、ホジキンリンパ腫は、米国におけるがんの全症例中１％未満を占める。リンパ系は身体の免疫系の一部であるため、ＨＩＶ感染またはある薬物もしくは薬剤により免疫力が低下している患者も、リンパ腫の発生率が高い。

１９世紀及び２０世紀には、この疾患は、１８３２年にトーマス・ホジキンにより発見されたため、ホジキン病と呼ばれていた。口語的には、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫（他の全ての種類のリンパ腫）として広く分類される。リンパ腫の種類の科学的分類についてより詳述する。旧分類では組織球性リンパ腫と呼ばれていたが、これらは、新規分類ではＢ、Ｔ、またはＮＫ細胞系統として認識される。

自己免疫疾患または自己免疫は、生物体が自身の構成部分を（サブ分子レベルに至るまで）「自己」と認識できないことであり、生物体自身の細胞および組織に対する免疫応答がもたらされる。かかる異常な免疫応答に起因する任意の疾患を自己免疫疾患と称する。顕著な例としては、セリアック病、１型糖尿病（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、及び関節リウマチ（ＲＡ）が挙げられる。

自己免疫疾患を含む炎症性疾患は、Ｂ細胞疾患と関連するクラスの疾患でもある。自己免疫疾患の例としては、限定的ではないが、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多内分泌腺症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、紅斑結節炎、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性関節炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血管血栓炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性的活動性肝炎、多発筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性触覚錯誤症、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発筋痛、ペミシオウサネミア、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、及び線維化性肺胞炎が挙げられる。最も一般的な治療は、コルチコステロイド及び細胞毒性薬であり、これは猛毒になり得る。これらの薬剤は、免疫系全体も抑制し、重篤な感染症をもたらし、骨髄、肝臓、及び腎臓に悪影響を及ぼす。クラスＩＩＩ自己免疫疾患の治療に今まで用いられてきた他の治療は、Ｔ細胞及びマクロファージに対して向けられている。自己免疫疾患、特に、クラスＩＩＩ自己免疫疾患をより効果的に治療する方法が必要とされている。
ＶＩＩＩ．人工抗原提示細胞

場合によっては、ａＡＰＣは、実施形態の治療組成物及び細胞治療剤の調製に有用である。調製物及び抗原提示系の使用に関する一般的なガイダンスには、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号、及び同第６，７９０，６６２号；米国特許出願公開第２００９／００１７０００号及び同第２００９／０００４１４２号；及び国際公開第ＷＯ２００７／１０３００９号を参照されたい。

ａＡＰＣは、一般に、ペプチドをＭＨＣ分子に追加の処理をすることなく直接結合することができる最適な長さのペプチドでインキュベートされる。あるいは、細胞は、対象の抗原を発現することができる（即ち、ＭＨＣ非依存性抗原認識の場合）。ペプチド−ＭＨＣ分子または対象の抗原に加えて、ａＡＰＣ系はまた、少なくとも１つの外因性補助分子も含んでもよい。任意の好適な数及び組み合わせの補助分子を使用してもよい。補助分子は、共刺激分子及び接着分子などの補助分子から選択してもよい。例示の共刺激分子としては、ＣＤ７０及びＢ７．１（Ｂ７．１は、以前はＢ７として知られており、ＣＤ８０としても知られる）が挙げられ、特にＴ細胞表面上のＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ−４分子に結合し、これにより、例えば、Ｔ細胞増殖、Ｔｈ１分化、Ｔ細胞短期間生存、及びインターロイキン（ＩＬ）−２などのサイトカイン分泌に作用する（Ｋｉｍら、２００４，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２２（４），ｐｐ．４０３〜４１０を参照されたい）。接着分子としては、セレクチンなどの炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通型結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、及び細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの単回膜貫通型免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質などを挙げることができ、これらは、例えば、細胞対細胞、または細胞対マトリックスの接触を促進する。例示の接着分子としては、ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１などのＩＣＡＭが挙げられる。共刺激分子及び接着分子を含む例示の補助分子の選択、クローニング、調製、及び発現に有用な技術、方法、及び試薬は、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、及び同第６，３６２，００１号に例示されている。

ａＡＰＣになるように選択された細胞は、好ましくは細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチド輸送、及び／または細胞内ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子−ペプチドローディングが欠失しているか、または変温性（即ち、温度攻撃に対して哺乳類細胞株よりも感受性が低い）であるか、またはこれら欠失と変温性特性の両方を保有している。好ましくは、ａＡＰＣになるように選択された細胞はまた、外因性ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子、及び細胞内に導入される補助分子要素に対して、少なくとも１つの内因性対応物（例えば、内因性ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子、及び／または上記内因性補助分子）を発現する能力をも欠失している。さらに、ａＡＰＣは、好ましくは、ａＡＰＣ生成のためのそれらの改変以前に細胞が保有していた欠失及び変温性特性を保持する。例示のａＡＰＣは、昆虫細胞株などの抗原プロセシング関連トランスポーター（ＴＡＰ）−欠失細胞株を構成するか、もしくはその細胞株由来である。例示の変温性昆虫細胞株は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞株などのショウジョウバエ細胞株である（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．１９７２Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．３５３〜３６５を参照されたい）。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞の調製、増殖、培養に関する実例となる方法は、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、及び同第６，３６２，００１号に記載されている。

一実施形態では、ａＡＰＣは、凍結解凍サイクルにも曝される。例示の凍結解凍サイクルにおいて、ａＡＰＣを収容する好適な容器を、適量の液体窒素、固体二酸化炭素（即ち、ドライアイス）、または急速に凍結を起こすような同様の低温材料と接触させることにより、ａＡＰＣを凍結してもよい。その後、低温材料をａＡＰＣから除去して周囲室温条件に曝すことにより、または、微温湯浴若しくは温かい手を用いて解凍時間の短縮を促進する促進化解凍プロセスのいずれかにより、凍結したａＡＰＣを解凍する。さらに、ａＡＰＣを凍結し、解凍まで長期間保存してもよい。また、凍結したａＡＰＣを解凍した後、更に用いるまで凍結乾燥してもよい。好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び他の防腐剤などの凍結解凍手順に悪影響を及ぼし得る防腐剤は、本質的にそのような防腐剤を欠く培地にａＡＰＣを移すことなどにより、凍結解凍サイクルを受けるａＡＰＣを含む培地には含まれず、または本質的に除去される。

他の好ましい実施形態では、不活化後に、細胞増殖、核酸の複製または発現が本質的に起こらないように、異種核酸及びａＡＰＣ内因性の核酸を架橋により不活化してもよい。一実施形態では、外因性ＭＨＣ及び補助分子の発現、このような分子のａＡＰＣ表面上への提示、並びに選択された単一のペプチドまたは複数のペプチドによる提示されたＭＨＣ分子のローディングに続く点で、ａＡＰＣが不活化される。従って、このような不活化されて選択したペプチドロードａＡＰＣは、本質的に増殖不能または複製不能にされているものの、選択したペプチド提示機能を保持している。好ましくは、架橋によっても、ａＡＰＣの抗原提示細胞機能を実質的に低下させることなく、細菌及びウイルスなどの微生物汚染が本質的にないａＡＰＣがもたらされる。従って、架橋は、ａＡＰＣの重要なＡＰＣ機能を維持する一方で、ａＡＰＣを用いて開発された細胞療法生成物の安全性に関する懸念を軽減するのに役立つ。架橋及びａＡＰＣに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００１７０００号を参照されたい。
ＩＸ．本発明のキット

本明細書に記載の組成物のどれもがキットに含まれ得る。いくつかの実施形態では、同種ＣＡＲＴ細胞をキットに提供し、これには、培地などの細胞の増殖に適した試薬、ａＡＰＣ、増殖因子、抗体（例えば、ＣＡＲＴ細胞を選別または特徴付けするためのもの）、及び／またはＣＡＲまたはトランスポゼースをコードするプラスミドも含み得る。

非限定例では、キメラ受容体発現構築物、キメラ受容体発現構築物を生成するための１つ以上の試薬、発現構築物のトランスフェクションのための細胞、及び／または、発現構築物のトランスフェクションのために同種細胞を得るための１つ以上の器具（そのような器具は、シリンジ、ピペット、鉗子、及び／または、いずれかのそのような医療承認された装置であり得る）。

いくつかの実施形態では、内因性ＴＣＲ α／β発現を排除するための発現構築物、構築物を生成するための１つ以上の試薬、及び／またはＣＡＲ^＋Ｔ細胞がキットに提供される。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする発現構築物が含まれる。

いくつかの態様では、キットは、細胞をエレクトロポレーションするための試薬または装置を含む。

キットは、本発明の組成物を生成するために、１つ以上の好適に等分された本発明の組成物または試薬を含み得る。キットの構成成分は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装され得る。キットの容器手段には、成分を入れることができ、好ましくは好適に等分して入れることができる少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、びん、シリンジまたは他の容器手段が含まれ得る。２つ以上の成分がキットに存在する場合、キットは、追加の成分を別々に入れることができる第２、第３、または他の追加の容器も一般に含有するであろう。しかしながら、成分の種々の組み合わせがバイアルに含まれてもよい。本発明のキットはまた典型的には、キメラ受容体構築物を含有するための手段、及び、商業用販売のために厳重に閉じ込められている何らかの他の試薬容器を含むであろう。そのような容器には、例えば、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれ得る。

Ｘ．実施例
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。下記の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を表しているため、その実施のための好ましい態様を構成すると見なされ得ることが当業者によって理解されるはずである。しかしながら、当業者は本開示に照らして、多くの変化が、開示される具体的な実施形態において行われ得ること、そして、多くの変化により、同様な結果または類似する結果が依然として、本発明の精神および範囲から逸脱することなく得られ得ることを理解しなければならない。
実施例１−末梢血及び臍帯血からのＴ細胞を遺伝的に改変するためのスリーピングビューティ及び人工抗原提示細胞の臨床応用−材料及び方法

ＰＢ及びＵＣＢからの単核球（ＭＮＣ）の単離。０日目またはその前に、等容積のＰＢと４容積のＰＢＳ−ＥＤＴＡを持つＵＣＢを希釈する。５０ｍＬ遠心分離管内で希釈血液（２５ｍＬ）をフィコール（１２ｍＬ）の上にゆっくり重層し、４００×ｇで３０〜４０分間（ブレーキなし）遠心分離する。移送ピペットを用いて単核球分画（界面）を回収し、新しい５０ｍＬ遠心分離管に移す。容積をＰＢＳ−ＥＤＴＡで５０ｍＬまでにし、４５０×ｇで１０分間遠心分離する。上清を吸引し、５０ｍＬの完全培養培地（ＣＣＭ）中で細胞ペレットを穏やかに再懸濁させる。４００×ｇで１０分間遠心分離する。ＣＣＭ中の細胞ペレットを穏やかに再懸濁させ、プールし、トリパンブルー色素排除（セロメーター、ＰＢＭＣプログラム）を用いて細胞計数を行う。ＭＮＣをエレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）に用いてもよいし、あるいは将来使うために凍結保存してもよい。

０日目にエレクトロポレーションするＴ細胞の調製。凍結保存ＭＮＣを用いる場合、大規模なエレクトロポレーションのために十分な細胞を、３７℃の水浴で速やかに解凍する（遠心分離及び２時間のインキュベーション中の細胞喪失は２×１０^８プラス〜２０％）。穏やかに再懸濁させ、予熱した完全無フェノールＲＰＭＩ培養培地（ＰＦ−ＲＰＭＩ）を含有する適当なサイズの遠心分離管に細胞を移し、２００×ｇで１０分間（ブレーキなし）遠心分離し、上清を吸引する。次に、新鮮分離したＭＮＣを用いる場合、ＰＦ−ＲＰＭＩ中でＭＮＣを再懸濁させ、細胞計数（セロメーター）を行い、細胞を適当なサイズの細胞培養容器に１０^６個の細胞／ｍｌ濃度で移す。加湿した３７℃／５％のＣＯ_２インキュベーターで細胞を２時間±３０分インキュベートする。ＭＮＣを滅菌遠心分離管に移し、２００×ｇで５分間（ブレーキなし）回転させ、上清を吸引し、穏やかに再懸濁させ、細胞ペレットをＰＦ−ＲＰＭＩ中で組み合わせる。細胞計数（セロメーター）を行い、必要な細胞懸濁液（２×１０^８ＭＮＣ）の容量を算出する。算出した容量を５０ｍＬの滅菌遠心分離管に移し、２００×ｇで１０分間（ブレーキなし）回転させる。残存培地が残らないように上清を吸引し、管の側面を軽くたたくことで穏やかに再懸濁させる。

０日目のＭＮＣ（１０個のキュベットを用いたフルスケールプロセス）のエレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）。加湿した３７℃／５％のＣＯ_２インキュベーターで、４ｍＬの温かなＰＦ−ＲＰＭＩを含有する１０ウェルで滅菌１２ウェルプレートをプレインキュベートする。ロンザヌクレオフェクター溶液ヒトＴ細胞キット（製造者指示ごとに再構築した、ｗｗｗ．ｌｏｎｚａ．ｃｏｍ）を調製し、バイオセーフティーキャビネット（ＢＳＣ）内で外気温度に予熱する。反応／キュベット当たり１００μＬの補充ヌクレオフェクター溶液、１５μｇのトランスポゾン（ＣＤ１９ＲＣＤ２８／ｐＳＢＳＯとして指名された超らせんＤＮＡプラスミド）、及び５μｇのトランスポゼース（ｐＣＭＶ−ＳＢ１１として指名された超らせんＤＮＡプラスミド）を添加して、ヌクレオフェクター溶液／ＤＮＡマスターミックスを調製する。遠心分離管の側面を軽くたたくことでＭＣＮ細胞ペレットを分散させ、２×１０^７細胞／１００μＬの最終細胞濃度でヌクレオフェクション溶液／ＤＮＡマスターミックスを再懸濁させる。１００μＬの細胞懸濁液を１０本のロンザヌクレオフェクションキュベットの各々に気泡を避けながら慎重に移す。キュベットを１回軽くたたいて、プログラムＵ−０１４（非刺激Ｔ細胞用）を用いて電気穿孔する。キュベット及び１２ウェルプレートをＢＳＣに移す。対応するウェルから〜５００μＬの予熱した培養培地を加えることで、Ａｍａｘａ社製の先の細い移送ピペットを用いて各キュベットから電気穿孔細胞を採取し、プレートを２時間±３０分の加湿した３７℃／５％のＣＯ_２インキュベーターに戻す。２時間のインキュベーション後、細胞を全てのウェルから採取し、滅菌遠心分離管に移す。１４０×ｇで８分間、外気温度で、ブレーキなしで遠心分離して細胞を洗浄し、残存培地が細胞ペレットを覆わないように上清を吸引し、廃棄する。遠心分離管の側面を軽くたたくことで細胞ペレットを分散させ、ＣＣＭ中で穏やかに再懸濁させ、単細胞懸濁液を得る。細胞計数を行い、細胞濃度をＣＣＭ中で１０^６個の細胞／ｍＬに調整する。細胞懸濁液を細胞培養フラスコに移し、インキュベーター中に一晩置く。同じプロセスを、対照ＥＧＦＰトランスフェクト細胞（５μｇのＡｍａｘａ対照ＥＧＦＰ超らせんプラスミド、ｐｍａｘＧＦＰを持つ５×１０^６個の細胞／キュベット）に用いてもよい。

１回目及びそれに続く刺激サイクルの１日目にフローサイトメトリーによるＣＡＲ発現の分析。電気穿孔細胞を採取し、トリパンブルー色素排除（血球計）を用いて細胞計数を行う。ＣＡＲ発現の計測としてＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びヒトＩｇＧＦｃγに特異的な抗体を持つ細胞（１〜２×１０^６）を染色する。ＦＡＣＳカリバー上の細胞を得、ＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いてデータを分析し、ＣＡＲの発現を算出する。式：（総生細胞数）×（％ＣＡＲ^＋細胞）＝ＣＡＲ^＋細胞数によって、培養中のＣＡＲ^＋細胞を算出する。

１回目及びそれに続く刺激サイクルの１日目のａＡＰＣ（クローン＃４）の調製。ａＡＰＣ（クローン＃４）をＫ５６２細胞（米国菌培養収集所から得た親株）から得て、所望のＴ細胞共刺激分子を共発現した。凍結した１００Ｇｙ照射ａＡＰＣの等分量を３７℃の水浴で解凍する。細胞を、４００×ｇで１０分間ＣＣＭ中にて遠心分離することで２回洗浄し、セロメーター（トリパンブルー色素排除）を用いてカウントする。刺激に必要な生存ａＡＰＣの数：（ＣＡＲ^＋細胞数）×２＝必要な照射ａＡＰＣの数を算出する。

１回目及びそれに続く刺激サイクルの１日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞のａＡＰＣ媒介刺激。滅菌容器中で電気穿孔細胞（ＣＡＲを発現）とγ照射ａＡＰＣ（クローン＃４）とを、ＣＣＭ中で１：２（ＣＡＲ^＋細胞：生存ａＡＰＣ）の比率でミックスする。ａＡＰＣ比率は、エレクトロポレーションの次の日のフローサイトメトリーに基づいて、ＣＡＲを発現するために調整されることに留意されたい。ＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍＬ）を細胞懸濁液に加える。１０^６個の細胞／ｍＬの濃度で、Ｔ−７５ｃｍ^２フラスコ及び／またはＶｕｅＬｉｆｅ培養バッグ中に等分し、インキュベーターに戻す。

３日目及び５日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の継続培養。半培地交換を行い、ＩＬ−２１を補充し、Ｔ細胞を１０^６個の細胞／ｍＬの濃度で維持する。

７日目の第１ａＡＰＣ−媒介刺激サイクルの終了。細胞を採取し、計数し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＦｃγ（ＣＡＲ）を染色する。

エレクトロポレーション後７日目〜１４日目のＣＤ５６^＋細胞の枯渇。ＣＤ５６^＋ＣＤ３^ｎｅｇリンパ球≧１０％の場合、常磁性粒子を用いてＣＤ５６枯渇を行う。

８日目→１４日目、１５日目→２１日目、及び２２日目→２８日目に対応する刺激サイクル＃２、＃３、及び＃４中にＴ細胞を臨床的に十分な数に増殖するためのａＡＰＣの反復追加。刺激プロセスを４回まで繰り返す。７日目、１４日目、及び２１日目の始めにＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）を培養に加えた後、各培地を交換する（月、水、金スケジュールで、１週間で３回）。放出試験及び注入用のコントロールドレートフリーザーを用いて、必要に応じて過剰Ｔ細胞を冷凍保存する（アーカイブ保存する）。
実施例２−末梢血及び臍帯血からＴ細胞を遺伝的に改変するためのスリーピングビューティ及び人工抗原提示細胞の臨床応用−結果

ＤＮＡプラスミドの電気移動、及びγ照射ａＡＰＣ上のＴ細胞の増殖を用いて、ヒト応用のためのＰＢ及びＵＣＢ由来の臨床的に魅力的な数のＴ細胞を生成する。これらの遺伝子改変Ｔ細胞は、主要組織適合複合体に依存しないＴＡＡＣＤ１９を認識する導入ＣＡＲを発現する。（ｉ）トランスポゾン、ＣＤ２８及びＣＤ３−ε^１４を介してシグナルを送る第２世代ＣＡＲ（ＣＤ１９ＲＣＤ２８）、及び（ｉｉ）トランスポゼース、ＳＢ１１（Ｊｉｎら、２０１１）を発現するためのＳＢ由来ＤＮＡプラスミドが前述されている（Ｓｉｎｇｈら、２０１１；Ｄａｖｉｅｓら、２０１０；Ｋｅｂｒｉａｅｉら、２０１２）。現在の研究で用いるプラスミドは、ＷａｉｓｍａｎＣｌｉｎｉｃａｌＢｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＦａｃｉｌｉｔｙ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により商用に生産された。ａＡＰＣ（クローン＃４）は、前述したように、Ｋ５６２細胞（米国菌培養収集所から得た親株）から得て、所望のＴ細胞共刺激分子（各分子は、ａＡＰＣの細胞表面上に９０％で導入した）を共発現した（Ｍａｎｕｒｉら、２０１０）。ここで、ＣＤ１９特異的Ｔ細胞は、ＳＢ転位を用いてＰＢまたはＵＣＢ由来の単核球（ＭＮＣ）から生成し、ＣＡＲに導入した後、ａＡＰＣを追加することで、ＣＡＲ依存的にＴ細胞を数値的に増殖させることができた（図１及び図４）（Ｓｉｎｇｈら、２０１１；Ｓｉｎｇｈら、２００８）。トランスポゾン（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡプラスミド（ＣＤ１９ＲＣＤ２８／ｐＳＢＳＯ）１５μｇと、トランスポゼース（ＳＢ１１）をコードするＤＮＡプラスミド（ｐＣＭＶ−ＳＢ１１）５μｇとを用いて、各受容者に１０本のキュベット（２×１０^７ＭＮＣ／キュベット）を電気穿孔した。ＭＮＣが研究室での作業のために制限されていたり、あるいは規模が小さい場合、キュベットの数を減らしてもよい。エレクトロポレーションの日は、刺激サイクル＃１の「０日目」として定義する。フローサイトメトリー及び培養条件の対照として、自己Ｔ細胞を模擬電気穿孔し（ＤＮＡプラスミド無）、ＯＫＴ３でプレロードしたγ照射ａＡＰＣ（クローン＃４）上で数値的に増殖させ、ＣＤ３を架橋させて、Ｔ細胞増殖を維持した。エレクトロポレーションの翌日に、電気移送の効率及びＴ細胞の生存率を定期的に評価した（図２Ｂ）。この初期時点での対照ＤＮＡプラスミド（指定されたｐｍａｘＧＦＰ）及びＣＡＲからのＥＧＦＰの発現は、組み込みプラスミド及びエピソームプラスミドからのタンパク質発現を反映している。一般に、ＥＧＦＰ発現は、エレクトロポレーションの翌日には６０％と測定し、ＣＡＲ発現は、４０％〜５０％のＴ細胞生存率で〜４０％（図２Ａ）と測定した。可溶性組み換えヒトＩＬ−２及びＩＬ−２１の存在下でγ照射ａＡＰＣの反復追加により、ＣＡＲを安定的に発現するＴ細胞（ＣＤ１９ＲＣＤ２８）を回収する。これらのＮＫ細胞の百分率が≧１０％、特に、Ｔ細胞上で発現したＣＡＲの百分率が低い場合、ＣＤ３^ｎｅｇＣＤ５６^＋ＮＫ細胞は、ＣＤ５６特異的常磁性粒子を用いて培養から枯渇される。この枯渇により、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の増殖を維持するａＡＰＣの能力に干渉するＮＫ細胞の急速な異常増殖が防止される。時々、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞からのＮＫ細胞を最後の２回の刺激サイクル中に枯渇させるが、これにより、いくつかのＣＡＲ^＋Ｔ細胞上のＣＤ５６の共発現により所望の細胞の喪失がもたらされる。１４日目を過ぎて、ＶｕｅＬｉｆｅ培養バッグを用いて機能的閉鎖システムでＴ細胞を増殖させた。将来の分析のためにアーカイブ保存した材料のソースとして機能し、かつ、予期しない問題がその後製造プロセス中に発生した場合に解凍するために、遺伝子改変され増殖させたＴ細胞のサブセットは、一般に、ａＡＰＣ上の共培養の１４日目または２１日目（刺激サイクル＃２または＃３の最後）に凍結保存する。Ｔ細胞は、通常、＞９０％のＣＡＲを定期的に発現し、かつ、＞８０％の生存がある培養（図３）の２８日目または約２８日目に採取する（図２Ｃ及び２Ｄ）。ａＡＰＣ上で共培養して４週間後に、ＣＤ３^＋Ｔ細胞の平均倍数増殖は、ＣＡＲ^＋発現が９０％±７．５％で１９，８００±１１，３１３である（Ｓｉｎｇｈら、２０１１）。これらのＴ細胞を凍結保存し、製造した生成物の安全性及び治療潜在力を知らせるインプロセス及び放出試験を行う。放出試験は、臨床検査室改善法（ＣＬＩＡ）に従って実施し、臨床試験で受容者に注入する前に分析証明書を作成する。
実施例３−スリーピングビューティ及び人工抗原提示細胞を用いて、キメラ抗原受容体を安定的に発現する臨床等級ＣＤ１９特異的Ｔ細胞の製造−材料及び方法

臨床等級ＤＮＡプラスミドの生成。ＳＢトランスポゾンである_ＣｏＯｐＣＤ１９ＲＣＤ２８／ｐＳＢＳＯは、伸長因子−１α（ＥＦ−１α）（Ｋｉｍら、１９９０）及びヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）の５’非翻訳領域（Ｓｉｎｇｈら、２０１１；Ｄａｖｉｅｓら、２０１０）からなるＥＦ−１／ＨＴＬＶハイブリッド複合体プロモーター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）下で、ヒトコドン最適化（ＣｏＯｐ）第２世代_ＣｏＯｐＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ（配列番号１）を発現する。このＤＮＡプラスミドの誘導については、図１０に記載される。ＳＢトランスポゼース、ＳＢ１１は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター下で、ＤＮＡプラスミドｐＣＭＶ−ＳＢ１１からｃｉｓで発現された（Ｓｉｎｇｈら、２０１１）。このＤＮＡプラスミドの誘導については、図１１に記載される。プラスミドは両方とも、これら全体にわたって配列を決定し、菌株大腸菌ＤＨ５αを選択するためのカナマイシンを用いて、ＷａｉｓｍａｎＣｌｉｎｉｃａｌＢｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＦａｃｉｌｉｔｙ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により製造した。ＤＮＡプラスミドの放出基準を表１に示す。ＤＮＡプラスミドΔＣＤ１９_ＣｏＯｐ−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ／ｐＳＢＳＯを用いて、ＣＤ１９を発現した（図１２）。

細胞計数。トリパンブルー色素排除を用いて、生細胞を死細胞と区別し、セロメーター（ＮｅｘｅｃｅｌｏｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて計数した（Ｓｉｎｇｈら、２０１１）。

ＰＢＭＣの単離。２人の男性ボランティアの健康なドナーからの白血球除去産物を、ＫｅｙＢｉｏｌｏｇｉｃｓＬＬＣ（Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮ）から購入した。末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を、ｃＧＭＰに準じて行うようにＢｉｏｓａｆｅＳｅｐａｘシステム（Ｅｙｓｉｎｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を適応させて単離した。簡単に言えば、ＣＳ−９００キット上の全てのクランプを閉じた後、１００ｍＬのフィコール（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、６０ｍＬのシリンジを介して、ルアーロックコネクタを介した密度勾配培地バッグ（「フィコールバッグ」）に無菌で移し、手持ち式シーラー（Ｓｅｂｒａ、モデル＃２３８０）を用いてチューブを熱融着させた。キットを、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａｔ＃７００２６）を洗浄用の２０ｍＬの２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｂａｘｔｅｒ）（２％ｖ／ｖ、洗浄緩衝液）と共に含有する１，０００ｍＬバッグと、最終生成物バッグ［カップラー付き３００ｍＬ移動パック（Ｂａｘｔｅｒ／Ｆｅｎｗａｌ４Ｒ２０１４）］と、試薬／血液バッグとにスパイク連結した。密度勾配ベース分離プロトコル（ｖ１２６）を用いて、シリンジピストンを遠心分離器に装填し、Ｓｅｐａｘ装置のカバーを閉じた。試薬／血液バッグと及び生成物バッグを吊り下げ、全ての栓を「Ｔ」位置で回転ピン上にはめた。圧力センサーラインを接続した後、キットを自動使い捨て試験により検証し、重力流を用いて手作業でプライムした。サイクルの完了後、最終生成物を遠心分離管に無菌で移し、４００ｇの洗浄緩衝液、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ごとに１回１０分間で洗浄した。計数後、コントロールドレートフリーザー（ＰｌａｎｅｒＫｒｙｏ７５０）内で、ＢＭ５プログラム（−２℃／分の割合で４℃〜−４℃、−３５℃／分の割合で−４℃〜−６０℃、８℃／分の割合で−６０℃〜２０℃、−２．５℃／分の割合で−２０℃〜−４５℃、−１０℃／分の割合で−４５℃〜−８０℃）を用いたＣｒｙｏＭＡＣＳＦｒｅｅｚｅバッグ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及びバイアル（Ｎｕｎｃ）中の凍結保存培地（５０％のＨＳＡ、４０％のプラズマライト、１０％のＤＭＳＯ）を用いて、細胞を凍結保存した。

ａＡＰＣ（クローン＃４）マスター及び作業用細胞バンクの製造。ペンシルベニア大学でレンチウイルスによりＫ５６２を形質導入し、ビシストロニックベクターとしての（ｉ）ＣＤ１９、（ｉｉ）ＣＤ６４、（ｉｉｉ）ＣＤ８６、（ｉｖ）ＣＤ１３７Ｌ、及び（ｖ）膜結合型ＩＬ−１５（ｍＩＬ１５）をＥＧＦＰと共に共発現するａＡＰＣ（クローン＃４、ＣＪＫ６４．８６．４１ＢＢＬ．ＧＦＰ．ＩＬ−１５．ＣＤ１９として指定）を生成した。１０％の熱不活性化した規定のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有するＨｙＱＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中でａＡＰＣを数値的に増殖させ、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ−１（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培養培地（ＣＭ）で細胞を５×１０^５個の細胞／ｍＬで維持した。３２０バイアルのマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を、ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＡｓｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＴｈｅｒａｐｉｅｓ（ＰＡＣＴ）を介して作製した（表２）。ＭＣＢ由来のクローン４ａＡＰＣの２００バイアル作業用細胞バンク（ＷＣＢ）を、ＭＤＡＣＣで生成し、試験した（表３）。

ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を選択的に増殖させるためのａＡＰＣ（クローン＃４）。γ照射ａＡＰＣを用いて、遺伝子改変Ｔ細胞を数値的に増殖させた。ＷＣＢからの解凍ａＡＰＣを、ＶｕｅＬｉｆｅ細胞培養バッグで最大６０日間ＣＭで増殖させ、ＢｉｏｓａｆｅＳｅｐａｘＩＩ採取手順を用いて採取した。簡単に言えば、ＣＳ−４９０．１キットを、ルアーロックコネクタを介して３００ｍＬの出力バッグ（移動パック）に接続した。分離チャンバをピットに設置し、チューブを光センサに挿入し、栓を「Ｔ」位置で整列させた。圧力センサーラインを接続した後、生成物バッグ及び上清／血漿バッグをホルダーに吊り下げた。改変プロトコルＰＢＳＣｖ３０２をＳｅｐａｘメニューから選択し、処理される入力生成物の容量（初期容量）を、≦８４０ｍＬに設定した。検証及びキット試験後、手順を開始した。完了後、バッグを除去し、クランプを閉じ、キットを除去した。最終生成物バッグからの細胞を無菌除去し、洗浄培地（プラズマライト中で１０％ＨＳＡ）で２回洗浄し、計数した。ＣＩＳＢＩＯＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製ラジエーター（ＩＢＬ−４３７Ｃ＃０９４３３）を用いて、ａＡＰＣを照射（１００Ｇｙ）し、コントロールドレートフリーザー（ＰｌａｎｅｒＫｒｙｏ７５０）を用いて、凍結保存培地中に後々の使用のために凍結保存した。

ａＡＰＣのＯＫＴ３−ローディング。ＯＫＴ３をロードした（ＣＤ６４を介して）ａＡＰＣ（クローン＃４）を用いて、遺伝子改変していない対照（ＣＡＲ^ｎｅｇ）自己制御性Ｔ細胞を増殖させた。培養から得たａＡＰＣを、ローディング培地（ＬＭ）と呼ばれる、０．２％アセチルシステイン（Ａｃｅｔａｄｏｔｅ、ＣｕｍｂｅｒｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含有する無血清Ｘ−Ｖｉｖｏ１５（ｃａｔ＃０４−７４４Ｑ、Ｌｏｎｚａ）で一晩インキュベートした。翌日、細胞を洗浄し、ＧａｍｍａＣｅｌｌ１０００ＥｌｉｔｅＣｓ−１３７ラジエーター（ＭＤＳＮｏｒｄｉｏｎ）を用いて照射（１００Ｇｙ）し、機能等級の精製抗ヒトＣＤ３（クローン−ＯＫＴ３、１６−００３７−８５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の１μｇ／１０^６個の細胞と共に１０^６個の細胞／ｍＬの濃度でＬＭ中に再懸濁させ、４℃で３０分間３−Ｄ回転子（Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ）で穏やかに攪拌してインキュベートした。ＬＭで３回洗浄後、細胞を実験で用いたか、あるいは後々の使用のために蒸気層の液体窒素で等分に凍結した。

ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の製造。解凍ＰＢＭＣを、（ｉ）ヒトＴ細胞キット（ｃａｔ＃ＶＰＡ−１００２、Ｌｏｎｚａ；１キュベットに２×１０^７個の細胞当たり１００μＬ）で、（ｉｉ）ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲトランスポゾン（キュベット当たり２×１０^７個のＰＢＭＣ当たり１５μｇの超らせんＤＮＡ）をコードするＤＮＡプラスミド（_ＣｏＯｐＣＤ１９ＲＣＤ２８／ｐＳＢＳＯ）と、（ｉｉｉ）ＳＢ１１トランスポゼース（１キュベット当たり２×１０^７個のＰＢＭＣ当たり５μｇの超らせんＤＮＡ）をコードするＤＮＡプラスミド（ｐＣＭＶ−ＳＢ１１）と共に再懸濁させた。この混合物をキュベット（Ｌｏｎｚａ）に直ちに移し、ヌクレオフェクターＩＩ（Ａｍａｘａ／Ｌｏｎｚａ）を用いて電気穿孔し（培養０日目と定義）、１０％ＲＰＭＩ完全培地中で２〜３時間放置し、半培地交換、３７℃で５％ＣＯ_２下で一晩インキュベートした。翌日、細胞を採取し、計数し、フローサイトメトリーにより表現型を生じ、γ照射ａＡＰＣと１：２の比率（ＣＡＲ^＋Ｔ細胞：ａＡＰＣ）で共培養し、培養１日目、及び７日間の刺激サイクルの開始と印を付けた。ＩＬ−２１（ｃａｔ＃ＡＦ−２００−２１、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及びＩＬ−２（ｃａｔ＃ＮＤＣ６５４８３−１１６−０７、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を、月、水、金スケジュールでそれぞれ、１日目及び７日目以降に追加した。特に、これらの異常増殖が組織培養プロセスの初期に生じた場合、ＮＫ細胞は、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の数的増殖を防ぐことができる。従って、２５％ＨＳＡ（８０μＬ／１０^７細胞）を含有するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液中のＬＳカラム（ｃａｔ＃１３０−０４２−４０１、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）上で、ＣＤ５６ビーズ（ｃａｔ＃７０２０６、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ、２０μＬビーズ／１０^７細胞）を用いてＣＤ３^ｎｅｇＣＤ５６^＋細胞≧１０％の場合、ＣＤ５６枯渇を行った。上述のようなコントロールドレートフリーザー（ＰｌａｎｅｒＫｒｙｏ７５０）を用いて、エレクトロポレーション後の培養２１日目、及び第３刺激サイクルの最後に、Ｔ細胞をバックアップとして凍結保存し、液体窒素（蒸気層）中に保存した。全てのＣＤ３^＋及びＣＡＲ^＋Ｔ細胞の細胞計数を経時的にプロットし、線型回帰を用いて傾きを決定した。スチューデントｔ検定を用いて倍数増殖結果を比較した。各時点及び検証ランごとにＣＤ４／ＣＤ８比率を算出し、平均化した。

ＣＡＲ^ｎｅｇ対照Ｔ細胞の生成。対照として、５×１０^６個の模擬トランスフェクトしたＰＢＭＣを、照射及び抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）をロードしたＫ５６２由来ａＡＰＣクローン＃４と７日間の刺激サイクルで１：１の比率で共培養した。全ての培養を、培養１日目以降にＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍＬ）で補充し、培養の開始後７日目にＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）で補充した。その後、全てのサイトカインを月、水、金スケジュールで追加した。

細胞株。ＣＤ１９^＋Ｄａｕｄｉβ_２ｍ［β_２ミクログロブリンを共発現するバーキットリンパ腫（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら、２００８）］、及びＣＤ１９^＋ＮＡＬＭ−６（プレＢ細胞）を、前述のように培養した（Ｓｉｎｇｈら、２０１１）。ＡＴＣＣからのＥＬ−４細胞（マウスＴ細胞リンパ腫株）は、ΔＣＤ１９_ＣｏＯｐ−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ／ｐＳＢＳＯ構築物を用いてＣＤ１９を発現するように改変した。簡単に言えば、５×１０^６個のＥＬ−４細胞を、ＳＢトランスポゾン（ΔＣＤ１９_ＣｏＯｐ−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ／ｐＳＢＳＯ、３μｇ）及びＳＢトランスポゼース（ｐＣＭＶ−ＳＢ１１、１μｇ）を持つ１００μＬのＡｍａｘａＭｏｕｓｅＴ細胞ヌクレオフェクターキット（カタログ＃ＶＰＡ−１００６）中で再懸濁し、ヌクレオフェクターＩＩ（Ｌｏｎｚａ）を用いて電気穿孔した（プログラムＸ−００１）。トランスフェクタントを細胞破壊濃度のＧ４１８（０．８ｍｇ／ｍＬ）中で培養し、ＣＤ１９を均一に発現するために蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行い、クローン（クローン＃１７）を得た。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＡＴＣＣから得て、Ａｍａｘａ／Ｌｏｎｚａヌクレオフェクター溶液（ＫｉｔＶ）を用いて、_ＣｏＯｐＣＤ１９ＲＣＤ２８ｍｚ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯを電気穿孔した（ＰｒｏｇｒａｍＴ−１４、ヌクレオフェクターＩＩ、Ｌｏｎｚａ）。エレクトロポレーションしてから２週間後に、ＣＡＲを安定的に発現するＪｕｒｋａｔ細胞に、ＣＡＲを均一に発現するためにＦＡＣＳを行い、クローン（クローン＃１２）を得た（Ｍａｉｔｉら、２０１３）。２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ；１０％ＲＰＭＩ）で補充したＨｙＱＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で細胞株を維持した。制度的細胞株認証ポリシーに従ったＳＴＲプロファイリングまたは染色体分析を用いて、全ての細胞株を確認した。

細胞の免疫表現型。１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ、０．１％アジ化ナトリウム）中の抗体（表４）を用いて、細胞を４℃で３０分間染色した。細胞内染色では、２０分間固定／透過化後、適当な抗体を持つＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中で、細胞を４℃で３０分間染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて獲得を行い、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ３．００．０６１２（ＤｅＮｏｖｏＳｏｆｔｗａｒｅ、Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて分析した。
表４：フローサイトメトリーに用いた抗体。

ウエスタンブロット法。ＣＤ１９ＲＣＤ２８由来のキメラＣＤ３−ζ（７３ｋＤａ）のタンパク質発現を前述のように評価した（Ｓｉｎｇｈら、２００８）。簡単に言えば、ｉＢｌｏｔＤｒｙブロッティングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、タンパク質溶解物をニトロセルロース膜の上に移し、マウス抗ヒトＣＤ３−ζモノクローナル抗体（ｃａｔ＃５５１０３３、０．５μｇ／ｍＬ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｃａｔ＃１８５８４１３、１：１０，０００；Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ）でインキュベートし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＭａｘｉｍｕｍＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＳｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ）を用いて成長させ、ＶｅｒｓａＤｏｃＴＭ４０００ゲルドキュメンテーションシステム（ＢｉｏＲａｄ、ＣＡ）を用いて、化学発光を捕捉した。

ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ−ＦＩＳＨ）での蛍光によるテロメア長分析。製造者の指示に従って、フローサイトメトリー（ＤＡＫＯ）用のテロメアＰＮＡキット／ＦＩＴＣを用いて、Ｔ細胞のテロメア長を測定した。簡単に言えば、単離細胞（ＣＤ４またはＣＤ８）及び対照細胞（ｃａｔ＃８５１１２１０５、ＣＥＭ−１３０１細胞株；ＥＣＡＣＣ）を、ＦＩＴＣ標識テロメアＰＮＡプローブの有無に関わらないハイブリダイゼーション溶液で８２℃にて１０分間同等に混合し；室温にて遮光下で一晩ハイブリダイズし；４０℃にて洗浄液で２回洗浄し；２％ＦＣＳ及びヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳ中で再懸濁させ；ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。ＦＩＴＣ標識蛍光較正ビーズ（ｃａｔ＃８２４Ａ、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＦＩＴＣＭＥＳＦ、ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、フローサイトメトリー装置を較正した。Ｔ細胞をＣＥＭ−１３０１細胞株と比較することで、相対テロメア長（ＲＴＬ）を決定した：
ＲＴＬ＝（（プローブ有りの平均ＦＬ１試料細胞−プローブ無しの平均ＦＬ１試料細胞）×２×１００）／（プローブ有りの平均ＦＬ１参照細胞−プローブ無しの平均ＦＬ１参照細胞）

クロム遊離アッセイ。^５１Ｃｒ標識標的細胞を用いた標準４時間クロム遊離アッセイでＴ細胞の細胞毒性について評価した。９６ウエルＶ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に５×１０^３個の標的細胞を持つ１×１０^５個、０．５×１０^５個、０．２５×１０^５個、０．１２５×１０^５個及び０．０６２５×１０^５個の細胞／ウエルで、Ｔ細胞を３通りで被覆した。インキュベーション後、５０μＬの上清をＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の上に採取し、ＴｏｐＣｏｕｎｔＮＸＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み、及び特異的溶解率を算出した：
（実験的５１Ｃｒ放出−自発的５１Ｃｒ放出）／（最大５１Ｃｒ放出−自発的５１Ｃｒ放出）×１００
自発的放出及び最大放出は、ＣＭまたは０．１％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）でそれぞれインキュベートされた標的細胞からの馴化上清中のクロムを測定することにより判断した。

内毒素試験。最終生成物の内毒素レベルは、製造者のガイドライン通り、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）−ＰＴＳポータブル・テスト・システム（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて判断した。試験は、０．０１〜１０ＥＵ／ｍＬの検出限界を有し、これは、ＥＵ／患者の体重に変換することができる。

マイコプラズマ試験。製造者の指示に従って、ＴａＫａＲａマイコプラズマ検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＰＣＲによるマイコプラズマ検出を行った。

Ｔ細胞受容体Ｖβレパートリー。ＣＤ３特異的ｍＡｂ（ｃａｔ＃３４０９４９、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０μＬ）及びアイソタイプ適合対照ｍＡｂ（ｃａｔ＃５５２８３４、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と関連して用いた２４個のＴＣＲＶβ特異的ｍＡｂ（ｃａｔ＃ＩＭ３４９７、ＩＯＴＥＳＴＢｅｔａＭａｒｋＴＣＲ−Ｖβレパートリーキット、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）のパネルを用いて、培養２８日目及び３５日目のＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）−Ｖβ使用について判断した。

組み込みＣＡＲのコピー数を判断するためのリアルタイムＰＣＲ。遺伝子改変Ｔ細胞中の組み込みＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲのコピー数を判断するため、以下のプライマー：フォワード（５’−ＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴ−３’；配列番号８）、リバース（５’−ＴＧＣＡＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＡ−３’；配列番号９）、及びプローブ（５’−ＡＧＡＧＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＧ−３’；配列番号１０）を用いて、ＳｔｅｐｏｎｅｐｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＰＣＲ反応（５０℃で２分間、９５℃で１０分間、続いて、９５℃で１５秒、及び６０℃で１分を４０サイクル）で、５０〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡ（ｃａｔ＃８０２０４、ＡｌｌＰｒｅｐＤＮＡ／ＲＮＡミニキット、Ｑｉａｇｅｎ）を増殖させた。ＲＮＡｓｅＰ遺伝子のプライマー（Ｃａｔ＃４３１６８４４、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を内部対照として用いた。ＣＤ１９ＲＣＤ２８ｍｚ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯＤＮＡプラスミドからのＣＡＲを１コピー含有する遺伝子改変Ｊｕｒｋａｔ細胞（クローン＃１２）からの段階希釈ゲノムＤＮＡを用いて、標準曲線を生成した（Ｍａｉｔｉら、２０１３）。全てのプライマー、プローブ、及びＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックスは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。

ＳＢ１１トランスポゼースのＰＣＲ。フォワード（５’−ＡＴＧＧＧＡＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＣ−３’；配列番号１１）及びリバース（５’−ＣＴＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＧＣＡＴＴＧＣ−３’；配列番号１２）プライマーを用いて、サーマルサイクラー（ＰＴＣ−２００、ＤＮＡＥｎｇｉｎｅ、ＢｉｏＲａｄ）を用いたＰＣＲ反応（９５℃で５分間；９５℃で１５秒、５８℃で４０秒、７２℃で６０秒を２５サイクル；続いて、７２℃で７分間最終伸張）で、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞から単離したＤＮＡ（２０ｎｇ）（ＡｌｌＰｒｅｐＤＮＡ／ＲＮＡミニキット、Ｑｉａｇｅｎ）を増殖させた。ＧＡＰＤＨは、ハウスキーピング遺伝子として使用し、プライマー：フォワード（５’−ＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＣＡＣ−３’；配列番号１３）及びリバース（５’−ＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧ−３’；配列番号１４）を用いた同じＰＣＲ反応で増殖させた。ＳＢ１１及びＥＧＦＰ（ＤＮＡプラスミドＳＢ１１−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰから発現）を安定的に発現する遺伝子改変Ｊｕｒｋａｔ細胞からの線状化ｐＣＭＶ−ＳＢ１１プラスミドＤＮＡ（１ｎｇ）及びゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）（Ｍａｉｔｉら、２０１３）は、陽性対照として用いた。模擬電気穿孔（無ＤＮＡ）Ｔ細胞及びＯＫＴ３−ａＡＰＣ増殖Ｔ細胞は、陰性対照として用いた。

望ましくない自律的Ｔ細胞増殖を評価するためのアッセイ。異常なＴ細胞増殖を監視するため、４回のａＡＰＣ媒介刺激サイクル（エレクトロポレーションしてから２８日後）後に採取した２×１０^５個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、２４ウエル組織培養プレートでさらに１８日間３通りで培養した。（ｉ）陽性対照：ａＡＰＣ及びサイトカイン（５０Ｕ／ｍＬＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬＩＬ−２１）の存在。（ｉｉ）試験：ａＡＰＣ及びサイトカインの不在。１８日目の全生存細胞が、（ｉ）ａＡＰＣ及びサイトカインと共に培養したＣＡＲ^＋Ｔ細胞の２×１０^５個の細胞よりも多く、かつ、（ｉｉ）ａＡＰＣ及びサイトカイン無しで培養したＣＡＲ^＋Ｔ細胞の２×１０^４個の細胞よりも少ない場合、遺伝子改変Ｔ細胞は、アッセイをパスした。

Ｇバンド染色体分析。共培養の最後でＣＡＲ^＋Ｔ細胞を採取し、標準手順を用いてギムザ染色によりスライドを染色した。全部で２０個のＧバンド中期を分析した。
実施例４−スリーピングビューティ及び人工抗原提示細胞を用いて、キメラ抗原受容体を安定的に発現する臨床等級ＣＤ１９特異的Ｔ細胞の製造−結果

ａＡＰＣ（クローン＃４）。ａＡＰＣ（クローン＃４）として機能するＫ５６２を用いて、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を選択的に増殖させた。減容手順を用いて、ＳｅｐａｘＩＩ装置により培養ａＡＰＣをＶｕｅＬｉｆｅバッグから採取した。これは、約４０分かかった。平均の処理前容量及びａＡＰＣ計数は、ぞれぞれ、５７５ｍＬ（５００〜７００ｍＬの範囲）及び４．９×１０^８（３．２×１０^８〜７．７×１０^８の範囲）であった。ＳｅｐａｘＩＩで処理後、細胞の平均回収は、１０８％（７５％〜１３６％の範囲）であり、出力容量は、１２５ｍＬ（５０〜２００ｍＬの範囲）であり、平均減容は、７８．３％（６０％〜９１．６％の範囲、図５Ａ及び５Ｂ）であった。自動細胞回収は、マニュアルの減容手順（８２％）と同様であり、持続オペレータ時間で４５分かかり、９１％の減容をもたらした。ＣＤ１９、ＣＤ６４、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、及びＥＧＦＰ（ｍＩＬ１５を発現するためのマーカーとして）をコードする導入されたトランス遺伝子の発現が＞８０％のものについて、フローサイトメトリーによりａＡＰＣを定期的に監視した。ＭＣＢ及びＷＣＢの生成時、及びγ照射ａＡＰＣをＴ細胞培養（各刺激サイクルの開始と印を付けた、図５Ｃ）に加えるごとに、免疫表現型検査を実施した。試験したａＡＰＣ（クローン４）のＭＣＢ及びＷＣＢは、無菌状態、及び、細胞及び細胞上清上のマイコプラズマに対して陰性であった。バイオセーフティ試験では、外来性ウイルス試験、複製可能レトロウイルス試験、及び様々なヒト病原性ウイルスのスクリーニングによるウイルスは検出されなかった。フィンガープリンティングに基づいてａＡＰＣ（クローン＃４）がＫ５６２由来であることが試験により確認された（表５）。
表５：Ｋ５６２ａＡＰＣ（クローン＃４）のＳＴＲフィンガープリンティング

ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の製造。ＰＢＭＣを電気穿孔し、臨床的に意味のある数（Ｈｕｌｓら、２０１３）（図６）に増殖させ、かつ、予め決められた放出基準（表６）を満たすことができることを確立するために、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の大規模な産生について検証研究を実施した。２名の健常ドナーのアフェレーシス生成物を処理して、Ｓｅｐａｘ細胞処理システムを用いて単核球（ＭＮＣ）を単離した。アフェレーシス生成物２０１ｍＬ（ドナー１）及び２０２ｍＬ（ドナー２）を２つのバッチ（約１００ｍＬ／バッチ）で処理し、５０ｍＬの出力生成物を生成した。処理前計数は、アフェレーシス生成物の処理後計数と同様であった。ドナー１及びドナー２からそれぞれ４０．５％及び５１％のＣＤ３^＋Ｔ細胞を含有する、全部で５．３×１０^９個及び７．１×１０^９個の細胞を単離した。その後、細胞を、後々の使用のためにＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結バッグ（１０ｍＬ）及び参照凍結バイアル（１ｍＬ）中に等分（４×１０^７個の細胞／ｍＬ）で凍結保存した。３つの別々の検証実験を行い、表６にまとめた。検証ラン１及び２（Ｖ１、Ｖ２）では、ドナー１からの細胞を、検証３（Ｖ３）では、ドナー２からの細胞を用いた。各ランでは、新たに解凍したＰＢＭＣを電気穿孔し、別々の培養手順でｅｘｖｉｖｏにて数値的に増殖させた（表７）。培養０日目に、３×１０^８（Ｖ１）及び８×１０^８（Ｖ２、Ｖ３）個の細胞を解凍し（生存率、８８．９％〜９７．６％）、エレクトロポレーション前に２時間放置した。２〜３×１０^８個の細胞（Ｖ１＝２×１０^８；Ｖ２及びＶ３＝３×１０^８）を、キュベット当たり２×１０^７個の細胞で、ＣＤ１９ＲＣＤ２８ｍｚ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯトランスポゾン及びｐＣＭＶ−ＳＢ１１トランスポゼースＤＮＡプラスミドを電気穿孔し、翌日（培養１日目）に、ＣＡＲ発現に基づいてａＡＰＣクローン＃４と共培養した。３つの検証ランのエレクトロポレーション効率は、ＣＡＲの発現（３３．７％、２５．５％及び４７．１％）により計測された培養１日目に評価した。共培養の最後（培養２８日目）のＣＡＲ発現は、９２％、９９．２％、及び９６．７％であり、培養には、平均９５％±５．３％のＣＤ３^＋Ｔ細胞とごく少量の汚染ＣＤ１９^＋細胞（平均＝０．７％±０．１５％）及びＣＤ３２^＋ａＡＰＣ（平均＝０．６％±０．６％、図７Ａ、表６）とが含まれていた。発明者らは、期待した７３ｋＤａキメラζ鎖を表すＣＤ３−ζ鎖特異的ｍＡｂを用いて、電気穿孔し／増殖させたＴ細胞の全細胞溶解物をウエスタンブロット法によりＣＡＲ発現をさらに確認した（Ｓｉｎｇｈら、２００８）（図７Ｂ）。ａＡＰＣ上のＴ細胞増殖の動態を検査時、発明者らは、培養の第２週目の最後（刺激サイクル２の終わり）に、Ｔ細胞増殖が加速度的に上昇したことが観察され、これは、刺激の第１週目における倍数増殖と比較して、全（ｐ＝０．０１）Ｔ細胞及びＣＤ３^＋（ｐ＝０．０１）Ｔ細胞の倍数増殖が増したことと一致する。全（ｐ＝０．０１、ｐ＜０．００１）Ｔ細胞、ＣＤ３^＋（ｐ＝０．０３、ｐ＜０．００１）Ｔ細胞、ＣＡＲ^＋（ｐ＝０．０２、ｐ＜０．００１）Ｔ細胞の第３週目及び第４週目の最後の週間倍数増殖は、１週目のものよりもそれぞれ一貫して高かった（図１３）。
表６：電気穿孔し増殖させたＴ細胞を放出するための合否判定基準

刺激してから１週間後のＣＤ３^＋及びＣＡＲ^＋Ｔ細胞については同様の週間倍数増殖したことを発明者らは観察した。γ照射ａＡＰＣ上の共培養の４週間後に、平均で、ＣＤ３^＋Ｔ細胞は５４５倍に数的増殖し、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は１，１１１倍に数的増殖した。ｅｘｖｉｖｏ増殖（培養２８日目）により、平均で２．８６×１０^１０個のＣＤ３^＋Ｔ細胞が得られ、そのほとんどは、ＣＡＲ^＋（２．６５×１０^１０個）であった。３つの検証ランの全（ｐ＝０．１８）Ｔ細胞、ＣＤ３^＋（ｐ＝０．１７）Ｔ細胞、及びＣＡＲ^＋（ｐ＝０．２）Ｔ細胞の増殖動態は同様であった（図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ）。ａＡＰＣの反復追加により、ＣＤ１９特異的Ｔ細胞が選択的に増殖されたことをこれらのデータは支持している。

電気穿孔し増殖させたＣＡＲ^＋Ｔ細胞の免疫表現型。３つの検証ランの２つにより、ＣＤ４^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（平均１６％±２４％）（図７Ｃ）と比較してＣＤ８^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（平均７６％±２２％）が優先的に増殖され、これは、ＩＬ−２１の含有により予測された（Ｓｉｎｇｈら、２０１１）。共培養の経過中に改変されたＣＡＲ^＋Ｔ細胞の平均ＣＤ４／ＣＤ８比率は、ａＡＰＣ（培養１日目、比率＝３．３）上の共培養の開始時にはＣＤ４^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が優勢であり、培養１４日目（比率＝０．９）にＣＤ４^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の量は等しくなり、その後、比率は減少した（培養２１日目、比率＝０．４；培養２８日目、比率＝０．３）。全てのＣＤ４／ＣＤ８比率は、同様のトレンドに沿い、経時的に減少した（表７）。増殖期間の最後（培養２８日目）のＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、活性化され（ＣＤ６９発現、平均４３．６％；ＨＬＡ−ＤＲ発現、平均６１．２％）、細胞溶解することができ（グランザイムＢ発現、平均９２．３％）、メモリー／ナイーブＴ細胞のマーカーを発現した（ＣＤ６２Ｌ発現、平均４５．６％；ＣＤ２８発現、平均６６．４％；ＣＤ２７発現、平均７７．５％、ＣＤ４５ＲＡ発現、平均９９．７％）。発明者らは、枯渇／老化の細胞表面マーカーを検出することができなかった（ＰＤ−１発現、平均２．７％；ＣＤ５７発現、平均３．３％）（図７Ｄ）。これらのデータは、ａＡＰＣがＣＡＲ^＋Ｔ細胞の不均一集団の増殖を支持していることと一致する。

ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の再指向特異性。３つ全ての検証ランから生成したＴ細胞は、ＣＤ１９^＋腫瘍標的を特異的に溶解することができた。平均で、５７％±４％（平均±標準偏差、６１．２％〜５３．８％の範囲）のＤａｕｄｉβ_２ｍ、及び４９％±７％（平均±標準偏差、４１％〜５４％の範囲）のＮＡＬＭ−６が、エフェクター対標的の比率２０：１で溶解した。ＣＤ１９特異的殺傷は、ＣＡＲ^ｎｅｇ（模擬電気穿孔）対照による１．４±１（平均±標準偏差）倍のバックグラウンドＣＤ１９特異的溶解において、エフェクター／標的比率が２０：１のＣＤ１９^ｎｅｇ親ＥＬ−４細胞と比較して、ＣＤ１９^＋ＥＬ−４の殺傷は平均して６．２±２．６（平均±標準偏差）倍（４．２〜９．２倍の範囲）高いことが実証された（図８Ｄ、図１４）。これは、電気穿孔し増殖させたＴ細胞中のＣＡＲがＣＤ１９に殺傷を再指向したことを意味する。

遺伝子改変され増殖させたＴ細胞による望ましくない自律的な増殖の欠如。発明者らは、Ｋ５６２ａＡＰＣ及びサイトカイン（ＩＬ−２及びＩＬ−２１）の存在下／不在下でのＣＡＲ^＋Ｔ細胞の増殖を評価し、ＳＢ転位に起因する強力な遺伝毒性による異常なＴ細胞増殖を除外した。培養１８日目の最後に、サイトカイン及びａＡＰＣを受けていない遺伝子改変Ｔ細胞では、＜２×１０^４個の細胞（平均２，８００、０．０〜５．６×１０^３の範囲）、サイトカイン及びａＡＰＣを受けた対照群では、平均７．６×１０^７個の細胞（４．１２×１０^７〜１２．８×１０^７の範囲）に数値的に増殖したことを発明者らは観察した（表８）。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が、増殖因子及び抗原刺激の離脱時に増殖を維持できないことが、これらのデータにより示される。
表８：遺伝子改変Ｔ細胞による自律的な細胞増殖の欠如。

ａＴ細胞を播種した場合の培養日数
ｂ実験の開始時に培養で播種した全Ｔ細胞数
ｃサイトカイン及びａＡＰＣ不在下で計数した全Ｔ細胞数
ｄサイトカイン及びａＡＰＣ（陽性対照）の存在下で計数した全Ｔ細胞（推定）数
ｅ倍数変化率＝［（ｃ／ｂ）÷（ｄ／ｂ）］＊１００
表９：電気穿孔し増殖させたＴ細胞の処理中試験

ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のテロメア長。テロメア長は、細胞分化及び老化の進行の重要な測度である。従って、テロメア長でのＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＳＢ転位及びｅｘｖｉｖｏ数的増殖を評価するため、発明者らは、Ｆｌｏｗ−ＦＩＳＨアッセイを用いて、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（培養２８日目）のテロメア長を、これらの適合非操作対照（エレクトロポレーション前）のテロメア長と比較した。Ｖ１及びＶ２ではＣＤ８^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、Ｖ３ではＣＤ４^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を主に生成したため、発明者らは、Ｖ１及びＶ２のＣＤ８^＋Ｔ細胞並びにＶ３のＣＤ４^＋Ｔ細胞のテロメア長を、ＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋Ｔ細胞のテロメア長と増殖前から比較した（図９Ａ）。ｅｘｖｉｖｏ数的増殖（培養２８日目、８．９３％±１．３３％）後のＴ細胞の平均テロメア長は、非操作対照Ｔ細胞（０日目、７．７７％±１．２１％）のものと同様であった。これらの結果は、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション及び増殖がテロメア長の浸食をもたらさないことを示すものである。

ＣＡＲトランス遺伝子のコピー数。組み込みＣＤ１９ＲＣＤ２８トランス遺伝子のコピー数は、ＣＤ１９ＲＣＤ２８^＋Ｊｕｒｋａｔ細胞クローン＃１２を参照として、内因性ＲＮａｓｅＰを正規化群として用いて判断した（Ｍａｉｔｉら、２０１３）。検証ランで生成したＴ細胞当たりの平均トランス遺伝子コピーは、０．９６±０．０９（０．７５〜１．０７の範囲、図９Ｂ）であった。ＳＢ転位が、Ｔ細胞ゲノム当たりおおよそ１つの組み込みコピーのＣＡＲがもたらされたことがこれらのデータにより示される。

ＴＣＲＶβ使用。Ｔ細胞のエレクトロポレーション及び増殖は、選択的な増殖を示すことができ、そのため遺伝毒性イベントの指標になり得るＴ細胞のオリゴクローナルまたはクローナル集団の発生をもたらし得る。従って、発明者らは、レパートリーの多様性を評価するための手段として、フローサイトメトリーによりＴＣＲＶβ使用を評価した。試験した２４個全てのＴＣＲＶβファミリーは、ａＡＰＣ上で共培養２８日後にＴ細胞中に保存し、エレクトロポレーション前のレパートリーと同様であった。さらに、ＴＣＲＶβファミリーは、長期培養時（培養３５日目、図９Ｃ）に保存した。培養されたＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＴＣＲレパートリーの広範な多様性のメンテナンスが、ＴＣＲ配列の使用における不均衡をもたらさないことをこれらのデータは示している。

ＣＡＲ^＋Ｔ細胞中のＳＢ１１トランスポゼースの欠如。ＳＢ１１トランスポゼースの持続発現は、組み込みＣＡＲトランス遺伝子の再移動をもたらし得る。従って、発明者らは、ゲノムＰＣＲを行い、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞中のＳＢ１１をコードするＤＮＡプラスミドの非正統的な相同的組み換えを排除した。アッセイの範囲内で、発明者らは、２８日間培養し、ＳＢ１１特異的プライマーを用いて増殖させたＣＡＲ^＋Ｔ細胞からのＤＮＡを含有するＰＣＲ反応においてバンド（約１ｋｂ）を検出することができなかった（図９Ｄ）。電気穿孔し増殖させたＴ細胞中でＳＢ１１トランスポゼースの組み込みが欠如していたことが、これらのデータにより示される。

ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の核型。染色体構造の完全性を評価して、ＳＢ転位と関連する包括的な遺伝毒性を排除した。３つ全ての検証ランからのＣＡＲ^＋Ｔ細胞（エレクトロポレーションしてから２８日後に採取）のＧ−バンディングにより、分析した全ての分裂中期展開において正常な（雄の）核型が示された（図９Ｅ、図１５）。
実施例５−キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作された養子Ｔ細胞を用いた、がん及び感染に発現した古代レトロウイルスの標的化−方法

免疫組織化学。Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｍａｘ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た組織マイクロアレイ（＃ＭＥ１００４ａ、ＭＥ２０８２ｂ、ＦＤＡ９９８ｔ）をＤｉＨ_２Ｏで水和させた。ＥＤＴＡを含まないｐＨ６のクエン酸緩衝液を用いて抗原回復を行った。スライドを、３％過酸化水素（ＢｉｏｃａｒｅＭｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）、アビジン（ＢｉｏｃａｒｅＭｅｄｉｃａｌ）、ビオチン（ＢｉｏｃａｒｅＭｅｄｉｃａｌ）、及び多価全血清（ＢｉｏｃａｒｅＭｅｄｉｃａｌ）でブロックした。各々のスライドを、ＨＥＲＶ−ＫｍＡｂ（０．６ｍｇ／ｍｌ）で１：２０希釈にして３０分間インキュベートした後、抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏｃａｒｅＭｅｄｉｃａｌ）及びストレプトアビジンＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）でビオチン化し、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン対比染色（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で視覚化した。アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ）を持つスライド上でも同様の染色手順を行った。

プラスミド。ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープタンパク質に対するｓｃＦｖ配列（ｍＡｂクローン６Ｈ５由来）をコドン最適化（ＣｏＯｐ）し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ヒト伸長因子−１α（ｈＥＦ−１α）プロモーターの制御下でＳＢトランスポゾンにクローニングし、_ＣｏＯｐ６Ｈ５ＣＤ２８／ｐＳＢＳＯを形成するＳＢ逆方向反復によりフランクした。

ＨＥＲＶ−Ｋ抗原は、両方向性プロモーターｈＥＦ−１α及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を含有するＳＢプラスミドから発現した。ウイルス膜貫通領域を含むコドン最適化全長抗原配列を、ｈＥＦ−１αプロモーターの制御下でクローニングし、ネオマイシン遺伝子を、両方向性ベクターのＣＭＶプロモーターの制御下で転写した。トランスポゼース（ＳＢ１１）は、プラスミドｐＣＭＶ−ＳＢ１１からｃｉｓで発現した（Ｄａｖｉｅｓら、２０１０）。

Ｔ細胞のＳＢプラスミドのｉｎｖｉｖｏイメージングを生成するため、コドン最適化蛍ルシフェラーゼをｍｙｃｔａｇに融合し、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現した。ｅＥＦ１αプロモーターの制御下でｍＫａｔｅウミシイタケルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターを、ｉｎｖｉｖｏでの黒色腫瘍細胞のイメージングベクターとして用いた。

細胞株及びこれらの増殖。Ａ３７５−ｍｅｌ及びＡ８８８−ｍｅｌは、テキサス州立大学ＭＤアンダーソンがんセンター（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）のＬａｚｌｏＲａｄｖａｎｙｉ博士からの親切な贈り物だった。Ａ６２４−ｍｅｌ及びＥＬ４親は、米国菌培養収集所（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。Ａ３７５−ＳＭ（高転移性黒色腫細胞株）は、テキサス州立大学ＭＤアンダーソンがんセンター（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）のＣＣＧＳコア施設から受け取った。全ての細胞株は、１０％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５％グルタマックス（ＧｉｂｃｏＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含むＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中で培養した。全ての細胞株は、形態学、細胞フィンガープリンティング、及び／またはフローサイトメトリーにより検証した。全ての細胞株は、マイコプラズマに対して試験し、研究用細胞バンクに保存した。

Ｔ細胞を発現するＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲの生成及び増殖。健康なドナーからのＰＢＭＣを、フィコール・パック密度勾配遠心分離（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により単離し、Ａｍａｘａエレクトロポレーションシステムを用いてＨＥＲＶ−ＫＳＢトランスポゾン及びＳＢ１１トランスポゼースを電気穿孔した。簡単に言えば、２×１０^７個のＰＢＭＣ細胞を洗浄し、１０％ウシ胎仔血清血清（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１％グルタマックス（ＧｉｂｃｏＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した完全ＲＰＭＩ中で２時間インキュベートした。その後、これらの細胞をＨＥＲＶ−ＫＣＡＲトランスポゾン（６Ｈ５ＣＤ２８／ｐＳＢＳＯ、１５μｇ）及びＳＢトランスポゼース（ｐＣＭＶ−ＳＢ１１、５μｇ）と共に、１００μｌのＡｍａｘａヌクレオフェクター溶液（ヒトＴ細胞キット）中で再懸濁させ、単一のキュベットに移し、Ａｍａｘａエレクトロポレーター（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）のＵ−１４プログラムを用いて電気穿孔した。電気穿孔したＴ細胞を、完全無フェノールＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で４時間３７℃でインキュベートし、その後、半培地交換を行った。

Ｋ５６２は、内因性ＨＥＲＶ−Ｋ抗原を発現するため、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を増殖させるａＡＰＣとして機能する。１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩで培養された電気穿孔したＴ細胞に、γ照射（１００Ｇｙ）Ｋ５６２−ａＡＰＣをＴ細胞：ａＡＰＣが１：２の比率で補充した。Ｔ細胞刺激の毎週最後に、照射ａＡＰＣを同じ比率で追加した。可溶性ＩＬ−２１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ）サイトカインを、それぞれ３０ｎｇ／ｍｌ及び５０Ｕ／ｍｌの濃度で補充し、エレクトロポレーション後の培養で１日おきにＲＰＭＩ培地を完成させた。ＯＫＴ３をロードしたＫ５６２細胞の存在下で増殖させた模擬トランスフェクトした無ＤＮＡ対照Ｔ細胞は、陰性対照として機能した。_ＣｏＯｐＣＤ１９ＣＡＲＣＤ２８／ｐＳＢＳＯ及びＳＢ１１トランスポゼースを電気穿孔したＣＤ１９ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と同様に同じ培養条件下で増殖させ、非特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞対照として機能した。

毎週、Ｔ細胞培養をＣＤ３^ｎｅｇＣＤ５６^＋細胞の存在について監視し、集団が全集団の１０％を超えると枯渇した。この枯渇は、通常、ａＡＰＣとの初期共培養の１０〜１４日目に起こった。枯渇は、製造者の指示に従って陽性選択「ｐｏｓｓｅｌ」を用いて、Ａｕｔｏｍａｘ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）上のＣＤ５６ビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いて行った。

セロメーター自動細胞計数器（ＡｕｔｏＴ４ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｅｒ、ＮｅｘｃｅｌｏｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＭＡ）を用いて、トリパンブルー色素排除に基づいてＴ細胞生存率を評価した。エレクトロポレーション及び共培養期間中に、プログラム「ＰＢＭＣ＿ｈｕｍａｎ＿ｆｒｏｚｅｎ」及び「活性化Ｔ細胞」を用いて生存率を分析した。個々のドナーに対して共培養７日目、１４日目、２８日目、３２日目の最後に、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋及びＣＡＲ^＋細胞の全ての倍数増殖（１日目と比較）を算出し、３人のドナーの平均を、スチューデントｔ検定を用いてＣＤ１９ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と無ＤＮＡ対照細胞との間で比較した。

フローサイトメトリー。全ての試薬は、他に記載がない限り、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ）から得た。１００万個の細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、シアニン染料（ＰｅｒＣＰＣｙ５．５）に共役したペリジニンクロロフィルタンパク質、またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）と共役した抗体で染色した。使用した抗体には、抗ＣＤ３ＦＩＴＣ（５μｌ）、抗ＣＤ３ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（２．５μｌ）、抗ＣＤ３ＰＥ（２μｌ）、抗ＣＤ４ＡＰＣ（２．５μｌ）、抗ＣＤ８ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（４μｌ）、抗ＣＤ５６ＡＰＣ（２．５μｌ）、アネキシンＶ（５μｌ）、抗ＣＤ３２ＦＩＴＣ（５μｌ）、抗ＣＤ４５ＲＡＦＩＴＣ（５μｌ）、抗ＣＤ４５ＲＯＡＰＣ（２．５μｌ）、抗グランザイムＢＦＩＴＣ（５μｌ）、抗ＣＤ６２ＬＡＰＣ（２．５μｌ）、抗ＩＦＮ−γＡＰＣ（２μｌ）、抗ＣＤ２７ＰＥ（２μｌ）、抗αβＴＣＲＦＩＴＣ（５μｌ）、抗γδＴＣＲＰＥ（２μｌ）、及び抗ＣＣＲ７ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（２．５μｌ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が含まれる。ヤギ抗ヒトＦｃγのＦＩＴＣ共役（３μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰＥ共役（２．５μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ｆ（ａｂ’）_２断片を用いて、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲの細胞表面発現を検出した。非特異的抗体結合のブロッキングは、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ及び０．１％アジ化ナトリウム）を用いて達成した。データは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔバージョン３．３（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で獲得した。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）の分析及び算出は、ＦｌｏｗＪｏバージョン７．５．５を用いて実施した。

ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析デジタル遺伝子発現システム。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と無ＤＮＡ対照Ｔ細胞との間の遺伝子発現の差を、ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システム（モデル番号：ＮＣＴ−ＳＹＳＴ−１２０、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｅｉｓｓら、２００８）を用いて評価した。簡単に言えば、１０^４個のＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞または無ＤＮＡＴ細胞をＲＮｅａｓｙ溶解緩衝液（ＲＬＴ；５μｌ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中に溶解し、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイキットを用いて設計させたレポーターコードセット及びキャプチャコードセットカスタムでｍＲＮＡを１２時間６５℃でハイブリダイズした。ｎＣｏｕｎｔｅｒｐｒｅｐｓｔａｔｉｏｎをポストハイブリダイゼーションプロセスに用いた。Ｎａｎｏｍｉｒソフトウェアを用いて、ｍＲＮＡレベルを内部対照で正規化した。Ｒプログラム、ツリービュー、及びクラスタービューを用いて、統計分析でデータを出力した。正規化した結果は、相対ｍＲＮＡレベルとして表した。ＩｎｇｅｎｕｉｔｙＰａｔｈｗａｙ解析（ＩＰＡ）（ＩｎｇｅｎｕｉｔｙＳｙｓｔｅｍｓ、ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）を統計的に有意な遺伝子に行い、文献ソース由来のデータベースに基づいてこれらの生物相互作用を理解した。

組み込み分析。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞からのゲノムＤＮＡをＱＩＡａｍｐＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、リアルタイムＰＣＲを前述したように行った（Ｍａｉｔｉら、２０１３）。前述したＣＡＲコピーの単一組み込みを持つＪｕｒｋａｔ細胞（クローン＃１４）からのゲノムＤＮＡを陽性対照として用いた（Ｍａｉｔｉら、２０１３）。実験については、１０μｌのＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）、ＩｇＧ４Ｆｃ［フォワード（５’−ＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴＧ−３’；配列番号１５）及びリバース（５’−ＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＡ−３’；配列番号１６）プライマー及びカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）標識プローブ（５’−ＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣ−３’；配列番号１７）］に特異的な１μｌ（２５０ｎＭの１×プローブと９００ｎＭの１×プライマー）の２０×ＦＡＭ標識ＣＡＲ特異的ＴａｑＭａｎプローブプライマーセット、及び１μｌ（９００ｎＭの１×プライマー及び２５０ｎＭの１×プローブ）の２０×ＶＩＣ標識ＴａｑＭａｎＲＮａｓｅＰプローブプライマーセット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、全ての反応容量が２０μｌで混合した１００ｎｇのゲノムＤＮＡで３通りで行った。プライマーハイブリダイゼーションは、ＣＡＲのＩｇＧＦｃ４部分で起こった。増幅サイクルは、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、及び、９５℃で１５秒と６０℃で１分の４０サイクルを含んでいた。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で検出を行った。２倍体細胞当たり２コピーで存在する常染色体ＲＮａｓｅＰ遺伝子を、正規化のための内因性参照として用いた（Ｊｉｎら、２０１１）。ΔΔＣ_Ｔ方法（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）を用いて、ＲＮａｓｅＰ及びＪｕｒｋａｔクローンを正規化対照として参照しながら組み込み数を算出した。

クロム遊離アッセイ（ＣＲＡ）。ＣＲＡを前述したように行った（Ｍａｉｔｉら、２０１３；Ｊｉｎら、２０１１）。簡単に言えば、ＨＥＲＶ−Ｋ^＋ｖｅ標的を^５１Ｃｒで２時間処理し、３５日目のＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞または無ＤＮＡ対照Ｔ細胞でインキュベートし、^５１Ｃｒ放出の百分率を、以下の式を用いて算出した：
^５１Ｃｒ放出％＝（実験的放出−バックグラウンド放出）／（最大放出−バックグラウンド放出）×１００

微速度バイオイメージング。（Ａ）腫瘍細胞上での抗原とのＣＡＲ結合を視覚化するため、ＢｉｏＳｔａｔｉｏｎＩＭ細胞−Ｓ１／細胞−Ｓ１−Ｐシステム（Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いて微速度イメージングを行った。Ｋ５６２親細胞を抗ＨＥＲＶ−ＫＡＰＣ抗体（１μｇ）で染色し、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、ヤギ抗ヒトＦｃγ抗体のＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）２断片（５μｌ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＣＡＲ表面発現用に染色した。Ｔ細胞及び標的細胞を５：１の比率で混合し、Ｔ−３５ｍｍガラス底プレート（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈａｍｐｔｏｎ、ＮＨ）上の完全ＲＰＭＩ培養培地に載置した。細胞を直ちに２分ごとに３７℃で８時間まで造影した。各画像を、２０×対物の１６００×１２００ピクセルで、緑色ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を観察するために位相差の蛍光チャネル２を、赤色Ｋ５６２細胞を観察するために位相差の蛍光チャネル３を用いて、それぞれ、１／１２５秒及び１／５秒の露光時間で記録した。抗原とのＣＡＲ結合は、ＡＰＣ標識抗原が緑色標識ＣＡＲと重畳した際に見られた。

（Ｂ）ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が腫瘍細胞を殺傷するのにかかる時間を視覚化しかつ定量化するため、腫瘍細胞を、１ｎｇ／ｍｇＳｙｔｏｘ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する完全ＲＰＭＩを持つＴ−３５ｍｍガラス底プレートにおいてＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞で被覆した。腫瘍細胞死は、腫瘍細胞壁を穿刺し、ＢｉｏｓｔａｔｉｏｎＩＭ細胞−Ｓ１−Ｐシステム（Ｎｉｋｏｎ）を用いて細胞が緑色に変色した際の時間として記録した。各腫瘍細胞の緑色蛍光強度は、１５時間にわたり生細胞イメージングソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を用いて記録した。

細胞内ＩＦＮ−γ放出アッセイ。２００μｌの完全ＲＰＭＩ培養培地を持つ丸底９６ウエルプレートで、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、腫瘍細胞と１：１０の比率で共培養した。タンパク質輸送阻害剤（ブレフェルジンＡを含有するＢＤＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）を全てのウエルに追加し、細胞内のＩＦＮ−γをトラップした。共培養を３７℃で４時間インキュベートした後、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ発現のために４℃で２０分間染色した。次いで、細胞を洗浄し、固定し、１００μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（カタログ番号５５５０２８）で４℃で２０分間透過処理した。透過処理した細胞を、サイトカインについて、抗ＩＦＮ−γＡＰＣ共役抗体で染色細胞を洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにより分析した。ＰＭＡ（ホルボール１２ミリスチン酸１３酢酸エステル）−及びイオノマイシン−（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）処理されたＴ細胞を、本アッセイの陽性対照として用いた。同様のアッセイを無ＤＮＡ対照Ｔ細胞で行った。

ＨＥＲＶ−Ｋ^＋ｖｅＥＬ４細胞株の成長。２００万個のＥＬ４細胞を、ＨＥＲＶ−Ｋ抗原発現ＳＢトランスポゾン及びＳＢ１１トランスポゼース（２μｇの全ＤＮＡ）を含むＡＭＡＸＡマウスＴ細胞ヌクレオフェクター溶液（Ａｍａｘａ、ＵＳＡ）中で懸濁させ、最終容量を１００ｍｌにした。この懸濁液を単一のキュベットに移し、ＡｍｅｘａエレクトロポレーターのＣ−０９プログラムを用いて電気穿孔した。細胞を、１０％ＦＢＳで補充したキットで供給したエレクトロポレーション培地中で３７℃にて４時間インキュベートした（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｉｅｒｃｅ）。その後、細胞をＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｉｅｒｃｅ）、及び５％グルタマックス（ＧｉｂｃｏＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移した。これらの細胞を０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で増殖させ、ＨＥＲＶ−Ｋ抗体を用いてネオマイシン−耐性ＨＥＲＶＫ^＋ｖｅＥＬ４細胞を選別し、増殖させて、細胞の純粋な集団を得た。

Ａ８８８−ｍｅｌ細胞におけるｓｈＲＮＡ−媒介ＨＥＲＶ−Ｋノックダウン。Ａ８８８−ｍｅｌ細胞を、６ウエルプレートにおいて９０％コンフルエンスに増殖させた。その後、培地を、１００μｌのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ｓｈＲＮＡまたはスクランブルｓｈＲＮＡレンチウイルスのいずれかとポリブレン（５μｇ／ｍｌ）とを用いて交換し、３７℃で４時間形質導入し、通常ＲＰＭＩ培地に交換した。細胞を、ＧＦＰ発現及び増殖に基づいて選別した。スクランブルｓｈＲＮＡ形質導入Ａ８８８−ｍｅｌ細胞を対照として用いた。細胞株溶解物の免疫ブロットアッセイを行い、ＨＥＲＶ−Ｋノックダウンの程度について判断した。６Ｈ５ＨＥＲＶ−Ｋ抗体を用いて、ＨＥＲＶ−ＫｓｈＲＮＡまたはスクランブルｓｈＲＮＡを持つＡ８８８−ｍｅｌ細胞または親細胞上でのＨＥＲＶ−Ｋ抗原発現を検出した。１，０００万個の細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）に溶解した。ＢＣＡアッセイを行い、タンパク質濃度（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｉｅｒｃｅ）を検出した。４％〜２０％勾配ゲル（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、１０μｇのタンパク質をＳＤＳローディング緩衝液中で煮沸した。その後、タンパク質を、ニトロセルロース膜に移し、ＰＢＳＴ中の５％ミルクでブロックし、６Ｈ５ＨＥＲＶ−Ｋ抗体（ｍｇ／ｍｌ）でインキュベートした。ヤギ抗マウスＦｃ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により結合を検出し、ＥＣＬＷｅｓｔｆｅｍｔｏ（商標）ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｉｅｒｃｅ）を用いて成長させた。ＶｅｒｓａｄｏｃＱｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ（商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてブロットを造影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてブロットを定量化した。

Ｉｎｖｉｖｏ分析。転移性黒色腫モデル：５週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ_ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ_{ｔｍ１ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢａｒＨａｒｂｏｒ、ＭＥ）に、１０^６個のＡ３７５−ＳＭ細胞を０日目に静脈内注射した。Ａ３７５−ＳＭ細胞にｍＫａｔｅ−ｒＲＬｕｃを予め安定して形質導入し、細胞を均一集団に選別した。処置コホート（ｎ＝７）のマウスには、７日目、１４日目、及び２１日目の始めに、２×１０^６個のＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ＦｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞を受け始めた。ＩＬ−２（６００Ｕ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を治療期間中に週３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍を持つマウス（ｎ＝６）の１つのコホートは治療を受けなかったが、腫瘍のないマウス（ｎ＝３）の対照群は、処置群と同様に同様の数のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を受けた。

フラックス定量化：生物発光イメージング（ＢＬＩ）を毎週行い、ｉｎｖｉｖｏの腫瘍及びＴ細胞活性を造影した。マウスに麻酔をかけ、前述したように、ＸｅｎｏＩＶＩＳ１００シリーズシステム（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＢＬＩの前後方向位置に置いた（Ｓｉｎｇｈら、２００７）。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ｆｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞活性を造影するため、１５０μｌ（２００μｇ／マウス）のＤ−ルシフェリンカリウム塩（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。注射１０分後に、放出された光子を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ２．５０．１（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）プログラムを用いて定量化した。腫瘍細胞活性を造影するため、１００μｌのＥｎｄｕｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ、ＷＡ）を腹腔内注射した。注射２０分後に、腫瘍活性をｆｆＬｕｃと同様に定量化した。非対合スチューデントｔ検定を行い、フラックスの統計的有意性を確立した。

統計分析。種々のグレード及びステージの黒色腫と正常組織との間の抗原発現における統計的差異を分析するため、スチューデントｔ検定及びＡＮＯＶＡを用いた。対照対ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞増殖の差異を分析するため、表現型分析、及び機能的アッセイ、スチューデントｔ検定、平均、標準偏差、及び９５％信頼区間（ＣＩ）を算出した。ｉｎｖｉｖｏの転移性黒色腫モデルでは、スチューデントｔ検定を用いて、腫瘍と処置群との間のフラックスデータの有意性を分析した。全ての統計的検定は、両側であり、グラフパッドプリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて行った。０．０５未満の全てのＰ値は、統計的に有意であると見なした。
実施例６−キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作された養子Ｔ細胞を用いた、がん及び感染を発現した古代レトロウイルスの標的化−結果

黒色腫患者試料におけるＨＥＲＶ−Ｋの発現。ｉｎｖｉｖｏでの黒色腫浸潤及び転移中のＨＥＲＶ−Ｋの生理的関連性を明らかにするため、発明者らは、種々のステージの黒色腫を持つ患者から得た生検中の腫瘍抗原ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープタンパク質の発現を評価しようとした。２６８人の患者からの悪性腫瘍組織と、４０人の患者からの良性皮膚及び乳房組織をＩＨＣを用いて分析した。腫瘍組織染色を、ＨＥＲＶ−Ｋに対して陽性の腫瘍細胞の百分率に基づいて等級分けし、染色強度及びこれらの産物を算出して、Ｈ指数を得た。腫瘍組織は、多様なレベルの染色強度を示し、同じ組織上でのアイソタイプ対照染色と比較した際に、０、１、２、または３（図１６Ａ）と採点した。抗原は、実線矢印で示したように細胞表面に沿って断続的な形態かあるいは点線矢印で示したように拡散した細胞質染色のいずれかで細胞上で発現した（図１６Ｂ）。これは、ウイルスタンパク質（ＲＥＦ）を排除する目的で細胞表面上に抗原が循環し集積していることを示唆するものである。腫瘍細胞は、良性腫瘍と比較して、Ｈ指数が有意に高いＨＥＲＶ−Ｋ抗原を発現した（図１６Ｃ）。悪性腫瘍と転移性腫瘍との間でＨ指数に差異はないが、ステージＩＩＩ及びＩＶの腫瘍と比較して、ステージＩ及びＩＩの腫瘍には有意差が見られる（図１６Ｄ及び１６Ｅ）。正常細胞ではなく腫瘍細胞でのＨＥＲＶ−Ｋ発現の特異性をさらに示すために、３名の健常ドナーから得た３３種類の正常臓器からの組織を分析した。正常な臓器組織のいずれにおいてもＨＥＲＶ−Ｋの有意な発現は観察されなかった（図２２）。これらの知見は、腫瘍細胞で特異的に上方調節されるＨＥＲＶ−Ｋが、免疫療法において固有の標的マーカーとして機能し得ることを示唆するものである。

ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の増殖及び特性化。ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をマウス中で成長させ、６Ｈ５ｍＡｂクローンが、ｉｎｖｉｔｒｏで抗原を検出するのに最も感度が高いことが分かった（Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇら、２００３）。６Ｈ５ｍＡｂクローンのｓｃＦｖ配列を用いて、ＣＡＲを構築した。ｓｃＦｖカセットを、フレキシブルリンカーを介してＩｇＧ４Ｆｃ領域に融合させた後、ＣＤ２８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８及びＣＤ３ｚ細胞内ドメインに融合させた。その後、これをＳＢトランスポゾンベクターにクローニングした（図１７Ａ）。

ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ抗原に特異的なＣＡＲ^＋Ｔ細胞を生成するため、発明者らは、ＳＢ１１トランスポゼースと共にＳＢトランスポゾンを持つ末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）に電気穿孔し、内因性由来ＨＥＲＶ−Ｋ^＋ｖｅＫ５６２ａＡＰＣ上の細胞を増殖させた。ＣＡＲを安定的に発現させるＴ細胞を選択的に増殖させるため、ＨＥＲＶ−Ｋ抗原を内因性発現するこれらのａＡＰＣを、所望のＴ細胞共刺激分子ＣＤ８６、４−１ＢＢＬ、及び膜結合型ＩＬ−１５（強化緑色蛍光タンパク質、ＥＧＦＰと共発現させた）を共発現するように遺伝子改変した（Ｓｉｎｇｈら、２００８）。同じ培養条件下でＯＫＴ３−をロードしたａＡＰＣ上で増殖させた、トランスポゾンを一切電気穿孔していないＰＢＭＣは、陰性無ＤＮＡ対照として機能した。

ＣＡＲの発現は、ＩｇＧ４Ｆｃ領域に特異的なポリクローナルＦｃ抗体を用いて検出した。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、培養を照射ａＡＰＣで補う前に、７日ごとにＦｃ抗体で染色した。フローデータにより、９５％のＴ細胞がその表面上でＣＡＲを発現することが分かり、これは、培養３５日目まで検出することができた（図１７Ｂ）。無ＤＮＡ対照細胞と比較した際に、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の増殖動態に有意差は見られず、全てのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、培養の１４日目にはＣＤ３^＋Ｔ細胞であった（図１７Ｃ及び１７Ｄ）。ＣＡＲ^＋ＣＤ４のパーセントの平均数は増加するが、ＣＡＲ^＋ＣＤ８細胞は、培養期間に沿って減少する（図２３Ａ）。無ＤＮＡ対照細胞と比較したＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のゲノムＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析により、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞ゲノム中のＣＡＲの組み込みは２つ未満であることが示された（図１７Ｄ）。培養されたＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、エフェクターメモリー表現型を有し、これには、グランザイムＢレベルにより観察された溶解能がかなり高いＣＤ３^＋ＣＤ５６^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ２７^ｎｅｇＣＣＲ７^ｎｅｇ細胞が含まれる（図１７Ｆ）。

３名の健常ドナーからのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のｍＲＮＡレベルを測定し、ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析を用いた培養２８日目の無ＤＮＡ対照Ｔ細胞からのｍＲＮＡレベルと比較した。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、有意に高いレベルの化学誘引物質、転写制御因子、及び活性化因子を有した。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞中のパーフォリン１及びグランザイムＨのレベルの増加は、これらの細胞の溶解能がより高いことを示している（図２３Ｂ）。ＩｎｇｅｎｕｉｔｙＰａｔｈｗａｙ解析（ＩＰＡ）（ｐ＜０．０５）により、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞中のこれらの上方調節遺伝子のいくつかがＮＦ−κＢ活性化に関与していることが示唆された。化学誘引物質及びサイトカインは、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１２の調節に関与した（図２３Ｃ）。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が中心エフェクター表現型を有するという前回観測が、これらのデータにより強化される。

ＨＥＲＶ−ＫＣＡＲ^＋Ｔ細胞機能性の特性化。黒色腫細胞株、例えば、Ａ８８８、Ａ３７５、Ａ３７５−ＳＭ、Ａ６２４上の抗原発現は、ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープタンパク質に対するモノクローナル６Ｈ５抗体を用いて分析した（図１８Ａ）。黒色腫細胞上のＨＥＲＶ−Ｋ抗原発現をアイソタイプ対照と比較した（マウスＩｇＧ２ａ）。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の機能性を分析するため、ＨＥＲＶ−Ｋ^＋腫瘍細胞を放射性クロムでパルスし、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の比率を変えながら培養した。無ＤＮＡ対照を陰性対照としてＣＲＡを行った。無ＤＮＡ対照Ｔ細胞と比較した際に、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞では有意に高いレベルのＨＥＲＶ−Ｋ^＋腫瘍細胞溶解が観察された（図１８Ｂ）。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞などの非関連ＣＡＲも用いてＣＲＡを行い、ＣＤ１９抗原を持つＥＬ−４細胞などのＣＤ１９抗原陽性腫瘍細胞と比較した際に、基礎レベルの非特異的殺傷がＨＥＲＶ−Ｋ抗原陽性腫瘍細胞で観察された（図２４Ａ）。

これらのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の機能性をさらに証明するため、４時間ＩＦＮ−γ放出を行った。黒色腫腫瘍標的を、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞または無ＤＮＡ対照Ｔ細胞と１：１０の比率で共培養し、フローサイトメトリーを用いて細胞内サイトカインレベルを分析した。ＰＭＡ−イオノマイシンで培養したＴ細胞は、陽性対照として機能した。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、無ＤＮＡ対照Ｔ細胞（図１８Ｃ）と比較して、高いレベルのＩＦＮ−γ放出を示し、この結果はＣＲＡと相関している。

ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の特異性。ＨＥＲ−Ｋ特異的ＣＡＲのの特異性を示すため、ＨＥＲＶ−Ｋ^ｎｅｇＥＬ−４細胞を、ｈＥＦ−１αプロモーター下でＨＥＲＶ−Ｋ抗原を、ＣＭＶプロモーター下でネオマイシン耐性をコードする両方向性ＳＢベクターを電気穿孔した（図２５Ａ）。その後、ＥＬ−４ＨＥＲＶ−Ｋ^＋ｖｅ細胞を単細胞に選別し、哺乳動物選択マーカーであるネオマイシンの存在下で増殖させ、純粋なＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ発現集団を得た。興味深いことに、これらの細胞は、翻訳後修飾及びタンパク質分解切断により培養１０日間以内にＨＥＲＶ−Ｋ抗原発現が失われた。選別１０日間以内に、これらのＥＬ−４ＨＥＲＶ−Ｋ^＋ｖｅ細胞に４時間ＣＲＡを行った。クロムパルスＥＬ−４ＨＥＲＶ−Ｋ^＋ｖｅ細胞及びＨＥＲＶ−Ｋ^ｎｅｇＥＬ４親細胞を、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の濃度を変えながら共培養し、等級分けした腫瘍特異的溶解が抗原特異的な形で観察された（図１９Ｂ）。

特異性をさらに証明するため、ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ抗原を、ｓｈＲＮＡレンチウイルスを用いてＡ８８８黒色腫細胞でノックダウンした。免疫ブロット分析により、Ａ８８８親及び対照スクランブルｓｈＲＮＡと比較してＨＥＲＶ−Ｋタンパク質レベルの約５０％のノックダウンが示された（図１９Ｃ）。ＨＥＲＶ−Ｋノックダウン細胞、Ａ８８８親、及びＡ８８８スクランブルｓｈＲＮＡを持つＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＣＲＡにより、親及び対照腫瘍細胞と比較して、ＨＥＲＶ−Ｋノックダウンによる殺傷の有意な減少が示された（図１９Ｄ）。

ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が腫瘍標的を殺傷するのにかかる時間および１５時間にわたって殺傷された腫瘍細胞数を視覚化しかつ定量化するために、微速度イメージングを行った。腫瘍細胞及びＴ細胞を、Ｓｙｔｏｘ（登録商標）の存在下で１：５の比率で培養し、細胞膜が損傷すると細胞は緑色に変色する。黒色腫標的Ａ８８８及びＡ３７５細胞がＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞によって殺傷されたため、緑色蛍光のスパイクが５時間あたりで報告され、１５時間にわたり徐々に増加した。ＨＥＲＶＫ−Ｋ^ｎｅｇＨＥＫ２９３親標的では殺傷は観察されなかった。約３０％のＡ８８８細胞と、約３５％のＡ３７５細胞が、１５時間にわたってＣＡＲ^＋Ｔ細胞により殺傷された。抗原特異的ＣＡＲ結合を視覚化するため、Ｋ５６２細胞は、ＨＥＲＶ−Ｋ抗原に対して赤色にポジティブ染色し、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲは、Ｆｃに対して緑色に染色した。ＣＡＲと抗原の重なりは、５時間にわたって見られ、その後、抗体結合抗原及びＣＡＲは、細胞により内在化した（図２６Ａ）。

ｉｎｖｉｖｏでのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の腫瘍殺傷能力。ＰＢＭＣを、ＳＢ１１トランスポゼースによりＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ及びｍｙｃ−ＦＦＬｕｃをコードするＳＢベクターで２回電気穿孔した。ｍｙｃ−ｆｆＬｕｃ遺伝子を持つＳＢベクターは、リンカーを介して連結したネオマイシン耐性遺伝子を有する（図２７Ａ）。これらのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ−ｆｆＬｕｃ^＋Ｔ細胞は、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的−ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と同様の増殖動態を有し、これらの腫瘍殺傷能力及び特異性は同等であった（図２７Ｂ及び２７Ｃ）。

Ａ３７５高転移性（Ａ３７５−ＳＭ）細胞株をＮＳＧマウスの尾静脈を介して注入した転移性黒色腫モデルを成長させた。これらの細胞を肺に生着させ、肝臓に転移させた。腫瘍塊の非侵襲的な減少を視覚化するため、腫瘍細胞は、ｍＫａｔｅ−ｒＲＬｕｃ遺伝子を持つレンチウイルスベクターで形質導入し、ｍＫａｔｅマーカーを用いて選別し、細胞の純粋な集団を得た（図２１Ａ）。腫瘍細胞生着の１週間後、２０００万個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、８日、１５日、及び２２日に、ＩＬ−２（ｉ．ｐ．）を週２回と共に３週間静脈内注入した。生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて、各群のマウスのｒＲＬｕｃ活性を評価した。腫瘍細胞を持つマウス群のみが、ＨＥＲＶ−ＫＣＡＲ^＋Ｔ細胞を受けた腫瘍細胞を持つマウス群と比較して、２５日目まで有意に高いルシフェラーゼ活性を有した（図２１Ａ及び２１Ｂ）。また、腫瘍のみを持つマウスは、腫瘍が肝臓に高転移性であることにより２８日目までに瀕死状態になったが、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を受けたマウス群は、旺盛な食欲と活性を示した。腫瘍細胞上のｍＫａｔｅのＥｘｖｉｖｏイメージングにより、腫瘍のみのマウスは、処置群よりも肝臓にかなり多い腫瘍コロニーを有したことが示された（図２１Ｃ）。腫瘍群が処置群と比較して肝臓に有意に高い転移性コロニーを有したという観察は、病理学検査により証明され、これは、ＨＥＲＶ−ＫＣＡＲ^＋Ｔ細胞の役割が腫瘍増殖及び転移を減少させることを示唆するものである（図２１Ｄ）。

議論。これらの結果は、ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞がウイルス糖タンパク質を正常に標的にすることで、ｉｎｖｉｔｒｏで抗原特異的な形でＨＥＲＶ−Ｋ^＋腫瘍細胞を殺傷し、ｉｎｖｉｖｏで黒色腫瘍の増殖及び転移を減少させることができることを示している。

ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープは、黒色腫転移中に際立って上方調節され、腫瘍細胞上でのみ排他的に存在し、隣接した正常なメラニン細胞上では存在しない。黒色腫では、ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープタンパク質は、腫瘍進行に関係するＭＥＫ−ＥＲＫ及びｐ１６ＩＮＫ４Ａ−ＣＤＫ４経路活性化と関連する（Ｌｉら、２０１０）。ＨＥＲＶ−Ｋ分子擬態により、グルタチオンペルオキシダーゼレベルも減少することで、組織中の活性酸素種が増加し、黒色腫発生をもたらした（Ｋｒｏｎｅら、２００５）。異常なレベルのＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ発現が、黒色腫発症に関与し、形態的及び細胞性改変をもたらし、腫瘍進行をもたらすトリガー因子であると思われる（Ｓｅｒａｆｉｎｏら、２００９）。ＨＥＲＶ−Ｋのウイルス転写の変調により、炎症及び黒色腫細胞の形態的分化が増した（Ｓｃｉａｍａｎｎａら、２００５）。組織マイクロアレイは、黒色腫進行と相関して抗原発現のレベルが高くなったことを表すが、正常なヒト組織は、ＨＥＲＶ−Ｋ発現が基礎レベルまたは不在である。

黒色腫は、その免疫原性特性により、強力なＴ細胞ベース療法を開発するための魅力的なモデル及び標的である。Ｔ細胞ベース療法の主要な限界の１つは、ＴＣＲ上のＨＬＡベース制限であり、これは、抗原認識を制限してしまう（Ｇａｒｒｉｄｏら、１９９７）。腫瘍抗原特異的受容体を発現するための遺伝子改変Ｔ細胞は、この制限を回避し、非ＨＬＡベース抗原認識をもたらす（Ｇｒｏｓｓら、１９８９）。Ｔ細胞改変は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターのいずれかを用いてもたらすことができる。スリーピングビューティベクターは、遺伝子をＴ細胞に導入するための非ウイルスアプローチである。他のウイルス形質導入方法を上回るスリーピングビューティシステムの主要な利点の１つは、レトロウイルス形質導入よりも遺伝的に安全、効率的、及び安価である（Ｍａｉｔｉら、２０１３）。これらのＣＡＲ^＋Ｔ細胞をＩＬ−２及びＩＬ−２１で培養することで、注入目的に十分な細胞が生成される。これは、Ｂ系列悪性腫瘍に対してＣＤ１９ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を用いた予備臨床試験につながる。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、同様の方法で臨床等級のＣＤ１９ＣＡＲ^＋Ｔ細胞に増殖させた。これらのＨＥＲＶ−Ｋ特異的ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、主にエフェクターメモリー表現型であり、腫瘍細胞を標的にし、殺傷するようによく適合されている。

サイトカイン、ホルモン、及び化学物質などの複数の因子が、がんの最中にＨＥＲＶ−Ｋレベルを調節することが知られている（Ｔａｒｕｓｃｉｏ及びＭａｎｔｏｖａｎｉ、２００４）。ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ抗原は、細胞膜と細胞質との間を循環し、ある腫瘍条件で細胞表面から発芽することが知られている。そのため、養子Ｔ細胞療法を用いることは、細胞表面上で一時的な抗原発現のみを必要とする好ましい治療戦略になり得る。

ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープ抗原は、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、リンパ腫、奇形がん、多発性硬化症などの自己免疫疾患、及びＨＩＶなどの感染性疾患と関連することも知られている（Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇら、２００３；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ−Ｇａｌｉｎｄｏら、２００８；Ｊｏｎｅｓら、２０１２；Ｏｎｏ、１９８６；Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇら、２００７）。従って、養子Ｔ細胞療法を用いてエンベロープ抗原を標的化することは、多数の疾患病態に対する治療選択になり得る。この仮説と一致して、ＨＥＲＶ−Ｋエンベロープは、ＨＥＲＶ−ＫＣＡＲ^＋Ｔ細胞によりうまくかつ選択的に標的化することができる。これらの遺伝子改変ＣＡＲ^＋Ｔ細胞をｉｎｖｉｖｏで注入することは、これらの細胞の抗腫瘍活性を示す腫瘍の退縮及び転移の減少と関連した。
実施例７−微小残存病変の免疫療法で使用される可能性のあるｉｎｖｉｖｏで長寿命のＴ細胞を生成するための膜結合型サイトカインの使用

ｍＩＬ１５の生成及び発現。ｍＩＬ１５構築物（図２８）は、セリン−グリシンリンカーにより、ＩＬ−１５ｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿０００５８５．４）を全長ＩＬ−１５Ｒα（ＮＭ＿００２１８９．３）に融合する。ＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαのシグナルペプチドは省略し、ＩｇＥシグナルペプチド（ｇｂ｜ＡＡＢ５９４２４．１）をｍＩＬ１５構築物に用いた。この構築物は、膜結合型であるが、上述のトランス提示モデルに類似しているＩＬ−１５Ｒαとの関連において提示されるＩＬ−１５を産生する。ＤＮＡプラスミドをＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成し、その後、スリーピングビューティプラスミドにサブクローニングした（非ウイルス遺伝子導入方法）。一次ヒトＴ細胞に、ｍＩＬ１５プラスミド及びＳＢ−１１トランスポゾンの有無に関わらず、ＣＡＲプラスミド（ＣＤ１９に特異的）を共電気穿孔した。遺伝子改変Ｔ細胞の増殖及び膨張は、４１ＢＢＬ及びＣＤ８６共刺激分子を発現するＣＤ１９^＋Ｋ５６２人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）変異体を１週間刺激することで達成した。使用したＣＡＲは、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８シグナル伝達細胞質ドメインを含有する第２世代ＣＡＲである。ａＡＰＣ上にＣＤ１９が存在することで、抗原特異的Ｔ細胞を選択的に増殖させることができるが、共刺激分子は、ｉｎｖｉｔｒｏ増殖を改善する。ｍＩＬ１５分子は、改変Ｔ細胞によりＣＡＲと安定して共発現させることができ、共発現させたＴ細胞は、バルク集団を表す（図２９）。さらに、改変Ｔ細胞での全ＣＡＲ発現は、ｍＩＬ１５−ＣＡＲ改変Ｔ細胞に対して９０％を超えて到達する（図２９）。

ｍＩＬ１５の機能性。ＩＬ−１５受容体複合体シグナル伝達は、転写５のシグナル伝達物質及び活性化因子のリン酸化を主に誘導する。フォスフローを用いてリン酸化されたＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）を見ることで、ｍＩＬ１５がサイトカインシグナル伝達経路を誘導することができるかどうか判断することができる。ｐＳＴＡＴ５レベルは、これらのレベルでのサイトカイン補充が血清及びサイトカイン飢餓下で無効にされているＣＡＲ^＋Ｔ細胞で上昇した。飢餓条件下で、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のｐＳＴＡＴ５レベルを維持した（図３０）。ｍＩＬ１５が機能的であり、サイトカインシグナル伝達経路のｐＳＴＡＴ５部分を活性化することが、これらのデータにより実証される。

ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の臨床的に有意な数への増殖。Ｔ細胞特異性をＣＡＲに再指向させる際に、ｅｘｖｉｖｏ増殖の焦点は、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞集団、この場合、ｍＩＬ１５の有無に関わらないＣＡＲを活発にすることである。標準ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、可溶性ＩＬ−２及びＩＬ−２１で増殖させるが、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１５とＩＬ−２１との間の報告された相乗効果を利用するために可溶性ＩＬ−２１で増殖させた。ＩＬ−２１を補充したｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、標準ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のみならず、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１を与えられた対照ＣＡＲ^＋Ｔ細胞に同等の増殖が実証された（Ｐ＝０．５３、二元配置ＡＮＯＶＡ；図３１）。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖により、臨床的に有意な数の細胞を産生する。

ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型及び機能性の評価。ｅｘｖｉｖｏ増殖させたｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の表現型は、ＩＬ−７Ｒａ発現を除いてＣＡＲ^＋Ｔ細胞とほぼ同じである。この時点では注入産物を表す細胞の一般的な表現型は大部分が、活性化マーカーＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ２５の発現が中程度から高程度のＣＤ８^＋（細胞傷害性）Ｔ細胞である。両方のＴ細胞群のＴ細胞メモリー関連マーカー（ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、及びＣＤ２８）（図３２Ａ）の発現レベルは低程度から中程度まで可変であった。改変Ｔ細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖後、Ｔ細胞は、これらの再指向Ｔ細胞特異性及び溶解機能を保持する必要がある。クロム遊離アッセイを行い、増殖産物中のＴ細胞の機能を評価した。ＣＤ１９^＋及びＣＤ１９⁻ＥＬ４標的を、エフェクター対標的の比率を変えながら、改変Ｔ細胞で被覆した。ＣＤ１９^＋腫瘍標的の特異的溶解は、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及びＣＡＲ^＋Ｔ細胞の両方（Ｐ＜０．００１、二元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３）により、全てのエフェクター対標的の比率にわたって実証され、互いに違いはなかった（Ｐ＞０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡ）。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞によるＣＤ１９^＋標的溶解は、特異的であり、ＣＤ１９⁻標的のバックグラウンド溶解と有意に異なった（Ｐ＜０．００１、二元配置ＡＮＯＶＡ）（図３２Ｂ）。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、これらの再指向特異性及び溶解能力を保持した。

特異的ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞サブセットは、長期ｉｎｖｉｔｒｏ持続し、機能的なままである。長期のｉｎｖｉｔｒｏ持続性を評価するため、４つのａＡＰＣ刺激で増殖させたｍＩＬ１５^＋／−ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、抗原再刺激をさらにせずに長期培養した。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、または無サイトカインの補充を受けたが、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、外因性サイトカインを受けなかった。予想した通り、サイトカイン補充を受けなかったＣＡＲ^＋Ｔ細胞は持続しなかった。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のみならず、ＩＬ−２またはＩＬ−１５を受けたＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、非補充ＣＡＲ^＋Ｔ細胞よりも有意に大きな相対倍数増殖を有した（Ｐ＜０．０００１、反復測定ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３；図３３Ａ）。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の相対増殖をほぼ０にメンテナンスすることも、これらの改変細胞が非制限的に増殖していないことを示唆するものである。臨床応用に対して有益であるため、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、抗原に応答性のままでなければならない。したがって、抗原遭遇から７５＋日目でこれらのＴ細胞に、無標的、ＣＤ１９⁻ＥＬ−４、ＣＤ１９^＋ＥＬ−４、ＣＤ１９^＋Ｎａｌｍ−６（ヒト白血病細胞株）、またはリンパ球活性化カクテル（ＬＡＣ）で抗原投与し、インターフェロンγ（ＩＦＮｇ）産生を、標的でインキュベーション６時間後に、細胞内サイトカイン染色により評価した。ＩＬ−２またはＩＬ−１５のいずれかを受けたＣＡＲ^＋Ｔ細胞と同様に、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞も、ＣＤ１９^＋標的及びＬＡＣに応答するＩＦＮｇを産生した（図３３Ｂ）。別のアッセイでは、これらの７５日目の離脱Ｔ細胞をａＡＰＣで刺激し、ＩＬ−２１を補充した。従って、ＩＬ−２で培養したＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２及びＩＬ−２１を提供し、ＩＬ−１５培養Ｔ細胞は、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１を受け、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞には、ＩＬ−２１のみを補充した。ａＡＰＣ刺激後８日目に、アネキシンＶ染色を介してＴ細胞生存率を評価した。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、最も大きな生細胞集団（アネキシンＶ^ｎｅｇ）（図３３Ｃ）を有することが示され、活性化への耐性が細胞死を誘発したことを示す。

持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、低分化Ｔ細胞の特徴を持つ。長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を特徴付けるため、発明者らは、低分化Ｔ細胞サブセットは長寿命の潜在力があると知られているため、持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が低分化Ｔ細胞サブセットと関連する特徴を示すであろうと仮説を立てた。構成的プロモーターの存在により構成的シグナル伝達が可能なため、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のｅｘｖｉｖｏ培養中、発明者らは、これらのＴ細胞が、持続性利点を持つ細胞を生み出す低分化状態の分子プログラムを持つかどうか評価した。ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システムを用いた多重化デジタル遺伝子プロファイリングの分析を、４刺激（離脱アッセイＴ細胞入力）からのＣＡＲ^＋及びｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞に行った。正規化ｍＲＮＡ計数の分析には、負の２項分布ベース統計プログラム（Ｌｏｈｓｅら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１２）４０、Ｗ６２２−７）を用いた。２倍を超える特異的なｍＲＮＡ計数、Ｐ＜０．０５、ＦＤＲｑ＜０．０５である場合、遺伝子は、有意に特異的発現をしたと見なした。これらの基準を用いて、５個の遺伝子しか特異的に発現したと見なされなかったため、ｍＩＬ１５により得られた培養または分子プログラミングの利点はないことが示唆された。

その後、発明者らは、長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を特徴付けた。まず、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７マーカーを用いてこれらの表現型を評価し、これらの分化状態を表現型として記述した。最低から最高の分化状態の細胞は、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋＜ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＣＲ７^＋＜ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＣＲ７⁻＜ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７⁻と表すため、これらのマーカーは、Ｔ細胞の分化状態を特徴付ける。実験（４刺激したｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞）の開始時に、７５日目離脱ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞をこれらの対応物と比較すると、持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞培養により、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋及びＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７⁻Ｔ細胞サブセットの割合が増した（＊＊＊Ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ反復測定ＡＮＯＶＡ、ｎ＝７；図３４）ことが観察される。ＣＣＲ７発現は、ＣＡＲＴ細胞に対して離脱ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞で有意に強化された。ＣＣＲ７^ｎｅｇ及びＣＣＲ７^＋サブセットの生存率は、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）を受けたＣＡＲ^＋Ｔ細胞、及び抗原離脱後に可溶性ＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）を受けたＣＡＲ^＋Ｔ細胞のアネキシンＶ染色により評価された。サイトカイン刺激（ＩＬ−２、ＩＬ−１５複合体、またはｍＩＬ１５）の種類に関わらず、ＣＣＲ７^ｎｅｇＴ細胞は、生細胞と等しい周波数を示すことが分かった。これに対し、ｍＩＬ１５に曝露されたＣＣＲ７^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２またはＩＬ−１５複合体を受けたＣＡＲＴ細胞よりも生存率が有意に高かった（両方とも、Ｐ＜０．０５；図３４）。ｍＩＬ１５がＣＣＲ７^＋表現型を十分に支持するため、低分化ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋Ｔ細胞サブセットの維持に寄与することを、これらのデータは示している。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が低分化Ｔ細胞の持続性を促進する能力は、養子療法の所望の表現型であり、長寿命Ｔ細胞サブセットが低分化表現型を持つと報告している他の研究を裏付けるものである。さらに、高分化サブセットの生存も観察され、構成的ＩＬ−１５シグナル伝達により支持されたと思われる。

長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、低分化Ｔ細胞サブセットと関連するいくつかの分子マーカーを表示する。ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システムを用いてＴ細胞の遺伝子発現パターンを分析し、４刺激からのｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と離脱後７５日目に生存しているものとの間の特異的発現遺伝子の階層的にクラスタリングされたヒートマップを生成した（＞２倍切り捨て、Ｐ＜０．０５、ＦＤＲｑ＜０．０５）。これらの研究により、１０８個の有意に特異的な発現遺伝子を同定した（＞２倍切り捨て、Ｐ＜０．０５、ＦＤＲｑ＜０．０５）。ＤＡＶＩＤ機能注解を用いて遺伝子オントロジー分類を評価した。特異的発現遺伝子の機能的分類は、広義のカテゴリー：Ｔ細胞活性化、分化、増殖、及びアポトーシスに分類される。即ち、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の多数の遺伝子が、正の分化調節、アポトーシス調節、及びアポトーシス誘導を下方調節した。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の多数の遺伝子が、負の分化調節、及びＷｎｔシグナル伝達経路を上方調節した（図３６）。これは、持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の分子署名が、４刺激のｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（実験開始時のＴ細胞）よりも低分化であることを示唆するものである。

選択した遺伝子の発現は、フローサイトメトリーにより検証した。低分化状態（Ｔｃｆ−７）及びエフェクター機能／分化状態（Ｂｌｉｍｐ−１及びＴｂｅｔ）の獲得と関連する転写因子の発現は、持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が低分化細胞と関連する転写因子バランスを示すことを示すものである。これは、Ｔｃｆ−７の発現が大きくなり、Ｂｌｉｍｐ−１及びＴｂｅｔの発現が小さくなることを特徴とする（図３７）。細胞表面マーカーＩＬ−７Ｒａ及びＣＣＲ７の評価は、低分化Ｔ細胞サブセットにより特徴的に発現される際に行った。持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、長寿命Ｔ細胞サブセットと関連するこれらのマーカーの発現を増加させた（図３８）。Ｔ細胞の分化レベルを区別するための１つの追加の尺度は、低分化Ｔ細胞がＩＬ−２を産生する能力によるものである。４刺激または７５日目離脱培養のいずれかからのｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、ＬＡＣで６時間模擬処置もしくは処理した後、細胞内サイトカイン染色によりＩＬ−２産生を評価した。４刺激Ｔ細胞は、ＩＬ−２を産生することができなかったが、持続性７５日目離脱Ｔ細胞は、ＩＬ−２を産生する能力を獲得した（図３９）。これらの結果は、集合的に、ｅｘｖｉｖｏ増殖させたＣＡＲ^＋Ｔ細胞またはｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の間に識別可能な差異はないが、得られた長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、ｉｎｖｉｖｏでの長期生存を実証する低分化Ｔ細胞サブセットと関連する特徴を示すことを示唆するものである。

高腫瘍量モデルにおけるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｖｏ持続性及び抗腫瘍効果。ｉｎｖｉｖｏ持続性を評価するため、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及びＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、蛍ルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）を発現するように共改変し、生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いたｉｎｖｉｖｏのＴ細胞の縦方向モニタリングを可能にした。これらの改変Ｔ細胞を、２０×１０^６個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１回Ｔ細胞注入を用いて、播種Ｎａｌｍ−６（ＣＤ１９^＋）悪性腫瘍を持つＮＳＧマウスに、未処置対照群と共に養子導入した。１４日後にマウスを犠牲にした。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が持続するとは分かっていなかったが、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、１１日間のイメージング期間を通じて持続することがＢＬＩにより観察された（図４０Ｂ）。骨髄、脾臓、及び末梢血液を採取し、ヒトＣＤ３をマーカーとして用いて、かつ、マウスリンパ球をゲートアウトして、ヒトＴ細胞の存在についてフローサイトメトリーにより評価した。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を注入したマウスには、骨髄（０．４９〜２．１７％、Ｐ＝０．０００１、非対応ｔ検定、ｎ＝５）、脾臓（１．１５〜１２．３８％、Ｐ＜０．０００１、非対応ｔ検定、ｎ＝５）及び末梢血液（５８．３９〜９２．６０％、Ｐ＜０．０００１、非対応ｔ検定、ｎ＝５）に著しいＣＤ３^＋Ｔ細胞が検出された（図４０Ｃ）。評価した組織のいずれにおいても、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞処置群（図４０Ｃ）及び未処置群（腫瘍のみ）からの試料にＣＤ３^＋細胞は検出されなかった。このモデルでは、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、末梢血液で腫瘍制御を実証したが（図４０Ｄ）、完全な腫瘍消失は観察されなかった。腫瘍抗原の有病率にかかわらず、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、Ｉｎｖｉｖｏ持続性が不十分であるが、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、身体を通じて有意なレベルで存在したことが、これらのデータにより示される。

低腫瘍量モデルにおけるｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｖｏ持続性及び抗腫瘍効果。発明者らは次に、低腫瘍量の予防モデルにおけるＴ細胞生着及び抗腫瘍活性を評価した。改変Ｔ細胞（ｍＩＬ１５^＋／−ＣＡＲ^＋ｆｆＬｕｃ^＋）を、外因性サイトカインのないＮＳＧマウスに注入し、ウミシイタケルシフェラーゼ（ｒＬｕｃ）改変Ｎａｌｍ−６の注入前に６日間生着させた。マウスには、３０日間にわたってＢＬＩを行った。この予防モデルでは、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、実験期間を通じて持続することが観察され、腫瘍生着を予防した。これは、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び無Ｔ細胞処置群と比較して有意な抗腫瘍効果であった（Ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ＝４〜５）（図４１Ｃ及び４１Ｄ）。フローサイトメトリーによる臓器及び末梢血液の分析により、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞処置群にヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞を検出したが、興味深いことに、Ｔ細胞は骨髄でしか見つからず（図４１Ｅ）、腫瘍遭遇後に選択的なホーミングまたは生存を示し得る。同様の実験では、生存を試験し、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞処置マウスは、無Ｔ細胞処置マウスまたはＣＡＲ^＋Ｔ細胞処置マウスと比較して有意に改善された生存を示した［Ｐ＝０．０４５（ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞対ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、ログランクマンテル・コックス検定、ｎ＝７〜８；図４１）。

ＣＡＲ活性化の不在下でのｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩｎｖｉｖｏ持続性。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が、ＣＡＲシグナル伝達の必要なくｉｎｖｉｖｏで長期持続が可能かどうか評価するため、改変Ｔ細胞（ｍＩＬ１５^＋／−ＣＡＲ^＋ｆｆＬｕｃ^＋）をマウス（無腫瘍または無外因性サイトカイン）に注入し、最大４７日間監視した。この方法でＴ細胞を試験することで、持続性Ｔ細胞が、非制限の増殖を実証するかどうか、あるいは、ホメオスタシスに似た状態でこれらの集団を維持するかどうか明らかになるであろう。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の持続は観察されなかったが、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の存在により、外因性サイトカイン及び抗原の不在下での持続性が示された（図４２Ｂ）。これは、骨髄、脾臓、及び末梢血液から単離したＣＤ３染色細胞のフローサイトメトリーによりさらに確認された（図４３Ｃ）。縦方向のＴ細胞持続性の評価では、フラックス値は、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞レベルが経時的に安定するかまたは徐々に低下することを示すが、未制御増殖の発生は示さなかった（図４２Ｄ）。これらの持続性Ｔ細胞を採取し、遺伝子改変Ｔ細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖で前述したのと同じ方法で、ｅｘｖｉｖｏ増殖させた。これらの細胞は、インターフェロン−γ産生により評価されたように、抗原特異的に活性化することができた（図４２Ｅ）。ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の抗原特異的応答を保持しながら、ＣＡＲに依存せずかつホメオスタシスに似た状態でｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の持続性が強化されたことを、このｉｎｖｉｖｏデータは実証している。

ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の細胞増殖及びメモリー動態。フローサイトメトリー分析を用いて、ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞をさらに特徴付けた（結果を図３５に示す）。長期持続性ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、１年を超えて一定で培養されている試料において１０日にわたる最小ＰＫＨ希釈により示されるように、低回転率での培養を維持する。さらに、細胞を分割すると、大部分がＣＣＲ７⁻であった。そのようなデータは、Ｔ細胞が、非制限の自律的な増殖または成長とは反対に恒常的に維持されることを示している（図３５Ａ）。連続的長期培養（１．５〜２．４５年）のｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、ａＡＰＣで活性化され、表現型検査し、染色体分析用に提出された。表現型検査は、これらのＴ細胞がｍＩＬ１５を発現したことを示し、提出された全てのドナーの染色体分析の結果は、正常な中期展開を示した（図３５Ｂ及び３５Ｃ）。図３５Ｄは、Ｋ５６２ａＡＰＣを用いた細胞の刺激後のメモリー動態を示す：離脱中の刺激１−ＣＡＲ対ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲ条件：これらの研究では、ＣＡＲＴ細胞は、刺激の最初の９日間中にはＩＬ−２１のみ、Ａｇ離脱中にはＩＬ２のみを得；ｍＩＬ５^＋ＣＡＲＴ細胞は、最初の９日間中にはＩＬ−２１のみを得、離脱中に外因性サイトカインは得られなかった。ＣＡＲ及びｍＩＬ１５^＋ＣＡＲＴ細胞間の刺激１後１９日目にＣＣＲ７及びＩＬ−７Ｒａ発現に差異はないことを結果は示すものである。ＣＣＲ７及びＩＬ−７Ｒａ発現は、ｍＩＬ１５−改変Ｔ細胞のみの抗原暴露（２９日目対１９日目）から離れて時間と共に増加する。ＣＡＲ発現は、抗原に暴露することなく〜８０％に増加する（刺激１後９日目に、ＰＢ５２２は５１％、ＰＢ２７３は５３％であった）。図３５Ｅは、ＣＡＲ及びｍＩＬ１５^＋ＣＡＲＴ細胞の刺激１対２のメモリー動態を示す。離脱中の条件：ＣＡＲＴ細胞は、刺激後１０日目に策定したＡｇ離脱中にＩＬ２のみを得；ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲＴ細胞は、離脱中に外因性サイトカインは得られなかった。刺激１及び刺激２後の同じような時点でＣＣＲ７及びＩＬ−７Ｒａ発現を比較することで、１９日目の刺激１でＣＡＲ対ｍＩＬ１５^＋ＣＡＲのメモリー差は示されなかった。刺激２では、刺激１と同じ時点で、２回刺激されたＣＡＲＴ細胞は、刺激１対応物と比較してＣＣＲ７ははるかに少なく、ＩＬ−７Ｒａはほとんどない。２回刺激されたｍＩＬ１５^＋ＣＡＲＴ細胞も、メモリーは少ないが、ＣＣＲ７がいくつか残ったｍＩＬ１５^＋ＣＡＲＴ細胞を持つＣＡＲのみＴ細胞よりもより多くの「メモリー」を保持する（しかし、ＩＬ−７Ｒａはほぼ完全に消失した）。
実施例８−ＳＢトランスポゼースをコードするｍＲＮＡを用いて最小限に操作されたＴ細胞の生成

エレクトロポレーション用のｍＲＮＡとして提供されたＳＢトランスポゼースの使用により、ＳＢトランスポゼースシステムを用いてＣＡＲＴ細胞産生をさらに強化できたかどうかについての研究を実施した。これらの研究では、トランスポゾン反復によりフランクされたＣＡＲをコードするプラスミドと、トランスポゼース（例えば、ＳＢ１１または１００×）をコードするｍＲＮＡとの両方を用いて、上に詳述したように細胞を電気穿孔した。研究用のｍＲＮＡは、ｍ７ＧＴＰがキャップされ、ポリＡ尾部を含んだ。ｍＲＮＡとして提供されたｍＲＮＡＳＢトランスポゼースを用いたＣＡＲＴ細胞作製プロトコルを示す概略を図４３に示す。これらの研究では、ドナー＃０からの細胞は、ＳＢ１１ｍＲＮＡで電気穿孔したが、ドナー＃１からの研究細胞は、１００×ｍＲＮＡで電気穿孔した。

ドナー＃０から作製された細胞は、ＣＡＲ発現及び細胞増殖のためのフローサイトメトリー分析により特徴付けられた。図４４Ａに示すように、ＣＡＲを安定的に発現するＴ細胞の百分率は、９日目（８．３％）から１６日目（６６．２％）に有意に増加する。Ｔ細胞は、急速に成長し、エレクトロポレーション後１６日目に２０倍に増殖した（図４４Ｂ）。さらに、図４４Ｄに示す研究を用いて、エレクトロポレーション後９日目（左側パネル）及び１７日目（右側パネル）にセントラルメモリーＴ細胞数（Ｔｃｍ）を評価した。これらの結果から、低分化セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）数は９日目〜１７日目に減少するが、相対的に高い（２７％）ことが分かる。次に、クロム遊離アッセイを用いて、細胞の細胞毒性活性を判断した。図４４Ｃに示すように、作製されたＣＡＲＴ細胞は、標的細胞に対するＣＤ−１９特異的細胞毒性をもらたしたが、非改変Ｔ細胞には細胞毒性活性が本質的に見られなかった。

ドナー＃１から作製された細胞についても研究した。図４５Ａに示すように、このドナーから作製されたＣＡＲＴ細胞も、標的細胞に対するＣＤ−１９特異的細胞毒性をもらたしたが、非改変Ｔ細胞（右側パネル）には細胞毒性活性が本質的に見られなかった。さらに、改変Ｔ細胞は、ＣＡＲ陽性細胞数が異なるにもかかわらず、同様の効率で９日目及び１５日目にＣＤ１９陽性標的細胞を殺傷する。図４５Ｂでは、ＣＡＲコピー数及び発現を評価した研究結果を示す。これらの結果は、ＣＡＲＤＮＡコピー数が１５日目から２２日目に１．５から０．９に減少し、その後は安定的であることを示すものである。

最後に、フローサイトメトリーを用いて、エレクトロポレーション後の細胞生存率を評価した。図４６に示すように、ＤＮＡ／ｍＲＮＡでエレクトロポレーション後、全細胞数はまず減少し（１日目及び２日目）、その後、細胞は増殖し始める。セロメーターカウントにより、細胞数は、エレクトロポレーション後２日目に５９％〜７６％減少する（生存率２４〜４１％）。

従って、トランスポゼースをコードするｍＲＮＡを用いるＣＡＲ作製技術の使用により、効果的な数の標的特異的細胞傷害性Ｔ細胞を極めて短期間かつ最小限の操作で作製できることが、前述のデータにより実証された。ｍＲＮＡエレクトロポレーションの効率はドナーに依るが、ＳＢ１００×トランスポゼースはＣＡＲ作製においてより効率的であり得ると考えられる。興味深いことに、ＣＡＲを発現する細胞の百分率が低いエレクトロポレーション後早期であっても（９日目）、全ての細胞集団は、後の段階（１５〜１６日目）からのものとほとんど同じ効率で標的腫瘍細胞を殺傷し、より多くのセントラルメモリー（低分化）細胞を含有する。ｍＲＮＡをコードするＳＢ１１及びＳＢ１００×は、試験条件下で、細胞ゲノム当たり約１つのコピーＣＡＲコード遺伝子の組み込みをもたらすことも確認された。

本書で開示されかつ特許請求の範囲に記載した方法の全てを、本開示を考慮に入れて必要以上の実験なしに構成及び実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して説明する一方、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び方法のステップまたはステップの手順の様々な変更を適用してもよいことは、当業者にとって明らかである。さらに、同一または類似の結果を得ながら本明細書に記載の薬剤を化学的及び生理学的に関連する特定の薬剤に置き換えてもよいことに留意されたい。このような当業者に明らかな同様の置換及び変更の全ては、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲、及び概念の範囲内であると考えられる。
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Ｒｅｉｃｈｅｅｔａｌ，ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓＫｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｉｎｐｒｉｍａｒｙｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓａｎｄｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓａｆｔｅｒＵＶｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．ＭｅｌａｎｏｍａＲｅｓ．，２０：４３５−４４０，２０１０．
Ｓｃｉａｍａｎｎａｅｔａｌ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２４：３９２３−３９３１，２００５．
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Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇｅｔａｌ，ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆＨＥＲＶ−Ｋｅｎｖｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｐｌｉｃｉｎｇｉｎｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：１５２８−１５３５，２００３．
Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇｅｔａｌ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｈｕｍａｎｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｓｕｒｆａｃｅｅｎｖｅｌｏｐｅｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２０：８１−９０，２００７．
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Claims

遺伝子操作細胞であって、
（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と；
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へとＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαを含む膜結合型融合タンパク質と
を含む、前記細胞。
前記融合タンパク質が、配列番号６に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の細胞。
前記融合タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む請求項２に記載の細胞。
前記融合タンパク質が、配列番号７に少なくとも９０％同一である配列を含むＤＮＡによってコードされる請求項１に記載の細胞。
前記融合タンパク質が、配列番号７の配列を含むＤＮＡによってコードされる請求項４に記載の細胞。
前記ＣＡＲをコードするＤＮＡを、前記細胞のゲノム中に組み込む請求項１に記載の細胞。
前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが、染色体外ベクター中に含まれる請求項１に記載の細胞。
前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを、前記細胞のゲノム中に組み込む請求項１に記載の細胞。
治療を必要とするヒト対象においてがんを治療するための組成物であって、請求項１に記載の１つ以上の細胞を含む組成物。
前記細胞が、がん細胞抗原を標的にするＣＡＲを含む請求項９に記載の組成物。
前記対象が、以前に抗がん治療を経験している請求項１０に記載の組成物。
前記対象が、寛解期である請求項１１に記載の組成物。
前記対象が、前記がんの症状がないが、検出可能ながん細胞を含む請求項１１に記載の組成物。
配列番号６に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ−１５，ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質。
配列番号６のアミノ酸配列を含む請求項１４に記載の融合タンパク質。
配列番号６に少なくとも９０％同一であるＩＬ−１５，ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド。
配列番号７に少なくとも９０％同一である配列を含む請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子操作細胞。
前記細胞が、Ｔ細胞、Ｔ前駆細胞、ＮＫ細胞またはａＡＰＣである請求項１８に記載の細胞。
前記がん細胞抗原が、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ＣＤ１２３、ｃ−ｍｅｔ、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＭＵＣ−１、ＣＤ２３またはＣＤ３０である請求項１０に記載の組成物。
前記がんが白血病または固形腫瘍である請求項１０に記載の組成物。
前記融合タンパク質が前記ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとを連結するリンカーをさらに含む請求項１に記載の細胞。
前記リンカーがセリン−グリシンリンカーをさらに含む請求項２２に記載の細胞。
前記融合タンパク質が、ＩｇＥシグナルペプチドをさらに含む請求項１に記載の細胞。
ＤＮＡを含む遺伝子操作細胞であって、該ＤＮＡは、
（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と；
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へとＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαを含む膜結合型融合タンパク質と
をコードする、細胞。
トランスポゼースをさらに含む請求項２５に記載の細胞。
前記トランスポゼースが、スリーピングビューティトランスポゼースである請求項２６に記載の細胞。
前記トランスポゼースが、ＤＮＡ発現ベクターとして提供される請求項２６に記載の細胞。
前記トランスポゼースが、スリーピングビューティトランスポゼースをコードするｍＲＮＡである請求項２６に記載の細胞。
前記ｍＲＮＡは、キャップ、ポリＡ尾部またはその両方を含む請求項２９に記載の細胞。