JP6336976B2 - 多能性幹細胞の増殖促進因子のスクリーニング法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養のための高効率な無フィーダー無血清培養技術、及び前記培養技術に基づくスクリーニング方法に関する。

ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳＣ）やヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）等のヒト多能性幹細胞の近年の研究により、再生医療の実用化の可能性が高まっている。これらの細胞は、無限に増殖できる能力と、様々な細胞に分化する能力を有していることから、多能性幹細胞を用いた再生医療には、難治性疾患、生活習慣病等に対する治療法を根本的に変革することが期待されている。多能性幹細胞からは、神経細胞をはじめとして、心筋細胞、血液細胞、及び網膜細胞などさまざまな種類の細胞に試験管内で分化誘導することが既に可能になっている。

従来、ｈＥＳＣやｈｉＰＳＣ等のヒト多能性幹細胞は、主にマウス由来の胎児線維芽細胞ＭＥＦ（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を用いたフィーダー細胞層上で培養されてきた。フィーダー細胞には、ヒト多能性幹細胞を維持培養するために有益な増殖因子を幹細胞に供給する働きがある。このヒト多能性幹細胞の維持培養を可能とする活性は、ＭＥＦ以外に、種々のヒト細胞種でも報告されている（非特許文献１〜４）。しかし、従来の方法では培養時にフィーダー細胞を調製するのに手間がかかる上に、幹細胞にフィーダー細胞が混入するリスクがあるため、より安全な代替法の開発が必要とされている。

ＭＥＦを用いずに多能性幹細胞を培養する方法として、ＦＢＳ等の血清や血清代替物を添加した培地を予めＭＥＦで馴化したもの（ＭＥＦ−ＣＭ）を用いる方法やＭＥＦを化学的に固定化する方法（非特許文献５）が知られている。また、異種細胞を用いず、各種ヒト由来細胞（線維芽細胞、胎盤細胞、骨髄細胞、子宮内膜細胞など）を生フィーダー細胞として用いる方法も報告されている（非特許文献６）。これらの方法では、ヒト多能性幹細胞を培養するために、牛血清や、ＫＮＯＣＫＯＵＴ^ＴＭ ＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：血清の代わりとして用いることによりＥＳ／ｉＰＳ細胞を培養することができる添加剤）などを添加した培地が使用されているが、それらの添加成分は、ウシ血清から抽出されたタンパク質を用いたものが多く、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの感染症や、ウイルスによる細胞汚染が懸念されている。ヒト由来血清も一部では用いられているが、使用する上での制約や量的に有限なものであるため実用化には向いていない。

また、ＭＥＦを用いずに培養するための完全合成培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）の開発も進められている（非特許文献７及び８）。ＭＥＦの分泌物についての機能性タンパク質の解析も行われている（非特許文献９）。しかしながら、無フィーダー無血清培養法でヒト多能性幹細胞を安定して培養するのは依然として難しく、良好な増殖を可能にする技術の開発がなお求められている。

Hovatta O. et al., Hum. Reprod. (2003) 18, p.1404-1409 Richards M. et al., Nat. Biotechnol. (2002) 20, p.933-936 Cheng L. et al., Stem Cells (2003) 21, p.131-142 Richards M. et al., Stem Cells (2003) 21, p.546-556 Yue X-S. et al., PLoS. ONE (2012) 7, e32707 福角勇人及び金村米博、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の無フィーダー細胞培養技術の開発、医学のあゆみ、(2011) 239, p.1338-1344 Akopian V. et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. (2010) 46, p.247-258 Chen G. et al., Nat. Methods (2011) 8, p.424-429 Chin AC. et al., J. Biotechnol. (2007) 130, p.320-328

本発明は、細胞培養のための高効率な無フィーダー無血清培養技術を提供することを課題とする。さらに、前記培養技術を応用した増殖促進因子のスクリーニング方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、多能性幹細胞の培養に利用可能な無血清培地を予めフィーダー細胞で馴化することにより、フィーダー細胞と共培養することなく多能性幹細胞を安定的に培養でき、増殖性を向上させることができる培地を調製できることを見出し、さらに調製した培地をスクリーニングすることによって、効率的に多能性幹細胞の増殖促進因子を同定できる技術を見出し、本発明を完成するに至った。

また本発明者らは、所定の成分を含む無血清培地で多能性幹細胞をオンフィーダー培養した後、無フィーダー培養することにより、多能性幹細胞の増殖性をさらに高めることができることも見出した。

すなわち、本発明は以下を包含する。

［１］多能性幹細胞に対する増殖促進因子をスクリーニングする方法であって、
ａ）Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地において、フィーダー細胞を培養し、生成した馴化培地を回収する工程、及び
ｂ）回収した馴化培地に含まれる、多能性幹細胞に対する増殖促進因子を検出する工程、
を含む方法。

本スクリーニング方法の好ましい一実施形態では、前記無血清培地は、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含む、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であってよい。

本スクリーニング方法の一実施形態では、フィーダー細胞の培養を、前記無血清培地に増殖因子を添加して行うことも好ましい。本スクリーニング方法において添加する増殖因子は、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ−β１であることが好ましい。

本スクリーニング方法において、フィーダー細胞はマウス胎児線維芽細胞であり得る。

本スクリーニング方法において、多能性幹細胞は、好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。

［２］Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地において、フィーダー細胞を培養し、生成した馴化培地を回収することを含む、多能性幹細胞培養用培地の調製方法。

本調製方法の好ましい一実施形態では、前記無血清培地は、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含む、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であってよい。

本調製方法において、一実施形態では、フィーダー細胞の培養を、前記無血清培地に増殖因子を添加して行うことも好ましい。本調製方法において添加する増殖因子は、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ−β１であることが好ましい。

本調製方法において、フィーダー細胞はマウス胎児線維芽細胞であり得る。

本調製方法において、多能性幹細胞は、好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。

［３］上記［２］の方法によって調製される、多能性幹細胞培養用馴化培地。

［４］Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地でフィーダー細胞を培養することにより生成された馴化培地において、多能性幹細胞を無フィーダー培養することを含む、多能性幹細胞の増殖方法。

本増殖方法の好ましい一実施形態では、前記無血清培地は、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含む、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であってよい。

本増殖方法において、一実施形態では、フィーダー細胞の培養を、前記無血清培地に増殖因子を添加して行うことも好ましい。別の実施形態では、フィーダー細胞の培養を、前記無血清培地に増殖因子を添加せずに行い、かつ、多能性幹細胞の無フィーダー培養を、前記馴化培地に増殖因子を添加して行うことも好ましい。本増殖方法において添加する増殖因子は、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ−β１であることが好ましい。

本増殖方法において、フィーダー細胞はマウス胎児線維芽細胞であり得る。

本増殖方法において、多能性幹細胞は、好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。

［５］Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地を用いてフィーダー細胞上で培養した多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に移行して無フィーダー培養することを含む、多能性幹細胞の増殖方法。

この方法の好ましい一実施形態では、無血清培地はアルブミンを含まないことが好ましい。

本明細書は本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願 特願2013-137206号の開示内容を包含する。

本発明によれば、血清及び血清代替物を使用しない無血清培地を用いて、多能性幹細胞の無フィーダー培養における増殖性を向上させることができる。また本発明によれば、無フィーダー培養において多能性幹細胞の未分化増殖を促進する因子をスクリーニング可能な馴化培地を取得することができる。

図１は無フィーダー培養でのｉＰＳ細胞の増殖性に対する無血清ＭＥＦ馴化培地の効果を示す写真である。Ａは基本培地（無血清培地）Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ２＋ＴＧＦ−β１から調製した馴化培地における増殖性（＋＋＋）、Ｂは基本培地（無血清培地）Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ２＋ＴＧＦ−β１（馴化なし）における増殖性（＋）、Ｃは基本培地（無血清培地）Ａ＋ＩＴＳから調製した馴化培地（馴化後、ＦＧＦ２＋ＴＧＦ−β１添加）における増殖性（＋＋）、Ｄは基本培地（無血清培地）Ａから調製した馴化培地（馴化後、ＩＴＳ＋ＦＧＦ２＋ＴＧＦ−β１添加）における増殖性（−）、Ｅは基本培地（無血清培地）Ｂ＋ＩＴＳから調製した馴化培地（馴化後、ＦＧＦ２＋ＴＧＦ−β１添加）における増殖性（−）、Ｆは基本培地（無血清培地）Ｂ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ２＋ＴＧＦ−β１（馴化なし）における増殖性（−）を示す。 図２は各種培養基質でコーティングしたプラスチック培養ディッシュにおける、無血清馴化培地中でのヒトｉＰＳ細胞の増殖結果を示す写真である。培養基質として、Ａ、Ｂはマトリゲル（登録商標）、Ｃ、Ｄはビトロネクチン、Ｅ、ＦはＰＣＭ−ＤＭを用いた。Ａ、Ｃ、Ｅは馴化していない無血清培地、Ｂ、Ｄ、ＦはＭＥＦ馴化培地を使用した。 図３はＭＥＦで馴化した無血清培地又は馴化していない無血清培地を用いた培養でのヒトｉＰＳ細胞の増殖性を比較した表を示す。 図４はＭＥＦで馴化した無血清培地又は馴化していない無血清培地で培養したヒトｉＰＳ細胞について、フローサイトメトリーにより未分化マーカーの発現を解析した結果を示す。 図５は、血清代替物含有培地（Ｂ〜Ｅ）又は所定の成分を含む無血清培地（Ｇ〜Ｊ）を用いてオンフィーダー培養したヒトｉＰＳ細胞を、無フィーダー培養に移行した後の増殖性を比較した結果を示す写真である。図５中、増殖性のレベルを、−（増殖せず）又は＋の個数で示す。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、フィーダー細胞により無血清培地を馴化することにより、無フィーダー培養で多能性幹細胞を増殖させるのに好適な培地を調製する方法に関する。

本発明において「多能性幹細胞」とは、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有する細胞であって、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。本発明において増殖させる多能性幹細胞の具体例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞であるＥＧ細胞（Shamblott M.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1998) 95, p.13726-13731）、精巣由来の多能性幹細胞であるＧＳ細胞（Conrad S., Nature (2008) 456, p.344-349）、体細胞由来の人工多能性幹細胞であるｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明において増殖させる多能性幹細胞は、特に好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ＥＳ細胞は、胚盤胞と呼ばれる初期胚の内部に存在する内部細胞塊から採取した未分化細胞に由来する培養細胞である。ｉＰＳ細胞は、体細胞に初期化因子を導入することにより体細胞を未分化状態へと初期化し、多能性を付与した培養細胞である。初期化因子としては、Ｏｃｔファミリー遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４）及びＫｌｆファミリー遺伝子（例えば、Ｋｌｆ４）、並びにＭｙｃファミリー遺伝子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ）及び／又はＳｏｘファミリー遺伝子（例えば、Ｓｏｘ２）を用いることができる。多能性幹細胞は、任意の動物由来のものであってよく、例えば、マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類、ヒト、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類、さらにイヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜又は愛玩動物などの哺乳動物由来のものであってよいが、ヒト由来の多能性幹細胞が特に好ましい。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を始めとする多能性幹細胞は、市販品又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製したものを用いてもよい。また、刺激惹起性多能性獲得細胞（Ｓｔｉｍｕｌｕｓ−Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｃｅｌｌｓ：ＳＴＡＰ細胞）を多能性幹細胞として用いてもよい。ＳＴＡＰ細胞は、動物細胞に外部から強い刺激（ストレス）を与えて分化多能性を持たせた細胞である（Nature, 505, 641-647, (2014)）。

本発明においては、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地を馴化に供する。本発明において「血清」とは、任意の動物（例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ヤギ等）由来の血清を指す。また「血清代替物」（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）とは、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の培養において血清（ＦＢＳ等）の代替品として細胞の未分化状態の維持及び培養のために使用される試薬であり、例えば、ＫＮＯＣＫＯＵＴ^ＴＭ ＳＲ（ＫｎｏｃｋＯｕｔ^ＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）； ＧＩＢＣＯ社）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標） Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＳＲ；和光純薬工業）、Ｎ２サプリメント（和光純薬工業）等が挙げられる。この無血清培地は、血清及び血清代替物を含まない、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２ Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。これらの基礎培地を用いて無血清培地を調製する場合には、基礎培地にＬ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを添加すればよい。

あるいは、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムのうち少なくとも１つ以上が予め添加された、血清及び血清代替物を含まない液体培地を用いて、無血清培地を調製することもできる。この場合には、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムのうち培地に含まれていない成分を培地に添加することにより、無血清培地を調製してもよいし、培地に含まれている成分も含めてＬ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを培地に添加して無血清培地を調製してもよい。例えば、インスリン及びトランスフェリンを添加した血清由来成分不含培地である、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、ｅＲＤＦ Ｄｒｙ Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｍｅｄｉａ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、ＵｌｔｒａＣＨＯ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）等を用いることができる。ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社製）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社製）なども好適に用いることができる。タンパク質成分がごく一部に限定されたＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）も好適に使用することができる。

上記無血清培地の好ましい例は、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムをを含む、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。

本発明において無血清培地の調製に用いる培地は、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、又はこれらの均等物などを含有してもよいが、増殖因子以外のタンパク質成分の含量はできる限り少ない方が好ましい。一実施形態では、本発明で用いる無血清培地は、アルブミンを含まないことも好ましい。アルブミンは無血清培地に添加されることが多いが、ロットによる品質の変動が大きいことなどの問題が懸念されるためである。一実施形態では、本発明において無血清培地の調製に用いる培地は、その組成が既知のものが好ましい。例えば、多能性幹細胞に対する増殖促進因子を馴化培地からスクリーニングする場合には、培地組成が既知であることが好ましい。

無血清培地を調製する際には、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムは、溶液、誘導体、塩又は混合試薬等の形態で動物細胞培養用の培地に添加することができる。例えば、Ｌ−アスコルビン酸は、２−リン酸アスコルビン酸マグネシウムなどの誘導体の形態で培地に添加してもよい。セレンは亜セレン酸塩（亜セレン酸ナトリウムなど）の形態で培地に添加してもよい。インスリン及びトランスフェリンは、動物（好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ等）の組織又は血清等から分離した天然由来のものであってもよいし、遺伝子工学的に作製した組換えタンパク質であってもよい。インスリン、トランスフェリン、及びセレンは、試薬ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン）の形態で培地に添加してもよい。ＩＴＳは、インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウムを含む、細胞増殖促進用の添加剤である。

本発明において馴化に供する無血清培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。例えば、２−メルカプトエタノールを含む場合、その濃度は幹細胞の培養に適する限り限定されないが、例えば約０．０５〜１．０ｍＭ、好ましくは約０．１〜０．５ｍＭであってよい。

本発明では、上記のような無血清培地においてフィーダー細胞を培養することにより、培地を馴化する。フィーダー細胞は、マイトマイシン処理やγ線照射処理等により、有糸分裂を不活性化してから馴化に用いることが好ましい。本発明で用いるフィーダー細胞は、多能性幹細胞のフィーダー細胞層上での培養（オンフィーダー培養）のために使用可能な細胞である。フィーダー細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウシ等の哺乳動物の胚又は組織由来の、線維芽細胞、胎盤細胞、骨髄細胞、子宮内膜細胞などの細胞であってよい。フィーダー細胞の具体例としては、マウス胎児線維芽細胞であるＭＥＦ又はＳＴＯ細胞株、ＳＴＯ細胞の派生株（例えば、ネオマイシン抵抗性遺伝子発現ベクターとＬＩＦ発現ベクターを安定的に組み込んだＳＮＬ細胞など）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

フィーダー細胞による馴化に供する無血清培地には、増殖因子が含まれていてもよいが、含まれていなくてもよい。無血清培地に増殖因子が含まれるか含まれないかにかかわらず、無血清培地には、馴化を実施する際に、増殖因子を添加しなくてもよいが、無血清培地に増殖因子が含まれない場合は増殖因子を添加して馴化に供することがより好ましい。増殖因子としては、限定するものではないが、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦ−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１）、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＬＩＦ及びＩＧＦＢＰ−７からなる群から選択される１つ以上、例えばＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ−β１、を含むことが好ましい。特に好ましい増殖因子は、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ−β１である。

フィーダー細胞による培地の馴化は、増殖のためのフィーダー細胞の培養後、培養容器内の培地を上記の無血清培地に置換し、培養することにより実施することができる。フィーダー細胞の培養は、常法により行うことができる。馴化のための無血清培地での培養は、温度４〜４５℃、例えば２５〜４０℃にて、１〜７２時間、例えば８時間〜３６時間かけて行うことができる。この培養は、４〜１０％、例えば５％のＣＯ_２濃度下で行うことも好ましい。

培養容器は、細胞培養用に使用可能な容器であれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、培養ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル、中空糸培養器などが挙げられる。

以上のようにして無血清培地でフィーダー細胞を培養し、フィーダー細胞から培地中に増殖促進因子等を分泌させ、無血清培地を馴化することができる。このようにして生成される馴化培地は、常法によりフィーダー細胞から分離して回収することができる。馴化培地の回収は、濾過及び／又は遠心分離により、例えば１０００ｒｐｍで５分間遠心することにより、液体培地をフィーダー細胞と分離し、それを回収することにより行ってもよい。馴化培地の回収後、馴化のための無血清培地での培養をさらに反復して（例えば２〜１０回）行うこともできる。

馴化培地の調製手順の具体例を挙げれば、単層のＭＥＦをコンフルエントになるまで培養し、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣで処理した後、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ等の細胞剥離液により細胞を剥がし、回収したＭＥＦを、培養ディッシュ上に３〜５×１０^５細胞／６０ ｍｍディッシュの細胞密度で播種し、１〜２日培養した後に、培養ディッシュ中の培地を上記無血清培地と置換した後、２４時間毎に液体培地を回収することにより馴化培地を調製することもできる。

得られた馴化培地は、多能性幹細胞培養用培地として、特に無フィーダー無血清・無血清代替物培養に好適に用いることができる。本発明において「無フィーダー無血清・無血清代替物培養」とは、フィーダー細胞層を用いない培養（無フィーダー培養；ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）であって、血清も血清代替物も含まない培地で行う培養を意味する。増殖因子や培地成分に多能性幹細胞にとっての異種由来成分を含まない場合には、異種由来成分不含培地（ゼノフリー培地）として特に好適に用いることができる。本発明は、このような多能性幹細胞培養用の馴化培地の調製方法、及びこの方法により得られる多能性幹細胞培養用の馴化培地にも関する。

本発明では、上記のようにして生成された馴化培地を用いて、多能性幹細胞を無フィーダー培養することができる。この馴化培地の使用により、無フィーダー培養での多能性幹細胞の増殖性を格段に向上させることができる。すなわち本発明は、上記の馴化培地において多能性幹細胞を無フィーダー培養することを含む、多能性幹細胞の増殖方法にも関する。

馴化培地で培養する多能性幹細胞は、予め常法により維持培養しておくことができる。維持培養しておいた多能性幹細胞は、コラゲナーゼ溶液等の解離液で培養容器から解離し、およそ数十個、例えば２０〜５０個程度の小塊にして回収することが好ましい。維持培養においてフィーダー細胞を使用した場合には、回収した多能性幹細胞から、混入したフィーダー細胞を常法により除去することが好ましい。例えば、ＭＥＦをフィーダー細胞として維持培養した場合には、回収した多能性幹細胞をゼラチンコーティングした培養容器にてインキュベートすることでＭＥＦを培養容器に接着させ、培地に浮遊している多能性幹細胞を採取することによって、ＭＥＦを除去することができる。

このようにして調製した多能性幹細胞は、細胞の足場となる培養基質でコーティングした培養容器に播種することが好ましい。培養容器は、馴化培地の調製に関して記載したものと同様である。培養基質としては、細胞培養用に使用できるものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から産生されるマトリゲル（登録商標）、ラミニン（ラミニン−５１１、ラミニン−１１１、ラミニン−３３２等）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、Ｅ−カドヘリン、合成ペプチド、合成ポリマー等の他、ＭＥＦ又はヒト血清や脱落膜間葉系細胞由来の細胞外マトリクス（ＰＣＭ−ＣＭ）などが挙げられる。また、合成ポリマーの例として、ハイドロゲル、例えばアクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチルを基本骨格とする温度感受性ハイドロゲルも培養基質として用いることができる（Zhang et al., Nature Communications, (2013) 4, Article number: 1335）。これらの培養基質による培養容器のコーティングは、当業者には良く知られており、常法により行うことができる。例えば、培養容器に培養基質溶液（例えば、ビトロネクチン溶液）を入れて一定時間（例えば、１時間）インキュベートすることにより培養容器をコーティングすることができる。

上記の馴化培地における多能性幹細胞の培養は、限定するものではないが、好適には、２０〜４０℃、例えば３５〜４０℃にて、１時間〜７日間、例えば１〜２４時間にわたって行えばよい。馴化培地における多能性幹細胞の培養は、４〜１０％、例えば５％のＣＯ_２濃度下で行うことも好ましい。多能性幹細胞の培養は、継代を伴ってもよい。

このようにして培養された多能性幹細胞は、馴化しない培地を使用した場合と比較して、増殖性が顕著に向上する。好適な実施形態では、馴化培地で増殖させた多能性幹細胞の細胞数は、馴化しない培地を使用した場合と比較して、好ましくは１０倍以上、より好ましくは１００倍以上、さらに好ましくは２００倍以上、例えば２５０〜３００倍に増加する。この細胞数の増加は、例えば、５継代後に測定した値を基準とすることができる。またこの馴化培地で培養された多能性幹細胞は、未分化状態を維持することができる。多能性幹細胞の未分化状態は、未分化マーカー（例えば、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１、Ｏｃｔ４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＯＸ２等の遺伝子又はタンパク質）の発現によって確認することができる。

上記のようにして得られる馴化培地は、ＭＥＦ等のフィーダー細胞から分泌された、多能性幹細胞の未分化状態での増殖を促進することができる物質（多能性幹細胞に対する増殖促進因子）を含む。したがって本発明はさらに、上記のようにして得られる馴化培地を、そのような増殖促進因子を同定するために、スクリーニングに供することができる。このスクリーニングでは、上記の馴化培地中に含まれる、多能性幹細胞の増殖促進因子を検出することにより、増殖促進因子を同定することができる。すなわち本発明は、上記のように生成した馴化培地を回収し、回収した馴化培地に含まれる多能性幹細胞の増殖促進因子を検出することを含む、多能性幹細胞に対する増殖促進因子をスクリーニングする方法も提供する。ここで、多能性幹細胞に対する増殖促進因子は、タンパク質や核酸（ＲＮＡ等）であってもよいし、アミノ酸、ペプチド、及び糖鎖や、代謝産物等の低分子化合物であってもよい。

このスクリーニング方法では、回収した馴化培地を任意の方法で分離及び／又は精製し、増殖促進因子を同定することが好ましい。例えば、二次元電気泳動、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦＭＳ）、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）等の質量分析法等を用いて、増殖促進因子の分離・精製や同定を行うことができる。このような馴化培地中の成分の分析結果を、馴化前の無血清培地に用いた培地成分の分析結果と比較し、馴化培地において異なって含まれている成分を、多能性幹細胞に対する増殖促進因子の候補として検出できる。このため、スクリーニングに用いる目的では、馴化に用いる無血清培地の成分は全て既知であることが好ましい。

馴化培地に含まれる、多能性幹細胞に対する増殖促進因子の検出においては、多能性幹細胞培養用の培地における多能性幹細胞の培養系に、馴化培地から分離若しくは精製及び／又は同定された成分（特に、多能性幹細胞に対する増殖促進因子の候補である成分）を添加して培養し、その成分を非添加の系（対照）と比較して多能性幹細胞の増殖性（特に、未分化増殖）が増加したかどうかを確認してもよい。増殖性（増殖後の細胞数）が例えば１０倍以上、好ましくは１００倍以上に上昇した場合、当該成分は多能性幹細胞に対する増殖促進因子であると確認することができる。本発明のスクリーニング方法は、馴化培地中の成分について多能性幹細胞に対する増殖促進活性を検出するこのような工程を含んでもよい。多能性幹細胞の未分化状態での増殖（未分化増殖）を促進することができるかどうかは、さらに未分化マーカー（例えば、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１、Ｏｃｔ４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＯＸ２等の遺伝子又はタンパク質）の発現が維持されていることを確認することによって判定することができる。

本発明のスクリーニング方法で得られた多能性幹細胞に対する増殖促進因子は、多能性幹細胞の培養系に添加することにより、多能性幹細胞の未分化増殖の促進のために用いることができる。

本発明はまた、多能性幹細胞の培養に利用可能な無血清培地中、フィーダー細胞上で培養した多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に移行して、無フィーダー培養することを含む、多能性幹細胞の増殖方法も提供する。この多能性幹細胞の増殖方法の特に好適な実施形態では、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地を用いてフィーダー細胞上で培養した多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に移行し、無フィーダー培養する。すなわちこの方法では、フィーダー細胞による無血清培地の馴化を行いながら多能性幹細胞を維持培養し、その後、無フィーダー培養を行う。この方法によれば、無フィーダー培養における多能性幹細胞の増殖をさらに増強することができる。

この方法で用いる多能性幹細胞、フィーダー細胞、培養条件・手順等は上記と同様である。無血清培地としては、上記で馴化培地の調製に用いたのと同様の無血清培地を好適に用いることができる。

一実施形態では、多能性幹細胞を、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、アルギニン、血清及び血清代替物を含まない無血清培地を用いてフィーダー細胞上で培養した後、無フィーダー培養することにより、多能性幹細胞を高効率に増殖させることができる。この方法では例えば、マトリゲル（登録商標）、合成ポリマー等の高分子化合物を培養基質として用いて無フィーダー培養を特に好適に行うことができる。合成ポリマーの例としては、ハイドロゲル、例えばアクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチルを基本骨格とする温度感受性ハイドロゲルが挙げられる。例えば、そのような培養基質で内側をコーティングした培養ディッシュなどの培養容器を用いて、無フィーダー培養を行うことができる。フィーダー細胞上で培養した多能性幹細胞を、フィーダー細胞を除去した後に、フィーダー細胞を含まない培養容器中の培地に移して培養することにより、好適に無フィーダー培養を実施することができる。

本方法では、無フィーダー培養は、上述のようなＬ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地の馴化培地を用いて行うことができるが、馴化培地に代えて他の任意の無血清培地を用いて行ってもよい。本方法では、後者の場合でも、無フィーダー培養における多能性幹細胞の増殖（未分化増殖）を顕著に増強することができる。

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
本実施例では、以下のように、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ細胞；フィーダー細胞）上で維持培養した未分化ヒトｉＰＳ細胞を、ビトロネクチン（ＶＴＮ−Ｎ）でコーティングした培養ウェル中、フィーダー細胞の非存在下に移行し、ＭＥＦ馴化栄養培地の存在下で培養した。

１．ヒトｉＰＳ細胞の調製
ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社（日本、京都）より入手した２０１Ｂ７細胞株（Takahashi K., et al., Cell 131, 1-12 (2007)）をヒトｉＰＳ細胞（未分化ヒトｉＰＳ細胞）として使用した。ヒトｉＰＳ細胞は、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞ＭＥＦ（フィーダー細胞）を播いたプラスチック培養ディッシュの上で維持培養した。培養には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２ Ｈａｍ； Ｓｉｇｍａ Ｄ６４２１）に終濃度２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴ^ＴＭ ＳＲ（ＫｎｏｃｋＯｕｔ^ＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）； ＧＩＢＣＯ社）、０．１ ｍＭ ＮＥＡＡ（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ； 非必須アミノ酸）、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ ｎｇ／ｍｌ ヒトＦＧＦ２（塩基性ＦＧＦ又はｂＦＧＦとも称される）及び０．１ ｍＭ ２−メルカプトエタノールを添加して調製した培地を用い、３７℃にてＣＯ_２インキュベーター内で培養した（５％ＣＯ_２濃度）。継代は６〜７日毎に行った。継代の際には、解離液（コラゲナーゼ溶液）を用いて、ヒトｉＰＳ細胞のコロニーをフィーダー細胞層から解離し、ピペット操作で２０〜５０個程度の小塊にした後、新しいフィーダー細胞層の上に播いた。

以上のようにしてフィーダー細胞上で維持培養したヒトｉＰＳ細胞を、解離液で解離し、ピペット操作で２０〜５０個程度の小塊にし、３００ｒｐｍで５分間遠心することによりｉＰＳ細胞を回収した。回収したｉＰＳ細胞をゼラチンでコートした培養ディッシュ上で３０分インキュベートして、ＭＥＦ細胞をディッシュに接着させ、培地中に浮遊しているｉＰＳ細胞を回収することによりＭＥＦ細胞を除去した。続いて回収したｉＰＳ細胞を４分の１に分け（１／４分割）、ビトロネクチン（ＶＴＮ−Ｎ；Ｇｉｂｃｏ社）でコーティングされたプラスチック培養ディッシュに播種した。培養ディッシュのビトロネクチン（ＶＴＮ−Ｎ）によるコーティングは、０．５μｇ／ｃｍ^２の濃度のビトロネクチン溶液で室温にて１時間インキュベートすることにより行った。

２．馴化培地の調製
馴化培地（ＣＭ）は、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）を用いて無血清培地から調製した。マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞ＭＥＦを、ＭＥＦ用培地（１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地）中に約５００，０００ 細胞／直径６０ｍｍディッシュの細胞密度で播種した。細胞を少なくとも１６時間培養した後、ＰＢＳ（−）、次いで無血清培地で洗浄し、培地を同じ無血清培地に置換した。用いた無血清培地の組成は以下の通りである。

・無血清培地Ａ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、６４ｍｇ／Ｌ ２−リン酸アスコルビン酸マグネシウム、及び５４３ｍｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム）
・無血清培地Ａ＋ＩＴＳ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、６４ｍｇ／Ｌ ２−リン酸アスコルビン酸マグネシウム、５４３ｍｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、１％ ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン； Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））
無血清培地には、馴化前に、増殖因子として１００μｇ／Ｌ ヒトＦＧＦ２及び２μｇ／Ｌ ＴＧＦ−β１を添加した（ＦＧＦ＋ＴＧＦ添加）。並行して、増殖因子を添加しない無血清培地を用いた馴化培地の調製も行った。

培地を置換した後、２４時間ＣＯ_２インキュベーター内でインキュベートした（３７℃、５％ＣＯ_２濃度）。

２４時間培養した後の培地を回収し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、得られた液体培地（上清）をＭＥＦ馴化培地とした。

３．フィーダー細胞を使用しないｉＰＳ細胞の培養
本実施例の１．でビトロネクチン（ＶＴＮ−Ｎ）でコーティングされた培養ディッシュに播種したｉＰＳ細胞に、本実施例の２．で調製したＭＥＦ馴化培地を２ｍｌ加えた。増殖因子としてヒトＦＧＦ２及び２μｇ／Ｌ ＴＧＦ−β１を添加せずに調製したＭＥＦ馴化培地には、この段階で１００μｇ／Ｌ ヒトＦＧＦ２及び２μｇ／Ｌ ＴＧＦ−β１を添加した。ｉＰＳ細胞をＭＥＦ馴化培地で３７℃、５％ＣＯ_２濃度で５日間培養した。

培養後の細胞をアルカリフォスファターゼで染色した。染色は、培養プレート上の細胞を１０％ホルマリンで固定化した後、１ｍｌのＯｎｅ−ｓｔｅｐ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ社）を加え、室温にて遮光して３０分静置することにより行った。

図１に示すように、無血清培地Ａ＋ＩＴＳを用いて調製したＭＥＦ馴化培地においてｉＰＳ細胞の高い増殖性が認められた（図１Ａ、Ｃ）。なお、馴化後に増殖因子を加えてもｉＰＳ細胞は良好な増殖性を示した（図１Ｃ）が、増殖因子を加えた培地で調製した馴化培地を用いると、ｉＰＳ細胞の増殖性のさらなる向上が認められた（図１Ａ）。

［比較例１］
無血清培地として、無血清培地Ａ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、６４ｍｇ／Ｌ ２−リン酸アスコルビン酸マグネシウム、５４３ｍｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム）を使用し、増殖因子を加えずにＭＥＦ馴化培地を調製し、それをｉＰＳ細胞に添加して培養に用いる際に１％ ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン）、１００μｇ／Ｌ ヒトＦＧＦ２及び２μｇ／Ｌ ＴＧＦ−β１を添加したこと以外は、実施例１と同様にして無血清馴化培地でｉＰＳ細胞を培養した。

アルカリフォスファターゼ染色後の観察結果を図１Ｄに示す。ＩＴＳ及び増殖因子を含まない無血清培地Ａを用いて調製したＭＥＦ馴化培地においては、ｉＰＳ細胞培養時にＩＴＳ、ヒトＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１を添加しても、ｉＰＳ細胞の増殖はほとんど認められなかった。

［比較例２］
実施例１と同様にしてｉＰＳ細胞を調製し、ビトロネクチン（ＶＴＮ−Ｎ）でコーティングされた培養ディッシュに播種したｉＰＳ細胞に、ＭＥＦにより馴化していない無血清培地Ａ＋ＩＴＳ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、６４ｍｇ／Ｌ ２−リン酸アスコルビン酸マグネシウム、５４３ｍｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、１％ ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン； Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））を添加した。さらに１００μｇ／Ｌ ヒトＦＧＦ２及び２μｇ／Ｌ ＴＧＦ−β１を添加し、実施例１と同様にしてｉＰＳ細胞を培養した。

アルカリフォスファターゼ染色後の観察結果を図１Ｂに示す。ＭＥＦにより馴化していない、無血清培地Ａ＋ＩＴＳを用いてｉＰＳ細胞を培養した場合、増殖因子を添加しても、ｉＰＳ細胞の増殖性は低かった。

［比較例３］
無血清培地として、無血清培地Ｂ＋ＩＴＳ（ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ； 非必須アミノ酸）、１％ ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール）を使用し、増殖因子として１００μｇ／Ｌ ヒトＦＧＦ２及び２μｇ／Ｌ ＴＧＦ−β１を添加して（ＦＧＦ＋ＴＧＦ添加）馴化を行ったこと以外は、実施例１と同様にして無血清馴化培地でｉＰＳ細胞を培養した。また、ＭＥＦにより馴化していない無血清培地Ｂ＋ＩＴＳを用いて、比較例２と同様に１００μｇ／Ｌ ヒトＦＧＦ２及び２μｇ／Ｌ ＴＧＦ−β１を添加してｉＰＳ細胞を培養した実験も行った。

アルカリフォスファターゼ染色後の観察結果を図１に示す。無血清培地Ｂ＋ＩＴＳを用いて調製したＭＥＦ馴化培地においても（図１Ｅ）、ＭＥＦ細胞により馴化していない無血清培地Ｂ＋ＩＴＳにおいても（図１Ｆ）、ＭＥＦ細胞による馴化の有無にかかわらず、ｉＰＳ細胞の増殖は認められなかった。この結果から、無血清培地Ｂ＋ＩＴＳを用いて調製した馴化培地には、無血清培地Ａ＋ＩＴＳを用いて調製した馴化培地とは異なり、ｉＰＳ細胞の増殖を促進する因子は分泌されないことが示された。

［実施例２］
本実施例では、以下のように、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞ＭＥＦ（フィーダー細胞）上で維持培養した未分化ヒトｉＰＳ細胞を、マトリゲル、ビトロネクチン（ＶＴＮ−Ｎ）、又はＰＣＭ−ＤＭでコーティングした培養ウェル中、フィーダー細胞の非存在下に移行し、ＭＥＦ細胞馴化栄養培地の存在下で培養した。ＰＣＭ−ＤＭは、ヒト脱落膜由来の間葉系細胞の細胞外マトリクス（D. Kanematsu et al: Differentiation, 82, 77-88, 2011）である。

１．ヒトｉＰＳ細胞の調製
ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手した２０１Ｂ７細胞株をヒトｉＰＳ細胞（未分化ヒトｉＰＳ細胞）として使用した。ヒトｉＰＳ細胞は、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞ＭＥＦ（フィーダー細胞）を播いたプラスチック培養ディッシュの上で維持培養した。培養には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２ Ｈａｍ； Ｓｉｇｍａ Ｄ６４２１）に終濃度２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴ^ＴＭ ＳＲ（ＫｎｏｃｋＯｕｔ^ＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （ＫＳＲ）； ＧＩＢＣＯ社）、０．１ ｍＭ ＮＥＡＡ（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ； 非必須アミノ酸）、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ ｎｇ／ｍｌ ヒトＦＧＦ２（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２とも称される）及び０．１ ｍＭ ２−メルカプトエタノールを添加して調製した培地を用い、３７℃にてＣＯ_２インキュベーター内で培養した（５％ＣＯ_２濃度）。継代は６〜７日毎に行った。継代の際には、解離液（コラゲナーゼ溶液）を用いて、ヒトｉＰＳ細胞のコロニーをフィーダー細胞層から解離し、ピペット操作で２０〜５０個程度の小塊にした後、新しいフィーダー細胞層の上に播いた。

以上のようにしてフィーダー細胞上で維持培養したヒトｉＰＳ細胞を、解離液で解離し、ピペット操作で２０〜５０個程度の小塊にし、３００ｒｐｍで５分間遠心することによりｉＰＳ細胞を回収した。回収したｉＰＳ細胞をゼラチンでコートした培養ディッシュ上で３０分インキュベートして、ＭＥＦをディッシュに接着させ、培地中に浮遊しているｉＰＳ細胞を回収することによりＭＥＦを除去した。

２．馴化培地の調製
馴化培地（ＣＭ）は、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）を用いて無血清培地から調製した。マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）を、ＭＥＦ用培地（１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地）中に約５００，０００ 細胞／直径６０ｍｍディッシュの細胞密度で播種した。細胞を少なくとも１６時間培養した後、ＰＢＳ（−）、次いで１％ ＩＴＳ、１００μｇ／Ｌ ヒトＦＧＦ２及び２μｇ／Ｌ ＴＧＦ−β１を添加した無血清培地Ａ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、６４ｍｇ／Ｌ ２−リン酸アスコルビン酸マグネシウム、及び５４３ｍｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム）（基本培地Ａとも呼ぶ）で洗浄し、培地を同じ無血清培地に置換した。

培地を置換した後、２４時間ＣＯ_２インキュベーター内でインキュベートした（３７℃、５％ＣＯ_２濃度）。２４時間培養した後の培地を回収し、新鮮な培地と入れ替えることを６回まで繰り返し実施した。回収した培地は１０００ｒｐｍで５分間遠心し、得られた液体培地をＭＥＦ馴化培地（無血清培地Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ＋ＴＧＦ）とした。

３．基質コーティング培養ディッシュの調製
マトリゲルでの培養ディッシュのコーティングは、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のプロトコールに従い、マトリゲル（登録商標）（ＢＤ社）の、ＤＭＥＭ／Ｆ１２での３０倍希釈液で、室温にて１時間インキュベートすることにより実施した。

ＰＣＭ−ＤＭでコーティングされた培養ディッシュの作製は、従来の方法（D. Kanematsu et al: Differentiation, 82, 77-88, 2011）に従った。具体的には、まず、０．１％ゼラチンでコーティングしたプラスチック培養ディッシュに、ヒト脱落膜由来間葉系細胞を３．５×１０^４ 細胞／ｃｍ^２の濃度で播種し、３日間コンフルエントな状態を維持した状態で培養した。培養細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、その細胞をデオキシコール酸処理（０．５％ デオキシコール酸ナトリウム／１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．０を培養ディッシュに加えて４℃で３０分処理）することにより、細胞成分を融解した。その後、培養ディッシュに残った細胞外マトリクス成分をＰＢＳ（−）で洗浄した。

ビトロネクチン（ＶＴＮ−Ｎ）でコーティングされた培養ディッシュの作製は、実施例１と同様にして行った。

４．フィーダー細胞を使用しないｉＰＳ細胞の培養
本実施例の１．において調製及び回収しＭＥＦ細胞を除去したｉＰＳ細胞を、本実施例の３．で調製したマトリゲル、ビトロネクチン、又はＰＣＭ−ＤＭのそれぞれでコーティングされたプラスチック培養ディッシュに、４分の１に分け（１／４分割）、播種した。培地として、本実施例の２．で調製した無血清培地Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ＋ＴＧＦのＭＥＦ馴化培地を用いて、培養を行った（５％ＣＯ_２濃度、３７℃、５日間）。

並行して、本実施例の１．において調製及び回収しＭＥＦを除去したｉＰＳ細胞を、ＭＥＦで馴化していない同培地でも培養した。

アルカリフォスファターゼ染色後の観察結果を図２に示す。ＭＥＦ馴化培地を用いた培養では、マトリゲル、ビトロネクチン、及びＰＣＭ−ＤＭのいずれの培養基質でコーティングした培養ディッシュにおいても、ｉＰＳ細胞の増殖性の向上を示した。

［実施例３］
実施例２に従って調製した、マトリゲル又はＰＣＭ−ＤＭでコーティングしたプラスチック培養ディッシュを用いた、ＭＥＦにより馴化した培地（無血清培地Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ＋ＴＧＦ）及びＭＥＦにより馴化していない培地（無血清培地Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ＋ＴＧＦ）におけるｉＰＳ細胞の培養を、５継代にわたって継続した。その間の細胞増殖率を比較した結果を図３に示す。無血清培地Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ＋ＴＧＦのＭＥＦ馴化培地を用いてｉＰＳ細胞を培養した場合、馴化していない培地を用いた場合と比べて、約３００倍高い増殖効率が示された。

［実施例４］
実施例２に従って調製した、ビトロネクチンでコーティングしたプラスチック培養ディッシュを用いた、ＭＥＦにより馴化した培地（無血清培地Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ＋ＴＧＦ）及びＭＥＦにより馴化していない培地（無血清培地Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ＋ＴＧＦ）におけるｉＰＳ細胞の培養を、４継代にわたって継続した。対照として、ＭＥＦをフィーダー細胞として用いたｉＰＳ細胞の培養（オンフィーダー培養）、及びＭＥＦ−ＣＭにおけるｉＰＳ細胞の培養も行った。対照のＭＥＦ−ＣＭは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２ Ｈａｍ； Ｓｉｇｍａ Ｄ６４２１）に終濃度２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴ^ＴＭ ＳＲ（ＫｎｏｃｋＯｕｔ^ＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）； ＧＩＢＣＯ社）を添加して調製した培地において、ＭＥＦを３７℃にて５％ＣＯ_２濃度で培養した後、培地を回収することにより、調製した。

アルカリフォスファターゼ染色の結果、培養中のｉＰＳ細胞は、いずれの条件で培養した場合でもアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）陽性であり、未分化状態が保持されていることが示された。

培養後のｉＰＳ細胞をフローサイトメーターで解析した結果、未分化マーカーＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１−６０、及びＴｒａ１−８１陽性であった（図４）。このことから、上記実施例で示されたように増殖性が向上する無血清馴化培地におけるｉＰＳ細胞の培養でも、馴化しない無血清培地での培養、オンフィーダー培養、及びＭＥＦ−ＣＭでの培養と比べて未分化マーカーの発現状態は変わっておらず、細胞の性質に変化はないことが確認された。

またＲＴ−ｑＰＣＲ解析を行った結果、未分化マーカーＯｃｔ４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＯＸ２の遺伝子発現も確認できた。

このように、ＭＥＦで馴化した無血清培地においては、未分化状態を維持したまま、ｉＰＳ細胞の増殖効率を高めることができることが示された。

［実施例５］
実施例１においてＩＴＳ及び増殖因子を加えた培地で調製した馴化培地（図１Ａ）と、比較例１においてＩＴＳ及び増殖因子を含まない培地で調製した馴化培地（図１Ｄ）について、馴化しない培地をコントロールとしてそれぞれの培地中に分泌されたタンパク質の解析を二次元ゲル電気泳動により行った。まずそれぞれの培地１ｍｌからアセトン沈殿によりタンパク質を回収した。それぞれの回収したタンパク質を、膨潤バッファーに懸濁し、固定化ｐＨ勾配ゲルＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ ＩＰＧストリップ（ｐＨ３−１０、１１ｃｍ； Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に添加して等電点電気泳動装置Ｐｒｏｔｅａｎ（登録商標） ＩＥＦ ｃｅｌｌ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により５０Ｖ、２０℃で１２時間膨潤後、等電点電気泳動を行った。その後、ＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ ＩＰＧストリップをＳＤＳ−ＰＡＧＥ平衡化バッファー（２％ ＤＴＴ含有）中で１０分間、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ平衡化バッファー（２．５％ ヨードアセトアミド含有）で１０分間振盪後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を展開した。実施例１においてＩＴＳ及び増殖因子を加えた培地で調製した馴化培地では４０個、比較例１においてＩＴＳ及び増殖因子を含まない培地で調製した馴化培地では１２個のＭＥＦ由来の分泌タンパク質のスポットを検出することができた。このことから、実施例１においてＩＴＳ及び増殖因子を加えた培地で調製した馴化培地（図１Ａ）には、増殖促進に寄与するタンパク質が含まれることが示された。

［実施例６］
１．ＭＥＦ馴化培地を用いた無フィーダー培養
実施例２の「１．ヒトｉＰＳ細胞の調製」の記載に従って、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞ＭＥＦ（フィーダー細胞）上でヒトｉＰＳ細胞を培養し（オンフィーダー培養）、回収し、ＭＥＦを除去した。

このようにして調製したヒトｉＰＳ細胞を、マトリゲルでコーティングした培養ウェル中、フィーダー細胞の非存在下に移行し、各種培地を用いて培養した（無フィーダー培養）。以下の培地を用いた。

・無血清培地Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ＋ＴＧＦ（ＤＭＥＭ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ、１％ ＩＴＳ、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールに１００μｇ／Ｌ ヒトＦＧＦ２及び２μｇ／Ｌ ＴＧＦ−β１を添加したもの）（図５中、Ｅ８）
・実施例２の「２．馴化培地の調製」の記載に従って調製した、無血清培地Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ＋ＴＧＦのＭＥＦ馴化培地（図５中、Ｅ８−ＣＭ）
・実施例４の記載に従って調製したＭＥＦ−ＣＭ
・ｍＴｅＳＲ^ＴＭ１培地（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｎｎｅｉｌｌｅ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｒ １）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
対照として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に終濃度２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴ^ＴＭ ＳＲ、０．１ ｍＭ ＮＥＡＡ、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ ｎｇ／ｍｌ ヒトＦＧＦ２及び０．１ ｍＭ ２−メルカプトエタノールを添加して調製した培地中でのオンフィーダー培養のみを行う試験も実施した。（図５中、ＫＳＲ） なおマトリゲルでの培養ディッシュのコーティングは、実施例２の「３．基質コーティング培養ディッシュの調製」の記載に従って行った。

培養期間が４日間であったこと以外は、実施例２の「４．フィーダー細胞を使用しないｉＰＳ細胞の培養」に記載された手順に従って、培養及びアルカリフォスファターゼ染色を行った。

その結果を図５Ａ〜Ｅに示す。オンフィーダー培養から無フィーダー培養への移行後、無血清培地Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ＋ＴＧＦのＭＥＦ馴化培地（Ｅ８−ＣＭ）では増殖が認められたが、他の培地では増殖がほとんど認められなかった。

２．所定成分を含む培地でのオンフィーダー培養からの移行後の無フィーダー培養
培地として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に終濃度２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴ^ＴＭ ＳＲ、０．１ ｍＭ ＮＥＡＡ、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ ｎｇ／ｍｌ ヒトＦＧＦ２及び０．１ ｍＭ ２−メルカプトエタノールを添加して調製した培地に代えて、無血清培地Ａ＋ＩＴＳ＋ＦＧＦ＋ＴＧＦを使用したこと以外は、実施例２の「１．ヒトｉＰＳ細胞の調製」の記載に従ってマイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞ＭＥＦ（フィーダー細胞）上でヒトｉＰＳ細胞を培養し（オンフィーダー培養）、回収し、ＭＥＦを除去した。

このようにして調製したヒトｉＰＳ細胞を、マトリゲルでコーティングした培養ウェル中、フィーダー細胞の非存在下に移行し、本実施例の１．と同じ各種培地を用いて同様に無フィーダー培養し、アルカリフォスファターゼ染色を行った。

その結果、本実施例の１．の結果と比較して、いずれの培地を用いた無フィーダー培養においても、顕著に高い増殖性を示した。

このことから、上記無血清培地を用いてオンフィーダー培養を行った後に無フィーダー培養に移行することにより、多能性幹細胞の増殖をさらに増強できることが示された。

［実施例７］
アクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチルを基本骨格とする温度感受性ハイドロゲルでコートした培養ディッシュを作製した（Zhang et al., Nature Communications, (2013) 4, Article number: 1335）。具体的には、Ｎ−メチル−２−ピロリドン中に、Ｎ−アクリロイル−Ｎ’−プロピルピペラジン、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）モノアクリルアミド、架橋剤及び光重合開始剤を溶解した混合溶液を、３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートで予め処理したプラスチック培養ディッシュに添加し、３６５ｎｍのＵＶ光を３０分照射した後、５０℃で一晩放置した。その後、エタノール、アセトンで順次洗浄し、風乾した。

このようにして作製したハイドロゲルコート培養ディッシュを、マトリゲルコート培養ディッシュの代わりに用いて、実施例６の２．の記載に従って、ヒトｉＰＳ細胞についてオンフィーダー培養とその後の各種培地を用いた無フィーダー培養を行った。その結果、いずれの培地においても、ｉＰＳ細胞は高い増殖性を示した。

本発明は、多能性幹細胞の無フィーダー無血清培養に好適に利用できる。本発明はまた、安全性の高い多能性幹細胞の増殖を容易にする増殖促進因子を含む、ヒト多能性幹細胞の培養を行うための無血清培地、例えば無血清の完全合成培地、を調製するために用いることができる。そのような培地を用いることにより、ヒト多能性幹細胞の無フィーダー培養を安定に効率良く実施することが可能になる。また、本発明によれば、ＭＥＦ等のフィーダー細胞から分泌される増殖促進因子の単離を可能にする培地を得ることができる。そのような培地は、ヒト多能性幹細胞の増殖に有用な因子をスクリーニングするために用いることができる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体が引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (15)

1. 多能性幹細胞に対する増殖促進因子をスクリーニングする方法であって、
   ａ）Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地において、フィーダー細胞を培養し、生成した馴化培地を回収する工程、及び
   ｂ）回収した馴化培地に含まれる、多能性幹細胞に対する増殖促進因子を検出する工程、
   を含む方法。
2. 前記無血清培地が、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含む、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、請求項１に記載の方法。
3. フィーダー細胞の培養を、前記無血清培地に増殖因子を添加して行う、請求項１に記載の方法。
4. 増殖因子がＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ−β１である、請求項３に記載の方法。
5. フィーダー細胞が、マウス胎児線維芽細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 多能性幹細胞がＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地でフィーダー細胞を培養することにより生成された馴化培地において、多能性幹細胞を無フィーダー培養することを含む、多能性幹細胞の増殖方法。
8. 前記無血清培地が、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含む、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、請求項７に記載の方法。
9. フィーダー細胞の培養を、前記無血清培地に増殖因子を添加して行う、請求項７又は８に記載の方法。
10. フィーダー細胞の培養を、前記無血清培地に増殖因子を添加せずに行い、かつ、多能性幹細胞の無フィーダー培養を、前記馴化培地に増殖因子を添加して行う、請求項７又は８に記載の方法。
11. 増殖因子がＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ−β１である、請求項９又は１０に記載の方法。
12. フィーダー細胞が、マウス胎児線維芽細胞である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 多能性幹細胞がＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地を用いてフィーダー細胞上で培養した多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に移行して無フィーダー培養することを含む、多能性幹細胞の増殖方法。
15. 前記無血清培地がアルブミンを含まない、請求項１４に記載の方法。

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