[go: up one dir, main page]

JP6313203B2 - Ａｌｕ−ｒｎａ誘導変性からの細胞の保護及び細胞保護用阻害剤 - Google Patents

Ａｌｕ−ｒｎａ誘導変性からの細胞の保護及び細胞保護用阻害剤 Download PDF

Info

Publication number
JP6313203B2
JP6313203B2 JP2014521695A JP2014521695A JP6313203B2 JP 6313203 B2 JP6313203 B2 JP 6313203B2 JP 2014521695 A JP2014521695 A JP 2014521695A JP 2014521695 A JP2014521695 A JP 2014521695A JP 6313203 B2 JP6313203 B2 JP 6313203B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
myd88
rpe
caspase
cell
inhibitor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2014521695A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2014528700A (ja
JP2014528700A5 (ja
Inventor
アンバティ，ジャヤクリシュナ
タラッロ，ヴァレリア
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Kentucky Research Foundation
Original Assignee
University of Kentucky Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Kentucky Research Foundation filed Critical University of Kentucky Research Foundation
Publication of JP2014528700A publication Critical patent/JP2014528700A/ja
Publication of JP2014528700A5 publication Critical patent/JP2014528700A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6313203B2 publication Critical patent/JP6313203B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)

Description

ジャヤクリシュナ アンバティ(ケンタッキー、レキシントン；アメリカ国籍)；及び
ヴァレリア タラッロ(ケンタッキー、レキシントン；イタリア国籍)
譲受人：ユニバーシティー オブ ケンタッキー リサーチ ファウンデイション
代理人整理番号：13177N/1790WO
関連出願
本出願は、2011年７月18日出願の米国仮出願第61/508,867号及び2011年10月４日出願の米国仮出願第61/543,038号(この参照により、これら出願の開示全体が本明細書中に組み込まれる)の優先権を主張する。

政府の権益
本発明は、米国国立衛生研究所の国立眼研究所により認められた政府補助R01EY018350、R01EY018836、R01EY020672、R01EY022238、R21EY019778、RC1EY020442の下でなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
技術分野
本願開示の主題は、インフラマソーム、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、カスパーゼ-８及びNFκBの阻害；インフラマソーム、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、カスパーゼ-８及びNFκBの阻害剤、細胞の保護方法、並びに阻害剤を同定するスクリーニング法に関する。
はじめに
加齢性黄斑変性(AMD)(これは先進工業国ではガンと同程度に蔓延している)は、世界中で失明の主原因である。血管新生型AMD(この疾患に対しては多くの認可された治療法が存在する)とは対照的に、遥かにより一般的な萎縮型AMDは十分に解明されておらず、有効な臨床的介入が存在しない。網膜色素上皮(RPE)の広範な萎縮は、重篤な視力喪失に至り、地図状萎縮と名付けられており、その病因は不明である。地図状萎縮は、世界中で数百万人の人々に失明を引き起こし、現時点で認可された治療法が存在しない。
本発明者らは、地図状萎縮を有するヒト眼の網膜色素上皮(RPE)におけるRNase DICER1の劇的な低下を示した(Kanekoら，Nature 2011；この参照により本明細書中に組み込まれる)。本発明者らはまた、DICER1欠損がAlu RNA転写物の蓄積を導き、この転写物が地図状萎縮を有するヒト眼のRPE中でも観察されることを証明した。これらAlu RNA転写物は、ヒトRPE細胞の細胞死及びマウスにおけるRPE変性を誘導する。Alu転写物の細胞毒性の正確な機序は不明である。
本明細書で説明するように、本発明者らは、今や、DICER1欠損又はAlu RNA曝露がNLRP3インフラマソームを活性化し、マウスのRPEとヒト及びマウスRPE細胞との両方で、IL-18を介するtoll様レセプター非依存性MyD88シグナル伝達を誘引することを見出した。
要旨
本願開示の主題は、本明細書で提供される情報を学んだ後に当業者に明らかとなるように、上記のニーズの幾つか又は全てを満たす。
この「要旨」は、本願開示の主題の幾つかの実施形態を記載し、多くの場合で、これら実施形態の変形物及び入替物を挙げる。この「要旨」は、単に、多くの多様な実施形態の例示に過ぎない。所与の実施形態の１以上の代表的特徴の言及も同様に例示である。このような実施形態は、典型的には、言及した特徴を有していることもあれば有していないこともある；同様に、これら特徴は、本願開示の主題の他の実施形態(この「要旨」で挙げられていてもいなくても)にあてはまる。過度の繰返しを避けるために、この「要旨」は、この特徴の可能な組合せの全てを列挙せず、示唆もしない。
本願開示の主題は、MyD88阻害剤を同定する方法、MyD88を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、インフラマソーム阻害剤を同定する方法、インフラマソームを阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、インフラマソームの１つの構成要素の阻害剤を同定する方法、インフラマソームの構成要素を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。インフラマソームの構成要素としては、例えば、NLRP3、PYCARD及びカスパーゼ-１が挙げられる。本願開示の主題は、IL-18阻害剤を同定する方法、IL-18を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、VDAC1又はVDAC2阻害剤を同定する方法、VDAC1又はVDAC2を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、カスパーゼ-８阻害剤を同定する方法、カスパーゼ-８を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、NFkB阻害剤を同定する方法、NFkBを阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。対象者の眼において活性化カスパーゼ-１を画像化する方法及び組成物もまた提供する。
本願開示の主題は、細胞のインフラマソーム、MyD88及びIL-18の１以上を阻害することを含む方法を包含する。幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のMyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、NFκB、カスパーゼ-８、カスパーゼ-１、NLRP-3、PYCARD及びインフラマソーム(インフラマソームの１つの構成要素(例えば、カスパーゼ１、NLRP-3、PYCARD)を含む)の１以上を阻害することを含む方法を包含する。幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、NFκB、カスパーゼ-８、カスパーゼ-１、NLRP-3、PYCARD及びインフラマソーム(インフラマソームの１つの構成要素(例えば、カスパーゼ１、NLRP-3、PYCARD)を含む)の阻害剤から選択される１以上の阻害剤を投与することを含む方法を包含する。
本方法の幾つかの実施形態では、細胞は、RPE細胞、網膜光受容器細胞又は脈絡叢細胞から選択される。幾つかの実施形態では、細胞はRPE細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、興味対象の病状を有しているか、有していると疑われるか又は有するリスクにある対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、加齢性黄斑変性を有しているか、有していると疑われるか又は有するリスクにある細胞は対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、地図状萎縮を有しているか、有していると疑われるか又は有するリスクにある対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、地図状萎縮を有しているか、有していると疑われるか又は有するリスクにある対象者の細胞であり、細胞はRPE細胞である。幾つかの実施形態では、加齢性黄斑変性を有する対象者は、本明細書に記載の方法及び組成物を用いて治療され得る。本方法の幾つかの実施形態では、細胞は、Alu-RNA誘導変性に対して保護される。
Alu RNAは、toll様レセプター(TLR)を介して活性化せず、機能もしない。(Ａ〜Ｅ)pAluは、WT(Ａ)、Tlr3-/-(Ｂ)、Tlr7-/-(Ｃ)、Unc93b1 mtマウス(TLR-3、7、9が機能的に欠損している)(Ｄ)、及びTlr4-/-マウス(Ｅ)においてRPE変性を誘導するが、pNullは誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；閉鎖帯-１(ZO-1)について染色(赤色)した平面マウント、下列。変性は青色矢頭で輪郭を示す。スケールバー、20μm。(Ｆ)２つの異なるAlu RNA配列のいずれかでの、種々のTLRを発現するHEK293細胞株の刺激は、NF-κB活性化を誘発しない。TLR-特異的リガンドを用いるポジティブ(＋)コントロールは、NF-κBを活性化した。ｎ=３。データは平均±SEMとして表す。図８も参照。 Alu RNAはMyD88を介してRPE変性を誘導する。(Ａ)pAluはMyd88-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。(Ｂ)WTマウスにおけるpAlu誘導RPE変性は、MyD88ホモ二量体化ペプチド阻害剤(MyD88i)により阻害されるが、コントロールペプチドによっては阻害されない。(Ｃ)WTマウスにおけるpAlu誘導RPE変性は、コレステロール-接合Myd88 siRNAにより阻害されるが、コントロールsiRNAによっては阻害されない。(Ｄ及びＥ)MyD88を標的するsiRNA(siMyD88)は、コントロールsiRNAと比較して、マウスRPE細胞における標的遺伝子(Ｄ)及びタンパク質(Ｅ)の量を低下させる。ｎ=３、* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)。(Ｆ)pAluはMyd88ヘテロ接合型(het)マウスにおいてRPE変性を誘導しない。(Ｇ)ヒトRPE細胞におけるAlu RNA誘導IRAK1及びIRAK4リン酸化のウェスタンブロット。３つの実験の代表的画像。(Ｈ)pAluはWTの細胞生存能を低下させるが、Myd88-/-マウスRPE細胞の細胞生存能を低下させない。(Ｉ)pAluにより誘導されるヒトRPE細胞生存能の喪失は、MyD88iにより回復される。(Ｊ)AAV1-BEST1-Creは、pAlu誘導RPE変性からMyd88f/fマウスを保護するが、AAV1-BEST1-GFPは保護しない。(Ｋ)pAluは、ELISAにより測定した、ヒトRPE細胞からのIL-18分泌を誘導する。IL-1β分泌は辛うじて検出可能である。ｎ=３、* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)。(Ｌ)組換えIL-18はWTにおいてRPE変性を誘導するが、Myd88-/-マウスにおいては誘導しない。(Ｍ及びＮ)WTマウスにおけるpAlu誘導RPE変性はIL-18中和抗体により回復する(Ｎ)が、IL-1β中和抗体によっては回復しない(Ｍ)。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。変性は青色矢頭で輪郭を示す。スケールバー、20μm(Ａ〜Ｃ、Ｆ、Ｊ、Ｌ〜Ｎ)。ｎ=３、* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)。データは平均±SEMとして表す(Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ)。図９も参照。 Alu RNAはNLRP3インフラマソームを介してRPE変性を誘導する。(Ａ)ヒトRPE細胞におけるAlu RNAによるカスパーゼ-１活性化(p20サブユニット)のウェスタンブロット。(Ｂ)カスパーゼ-１ペプチド阻害剤で障害された野生型マウスにおけるRPE細胞溶解物中でのpAlu誘導IL-18成熟のウェスタンブロット。(Ｃ)カスパーゼ-１ペプチド阻害剤はpAlu誘導RPE変性からWTマウスを保護する。(Ｄ及びＥ)pAluはCasp1-/-マウスにおけるRPE変性も、(Ｅ)Casp1-/-マウスRPE細胞における細胞毒性も誘導しない。(Ｆ)Alu RNA及びLPS＋ATPは、GFP-PYCARDでトランスフェクトしたヒトRPE細胞におけるPYCARDクラスターの形成を誘導する。(Ｇ及びＨ)pAluは、Nlrp3-/-マウス(Ｇ)においてもPycard-/-マウス(Ｈ)においてもRPE変性を誘導しない。(Ｉ)Nlrp3-/-マウスRPE細胞及びPycard-/-マウスRPE細胞は、pAlu誘導性細胞生存能喪失に対して保護される。(Ｊ)NLRP3又はPYCARDを標的するsiRNAは、コントロールsiRNAと比較して、pAlu誘導細胞毒性からヒトRPE細胞を救った。ｎ=３〜４、* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)(Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｊ)。３つの実験の代表的画像。ビンキュリンに対して規格化したデンシトメトリー値を括弧内に示す(Ａ、Ｂ)。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。変性は青色矢頭で輪郭を示す。ｎ=８〜12。スケールバー、20μm(Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ)。代表的画像を示す。図11も参照。 Alu RNAはミトコンドリアROS産生及びNLRP3プライミングを誘導する。(Ａ)pAluはWTマウスRPE細胞及びMyd88-/-マウスRPE細胞においてNLRP3 mRNA及びIL18 mRNAを誘導する。(Ｂ)pAluは、蛍光プローブH2DCFDA(A.U、任意単位)でモニターされるように、ヒトRPE細胞において反応性酸素種(ROS)の生成を誘導する。(Ｃ)DPIはヒトRPE細胞においてpAlu誘導NLRP3 mRNA及びIL18 mRNAをブロックする。(Ｄ)DPIはWTマウスをpAlu誘導RPE変性から保護する。(Ｅ)pAluは、MitoSOX Redの蛍光(緑擬似カラー)により検出されるように、ヒトRPE細胞におけるミトコンドリア反応性酸素種の生成(MitoTracker Deep Red(赤色)で標識される呼吸性ミトコンドリアと共局在する)を誘導する。(Ｆ)PMAは、ヒトRPE細胞において蛍光Fc OXYBURST Greenアッセイ(A.U、任意単位)により評価されるように、ファゴソームROS生成を誘導するが、pAluは誘導しない。(Ｇ)MitoTempo及びMitoQは、WTマウスにおいてAlu RNA誘導RPE変性を予防するが、ビヒクルもdTPPコントロールも予防しない。(Ｈ)NADPHオキシダーゼ阻害剤gp91ds-tat又はスクランブルペプチドは、WTマウスにおけるAlu RNA誘導RPE変性を予防しない。(Ｉ)Alu RNAは、Cybb(NADPHオキシダーゼのgp91phoxサブユニットをコードする)が欠損したRPE変性マウスを誘導する。(Ｊ及びＫ)VDAC1及びVDAC2をそれぞれ標的するsiRNAは、ヒトRPE細胞において、pAlu誘導mROS生成(Ｊ)並びにNLRP3 mRNA及びIL18 mRNAのアップレギュレーション(Ｋ)を予防するが、VDAC3もスクランブルコントロールも予防しない。mROSはMitoSox Red色素で可視化し、細胞核はHoechst染色で可視化した。ｎ=３〜４。* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)(Ａ〜Ｃ、Ｋ)。NS、スチューデントｔ検定により有意差なし(Ｆ)。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。ZO-1染色(赤色)平面マウント。スケールバー、20μm(Ｄ、Ｅ、Ｇ〜Ｉ)。ｎ=３〜４。スケールバー、100μm(Ｊ)。図11も参照。 RPE変性は、パイロプトーシス(pyroptosis)を介して起きない。(Ａ及びＢ)グリシンは、LPS＋ATPにより誘導されるヒトRPE細胞死を阻害する(Ａ)が、pAluにより誘導されるものは阻害しない(Ｂ)。(Ｃ)組換えIL-18はCasp1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導する。ｎ=３〜４(Ａ、Ｂ)。* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。変性は青色矢頭で輪郭を示す。スケールバー、20μm(Ｃ)。 DICER1喪失はインフラマソームを介する細胞死を誘導する。(Ａ)ヒトRPE細胞においてDICER1過剰発現により阻害されたAlu RNA誘導カスパーゼ-１切断(p20)のウェスタンブロット。(Ｂ及びＣ)DICER1過剰発現は、ヒトRPE細胞におけるAlu RNA誘導カスパーゼ-１活性化を低下させる(Caspalux(登録商標)1蛍光基質の切断(Ｂ左パネル、緑色)により測定)。蛍光定量を右パネルに示す。(Ｃ)BEST1-Creマウス又はDicer1f/fマウスと比較したBEST1-Cre;Dicer1f/fマウスのRPE細胞溶解物における増大したカスパーゼ-１活性化(p20サブユニット)のウェスタンブロット；(Ｄ)AAV1-BEST1-Creで処置したDicer1f/fマウスのRPE細胞溶解物における増大したカスパーゼ-１活性化(p20サブユニット)及びIL-18成熟のウェスタンブロット。(Ｅ及びＦ)Dicer1f/fマウスにおいてAAV1-BEST1-Creにより誘導されたRPE変性は、カスパーゼ-１(Ｅ)又はMyD88(Ｆ)にいずれのペプチド阻害剤によっても回復される。(Ｇ)MyD88阻害剤は、DICER1アンチセンス(AS)処置により誘導されるヒトRPE細胞生存能の喪失を回復させる。(Ｈ)ヒトRPE細胞のDICER1アンチセンス(AS)処置は、DICER1を低下させ、IRAK1及びIRAK4のリン酸化を増大させる。(Ｉ)MyD88阻害剤は、Creリコンビナーゼ(Ad-Cre)をコードするアデノウイルスベクターで処置したDicer1f/fマウスRPE細胞において細胞生存能の喪失を回復させる。(Ｊ)Ad-Creは、Dicer1f/fマウスRPE細胞において、Ad-Nullと比較して、グローバルなmiRNA発現欠損を誘導した。MyD88阻害剤処置Dicer1涸渇細胞とコントロールペプチド処置Dicer1涸渇細胞との間でmiRNA量に有意差なし。ｎ=３(Ａ、Ｂ、Ｆ〜Ｈ)。ビンキュリンに対して規格化したデンシトメトリー値を括弧内に示す(Ａ、Ｃ)。変性は青色矢頭で輪郭を示す。ｎ=８(Ｅ、Ｆ)。* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)(Ｇ、Ｉ)。３つの実験の代表的画像(Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ)。図12もまた参照。 ヒトGAにおけるNLRP3インフラマソーム及びMyD88の活性化。(Ａ)NLRP3量及びIL18量は、正常な年齢適合コントロール(ｎ=12)と比較して、黄斑性GA RPE(ｎ=13)において有意に上昇した。* ｐ<0.05(マンホイットニーＵ検定による)。IL1B量に群間で有意差なし(ｐ=0.32(マンホイットニーＵ検定による))。(Ｂ〜Ｄ)黄斑性GA RPEにおける、NLRP3(Ｂ)、PYCARD(Ｃ)及びカスパーゼ-１(Ｄ)の、年齢適合正常コントロールと比較して増大したイムノ局在化。スケールバー、20μm。(Ｅ)個々のヒトドナー眼からの黄斑性RPE溶解物のウェスタンブロットは、NLRP3、PYCARD及びリン酸化IRAK1/4の量(ハウスキーピングタンパク質ビンキュリンレベルに対して規格化)が、地図状萎縮(GA)において、年齢適合正常コントロールと比較して低下していることを示す。データは平均±SEMとして表す(Ａ)。代表的画像を示す。ｎ=６(Ｂ〜Ｅ)。図13も参照。 Alu RNAは幾つかのRNAセンサーを活性化しない。(Ａ及びＢ)p7SL(7SL発現ベクター)(Ａ)及びインビトロ合成7SL RNA(Ｂ)は野生型マウスにおいてRPE変性を誘導しない。(Ｃ)野生型マウスにおいてpAluの網膜下注射により誘導されたRPE変性は、TLR4アンタゴニストにより遮断されない。（Ｄ〜Ｅ)Mda5欠損マウス(Ｄ)又はPrkr欠損マウス(Ｅ)は、pAlu誘導RPE変性に感受性である。(Ｆ)脱リン酸化(Dep)Alu RNAは、Alu RNAと同様に、野生型マウスにおいてRPE変性を誘導する。(Ｇ)Mavs欠損マウスは、pAlu誘導RPE変性に感受性である。pNullは、いずれの系統のマウスにおいてもRPE変性を誘導しない。変性は青色矢頭で輪郭を示す。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)RPE平面マウント、下列。ｎ=８(Ａ〜Ｇ)。(Ｈ)Alu RNAにより活性化されない先天免疫経路の概略図。 Alu RNAは、TRIFでもIFNγでもなくMyD88を介してRPE変性を誘導する。(Ａ)pAluの網膜下投与はTicam1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導する。(Ｂ)Alu RNAはMyd88-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。(Ｃ)異なるAlu発現プラスミド(pAlu(2))の網膜下投与もまた、野生型マウスにおいてRPE変性を誘導するが、Myd88-/-マウスにおいては誘導しない。(Ｄ)Alu RNAは、Myd88+/-ヘテロ接合型(het)マウスにおいてRPE変性を誘導しない。(Ｅ)MyD88阻害性ペプチドは、(ビンキュリン発現に対して規格化した)IRAK1/4のAlu RNA誘導リン酸化を回復させる。(Ｆ)AAV1-BEST1-Creの網膜下注射は、Myd88f/fマウスをAlu RNA誘導RPE変性から保護するが、AAV1-BEST1-GFPの網膜下注射は保護しない。(Ｇ)pAlu及びAlu RNAは、Myd88-/-骨髄を移植された野生型マウス(Myd88-/-→野生型)においてRPE変性を誘導するが、野生型骨髄を移植されたMyd88-/-マウス(野生型→Myd88-/-)においては誘導しなかった。(Ｈ〜Ｋ)pAluの網膜下投与は、Ifng-/-マウス(Ｈ)、Ifngr1-/-マウス(Ｉ)及びIl1r1-/-マウス(Ｊ)においてRPE変性を誘導するが、Il18r1-/-マウス(Ｋ)においては誘導しない。pNull投与は、いずれの系統のマウスにおいてもRPE変性を誘導しない。変性は青色矢頭で輪郭を示す。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)RPE平面マウント、下列。ｎ=８(Ａ〜Ｄ、Ｆ〜Ｋ)。 Alu RNAは、NLRP3インフラマソーム活性化を介してRPE変性を誘導する。(Ａ)Alu RNA又はLPS＋ATPは、Caspalux(登録商標)1(蛍光連結ペプチド基質)の、擬処置と比較して増大した切断により評価されるように(緑色、左パネル)、ヒトRPE細胞においてカスパーゼ-１の活性化を誘導する。蛍光の定量を右パネルに示す。(Ｂ)ビンキュリン発現に対して規格化した、THP-1細胞及びHeLa細胞におけるAlu RNA誘導カスパーゼ-１活性化(p20サブユニット)のウェスタンブロット。(Ｃ)カスパーゼ-１阻害剤ペプチドは、ヒトRPE細胞においてAlu RNA誘導基質切断をブロックする。ｎ=３。(Ｄ)Alu RNAの網膜下注射は、Casp1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。(Ｅ)Alu RNA又はLPS＋ATPは、ヒトRPE細胞の細胞質中で視認可能なGFP-PYCARDの高輝度蛍光クラスターの出現を誘導する。囲み領域を高倍率で示す。３つの実験の代表的画像。(Ｆ及びＧ)Alu RNAの網膜下注射は、Nlrp3-/-マウス(Ｆ)でもPycard-/-マウス(Ｇ)でもRPE変性を誘導しない。(Ｈ)NLRP3発現ベクターでトランスフェクトしたHEK293細胞中のNLRP3量及びヒトRPE細胞中のPYCARD量は、これら遺伝子を標的するsiRNAのトランスフェクションにより、コントロール(Ctrl)siRNAと比較して低下する。ｎ=３、* ｐ<0.05(Ctrl siRNAとの比較；スチューデントｔ検定による)。(Ｉ)ヒトRPE細胞におけるAlu RNA誘導カスパーゼ-１活性化(p20サブユニット)はMyD88阻害性ペプチドにより影響されない(ビンキュリン発現に対して規格化)。(Ｊ)MyD88阻害性ペプチドは、ヒトRPE細胞において、カスパーゼ-１のAlu RNA誘導切断活性を低下させない(上パネル)。蛍光定量(下パネル)。(Ｋ)網膜下pAlu投与を処置した野生型マウスのRPE細胞溶解物におけるカスパーゼ-１活性化(p20サブユニット)は、抗IL-18中和抗体の硝子体内投与により障害されない。(Ｌ)IRAK1/4のAlu RNA誘導リン酸化は、ヒトRPE細胞においてカスパーゼ-１阻害性ペプチドにより低下する(ビンキュリン発現に対して規格化)。ビヒクルコントロール注射もまたRPEを障害しない。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)RPE平面マウント、下列。ｎ=８(Ｄ、Ｆ、Ｇ)。３つの実験の代表的画像(Ａ、Ｂ、Ｉ、Ｊ〜Ｌ)。 NLRP3はAlu RNAと物理的に相互作用せず、VDACはsiRNAによりノックダウンする。(Ａ)pAlu及びpNLRP3-FLAGでトランスフェクトしたヒトRPE細胞におけるRNA結合性タンパク質免疫沈降(RIP)アッセイ。タンパク質-RNA複合体のNLRP3又はFLAGに対する抗体での免疫沈降は、NLRP3とAlu RNAと相互作用を明らかにしなかった。等量の細胞溶解物(IPに供していない)から単離したRNAをAlu PCR用のインプットとして使用した。免疫沈降物中のAlu RNAの相対量(Alu特異的プライマーを用いるリアルタイムRT-PCRにより評価)を、コントロールIgG免疫沈降で得られたレベルに対して規格化した。Ｎ=３。(Ｂ)ヒトRPE細胞におけるVDAC1、VDAC2及びVDAC3 mRNAの量は、これら遺伝子を標的するsiRNAのトランスフェクションにより、コントロール(Lucを標的する)siRNAと比較して低下する。Ｎ=３。* ｐ<0.05(コントロールsiRNAとの比較；スチューデントｔ検定による)。 DICER1は、Alu RNAによるカスパーゼ-１活性化のネガティブレギュレーターである。(Ａ)ヒトRPE細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AS)によるDICER1のノックダウンは、Caspalux(基質切断の蛍光(重ね合わせで緑色)レポーター)によりモニターするとき、コントロールAS処置と比較して、カスパーゼ-１の切断活性を増大させる。(Ｂ)AS処理によるAlu RNAの阻害は、DICER1 ASで処理したヒトRPE細胞においてCaspalux蛍光を低下させる。Caspalux蛍光の平均値を括弧内に示す。３つの実験の代表的画像。 RPE変性及び地図状萎縮に至るDICER1欠損誘導Alu RNAによるNLRP3インフラマソーム活性化の提案モデルの概略図。Alu RNAは、反応性酸素種(ROS)の生成を介してNLRP3及びIL18 mRNAのプライミングを誘導する。NLRP3インフラマソームの活性化は、活性化カスパーゼ-１によるプロIL-18の切断を誘引してIL-18を成熟させる。、IL-18は、MyD88を介して、IRAK1及びIRAK4をリン酸化するようシグナルを送る(リン酸化はRPE細胞死を導く)。 カスパーゼ-８阻害剤の硝子体内投与は、野生型マウスをpAlu誘導RPE変性から保護する。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。 カスパーゼ-８阻害剤はヒトRPE細胞をAlu誘導細胞毒性から保護する。カスパーゼ-８阻害性ペプチドZ-IETD-FMK(100μM)はヒトRPE細胞をAlu RNA誘導細胞毒性から保護するが、コントロールペプチドZ-FA-FMK(100μM)は保護しない。 カスパーゼ-８阻害剤はヒトRPE細胞をpAlu誘導細胞毒性から保護する。カスパーゼ-８阻害性ペプチドZ-IETD-FMK(100μM)はヒトRPE細胞をpAlu誘導細胞毒性から保護するが、コントロールペプチドZ-FA-FMK(100μM)は保護しない。 IL-18はカスパーゼ-８活性化を誘導した。野生型マウスにおけるIL-18の網膜下注射は、蛍光定量プレートアッセイによりモニターするとき、カスパーゼ-８の活性化を誘導した。 pAluはCD95-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。 Alu RNAはCD95-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。 組換えIL-18はCD95-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。 pAluはFaslgマウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。 Alu RNAはFaslgマウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。 組換えIL-18は、FaslgマウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。 Alu RNAはNfkb1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。 Alu RNA又はビヒクル(PBS)を野生型マウスの僚眼の網膜下腔中に注射した。３日後、DyeLight782-VAD-FMK3を両眼の硝子体液中に注射した。24時間後、RPE平面マウント標本を蛍光顕微鏡下で可視化し、生物活性カスパーゼ(緑色蛍光)の領域を可視化した。この領域はAlu RNA注射領域に対応する。 Alu RNA又はビヒクル(PBS)を２匹の野生型マウスの僚眼の網膜下腔中に注射した(左パネル及び右パネル)。３日後、DyeLight782-VAD-FMK3を両眼の硝子体液中に注射した。ベースライン(０時間)からその後８時間まで、Topcon 50IXカメラのICGフィルターを通して眼底(網膜)の写真を撮影した。Alu RNAを注射した眼では、生物活性カスパーゼの生成に対応する白色蛍光領域がAlu RNA注射領域に観察された。ビヒクルを注射した眼では、そのような広範な領域は観察されなかった。 組換えIL-18又はビヒクル(PBS)を野生型マウスの僚眼の網膜下腔中に注射した。２日後、DyeLight782-VAD-FMK3を両眼の硝子体液中に注射した。ベースライン(０時間)からその後24時間まで、Topcon 50IXカメラのICGフィルターを通して眼底(網膜)の写真を撮影した。IL-18を注射した眼では、生物活性カスパーゼの生成に対応する白色蛍光領域がIL-18注射領域に観察された。ビヒクルを注射した眼では、そのような広範な領域は観察されなかった。
配列表の簡単な説明
配列番号１ IMG-2005-1ペプチド配列：DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT。ここで、最後の７アミノ酸はMyD88ホモ二量体化の阻害に必要であり、先行するアミノ酸配列は、阻害性ペプチドの細胞進入を可能にするアンテナペディア細胞透過配列であり、その結果、これはMyD88をブロックすることができる。
配列番号２ コントロールペプチド配列：DRQIKIWFQNRRMKWKK
配列番号３ MyD88 siRNA #1センス：5'-GAGAAGCCUUUACAGGUdTdT-3'
配列番号４ MyD88 siRNA #1アンチセンス：5'-ACCUGUAAAGGCUUCUCdTdT-3'
配列番号５ MyD88 siRNA #2センス：5'-CAGAGCAAGGAAUGUGAdTdT-3'
配列番号６ MyD88 siRNA #2アンチセンス：5'-UCACAUUCCUUGCUCUGdTdT-3'
配列番号７：NLRP3 siRNA - 5'-GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT-3'
配列番号８：NLRP3 siRNA - 5'-GGAUCAAACUACUCUGUGA-3'
配列番号９：NLRP3 siRNA - 5'-UGCAAGAUCUCUCAGCAAA-3'
配列番号10：NLRP3 siRNA - 5'-GAAGUGGGGUUCAGAUAAU-3'
配列番号11：NLRP3 siRNA - 5'-GCAAGACCAAGACGUGUGA-3'
配列番号12：PYCARD siRNA - 5'-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3'
配列番号13：PYCARD siRNA - 5'-GGCUGCUGGAUGCUCUGUACGGGAA-3'
配列番号14：PYCARD siRNA - 5'-UUCCCGUACAGAGCAUCCAGCAGCC-3'
配列番号15：ヒトピリンコーディング配列のsiRNA：GCTGGAGCAGGTGTACTACTTC
配列番号16：ヒトNLRP3コーディング配列のsiRNA：CAGGTTTGACTATCTGTTCT
配列番号17：ヒトカスパーゼ-１の3'UTRのsiRNA：GTGAAGAGATCCTTCTGTA
配列番号18：ヒトIL1B用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3'
配列番号19：ヒトIL1B用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-GCGAATGACAGAGGGTTTCTTAG-3'
配列番号20：ヒトIL18用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-ATCACTTGCACTCCGGAGGTA-3'
配列番号21：ヒトIL18用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-AGAGCGCAATGGTGCAATC-3'
配列番号22：ヒトNLRP3用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-GCACCTGTTGTGCAATCTGAA-3'
配列番号23：ヒトNLRP3用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-TCCTGACAACATGCTGATGTGA-3'
配列番号24：ヒトPYCARD用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-GCCAGGCCTGCACTTTATAGA-3'
配列番号25：ヒトPYCARD用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-GTTTGTGACCCTCGCGATAAG-3'
配列番号26：ヒトVDAC1用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-ACTGCAAAATCCCGAGTGAC-3'
配列番号27：ヒトVDAC1用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-CTGTCCAGGCAAGATTGACA-3'
配列番号28：ヒトVDAC2用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-CAGTGCCAAATCAAAGCTGA-3'
配列番号29：ヒトVDAC2用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-CCTGATGTCCAAGCAAGGTT-3')
配列番号30：ヒトVDAC3用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-TTGACACAGCCAAATCCAAA-3'
配列番号31：ヒトVDAC3用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-GCCAAAACGGGTGTTGTTAC-3'
配列番号32：ヒト18S rRNA用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3'
配列番号33：ヒト18S rRNA用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3'
配列番号34：マウスMyd88用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-CACCTGTGTCTGGTCCATTG-3'
配列番号35：マウスMyd88用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-AGGCTGAGTGCAAACTTGGT-3'
配列番号36：マウスNlrp3用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3'
配列番号37：マウスNlrp3用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-AACCAATGCGAGATCCTGAC-3'
配列番号38：マウスIl18用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-GACAGCCTGTGTTCGAGGAT-3'
配列番号39：マウスIl18用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-TGGATCCATTTCCTCAAAGG-3'
配列番号40：マウス18S rRNA用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-TTCGTATTGCGCCGCTAGA-3'
配列番号41：マウス18S rRNA用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-CTTTCGCTCTGGTCCGTCTT-3'
配列番号42：マウスmiR-184-5'-TGGACGGAGAACTGATAAGGGT-3'；
配列番号43：マウスmiR-221/222-5'-AGCTACATCTGGCTACTGGGT-3'；
配列番号44：マウスmiR-320a-5'-AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGA-3'、及び
配列番号45：マウスマウスmiR-484-5'-TCAGGCTCAGTCCCCTCCCGAT-3'
配列番号46：U6 snRNA-5'-AAATTCGTGAAGCGTTCC-3'
配列番号47：VDAC1 siRNAセンス-5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3'
配列番号48：VDAC2 siRNAセンス-5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3'
配列番号49：VDAC3 siRNAセンス-5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3'
配列番号50：DICER1アンチセンスオリゴヌクレオチド(AS)-5'-GCUGACCTTTTTGCTUCUCA-3'
配列番号51：DICER1 AS用コントロール-5'-TTGGTACGCATACGTGTTGACTGTGA-3'
配列番号52：Alu AS-5'-CCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCACGAGTAGCTGGGACTACAGGCGCCCGACACCACTCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTT-3'
配列番号53：Alu AS用コントロール-5'-GCATGGCCAGTCCATTGATCTTGCACGCTTGCCTAGTACGCTCCTCAACCTATCCTCCTAGCCCGTTACTTGGTGCCACCGGCG-3'
配列番号54：MyD88ホモ二量体化阻害用オリゴペプチド：RDVLPGT
配列番号55：MyD88ホモ二量体化阻害用オリゴペプチド：RDVVPGG
配列番号56 MyD88 siRNA：UUAUUUCCUAAWGGGUCdTdT
配列番号57 VDAC1 siRNAセンス(5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3')
配列番号58 VDAC2 siRNAセンス(5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3')
配列番号59 VDAC3 siRNAセンス(5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3')
例示的実施形態の説明
本願開示の主題は、MyD88阻害剤を同定する方法、MyD88を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、インフラマソーム阻害剤を同定する方法、インフラマソームを阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、インフラマソームの構成要素の阻害剤を同定する方法、インフラマソームの構成要素を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。インフラマソームの構成要素としては、例えば、NLRP3、PYCARD及びカスパーゼ-１が挙げられる。本願開示の主題は、IL-18阻害剤を同定する方法、IL-18を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、VDAC1又はVDAC2阻害剤を同定する方法、VDAC1又はVDAC2を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、カスパーゼ-８阻害剤を同定する方法、カスパーゼ-８を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、NFkB阻害剤を同定する方法、NFkBを阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。対象者の眼において活性化カスパーゼ-１を画像化する方法及び組成物もまた提供する。
本願開示の主題は、細胞のインフラマソーム、MyD88及びIL-18の１以上を阻害することを含む方法を包含する。幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のMyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、NFκB、カスパーゼ-８、カスパーゼ-１、NLRP-3、PYCARD及びインフラマソーム(インフラマソームの１つの構成要素(例えば、カスパーゼ１、NLRP-3、PYCARD)を含む)の１以上を阻害することを含む方法を包含する。
本方法の幾つかの実施形態では、細胞は、RPE細胞、網膜光受容器細胞又は脈絡叢細胞から選択される。幾つかの実施形態では、細胞はRPE細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、興味対象の病状を有しているか、有していると疑われるか、又は有するリスクにある対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、加齢性黄斑変性を有しているか、有していると疑われるか、又は有するリスクにある対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、地図状萎縮を有しているか、有していると疑われるか、又は有するリスクにある対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、地図状萎縮を有しているか、有していると疑われるか、又は有するリスクにある対象者の細胞であり、細胞はRPE細胞である。幾つかの実施形態では、加齢性黄斑変性を有する対象者は、本明細書で開示した方法及び組成物を用いて治療することができる。
本明細書で使用する場合、用語「対象者」とは、治療法の標的をいう。本明細書に開示の方法の対象者は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、魚、鳥、爬虫類又は両生動物であり得る。このように、本明細書に開示の方法の対象者は、ヒトでも、非ヒトでもあり得る。よって、獣医学的治療上の使用が本明細書に開示した主題に従って提供される。
幾つかの実施形態では、細胞のインフラマソーム、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、NLRP3、PYCARD、カスパーゼ-１、カスパーゼ-８、及びNFκBの１以上の阻害は、細胞又は対象者に阻害剤を投与することを含む(ここで、細胞は対象者の細胞である)。この阻害剤は、例えば、眼内注射(例えば、局所化眼内療法)；硝子体内注射；網膜下注射；胸膜上注射；テノン嚢下注射；球後注射；球周囲注射；経強膜投与；局所投与、例えば、局所的点眼適用；脈絡膜上投与；強膜に縫い付けられ若しくは付着され若しくは配置されたか又は硝子体液中に注入されたか、前眼房中に注入されたか、又は水晶体包若しくは水晶体嚢に埋め込まれた持続放出送達デバイスからの放出；経口投与；或いは静脈内投与により投与することができる。
本明細書で使用する場合、用語「阻害する」又は「阻害(すること)」とは、ポリペプチド(例えばMyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、カスパーゼ-８、NFκB)又はインフラマソーム(例えば、NLRP3、PYCARD、カスパーゼ-１)のポリペプチドの生物学的活性を抑制し、低下させ、減少させ、又は実質的に消去することをいう。本明細書で使用する場合、阻害されるべきポリペプチドに関する「細胞の」とは、細胞の内側(細胞膜の内側)に存在するポリペプチド、細胞上(細胞膜中、細胞膜上に提示、その他細胞に接して)に存在するポリペプチド、又は細胞外に存在するポリペプチド(ただし、当業者が該ポリペプチドを細胞と関係付けて認識するよう細胞外環境に存在する場合に限る)をいう。例えば、細胞のVDAC1、VDAC2、カスパーゼ-８、NFκB又はインフラマソーム(例えば、NLRP3、PYCARD、カスパーゼ-１)のポリペプチドは、細胞内に存在し得る。別の例として、MyD88は細胞内又は細胞上に存在し得る。更に別の例として、IL-18は、分泌されるので、細胞外に存在し得る(当業者はIL-18を該細胞と関係付けて認識する)。
本出願の検討に際して当業者に理解されるように、細胞のインフラマソーム、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、カスパーゼ-１、カスパーゼ-８及びNFκBの阻害は、幾つかの様式で達成することができる。幾つかの実施形態では、阻害は、ポリペプチドの転写又は翻訳に影響することにより、ポリペプチドを分解することにより、ポリペプチドを除去することにより、その他ポリペプチドの生物学的活性に影響を与えることにより達成できる。阻害は阻害剤を投与することを含んでなる。阻害剤は、ポリペプチドの生物学的活性の阻害に影響する化合物である。このような化合物は、例えば、ポリペプチド(オリゴヌクレオチドを含み、興味対象のポリペプチドに結合して阻害に影響するポリペプチドを含む)、小分子(小さな化学物質を含む)、RNA干渉のための化合物(siRNA、miRNA、shRNAを含む)、抗体(例えば、興味対象のポリペプチドに対する中和抗体、興味対象のポリペプチドのレセプターへの結合を遮断する抗体)、アプタマー、優勢ネガティブプラスミド若しくはベクター、又はウイルスがコードするインフラマソームであり得る。
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」(これらは本明細書中で互換可能に使用される)とは、サイズにかかわらず、20種のタンパク質アミノ酸、又はアミノ酸アナログのポリマーをいう。用語「ポリペプチドフラグメント」又は「フラグメント」とは、参照ポリペプチドに関して使用する場合、参照ポリペプチド自体と比較してアミノ酸残基が欠失しているが、残るアミノ酸配列は、通常、参照ポリペプチド中の対応する位置と同一であるポリペプチドをいう。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端若しくはカルボキシ末端で、又は参照ポリペプチドの内部位置から、又はその組合せで起こり得る。フラグメントはまた、当該フラグメントが本明細書で記載するような参照ポリペプチドの活性の幾らか又は全てを保持する場合、「機能的フラグメント」であり得る。
用語「改変アミノ酸」、「改変ポリペプチド」及び「変異型」とは、参照ポリペプチドと１以上のアミノ酸が異なる、例えば１以上のアミノ酸置換で異なるアミノ酸配列をいう。また、参照ポリペプチドの変異型は、参照ポリペプチドのフラグメントの変異型、例えば、参照ポリペプチドに対して１以上のアミノ酸置換がなされているフラグメントをいう。変異型はまた、本明細書で記載するような参照ポリペプチドの活性の幾らか又は全てを保持する「機能的変異型」であり得る。用語 機能的変異型には、参照ポリペプチドの機能的フラグメントの機能的変異型が含まれる。
幾つかの実施形態では、本願開示の主題の方法及び組成物は、興味対象の病状を有しているか、有していると疑われるか、又は有するリスクにある対象者において使用することができる。幾つかの実施形態では、本願開示の主題の方法及び組成物は、興味対象の病状を治療するために使用することができる。興味対象の病状の例としては、下記のものが挙げられるが、これらに限定されない：地図状萎縮(Kaneko, Dridiら，2011)；黄斑変性(Kaneko, Dridiら，2011)；角膜炎(Guo, Gaoら，2011)；痛風(Chen, Shiら，2006)；尋常性ざ瘡(Terhorst, Kalaliら，2010)；クローン病(Reuter and Pizarro 2004；Abreu, Fukataら，2005；Medvedev, Sabroeら，2006)；潰瘍性結腸炎(Reuter and Pizarro 2004；Abreu, Fukataら，2005；Medvedev, Sabroeら，2006)；過敏性腸疾患/過敏性腸症候群(McKernan, Nolanら，2009)；Ｉ型糖尿病(Devaraj, Tobiasら，2011；von Herrath, Filippiら，2011)；２型糖尿病(Hutton, Soukhatchevaら，2010；Nogueira-Machado, Volpeら，2011)；インスリン抵抗性(Ghanim, Mohantyら，2008；Tilich and Arora 2011)；肥満(Fresno, Alvarezら，2011)；溶血性尿毒症症候群(Batsford, Duermuellerら，2011)；ポリオーマウイルス感染(Batsford, Duermuellerら，2011)；免疫複合体腎疾患(Anders, Banasら，2004；Anders and Schlondorff 2007)；急性尿細管傷害(Anders, Banasら，2004；Anders and Schlondorff 2007)；ループス腎炎(Anders, Banasら，2004；Anders and Schlondorff 2007)；家族性寒冷自己炎症症候群(Familial cold autoinflammatory syndrome)(Mariathasan, Weissら，2006；Meng, Zhangら，2009)；マックル‐ウェルズ症候群及び新生児発症多系炎症性疾患(neonatal onset multisystem inflammatory disease)(Mariathasan, Weissら，2006；Meng, Zhangら，2009)；慢性乳児神経性皮膚・関節自己炎症性疾患(Chronic infantile neurologic cutaneous and articular autoinflammatory diseases)、腎虚血-再灌流傷害(El-Achkar and Dagher 2006；Robson 2009)；糸球体腎炎(El-Achkar and Dagher 2006；Robson 2009)；クリオグロブリン血症(Banas, Banasら，2008)；全身性血管炎(Weyand, Ma-Krupaら，2005；Hurtado, Jeffsら，2008；Summers, Steinmetzら，2011)；IgAネフロパシー(Lim, Leeら，2011)；アテローム性動脈硬化症(Curtiss and Tobias 2009)；HIV/AIDS(Brichacek, Vanpouilleら，2010)；マラアリア(Franklin, Ishizakaら，2011)；蠕虫寄生虫(Babu, Blauveltら，2005；Venugopal, Nutmanら，2009)；敗血症及び敗血症性ショック(Knuefermann, Nemotoら，2002；Opal and Huber 2002；Cristofaro and Opal 2003；Chen, Koustovaら，2007)；アレルギー性喘息(Slater, Pauporeら，1998；Park, Goldら，2001)；枯草熱(Slater, Pauporeら，1998；Park, Goldら，2001)；慢性閉塞性肺疾患(Geraghty, Daboら，2011)；薬物誘導肺炎症(Liu, Yangら，2010)；接触皮膚炎(Martin, Duddaら，2008；Yokoi, Niizekiら，2009)；らい病(Krutzik, Tanら，2005；Terhorst, Kalaliら，2010)；Burkholderia cenocepacia感染(Ventura, Balloyら，2009)；RSウイルス感染(Aeffner, Traylorら，2011)；乾癬(Zuany-Amorim, Hastewellら，2002；Barrat and Coffman 2008；Li, Zhouら，2009)；全身性エリテマトーデス(Zuany-Amorim, Hastewellら，2002；Barrat and Coffman 2008；Li, Zhouら，2009)；強皮症(Zuany-Amorim, Hastewellら，2002；Barrat and Coffman 2008；Li, Zhouら，2009)；反応性関節炎(Zuany-Amorim, Hastewellら，2002；Barrat and Coffman 2008；Li, Zhouら，2009)；嚢胞性線維症、梅毒、シェーグレン症候群(Zuany-Amorim, Hastewellら，2002；Barrat and Coffman 2008；Li, Zhouら，2009)；慢性関節リウマチ(Zuany-Amorim, Hastewellら，2002；Barrat and Coffman 2008；Li, Zhouら，2009)；炎症性関節疾患(O'Neill 2008)；非アルコール性脂肪肝疾患(Tan, Fielら，2009)；心臓手術(術中/術後炎症)(Cremer, Martinら，1996；Taylor 1996；Dybdahl, Wahbaら，2002)；急性及び慢性臓器移植拒絶(Alegre, Leemansら，2008；Miller, Rossiniら，2008；Taylor, Ehrhardtら，2008；Krams, Wangら，2010；Wang, Schmadererら，2010；Shin and Harris 2011；Testro, Visvanathanら，2011)；急性及び慢性骨髄移植拒絶(Alegre, Leemansら，2008；Miller, Rossiniら，2008；Taylor, Ehrhardtら，2008；Krams, Wangら，2010；Wang, Schmadererら，2010；Shin and Harris 2011；Testro, Visvanathanら，2011)；アルツハイマー病；及び腫瘍血管新生(Frantz, Vincentら，2005；Schmid, Avraamidesら，2011)。
本明細書で使用する場合、用語 治療は、興味対象の病状の任意の治療(予防的処置及び治療的処置を含むが、これらに限定されない)に関する。よって、用語 処置は、下記を含むがこれらに限定されない：興味対象の病状を予防するか又は興味対象の病状の発症を予防すること；興味対象の病状の進行を抑制すること；興味対象の病状の発症を停止させ又は予防すること；興味対象の病状の重篤度を低減すること；興味対象の病状と関連する症状を緩解又は軽減させること；及び興味対象の病状、又は興味対象の病状と関連する症状の１以上の減退を引き起こすこと。
幾つかの実施形態では、本願開示の主題の方法及び組成物は、細胞をAlu-RNA誘導変性に対して保護するために有用である。よって、幾つかの実施形態では、方法は阻害剤を投与することを含み、細胞がAlu-RNA誘導変性に対して保護される。
インフラマソームの阻害
幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のインフラマソームを阻害することを含んでなる、細胞を保護する方法を包含する。インフラマソームがNLRP3インフラマソーム、NLRP1インフラマソーム、NLRC4インフラマソーム、AIM2インフラマソーム及びIFI16インフラマソームから選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。幾つかの実施形態では、インフラマソームはNLRP3インフラマソームである。
幾つかの実施形態では、インフラマソームの阻害は、インフラマソームの１つの構成要素を阻害することを含む。幾つかの実施形態では、インフラマソーム構成要素は、PYCARDによりコードされるポリペプチドを含み得る。幾つかの実施形態では、インフラマソーム構成要素はカスパーゼを含み得る。幾つかの実施形態では、インフラマソーム構成要素はPYCARD、NLRP3及びカスパーゼ-１を含み得る。
幾つかの実施形態では、インフラマソームの阻害はインフラマソーム阻害剤を投与することを含んでなる。インフラマソーム阻害剤は、インフラマソームの１つの構成要素の阻害剤であり得る。幾つかの実施形態では、インフラマソーム
上記のように、幾つかの実施形態では、興味対象のポリペプチドの阻害は、オリゴヌクレオチド又は小RNA分子を投与することを含んでなる。小RNA分子は、例えばNLRP3及び/又はPYCARDを標的することができる。ヌクレオチドは、NLRP3及び/又はPYCARDを標的し、分解することができる。この点に関して、本願開示の主題は、NLRP3及び/又はPYCARDの発現を阻害する単離二本鎖RNA分子(ここで、該二本鎖RNAの第１の鎖は表Ａに示した配列を含んでなり、約14〜25ヌクレオチドを含む)を包含する。上記のように、幾つかの実施形態では、阻害は、優勢ネガティブベクターであるインフラマソーム阻害剤を投与することを含んでなる。幾つかの実施形態では、インフラマソームの阻害は、カスパーゼ-１の阻害剤を投与することを含んでなる。幾つかの実施形態では、カスパーゼ-１の阻害剤はペプチド阻害剤である。
本願開示の主題に従って使用することができるインフラマソーム阻害剤の例としては、表Ａに示すものが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本願開示の主題の実施形態は、表Ａに示すインフラマソーム阻害剤を投与することを含み得る。
カスパーゼ-１阻害剤及びプローブに関する更なる情報は、表Ｂに見出し得る。本出願の出願日当時に表Ｂに記載のリンクで見出される情報は、この参照により本明細書中に組み込まれる。
本願開示の主題は、更に、インフラマソームの阻害に有用な組成物を包含する。この組成物は阻害剤を含む。上記のように、阻害剤は、例えば、ヌクレオチド、ポリペプチド、小(化学)分子などであり得る。幾つかの実施形態では、組成物は単離されたRNA分子を含み得る。
本願開示の主題は、インフラマソームの構成要素、例えば、NLRP3、カスパーゼ-１及び/又はPYCARDの発現を阻害する単離RNA分子を包含する。幾つかの実施形態では、二本鎖RNAの第１の鎖は、以下の配列から選択される配列を含んでなり、約14〜25ヌクレオチドを含む：5'-GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT-3'(配列番号７)；5'-GGAUCAAACUACUCUGUGA-3'(配列番号８)；5'-UGCAAGAUCUCUCAGCAAA-3'(配列番号９)；5'-GAAGUGGGGUUCAGAUAAU-3'(配列番号10)；5'-GCAAGACCAAGACGUGUGA-3'(配列番号11)；5'-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3'(配列番号12)；5'-GGCUGCUGGAUGCUCUGUACGGGAA-3'(配列番号13)；及び5'-UUCCCGUACAGAGCAUCCAGCAGCC-3'(配列番号14)。
本願開示の主題は、インフラマソーム構成要素の発現を阻害する単離RNA分子を包含する。幾つかの実施形態では、このRNA分子は、下記の配列から選択される配列を含んでなる：GCTGGAGCAGGTGTACTACTTC(配列番号15)、CAGGTTTGACTATCTGTTCT(配列番号16)及びGTGAAGAGATCCTTCTGTA(配列番号17)。
本願開示の主題は更に、候補阻害剤をスクリーニングしてインフラマソーム阻害剤を同定する方法を包含する。幾つかの実施形態では、インフラマソーム阻害剤を同定する方法は、培養細胞を使用する。ここで、インフラマソームの活性化剤(例えば、Alu RNA、リポ多糖＋ATP)に応答してのPYCARD凝集、カスパーゼ-１切断又はIL-1β若しくはIL-18の切断/分泌を測定する細胞ベースの系が提供される。
幾つかの実施形態では、インフラマソーム阻害剤のスクリーニング法は、蛍光-タグ化PYCARDをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞(例えば、RPE細胞)又は細胞株(例えば、THP-1又はRAWマクロファージ)をAlu RNA又はLPS＋ATPで刺激すること；蛍光顕微鏡を用いて蛍光PYCARDの「スペック」−アグレソーム巣への凝集をモニターすること；及びPYCARD「スペック」形成の阻害程度について候補分子を試験することを含む。
幾つかの実施形態では、インフラマソーム阻害剤のスクリーニング法は、細胞(例えば、RPE細胞)又は細胞株(例えば、THP-1又はRAWマクロファージ)をAlu RNA又はLPS＋ATPで刺激すること；CaspaLux(登録商標)1-E2D2アッセイ(OncoImmunin, Inc.)を用いてカスパーゼ-１活性をモニターすること；及びCaspaslux蛍光の阻害程度について候補分子を試験することを含む。
幾つかの実施形態では、インフラマソーム阻害剤のスクリーニング法は、細胞(例えば、RPE細胞)又は細胞株(例えば、THP-1又はRAWマクロファージ)をAlu RNA又はLPS＋ATPで刺激すること；抗カスパーゼ-１抗体を用いるウェスタンブロッティングにより切断されたカスパーゼ-１(p10又はp20アイソフォーム)の量を測定することによってカスパーゼ-１活性をモニターすること；及びカスパーゼ-１切断フラグメント(p10又はp20)の阻害程度について候補分子を試験することを含む。
幾つかの実施形態では、インフラマソーム阻害剤のスクリーニング法は、HEK-BlueTM IL-1β細胞(Invivogen)をAlu RNA又はLPS＋ARPで刺激して、QUANTI-BlueTM(Invivogen)を用い生物活性IL-1βの生成を検出すること；及び呈色シグナルの阻害程度について候補分子を試験することを含む。
MyD88の阻害
幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のMyD88を阻害することを含んでなる細胞を保護する方法を包含する。幾つかの実施形態では、MyD88の阻害はMyD88阻害剤を投与することを含んでなる。
上記のように、幾つかの実施形態では、興味対象のポリペプチドの阻害は、オリゴヌクレオチド又は小RNA分子を投与することを含んでなる。この小RNA分子はMyD88を標的することができる。このヌクレオチドはMyD88を標的し分解することができる。この点に関して、本願開示の主題は、myD88の発現を阻害する単離二本鎖RNA分子(ここで、該二本鎖RNAの第１の鎖は表Ｃに示した配列を含んでなり、約14〜25ヌクレオチドを含む)を包含する。本願開示の主題に従って使用することができるMyD88阻害剤の例はとしては、表Ｃに示すものが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本願開示の主題の実施形態は、表Ｃに示すMyD88阻害剤を投与することを含み得る。
上記のように、幾つかの実施形態では、MyD88の阻害は、MyD88に対する優勢ネガティブベクターであるMyD88阻害剤、例えば、MyD88の死ドメインを欠く短縮型ΔMyD88(アミノ酸152〜296)(Muzioら，IRAK(Pelle) Family Member IRAK-2 and MyD88 as Proximal Mediators of IL-1 Signaling. Science 1997；278:1612-1615)を含有する優勢ネガティブ阻害形態のMyD88(pMyD88-dn)を投与することを含んでなる。
上記のように、幾つかの実施形態では、MyD88の阻害は、小分子(例えば、(１)Bartfaiら「A low molecular weight mimic of the Toll/IL-1 receptor/resistance domain inhibits IL-1 receptor-mediated responses.」 PNAS 2003；100: 7971-7976において化合物4aと呼ばれるヒドロシナモイル-L-バリルピロリジン；又は(２)Carminati, P., Gallo, G., Ruggiero, V., Sassano, M., Mastroianni, D.「MyD88 homodimerization inhibitors」特許第WO2006067091号に記載され、Loiarroら「Inhibition of MyD88 dimerization and recruitment of IRAK1 and IRAK4 by a novel peptidomimetic compound.」 Journal of Leukocyte Biology. 2007;82:801-810において特徴付けられているようなST2825；又は(３)MyD88相互作用を遮断する4-[(E)-2-(1-ヘキシルピリジン-1-イウム-2-イル)エテニル]-N,N-ジメチルアニリン ヨーダイド(これは4-[(E)-2-(1-ヘキシルピリジン-6-イル)エテニル-N,N-ジメチル-アニリン ヨーダイドとしても知られ、PubChemにおいて化学構造CID 5716367としても知られる)、又は(４)Leeら「Application of β-Lactamase Enzyme Complementation to the High-Throughput Screening of Toll-Like Receptor Signaling Inhibitors.」 Molecular Pharmacology 2007；72:868-875において50-F12及び26-J10と呼ばれる化合物)であるか、又は天然物(Villaら「Selective MyD88-dependent pathway inhibition by the cyanobacterial natural product malyngamide F acetate.」 European Journal of Pharmacology 2010；629:140-146)に記載されているようなマリンガミドＦアセテート)であるか、又はSELEXその他のスクリーニング技術により生成された、MyD88に結合するか若しくはMyD88をブロックするDNA若しくはRNAアプタマーであるMyD88阻害剤を投与することを含んでなる。
本願開示の主題は更に、MyD88の阻害に有用な組成物を包含する。このような組成物は阻害剤を含む。上記のように、この阻害剤は、例えば、ヌクレオチド、ポリペプチド、小(化学)分子などであることができる。幾つかの実施形態では、組成物は単離されたRNA分子を含み得る。
本願開示の主題は、myD88の発現を阻害する単離RNA分子を包含する。幾つかの実施形態では、二本鎖RNAの第１の鎖は下記の配列から選択される配列を含んでなり、約14〜25ヌクレオチドを含む：5'-GAGAAGCCUUUACAGGUdTdT-3'(配列番号３)；5'-ACCUGUAAAGGCUUCUCdTdT-3'(配列番号４)；5'-CAGAGCAAGGAAUGUGAdTdT-3'(配列番号５)；及び5'-UCACAUUCCUUGCUCUGdTdT-3'(配列番号６)。
本願開示の主題は、myD88の発現を阻害する単離ポリペプチド分子を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド分子は、以下：DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT(配列番号１)から選択される配列を含んでなり、約29〜100アミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド分子は、以下：RDVLPGT(配列番号54)及びRDVVPGG(配列番号55)から選択される配列を含んでなる。
幾つかの実施形態では、MyD88阻害剤を同定する方法は、MyD88がアップレギュレートされている培養細胞を利用する。該培養細胞を用いて候補化合物をスクリーニングし、MyD88をモジュレートする効力を決定することができる。候補化合物としては、例えば、小分子、生物製剤及びそれらの組合せ(例えば、複数の化合物を含む組成物)が挙げられる。用語 小分子は、従来の薬学的化合物を含む。用語 生物製剤は、ポリペプチド及びヌクレオチドを含み、siRNA、抗体、アプタマー、及び優勢ネガティブプラスミド又はベクターを含む。
幾つかの実施形態では、スクリーニング法は、MyD88がアップレギュレートされている培養細胞を準備すること；及び候補化合物を該細胞と接触させることを含む。本方法は、MyD88の変化を同定することを更に含み得る。例えば、MyD88レベルの測定可能な変化は、候補化合物と関係する効力を示し得る。MyD88の変化がMyD88の測定可能な減少である幾つかの実施形態では、変化は、候補化合物がMyD88阻害剤であることを示す。このようなMyD88阻害剤は、本明細書で開示する治療的適用に有用性を有し得る。
幾つかの実施形態では、MyD88は、Alu RNA又はリポ多糖(LPS)を用いて、例えば細胞(マクロファージ又はRPE細胞)をAlu RNA又はLPSで刺激することによりアップレギュレートさせ得る。幾つかの実施形態では、MyD88は、CpGヌクレオチドを用いて、例えば細胞(マクロファージ又はRPE細胞)を非メチル化CpGジヌクレオチドを含有する合成オリゴヌクレオチド(例えば5'-tcg tcg ttt tgt cgt ttt gtc gtt-3'又は5'-ggG GGA CGA TCG TCg ggg gg-3')で刺激することによりアップレギュレートさせ得る。幾つかの実施形態では、MyD88は、インターロイキン-1β又はインターロイキン18を用いて、例えば細胞(マクロファージ又はRPE細胞)を組換え形態のインターロイキン-1β又はインターロイキン18で刺激することによりアップレギュレートさせ得る。
MyD88阻害剤を同定する方法の幾つかの実施形態では、MyD88の変化は、当業者に既知の方法を使用して、細胞生存能を測定するか、MyD88シグナル伝達により誘導されることが知られている遺伝子(例えば、Cox-2、Socs3、TNF-α)の発現を測定するか、又は当業者により認められている他の基準を用いるによりモニターすることができる。幾つかの実施形態では、培養細胞はRPE細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は網膜光受容器細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は脈絡叢細胞である。
幾つかの実施形態では、MyD88阻害剤を同定する方法は、MyD88がアップレギュレートされているか又はオリゴマー化を受けているか又はIRAK1若しくはIRAK4のリン酸化を誘導している培養細胞を準備すること；細胞を候補化合物と接触させること；及び候補化合物がMyD88レベルの変化又は二量体化若しくはオリゴマー化MyD88の量の変化又はリン酸化IRAK1若しくはリン酸化IRAK4の量の変化を生じるかどうかを決定することを含む。幾つかの実施形態では、MyD88は、下記によりアップレギュレートされる：Alu RNA、リポ多糖、CpGヌクレオチド、一本鎖RNA、インターロイキン-1β又はインターロイキン18。幾つかの実施形態では、MyD88は、細胞生存能を測定すること、又はMyD88シグナル伝達により誘導されることが知られている遺伝子の発現を測定することによりモニターする。幾つかの実施形態では、MyD88シグナル伝達により誘導されることが知られている遺伝子は、Cox-2、Socs3及びTNF-αから選択される。
MyD88阻害剤のスクリーニング法の幾つかの実施形態では、細胞又は細胞株は、MyD88の既知の活性化剤、例えば、Alu RNA又はLPSで刺激することができる。遺伝子(例えばCox2、Socs3又はTNF-α)のRNAレベルは、定量的リアルタイムRT-PCRを用いて測定することができる。候補分子は、これら遺伝子転写物の阻害の程度について試験され得る。
MyD88阻害剤のスクリーニング法の幾つかの実施形態では、細胞又は細胞株は、MyD88の既知の活性化剤(例えば、Alu RNA又はLPS)で刺激することができる。二量体化若しくはオリゴマー化MyD88の量は、非還元条件下で抗MyD88抗体を用いるウェスタンブロッティングにより測定することができる。候補分子は、MyD88の二量体化又はオリゴマー化の阻害の程度について試験され得る。
MyD88阻害剤のスクリーニング法の幾つかの実施形態では、YFP(黄色蛍光タンパク質)のフラグメントに付された融合MyD88タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞又は細胞株を、MyD88の既知の活性化剤(例えば、Alu RNA又はLPS)で刺激し得る。蛍光シグナルは、二分子蛍光補償技法を用いて測定することができる。候補分子は蛍光シグナルの阻害の程度について試験され得る。
MyD88阻害剤のスクリーニング法の幾つかの実施形態では、細胞又は細胞株は、MyD88の既知の活性化剤(例えば、Alu RNA又はLPS)で刺激することができる。リン酸化形態のIRAK1又はIRAK4の量は、還元条件下で抗ホスホIRAK1抗体又は抗ホスホIRAK4抗体を用いるウェスタンブロッティングにより測定することができる。候補分子はIRAK1又はIRAK4のリン酸化の阻害程度について試験され得る。
IL-18の阻害
幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のIL-18を阻害することを含んでなる、細胞を保護する方法を包含する。幾つかの実施形態では、IL-18の阻害はIL-18阻害剤を投与することを含んでなる。
上記のように、幾つかの実施形態では、興味対象のポリペプチドの阻害は、結合性タンパク質又は抗体を投与することを含んでなる。このような抗体は、IL-18に対する中和抗体又はIL-18レセプターへのIL-18結合をブロックする抗体を含み得る。幾つかの実施形態では、IL-18阻害剤は、IL-18結合性タンパク質(Novickら，1999)であり得る。
本願開示の主題に従って使用することができるIL-18阻害剤の例としては、表Ｄに示したものが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本願開示の主題の実施形態は、表Ｄに示したIL-18阻害剤を投与することを含み得る。
本願開示の主題は更に、IL-18の阻害に有用な組成物を包含する。このような組成物は阻害剤を含む。上記のように、阻害剤は、例えば、ヌクレオチド、ポリペプチド、小(化学)分子などであり得る。幾つかの実施形態では、組成物は単離されたRNA分子を含み得る。幾つかの実施形態では、組成物は抗体又は結合性タンパク質を含み得る。
本願開示の主題は更に、候補阻害剤をスクリーニングして、IL-18阻害剤を同定する方法を包含する。幾つかの実施形態では、IL-18阻害剤を同定する方法は、組換えIL-18R1を表面プラズモン共鳴(SPR)に適切な固相状態表面に貼り付けること；貼り付けた組換えIL-18R1を蛍光-標識組換えIL-18に曝露すること；当該系をIL-18:IL-18R1結合に置き換わる推定のIL-18阻害剤に更に曝露すること；及び蛍光を測定して、阻害程度を決定することを含む。
幾つかの実施形態では、IL-18阻害剤を同定する方法は、細胞(例えば、RPE細胞)又は細胞株(例えば、THP-1又はRAWマクロファージ)を組換えIL-18で刺激すること；MyD88活性化を、例えば増加したMyD88二量体化を(ウェスタンブロッティングにより)測定するか又はIRAK1若しくはIRAK4の増大したリン酸化を測定することにより測定することを含む。
VDAC1及び/又はVDAC2の阻害
幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のVDAC1及び/又はVDAC2を阻害することを含んでなる、細胞を保護する方法を包含する。幾つかの実施形態では、VDAC1及び/又はVDAC2の阻害は、VDAC1阻害剤及び/又はVDAC2阻害剤を投与することを含んでなる。
上記のように、幾つかの実施形態では、興味対象のポリペプチドの阻害は、オリゴヌクレオチド又は小RNA分子を投与することを含んでなる。小RNA分子はVDAC1及び/又はVDAC2を標的することができる。ヌクレオチドは、VDAC1及び/又はVDAC2を標的し、分解することができる。この点に関して、本願開示の主題は、VDAC1及び/又はVDAC2の発現を阻害する単離二本鎖RNA分子(ここで、該二本鎖RNAの第１の鎖は表Ｅに示す配列を含んでなり、約14〜25ヌクレオチドを含む)を包含する。本願開示の主題に従って使用することができるVDAC1及び/又はVDAC2阻害剤の例としては、表Ｅに示すものが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本願開示の主題の実施形態は、表Ｅに示すVDAC1及び/又はVDAC2阻害剤を投与することを含み得る。
本願開示の主題は、更に、VDAC1及び/又はVDAC2の阻害に有用な組成物を包含する。このような組成物は阻害剤を含む。上記のように、阻害剤は、例えば、ヌクレオチド、ポリペプチド、小(化学)分子などであり得る。幾つかの実施形態では、組成物は単離されたRNA分子を含み得る。
本願開示の主題は、VDAC1及び/又はVDAC2の発現を阻害する単離RNA分子を包含する。幾つかの実施形態では、二本鎖RNAの第１の鎖は、以下から選択される配列を含んでなり、約14〜25ヌクレオチドを含む：5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3'(配列番号47)及び5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3'(配列番号48)。
本願開示の主題は更に、候補阻害剤をスクリーニングしてVDAC1及び/又はVDAC2の阻害剤を同定する方法を包含する。幾つかの実施形態では、細胞又は細胞株ベースの方法が使用される。
カスパーゼ-８の阻害
幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のカスパーゼ-８を阻害することを含んでなる、細胞を保護する方法を包含する。幾つかの実施形態では、カスパーゼ-８の阻害は、カスパーゼ-８阻害剤を投与することを含んでなる。
本願開示の主題に従って使用することができるカスパーゼ-８阻害剤の例としては、表Ｆに示すものが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本願開示の主題の実施形態は、表Ｆに示すカスパーゼ８阻害剤を投与することを含み得る。
本願開示の主題は、更に、カスパーゼ-８の阻害に有用な組成物を包含する。このような組成物は阻害剤を含む。上記のように、阻害剤は、例えば、ヌクレオチド、ポリペプチド、小(化学)分子などであり得る。幾つかの実施形態では、組成物は単離されたRNA分子を含み得る。
本願開示の主題は更に、候補阻害剤をスクリーニングしてカスパーゼ-８阻害剤を同定する方法を包含する。幾つかの実施形態では、細胞又は細胞株ベースの方法が使用される。
NFκBの阻害
幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のNFκBを阻害することを含んでなる、細胞を保護する方法を包含する。幾つかの実施形態では、NFκBの阻害は、NFκB阻害剤を投与することを含んでなる。
本願開示の主題に従って使用することができるNFκB阻害剤の例としては、表Ｇに示すものが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本願開示の主題の実施形態は、表Ｇに示すNFκB阻害剤を投与することを含み得る。
本願開示の主題は、更に、NFκBの阻害に有用な組成物を包含する。このような組成物は阻害剤を含む。上記のように、阻害剤は、例えば、ヌクレオチド、ポリペプチド、小(化学)分子などであり得る。幾つかの実施形態では、組成物は単離RNA分子を含み得る。
本願開示の主題は更に、候補阻害剤をスクリーニングしてNFκB阻害剤を同定する方法を包含する。幾つかの実施形態では、細胞又は細胞株ベースの方法が使用される。
対象者の眼におけるカスパーゼの画像化
幾つかの実施形態では、カスパーゼ-１の基質に接合した蛍光分子又はカスパーゼ-１による切断後に蛍光を発する分子を含んでなる、対象者の眼において活性化カスパーゼを画像化するための診断組成物が提供される。幾つかの実施形態では、対象者のRPE細胞に診断組成物を(例えば、眼内又は静脈内)投与すること及び任意に蛍光の空間的クラスター化をモニターすることを含む、対象者の眼において活性化カスパーゼ-１を画像化する方法が提供される。
本願開示の主題の１以上の実施形態の詳細が本明細書に記載される。本明細書に記載した実施形態に対する改変及び他の実施形態は、本明細書に提供した情報に接した後、当業者に明らかになる。本明細書に提供した情報及び特に記載した例示的実施形態の具体的詳細は、明確な理解のために主に提供されているのであって、不必要な限定はされないと理解すべきである。矛盾する場合、本明細書(定義を含む)が支配する。
本明細書に開示のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の幾つかは、GENBANK(登録商標)/GENPEPT(登録商標)のアクセッション番号も相互参照されている。GENBANK(登録商標)/GENPEPT(登録商標)データベースで相互参照される配列は、参照により、GENBANK(登録商標)/GENPEPT(登録商標)又は他の公開データベースに存在する等価な配列又は関連する配列が書かれているかのように明示的に組み込まれる。また、本明細書に開示された配列と関係してGENBANK(登録商標)/GENPEPT(登録商標)データベースに存在する全ての注釈も、参照により本明細書中に明示的に組み込まれる。そうではないことが示されていないか又は明らかでない場合には、GENBANK(登録商標)/GENPEPT(登録商標)データベースへの言及は、本出願の出願時点で最新バージョンのデータベースへの言及である。
本明細書で使用する用語は、当業者により十分に理解されると考えられるが、本願開示の主題の説明を容易にするため定義を示す。
そうでないと規定されていない場合、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本願開示の主題が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものに類似するか又は等価である任意の方法、デバイス及び材料を本願開示の主題の実施及び試験に使用できるが、代表的な方法、デバイス及び材料をここに記載する。
長年の特許法上の慣例に従って、用語「a」、「an」及び「the」は、本出願(特許請求の範囲を含む)で使用する場合には、「１以上の」をいうものとする。よって、例えば、「細胞」への言及は複数の当該細胞を含む、といった具合である。
そうでないことが示されていない場合、本明細書及び特許請求の範囲で使用する成分、性質(例えば反応条件)などの量を表す全ての数は、全ての場合で、用語「約」で修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうでないことが示されていない場合、本明細書及び特許請求の範囲に示される数値パラメータは、本願開示の主題により得ることが求められる所望の性質に応じて変動し得る近似値である。
本明細書で使用する場合、質量、重量、時間、容量、濃度又はパーセンテージの値又は量に言及するときの用語「約」は、変動が開示された方法を実行するに適切であるように、特定された量からの、幾つかの実施形態では±20％、幾つかの実施形態では±10％、幾つかの実施形態では±５％、幾つかの実施形態では±１％、幾つかの実施形態では±0.5％、幾つかの実施形態では±0.1％の変動を包含するとされる。
本明細書で使用する場合、範囲は、「約」を付した１つの特定値から及び/又は「約」を付した別の１つの特定値までとして表現されることがある。また、本明細書に開示されている値について、各値は、当該値自体に加えて「約」を付した当該特定の値としても開示されていると理解される。例えば、値「10」が開示されている場合、「約10」もまた開示されている。また、２つの特定の単位の間の各単位も開示されていると理解される。例えば、10及び15が開示されている場合、11、12、13及び14も開示されている。
本願開示の主題は、下記の具体的(非限定的)実施例により更に説明される。以下の実施例は、本発明に関連する開発及び実験の過程で種々の時点で集めたデータの代表例であるデータを合併したものを含み得る。
実施例
実施例１
網膜色素上皮(RPE)におけるDICER1欠損に起因するAlu RNA蓄積は、地図状萎縮(GA)(数百万人に失明を引き起こす進行型加齢性黄斑変性)に関わる。Alu RNA誘導細胞毒性の機序は不明である。ここでは、DICER1欠損又はAlu RNA曝露が、RPEにおいて、NLRP3インフラマソームを活性化し、IL-18を介するTLR非依存性MyD88シグナル伝達を誘引することを示す。インフラマソーム構成要素(NLRP3、Pycard、カスパーゼ-１)、MyD88又はIL-18の遺伝子阻害又は薬理学的阻害は、DICER1喪失又はAlu RNA曝露により引き起こされるRPE変性を防止する。これら知見は、ヒトGA RPEが上昇量のNLRP3、PYCARD及びIL-18を含有するという観察並びにカスパーゼ-１及びMyD88の増大した活性化の証拠と併せると、GAにおいてこの経路を標的する合理的根拠を提供する。これら知見はまた、免疫系外でのインフラマソームの新規機能及び可動エレメントの驚くべき免疫調整作用を明らかにする。
加齢性黄斑変性(AMD)は、数百万人の視覚に影響している(Smithら，2001)。AMDは、網膜光受容器と脈絡膜毛細管との間に位置する網膜色素上皮(RPE)の変性によって特徴付けられる(Ambatiら，2003)。RPE機能不全は、光受容器及び脈絡膜脈管系の両方を破壊する(Blaauwgeersら，1999；Lopezら，1996；McLeodら，2009；Vogtら，2011)。これら組織破壊は萎縮性又は新生血管性の疾患表現型を導く。新生血管性AMDの治療法は存在するが、より一般的な萎縮型については有効な治療はない。GA(萎縮型AMDの進行ステージ)は、RPEの変性により特徴付けられ、治療不可能な視覚喪失の主原因である。
近年、RNase DICER1の劇的で特異的な低下がGAのヒト眼のRPEにおいてAlu RNA転写物の蓄積を導くことが示された(Kanekoら，2011)。これら反復性エレメント転写物(これは高度に豊富なAluレトロトランスポゾンにより発現される非コーディングRNAである；Batzer and Deininger, 2002)は、ヒトRPE細胞死及びマウスにけるRPE変性を誘導する。GA RPEにおけるDICER1欠損は包括的な細胞死応答ではなかった。なぜなら、DICER1発現が他の網膜疾患で調節不全でなかったからである。同様に、Alu RNA蓄積は、細胞死亡におけるストレス応答に起因する一般化したレトロトランスポゾン活性化を代表するものではなかった。なぜなら、他のレトロトランスポゾンはGA RPEで上昇しなかったからである。
DICER1は成熟マイクロRNA生合成の中核をなす(Bernsteinら，2001)。にもかかわらず、DICER1欠損後、Alu RNAの蓄積は、RPE細胞生存能の重要な決定因子であったが、成熟マイクロRNAの欠如はそうではなかった(Kanekoら，2011)。更に、7SL RNA、転移RNA及び一次(primary)マイクロRNAはRPE変性を誘導せず(Kanekoら，2011)、このことは過剰な高度に構造化されたRNAの非特異的毒性を除外する。依然として、Alu RNA細胞毒性の正確な機序は不明である。
網膜は免疫特権の例外である(Streilein, 2003)が、先天性免疫センサにより媒介される発作は、著明な炎症をもたらすことがある。３つの主要なクラスの先天性免疫レセプターには、TLR、RIG-I様ヘリカーゼ及びNLRタンパク質が含まれる(Akiraら，2006)。多くの先天性免疫レセプターがRPEで発現し(Kumarら，2004)、幾つかの外因性物質が網膜炎症を誘導することがある(Allensworthら，2011；Kleinmanら，2012)。しかし、この監視機構が宿主の内因性RNAを認識するのか又はこれに応答するのか不明である。先天性免疫機構(この正統な機能は病原因子関連分子パターン及び外来生物由来のその他成分の検出である)もまたAlu RNAを認識し得るという概念が検討された。
事実、Alu転写物は先天性免疫機構を乗っ取り、RPE細胞死を誘導することがあることが示された。驚くべきことに、データが、DICER1欠損又はAlu RNAがNLRP3インフラマソームをMyD88依存性様式であるがTLR非依存性様式で活性化することを示している。インビボでのNLRP3インフラマソーム活性化は、主として免疫細胞に限定されていたが、ケラチノサイトの細胞培養物研究(Feldmeyerら，2007；Kellerら，2008)で示されるように、このデータはNLRP3活性がより広範囲であり得る可能性について門戸を開く。また、データは、DICER1機能の範囲をマイクロRNA生合成を超えて広げ、ヒトゲノムの概ね50％を含む毒性レトロトランスポゾンエレメントの異所性蓄積に対する監視者として同定する(Landerら，2001)。まとめると、これら知見は、新規な自己認識免疫応答を提示する。これにより、内因性非コーディングRNA誘導NLRP3インフラマソーム活性化は、非免疫細胞において、DICER1欠損に起因する。
結果
Alu RNAは種々のTLR又はRNAセンサを活性化しない
Alu RNAは、一本鎖(ss)RNA及び二本鎖(ds)RNAモチーフを有する(Sinnettら，1991)。よって、Alu RNAがtoll様レセプター-３(TLR3)、dsRNAセンサ(Alexopoulouら，2001)又はTLR7(ssRNAセンサ(Dieboldら，2004；Heilら，2004))が欠損したマウスにおいてRPE変性を誘導するかどうかを調べた。Alu RNAをコードするプラスミド(pAlu)の網膜下送達は、Tlr3-/-マウス及びTlr7-/-マウスにおいて、野生型(WT)マウスと同様に、RPE変性を誘導した(図1A〜C)。21ヌクレオチド以上の完全相補性siRNAはRPE細胞のTLR3を活性化することが以前に示されている(Kleinmanら，2011)。Alu RNAによるTLR3活性化の欠如は、TLR3結合を妨げ得る複数のヘアピン及び隆起を含有する複雑な構造に起因する蓋然性が高い。7SL RNA(Alu RNAの進化的前駆体)もp7SLもWTマウスにおいてRPE変性を誘導しなかった(図8A及び8B)。このことは、Alu RNA細胞毒性が、今のところ不明確な構造的特徴に起因し得ることを示唆する。pAluはUnc93b1マウス(これは、TLR3、TLR7及びTLR9シグナル伝達を欠く；Tabetaら，2006)においてRPE変性を誘導した(図1D)。このことは、これら核酸センサがAlu RNAにより重複して活性化されないことを示している。pAluはTlr4-/-マウスにおいてRPE変性を誘導し(図1E)、TLR4アンタゴニストであるRhodobacter sphaeroides LPS(Qureshiら，1991)はWTマウスにおいてpAlu誘導RPE変性を阻害しなかった(図8C)。よって、観察されたRPE細胞死はリポ多糖混入に起因しない。更に、２つの異なるインビトロ転写Alu RNA(Kanekoら，2011)は複数のTLRを活性化しなかった(図1F)。
次に、他のdsRNAセンサ(例えばMDA5(Katoら，2006)又はPKR(Prkrによりコードされる(Yangら，1995))がAlu RNA毒性を媒介し得るかどうかを調べた。しかし、pAluはMda5-/-マウス及びPrkr-/-マウスにおいてRPE変性を誘導した(図8D及び8E)。インビトロ転写Alu RNAの5'-トリホスフェート(これは、この部分を感知するRIG-I又はIFIT-1を活性化し得る)(Hornungら，2006；Pichlmairら，2011)が、RPE変性を担っているかどうかを調べた。脱リン酸化Alu RNAは、脱リン酸化に付されていないAlu RNAと同様に、WTマウスにおいてRPE変性を誘導した(図8F)。このことは、この化学基が観察された細胞死を担っていないことを示している。事実、RIG-Iを活性化する5'-トリホスフェートssRNAは、マウスにおいてRPE変性を誘導しない(Kleinmanら，2011)。更に、pAluはMAVS(これにより、RIG-I及びMDA-5がシグナル伝達する(Kumarら，2006；Sunら，2006))を欠損するマウスにおいてRPE変性を誘導した(図8G)。まとめると、これらデータは、広範な正統RNAセンサにより媒介されないAlu RNA誘導RPE変性の新規な機序を指摘している。
Alu RNA細胞毒性はMyD88及びIL-18により媒介される
次いで、TRIF(Ticam1によりコードされる；TLR3及びTLR4のアダプター(Hoebeら，2003；Yamamotoら，2003))及びMyD88(TLR3以外の全てのTLRのアダプター(Akiraら，2006；Alexopoulouら，2001；Suzukiら，2003))の関与を調べた。Alu RNAは、Tlr3-/-マウス及びTlr4-/-マウスにおける知見と一致して、Ticam1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導した(図9A)。予想外にも、Alu RNAも２つの異なるpAluプラスミドもMyd88-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しなかった(図2A、9B及び9C)。MyD88ホモ二量体化のペプチド阻害剤(Loiarroら，2005)の硝子体内送達は、WTマウスにおいてAlu RNAにより誘導されるRPE変性を防止した一方、コントロールペプチドは防止しなかった(図2B)。MyD88を標的する短い干渉RNA(siRNA)(これは、長さが21ヌクレオチドより短く、TLR3活性化を防止し、細胞透過を可能にするためにコレステロールに接合されている(Kleinmanら，2008))は、WTマウスにおいて、pAluにより誘導されるRPE変性を阻害したが、コントロールsiRNAは阻害しなかった(図2C〜2E)。Myd88+/-ヘテロ接合型マウスはAlu RNA誘導RPE変性に対して保護された(図2F及び9D)。このことは、MyD88の部分的ノックダウンが治療上十分であるというsiRNA研究を実証している。
インターロイキンにより誘導されるMyD88媒介シグナル伝達は、IRAK1及びIRAK4の動員及びリン酸化を導く(Caoら，1996；Kanakarajら，1999；Suzukiら，2003；Suzukiら，2002)。Alu RNAはヒトRPE細胞においてIRAK1/4リン酸化を増大させた(図2G)。このことは、Alu RNAがMyD88シグナル伝達を誘引するという概念を支持する。MyD88阻害性ペプチドは、ヒトRPE細胞においてAlu RNA誘導IRAK1/4リン酸化を低下させた(図9E)。このことはその作用態様を確証する。
次に、MyD88活性化がヒト及びマウスRPE細胞培養系においてAlu RNA誘導細胞死を媒介するかどうかを評価した。インビボデータと一致して、pAluはWTマウスRPE細胞において細胞生存能を低下させたが、Myd88-/-マウスRPE細胞においては低下させなかった(図2H)。MyD88阻害性ペプチドは、pAluでトランスフェクトしたヒトRPE細胞において細胞死を阻害したが、コントロールペプチドは阻害しなかった(図2I)。まとめると、これらデータは、MyD88がAlu RNA誘導RPE変性の重要なメディエータであることを示唆する。
MyD88は、一般には、免疫細胞のアダプターであると考えられている(O'Neill and Bowie, 2007)。しかし、Alu RNAは、RPE単一培養物においてMyD88を介して細胞死を誘導した。よって、マウスにおけるAlu RNA誘導RPE変性がRPE細胞におけるMyD88活性化のみに依存するかどうかを調べた。Myd88f/fマウスにおけるAAV1-BEST1-Creの網膜下注射によるRPEでのMyD88の条件的除去は、Alu RNA誘導RPE変性に対して保護した(図2J及び9F)。この知見と一致して、Alu RNAは、Myd88-/-の骨髄を投与されたWTマウスにおいてRPE変性を誘導したが、WTの骨髄を投与されたMyd88-/-マウスにおいてはRPE変性を誘導しなかった(図9G)。まとめると、これら結果は、(循環性免疫細胞ではなく)RPEにおけるMyD88発現がAlu RNA誘導RPE変性に重要であることを示している。これら知見は、病変領域で免疫細胞の浸潤が見られないとのヒトGA組織の組織病理学的研究に適合する(私信、C.A. Curcio, H.E. Grossniklaus, G.S. Hageman, L.V. Johnson)。
MyD88はTLRシグナル伝達に重要である(O'Neill and Bowie, 2007)が、Alu RNAによるMyD88活性化はTLR活性化から独立していた。よって、MyD88関与の他の機序を調べた。MyD88は、IFN-γレセプター１(Ifngr1によりコードされる)と干渉することによりIFN-γシグナル伝達を調節することができる(Sun and Ding, 2006)。しかし、pAluはIfng-/-マウス及びIfngr1-/-マウスの両方でRPE変性を誘導した(図9H及び9I)。MyD88はまた、インターロイキン-１シグナル伝達において必須である(Muzioら，1997)。よって、IL-1β及び関連するサイトカインIL-18(共にMyD88を活性化する(Adachiら，1998))がAlu RNA細胞毒性を媒介するかどうかを調べた。興味深いことに、ヒトRPE細胞におけるAlu RNA過剰発現はIL-18分泌を増大させる一方、IL-1β分泌は辛うじて検出可能であった(図2K)。
組換えIL-18はWTマウスにおいてRPE変性を誘導したがMyd88-/-マウスにおいては誘導しなかった(図2L)。IL-18の中和化は、WTマウスにおいてpAlu誘導RPE変性に対して保護したが、IL-1βは保護しなかった(図2M及び2N)。また、pAluはIl1r1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導したがIl18r1-/-マウスにおいては誘導しなかった(図9J及び9K)。これらデータは、IL-18がAlu RNA誘導細胞毒性のエフェクターであることを示している。
Alu RNAはNLRP3インフラマソームを活性化する
カスパーゼ-１(Casp1によりコードされる；生物学的に活性な形態へのインターロイキンの成熟を誘導するプロテアーゼである(Ghayurら，1997；Guら，1997；Thornberryら，1992)がAlu RNA誘導RPE変性に関与するかどうかを調べた。ヒトRPE細胞のAlu RNA処理は、ウェスタンブロッティング及び基質切断の蛍光レポーターにより測定されるように、カスパーゼ-１活性化を導いた(図3A及び10A)。事実、Alu RNAは、他の細胞タイプ(例えば、HeLa及びTHP-1単球細胞)において、カスパーゼ-１活性化を誘導した(図10B)。このことは、Alu RNA細胞毒性が多くの系において潜在的に広く関与していることを示唆している。カスパーゼ-１-阻害性ペプチドZ-WEHD-FMKの硝子体内送達は、WTマウスにおいてIL-18成熟及びpAlu誘導RPE変性をブロックしたが、コントロールペプチドZ-FA-FMKの硝子体内送達はブロックしなかった(図3B及び3C)。カスパーゼ-１阻害性ペプチドはヒトRPE細胞においてAlu RNA誘導基質切断をブロックした(図10C)。このことはその作用態様を確証する。同様に、Alu RNA又はpAluで処置したCasp1-/-マウスはRPE変性を示さなかった(図3D及び10D)。また、pAluはCasp1-/-マウスRPE細胞において細胞死を誘導しなかった(図3E)。
カスパーゼ-１は、インフラマソームと呼ばれるマルチタンパク質たる先天性免疫複合体内で活性化され得る(Tschoppら，2003)。最も十分に特徴付けられたインフラマソーム経路は、カスパーゼ-１アダプターであるASC(PYCARDによりコードされる)へのNLRP3の結合により活性化されるものである。インフラマソームアセンブリの１つの顕著な特徴はPYCARDの空間的クラスター化である(Fernandes-Alnemriら，2007)。蛍光タグ化PYCARD(GFP-PYCARD)でトランスフェクトされたヒトRPE細胞において、Alu RNAはLPS及びATP(これはNLRP3インフラマソームを活性化する)での処理と同様に、高輝度の蛍光細胞質クラスターの出現を誘導した(図3F及び10E)(Mariathasanら，2006)。
次に、NLRP3及びPYCARDとAlu RNA細胞毒性との機能的関連性を調べた。pAluもAlu RNAもNlrp3-/-マウス又はPycard-/-マウスのいずれにおいてもRPE変性を誘導しなかった(図3G、3H、10F及び10G)。このことは、Alu RNA細胞毒性におけるインフラマソームの決定的重要性を証明する。また、pAluはNlrp3-/-マウス又はPycard-/-マウスのいずれのRPE細胞においても細胞死を誘導しなかった(図3I)。更に、siRNAによるNLRP3又はPYCARDのノックダウンは、pAlu誘導ヒトRPE細胞死を回復させた(図3J及び10H)。これら知見は、Alu RNAに応答してのNLRP3活性化がRPE細胞において生じるが、他の免疫細胞の存在を必要としないことの直接的証拠を提供する。
(１)MyD88阻害はヒトRPE細胞においてAlu RNA誘導IRAK1/4リン酸化を低下させる(図9E)一方、Alu RNA誘導カスパーゼ-１切断も蛍光基質切断も低下させなかったこと(図10I及び10J)；(２)IL-18の中和化はAlu RNA誘導カスパーゼ-１切断を阻害しなかったこと(図10K)；及び(３)カスパーゼ-１阻害はIRAK1/4のAlu RNA誘導リン酸化を低下させたこと(図10L)を示すことで、IL-18及びMyD88の活性化が確かにカスパーゼ-１活性化の川下にあることが証明された。
Alu RNAはミトコンドリアROS及びNLRP3プライミングを誘導する
NLRP3インフラマソーム機能は２つのシグナルを必要とする。その第１はプライミングと呼ばれる。pAluは、NLRP3 mRNA及びIL18 mRNAの両方をアップレギュレートしたので、インフラマソームプライミングを誘導した。このプライミングは、WTマウス及びMyd88-/-マウスの両方のRPE細胞において等しく生じた(図4A)。このことは更に、MyD88がこの系のNLRP3の下流で機能することを確証する。NLRP3と直接相互作用しない他のインフラマソームアゴニスト(Tschopp and Schroder, 2010)と同様に、Alu RNAとNLRP3との間の物理的相互作用は観察されなかった(図11A)。Alu RNAがどのようにインフラマソームをプライムするかを決定するために、Alu RNAが反応性酸素種(ROS)産生(プライミングのシグナル(Bauernfeindら，2011；Nakahiraら，2011))を誘導するかどうかを調べた。pAluはヒトRPE細胞においてROS生成を誘導し(図4B)、ROS阻害剤であるジフェニルヨードニウム(DPI)は、WTマウスにおいて、pAlu誘導NLRP3 mRNA及びIL18 mRNAのアップレギュレーション及びAlu RNA誘導RPE変性をブロックした(図4C及び4D)。DPIはミトコンドリアROS及びファゴソームROSをブロックする(Li and Trush, 1998)ので、どちらの経路が誘引されるのかを調べた。というのも、NLRP3応答に寄与するROSの供給源をめぐる議論が存在する(Latz, 2010)からである。
ROS生成ミトコンドリアを標識するMitoSOX Redを、呼吸ミトコンドリアを標識するMitoTracker Deep Redと組み合わせて使用した。ファゴソームROS生成をモニターするため、ファゴソーム内でのNADPHオキシダーゼの活性化を測定するFc OxyBURST Greenを使用した。ROS生成ミトコンドリアの顕著な増加が、pAluでトランスフェクトしたヒトRPE細胞において観察された(図4E)。対照的に、ホルボールミリステートアセテー(PMA)は予想されたようにファゴソームROSを誘導した(Savinaら，2006)一方、pAluは誘導しなかった(図4F)。これらデータは、NLRP3応答がミトコンドリアROS阻害剤により害される(Nakahiraら，2011；Zhouら，2011)が、NADPH-オキシダーゼ依存性ROS産生を害する遺伝子変異を有する細胞では保存される(Meissnerら，2010；van Bruggenら，2010)という知見と一致する。
これら報告及び細胞性ROSの主要な供給源がミトコンドリアであるという観察(Murphy, 2009)と一致して、ミトコンドリア標的抗酸化剤Mito-TEMPO及びMitoQ(Murphy and Smith, 2007；Nakahiraら，2011)は共にWTマウスにおいてAlu RNA誘導RPE変性をブロックする一方、dTPP(ミトコンドリアROSを除去しない、MitoQの構造的アナログ)はブロックしないことが見出された(図4G)。対照的に、gp91ds-tat(２つの必須のNADPHオキシダーゼサブユニット(gp91phox及びp47phox)の会合を阻害する細胞透過ペプチド(Reyら，2001))はブロックしなかった(図4H)。これらデータを確証することに、Alu RNAは、Cybb(gp91phoxをコードする)を欠損するマウスにおいて、WTマウスと同様に、RPE変性を誘導した(図4I)。次に、電位依存性陰イオンチャネル(VDAC)を調べた。なぜなら、VDAC1及びVDAC2は、マクロファージにおいてNLRP3活性化因子により産生されるミトコンドリアROSに重要であるが、VDAC3はそうでないからである(Zhouら，2011)。これら観察と一致して、VDAC1及びVDAC2のsiRNAノックダウンは、ヒトRPE細胞において、pAlu誘導ミトコンドリアROS(図4J及び11B)並びにNLRP3 mRNA及びIL18 mRNAの誘導(図4K)を損傷したが、VDAC3のsiRNAノックダウンは損傷しなかった。まとめると、これらデータは、ミトコンドリアROSをAlu RNA誘導NLRP3インフラマソーム媒介RPE変性と結びつける。
Alu RNAはパイロプトーシスを介してRPE変性を誘導しない
Alu RNAはカスパーゼ-１(パイロプトーシスを誘引することができる)を活性化する。ここで、パイロプトーシスは、膜孔の形成及び浸透圧溶解により特徴付けられる細胞死の一形態である(Fink and Cookson, 2006)。細胞保護因子であるグリシン(これはパイロプトーシスを減弱させる(Finkら，2008；Fink and Cookson, 2006；Verhoefら，2005))は、LPS＋ATPにより誘導されるヒトRPE細胞死を阻害したが、Alu RNAにより誘導されるヒトRPE細胞死は阻害しなかった(図5A及び5B)。パイロプトーシスはカスパーゼ-１を必要とするが、IL-18とは独立して進行することができる(Miaoら，2010)。よって、IL-18がCasp1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導したという知見(図5C)は、グリシンによる回復の欠如と併せて考えると、Alu RNA誘導RPE変性はパイロプトーシスを介して起こるのではないことが示唆される。
DICER1喪失はインフラマソームを介して細胞死を誘導する
RPE細胞の健常維持にけるDICER1の鍵となる役割(Kanekoら，2011)が以前に証明されている：DICER1切断Alu RNAはインビボでRPE変性を誘導しなかった；DICER1過剰発現はAlu RNA誘導RPE変性に対して保護した；及び、DICER1喪失誘導RPE変性はAlu RNAの拮抗によりブロックされた(Kanekoら，2011)。また、Alu RNA阻害によるDICER1ノックダウン誘導RPE変性の回復は、マイクロRNA欠損の回復に伴うものではなかった(Kanekoら，2011)。したがって、DICER1もまたAlu RNAによるNLRP3インフラマソーム活性化を防止するかどうかを調べた。ヒトRPE細胞におけるAlu RNA誘導カスパーゼ-１活性化は、DICER1過剰発現により阻害された(図6A及び6B)。逆に、ヒトRPE細胞においてDICER1ノックダウンにより誘導されるカスパーゼ-１切断は、同時のAlu RNAのアンチセンスノックダウンにより阻害された(図12A及び12B)。
次に、これら経路の関連性を、インビボにおけるDICER1喪失との関連で調べた。カスパーゼ-１切断は、BEST1 Cre;Dicer1f/fマウス(これは発生の間にRPEでのDICER1発現を喪失してRPE変性を示す(Kanekoら，2011))のRPEにおいて増大した(図6C)。Dicer1f/fマウスにおけるAAV1-BEST1-Creの網膜下送達は、RPEにおいて、カスパーゼ-１活性化及びIL-18成熟を誘導した(図6D)。この処置はまたRPE変性を誘導した。RPE変性はカスパーゼ-１阻害性ペプチドの硝子体内送達によりブロックされたが、コントロールペプチドの硝子体内送達ではブロックされなかった(図6E)。Dicer1f/fマウスにおけるAAV1-BEST1-Cre誘導RPE変性はまた、MyD88阻害性ペプチドの硝子体内送達によりブロックされたが、コントロールペプチドの硝子体内送達ではブロックされなかった(図6F)。加えて、MyD88阻害は、DICER1を標的するアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したヒトRPE細胞において細胞死を防止した(図6G)。ヒトRPE細胞におけるDICER1ノックダウンは、IRAK1/4リン酸化を増加させた。このことはDICER1の喪失に際するMyD88活性化の更なる証拠を提供する(図6H)。MyD88阻害はまた、Creリコンビナーゼをコードするアデノウイルスベクターで処理したDicer1f/fマウスRPE細胞において細胞死を防止した(図6I)。MyD88阻害は、Dicer1ノックダウンにより誘導されるマイクロRNA発現欠損を回復させることなく、RPE細胞死をブロックした(図6J)。これら知見は、DICER1がNLRP3インフラマソーム活性化の本質的な内因性ネガティブレギュレータであり、DICER1欠損がAlu RNA媒介性、MyD88依存性、マイクロRNA非依存性のRPE変性を導くことを証明する。
ヒトGAにおけるインフラマソーム及びMyD88の活性化
次に、GAを有するヒト眼(RPEにおいてDICER1の喪失及びAlu RNAの蓄積を示す(Kanekoら，2011))もまたインフラマソーム活性化の証拠を示すかどうか調べた。GAを有するヒト眼のRPEにおけるNLRP3 mRNAの量は、コントロールの眼と比較して顕著に増加した(図7A)。IL18 mRNA及びIL1B mRNAの量もまたGA RPEで増加した；しかし、IL18レベルの差のみが統計学的有意に達した(図7A)。免疫局在化研究により、NLRP3、PYCARD及びカスパーゼ-１タンパク質の発現もGA RPEにおいて増加することが示された(図7B〜D)。ウェスタンブロット分析により、GA RPEにおけるNLRP3及びPYCARDの量の増加が確証され、GA RPEにおいて酵素的に活性な切断カスパーゼ-１p20サブユニットのレベルが大きく増大することが明らかになった(図7E)。GA RPEにおいて、リン酸化IRAK1及びIRAK4量も増大した。このことは、MyD88シグナル伝達の増大を示す(図7E)。まとめると、これらデータは、ヒトGAにおけるインサイチュでのNLRP3インフラマソーム及びMyD88の活性化の証拠を提供し、ヒトRPE細胞培養物及びマウスインビボでの機能的データを反映している。
考察
データにより、GAの病状におけるAlu RNAによる先天性免疫センシング経路の破壊についての機能的役割が確立される。まとめると、これら知見は、NLRP3インフラマソームがGA関連Alu RNA危険シグナルを感知し、RPE変性に寄与し、場合によってはAMDにおける視覚喪失に寄与することを証明する(図13)。今日まで、NLRP3インフラマソームの機能は、インビボでは免疫細胞にほとんど限定されていた。NLRP3インフラマソームがRPE細胞生存において重大な機能を演じているという知見は、このインフラマソームの細胞範囲を広げ、他の非免疫細胞がこのプラットフォームを用い得る可能性を生じさせる。
NLRP3インフラマソームは、当初は、外部危険シグナル(例えば、微生物毒素)のセンサとして認識されていた(Kannegantiら，2006；Mariathasanら，2006；Muruveら，2008)。その後、内因性結晶、ポリペプチド及び脂質が、痛風、アテローム発生、アルツハイマー病及び２型糖尿病のような疾患においてNLRP3インフラマソームを活性化することが報告された(Halleら，2008；Mastersら，2010；Muruveら，2008；Wenら，2011)。知る限りでは、Alu RNAは、この免疫プラットフォームを活性化することが知られている最初の内因性核酸である。この知見は、慢性ヒト疾患における内因性危険シグナルの多様性を拡げ、このインフラマソームが代謝危険のセンサであるという概念と一致している(Schroderら，2010)。
インフラマソーム活性化の減弱は、炎症応答の限定に必須であり得る。病原因子は、インフラマソーム活性化を阻害するための多くのストラテジを進化させている(Martinonら，2009)。同様に、宿主の自己貪食タンパク質(Nakahiraら，2011)、Ｉ型インターフェロン(Guardaら，2011)及びＴ細胞のマクロファージとの接触は、このプロセスを阻害し得る(Guardaら，2009)。DICER1がAlu RNAの切断によりNLRP3の活性化を防止するという知見は、宿主インフラマソーム調整能力のレパートリーに加えられ、恒常性抗炎症機序の調節不全が如何にしてAMDを促進し得るかという新たな面を明らかにする(Ambatiら，2003；Takedaら，2009)。
最近記載された抗アポトーシス及び抗腫瘍に関連する機能に加え、DICER1は多才なタンパク質として浮上する。この機能的汎用性(versatility)が種々の状態においてどのように切り替えられるかは決定されるべきままである。DICER1調節不全は幾つかのヒト疾患において認識されることが増えているので、Alu RNAがこれら病状においても危険シグナルを活性化するインフラマソームであり得ると推測することはもっともなことである。また、興味深いことには、少なくとも成体マウスにおいて並びに種々のマウス細胞及びヒト細胞において、DICER1のマイクロRNA生合成機能は少なくともMyD88欠損環境では細胞の生存に重要ではない(データは示さず)。
ミトコンドリアROS産生がAlu RNA誘導RPE変性に関与するというデータは、AMDを有するヒト眼のRPEにおける、ミトコンドリアDNA損傷(Linら，2011)、ミトコンドリアエネルギー産生及び輸送に関与するタンパク質のダウンレギュレーション(Nordgaardら，2008)及びミトコンドリアの数及びサイズの減少(Feherら，2006)という観察と一致する。まとめると、これら知見は、ミトコンドリアROS生成との干渉についての潜在的な治療上の有益性を示唆する。
インフラマソームを標的する現在の臨床プログラムは大部分がIL-1βに焦点を当てている；現在、登録された臨床試験にはIL-18阻害剤は存在しない。しかし、データは、IL-18が、GAにおけるRPE細胞死の媒介に、IL-1βより重要であることを示している(結腸炎モデルにおけるIL-18の選択的関与に類似する(Zakiら，2010))。このことは、インフラマソーム活性化がインターロイキンエフェクターのレベルで又はその直前に二股に分かれる調節機構の存在を指摘する。カスパーゼ-１阻害は魅力的な局所治療ストラテジであり得るが、カスパーゼ阻害剤は代替の細胞死経路を促進し得、おそらくその有用性は限定的である(Vandenabeeleら，2006)。
MyD88は、病原因子関連分子パターンにより開始されるTLRシグナル伝達の変換について最もよく知られている(O'Neill and Bowie, 2007)が、近年、ヒトガンでも示唆されている(Ngoら，2011；Puenteら，2011)。この知見は、網膜変性及び失明を導き得る移動性エレメント転写物からの死シグナルを発することにおけるMyD88の予想し得ない新たな機能を紹介し、MyD88がカスパーゼ-１を用いる他の非NLRP3インフラマソーム(Schroder and Tschopp, 2010)からのシグナルの中央統合装置であり得る可能性を生じさせる。MyD88の非正統な活性化は、GAにおけるRPE変性の重要なチェックポイントである(図13)ので、MyD88は魅力的な治療標的である。マウスにおける重要な抗微生物機能は潜在的な関心事である(O'Neill and Bowie, 2007)。しかし、Myd88-/-マウスとは対照的に、MyD88欠損を有する成人ヒトは、一般に健常であり、広範な種々の微生物病原体に対して耐性であると記載されている(von Bernuthら，2008)。MyD88欠損ヒトは、化膿性細菌感染に対して狭い範囲の感受性を有し、その上、初期の小児期だけであって成人期にはない(Picardら，2010)。更に、siRNA及びMyd88+/-研究から明らかなように、MyD88の部分的阻害は、Alu RNAに対する保護に十分である。局所眼内治療(網膜疾患のほとんどで現時点で標準のケア)は、有害な感染転帰の見込みを更に限定的にする。GAの予防又は治療用のMyD88阻害剤の開発を予見することはもっともである。
実験手順
網膜下注射及び画像化。網膜下注射(１μL)は、Pico-Injector(PLI-100, Harvard Apparatus)を用いて行った。プラスミドは、10％ Neuroporter(Genlantis)を用いてインビボでトランスフェクトした。眼底画像は、デジタル画像化システム(Sony)に連結したTRC-50 IXカメラ(Topcon)で撮影した。RPE平面マウントは、閉鎖帯-１に対する抗体(Invitrogen)を用いて免疫標識した。
mRNA量。転写物量は、Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR systemを用いるリアルタイムRT-PCRで2-ΔΔCt法により定量した。
タンパク質の量及び活性。タンパク質の量は、カスパーゼ-１に対する抗体(1:500；Invitrogen)、pIRAK1に対する抗体(1:500；Thermo Scientific)、pIRAK4に対する抗体(1:500, Abbomax)、PYCARDに対する抗体(1:200, Santa Cruz Biotechnology)、NLRP3に対する抗体(1:500, Enzo Life Sciences)及びビンキュリンに対する抗体(1:1,000；Sigma-Aldrich)を用いるウェスタンブロット分析により評価した。カスパーゼ-１活性は、Caspalux1 E1D2(OncoImmunin)を製造業者の指示に従って用いて視覚化した。
マウス。全ての動物実験は、研究所の審査委員会により承認され、Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Researchに従った。野生型C57BL/6J、Cybb-/-、Tlr3-/-、Tlr4-/-(C57BL/10ScNJ)、Trif-/-(Ticam1Lps2)、Ifng-/-、Ifngr1-/-、Il1r1-/-、Il18r1-/-、Myd88f/f及びDicer1f/fマウスは、The Jackson Laboratoryから購入した。Casp1-/-、Nlrp3-/-及びPycard-/-マウスは以前に記載されている(Kannegantiら，2006)。Unc93b1変異体マウスは、K. Fitzgeraldを介してB.A. Beutlerにより厚意で提供された。Myd88-/-及びTlr7-/-マウスは、T. Hawn及びD.T. Golenbockを介して、S. Akiraにより厚意で提供された。Mda5-/-マウスはM. Colonnaにより厚意で提供された。Prkr-/-マウスはB.R. Williams及びR.L. Silvermanにより厚意で提供された。Mavs-/-マウスはK. Fitzgeraldを介してZ. Chenにより厚意で提供された。全ての手順について、麻酔は、100mg/kg塩酸ケタミン(Ft. Dodge Animal Health)及び10mg/kgキシラジン(Phoenix Scientific)の腹腔内投与により行い、局所１％トロピカミド(Alcon Laboratories)で瞳孔を散大させた。
眼底写真撮影。散大したマウス眼の網膜写真を、デジタル画像化システム(Sony)に連結したTRC-50 IXカメラ(Topcon)で撮影した。
ヒト組織。AMDに起因する地図状萎縮を有する患者又はAMDを有しない年齢適合患者からのドナー眼又は眼組織を、種々のアイバンクから得た。診断は、組織若しくは眼の収集前に散大眼検査により、又は死後の眼球検査に際して確証した。研究は、ヘルシンキ宣言の指針に従った。研究所の審査会は標本の分配及び組織学的分析について認可した。
免疫標識。２〜４％パラホルムアルデヒドで固定したヒト眼を、アイカップとして準備し、30％スクロースで凍結保護し、適切な切断温度の化合物(Tissue-Tek OCT；Sakura Finetek)に包埋し、10μm切片に凍結下で切断した。0.25％過マンガン酸カリウム及び0.1％シュウ酸を用いて脱色を行った。NLRP3に対するウサギ抗体(1:100, Sigma Aldrich)又はカスパーゼ-１に対するウサギ抗体(予め希釈、AbCam)で免疫組織化学染色を行った。一次抗体に代えてアイソタイプIgGを使用して、染色の特異性を評価した。結合抗体は、ビオチン結合二次抗体で検出し、続いてABC試薬とインキュベートし、Vector Blueにより可視化した(Vector Laboratories)。Levamisole(Vector Laboratories)を使用して、内因性アルカリホスファターゼ活性をブロックした。スライドはPBSで洗浄し、ニュートラルレッドで対比染色し(Fisher Scientific)、脱イオン水でリンスし、風乾させた後、Vectamountにマウントした(Vector Laboratories)。ヒト組織の蛍光標識は、PYCARDに対するウサギ抗体(1:50,クローン N-15, Santa Cruz Biotechnology)で行った。免疫標識は、蛍光接合抗ウサギ二次抗体(Invitrogen)により可視化した。組織の自己蛍光は、切片を0.3％スダンブラック(Fisher Scientific)中でインキュベートすることにより消光させた。切片を、DAPIを備えるVectashield(Vector Laboratories)にマウントした。マウスRPE/脈絡膜平面マウントを４％パラホルムアルデヒド又は100％メタノールで固定し、ヒト閉鎖帯-１に対するウサギ抗体(1:100, Invitrogen)で染色し、Alexa594(Invitrogen)で可視化した。画像は全てLeica SP-5又はZeiss Axio Observer Z1顕微鏡を用いて取得した。
網膜下注射。マウスにおける網膜下注射(１μL)は、Pico-Injector(PLI-100, Harvard Apparatus)を用いて行った。２つの異なるAlu配列をコードするプラスミド(pAlu)又は空のコントロールベクター(pNull)(Bennettら，2008；Kanekoら，2011；Shaikhら，1997)のインビボトランスフェクションは、10％ Neuroporter(Genlantis)を用いて達成した。AAV1-BEST1-Cre(Alexander and Hauswirth, 2008)又はAAV1-BEST1-GFPは、1.0×1011pfu/mLで注射し、インビトロ転写Alu RNAは0.3mg/mLで注射した。
薬物処置。siRNAは、siRNA緩衝液(HEPES緩衝液(pH7.5)中、20mM KCL、0.2mM MgCl2；Dharmacon)又はリン酸緩衝化生理食塩水(PBS；Sigma-Aldrich)中に処方した；TLR4アンタゴニストUltra Pure Rhodobacter sphaeroides LPS(LPS-RS, InvivoGen)、MyD88ホモ二量体化のペプチド阻害剤IMG-2005(IMGENEX)、コントロール阻害剤(IMGENEX)、組換えIL-18(Medical & Biological Laboratories)、マウスIL-1βに対するラット中和抗体(IMGENEX)、マウスIL-18に対するラット中和抗体(Medical & Biological Laboratories)、コントロールのアイソタイプIgG(必要に応じてR&D Systems又はeBioscience)、カスパーゼ-１阻害剤Z-WEHD-FMK(R&D Systems)、コントロールのカスパーゼ阻害剤Z-FA-FMK(R&D Systems)、DPI(Enzo Life Sciences)、Mito-TEMPO(Enzo Life Sciences)、MitoQ及びdTPP(共に、シクロデキストリンに吸着。M.P. Murphy(MRC Mitochondrial Biology Unit)より提供)並びにgp91ds-tat及びスクランブルgp91 ds-tat(共にAnaspec)をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS；Sigma-Aldrich)又はジメチルスルホキシド(DMSO；Sigma-Aldrich)に溶解し、総容量１μLで33ゲージExmireマイクロシリンジ(Ito Corporation)を用いて硝子体液中に注射した。pAlu誘導RPE変性に対するMyD88遮断の効果を評価するため、１μLのコレステロール(chol)接合MyD88 siRNA(17＋２nt；２μg/μL)を、pAlu注射の１日後に硝子体内注射した。コントロールとして、Luc siRNA-chol(17＋２nt)を同一用量で使用した。
骨髄キメラ。骨髄移植を使用して、Myd88-/-キメラマウス(Myd88の遺伝子欠損が循環性細胞(Myd88-/-→WT)又は非造血組織(WT→Myd88-/-)のいずれかに限定された)を作製した。簡潔には、骨髄は、類遺伝子型のWT又はMyd88-/-ドナーマウスの大腿骨及び脛骨から、RPMI1640でのフラッシュで回収した。２回の洗浄工程の後、細胞をRPMI1640に再懸濁した。150μLのRPMI1640中１×107細胞を、照射ドナーマウスの尾静脈に注射した。２つのキメラ群を作製した：WT→Myd88-/-(Myd88-/-マウスにWT細胞)及びMyd88-/-→WT(WTマウスにMyd88-/-細胞)。骨髄移植の２ヵ月後、マウスにAlu RNA、ビヒクル、pAlu又はpNullを網膜下注射し、７日後にRPE変性についてモニターした。
リアルタイムPCR。トータルRNAを、Trizol試薬(Invitrogen)を製造業者の推奨に従って用いて組織又は細胞から抽出し、DNase処理し、逆転写させた(QuantiTect, Qiagen)。RT産物(cDNA)を、Power SYBR green Master Mixを備えたリアルタイム定量PCR(Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR system)により増幅した。ヒトIL1Bに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3'及びリバース5'-GCGAATGACAGAGGGTTTCTTAG-3')、ヒトIL18に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-ATCACTTGCACTCCGGAGGTA-3'及びリバース5'-AGAGCGCAATGGTGCAATC-3')、ヒトNLRP3に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-GCACCTGTTGTGCAATCTGAA-3'及びリバース5'-TCCTGACAACATGCTGATGTGA-3')、ヒトPYCARDに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-GCCAGGCCTGCACTTTATAGA-3'及びリバース5'-GTTTGTGACCCTCGCGATAAG-3')、ヒトVDAC1に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-ACTGCAAAATCCCGAGTGAC-3'及びリバース5'-CTGTCCAGGCAAGATTGACA-3')、ヒトVDAC2に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-CAGTGCCAAATCAAAGCTGA-3'及びリバース5'-CCTGATGTCCAAGCAAGGTT-3')、ヒトVDAC3に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-TTGACACAGCCAAATCCAAA-3'及びリバース5'-GCCAAAACGGGTGTTGTTAC-3')、ヒト18S rRNAに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3'及びリバース5'-GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3')、マウスMyd88に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-CACCTGTGTCTGGTCCATTG-3'及びリバース5'-AGGCTGAGTGCAAACTTGGT-3')、マウスNlrp3に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3'及びリバース5'-AACCAATGCGAGATCCTGAC-3')、マウスIl18に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-GACAGCCTGTGTTCGAGGAT-3'及びリバース5'-TGGATCCATTTCCTCAAAGG-3')及びマウス18S rRNAに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-TTCGTATTGCGCCGCTAGA-3'及びリバース5'-CTTTCGCTCTGGTCCGTCTT-3')を使用した。QPCRサイクル条件は、50℃にて２分間、95℃にて10分間、続いて40サイクルの２工程増幅プログラム(95℃にて15秒間及び58℃にて１分間)であった。増幅の終時に、Sequence Detection system社の解離プロトコールを用いて融解曲線分析を適用して、非特異PCR産物の混入を排除した。PCR産物はアガロースゲルによっても確証し、予想サイズに唯一の特異バンドが示された。ネガティブコントロールについては、QPCRにおいてRT産物なしをテンプレートとして使用し、ゲルにより検出されるバンドの不在により検証した。標的遺伝子の相対的発現を2-ΔΔCt法により決定した。
miRNA定量。miRNAを含有するトータルRNAをポリアデニル化し、ユニバーサルリバースプライマーを下記のフォワードプライマーと組み合わせて用いるAll-In-One miRNA q-RT-PCR Detection Kit(GeneCopoeia)を製造業者の仕様に従って用いてユニバーサルプライマーで逆転写した：マウスmiR-184(5'-TGGACGGAGAACTGATAAGGGT-3')；マウスmiR-221/222(5'-AGCTACATCTGGCTACTGGGT-3')；マウスmiR-320a(5'-AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGA-3')及びマウスmiR-484(5'-TCAGGCTCAGTCCCCTCCCGAT-3')。miRNAレベルは、2-ΔΔCt法を用いるU6 snRNA(5'-AAATTCGTGAAGCGTTCC-3')のレベルに対して規格化した。検出は、下記の条件でSYBR green qPCRにより行った：95℃にて10分間、続いて40サイクルの95℃にて10秒間、60℃にて20秒間及び72℃にて20秒間。アンプリコン特異性は、融解曲線分析及びアガロースゲル電気泳動による独特なバンドによって評価した。
ウェスタンブロッティング。組織又は細胞を、溶解緩衝液(10mM Tris塩基、pH7.4、150mM NaCl、１mM EDTA、１mM EGTA、１％ Triton X-100、0.5％ NP-40、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル(Roche))中でホモジナイズした。タンパク質濃度は、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いてBradfordアッセイキット(Bio-Rad)で決定した。タンパク質(40〜100μg)をNuPAGE Bis-Trisゲル(Invitrogen)上で泳動し、Immun-Blot PVDFメンブレン(Bio-Rad)に転移させた。細胞は、温Laemmli緩衝液(62.5mM Tris塩基、pH6.8、２％SDS、５％ 2-メルカプトエタノール、10％グリセロール、0.01％ブロモフェノールブルー)中に擦り取った。サンプルを沸騰させ、４〜20％ NuPAGE Tris-Glycineゲル(Invitrogen)上で泳動した。転移メンブレンをRTにて１時間ブロックし、ヒトカスパーゼ-１に対する抗体(1:500；Invitrogen)、マウスカスパーゼ１に対する抗体(1:500；MBL)、NLRP3に対する抗体(1:1000；Enzo Life Sciences)、PYCARDに対する抗体(1:1000, RayBiotech)、ホスホ-IRAK1(S376)に対する抗体(1:500, Thermo Scientific)、ホスホ-IRAK4(T345)に対する抗体(1:500, AbboMax)、DICER1に対する抗体(1:2,000；Bethyl)、MyD88に対する抗体(1:1,000；細胞シグナル伝達)及びマウスIL-18に対する抗体(1:200；MBL)と４℃にて一晩インキュベートした。タンパク質負荷量は、抗ビンキュリン抗体(1:1,000；Sigma-Aldrich)を用いる免疫ブロッティングにより評価した。二次抗体(1:5,000)をRTにて１時間使用した。シグナルは、増強化学発光(ECL plus)により視覚化し、VisionWorksLS Image Acquisition and Analysisソフトウェア(Version 6.7.2, UVP, LLC)により取り込んだ。
細胞培養。全ての細胞培養物を37℃にて５％ CO2で維持した。初代マウスRPE細胞は以前(Yangら，2009)に記載されたように単離し、20％ FBS及び標準の抗生物質濃度を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で増殖させた。初代ヒトRPE細胞は以前(Yangら，2008)に記載されたように単離し、10％ FBS及び抗生物質を補充したDMEMで維持した。HeL細胞は、20％ FBS及び標準の抗生物質濃度を補充したDMEMで維持した。THP-1細胞は、10％ FBS及び抗生物質を補充したRPMI 1640培地で培養した。
Alu RNAのインビトロ転写。２種のAlu RNAを合成した：cDNAクローンTS 103を起源とする281nt Alu配列(Shaikhら，1997)及び地図状萎縮を有するヒト眼のRPEから単離した302nt Alu配列。これらAlu配列を隣接の5' T7プロモーターと共に含有する線状化プラスミドを、製造業者の指示に従ってAmpliScribeTM T7-FlashTM Transcriptionキット(Epicentre)に供した。DNase処理RNAを、MEGAclearTM(Ambion)を用いて精製し、完全性をゲル電気泳動によりモニターした。このことにより、Pol III由来転写物と同一の規定された二次構造に折り畳まれる一本鎖RNAが得られる。示される場合、転写RNAはウシ腸アルカリホスファターゼ(Invitrogen)を用いて脱リン酸化し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール沈降により再精製した。
一過性トランスフェクション。ヒト又はマウスのRPE細胞は、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて、pUC19、pAlu、pCDNA3.1/Dicer-FLAG、pCDNA3.1、Alu RNA、NLRP3 siRNAセンス(5'-GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT-3')、PYCARD siRNAセンス(5'-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3')、MyD88 siRNAセンス(センス：5'-CAGAGCAAGGAAUGUGAdTdT-3')、VDAC1 siRNAセンス(5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3')、VDAC2 siRNAセンス(5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3')、VDAC3 siRNAセンス(5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3')、DICER1アンチセンスオリゴヌクレオチド(AS)(5'-GCUGACCTTTTTGCTUCUCA-3')、コントロール(DICER1用)のAS(5'-TTGGTACGCATACGTGTTGACTGTGA-3')、Alu AS(5'-CCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCACGAGTAGCTGGGACTACAGGCGCCCGACACCACTCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTT-3')、コントロール(Alu用)のAS(5'-GCATGGCCAGTCCATTGATCTTGCACGCTTGCCTAGTACGCTCCTCAACCTATCCTCCTAGCCCGTTACTTGGTGCCACCGGCG-3')でトランスフェクトした。
アデノウイルス感染。細胞を15×103/cm2の密度で播種し、16時間後、約50％コンフルーエンス時に、細胞にAdCre又はAdNull(Vector Laboratories)を1,000の多重感染度で感染させた。
細胞生存能。MTSアッセイを、CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferationアッセイ(Promega)を製造業者の指示に従って用いて行った。Alu RNA誘導細胞死におけるグリシンの細胞保護効果を調べるために、ヒトRPE細胞をpNull/pAluでトランスフェクトした。トランスフェクション後６時間で、細胞を、グリシン(５mM)含有完全培地又はビヒクルとインキュベートし、24時間後に細胞生存能を評価した。同様に、LPS(５μg/mlで６時間)でプライムしたヒトRPE細胞を、グリシン含有培地(５mM)の存在下にATP(25μM)で処理した。ATP処理の30分後に細胞生存能を上記のように評価した。
カスパーゼ-１活性。カスパーゼ-１活性は、細胞をCaspalux1E1D2試薬(OncoImmunin)と共に製造業者の指示に従ってインキュベートすることにより可視化した。Caspalux1E1D2シグナルは、Synergy 4リーダー(Biotek)を用いて蛍光(励起552nm、発光580nm)を読み取って定量した。画像からの蛍光の定量は、Adobe Photoshop CS5において画像をグレースケールに変換し、ImageJソフトウェア(NIH)(Bogdanovichら，2008)を用いて白黒画像の積算密度を測定することにより行った。
ROS産生。細胞ROS産生は、ROS特異的プローブ2'7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(H2DCFDA, BioChemica, Fluka)を用いて評価した。ミトコンドリアROS産生は、MitoSOXTM Red(Invitrogen)を用いて評価した。サブコンフルーエントのヒトRPE細胞をpNull又はpAluでトランスフェクトした。24時間後、細胞に、10μMのH2DCFDA又は生存細胞の画像化用のMitoSOXTM Red(Invitrogen)ミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターを37℃にて10分間ロードし、PBSで２回洗浄した。H2DCFDAについては、蛍光を、96ウェルプレート中、FITCフィルター(励起485nm、発光538nm)を用いてSynergy 4リーダー(Biotek)で記録した。ミトコンドリアROSシグナルとの共定位のために呼吸ミトコンドリアを可視化するため、PBS洗浄後、細胞をMitoTracker Deep RedTM(Invitrogen)と共に37℃にて30分間インキュベートし、その後PBSで２回洗浄した。蛍光シグナルは、Leica SP-5又はZeiss Axio Observer Z1顕微鏡を用いて検出した。ファゴソームROS産生は、Fc-OXYBURST GreenTMアッセイ(Invitrogen)を用いて評価した。サブコンフルーエントなヒトRPE細胞をpNull又はpAluでトランスフェクトしたか、又はPMA(0.5μg/ml；Sigma-Aldrich)で処理した。細胞をクレブスリンガーPBS(KRP)と共に37℃にて20分間インキュベートした後、Fc-OXYBURST GreenTMを添加した。細胞からの総蛍光を、Fc-OXYBURST GreenTMの添加直後に、FITCフィルター(励起485nm、発光538nm)を用いてSynergy 4リーダー(Biotek)で測定した。
RNA結合性タンパク質免疫沈降(RIP)：NLRP3とAlu RNAとの間の物理的相互作用を、RNA ChIP-ITキットを製造業者(Active Motif)の指示に従って用いて調べた。簡潔には、ヒトRPE細胞をpAlu及びpNLRP3-FLAG(G. Nunezより提供)でトランスフェクトし、タンパク質-RNA複合体を、NLRP3に対する抗体(Enzo Life Sciences)若しくはFLAG(Sigma-Aldrich)に対する抗体又はコントロールIgG(Sigma-Aldrich)で免疫沈降させた。これら免疫沈降物から単離したRNAを、Alu特異的プライマーを用いるリアルタイムRT-PCRにより分析した。
ELISA。馴化細胞培養培地中の分泌サイトカイン含量を、ヒトIL-1β及びIL-18 ELISAキット(R&D)を製造業者の指示に従って用いて分析した。
TLRスクリーニング。カスタムTLRリガンドスクリーニングを、個々のTLRファミリーメンバーを過剰発現するHEK293細胞をAP-1/NF-κBレポーター系と組み合わせて用いるInvivoGenにより行った。細胞は、インビトロ転写により合成した２種のAlu RNAの各々又はTLR特異的ポジティブコントロールリガンドで刺激した。
統計学。結果は、平均±SEMとして表し、ｐ<0.05を統計学的に有意と見なす。群間の差は、必要に応じてマンホイットニーＵ検定又はスチューデントｔ検定を用いて比較し、両側ｐ値を報告する。
実施例２
インビトロ転写Alu RNA及びAluをコードするプラスミド(pAlu)が共にIL-18分泌を誘導することによりRPE細胞死を誘導し、IL-18分泌がカスパーゼ-３活性化を導くMyD88依存性シグナル伝達を誘引することが示された。この細胞死経路に介在する機序工程を決定することが求められた。
カスパーゼ-８はカスパーゼ-３を活性化することが知られている(Stennickeら，1998)。したがって、カスパーゼ-８阻害がAlu RNA又はpAluにより誘導されるRPEの細胞死又は変性を阻害するかどうかを調べた。カスパーゼ-８阻害性ペプチドZ-IETD-FMKは、野生型マウスにおいてpAluにより誘導されるRPE変性をブロックするが、コントロールペプチドZ-FA-FMKはブロックしないことが見出された(図14)。Z-IETD-FMKはまた、Alu RNA(図15)又はpAlu (図16)により誘導されるヒトRPE細胞死を阻害した。組換えIL-18の網膜下注射が、野生型マウスのRPEにおいて、蛍光アッセイによりモニターされるように、カスパーゼ-８の活性化を誘導することも見出された(図17)。これらデータは、Alu RNA-又はpAlu誘導IL-18がカスパーゼ-３活性化の上流でカスパーゼ-８活性化を導くことを示唆する。
MyD88は、Fas関連死ドメインタンパク質(FADD)に結合し、カスパーゼ８を介してアポトーシスを誘導することが知られている(Aliprantisら，2000)。したがって、Fas(CD95によりコードされる)又はFasL(Faslgによりコードされる)の除去がAlu RNA、pAlu又はIL-18により誘導されるRPEの細胞死又は変性を阻害するかどうかを調べた。pAlu(図18)もAlu RNA(図19)もCD95-/-(Faslpr)マウスにおいてRPE変性を誘導しないことが見出された。加えて、組換えIL-18もまた、CD95-/-(Faslpr)マウスにおいてRPE変性を誘導しなかった(図20)。同様に、pAlu(図21)、Alu RNA(図22)及びIL-18(図23)は、Faslg-/-(Faslgld)マウスにおいてRPE変性を誘導しなかった。
Alu RNAはNLRP3インフラマソームを介してRPE変性を誘導することが示されている。NF-κB活性化はNLRP3活性化に必要とされる(Bauernfeindら，2009；Qiaoら，2012)ので、Alu RNAがRPE変性を誘導するためにNF-κBを必要とするかどうかを調べた。事実、Alu RNAはNfkb1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しないことが見出された。このことは、NF-κB活性化がこの細胞死経路における重要な工程であることを確証する。
実験手順
マウス。全ての動物実験は、研究所の審査委員会により承認され、Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Researchに従った。野生型C57BL/6J、Fas-/-(CD95又はFaslprとしても知られる)、Faslg-/-(Fasgldとしても知られる)及びNfkb1-/-マウスはThe Jackson Laboratoryから購入した。全ての手順について、麻酔は、100mg/kg塩酸ケタミン(Ft. Dodge Animal Health)及び10mg/kgキシラジン(Phoenix Scientific)の腹腔内投与により行い、局所１％トロピカミド(Alcon Laboratories)で瞳孔を散大させた。
眼底写真撮影。散大したマウス眼の網膜写真を、デジタル画像化システム(Sony)に連結したTRC-50 IXカメラ(Topcon)で撮影した。
網膜下注射。マウスにおける網膜下注射(１μL)は、Pico-Injector(PLI-100, Harvard Apparatus)を用いて行った。２つの異なるAlu配列をコードするプラスミド(pAlu)又は空のコントロールベクター(pNull)(Bennettら，2008；Kanekoら，2011；Shaikhら，1997)のインビボトランスフェクションは、10％ Neuroporter(Genlantis)を用いて達成した。インビトロ転写Alu RNAは0.3mg/mLで注射した。
薬物処置。組換えIL-18(Medical & Biological Laboratories)、カスパーゼ-８阻害剤Z-IETD-FMK(R&D Systems)、コントロールカスパーゼ阻害剤Z-FA-FMK(R&D Systems)、IRAK1/4阻害剤(Calbiochem)は、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS；Sigma-Aldrich)又はジメチルスルホキシド(DMSO；Sigma-Aldrich)に溶解し、総容量１μLで33ゲージExmireマイクロシリンジ(Ito Corporation)を用いて硝子体液中に注射した。
細胞培養。全ての細胞培養物を37℃にて５％ CO2で維持した。初代マウスRPE細胞は以前(Yangら，2009)に記載されたように単離し、20％ FBS及び標準の抗生物質濃度を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で増殖させた。初代ヒトRPE細胞は以前(Yangら，2008)に記載されたように単離し、10％ FBS及び抗生物質を補充したDMEMで維持した。HeL細胞は、20％ FBS及び標準の抗生物質濃度を補充したDMEMで維持した。THP-1細胞は、10％ FBS及び抗生物質を補充したRPMI 1640培地で培養した。
Alu RNAのインビトロ転写。我々は、地図状萎縮を有するヒト眼のRPEから単離した302nt Alu配列を合成した。このAlu配列を隣接の5' T7プロモーターと共に含有する線状化プラスミドを、製造業者の指示に従ってAmpliScribeTMT7-FlashTM Transcriptionキット(Epicentre)に供した。DNase処理RNAを、MEGAclearTM(Ambion)を用いて精製し、完全性をゲル電気泳動によりモニターした。このことにより、Pol III由来転写物と同一の規定された二次構造に折り畳まれる一本鎖RNAが得られる。示される場合、転写RNAはウシ腸アルカリホスファターゼ(Invitrogen)を用いて脱リン酸化し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール沈降により再精製した。
一過性トランスフェクション。ヒトRPE細胞は、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて、pUC19、pAlu、Alu RNA、VDAC1 siRNAセンス(5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3')、VDAC2 siRNAセンス(5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3')、VDAC3 siRNAセンス(5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3')でトランスフェクトした。
細胞生存能。MTSアッセイを、CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferationアッセイ(Promega)を製造業者の指示に従って用いて行った。
カスパーゼ-８活性。RPE組織を、溶解緩衝液(10mM Tris塩基、pH7.4、150mM NaCl、１mM EDTA、１mM EGTA、１％ Triton X-100、0.5％ NP-40、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル(Roche))中でホモジナイズした。タンパク質濃度は、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いてBradfordアッセイキット(Bio-Rad)で決定した。カスパーゼ-３活性は、Caspase-8 Fluorimetric Assay(R&D)を製造業者の指示に従って用いて測定した。
統計学。結果は、平均±SEMとして表し、ｐ<0.05を統計学的に有意と見なす。群間の差は、必要に応じてマンホイットニーＵ検定又はスチューデントｔ検定を用いて比較し、両側ｐ値を報告する。
カスパーゼ画像化法
Alu RNA又は組換えIL-18を、０日目に野生型マウスの網膜下腔に注射した。DyeLight782-VAD-FMK3(ThermoScientific)(生物活性カスパーゼの存在下に蛍光を発するプローブ)を、注射後２日目又は３日目に野生型マウスの硝子体液中に注射した。
平面マウント画像化。DyeLight782-VAD-FMK3の注射後24時間で、アイカップをマウスから切り出し、神経網膜を除去し、RPEの平面マウントを調製し、蛍光顕微鏡下で観察した。
生存眼におけるインビボバイオ画像化。DyeLight782-VAD-FMK3の注射後０〜24時間の間に、ICGフィルターを用いてTopcon 50IXカメラで眼底写真を撮影した。
本明細書を通じて、種々の参考文献が挙げられる。このような全ての参考文献は、各個の参考文献が個別具体的に参照により組み込まれる場合と同程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。参考文献には、以下のリストに記載される参考文献が含まれる：
参考文献
1) Abreu, M. T., M. Fukata, et al. (2005). "TLR signaling in the gut in health and disease." J Immunol 174(8): 4453-4460.
2) Adachi, O., Kawai, T., Takeda, K., Matsumoto, M., Tsutsui, H., Sakagami, M., Nakanishi, K., and Akira, S. (1998). Targeted disruption of the MyD88 gene results in loss of IL-1- and IL-18-mediated function. Immunity 9, 143-150.
3) Aeffner, F., Z. P. Traylor, et al. (2011). "Double-stranded RNA induces similar pulmonary dysfunction to respiratory syncytial virus in BALB/c mice." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 301(1): L99-L109.
4) Akira, S., Uematsu, S., and Takeuchi, O. (2006). Pathogen recognition and innate immunity. Cell 124, 783-801.
5) Alegre, M. L., J. Leemans, et al. (2008). "The multiple facets of toll-like receptors in transplantation biology." Transplantation 86(1): 1-9.
6) Alexander, J. J. & Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol 613, 121-128 (2008).
7) Alexopoulou, L., Holt, A.C., Medzhitov, R., and Flavell, R.A. (2001). Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature 413, 732-738.
8) Aliprantis, A. O., Yang, R. B., Weiss, D. S., et al. (2000). "The apoptotic signaling pathway activated by Toll-like receptor-2." EMBO J 19(13): 3325-3336.
9) Allensworth, J.J., Planck, S.R., Rosenbaum, J.T., and Rosenzweig, H.L. (2011). Investigation of the differential potentials of TLR agonists to elicit uveitis in mice. J Leukoc Biol.
10) Ambati, J., Ambati, B.K., Yoo, S.H., Ianchulev, S., and Adamis, A.P. (2003). Age-related macular degeneration: etiology, pathogenesis, and therapeutic strategies. Surv Ophthalmol 48, 257-293.
11) Anders, H. J., B. Banas, et al. (2004). "Signaling danger: toll-like receptors and their potential roles in kidney disease." J Am Soc Nephrol 15(4): 854-867.
12) Anders, H. J. and D. Schlondorff (2007). "Toll-like receptors: emerging concepts in kidney disease." Curr Opin Nephrol Hypertens 16(3): 177-183.
13) Babu, S., C. P. Blauvelt, et al. (2005). "Diminished expression and function of TLR in lymphatic filariasis: a novel mechanism of immune dysregulation." J Immunol 175(2): 1170-1176.
14) Banas, M. C., B. Banas, et al. (2008). "TLR4 links podocytes with the innate immune system to mediate glomerular injury." J Am Soc Nephrol 19(4): 704-713.
15) Barrat, F. J. and R. L. Coffman (2008). "Development of TLR inhibitors for the treatment of autoimmune diseases." Immunol Rev 223: 271-283.
16) Batsford, S., U. Duermueller, et al. (2011). "Protein level expression of Toll-like receptors 2, 4 and 9 in renal disease." Nephrol Dial Transplant 26(4): 1413-1416.
17) Batzer, M.A., and Deininger, P.L. (2002). Alu repeats and human genomic diversity. Nat Rev Genet 3, 370-379.
18) Bauernfeind, F., Bartok, E., Rieger, A., Franchi, L., Nunez, G., and Hornung, V. (2011). Cutting edge: reactive oxygen species inhibitors block priming, but not activation, of the NLRP3 inflammasome. J Immunol 187, 613-617.
19) Bauernfeind, F. G. et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol 183, 787-791 (2009).
20) Benedict, C. A. & Ware, C. F. Poxviruses aren't stuPYD. Immunity 23, 553-555, doi:10.1016/j.immuni.2005.11.008 (2005).
21) Bennett, E.A., Keller, H., Mills, R.E., Schmidt, S., Moran, J.V., Weichenrieder, O., and Devine, S.E. (2008). Active Alu retrotransposons in the human genome. Genome Res 18, 1875-1883.
22) Bernstein, E., Caudy, A.A., Hammond, S.M., and Hannon, G.J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409, 363-366.
23) Blaauwgeers, H.G., Holtkamp, G.M., Rutten, H., Witmer, A.N., Koolwijk, P., Partanen, T.A., Alitalo, K., Kroon, M.E., Kijlstra, A., van Hinsbergh, V.W., et al. (1999). Polarized vascular endothelial growth factor secretion by human retinal pigment epithelium and localization of vascular endothelial growth factor receptors on the inner choriocapillaris. Evidence for a trophic paracrine relation. Am J Pathol 155, 421-428.
24) Bogdanovich, S., McNally, E.M., and Khurana, T.S. (2008). Myostatin blockade improves function but not histopathology in a murine model of limb-girdle muscular dystrophy 2C. Muscle Nerve 37, 308-316.
25) Brichacek, B., C. Vanpouille, et al. (2010). "Contrasting roles for TLR ligands in HIV-1 pathogenesis." PLoS One 5(9).
26) Cao, Z., Henzel, W.J., and Gao, X. (1996). IRAK: a kinase associated with the interleukin-1 receptor. Science 271, 1128-1131.
27) Chen, C. J., Y. Shi, et al. (2006). "MyD88-dependent IL-1 receptor signaling is essential for gouty inflammation stimulated by monosodium urate crystals." J Clin Invest 116(8): 2262-2271.
28) Chen, H., E. Koustova, et al. (2007). "Differential effect of resuscitation on Toll-like receptors in a model of hemorrhagic shock without a septic challenge." Resuscitation 74(3): 526-537.
29) Cremer, J., M. Martin, et al. (1996). "Systemic inflammatory response syndrome after cardiac operations." Ann Thorac Surg 61(6): 1714-1720.
30) Cristofaro, P. and S. M. Opal (2003). "The Toll-like receptors and their role in septic shock." Expert Opin Ther Targets 7(5): 603-612.
31) Curtiss, L. K. and P. S. Tobias (2009). "Emerging role of Toll-like receptors in atherosclerosis." J Lipid Res 50 Suppl: S340-345.
32) de Rivero Vaccari, J. P., Lotocki, G., Marcillo, A. E., Dietrich, W. D. & Keane, R. W. A molecular platform in neurons regulates inflammation after spinal cord injury. J Neurosci 28, 3404-3414, doi:10.1523/JNEUROSCI.0157-08.2008 (2008).
33) Devaraj, S., P. Tobias, et al. (2011). "Knockout of Toll-Like Receptor-2 Attenuates Both the Proinflammatory State of Diabetes and Incipient Diabetic Nephropathy." Arterioscler Thromb Vasc Biol.
34) Dhellin, O., Maestre, J., and Heidmann, T. (1997). Functional differences between the human LINE retrotransposon and retroviral reverse transcriptases for in vivo mRNA reverse transcription. EMBO J 16, 6590-6602.
35) Diebold, S.S., Kaisho, T., Hemmi, H., Akira, S., and Reis e Sousa, C. (2004). Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA. Science 303, 1529-1531.
36) Dorfleutner, A. et al. A Shope Fibroma virus PYRIN-only protein modulates the host immune response. Virus Genes 35, 685-694, doi:10.1007/s11262-007-0141-9 (2007).
37) Dorfleutner, A. et al. Cellular pyrin domain-only protein 2 is a candidate regulator of inflammasome activation. Infect Immun 75, 1484-1492, doi:10.1128/IAI.01315-06 (2007).
38) Dostert, C. et al. Innate immune activation through Nalp3 inflammasome sensing of asbestos and silica. Science 320, 674-677, doi:10.1126/science.1156995 (2008).
39) Dostert, C. et al. Malarial hemozoin is a Nalp3 inflammasome activating danger signal. PLoS One 4, e6510, doi:10.1371/journal.pone.0006510 (2009).
40) Dybdahl, B., A. Wahba, et al. (2002). "Inflammatory response after open heart surgery: release of heat-shock protein 70 and signaling through toll-like receptor-4." Circulation 105(6): 685-690.
41) El-Achkar, T. M. and P. C. Dagher (2006). "Renal Toll-like receptors: recent advances and implications for disease." Nat Clin Pract Nephrol 2(10): 568-581.
42) Feher, J., Kovacs, I., Artico, M., Cavallotti, C., Papale, A., and Balacco Gabrieli, C. (2006). Mitochondrial alterations of retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration. Neurobiol Aging 27, 983-993.
43) Feldmeyer, L., Keller, M., Niklaus, G., Hohl, D., Werner, S., and Beer, H.D. (2007). The inflammasome mediates UVB-induced activation and secretion of interleukin-1beta by keratinocytes. Curr Biol 17, 1140-1145.
44) Fernandes-Alnemri, T., Wu, J., Yu, J.W., Datta, P., Miller, B., Jankowski, W., Rosenberg, S., Zhang, J., and Alnemri, E.S. (2007). The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death Differ 14, 1590-1604.
45) Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor and age-related macular degeneration: from basic science to therapy. Nat Med 16, 1107-1111 (2010).
46) Fink, S.L., Bergsbaken, T., and Cookson, B.T. (2008). Anthrax lethal toxin and Salmonella elicit the common cell death pathway of caspase-1-dependent pyroptosis via distinct mechanisms. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 4312-4317.
47) Fink, S.L., and Cookson, B.T. (2006). Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol 8, 1812-1825.
48) Franklin, B. S., S. T. Ishizaka, et al. (2011). "Therapeutical targeting of nucleic acid-sensing Toll-like receptors prevents experimental cerebral malaria." Proc Natl Acad Sci U S A 108(9): 3689-3694.
49) Frantz, S., K. A. Vincent, et al. (2005). "Innate immunity and angiogenesis." Circ Res 96(1): 15-26.
50) Fresno, M., R. Alvarez, et al. (2011). "Toll-like receptors, inflammation, metabolism and obesity." Arch Physiol Biochem 117(3): 151-164.
51) Geraghty, P., A. J. Dabo, et al. (2011). "TLR-4 contributes to cigarette smoke (CS) induced matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) expression in chronic obstructive pulmonary disease." J Biol Chem.
52) Ghanim, H., P. Mohanty, et al. (2008). "Acute modulation of toll-like receptors by insulin." Diabetes Care 31(9): 1827-1831.
53) Ghayur, T., Banerjee, S., Hugunin, M., Butler, D., Herzog, L., Carter, A., Quintal, L., Sekut, L., Talanian, R., Paskind, M., et al. (1997). Caspase-1 processes IFN-gamma-inducing factor and regulates LPS-induced IFN-gamma production. Nature 386, 619-623.
54) Gregory, S. M. et al. Discovery of a viral NLR homolog that inhibits the inflammasome. Science 331, 330-334, doi:10.1126/science.1199478 (2011).
55) Gu, Y., Kuida, K., Tsutsui, H., Ku, G., Hsiao, K., Fleming, M.A., Hayashi, N., Higashino, K., Okamura, H., Nakanishi, K., et al. (1997). Activation of interferon-gamma inducing factor mediated by interleukin-1beta converting enzyme. Science 275, 206-209.
56) Guarda, G., Braun, M., Staehli, F., Tardivel, A., Mattmann, C., Forster, I., Farlik, M., Decker, T., Du Pasquier, R.A., Romero, P., et al. (2011). Type I interferon inhibits interleukin-1 production and inflammasome activation. Immunity 34, 213-223.
57) Guarda, G., Dostert, C., Staehli, F., Cabalzar, K., Castillo, R., Tardivel, A., Schneider, P., and Tschopp, J. (2009). T cells dampen innate immune responses through inhibition of NLRP1 and NLRP3 inflammasomes. Nature 460, 269-273.
58) Guo, H., J. Gao, et al. (2011). "Toll-like receptor 2 siRNA suppresses corneal inflammation and attenuates Aspergillus fumigatus keratitis in rats." Immunol Cell Biol.
59) Halle, A., Hornung, V., Petzold, G.C., Stewart, C.R., Monks, B.G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K.A., Latz, E., Moore, K.J., and Golenbock, D.T. (2008). The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat Immunol 9, 857-865.
60) Heil, F., Hemmi, H., Hochrein, H., Ampenberger, F., Kirschning, C., Akira, S., Lipford, G., Wagner, H., and Bauer, S. (2004). Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science 303, 1526-1529.
61) Hilbi, H., Chen, Y., Thirumalai, K. & Zychlinsky, A. The interleukin 1beta-converting enzyme, caspase 1, is activated during Shigella flexneri-induced apoptosis in human monocyte-derived macrophages. Infect Immun 65, 5165-5170 (1997).
62) Hoebe, K., Du, X., Georgel, P., Janssen, E., Tabeta, K., Kim, S.O., Goode, J., Lin, P., Mann, N., Mudd, S., et al. (2003). Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88-independent TIR signalling. Nature 424, 743-748.
63) Hornung, V., Ellegast, J., Kim, S., Brzozka, K., Jung, A., Kato, H., Poeck, H., Akira, S., Conzelmann, K.K., Schlee, M., et al. (2006). 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science 314, 994-997.
64) Humke, E. W., Shriver, S. K., Starovasnik, M. A., Fairbrother, W. J. & Dixit, V. M. ICEBERG: a novel inhibitor of interleukin-1beta generation. Cell 103, 99-111 (2000).
65) Hurtado, P. R., L. Jeffs, et al. (2008). "CpG oligodeoxynucleotide stimulates production of anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in ANCA associated vasculitis." BMC Immunol 9: 34.
66) Hutton, M. J., G. Soukhatcheva, et al. (2010). "Role of the TLR signaling molecule TRIF in beta-cell function and glucose homeostasis." Islets 2(2): 104-111.
67) Jenssens et al. Regulation of Interleukin-1- and Lipopolysaccharide-Induced NF-κB Activation by Alternative Splicing of MyD88. Current Biology 2002; 12:467-71.
68) Jiang, J., Stoyanovsky, D.A., Belikova, N.A., Tyurina, Y.Y., Zhao, Q., Tungekar, M.A., Kapralova, V., Huang, Z., Mintz, A.H., Greenberger, J.S., et al. (2009). A mitochondria-targeted triphenylphosphonium-conjugated nitroxide functions as a radioprotector/mitigator. Radiat Res 172, 706-717.
69) Johnston, J. B. et al. A poxvirus-encoded pyrin domain protein interacts with ASC-1 to inhibit host inflammatory and apoptotic responses to infection. Immunity 23, 587-598, doi:10.1016/j.immuni.2005.10.003 (2005).
70) Juliana, C. et al. Anti-inflammatory compounds parthenolide and Bay 11-7082 are direct inhibitors of the inflammasome. J Biol Chem 285, 9792-9802, doi:10.1074/jbc.M109.082305 (2010).
71) Kanakaraj, P., Ngo, K., Wu, Y., Angulo, A., Ghazal, P., Harris, C.A., Siekierka, J.J., Peterson, P.A., and Fung-Leung, W.P. (1999). Defective interleukin (IL)-18-mediated natural killer and T helper cell type 1 responses in IL-1 receptor-associated kinase (IRAK)-deficient mice. J Exp Med 189, 1129-1138.
72) Kaneko, H., Dridi, S., Tarallo, V., Gelfand, B.D., Fowler, B.J., Cho, W.G., Kleinman, M.E., Ponicsan, S.L., Hauswirth, W.W., Chiodo, V.A., et al. (2011). DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration. Nature 471, 325-330.

73) Kanneganti, T.D., Ozoren, N., Body-Malapel, M., Amer, A., Park, J.H., Franchi, L., Whitfield, J., Barchet, W., Colonna, M., Vandenabeele, P., et al. (2006). Bacterial RNA and small antiviral compounds activate caspase-1 through cryopyrin/Nalp3. Nature 440, 233-236.
74) Kato, H., Takeuchi, O., Sato, S., Yoneyama, M., Yamamoto, M., Matsui, K., Uematsu, S., Jung, A., Kawai, T., Ishii, K.J., et al. (2006). Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature 441, 101-105.
75) Keller, M., Ruegg, A., Werner, S., and Beer, H.D. (2008). Active caspase-1 is a regulator of unconventional protein secretion. Cell 132, 818-831.
76) Kettle, S. et al. Vaccinia virus serpin B13R (SPI-2) inhibits interleukin-1beta-converting enzyme and protects virus-infected cells from TNF- and Fas-mediated apoptosis, but does not prevent IL-1beta-induced fever. J Gen Virol 78 ( Pt 3), 677-685 (1997).
77) Kleinman, M.E., Kaneko, H., Cho, W.G., Dridi, S., Fowler, B.J., Blandford, A.D., Albuquerque, R.J., Hirano, Y., Terasaki, H., Kondo, M., et al. (2012). Short-interfering RNAs Induce Retinal Degeneration via TLR3 and IRF3. Mol Ther. 20, 101-108.
78) Kleinman, M. E. et al. Short interfering RNAs induce retinal degeneration via TLR3 and IRF3. Mol Ther, In press (2011).
79) Kleinman, M.E., Yamada, K., Takeda, A., Chandrasekaran, V., Nozaki, M., Baffi, J.Z., Albuquerque, R.J., Yamasaki, S., Itaya, M., Pan, Y., et al. (2008). Sequence- and target-independent angiogenesis suppression by siRNA via TLR3. Nature 452, 591-597.
80) Knuefermann, P., S. Nemoto, et al. (2002). "Cardiac inflammation and innate immunity in septic shock: is there a role for toll-like receptors?" Chest 121(4): 1329-1336.
81) Komiyama, T. et al. Inhibition of interleukin-1 beta converting enzyme by the cowpox virus serpin CrmA. An example of cross-class inhibition. J Biol Chem 269, 19331-19337 (1994).
82) Krams, S. M., M. Wang, et al. (2010). "Toll-like receptor 4 contributes to small intestine allograft rejection." Transplantation 90(12): 1272-1277.
83) Krieg, A. M. et al. Sequence motifs in adenoviral DNA block immune activation by stimulatory CpG motifs. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 12631-12636 (1998).
84) Krutzik, S. R., B. Tan, et al. (2005). "TLR activation triggers the rapid differentiation of monocytes into macrophages and dendritic cells." Nat Med 11(6): 653-660.
85) Kumar, H., Kawai, T., Kato, H., Sato, S., Takahashi, K., Coban, C., Yamamoto, M., Uematsu, S., Ishii, K.J., Takeuchi, O., et al. (2006). Essential role of IPS-1 in innate immune responses against RNA viruses. J Exp Med 203, 1795-1803.
86) Kumar, M.V., Nagineni, C.N., Chin, M.S., Hooks, J.J., and Detrick, B. (2004). Innate immunity in the retina: Toll-like receptor (TLR) signaling in human retinal pigment epithelial cells. J Neuroimmunol 153, 7-15.
87) Lamkanfi, M. et al. Glyburide inhibits the Cryopyrin/Nalp3 inflammasome. J Cell Biol 187, 61-70, doi:10.1083/jcb.200903124 (2009).
88) Lander, E.S., Linton, L.M., Birren, B., Nusbaum, C., Zody, M.C., Baldwin, J., Devon, K., Dewar, K., Doyle, M., FitzHugh, W., et al. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860-921.
89) Latz, E. (2010). NOX-free inflammasome activation. Blood 116, 1393-1394.
90) Lee, S. H., Stehlik, C. & Reed, J. C. Cop, a caspase recruitment domain-containing protein and inhibitor of caspase-1 activation processing. J Biol Chem 276, 34495-34500, doi:10.1074/jbc.M101415200 (2001).
91) Li, H., Ambade, A. & Re, F. Cutting edge: Necrosis activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol 183, 1528-1532, doi:10.4049/jimmunol.0901080 (2009).
92) Li, Y., and Trush, M.A. (1998). Diphenyleneiodonium, an NAD(P)H oxidase inhibitor, also potently inhibits mitochondrial reactive oxygen species production. Biochem Biophys Res Commun 253, 295-299.
93) Li, M., Y. Zhou, et al. (2009). "The critical role of Toll-like receptor signaling pathways in the induction and progression of autoimmune diseases." Curr Mol Med 9(3): 365-374.
94) Lim, B. J., D. Lee, et al. (2011). "Toll-Like Receptor 4 Signaling is Involved in IgA-Stimulated Mesangial Cell Activation." Yonsei Med J 52(4): 610-615.
95) Lin, H., Xu, H., Liang, F.Q., Liang, H., Gupta, P., Havey, A.N., Boulton, M.E., and Godley, B.F. (2011). Mitochondrial DNA damage and repair in RPE associated with aging and age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci 52, 3521-3529.
96) Liu, H. Z., H. Z. Yang, et al. (2010). "Toll like receptor 2 mediates bleomycin-induced acute lung injury, inflammation and fibrosis in mice." Yao Xue Xue Bao 45(8): 976-986.
97) Loiarro, M., Sette, C., Gallo, G., Ciacci, A., Fanto, N., Mastroianni, D., Carminati, P., and Ruggiero, V. (2005). Peptide-mediated interference of TIR domain dimerization in MyD88 inhibits interleukin-1-dependent activation of NF-κB. J Biol Chem 280, 15809-15814.
98) Lopez, P.F., Sippy, B.D., Lambert, H.M., Thach, A.B., and Hinton, D.R. (1996). Transdifferentiated retinal pigment epithelial cells are immunoreactive for vascular endothelial growth factor in surgically excised age-related macular degeneration-related choroidal neovascular membranes. Invest Ophthalmol Vis Sci 37, 855-868.
99) Mariathasan, S. et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature 430, 213-218 (2004).
100) Mariathasan, S., Weiss, D.S., Newton, K., McBride, J., O'Rourke, K., Roose-Girma, M., Lee, W.P., Weinrauch, Y., Monack, D.M., and Dixit, V.M. (2006). Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature 440, 228-232.
101) Martin, S. F., J. C. Dudda, et al. (2008). "Toll-like receptor and IL-12 signaling control susceptibility to contact hypersensitivity." J Exp Med 205(9): 2151-2162.
102) Martinon, F., Mayor, A., and Tschopp, J. (2009). The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol 27, 229-265.
103) Martinon, F., Petrilli, V., Mayor, A., Tardivel, A. & Tschopp, J. Gout-associated uric acid crystals activate the NALP3 inflammasome. Nature 440, 237-241, doi:10.1038/nature04516 (2006).
104) Masters, S.L., Dunne, A., Subramanian, S.L., Hull, R.L., Tannahill, G.M., Sharp, F.A., Becker, C., Franchi, L., Yoshihara, E., Chen, Z., et al. (2010). Activation of the NLRP3 inflammasome by islet amyloid polypeptide provides a mechanism for enhanced IL-1beta in type 2 diabetes. Nat Immunol 11, 897-904.
105) McKernan, D. P., A. Nolan, et al. (2009). "Toll-like receptor mRNA expression is selectively increased in the colonic mucosa of two animal models relevant to irritable bowel syndrome." PLoS One 4(12): e8226.
106) McLeod, D.S., Grebe, R., Bhutto, I., Merges, C., Baba, T., and Lutty, G.A. (2009). Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci 50, 4982-4991.
107) Medvedev, A. E., I. Sabroe, et al. (2006). "Tolerance to microbial TLR ligands: molecular mechanisms and relevance to disease." J Endotoxin Res 12(3): 133-150.
108) Meissner, F., Seger, R.A., Moshous, D., Fischer, A., Reichenbach, J., and Zychlinsky, A. (2010). Inflammasome activation in NADPH oxidase defective mononuclear phagocytes from patients with chronic granulomatous disease. Blood 116, 1570-1573.
109) Meng, G., F. Zhang, et al. (2009). "A mutation in the Nlrp3 gene causing inflammasome hyperactivation potentiates Th17 cell-dominant immune responses." Immunity 30(6): 860-874.
110) Messud-Petit, F. et al. Serp2, an inhibitor of the interleukin-1beta-converting enzyme, is critical in the pathobiology of myxoma virus. J Virol 72, 7830-7839 (1998).
111) Mhyre, A. J., Marcondes, A. M., Spaulding, E. Y. & Deeg, H. J. Stroma-dependent apoptosis in clonal hematopoietic precursors correlates with expression of PYCARD. Blood 113, 649-658, doi:10.1182/blood-2008-04-152686 (2009).
112) Miao, E.A., Leaf, I.A., Treuting, P.M., Mao, D.P., Dors, M., Sarkar, A., Warren, S.E., Wewers, M.D., and Aderem, A. (2010). Caspase-1-induced pyroptosis is an innate immune effector mechanism against intracellular bacteria. Nat Immunol 11, 1136-1142.

113) Miller, D. M., A. A. Rossini, et al. (2008). "Role of innate immunity in transplantation tolerance." Crit Rev Immunol 28(5): 403-439.
114) Munding, C. et al. The estrogen-responsive B box protein: a novel enhancer of interleukin-1beta secretion. Cell Death Differ 13, 1938-1949, doi:10.1038/sj.cdd.4401896 (2006).
115) Murphy, M.P. (2009). How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J 417, 1-13.
116) Murphy, M.P., and Smith, R.A. (2007). Targeting antioxidants to mitochondria by conjugation to lipophilic cations. Annu Rev Pharmacol Toxicol 47, 629-656.
117) Muruve, D.A., Petrilli, V., Zaiss, A.K., White, L.R., Clark, S.A., Ross, P.J., Parks, R.J., and Tschopp, J. (2008). The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature 452, 103-107.
118) Muzio, M., Ni, J., Feng, P., and Dixit, V.M. (1997). IRAK (Pelle) family member IRAK-2 and MyD88 as proximal mediators of IL-1 signaling. Science 278, 1612-1615.
119) Nakahira, K., Haspel, J.A., Rathinam, V.A., Lee, S.J., Dolinay, T., Lam, H.C., Englert, J.A., Rabinovitch, M., Cernadas, M., Kim, H.P., et al. (2011). Autophagy proteins regulate innate immune responses by inhibiting the release of mitochondrial DNA mediated by the NALP3 inflammasome. Nat Immunol 12, 222-230.
120) Newman, Z. L. et al. Auranofin protects against anthrax lethal toxin-induced activation of the Nlrp1b inflammasome. Antimicrob Agents Chemother 55, 1028-1035, doi:10.1128/AAC.00772-10 (2011).
121) Ngo, V.N., Young, R.M., Schmitz, R., Jhavar, S., Xiao, W., Lim, K.H., Kohlhammer, H., Xu, W., Yang, Y., Zhao, H., et al. (2011). Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature 470, 115-119.
122) Nogueira-Machado, J. A., C. M. Volpe, et al. (2011). "HMGB1, TLR and RAGE: a functional tripod that leads to diabetic inflammation." Expert Opin Ther Targets 15(8): 1023-1035.
123) Nordgaard, C.L., Karunadharma, P.P., Feng, X., Olsen, T.W., and Ferrington, D.A. (2008). Mitochondrial proteomics of the retinal pigment epithelium at progressive stages of age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci 49, 2848-2855.
124) Novick, D. et al. Interleukin-18 binding protein: a novel modulator of the Th1 cytokine response. Immunity 10, 127-136 (1999).
125) O'Neill, L.A., and Bowie, A.G. (2007). The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol 7, 353-364.
126) O'Neill, L. A. (2008). "Primer: Toll-like receptor signaling pathways--what do rheumatologists need to know?" Nat Clin Pract Rheumatol 4(6): 319-327.
127) Opal, S. M. and C. E. Huber (2002). "Bench-to-bedside review: Toll-like receptors and their role in septic shock." Crit Care 6(2): 125-136.
128) Papin, S. et al. The SPRY domain of Pyrin, mutated in familial Mediterranean fever patients, interacts with inflammasome components and inhibits proIL-1beta processing. Cell Death Differ 14, 1457-1466, doi:10.1038/sj.cdd.4402142 (2007).
129) Park, J. H., D. R. Gold, et al. (2001). "House dust endotoxin and wheeze in the first year of life." Am J Respir Crit Care Med 163(2): 322-328.
130) Parker, J.S., Roe, S.M., and Barford, D. (2004). Crystal structure of a PIWI protein suggests mechanisms for siRNA recognition and slicer activity. EMBO J 23, 4727-4737.
131) Picard, C., von Bernuth, H., Ghandil, P., Chrabieh, M., Levy, O., Arkwright, P.D., McDonald, D., Geha, R.S., Takada, H., Krause, J.C., et al. (2010). Clinical features and outcome of patients with IRAK-4 and MyD88 deficiency. Medicine (Baltimore) 89, 403-425.
132) Pichlmair, A., Lassnig, C., Eberle, C.A., Gorna, M.W., Baumann, C.L., Burkard, T.R., Burckstummer, T., Stefanovic, A., Krieger, S., Bennett, K.L., et al. (2011). IFIT1 is an antiviral protein that recognizes 5'-triphosphate RNA. Nat Immunol 12, 624-630.
133) Puente, X.S., Pinyol, M., Quesada, V., Conde, L., Ordonez, G.R., Villamor, N., Escaramis, G., Jares, P., Bea, S., Gonzalez-Diaz, M., et al. (2011). Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in chronic lymphocytic leukaemia. Nature 475, 101-105.
134) Qiao, Y., Wang, P., Qi, J., et al. (2012). "TLR-induced NF-kappaB activation regulates NLRP3 expression in murine macrophages." FEBS Lett 586(7): 1022-1026.
135) Qureshi, N., Takayama, K., and Kurtz, R. (1991). Diphosphoryl lipid A obtained from the nontoxic lipopolysaccharide of Rhodopseudomonas sphaeroides is an endotoxin antagonist in mice. Infect Immun 59, 441-444.
136) Rahman, M. M., Mohamed, M. R., Kim, M., Smallwood, S. & McFadden, G. Co-regulation of NF-kappaB and inflammasome-mediated inflammatory responses by myxoma virus pyrin domain-containing protein M013. PLoS Pathog 5, e1000635, doi:10.1371/journal.ppat.1000635 (2009).
137) Rakoff-Nahoum, S. & Medzhitov, R. Regulation of spontaneous intestinal tumorigenesis through the adaptor protein MyD88. Science 317, 124-127 (2007).
138) Reuter, B. K. and T. T. Pizarro (2004). "Commentary: the role of the IL-18 system and other members of the IL-1R/TLR superfamily in innate mucosal immunity and the pathogenesis of inflammatory bowel disease: friend or foe?" Eur J Immunol 34(9): 2347-2355.
139) Rey, F.E., Cifuentes, M.E., Kiarash, A., Quinn, M.T., and Pagano, P.J. (2001). Novel competitive inhibitor of NAD(P)H oxidase assembly attenuates vascular O(2)(-) and systolic blood pressure in mice. Circ Res 89, 408-414.
140) Robson, M. G. (2009). "Toll-like receptors and renal disease." Nephron Exp Nephrol 113(1): e1-7.
141) Saleh, M. et al. Enhanced bacterial clearance and sepsis resistance in caspase-12-deficient mice. Nature 440, 1064-1068, doi:10.1038/nature04656 (2006).
142) Savina, A., Jancic, C., Hugues, S., Guermonprez, P., Vargas, P., Moura, I.C., Lennon-Dumenil, A.M., Seabra, M.C., Raposo, G., and Amigorena, S. (2006). NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell 126, 205-218.
143) Schmid, M. C., C. J. Avraamides, et al. (2011). "Receptor Tyrosine Kinases and TLR/IL1Rs Unexpectedly Activate Myeloid Cell PI3Kgamma, A Single Convergent Point Promoting Tumor Inflammation and Progression." Cancer Cell 19(6): 715-727.
144) Schorn, C. et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. J Biol Chem 286, 35-41, doi:10.1074/jbc.M110.139048 (2011).
145) Schroder, K., and Tschopp, J. (2010). The inflammasomes. Cell 140, 821-832.
146) Schroder, K., Zhou, R., and Tschopp, J. (2010). The NLRP3 inflammasome: a sensor for metabolic danger? Science 327, 296-300.
147) Shaikh, T.H., Roy, A.M., Kim, J., Batzer, M.A., and Deininger, P.L. (1997). cDNAs derived from primary and small cytoplasmic Alu (scAlu) transcripts. J Mol Biol 271, 222-234.
148) Shaikh, T. H., Roy, A. M., Kim, J., Batzer, M. A. & Deininger, P. L. cDNAs derived from primary and small cytoplasmic Alu (scAlu) transcripts. J Mol Biol 271, 222-234 (1997).
149) Shin, O. S. and J. B. Harris (2011). "Innate immunity and transplantation tolerance: the potential role of TLRs/NLRs in GVHD." Korean J Hematol 46(2): 69-79.
150) Sinnett, D., Richer, C., Deragon, J.M., and Labuda, D. (1991). Alu RNA secondary structure consists of two independent 7 SL RNA-like folding units. J Biol Chem 266, 8675-8678.
151) Slater, J. E., E. J. Paupore, et al. (1998). "Lipopolysaccharide augments IgG and IgE responses of mice to the latex allergen Hev b 5." J Allergy Clin Immunol 102(6 Pt 1): 977-983.
152) Smith, W., Assink, J., Klein, R., Mitchell, P., Klaver, C.C., Klein, B.E., Hofman, A., Jensen, S., Wang, J.J., and de Jong, P.T. (2001). Risk factors for age-related macular degeneration: Pooled findings from three continents. Ophthalmology 108, 697-704.
153) Stasakova, J. et al. Influenza A mutant viruses with altered NS1 protein function provoke caspase-1 activation in primary human macrophages, resulting in fast apoptosis and release of high levels of interleukins 1beta and 18. J Gen Virol 86, 185-195, doi:10.1099/vir.0.80422-0 (2005).
154) Stehlik, C. et al. The PAAD/PYRIN-only protein POP1/ASC2 is a modulator of ASC-mediated nuclear-factor-kappa B and pro-caspase-1 regulation. Biochem J 373, 101-113, doi:10.1042/BJ20030304 (2003).
155) Streilein, J.W. (2003). Ocular immune privilege: therapeutic opportunities from an experiment of nature. Nat Rev Immunol 3, 879-889.
156) Stennicke, H. R., Jurgensmeier, J. M., Shin, H., et al. (1998). "Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8." J Biol Chem 273(42): 27084-27090.
157) Summers, S. A., O. M. Steinmetz, et al. (2011). "Toll-like receptor 2 induces Th17 myeloperoxidase autoimmunity while Toll-like receptor 9 drives Th1 autoimmunity in murine vasculitis." Arthritis Rheum 63(4): 1124-1135.
158) Sun, D., and Ding, A. (2006). MyD88-mediated stabilization of interferon-gamma-induced cytokine and chemokine mRNA. Nat Immunol 7, 375-381.
159) Sun, Q., Sun, L., Liu, H.H., Chen, X., Seth, R.B., Forman, J., and Chen, Z.J. (2006). The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses. Immunity 24, 633-642.
160) Suzuki, N., Chen, N.J., Millar, D.G., Suzuki, S., Horacek, T., Hara, H., Bouchard, D., Nakanishi, K., Penninger, J.M., Ohashi, P.S., et al. (2003). IL-1 receptor-associated kinase 4 is essential for IL-18-mediated NK and Th1 cell responses. J Immunol 170, 4031-4035.
161) Suzuki, N., Suzuki, S., Duncan, G.S., Millar, D.G., Wada, T., Mirtsos, C., Takada, H., Wakeham, A., Itie, A., Li, S., et al. (2002). Severe impairment of interleukin-1 and Toll-like receptor signalling in mice lacking IRAK-4. Nature 416, 750-756.
162) Tabeta, K., Hoebe, K., Janssen, E.M., Du, X., Georgel, P., Crozat, K., Mudd, S., Mann, N., Sovath, S., Goode, J., et al. (2006). The Unc93b1 mutation 3d disrupts exogenous antigen presentation and signaling via Toll-like receptors 3, 7 and 9. Nat Immunol 7, 156-164.
163) Takeda, A., Baffi, J.Z., Kleinman, M.E., Cho, W.G., Nozaki, M., Yamada, K., Kaneko, H., Albuquerque, R.J., Dridi, S., Saito, K., et al. (2009). CCR3 is a target for age-related macular degeneration diagnosis and therapy. Nature 460, 225-230.
164) Tan, H. H., M. I. Fiel, et al. (2009). "Kupffer cell activation by ambient air particulate matter exposure may exacerbate non-alcoholic fatty liver disease." J Immunotoxicol 6(4): 266-275.
165) Tarallo V, Hirano Y, Gelfand BD, Dridi S, Kerur N, Kim Y, Cho WG, Kaneko H, Fowler BJ, Bogdanovich S, Albuquerque RJ, Hauswirth WW, Chiodo VA, Kugel JF, Goodrich JA, Ponicsan SL, Chaudhuri G, Murphy MP, Dunaief JL, Ambati BK, Ogura Y, Yoo JW, Lee DK, Provost P, Hinton DR, N??ez G, Baffi JZ, Kleinman ME, Ambati J. (2012). DICER1 loss and Alu RNA induce age-related macular degeneration via the NLRP3 inflammasome and MyD88. Cell 149(4):847-859.
166) Taylor, K. M. (1996). "SIRS--the systemic inflammatory response syndrome after cardiac operations." Ann Thorac Surg 61(6): 1607-1608.
167) Taylor, P. A., M. J. Ehrhardt, et al. (2008). "TLR agonists regulate alloresponses and uncover a critical role for donor APCs in allogeneic bone marrow rejection." Blood 112(8): 3508-3516.
168) Terhorst, D., B. N. Kalali, et al. (2010). "The role of toll-like receptors in host defenses and their relevance to dermatologic diseases." Am J Clin Dermatol 11(1): 1-10.
169) Testro, A. G., K. Visvanathan, et al. (2011). "Acute allograft rejection in human liver transplant recipients is associated with signaling through toll-like receptor 4." J Gastroenterol Hepatol 26(1): 155-163.
170) Thornberry, N.A., Bull, H.G., Calaycay, J.R., Chapman, K.T., Howard, A.D., Kostura, M.J., Miller, D.K., Molineaux, S.M., Weidner, J.R., Aunins, J., et al. (1992). A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1 beta processing in monocytes. Nature 356, 768-774.
171) Tilich, M. and R. R. Arora (2011). "Modulation of Toll-Like Receptors by Insulin." Am J Ther.
172) Trnka, J., Blaikie, F.H., Logan, A., Smith, R.A., and Murphy, M.P. (2009). Antioxidant properties of MitoTEMPOL and its hydroxylamine. Free Radic Res 43, 4-12.
173) Tschopp, J., Martinon, F., and Burns, K. (2003). NALPs: a novel protein family involved in inflammation. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 95-104.
174) Tschopp, J., and Schroder, K. (2010). NLRP3 inflammasome activation: The convergence of multiple signalling pathways on ROS production? Nat Rev Immunol 10, 210-215.
175) van Bruggen, R., Koker, M.Y., Jansen, M., van Houdt, M., Roos, D., Kuijpers, T.W., and van den Berg, T.K. (2010). Human NLRP3 inflammasome activation is Nox1-4 independent. Blood 115, 5398-5400.
176) Vandanmagsar, B. et al. The NLRP3 inflammasome instigates obesity-induced inflammation and insulin resistance. Nat Med 17, 179-188 (2011).
177) Vandenabeele, P., Vanden Berghe, T., and Festjens, N. (2006). Caspase inhibitors promote alternative cell death pathways. Sci STKE 2006, pe44.
178) Ventura, G. M., V. Balloy, et al. (2009). "Lack of MyD88 protects the immunodeficient host against fatal lung inflammation triggered by the opportunistic bacteria Burkholderia cenocepacia." J Immunol 183(1): 670-676.
179) Venugopal, P. G., T. B. Nutman, et al. (2009). "Activation and regulation of toll-like receptors (TLRs) by helminth parasites." Immunol Res 43(1-3): 252-263.
180) Verhoef, P.A., Kertesy, S.B., Lundberg, K., Kahlenberg, J.M., and Dubyak, G.R. (2005). Inhibitory effects of chloride on the activation of caspase-1, IL-1beta secretion, and cytolysis by the P2X7 receptor. J Immunol 175, 7623-7634.
181) Vogt, S.D., Curcio, C.A., Wang, L., Li, C.M., McGwin, G., Jr., Medeiros, N.E., Philp, N.J., Kimble, J.A., and Read, R.W. (2011). Retinal pigment epithelial expression of complement regulator CD46 is altered early in the course of geographic atrophy. Exp Eye Res.
182) von Bernuth, H., Picard, C., Jin, Z., Pankla, R., Xiao, H., Ku, C.L., Chrabieh, M., Mustapha, I.B., Ghandil, P., Camcioglu, Y., et al. (2008). Pyogenic bacterial infections in humans with MyD88 deficiency. Science 321, 691-696.
183) von Herrath, M., C. Filippi, et al. (2011). "How viral infections enhance or prevent type 1 diabetes-from mouse to man." J Med Virol 83(9): 1672.
184) Wang, S., C. Schmaderer, et al. (2010). "Recipient Toll-like receptors contribute to chronic graft dysfunction by both MyD88- and TRIF-dependent signaling." Dis Model Mech 3(1-2): 92-103.
185) Wen, H., Gris, D., Lei, Y., Jha, S., Zhang, L., Huang, M.T., Brickey, W.J., and Ting, J.P. (2011). Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol 12, 408-415.
186) Weyand, C. M., W. Ma-Krupa, et al. (2005). "Vascular dendritic cells in giant cell arteritis." Ann N Y Acad Sci 1062: 195-208.
187) Wong, K. W. & Jacobs, W. R., Jr. Critical role for NLRP3 in necrotic death triggered by Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol 13, 1371-1384, doi:10.1111/j.1462-5822.2011.01625.x (2011).
188) Yamamoto, M., Sato, S., Hemmi, H., Hoshino, K., Kaisho, T., Sanjo, H., Takeuchi, O., Sugiyama, M., Okabe, M., Takeda, K., et al. (2003). Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling pathway. Science 301, 640-643.
189) Yang, P., Tyrrell, J., Han, I. & Jaffe, G. J. Expression and modulation of RPE cell membrane complement regulatory proteins. Invest Ophthalmol Vis Sci 50, 3473-3481 (2009).
190) Yang, Y.L., Reis, L.F., Pavlovic, J., Aguzzi, A., Schafer, R., Kumar, A., Williams, B.R., Aguet, M., and Weissmann, C. (1995). Deficient signaling in mice devoid of double-stranded RNA-dependent protein kinase. EMBO J 14, 6095-6106.
191) Yang, Z. et al. Toll-like receptor 3 and geographic atrophy in age-related macular degeneration. N Engl J Med 359, 1456-1463 (2008).
192) Yokoi, S., H. Niizeki, et al. (2009). "Adjuvant effect of lipopolysaccharide on the induction of contact hypersensitivity to haptens in mice." J Dermatol Sci 53(2): 120-128.
193) Young, J. L. et al. The serpin proteinase inhibitor 9 is an endogenous inhibitor of interleukin 1beta-converting enzyme (caspase-1) activity in human vascular smooth muscle cells. J Exp Med 191, 1535-1544 (2000).
194) Zaki, M.H., Boyd, K.L., Vogel, P., Kastan, M.B., Lamkanfi, M., and Kanneganti, T.D. (2010). The NLRP3 inflammasome protects against loss of epithelial integrity and mortality during experimental colitis. Immunity 32, 379-391.
195) Zhang, L., Lu, R., Zhao, G., Pflugfelder, S. C. & Li, D. Q. TLR-mediated induction of pro-allergic cytokine IL-33 in ocular mucosal epithelium. Int J Biochem Cell Biol 43, 1383-1391, doi:10.1016/j.biocel.2011.06.003 (2011).
196) Zhou, R., Yazdi, A.S., Menu, P., and Tschopp, J. (2011). A role for mitochondria in NLRP3 inflammasome activation. Nature 469, 221-225.
197) Zuany-Amorim, C., J. Hastewell, et al. (2002). "Toll-like receptors as potential therapeutic targets for multiple diseases." Nat Rev Drug Discov 1(10): 797-807.
198) 国際特許出願公開第WO 2008/070579号「Inhibition of Brain Enzymes Involved in Cerebral Amyloid Angiopathy and Macular Degeneration」
199) 2010年６月１日出願の米国仮特許出願第61/396,747号
200) 2011年１月12日出願の米国仮特許出願第61/432,110号
201) 2011年１月14日出願の米国仮特許出願第61/432,948号
202) 2011年６月１日出願の国際特許出願第PCT/US11/38753号
203) 2011年１月18日出願の米国仮特許出願第61/508,867号
204) 2011年10月４日出願の米国仮特許出願第61/543,038号
205) 2012年１月13日出願の米国仮特許出願第61/586,427号
本明細書中で開示した主題の種々の詳細は、本明細書中に開示した主題の範囲を逸脱することなく、変更できることが理解される。更に、前記の説明は、例示の目的のためだけであり、限定を目的としていない。

Claims (9)

  1. 配列番号７〜16に記載の核酸から選択される核酸を含むインフラマソーム阻害剤；配列番号17に記載の核酸を含むカスパーゼ-１阻害剤；抗ASC抗体、次の配列：ALR QTQ PYL VTD LEQ Sで表されるエピトープに結合する抗体及び抗カスパーゼ-１抗体から選択される抗体；パルテノリド、エストロゲン結合性B-boxタンパク質、COP、ICEBERG、Z-WEHD-FMK、Ac-YVAD-CHO (Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CHO)及びAc-YVAD-CMK(CAS番号：178603-78-6；N-アセチル-L-チロシル-L-バニル-N-[(1S)-1-(カルボキシメチル)-3-クロロ-2-オキシ-プロピル]-L-アラニンアミド)、cPOP1、cPOP2、セルピンプロテイナーゼ阻害剤９(PI-9)、BCL-2及びBCL-xL、M13L-PYD、S013L、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスOrf63、M013、Z-VAD-FMK；NLRP3の発現を阻害する単離二本鎖RNA分子であって、コレステロールに結合していてもいなくてもよく、少なくとも一方の鎖が核酸GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT(配列番号７)を含む単離二本鎖RNA分子；PYCARDの発現を阻害する単離二本鎖RNA分子であって、その少なくとも一方の鎖が核酸5'-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3'(配列番号12)、5'-GGCUGCUGGAUGCUCUGUACGGGAA-3'(配列番号13)又は5'-UUCCCGUACAGAGCAUCCAGCAGCC-3'(配列番号14)を含む単離二本鎖RNA分子 からなる群より選択されるNLRP3インフラマソーム阻害剤を含んでなる、Alu-RNA誘導変性に対してRPE細胞を保護する組成物。
  2. 配列番号１、54及び55に記載のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含むMyD88阻害剤、MyD88の発現を阻害する二本鎖RNA分子であり、その少なくとも一方の鎖が配列番号３、４、５、６及び56に記載の核酸から選択される核酸を含む二本鎖RNA分子、Pepinh-MYD(Invitrogen)、短縮型MyD88(アミノ酸152〜296)、エキソン２を欠いているスプライス変異型MyD88、ヒドロシナモイル-L-バリルピロリジン；ST2825；4-[(E)-2-(1-ヘキシルピリジン-1-イウム-2-イル)エテニル]-N,N-ジメチルアニリン ヨーダイド；50-F12及び26-J10；マリンガミドＦアセテートからなる群より選択されるMyD88阻害剤を更に含んでなる請求項１に記載の組成物。
  3. IL-18に対する中和抗体、IL-18レセプターへのIL-18結合を遮断する抗体及びIL18BPからなる群より選択されるIL-18阻害剤を更に含んでなる請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 配列番号47に記載の核酸を含むVDAC1阻害剤、任意のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドランダマー、シクロスポリンＡ、スーパーオキシドジスムターゼ１、4,4'-ジイソチオシアナトスチルベン-2,2'-ジスルホン酸(DIDA)、Bcl-x(L) BH4(4-23)及びTR019622からなる群より選択されるVDAC1阻害剤を更に含んでなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 配列番号48に記載の核酸を含むVDAC2阻害剤、任意のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドランダマー、Bcl-x(L) BH4(4-23)及びTR019622からなる群より選択されるVDAC2阻害剤を更に含んでなる請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. Z-IETD-FMK、Ac-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro-Ile-Glu-Thr-Asp-CHO、Z-Ile-Glu(OMe)-Thr-Asp(OMe)-CH2F及び細胞性fas関連死ドメイン様インターロイキン-1β変換酵素阻害性タンパク質(Ｌ)からなる群より選択されるカスパーゼ-８阻害剤を更に含んでなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 硝子体内注射；網膜下注射；胸膜上注射；テノン嚢下注射；球後注射；球周囲注射；局所的点眼適用；強膜に縫い付けられ若しくは付着され又は強膜上に配置され、又は硝子体液若しくは前眼房中に注入され、水晶体包若しくは水晶体嚢に埋め込まれた持続放出インプラントデバイスからの放出；経口投与；又は静脈内投与により投与される請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 保護すべき細胞を有する対象者が地図状萎縮の治療を必要としている請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 保護すべき細胞を有する対象者が加齢性黄斑変性を有する請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
JP2014521695A 2011-07-18 2012-07-16 Ａｌｕ−ｒｎａ誘導変性からの細胞の保護及び細胞保護用阻害剤 Active JP6313203B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161508867P 2011-07-18 2011-07-18
US61/508,867 2011-07-18
US201161543038P 2011-10-04 2011-10-04
US61/543,038 2011-10-04
PCT/US2012/046928 WO2013012806A2 (en) 2011-07-18 2012-07-16 Protection of cells from alu-rna-induced degenereation and inhibitors for protecting cells

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2014528700A JP2014528700A (ja) 2014-10-30
JP2014528700A5 JP2014528700A5 (ja) 2015-08-20
JP6313203B2 true JP6313203B2 (ja) 2018-04-18

Family

ID=47558691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014521695A Active JP6313203B2 (ja) 2011-07-18 2012-07-16 Ａｌｕ−ｒｎａ誘導変性からの細胞の保護及び細胞保護用阻害剤

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9453226B2 (ja)
EP (2) EP2734240B1 (ja)
JP (1) JP6313203B2 (ja)
CN (1) CN103889461B (ja)
AU (1) AU2012284223B2 (ja)
CA (2) CA2842034C (ja)
ES (1) ES2907620T3 (ja)
PT (1) PT3366302T (ja)
WO (1) WO2013012806A2 (ja)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010138555A2 (en) 2009-05-26 2010-12-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Small peptide expression system in mammalian cells
JP5795072B2 (ja) 2010-10-22 2015-10-14 ソンギュングヮン ユニバーシティ ファウンデーション フォー コーポレート コラボレーション Ｒｎａ干渉を誘導する核酸分子及びその用途
US9707235B1 (en) 2012-01-13 2017-07-18 University Of Kentucky Research Foundation Protection of cells from degeneration and treatment of geographic atrophy
US20130297023A1 (en) * 2012-05-07 2013-11-07 Hee-Jeong Im Sampen Methods and Devices For Treating Intervertebral Disc Disease
JP6139671B2 (ja) 2012-05-22 2017-05-31 オリックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＯｌｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ． 細胞内貫通能を持ってｒｎａ干渉を誘導する核酸分子およびその用途
EP2893014A4 (en) 2012-09-05 2016-06-08 Cold Spring Harbor Lab TRANSPORTABLE ELEMENTS, TDP-43 AND NEURODEGENERATIVE DISEASES
US10981961B2 (en) 2013-03-11 2021-04-20 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Delivery of card protein as therapy for occular inflammation
US9326983B2 (en) 2013-08-01 2016-05-03 University Of Kentucky Research Foundation Compositions and methods for treating retinal degradation
WO2015095609A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 The J. David Gladstone Institute Inhibition of interferon-gamma-inducible protein 16 (ifi16)
EP3107939B1 (en) 2014-02-19 2020-06-17 University of Florida Research Foundation, Inc. Delivery of nrf2 as therapy for protection against reactive oxygen species
EP4050020A1 (en) * 2014-03-11 2022-08-31 University of Florida Research Foundation, Inc. Aav-expressed m013 protein as an anti-inflammatroy therapeutic for use in a method of treating inflammatory ocular disease
US20180085391A1 (en) * 2014-08-08 2018-03-29 Modernatx, Inc. Compositions and methods for the treatment of ophthalmic diseases and conditions
AU2016225037B2 (en) 2015-02-26 2021-06-17 University Of Kentucky Research Foundation Compositions and methods for treating retinal degradation
US11219623B2 (en) 2015-02-26 2022-01-11 University Of Kentucky Research Foundation Inflammasome inhibition for the treatment of Parkinson's disease, Alzheimer's disease and multiple sclerosis
JP7085712B2 (ja) 2015-09-03 2022-06-17 ビー．ジー． ネゲヴ テクノロジーズ アンド アプリケーションズ リミテッド、アット ベン－グリオン ユニヴァーシティ Ｖｄａｃ１由来ペプチドの類似体
IL289849B2 (en) * 2015-11-10 2024-01-01 Nat Inst Biotechnology Negev Ltd Means and methods for reducing tumorigenicity of cancer stem cells
JP7027311B2 (ja) 2015-11-16 2022-03-01 オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド ＭｙＤ８８又はＴＬＲ３を標的とするＲＮＡ複合体を使用した加齢黄斑変性の治療
EP3411480A4 (en) 2016-02-02 2020-01-22 Olix Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF ATOPIC DERMATITIS AND ASTHMA USING RNA COMPLEXES THAT TARGET lL4R , TRPA1, OR F2RL1
WO2017212477A1 (en) * 2016-06-07 2017-12-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Backbone cyclized inhibitory peptides of myeloid differentiation factor 88 (myd88)
WO2017214553A1 (en) * 2016-06-09 2017-12-14 The General Hospital Corporation Modulating the cellular stress response
KR101916652B1 (ko) 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
WO2018039371A1 (en) * 2016-08-26 2018-03-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for inhibiting stem cell aging
US11160788B2 (en) 2016-12-23 2021-11-02 Andrea Leblanc Caspase-1 inhibition and uses thereof for prevention and treatment of neurological conditions
JP7424728B2 (ja) 2017-02-10 2024-01-30 オリック パルマセゥティカルズ インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉のための長鎖の二本鎖ｒｎａ
GB2561540A (en) 2017-03-13 2018-10-24 Nodthera Ltd Chemical compounds
US11613756B2 (en) * 2017-04-03 2023-03-28 Duke University Compositions and methods for differential induction of cell death and interferon expression
US20200345756A1 (en) * 2017-10-10 2020-11-05 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for treating age-related macular degeneration and geographic atrophy
US20210267996A1 (en) * 2018-06-27 2021-09-02 Children`S Medical Center Corporation Compounds for inhibition of inflammation
KR102138256B1 (ko) * 2018-09-13 2020-08-13 한국과학기술연구원 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브, 이를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물
US20210348164A1 (en) * 2018-10-09 2021-11-11 University Of Virginia Patent Foundation Endogenous cytoplasmic alu complementary dna in age-related macular degeneration
CN110305957B (zh) * 2019-08-22 2022-07-29 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种鉴定黄颡鱼脂肪肝程度的试剂盒及其鉴定方法
WO2021041317A1 (en) * 2019-08-23 2021-03-04 University Of Virginia Patent Foundation Ddx17 and nlrc4 targeting for inflammatory diseases
US20230070129A1 (en) * 2020-01-06 2023-03-09 Seasun Therapeutics Composition for preventing or treating macular degeneration, containing cell permeable nucleic acid complex as active ingredient
WO2021163327A1 (en) * 2020-02-11 2021-08-19 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for treating and/or preventing ocular disorders
CN111358950A (zh) * 2020-03-20 2020-07-03 厦门大学 Caspase-1及ASC/Caspase-8作为靶点的应用
EP4192952A1 (en) * 2020-08-10 2023-06-14 Novartis AG Treatments for retinal degenerative diseases
AU2021384022A1 (en) 2020-11-18 2023-06-01 Novartis Ag Bispecific antibodies for use in treatment of nlrc4-gof inflammasomapathy
CN115969844B (zh) * 2021-12-28 2024-04-02 首都医科大学附属北京同仁医院 Nox2特异性抑制剂在制备视网膜变性药物中的应用

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2276216A1 (en) * 1998-06-24 1999-12-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo An artificial peptide capable of neutralizing the biological activity of interleukin-18
AU2988200A (en) * 1999-02-11 2000-08-29 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Regulation of photoreceptor degeneration
GB9930616D0 (en) * 1999-12-24 2000-02-16 Mathilda & Terence Kennedy Ins Activation and inhibition of the immune system
US20030186903A1 (en) * 2001-11-23 2003-10-02 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of MyD88 expression
CA2472927A1 (en) * 2002-01-10 2003-07-17 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw A novel splice variant of myd88 and uses thereof
WO2006006948A2 (en) * 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
EP2314691A3 (en) * 2002-11-14 2012-01-18 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional siRNA
US9549895B2 (en) * 2004-04-23 2017-01-24 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods and compositions for preserving the viability of photoreceptor cells
BRPI0519148A2 (pt) * 2004-12-20 2008-12-30 Sigma Tau Ind Farmaceuti inibidores de homodimerizaÇço de myd88
US7879992B2 (en) * 2005-01-31 2011-02-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modification of MyD88 splicing using modified oligonucleotides
EP1746167A1 (en) * 2005-07-20 2007-01-24 Apoxis SA Method for the identification of compounds susceptible to inhibit inflammation
WO2007077042A1 (en) * 2006-01-06 2007-07-12 Topotarget Switzerland Sa New method for the treatment of gout or pseudogout
US20090018094A1 (en) 2006-12-01 2009-01-15 Loma Linda University Medical Center Inhibition of brain enzymes involved in cerebral amyloid angiopathy and macular degeneration
AU2008260572A1 (en) * 2007-05-29 2008-12-11 Yale University IL- 18 and protein kinase R inhibition for the treatment of COPD
US20090227487A1 (en) * 2008-03-05 2009-09-10 Jeremy Pearl Methods for the control of macrophage-associated inflammation
WO2010017436A2 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of myeloid differentation primary response gene 88 (myd88) expression by antisense oligonucleotides
AU2011242465B2 (en) * 2010-04-23 2017-01-19 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods and compositions for preserving photoreceptor and retinal pigment epithelial cells
US8809517B2 (en) 2010-06-01 2014-08-19 University Of Kentucky Research Foundation Method of inhibiting Alu RNA and therapeutic uses thereof
US20120177632A1 (en) * 2011-01-10 2012-07-12 Shinohara Mari L Methods of optimizing disease treatment

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012284223B2 (en) 2017-06-22
JP2014528700A (ja) 2014-10-30
CA2842034C (en) 2023-09-05
CA3205596A1 (en) 2013-01-24
WO2013012806A3 (en) 2013-05-30
EP3366302B1 (en) 2021-12-08
EP2734240B1 (en) 2018-03-21
US9453226B2 (en) 2016-09-27
PT3366302T (pt) 2022-03-07
ES2907620T3 (es) 2022-04-25
EP3366302A1 (en) 2018-08-29
CN103889461B (zh) 2016-11-09
EP2734240A2 (en) 2014-05-28
AU2012284223A1 (en) 2014-02-06
CN103889461A (zh) 2014-06-25
CA2842034A1 (en) 2013-01-24
US20140178309A1 (en) 2014-06-26
WO2013012806A2 (en) 2013-01-24
EP2734240A4 (en) 2015-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6313203B2 (ja) Ａｌｕ−ｒｎａ誘導変性からの細胞の保護及び細胞保護用阻害剤
US11730743B2 (en) Protection of cells from degeneration and treatment of geographic atrophy
Tarallo et al. DICER1 loss and Alu RNA induce age-related macular degeneration via the NLRP3 inflammasome and MyD88
Krishnan et al. A small peptide antagonist of the Fas receptor inhibits neuroinflammation and prevents axon degeneration and retinal ganglion cell death in an inducible mouse model of glaucoma
Kerur et al. TLR-independent and P2X7-dependent signaling mediate Alu RNA-induced NLRP3 inflammasome activation in geographic atrophy
EP2340040B1 (en) Modulation of axon degeneration
Pfalzgraff et al. LPS-neutralizing peptides reduce outer membrane vesicle-induced inflammatory responses
US20240100081A1 (en) Compositions and methods for treating age-related macular degeneration and geographic atrophy
Yang et al. White spot syndrome virus infection activates Caspase 1-mediated cell death in crustacean
JP7384811B2 (ja) 白斑を処置するための方法及び組成物
WO2007046087A2 (en) Pharmaceutical compositions and diagnostic methods for inflammatory skin disesaes, disorders or conditions
JP2020527546A (ja) 治療方法
US20180030537A1 (en) Puma, a pro-apoptotic gene, as a novel molecular biomarker for tnfalpha-induced human islet damage
Tiffney et al. Cleaved CD95L perturbs in vitro macrophages responses to Toxoplasma gondii
Chan Macrophage Response to Interleukin-1 Stimulation and the Nature of Cell Surface Interleukin-1 Alpha
Heir Glial tumour necrosis factor in synaptic scaling and the regulation of immune molecules by neuronal activity
Marrero Investigating Cell Type-Specific Responses to Legionella pneumophila Infection
Consiglio Novel Regulators of Monocyte Gasdermin D Activation and Release in Exosomes
Rathkey Gasdermin D as the Effector of Pyroptotic Cell Death
Apel Recognition of Neutrophil Extracellular Traps by the Cytosolic DNA Sensor cGAS
Begum Defining How Entamoeba histolytica Modulates Macrophage Functions
Vercellone A simple method to measure CFTR-dependent iodide transport in peripheral blood leukocytes: mutant HS-YFP assay
Lei Biochemical and functional characterization of the mitochondrial immune Signaling protein complex
Kasumba A plant-derived nucleic acid protects mice from respiratory viruses in an IFN-I-dependent and independent manner
Foldenauer Substance P and the host immune response

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150702

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150702

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160628

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160907

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170207

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170426

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20170905

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20171226

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180109

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20180129

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20180306

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20180322

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6313203

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250