JP6309521B2 - ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体 - Google Patents

Description

本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）と特異的に相互作用する抗原結合性分子、ならびに高コレステロール血症およびコレステロールレベルの上昇を特徴とする他の関連障害を治療するこのような分子の使用に関する。

プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）は、分泌性サブチラーゼファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属するプロタンパク質転換酵素である。コードされたタンパク質は、小胞体中で自己触媒的分子内処理を受ける可溶性の酵素原として合成される。循環ＰＣＳＫ９は、肝細胞の表面上の低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合し、それを破壊の標的とする。この過程は、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）を結合して除去する肝臓の能力を低下させ、そのため、ＬＤＬ−Ｃレベルが上昇することになる。ＰＣＳＫ９を特異的に結合し、ＬＤＬ受容体とのその相互作用を遮断する抗体は、ヒト対象における血清ＬＤＬ−Ｃレベルの低下に治療上有用であることが示されている。（例えば、非特許文献１を参照のこと）。

治療作用をもたらすために必要な抗体の投与量および／または投与頻度は、一般に単一抗体分子が中和することができる抗原の数によって決まる。例えば、抗体が宿主内で分解の標的となる前に、抗体が１つの抗原にしか結合して中和できない場合、治療作用をもたらすために比較的多量の抗体を投与しなければならない、かつ／または抗体を比較的頻繁に投与しなければならない。一方、１つの抗体が分解前に複数の抗原と繰り返し結合することができる場合、投与に必要な抗体はより少なくなり、より少ない頻度で投与することができ、結果として有効な治療反応になる。

当分野では、現在知られている入手可能なＰＣＳＫ９アンタゴニストで必要とされるものより低い投与量で、かつ／またはより長期間にわたって有効な治療反応をもたらすことができる、ＰＣＳＫ９を結合できる新たな治療分子が必要とされている。

Stein et al., New Engl. J. Med. 2012; 366:1108-1118

本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に対するｐＨ依存性結合を示す抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。例えば、本発明は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨでより高い親和性によってＰＣＳＫ９を結合する（すなわち、酸性ｐＨで結合親和性が低下する）抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。本明細書に記載された実施例に説明するように、酸性ｐＨで低下した結合親和性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体は、酸性ｐＨで低下した結合親和性を示さない抗体と比較してさまざまな改善された／増強された生物学的特性を備えている。例えば、酸性ｐＨで低下した結合親和性を有する本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、酸性ｐＨで低下した結合親和性を示さない抗ＰＣＳＫ９抗体と比較して動物対象（ヒト患者を含む）に投与したときに、血行中でより長い半減期を有する。換言すれば、酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合親和性を有する本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、ｐＨ依存性結合がない抗ＰＣＳＫ９抗体よりもゆっくりと血行から取り除かれる。より遅い抗体クリアランス（すなわち、血行中のより長い半減期）は、本発明の抗体の延長されたコレステロール低下効力と関連がある。したがって、本発明の抗体は、酸性ｐＨで低下した結合親和性を有しない抗ＰＣＳＫ９抗体よりも、少ない頻度および／または少ない用量で対象に投与することができるが、それにもかかわらず、それと同等の（または、より良好な）有効性を示すことになる。

理論によって拘束されるわけではないが、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対するより低い結合親和性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体は、エンドソームの酸性環境中で抗原から解離し、血漿に再利用され、ここで、さらなる治療的抗原結合ラウンドを受けることができると考えられる。この現象は、「抗体リサイクリング（antibody recycling）」または「キャッチ・アンド・リリース（catch-and-release）」と呼ばれており、単一抗体分子が複数の抗原に結合して中和することができるため、in vivoでの抗体の効力を大いに改善することができる。対照的に、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで同等のまたはより大きな親和性によってＰＣＳＫ９を結合する抗体は、分解のためリソソームに送られた後、エンドソーム中で抗原とのその強い結合によって抗体−抗原結合ラウンドを１回だけ受ける。

抗ＰＣＳＫ９抗体の結合特性は、例えば、表面プラズモン共鳴によってin vitroで定量化することができ、これにより、中性ｐＨおよび酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体についての結合特性の数値（例えばｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、ｔ１／２など）が得られる。これらのパラメータは、抗体がｐＨ依存性結合特性によってＰＣＳＫ９を結合するかどうかを明らかにするために用いることができる。したがって、本発明は、表面プラズモン共鳴により測定して、酸性ｐＨよりも中性ｐＨで少なくとも５倍高い親和性によってＰＣＳＫ９を結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（または、逆に記載すると、表面プラズモン共鳴により測定して中性ｐＨよりも酸性ｐＨで少なくとも５倍低い親和性によってＰＣＳＫ９を結合する抗体）を含む。また、本発明は、表面プラズモン共鳴により測定して、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のｔ１／２より少なくとも５倍短いｔ１／２によって酸性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（または、逆に記載すると、表面プラズモン共鳴により測定して、酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のｔ１／２より少なくとも５倍長いｔ１／２によって中性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する抗体）を含む。特定の実施態様によれば、酸性ｐＨよりも中性ｐＨで少なくとも５倍高い親和性によってＰＣＳＫ９を結合し、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のｔ１／２より少なくとも５倍短いｔ１／２によって酸性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する抗ＰＣＳＫ９抗体が提供される。

本発明の特定の実施態様によれば、約１０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与したとき、血清ＬＤＬ−Ｃをベースラインから少なくとも２５％低下させ、少なくとも２０日間、血清ＬＤＬ−Ｃの低下を持続させる抗ＰＣＳＫ９抗体が提供される。

本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、例えば、ｐＨ依存性結合を示さないか、または中程度のｐＨ依存性結合しか示さない親抗ＰＣＳＫ９抗体のアミノ酸配列を突然変異させ、それによってｐＨ依存性結合を示す変異型抗ＰＣＳＫ９抗体を生成することによって得てもよい。例えば、親抗ＰＣＳＫ９抗体の１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）内の１つまたはそれ以上のアミノ酸をヒスチジン残基に〕えてもよく、得られたヒスチジン変異抗体をｐＨ依存性結合（例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した親和性）について試験することができる。

本発明により、増強されたｐＨ依存性結合特性を有する変異型抗ＰＣＳＫ９抗体を産生するためアミノ酸配列レベルで修飾してもよい例示的な親抗ＰＣＳＫ９抗体は、３００Ｎと呼ばれる抗体である。あるいは、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体がヒスチジン置換突然変異誘発を介して誘導されうる親抗体として、抗体３００Ｎの重鎖および軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）（すなわち、配列番号：２１８／２２６を含む）を含む、または抗体３００Ｎの重鎖および軽鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む（すなわち、配列番号：２２０−２２２−２２４−２２８−２３０−２３２を含む）任意の抗ＰＣＳＫ９抗体を使用することができる。さらに、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体がヒスチジン置換突然変異誘発を介して誘導されうる親抗体として、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対、または本明細書の表１に示すＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む任意の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを使用してもよい。

本発明は、ＰＣＳＫ９と拮抗することによって、例えば、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）との相互作用を遮断することによって治療可能であり、かつ／または改善される疾患および障害を治療する方法を含む。本発明のこの態様による方法は、それを必要とする対象に、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を投与することを含む。本発明のこの態様による方法は、例えば、本明細書における他の箇所に開示された高コレステロール血症および他の関連疾患または障害を治療するために用いてもよい。

また、本発明は、それを必要とする対象に、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体の多回投与を行うことを含む治療的投与療法を含む。本発明のこの態様内の特定の実施態様によれば、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体の個々の用量を、１ヵ月に１回未満（例えば、２ヵ月毎に１回、３ヵ月毎に１回、４ヵ月毎に１回、など）の頻度で対象に投与してもよい。

本発明は、本明細書に具体的に記載された例示的なＰＣＳＫ９関連の疾患および障害のいずれかを含む、ＰＣＳＫ９と拮抗することによって、例えばＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）との相互作用を遮断することによって治療可能であり、かつ／または改善される疾患および障害の治療に使用するためのｐＨ依存性結合特性を有するその抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合性フラグメントを含む。本発明のｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントは、本明細書に教示された治療的投与療法に従って投与することができる。

本発明は、ＰＣＳＫ９と拮抗することによって、例えばＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）との相互作用を遮断することによって治療可能であり、かつ／または改善される疾患および障害の治療に使用するための医薬組成物、好ましくは、ＰＣＳＫ９と拮抗することによって治療可能であり、かつ／または改善される疾患および障害を治療する方法に関して本明細書に教示されたものを含む。本発明のこの態様による医薬組成物は、ＰＣＳＫ９と拮抗することによって治療可能であり、かつ／または改善される疾患および障害の治療に使用するためのｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでもよい。本発明の医薬組成物は、本明細書に教示された治療的投与療法のいずれかに従って投与することができる。

他の実施態様は、続く詳細な説明の検討から明らかになるであろう。

マウスＰＣＳＫ９のみを発現する（すなわち、ヒトＰＣＳＫ９を発現しない）マウスにおいて１ｍｇ／ｋｇの用量で抗ＰＣＳＫ９抗体を皮下投与した後、さまざまな時点で測定した抗ＰＣＳＫ９抗体の血清中濃度を示す。 ヒトＰＣＳＫ９（マウスＰＣＳＫ９の代わりに）を発現するマウスにおいて、１ｍｇ／ｋｇの用量で抗ＰＣＳＫ９抗体を皮下投与した後、さまざまな時点で測定した抗ＰＣＳＫ９抗体の血清中濃度を示す。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示した実験に用いた抗体の説明は、本明細書の表５に示す。 ヒトＰＣＳＫ９（マウスＰＣＳＫ９の代わりに）を発現するマウスにおいて、１ｍｇ／ｋｇの用量で抗ＰＣＳＫ９抗体を皮下投与した後、さまざまな時点で測定した抗ＰＣＳＫ９抗体の血清中濃度を示す。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示した実験に用いた抗体の説明は、本明細書の表５に示す。 ヒトＰＣＳＫ９（マウスＰＣＳＫ９の代わりに）を発現するマウスにおいて、１ｍｇ／ｋｇの用量で抗ＰＣＳＫ９抗体を皮下投与した後、さまざまな時点で測定した抗ＰＣＳＫ９抗体の血清中濃度を示す。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示した実験に用いた抗体の説明は、本明細書の表５に示す。 表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示し、ここでは、抗ＰＣＳＫ９抗体を中性ｐＨ（ｐＨ７．４）でヒトＰＣＳＫ９抗原と結合させた後、解離段階のための種々のｐＨ（７．４、７．２、６．０および５．７５）を有する緩衝液に取り換えた。これらの実験で試験した抗体は、３１６Ｐ（ｖ１）および３００Ｎ（ｖ２）（図３Ａ）である。各グラフ中の個々の線は、それぞれの抗体の異なる濃度での結合レスポンスを表す。これらの実験に用いた抗体の説明を、本明細書の表５に示す。すべての実験は、３７℃で実施した。解離半減期の値（ｔ１／２）をそれぞれのセンサーグラムの上に示す。 表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示し、ここでは、抗ＰＣＳＫ９抗体を中性ｐＨ（ｐＨ７．４）でヒトＰＣＳＫ９抗原と結合させた後、解離段階のための種々のｐＨ（７．４、７．２、６．０および５．７５）を有する緩衝液に取り換えた。これらの実験で試験した抗体は、ＶＨ−Ｄ１０６ＨおよびＶＫ−Ｌ３０Ｈ（図３Ｂ）である。各グラフ中の個々の線は、それぞれの抗体の異なる濃度での結合レスポンスを表す。これらの実験に用いた抗体の説明を、本明細書の表５に示す。すべての実験は、３７℃で実施した。解離半減期の値（ｔ１／２）をそれぞれのセンサーグラムの上に示す。 表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示し、ここでは、抗ＰＣＳＫ９抗体を中性ｐＨ（ｐＨ７．４）でヒトＰＣＳＫ９抗原と結合させた後、解離段階のための種々のｐＨ（７．４、７．２、６．０および５．７５）を有する緩衝液に取り換えた。これらの実験で試験した抗体は、ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ／ＶＫ−Ｌ３０Ｈおよびコンパレーター１（図３Ｃ）である。各グラフ中の個々の線は、それぞれの抗体の異なる濃度での結合レスポンスを表す。これらの実験に用いた抗体の説明を、本明細書の表５に示す。すべての実験は、３７℃で実施した。解離半減期の値（ｔ１／２）をそれぞれのセンサーグラムの上に示す。 表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示し、ここでは、抗ＰＣＳＫ９抗体を中性ｐＨ（ｐＨ７．４）でヒトＰＣＳＫ９抗原と結合させた後、解離段階のための種々のｐＨ（７．４、７．２、６．０および５．７５）を有する緩衝液に取り換えた。これらの実験で試験した抗体は、コンパレーター２およびコンパレーター３（図３Ｄ）である。各グラフ中の個々の線は、それぞれの抗体の異なる濃度での結合レスポンスを表す。これらの実験に用いた抗体の説明を、本明細書の表５に示す。すべての実験は、３７℃で実施した。解離半減期の値（ｔ１／２）をそれぞれのセンサーグラムの上に示す。 表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示し、ここでは、抗ＰＣＳＫ９抗体を中性ｐＨ（ｐＨ７．４）でヒトＰＣＳＫ９抗原と結合させた後、解離段階のための種々のｐＨ（７．４、７．２、６．０および５．７５）を有する緩衝液に取り換えた。これらの実験で試験した抗体は、コンパレーター４およびコンパレーター５（図３Ｅ）である。各グラフ中の個々の線は、それぞれの抗体の異なる濃度での結合レスポンスを表す。これらの実験に用いた抗体の説明を、本明細書の表５に示す。すべての実験は、３７℃で実施した。解離半減期の値（ｔ１／２）をそれぞれのセンサーグラムの上に示す。 表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示し、ここでは、抗ＰＣＳＫ９抗体を中性ｐＨ（ｐＨ７．４）でヒトＰＣＳＫ９抗原と結合させた後、解離段階のための種々のｐＨ（７．４、７．２、６．０および５．７５）を有する緩衝液に取り換えた。これらの実験で試験した抗体は、コンパレーター６およびコンパレーター７（図３Ｆ）である。各グラフ中の個々の線は、それぞれの抗体の異なる濃度での結合レスポンスを表す。これらの実験に用いた抗体の説明を、本明細書の表５に示す。すべての実験は、３７℃で実施した。解離半減期の値（ｔ１／２）をそれぞれのセンサーグラムの上に示す。 表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示し、ここでは、抗ＰＣＳＫ９抗体を中性ｐＨ（ｐＨ７．４）でヒトＰＣＳＫ９抗原と結合させた後、解離段階のための種々のｐＨ（７．４、７．２、６．０および５．７５）を有する緩衝液に取り換えた。これらの実験で試験した抗体は、コンパレーター８およびコンパレーター９（図３Ｇ）である。各グラフ中の個々の線は、それぞれの抗体の異なる濃度での結合レスポンスを表す。これらの実験に用いた抗体の説明を、本明細書の表５に示す。すべての実験は、３７℃で実施した。解離半減期の値（ｔ１／２）をそれぞれのセンサーグラムの上に示す。

本発明を説明する前に、記載された特定の方法および実験条件は変化しうるため、本発明はこのような方法および条件に限定されるわけではないことを理解しなければならない。また、本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定されるため、本明細書に用いる専門用語は、特定の実施態様を説明するためだけにあって、限定しようとするものでないことを理解しなければならない。

特に明記しない限り、本明細書に用いるすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に用いるように、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して用いるとき、その値が列挙された値から１％を超えずに逸脱してもよいことを意味する。例えば、本明細書に用いるように、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびにその間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、など）を含む。

本発明の実施または試験においては、本明細書に記載されたものと類似または同等のあらゆる方法および材料を用いることができるが、ここで、好ましい方法および材料を説明する。

一般的な定義
「プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型」、「ＰＣＳＫ９」、「ＰＣＳＫ９フラグメント」などの表現は、本明細書に用いるように、非ヒト種（例えば、「マウスＰＣＳＫ９」、「マウスＰＣＳＫ９フラグメント」、「サルＰＣＳＫ９」、「サルＰＣＳＫ９フラグメント」、など）からであると明記されていなければ、ヒトＰＣＳＫ９タンパク質またはフラグメントのことをいう。ヒトＰＣＳＫ９（本明細書では、しばしば「ｈＰＣＳＫ９」と略す）は、配列番号：７５５に示すアミノ酸を有する。

「抗体」という用語は、本明細書に用いるように、特定の抗原（例えば、ＰＣＳＫ９）と特異的に結合するか、または相互作用する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、あらゆる抗原結合性分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に結合された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖である４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えば、免疫グロブリンＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶ_Ｈと略す）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＬＣＶＲまたはＶ_Ｌと略す）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存性の高い領域の間に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される。本発明の異なる実施態様では、抗体（またはその抗原結合性部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞系配列と同一であってもよく、または自然にもしくは人工的に修飾されてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つまたはそれ以上のＣＤＲの比較分析に基づいて定義してもよい。「抗体」という用語は、本明細書に用いるように、組換え抗体を包含する。

「抗体」という用語は、本明細書に用いるように、全抗体分子（full antibody molecules）の抗原結合性フラグメントも含む。抗体の「抗原結合性部分」、抗体の「抗原結合性フラグメント」などの用語は、本明細書に用いるように、抗原を特異的に結合して複合体を形成する、いずれか天然の、酵素によって入手可能な、合成の、または遺伝子組換えのポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合性フラグメントは、例えば、抗体の可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子工学技術またはタンパク質分解のようないずれかの適した標準技術を用いて全抗体分子から誘導してもよい。このようなＤＮＡは知られており、かつ／または、例えば、商業的な供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、配列決定し、化学的にまたは分子生物学的手法を用いて操作して、例えば、１つまたはそれ以上の可変および／または定常ドメインを適した配置に配列するか、またはコドンを導入し、システイン残基を生成し、アミノ酸などを修飾、付加もしくは除去しもよい。

抗原結合性フラグメントの非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小限の認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、または拘束性（constrained）ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドが含まれる。他の遺伝子操作された分子、例えばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特性抗体、ミニ抗体、ナノ抗体（例えば一価ナノ抗体、二価ナノ抗体、など）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ由来可変ＩｇＮＡＲドメインもまた、本明細書に用いるように、「抗原結合性フラグメント」の表現内に包含される。

抗体の抗原結合性フラグメントは、典型的に少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であってもよく、一般に１つまたはそれ以上のフレームワーク配列に隣接するか、またはそれを含むフレーム中にある少なくとも１つのＣＤＲを含むことになる。ＶＬドメインと関連するＶＨドメインを有する抗原結合性フラグメントにおいて、ＶＨおよびＶＬドメインは、任意の適した配置で互いに相対する状態にあってもよい。例えば、可変領域は二量体であって、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含んでもよい。あるいは、抗体の抗原結合性フラグメントは、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含んでもよい。

特定の実施態様において、抗体の抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの定常領域に共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含んでもよい。本発明の抗体の抗原結合性フラグメント内に見いだされうる可変および定常ドメインの非限定的な例示的配置としては、（ｉ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１；（ｉｉ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ２；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ３；（ｉｖ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１−Ｃ_Ｈ２；（ｖ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３；（ｖｉ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３；（ｖｉｉ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｌ；（ｖｉｉｉ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｈ１；（ｉｘ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｈ２；（ｘ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｈ３；（ｘｉ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｈ１−Ｃ_Ｈ２；（ｘｉｉ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｈ１−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３；（ｘｉｉｉ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３；および（ｘｉｖ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌが含まれる。上に記載された例示的配置のいずれかを含む可変および定常ドメインの任意の配置において、可変および定常ドメインは、互いに直接結合してもよいし、または完全なもしくは部分的なヒンジもしくはリンカー領域によって結合してもよい。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子中の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメインの間に可動性または半可動性の結合となる少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれ以上の）アミノ酸からなってもよい。特定の実施態様において、ヒンジ領域は２から６０の間のアミノ酸、例えば、５から５０の間、または１０から４０の間のアミノ酸からなる。さらに、本発明の抗体の抗原結合性フラグメントは、互いにかつ／または１つもしくはそれ以上の単量体Ｖ_ＨもしくはＶ_Ｌドメインと非共有結合的結合または共有結合で（例えば、ジスルフィド結合によって）上記の可変および定常領域配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含んでもよい。

「ヒト抗体」という用語は、本明細書に用いるように、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導された可変および定常領域を有する抗体を包含するものとする。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３中に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、in vitroでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはin vivoでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含んでもよい。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書に用いるように、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系から誘導されたＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むことは意図していない。特定の実施態様において、ヒト抗体は、本明細書において下に定義された組換えヒト抗体であることができる。

「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書に用いるように、組換え手段によって作製、発現、生成または単離されるすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞に導入された組換え発現ベクターを用いて発現された抗体（さらに下に説明する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（さらに下に説明する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295を参照のこと）または、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他のなんらかの手段によって作製、発現、生成もしくは単離された抗体を含むものとする。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導された可変および定常領域を有する。しかし、特定の実施態様において、このような組換えヒト抗体は、in vitroでの突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列に対してトランスジェニック動物を用いるとき、in vivoでの体細胞変異）にかけられ、そのため、組換え抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列から誘導されており、それらと関連があるが、in vivoにおいてヒト抗体生殖細胞系レパートリー内で天然に存在しえない配列となる。

ヒト抗体は、ヒンジ不均一性（heterogeneity）に関連する２つの形態で存在することができる。一形態において、免疫グロブリン分子は、鎖間の重鎖ジスルフィド結合によって二量体が一体となって保持されている約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４本鎖構築物を含む。第２の形態において、二量体は鎖間のジスルフィド結合を介して結合されておらず、共有結合した軽鎖および重鎖（半分の抗体）で構成される約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される。これらの形態は、アフィニティ精製の後でさえ分離するのが極めて困難である。

種々の無傷ＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造の違いによるが、それに限定されるわけではない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、第２の形態の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて典型的に観察されるレベルまで著しく低下させることができる（Angal et
al. (1993) Molecular Immunology 30:105）。本発明は、例えば、産生において、所望の抗体形態の収率を改善するために望ましいことがありうる、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２またはＣ_Ｈ
３領域中に１つまたはそれ以上の突然変異を有する抗体を包含する。

「単離された抗体」は、本明細書に用いるように、特定されており、その自然環境の少なくとも１つの成分から分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が自然に存在するか、もしくは自然に産生される組織もしくは細胞から分離された、または取り出された抗体が、本発明の目的の「単離された抗体」である。また、単離された抗体は、組換え細胞内の原位置の抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離ステップにかけられた抗体である。特定の実施態様によれば、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。

「中和」または「遮断」抗体は、本明細書に用いるように、ＰＣＳＫ９に結合すると、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）またはＬＤＬＲの細胞外フラグメントとの間の相互作用を低下させるか、または検出可能な程度に阻害する抗体のことをいうものとする。

本明細書に開示された抗ＰＣＳＫ９抗体は、この抗体が誘導された対応する生殖細胞系配列と比較してフレームワークおよび／または重鎖および軽鎖可変ドメインのＣＤＲ領域中に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の置換、および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の挿入、および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の欠失）を含んでもよい。このような突然変異は、本明細書に開示されたアミノ酸配列を、例えば、抗体配列の公開データベースから入手可能な生殖細胞系配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体においてｐＨ依存性結合特性を与える特定のアミノ酸変化は、本明細書の他の箇所で詳細に議論する。本発明は、本明細書に開示されたアミノ酸配列のいずれかから誘導されており、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸）が、抗体が誘導された生殖細胞系配列の対応する残基に、または別のヒト生殖細胞系配列の対応する残基に、または対応する生殖細胞系残基の保存的アミノ酸置換に突然変異している（このような配列変化は、本明細書においてまとめて「生殖細胞系突然変異」と呼ばれる）抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。当業者は、本明細書に開示された重鎖および軽鎖可変領域配列により出発して、１つまたはそれ以上の個々の生殖細胞系突然変異またはその組合せを含む、多くの抗体および抗原結合性フラグメントを容易に産生することができる。特定の実施態様では、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のすべてが、抗体が誘導された元の生殖細胞系配列に見いだされる残基に突然変異して戻る。別の実施態様では、特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸の範囲内もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸の範囲内に見いだされる突然変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見いだされる突然変異残基のみが、元の生殖細胞系配列に突然変異して戻る。別の実施態様において、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の１つまたはそれ以上が、異なる生殖細胞系配列（すなわち、抗体が最初に誘導された生殖細胞系配列と異なる生殖細胞系配列）の対応する残基に突然変異する。さらにまた、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つまたはそれ以上の生殖細胞系突然変異の任意の組合せを含んでもよく、例えば、ここでは、特定の個々の残基が、特定の生殖細胞系配列の対応する残基に突然変異すると同時に、最初の生殖細胞系配列と異なる特定の他の残基が維持されるか、または異なる生殖細胞系配列の対応する残基に突然変異する。一旦得られたら、１つまたはそれ以上の生殖細胞系突然変異を含む抗体および抗原結合性フラグメントは、改善された結合特異性、増加した結合親和性、改善されたまたは増強されたアンタゴニストまたはアゴニスト生物学的特性（場合によっては）、低下した免疫原性などのような１つまたはそれ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的なやり方で得られる抗体および抗原結合性フラグメントは、本発明内に包含される。

また、本発明は、１つまたはそれ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比較して、例えば１０またはそれ未満、８またはそれ未満、６またはそれ未満、４またはそれ未満、３またはそれ未満、２または１の保存的アミノ酸置換を有する、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。

「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域において特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基のことをいう。単一抗原が、複数のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体が、抗原上の異なる領域に結合してもよく、異なる生物学的作用を有してもよい。エピトープは立体構造または線状のいずれであってもよい。立体構造エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。特定の状況において、エピトープは、抗原上に糖類の部分、ホスホリル基またはスルホニル基を含んでもよい。

「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、核酸またはそのフラグメントに関するときは、別の核酸（またはその相補鎖）を用いて適当なヌクレオチド挿入または欠失により最適に整列させたとき、配列同一性のいずれかのよく知られたアルゴリズム、例えば、以下に議論するような、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐによって測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。配列同一性パーセンテージを、本開示中の核酸配列について示すとき、このようなパーセンテージは、特に明記しない限り、それぞれの参照核酸配列の完全長に関して計算するものとする。参照核酸分子に対して実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合、参照核酸分子によってコードされたポリペプチドと同じか、または実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。

ポリペプチドに適用されるように、「実質的な類似性」または「実質的に類似した」という用語は、例えば、デフォルトギャップ質量（default gap weight）を用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列させたとき、２つのペプチド配列が、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。配列同一性パーセンテージを本開示中のアミノ酸配列について示すとき、このようなパーセンテージは、特に明記しない限り、それぞれの参照アミノ酸配列の完全長に関して計算するものとする。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変えないことになる。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度を上向きに調整して置換の保存的性質に関して補正してもよい。この調整を行う手段は、当業者によく知られている。例えば、Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331を参照のこと。類似の化学的性質を備えた側鎖を有するアミノ酸基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニンおよびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパルテートおよびグルタメート、ならびに（７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタメート−アスパルテートおよびアスパラギン−グルタミンである。別法として、保存的置換は、Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445中に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックス（log-likelihood matrix）において正の値を有する任意の変化である。「適度な保存的」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有する任意の変化である。ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれており、配列解析ソフトウェアを用いて典型的に測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、種々の置換、欠失および他の修飾に割り当てられた類似性の手段を用いて、類似した配列を適合させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアとしては、異なる生物種からの相同ポリペプチドのような密接に関連したポリペプチド間、または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を明らかにするためにデフォルトパラメータで使用できるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔのようなプログラムが含まれる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。また、ポリペプチド配列は、デフォルトまたは推奨パラメータを用いるＦＡＳＴＡ、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリーと検索配列との間に最良の重複部分の領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性を提供する（前出、Pearson (2000) ）。本発明の配列を、異なる生物からの多数の配列を含むデータベースと比較するときの他の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いるコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402を参照のこと。

ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体
本発明は、ｐＨ依存性結合特性を示す抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。本明細書に用いるように、「ｐＨ依存性結合」という表現は、抗体またはその抗原結合性フラグメントが「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合」を示すことを意味する（本開示の目的では、いずれの表現も同じ意味で用いてよい）。例えば、「ｐＨ依存性結合特性を有する」抗体は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨでより高い親和性によってＰＣＳＫ９を結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。特定の実施態様において、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、酸性ｐＨよりも中性ｐＨで、少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００倍またはそれ以上のより高い親和性によってＰＣＳＫ９を結合する。また、「ｐＨ依存性結合特性を有する」抗体という成句は、「中程度のｐＨ依存性結合特性」を有する抗体を含み、その表現は本明細書の他の箇所に定義されたとおりである。

抗原（例えば、ＰＣＳＫ９）に対する抗体の「親和性」は、本開示の目的では、抗体のＫ_Ｄによって表される。抗体のＫ_Ｄは、抗体−抗原相互作用の平衡解離定数のことをいう。抗原に結合する抗体について、Ｋ_Ｄ値が大きくなるほど、その特定の抗原に対するその抗体の結合親和性が弱くなる。したがって、本明細書に用いるように、「酸性ｐＨよりも中性ｐＨでより高い親和性」という表現（または「ｐＨ依存性結合」という同等の表現）は、酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のＫ_Ｄは、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のＫ_Ｄより大きいことを意味する。例えば、本発明の文脈では、酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合す抗体のＫ_Ｄが、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のＫ_Ｄよりも少なくとも約３倍大きい場合、抗体は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨでより高い親和性によってＰＣＳＫ９を結合すると考えられる。したがって、本発明は、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のＫ_Ｄよりも少なくとも約３、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００倍、またはそれ以上となるＫ_Ｄによって酸性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む（それは、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、酸性ｐＨよりも少なくとも約３、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００倍、またはそれ以上の大きな親和性によって中性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合することを意味する）。

また、特定の抗原に対する抗体の結合特性は、抗体のｋ_ｄによって表してもよい。抗体のｋ_ｄは、特定の抗原に関する抗体の解離速度定数のことであり、レシプロカル秒（すなわち、秒^−１）によって表される。ｋ_ｄ値の増加は、その抗原に対する抗体の結合が弱くなることを示す。したがって、本発明は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでより高いｋ_ｄ値によってＰＣＳＫ９を結合する抗体を含む。本発明は、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のｋ_ｄよりも、少なくとも約３、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００倍、またはそれ以上となるｋ_ｄによって酸性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。

特定の抗原に対する抗体の結合特性は、抗体のｔ１／２によって表してもよい。抗体のｔ１／２は、抗体−抗原相互作用の半減期のことをいう。したがって、本発明によれば、「ｐＨ依存性結合特性」（または同等の表現「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合」）を有する抗体は、中性ｐＨより短いｔ１／２によって酸性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する抗体を含む。例えば、本発明は、中性ｐＨでＰＣＳＫ９と結合する抗体のｔ１／２よりも少なくとも５倍短いｔ１／２によって酸性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。例えば、本発明は、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のｔ１／２よりも、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０倍、またはそれ以上短いｔ１／２によって酸性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。具体例として、抗ＰＣＳＫ９抗体が中性ｐＨで２１分のｔ１／２、そして酸性ｐＨで３分のｔ１／２を示す場合、本開示の目的では、抗体は、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のｔ１／２よりも７倍［すなわち、２１分を３分で割る］短いｔ１／２によって酸性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する。

特定の例では、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合」は、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のＫ_Ｄ値に対する酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のＫ_Ｄ値の比率によって表される（または、その逆も同じ）。例えば、本発明の目的では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、約３．０またはそれ以上の酸性／中性Ｋ_Ｄ比を示す場合、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合」を示すとみなしてもよい。特定の例示的な実施態様において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの酸性／中性Ｋ_Ｄ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０またはそれ以上であることができる。

特定の例において、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合」は、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のｋ_ｄ値に対する酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のｋ_ｄ値の比率によって表される（または、その逆も同じ）。例えば、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、本発明の目的では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、約３．０またはそれ以上の酸性／中性ｋ_ｄ比を示す場合、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合」を示すとみなしてもよい。特定の例示的な実施態様において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの酸性／中性Ｋ_Ｄ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０またはそれ以上であることができる。

特定の例において、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合」は、中性ｐＨでＰＣＳＫ９と結合している抗体のｔ１／２値に対する酸性ｐＨでＰＣＳＫ９と結合する抗体のｔ１／２値の比率によって表される（または、その逆も同じ）。例えば、本発明の目的では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、約０．２０またはそれ未満の酸性／中性ｔ１／２比を示す場合、抗体またはその抗原結合性フラグメントが「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合」を示すとみなしてもよい。特定の例示的な実施態様において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの酸性／中性ｔ１／２比は、約０．２０、０．１５、０．１４、０．１２、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１またはそれ未満であることができる。

本発明の抗体は、特定の例において、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、より低い親和性（すなわち、より高いＫ_Ｄ）およびより短いｔ１／２の両方によってＰＣＳＫ９を結合する。例えば、本発明は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨで少なくとも５倍高い親和性によって、かつ中性ｐＨでｈＰＣＫＳ９に結合する抗体のｔ１／２よりも少なくとも５倍短い酸性ｐＨでのｔ１／２によってＰＣＳＫ９を結合する抗体を含む。しかし、特定の場合、酸性ｐＨよりも中性ｐＨでＰＣＳＫ９に対するより高い結合親和性を示す抗体（Ｋ_Ｄ値によって示すように）は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでより短いｔ１／２を必ずしも示さなくてよい。

本明細書に用いるように、「酸性ｐＨ」という表現は、６．０またはそれ未満（例えば、約６．０未満、約５．５未満、約５．０未満、など）のｐＨを意味する。「酸性ｐＨ」という表現は、６．０、５．９５、５．９０、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０、またはそれ未満のｐＨ値を含む。

本明細書に用いるように、「中性ｐＨ」という表現は、約７．０〜約７．４のｐＨを意味する。「中性ｐＨ」という表現は、７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、および７．４のｐＨ値を含む。

本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントのいずれかの特徴（例えば、Ｋ_Ｄ値、Ｋ_ｄ値、ｔ１／２時間、ＩＣ_５０値、など）を酸性ｐＨで測定し、中性ｐＨでの同じ特徴と比較する場合（または、その逆も同じ）、特に明記しない限り、比較測定は、酸性ｐＨ６．０および中性ｐＨ７．４、ならびに温度２５℃で測定したとみなさなければならない。

本明細書に表すＫ_Ｄ値、ｋ_ｄ値およびｔ１／２時間は、抗体−抗原相互作用を特徴づけるため表面プラズモン共鳴をベースとするバイオセンサーを用いて測定してもよい（例えば、本明細書の実施例３を参照のこと）。Ｋ_Ｄ値、ｋ_ｄ値およびｔ１／２時間は、２５℃または３７℃で測定することができる。

中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合を示す抗体およびその抗原結合性フラグメントは、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合を示さない抗体およびその抗原結合性フラグメントと比較して改善された薬物動態性質を示すことが発見された。例えば、本明細書に提供した実施例が示すように、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合を示す本発明の特定の抗体は、動物対象に投与したとき、ｐＨ依存性結合特性を示さない抗ＰＣＳＫ９抗体と比較して、血行からのより遅いクリアランスを示す。本発明のこの態様によれば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合を備えていない抗体と比較して少なくとも２倍遅い血行からのクリアランスを示す、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合を有する抗体が提供される。クリアランス速度は、抗体の半減期によって表すことができ、ここでは、クリアランスが遅いほど半減期が長くなるという相関関係がある。また、本発明は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合を有する抗ＰＣＳＫ９抗体を含み、ここで、この抗体は、ヒトＰＣＳＫ９を発現する動物（例えば、マウス）に約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与したとき、投与後、少なくとも３０日間、動物の血清中に１．０μｇ／ｍｌを超える濃度で検出可能である。

また、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合を示す抗体およびその抗原結合性フラグメントは、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合を示さない抗体およびその抗原結合性フラグメントと比較して、改善および延長されたコレステロール低下活性を示すことが発見された。例えば、本発明は、酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合を示さない抗体およびその抗原結合性フラグメントと比較して延長されたＬＤＬ−Ｃ低下能力をもたらす抗ＰＣＳＫ９抗体を提供する。本発明の特定の実施態様によれば、約１０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与したとき、ベースラインから少なくとも２５％血清ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させ、この血清ＬＤＬ−Ｃレベルの低下を少なくとも２５日間持続させる抗ＰＣＳＫ９抗体が提供される。特定の場合、約１０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与したとき、ベースラインから少なくとも２５％血清ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させ、この血清ＬＤＬ−Ｃレベルの低下を、例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５日間またはそれ以上持続させる抗ＰＣＳＫ９抗体が提供される。本明細書に用いるように、ＬＤＬ−Ｃ（または、他の関連パラメータ）に関連がある「ベースライン」という用語は、抗ＰＣＳＫ９抗体（または、他の比較の治療介入）を対象に投与する時間の直前に測定した対象の血清中のＬＤＬ−Ｃレベルを意味する。

本願発明者らは、少なくとも特定の治療状況下で、ＰＣＳＫ９に対する結合に関してあまりに高いｐＨ感受性の程度を示す抗体は有害となりうることを発見した。すなわち、特定の状況下で、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでより低い親和性によって結合するが、それにもかかわらず、酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する結合親和性をある程度を保持することは、抗体にとって望ましいことでありうる。したがって、本発明の特定の実施態様によれば、中程度のｐＨ依存性結合特性を示す抗ＰＣＳＫ９抗体が提供される。

本明細書に用いるように、「中程度のｐＨ依存性結合特性」という表現は、３．０を超えるが、８．０未満の酸性／中性Ｋ_Ｄ比を示す抗体またはその抗原結合性フラグメントを意味する。特定の例示的な実施態様において、「中程度のｐＨ依存性結合特性」を有する抗体の酸性／中性Ｋ_Ｄ比は、３．５から８．０の間；４．０から８．０の間；４.５から８．０の間；５．０から８．０の間；５．５から８．０の間；６．０から８．０の間；６．５から８．０の間；３．０から７．５の間；３．０から７．０の間；３．０から６．５の間；３．０から８．０の間；３．５から７．５の間；４．０から７．０の間；４.５から７．０の間；５．０から７．０の間；または４．５から６．５の間である。特定の例示的な実施態様において、「中程度のｐＨ依存性結合特性」を有する抗体の酸性／中性Ｋ_Ｄ比は、約３．０、約３．５、約４．０、約４.５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、または約８．０である。また、「中程度のｐＨ依存性結合特性」を有する抗ＰＣＳＫ９抗体は、約１．０未満であるが約０．１５を超える酸性／中性ｔ１／２比を示してもよい。抗体が、本明細書に定義される「中程度のｐＨ依存性結合特性」を示すかどうか明らかにする目的では、酸性／中性Ｋ_Ｄ比および／または酸性／中性ｔ１／２比を、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定してもよい。本明細書に他の箇所に示すように、酸性／中性Ｋ_Ｄ比および／または酸性／中性ｔ１／２比、などは、酸性ｐＨ６．０および中性ｐＨ７．４で、または代わりに酸性ｐＨ５．７５および中性ｐＨ７．２で測定することができる。

本明細書に用いるように、また、「中程度のｐＨ依存性結合特性」を有する抗ＰＣＳＫ９抗体は、表面プラズモン共鳴で測定して、約３５分未満であるが１０．５分を超えるｔ１／２によって酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）および２５℃でＰＣＳＫ９を結合する抗体および抗原結合性フラグメントを含む。例えば、本発明は、約２０分未満かつ約１０分を超える；約２０分未満かつ約１１分を超える；約２０分未満かつ約１２分を超える；約２０分未満かつ約１３分を超える；約２０分未満かつ約１４分を超える；約２０分未満かつ約１５分を超える；約３０分未満かつ約１１分を超える；約２５分未満かつ約１２分を超える；約１４分未満かつ約１８分を超える；約１６分未満かつ約１３分を超える；または約１６分未満かつ約１４分を超えるｔ１／２によって酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）および２５℃でＰＣＳＫ９を結合する「中程度のｐＨ依存性結合特性」を有する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。

また、「中程度のｐＨ依存性結合特性」を有する抗体は、約１０．５分、約１１．０分、約１１．５分、約１２．０分、約１２．５分、約１３．０分、約１３．５分、約１４．０分、約１４．５分、約１５．０分、約１５．５分、約１６．０分、約１６．５分、約１７．０分、約１７．５分、約１８．０分、約１８．５分、約１９．０分、約１９．５分、約２０．０分、約２０．５分、約２１．０分、約２２．０分、約２３．０分、約２４．０分、約２５．０分、約２６．０分、約２７．０分、約２８．０分、約２９．０分、約３０．０分、約３１．０分、約３２．０分、約３３．０分、約３４．０分、または約３５．０分のｔ１／２によって酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）および２５℃でＰＣＳＫ９を結合する抗体を含む。

ヒスチジン置換を有するｐＨ依存性抗ＰＣＳＫ９抗体
本発明は、親抗ＰＣＳＫ９抗体と比較して１つまたはそれ以上のアミノ酸の違いを有し、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体を提供する。本明細書に用いるように、「親」抗ＰＣＳＫ９抗体は、ｐＨ依存性結合特性を示さないか、または中程度のｐＨ依存性結合特性のみを示す抗ＰＣＳＫ９抗体である（例えば、ここでは、中性ｐＨでのＰＣＳＫ９に対する親抗体の結合親和性は、酸性ｐＨでのＰＣＳＫ９に対する抗体の結合親和性よりも３倍を超えることなく大きい；または親抗体は、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のｔ１／２よりも３倍を超えることなく短いｔ１／２によって酸性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する）。場合によっては、「親」抗ＰＣＳＫ９抗体は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する増強された結合を示す抗ＰＣＳＫ９抗体であってもよい。いくつかの実施態様では、「親」抗ＰＣＳＫ９抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）中に人工的に導入されたなんらかのアミノ酸修飾なしに、標準抗体産生／単離方法（例えば、マウス免疫化、ファージディスプレイ、など）によって得られる抗体である。

本発明のこの態様によれば、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体は、親抗ＰＣＳＫ９抗体と比較して１つまたはそれ以上のアミノ酸変異を有してもよい。例えば、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体は、例えば、親抗ＰＣＳＫ９抗体の１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５または６個の）ＣＤＲ中に、１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個またはそれ以上の）ヒスチジン置換または挿入を含んでもよい。したがって、本発明の特定の実施態様によれば、ヒスチジン残基による親抗体の１つまたはそれ以上のＣＤＲの１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換を除いて、親抗ＰＣＳＫ９抗体のＣＤＲアミノ酸配列と同一であるＣＤＲアミノ酸配列（例えば、重鎖および軽鎖ＣＤＲ）を含む抗ＰＣＳＫ９抗体が提供される。ｐＨ依存性結合を有する抗ＰＣＳＫ９抗体は、親抗体の単一ＣＤＲ内に、または親抗ＰＣＳＫ９抗体の複数（例えば、２、３、４、５または６個）のＣＤＲにわたって配置された、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個またはそれ以上のヒスチジン置換を有してもよい。例えば、本発明は、親抗ＰＣＳＫ９抗体の、ＨＣＤＲ１中の１つまたはそれ以上のヒスチジン置換、ＨＣＤＲ２中の１つまたはそれ以上のヒスチジン置換、ＨＣＤＲ３中の１つまたはそれ以上のヒスチジン置換、ＬＣＤＲ１中の１つまたはそれ以上のヒスチジン置換、ＬＣＤＲ２中の１つまたはそれ以上のヒスチジン置換、および／またはＬＣＤＲ３中の１つまたはそれ以上のヒスチジン置換を含む、ｐＨ依存性結合を有する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。

ｐＨ依存性結合特性（または増強されたｐＨ依存性結合特性）を有するために修飾するか、突然変異させるか、またはそうでない場合、遺伝子操作することができる「親」抗ＰＣＳＫ９抗体の例としては、米国特許第８,０６２,６４０号に開示された、いずれかの相補性決定領域（ＣＤＲ）または重鎖および軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む抗ＰＣＳＫ９抗体（また、本明細書の実施例１、表１にまとめる）が含まれる。中程度のｐＨ依存性結合特性のみを示す親抗ＰＣＳＫ９抗体の具体例は、「３００Ｎ」として本明細書（および米国特許第８,０６２,６４０号中）に引用された抗体である。３００Ｎは、配列番号：２１８／２２６を有するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列、ならびに、それぞれ、配列番号：２２０、２２２、２２４、２２８、２３０、２３２を有する重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む。したがって、配列番号：２１８／２２６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対、または配列番号：２２０、２２２、２２４、２２８、２３０、２３２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む任意の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを産生するため、アミノ酸配列レベルで修飾することができる（例えば、１つまたはそれ以上のＣＤＲ中の１つまたはそれ以上のヒスチジン置換および／または挿入を有する）適した「親」抗体である。

別法として、米国特許第８,０６２,６４０号に示された例示的な抗ＰＣＳＫ９抗体のいずれかのＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対、またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む任意の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメント（また、本明細書の実施例１、表１にまとめる）は、また、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを産生するため、アミノ酸配列レベルで修飾することができる（例えば、１つまたはそれ以上のＣＤＲ中に１つまたはそれ以上のヒスチジン置換および／または挿入を有する）適した「親」抗体である。

特定の実施態様において、本発明は、ｐＨ依存性結合特性を示し、かつ重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、このＨＣＶＲが、配列番号：２、１８、２２、２６、４２、４６、５０、６６、７０、７４、９０、９４、９８、１１４、１１８、１２２、１３８、１４２、１４６、１６２、１６６、１７０、１８６、１９０、１９４、２１０、２１４、２１８、２３４、２３８、２４２、２５８、２６２、２６６、２８２、２８６、２９０、３０６、３１０、３１４、３３０、３３４、３３８、３５４、３５８、３６２、３７８、３８２、３８６、４０２、４０６、４１０、４２６、４３０、４３４、４５０、４５４、４５８、４７４、４７８、４８２、４９８、５０２、５０６、５２２、５２６、５３０、５４６、５５０、５５４、５７０、５７４、５７８、５９４、５９８、６０２、６１８、６２２、６２６、６４２、６４６、６５０、６６６、６７０、６７４、６９０、６９４、６９８、７１４、７１８、７２２、７３８および７４２のいずれか１つのアミノ酸配列または１つもしくはそれ以上の重鎖ＣＤＲ内の１つもしくはそれ以上のアミノ酸がヒスチジン残基で置換された上記アミノ酸配列のいずれかの変異体を含み；そしてＬＣＶＲが、配列番号：１０、２０、２４、３４、４４、４８、５８、６８、７２、８２、９２、９６、１０６、１１６、１２０、１３０、１４０、１４４、１５４、１６４、１６８、１７８、１８８、１９２、２０２、２１２、２１６、２２６、２３６、２４０、２５０、２６０、２６４、２７４、２８４、２８８、２９８、３０８、３１２、３２２、３３２、３３６、３４６、３５６、３６０、３７０、３８０、３８４、３９４、４０４、４０８、４１８、４２８、４３２、４４２、４５２、４５６、４６６、４７６、４８０、４９０、５００、５０４、５１４、５２４、５２８、５３８、５４８、５５２、５６２、５７２、５７６、５８６、５９６、６００、６１０、６２０、６２４、６３４、６４４、６４８、６５８、６６８、６７２、６８２、６９２、６９６、７０６、７１６、７２０、７３０、７４０および７４４のいずれか１つのアミノ酸配列、または１つもしくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲ内の１つもしくはそれ以上のアミノ酸がヒスチジン残基で置換された上記アミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。

特定の実施態様において、本発明は、ｐＨ依存性結合特性を示し、かつ重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対が配列番号：２／１０、１８／２０、２２／２４、２６／３４、４２／４４、４６／４８、５０／５８、６６／６８、７０／７２、７４／８２、９０／９２、９４／９６、９８／１０６、１１４／１１６、１１８／１２０、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、１６６／１６８、１７０／１７８、１８６／１８８、１９０／１９２、１９４／２０２、２１０／２１２、２１４／２１６、２１８／２２６、２３４／２３６、２３８／２４０、２４２／２５０、２５８／５６０、２６２／２６４、２６６／２７４、２８２／２８４、２８６／２８８、２９０／２９８、３０６／３０８、３１０／３１２、３１４／３２２、３３０／３３２、３３４／３３６、３３８／３４６、３５４／３５６、３５８／３６０、３６２／３７０、３７８／３８０、３８２／３８４、３８６／３９４、４０２／４０４、４０６／４０８、４１０／４１８、４２６／４２８、４３０／４３２、４３４／４４２、４５０／４５２、４５４／４５６、４５８／４６６、４７４／４７６、４７８／４８０、４８２／４９０、４９８／５００、５０２／５０４、５０６／５１４、５２２／５２４、５２６／５２８、５３０／５３８、５４６／５４８、５５０／５５２、５５４／５６２、５７０／５７２、５７４／５７６、５７８／５８６、５９４／５９６、５９８／６００、６０２／６１０、６１８／６２０、６２２／６２４、６２６／６３４、６４２／６４４、６４６／６４８、６５０／６５８、６６６／６６８、６７０／６７２、６７４／６８２、６９０／６９２、６９４／６９６、６９８／７０６、７１４／７１６、７１８／７２０、７２２／７３０、７３８／７４０および７４２／７４４のいずれか１つのアミノ酸配列対または１つもしくはそれ以上の重鎖ＣＤＲおよび／もしくは軽鎖ＣＤＲ内の１つもしくはそれ以上のアミノ酸がヒスチジン残基で置換された上記アミノ酸配列対のいずれかの変異体を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。

例えば、本発明は、「３００Ｎ」として引用された例示的な親抗ＰＣＳＫ９抗体の変異体（すなわち、配列番号：２１８／２２６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む抗体の変異体）を提供する。特に、本発明は、ｐＨ依存性結合特性を示し、かつ重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ここで、ＨＣＶＲが、配列番号：２１８またはＮ５２Ｈ、Ｑ５３Ｈ、Ｉ１００Ｈ、Ｖ１０１Ｈ、Ｖ１０４Ｈ、Ｄ１０６Ｈ、Ｍ１０７Ｈ、Ｄ１０８ＨおよびＹ１１２Ｈからなる群から選択される１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含む配列番号：２１８の変異体を含み；かつＬＣＶＲが、配列番号：２２６またはＬ２９Ｈ、Ｌ３０Ｈ、Ｎ３３Ｈ、Ｇ３４Ｈ、Ｙ３７Ｈ、Ｌ９７Ｈ、Ｔ９９ＨおよびＰ１００Ｈからなる群から選択される１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含む配列番号：２２６の変異体を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

例示的な一実施態様によれば、本発明は、ｐＨ依存性結合特性を示し、かつ重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ここで、ＨＣＶＲがＤ１０６Ｈアミノ酸置換を含む配列番号：２１８の変異体を含み、かつＬＣＶＲが配列番号：２２６を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。Ｄ１０６Ｈアミノ酸置換は、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）内に位置する。Ｄ１０６Ｈアミノ酸置換を含む変異体ＨＣＤＲ３は、本明細書の表３に説明するように、配列番号：７８８のアミノ酸配列によって表される。

別の例示的な実施態様によれば、本発明は、ｐＨ依存性結合特性を示し、かつ重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ここで、ＨＣＶＲが配列番号：２１８を含み、かつＬＣＶＲがＬ３０Ｈアミノ酸置換を含む配列番号：２２６の変異体を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。Ｌ３０Ｈアミノ酸置換は、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）内に位置する。Ｌ３０Ｈアミノ酸置換を含む変異体ＬＣＤＲ１は、本明細書の表３に説明するように、配列番号：８０２のアミノ酸配列によって表される。

別の例示的な実施態様によれば、本発明は、ｐＨ依存性結合特性を示し、かつ重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ここで、ＨＣＶＲがＤ１０６Ｈアミノ酸置換を含む配列番号：２１８の変異体を含み、かつＬＣＶＲがＬ３０Ｈアミノ酸置換を含む配列番号：２２６の変異体を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

特定の実施態様において、本発明は、ｐＨ依存性結合特性を示し、かつ３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ここで、ＨＣＤＲ１が配列番号：２２０（親）を含み；ＨＣＤＲ２が配列番号：２２２（親）、７７２（Ｎ５２Ｈ）および７７３（Ｑ５３Ｈ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３が配列番号：２２４（親）、７８２（Ｉ１００Ｈ）、７８３（Ｖ１０１Ｈ）、７８６（Ｖ１０４Ｈ）、７８８（Ｄ１０６Ｈ）、７８９（Ｍ１０７Ｈ）、７９０（Ｄ１０８Ｈ）および７９４（Ｙ１１２Ｈ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１が配列番号：２２８（親）、８０１（Ｌ２９Ｈ）、８０２（Ｌ３０Ｈ）、８０４（Ｎ３３Ｈ）、８０５（Ｇ３４Ｈ）および８０８（Ｙ３７Ｈ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２が配列番号：２３０（親）を含み；かつＬＣＤＲ３が配列番号：２３２（親）、８１５（Ｌ９７Ｈ）、８１７（Ｔ９９Ｈ）および８１８（Ｐ１００Ｈ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。

特定の実施態様によれば、本発明は、ｐＨ依存性結合特性を示し、かつ３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ここで、ＨＣＤＲ１が配列番号：２２０（親）を含み；ＨＣＤＲ２が配列番号：２２２（親）を含み；ＨＣＤＲ３が配列番号：２２４（親）または７８８（Ｄ１０６Ｈ）を含み；ＬＣＤＲ１が配列番号：２２８（親）または８０２（Ｌ３０Ｈ）を含み；ＬＣＤＲ２が配列番号：２３０（親）を含み；かつＬＣＤＲ３が配列番号：２３２（親）を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。

特定の実施態様によれば、本発明は、ｐＨ依存性結合特性を示し、かつ３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ここで、ＨＣＤＲ１が配列番号：２２０（親）を含み；ＨＣＤＲ２が配列番号：２２２（親）を含み；ＨＣＤＲ３が配列番号：７８８（Ｄ１０６Ｈ）を含み；ＬＣＤＲ１が配列番号：２２８（親）を含み；ＬＣＤＲ２が配列番号：２３０（親）を含み；かつＬＣＤＲ３が配列番号：２３２（親）を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。

本発明は、ｐＨ依存性結合特性を示し、かつ３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ここで、ＨＣＤＲ１が配列番号：２２０（親）を含み；ＨＣＤＲ２が配列番号：２２２（親）を含み；ＨＣＤＲ３が配列番号：２２４（親）を含み；ＬＣＤＲ１が配列番号：８０２（Ｌ３０Ｈ）を含み；ＬＣＤＲ２が配列番号：２３０（親）を含み；かつＬＣＤＲ３が配列番号：２３２（親）を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。

特定の実施態様によれば、本発明は、ｐＨ依存性結合特性を示し、かつ３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ここで、ＨＣＤＲ１が配列番号：２２０（親）を含み；ＨＣＤＲ２が配列番号：２２２（親）を含み；ＨＣＤＲ３が配列番号：７８８（Ｄ１０６Ｈ）を含み；ＬＣＤＲ１が配列番号：８０２（Ｌ３０Ｈ）を含み；ＬＣＤＲ２が配列番号：２３０（親）を含み；かつＬＣＤＲ３が配列番号：２３２（親）を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。

Ｆｃ変異体を含む抗ＰＣＳＫ９抗体
本発明の特定の実施態様によれば、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＦｃＲｎ受容体に対する抗体結合を増強または減弱させる、１つまたはそれ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む抗ＰＣＳＫ９抗体が提供される。例えば、本発明は、突然変異によって酸性環境中（例えば、ｐＨが約５．５から約６．０までの範囲にあるエンドソーム中）でＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性が高まる、ＦｃドメインのＣ_Ｈ２またはＣ_Ｈ３領域中に突然変異を含む抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。このようなＦｃ修飾の非限定的な例としては、例えば、位置２５０（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８（例えば、ＬまたはＦ）；２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４（例えば、ＳまたはＴ）および２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾；または位置４２８および／または４３３（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／または４３４（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）での修飾；または位置２５０および／または４２８での修飾；または位置３０７または３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４での修飾が含まれる。一実施態様において、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾；２５２、２５４および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ）修飾；２５０Ｑおよび４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。

本発明は、（１）中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する抗体の結合親和性を低下させる１つまたはそれ以上のヒスチジン置換を含む変異型ＣＤＲ配列と、（２）中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を高める１つまたはそれ以上の突然変異を含む変異型Ｆｃドメイン配列との両方を含む抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。本発明のこの態様によれば、本明細書に記載された（例えば、表３を参照のこと）、ヒスチジン置換された重鎖もしくは軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）またはＣＤＲのいずれか、および酸性ｐＨでより大きな親和性によってＦｃドメインにＦｃＲｎを結合させる上記の突然変異のいずれかを含むＦｃドメインを含む抗ＰＣＳＫ９抗体が作製されうる。例えば、本発明は、例えば、本明細書において「ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ」と呼ばれるヒスチジン変異型抗ＰＣＳＫ９抗体のＣＤＲアミノ酸配列ならびにＴ２５０Ｑ／Ｍ２４８Ｌ；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ；およびＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆからなる群から選択される１つまたはそれ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。また、本発明は、例えば、本明細書において「ＶＫ−Ｌ３０Ｈ」と呼ばれるヒスチジン変異型抗ＰＣＳＫ９抗体のＣＤＲアミノ酸配列、ならびにＴ２５０Ｑ／Ｍ２４８Ｌ；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ；およびＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆからなる群から選択される１つまたはそれ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。本明細書に記載されたＣＤＲヒスチジン置換突然変異およびＦｃドメイン突然変異のすべての可能な組合せは、本発明の範囲内に企図される。

抗体の生物学的特性
また、ｐＨ依存性結合特性を有することに加えて、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、１つまたはそれ以上のさらなる有益な生物学的性質を有してもよい。例えば、本発明は、ＰＣＳＫ９と低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）との間の相互作用を効果的に遮断する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。特定の実施態様において、本発明の抗体は、例えば、本明細書の実施例４に示すブロッキングＥＬＩＳＡ、または実質的に類似したアッセイフォーマットを用いて測定して、約１ｎＭ未満、例えば、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満または約１００ｐＭ未満のＩＣ_５０によって中性ｐＨでＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの間の相互作用を遮断する。

特定の実施態様において、本発明の抗体は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨでより強力にＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ相互作用を遮断することができる（例えば、酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対して低下した抗体結合を示す）。ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ相互作用を遮断する抗ＰＣＳＫ９抗体の能力は、例えば、中性および酸性ｐＨでのＩＣ_５０値によって定量的に表してもよい（例えば、本明細書の実施例４を参照のこと）。抗体が酸性ｐＨと比較して中性ｐＨでＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ相互作用を遮断する程度は、中性ｐＨで測定された抗体のＩＣ_５０値に対する酸性ｐＨで測定された抗体のＩＣ_５０値の比率によって表してもよい。このタイプのアッセイフォーマットにおける酸性／中性ＩＣ_５０比が高いほど、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ相互作用を遮断する能力が低くなることを示している。したがって、本発明は、実施例４のアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを用いて測定して、約１を超える、約５を超える、約１０を超える、約２０を超える、約３０を超える、約３２を超える、約３４を超える、約３６を超える、約３８を超える、約４０を超える、約５０を超える、約６０を超える、約７０を超える、約８０を超える、約９０を超える、約１００を超える、約１１０を超える、約１２０を超える、約１３０を超える、約１４０を超える、約１５０を超える、約１６０を超える、約１７０を超える、約１８０を超える、約１９０を超える、約２００を超える、約２１０を超える、約２２０を超える、約２３０を超える、またはそれ以上の酸性／中性ＩＣ_５０比によって抗体がＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ相互作用を遮断する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。特定の実施態様において、酸性／中性ＩＣ_５０比は、酸性ｐＨ６．０および中性ｐＨ７．４で、ならびに２５℃の温度で測定される。別の実施態様において、酸性／中性ＩＣ_５０比は、酸性ｐＨ５．７５および中性ｐＨ７．２で、ならびに２５℃の温度で測定される。

また、本発明は、抗体がＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９介在性阻害を遮断する、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。細胞ベースのＬＤＬ取り込みアッセイ、例えば本明細書の実施例５に示すものは、抗ＰＣＳＫ９抗体が、ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９介在性阻害を遮断できるかどうか、および／またはどの程度遮断できるかを明らかにするために用いることができる。特定の実施態様によれば、抗体が、例えば、本明細書の実施例５に示すin vitroでのＬＤＬ取り込みアッセイ、または実質的に類似したアッセイフォーマットを用いて測定して、約４０ｎＭ未満、約３５ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満または約１０ｎＭ未満のＩＣ_５０によってＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９介在性阻害を遮断できる、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体が提供される。

本発明の抗体は、上記の生物学的特性またはそのいずれかの組合せの１つまたはそれ以上を有してもよい。本発明の抗体の生物学的特性の前述のリストは、網羅的であることを意図しているわけではない。本明細書の実施例を含む本開示の概説から、本発明の抗体の他の生物学的特性は当業者に明らかである。

ｐＨ依存性結合特性を有する抗体を生成する方法
また、本発明は、ｐＨ依存性結合特性を有する抗体を生成する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、少なくとも中程度のｐＨ依存性結合特性を示す抗体についてスクリーニングし、次いで、このような抗体を、その抗原に対する抗体のｐＨ依存性を増強するさらなる突然変異誘発にかけることを含む。スクリーニングステップは、それによって中程度のｐＨ依存性結合特性を有する抗体が、特定の抗原に特異的な抗体の集団内に特定される任意の方法または過程を含んでもよい。特定の実施態様において、最初の抗体集団は、動物を免疫化することによって、または興味の特定の抗原を特異的に結合する抗体についてファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。このような抗体は、特定の実施態様において、完全にヒト抗体、例えば、完全にヒト組換え抗体であってもよい。特定の実施態様において、スクリーニングステップは、酸性ｐＨおよび中性ｐＨの両方で最初の抗体集団内のそれぞれの抗体の１つまたはそれ以上の結合パラメータ（例えば、Ｋ_Ｄまたはｔ１／２）を測定することを含む。抗体の結合パラメータは、例えば、表面プラズモン共鳴、または特定の抗原に対する抗体の結合特性の定量的もしくは定性的評価を可能にする他のなんらかの分析方法を用いて測定してもよい。本発明のこの態様の特定の実施態様によれば、スクリーニングステップは、約３．０を超えるが約８．０未満の酸性／中性Ｋ_Ｄ比によって抗原を結合する抗体を特定することを含む。あるいは、スクリーニングステップは、約１．０未満であるが０．１５を超える酸性／中性ｔ１／２比によって抗原を結合する抗体を特定することを含んでもよい。さらに他の実施態様において、スクリーニングステップは、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）で４０分未満であるが２０分を超えない（例えば、２５℃で）ｔ１／２を示す抗体を特定することを含んでもよい。本発明のこの態様の特定の実施態様によれば、酸性／中性Ｋ_Ｄ比および／または酸性／中性ｔ１／２比は、酸性ｐＨ６．０および中性ｐＨ７．４で、ならびに２５℃の温度で測定した。別の実施態様によれば、酸性／中性Ｋ_Ｄ比および／または酸性／中性ｔ１／２比は、酸性ｐＨ５．７５および中性ｐＨ７．２で、ならびに２５℃の温度で測定した。

一旦、中程度のｐＨ依存性結合特性を有する抗体が特定されたら、こうして特定された抗体を、次いで、抗原に対する抗体のｐＨ依存性結合を増強するための突然変異誘発にかける。「増強されたｐＨ依存性結合」は、抗体の突然変異バージョンが突然変異誘発前の抗体の元の「親」（すなわち、中程度のｐＨ依存性）バージョンよりも、より大きな酸性／中性Ｋ_Ｄ比、またはより小さな酸性／中性ｔ１／２比を示すことを意味する。特定の実施態様において、「増強されたｐＨ依存性結合」は、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）でその抗原に結合する抗体のｔ１／２が、突然変異誘発前の抗体のｔ１／２より短いことを意味する。特定の実施態様において、「増強されたｐＨ依存性結合」は、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）でその抗原に結合する抗体のｔ１／２が、約１６分未満、約１０分未満、約５分未満、約２分未満または約１．５分未満（例えば、２５℃で）であることを意味する。

本発明のこの態様によれば、突然変異誘発ステップは、抗体の重鎖および／または軽鎖内にアミノ酸の欠失、置換または付加を含んでもよい。特定の実施態様によれば、突然変異誘発は、抗体の１つまたはそれ以上の可変ドメイン内で、例えば、１つまたはそれ以上のＣＤＲ内で実施される。例えば、突然変異誘発は、抗体の１つまたはそれ以上のＣＤＲ内のアミノ酸を別のアミノ酸で置換することを含んでもよい。特定の実施態様において、突然変異誘発は、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ中で１つまたはそれ以上のアミノ酸をヒスチジンで置換することを含む。

本明細書に記載された実施例において、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体（例えば、完全なヒト抗ＰＣＳＫ９抗体）は、上記のようなスクリーニング／突然変異誘発方法論を用いて生成された。しかし、本発明のこの態様による方法は、ｐＨ依存性特性が有用であるか、または望ましい任意の抗原を結合する、ｐＨ依存性結合特性を有する抗体を生成するために用いることができる。本発明のこの態様による方法は、対象または患者に投与したとき、延長された血清半減期を有する抗体を生成するために用いることができる。

ｐＨ依存性抗体を作るための「二重ヒスチジン」（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）突然変異誘発
本明細書に記載された特定の実験に基づいて、予想外なことに、ＣＤＲ中の天然のヒスチジン残基に隣接して（例えば、そこからすぐ上流または下流に）位置する残基で、抗体のＣＤＲにヒスチジン置換を導入し、それによって、Ｈｉｓ−Ｈｉｓアミノ酸配列を産生することによって、中程度のｐＨ依存性結合特性を有する抗体をより顕著なｐＨ依存性結合特性を有する抗体に変換できることが発見された。本明細書に用いるように、「より顕著なｐＨ依存性結合特性」は、抗体が、ヒスチジン置換の導入後、ヒスチジン置換の導入前の抗体よりも（ａ）より大きな酸性／中性Ｋ_Ｄ比；（ｂ）より大きな酸性／中性ｋ_ｄ比；および／または（ｃ）より小さな酸性／中性ｔ１／２比の１つまたはそれ以上を示すことを意味する。例えば、本明細書において３００Ｎとして引用された抗体は、中程度のｐＨ依存性結合特性を有し、ＬＣＤＲ１（配列番号：２２８を参照のこと）の５番目のアミノ酸位置で１つの天然ヒスチジンを含む。ＬＣＤＲ１の４番目のアミノ酸位置にヒスチジン置換を導入することによって（配列番号：８０２を有するＬＣＤＲ１を含む「ＶＫ−Ｌ３０Ｈ」抗体が得られ）、得られた抗体は、本明細書の実施例３Ａおよび３Ｂに示すように、３００Ｎよりも非常に顕著なｐＨ依存性結合特性を有することが見いだされた。この「二重Ｈｉｓ」突然変異の戦略は、顕著なｐＨ依存性結合特性を有する抗体を産生するための一般に適用できる方法論であってもよい。したがって、本発明は、中程度のｐＨ依存性結合特性を有する抗体を選択し、既存のヒスチジン残基に隣接したアミノ酸位置で抗体の１つまたはそれ以上のＣＤＲ中にヒスチジン置換を導入し、それによって、より顕著なｐＨ依存性結合特性を有する（例えば、ヒスチジン置換の導入前の親抗体より大きな酸性／中性Ｋ_Ｄ比を有する）抗体を生成することを含む、抗体のｐＨ依存性を増強する方法を含む。また、この方法論は、例えば、１つまたはそれ以上のＣＤＲ内の隣接するアミノ酸位置で２つまたはそれ以上のヒスチジン置換を導入することによって、通常、ＣＤＲ中になんらヒスチジン残基がない抗体に適用することができる。

エピトープマッピングおよび関連技術
本発明は、ＰＣＳＫ９（配列番号：７５５のアミノ酸１〜１５２）のプロドメイン内に見いだされる１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。また、本発明は、ＰＣＳＫ９（配列番号：７５５のアミノ酸１５３〜４２５）の触媒ドメイン内に見いだされる１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。また、本発明は、ＰＣＳＫ９（配列番号：７５５のアミノ酸４２６〜６９２）のＣ末端ドメイン内に見いだされる１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。特定の例において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、ＰＣＳＫ９の２つの隣接するドメイン内に位置するアミノ酸と相互作用する。抗体が結合するエピトープは、ＰＣＳＫ９の１つまたはそれ以上のドメイン内に位置する３つまたはそれ以上の（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の）アミノ酸の単一の連続した配列からなってもよい。代わりに、エピトープは、ＰＣＳＫ９の１つまたはそれ以上のドメイン内に位置する複数の非連続アミノ酸（または、アミノ酸配列）からなってもよい。

抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうか明らかにするために当業者に知られている種々の技術を用いることができる。例示的な技術としては、例えば、Antibodies, Harlow and Lane（Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY）に記載されたような常用の交叉ブロッキングアッセイ（cross-blocking assay）、アラニンスキャニング突然変異解析（alanine scanning mutational analysis）、ペプチドブロット解析（peptide blots analysis）（Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463）、およびペプチド切断解析（peptide cleavage analysis）が含まれる。さらに、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出および化学修飾のような方法を用いることができる（Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定するのに用いることができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的には、水素／重水素交換法は、興味のタンパク質を重水素標識し、続いて抗体を重水素標識タンパク質に結合することを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体によって保護された残基（それは重水素標識されたままである）を除くすべての残基で水素−重水素交換を起こさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析にかけ、それによって、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265Aを参照のこと。

さらに、本発明は、本明細書に記載された特定の例示的な抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書の表３に記載されたヒスチジン置換変異型抗体のいずれか（例えば、ＶＨ−Ｇ２６Ｈ、ＶＨ−Ｆ２７Ｈ、ＶＨ−Ｔ２８Ｈ、ＶＨ−Ｆ２９Ｈ、ＶＨ−Ｓ３０Ｈ、ＶＨ−Ｓ３１Ｈ、ＶＨ−Ｗ３３Ｈ、ＶＨ−Ｉ５１Ｈ、ＶＨ−Ｎ５２Ｈ、ＶＨ−Ｑ５３Ｈ、ＶＨ−Ｄ５４Ｈ、ＶＨ−Ｇ５５Ｈ、ＶＨ−Ｓ５６Ｈ、ＶＨ−Ｅ５７Ｈ、ＶＨ−Ｋ５８Ｈ、ＶＨ−Ａ９７、ＶＨ−Ｒ９８Ｈ、ＶＨ−Ｄ９９Ｈ、ＶＨ−Ｉ１００Ｈ、ＶＨ−Ｖ１０１Ｈ、ＶＨ−Ｌ１０２Ｈ、ＶＨ−Ｍ１０３Ｈ、ＶＨ−Ｖ１０４Ｈ、ＶＨ−Ｙ１０５Ｈ、ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ、ＶＨ−Ｍ１０７Ｈ、ＶＨ−Ｄ１０８Ｈ、ＶＨ−Ｙ１０９Ｈ、ＶＨ−Ｙ１１０Ｈ、ＶＨ−Ｙ１１１Ｈ、ＶＨ−Ｙ１１２Ｈ、ＶＨ−Ｇ１１３Ｈ、ＶＨ−Ｍ１１４Ｈ、ＶＨ−Ｄ１１５Ｈ、ＶＨ−Ｖ１１６Ｈ、ＶＫ−Ｑ２７Ｈ、ＶＫ−Ｓ２８Ｈ、ＶＫ−Ｌ２９Ｈ、ＶＫ−Ｌ３０Ｈ、ＶＫ−Ｓ３２Ｈ、ＶＫ−Ｎ３３Ｈ、ＶＫ−Ｇ３４Ｈ、ＶＫ−Ｎ３５Ｈ、ＶＫ−Ｎ３６Ｈ、ＶＫ−Ｙ３７Ｈ、ＶＫ−Ｌ５５Ｈ、ＶＫ−Ｇ５６Ｈ、ＶＫ−Ｓ５７Ｈ、ＶＫ−Ｍ９４Ｈ、ＶＫ−Ｑ９５Ｈ、ＶＫ−Ｔ９６Ｈ、ＶＫ−Ｌ９７Ｈ、ＶＫ−Ｑ９８Ｈ、ＶＫ−Ｔ９９Ｈ、ＶＫ−Ｐ１００Ｈ、ＶＫ−Ｌ１０１Ｈ、ＶＫ−Ｔ１０２Ｈ）と同じエピトープに結合する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。同様に、また、本発明は、本明細書の表３に記載されたヒスチジン置換変異型抗体のいずれか（例えば、ＶＨ−Ｇ２６Ｈ、ＶＨ−Ｆ２７Ｈ、ＶＨ−Ｔ２８Ｈ、ＶＨ−Ｆ２９Ｈ、ＶＨ−Ｓ３０Ｈ、ＶＨ−Ｓ３１Ｈ、ＶＨ−Ｗ３３Ｈ、ＶＨ−Ｉ５１Ｈ、ＶＨ−Ｎ５２Ｈ、ＶＨ−Ｑ５３Ｈ、ＶＨ−Ｄ５４Ｈ、ＶＨ−Ｇ５５Ｈ、ＶＨ−Ｓ５６Ｈ、ＶＨ−Ｅ５７Ｈ、ＶＨ−Ｋ５８Ｈ、ＶＨ−Ａ９７、ＶＨ−Ｒ９８Ｈ、ＶＨ−Ｄ９９Ｈ、ＶＨ−Ｉ１００Ｈ、ＶＨ−Ｖ１０１Ｈ、ＶＨ−Ｌ１０２Ｈ、ＶＨ−Ｍ１０３Ｈ、ＶＨ−Ｖ１０４Ｈ、ＶＨ−Ｙ１０５Ｈ、ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ、ＶＨ−Ｍ１０７Ｈ、ＶＨ−Ｄ１０８Ｈ、ＶＨ−Ｙ１０９Ｈ、ＶＨ−Ｙ１１０Ｈ、ＶＨ−Ｙ１１１Ｈ、ＶＨ−Ｙ１１２Ｈ、ＶＨ−Ｇ１１３Ｈ、ＶＨ−Ｍ１１４Ｈ、ＶＨ−Ｄ１１５Ｈ、ＶＨ−Ｖ１１６Ｈ、ＶＫ−Ｑ２７Ｈ、ＶＫ−Ｓ２８Ｈ、ＶＫ−Ｌ２９Ｈ、ＶＫ−Ｌ３０Ｈ、ＶＫ−Ｓ３２Ｈ、ＶＫ−Ｎ３３Ｈ、ＶＫ−Ｇ３４Ｈ、ＶＫ−Ｎ３５Ｈ、ＶＫ−Ｎ３６Ｈ、ＶＫ−Ｙ３７Ｈ、ＶＫ−Ｌ５５Ｈ、ＶＫ−Ｇ５６Ｈ、ＶＫ−Ｓ５７Ｈ、ＶＫ−Ｍ９４Ｈ、ＶＫ−Ｑ９５Ｈ、ＶＫ−Ｔ９６Ｈ、ＶＫ−Ｌ９７Ｈ、ＶＫ−Ｑ９８Ｈ、ＶＫ−Ｔ９９Ｈ、ＶＫ−Ｐ１００Ｈ、ＶＫ−Ｌ１０１Ｈ、ＶＫ−Ｔ１０２Ｈ）によってＰＣＳＫ９に対する結合と競合する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。

抗体が、参照抗ＰＣＳＫ９抗体と同じエピトープに結合するどうか、またはそれとの結合に競合するかどうかは、当分野で知られている常用の方法を用いて容易に明らかにすることができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ＰＣＳＫ９抗体と同じエピトープに結合するかどうかを明らかにするためには、参照抗体をＰＣＳＫ９タンパク質に結合させる。次に、ＰＣＳＫ９分子に結合する試験抗体の能力を評価する。参照抗ＰＣＳＫ９抗体と飽和結合後に、試験抗体がＰＣＳＫ９に結合できる場合、試験抗体が参照抗ＰＣＳＫ９抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方、試験抗体がＰＣＳＫ９分子に結合できない場合、参照抗ＰＣＳＫ９抗体と飽和結合後に、試験抗体は、本発明の参照抗ＰＣＳＫ９抗体によって結合されたエピトープと同じエピトープに結合しうる。次いで、試験抗体の結合が観察されなかったことが、実際に参照抗体と同じエピトープへの結合によるものかどうか、または結合が観察されなかった原因が立体障害（または、別の現象）であるかどうかを確かめるため、さらなる常用実験（例えば、ペプチド突然変異および結合解析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリーまたは当分野で利用できる他のいずれかの定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを用いて実施することができる。本発明の特定の実施態様によれば、競合的結合アッセイで測定して、例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰な一方の抗体が、他方の結合を少なくとも５０％、しかし、好ましくは７５％、９０％または９９％も阻害する場合、２つの抗体は同じ（または、オーバーラップ）エピトープに結合する（例えば、Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502を参照のこと）。あるいは、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸突然変異が、他方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合すると考えられる。一方の抗体の結合を低減または排除するアミノ酸突然変異のサブセットが他方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は「オーバーラップエピトープ」を有すると考えられる。

抗体が結合について参照抗ＰＣＳＫ９抗体と競合するかどうかを明らかにするため、上記の結合方法論は、２つの方向性で実施される：第１の方向性では、参照抗体を飽和条件下でＰＣＳＫ９分子に結合させ、続いてＰＣＳＫ９分子に対する試験抗体の結合を評価する。第２の方向性では、試験抗体を、飽和条件下でＰＣＳＫ９分子に結合させ、続いてＰＣＳＫ９分子に対する参照抗体の結合を評価する。いずれの方向性でも、最初の（飽和）抗体しかＰＣＳＫ９分子に結合することができない場合、試験抗体および参照抗体は、ＰＣＳＫ９に対する結合について競合すると結論付けられる。当業者によって理解されるように、参照抗体との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しなくてもよいが、オーバーラップまたは隣接するエピトープを結合することによって参照抗体の結合を立体的に阻止することがありうる。

ヒト抗体の調製
完全なヒトモノクローナル抗体を含む、モノクローナル抗体を生成する方法は、当分野で知られている。ヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合する組換えヒト抗体を含む抗体を作製する本発明の文脈では、このようないずれかの知られている方法を用いることができる。その時、このような抗体は、ヒスチジン置換変異型抗体（例えば、ｐＨ依存性結合性質を示すヒスチジン置換変異型抗体）が誘導されうる親抗体として用いることができる。

ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術またはモノクローナル抗体を生成する他のいずれかの知られている方法を用いて、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、ＰＣＳＫ９に対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。抗体を特徴づけて、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特性について選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域、例えば野生型または修飾されたＩｇＧ１またはＩｇＧ４で置換して完全なヒト抗体を生成する。選択される定常領域は具体的な使用に応じて変化しうるが、高親和性抗原結合性および標的特異性の特性は、可変領域に存在する。

生物学的同等物
また、本明細書に具体的に例示されたヒスチジン置換に加えて、本発明は、記載された抗体のものとは異なるが、ｐＨ依存性結合特性を有するヒトＰＣＳＫ９を結合する能力を保持するアミノ酸配列を有する抗体を包含する。このような変異型抗体および抗体フラグメントは、親配列と比較したときにアミノ酸の１つまたはそれ以上の付加、欠失または置換を含むが、記載された抗体のものと本質的に同等の生物活性を示す。同様に、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較したときに、ヌクレオチドの１つまたはそれ以上の付加、欠失または置換を含むが、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗体フラグメントと本質的に生物学的に同等である抗ＰＣＳＫ９抗体または抗体フラグメントをコードする配列を包含する。

２つの抗原結合性タンパク質または抗体を、例えば、類似の実験条件下、単回投与または多回投与のいずれかで同じモル用量で投与したときに、それらが吸収の速度および程度が有意差を示さない薬学的同等物または薬学的代替物である場合、それらは生物学的に同等であるとみなされる。いくつかの抗体は、それらが吸収の程度において同等であるが、吸収速度においては異なっていても、このような吸収速度における違いが意図的であり、表示に示されており、例えば、慢性使用において、有効な体内薬物濃度の達成に必須でなく、研究した特定の薬物生成物にとって医学的に重要でないと考えられるため、生物学的に同等であるとみなされうる場合、依然として、同等物または薬学的代替物とみなされることになる。

一実施態様において、２つの抗原結合性タンパク質は、それらの安全性、純度および効力において臨床的に意味のある差がない場合、生物学的に同等である。

一実施態様において、スイッチングのない継続治療と比較して、免疫原性における臨床的に有意な変化を含む、有害作用のリスクにおいて予想される増加なしに、または有効性の低下なしに、患者が参照生成物と生物学的生成物との間で１回またはそれ以上切り替えることができる場合、２つの抗原結合性タンパク質は生物学的に同等である。

一実施態様において、２つの抗原結合性タンパク質がいずれかも、１つまたは複数の使用条件について共通の機構または作用機構によって、このような機構が知られている程度まで作用する場合、これらは生物学的に同等である。

生物学的同等性は、in vivoおよびin vitro法によって示してもよい。生物学的同等性の測定手段としては、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度を、血液、血漿、血清または他の生物学的液体中で時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるin vivo検査；（ｂ）ヒトin vivo生物学的利用能データと関連づけられており、適度な予測となるin vitro試験；（ｃ）抗体（または、その標的）の適当な急性薬理学的作用を時間の関数として測定するヒトまたは他の哺乳動物におけるin vivo試験；および（ｄ）抗体の安全性、有効性、または生物学的利用能もしくは生物学的同等性を確立する管理良好の臨床試験が含まれる。

本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の生物学的に同等な変異体は、例えば、残基または配列の種々の置換を行うか、または生物活性に必要でない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失させることによって作製してもよい。例えば、再生により不必要なまたは間違った分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために生物活性に必須でないシステイン残基を欠失させるか、または他のアミノ酸で置換することができる。他の文脈において、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特性を変更するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する突然変異を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体変異体を含んでもよい。

種選択性および種交差反応性
本発明の特定の実施態様によれば、抗ＰＣＳＫ９抗体はヒトＰＣＳＫ９に結合するが、他の種からのＰＣＳＫ９には結合しない。また、本発明は、ヒトＰＣＳＫ９および１つまたはそれ以上の非ヒト種からのＰＣＳＫ９に結合する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。例えば、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、ヒトＰＣＳＫ９に結合し、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのＰＣＳＫ９の１つまたはそれ以上に結合してもよく、または結合しなくてもよい。

多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であってもよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的でもあってよいし、または複数の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合性ドメインを含んでもよい。例えば、Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244を参照のこと。本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、他の機能性分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質に結合するか、またはそれと共発現することができる。例えば、抗体またはそのフラグメントは、１つまたはそれ以上の他の分子単位、例えば他の抗体または抗体フラグメントに（例えば、化学カップリング、遺伝的融合、非共有結合またはその他によって）機能的に結合して第２の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を産生することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの１つのアームが、ヒトＰＣＳＫ９またはそのフラグメントに特異的であり、かつ免疫グロブリンの他のアームが第２の治療標的に特異的であるか、または治療部分に結合される、二重特異性抗体を含む。

本発明の文脈において用いることができる例示的な二重特異性抗体フォーマットとしては、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｃ_Ｈ３ドメインおよび第２のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインの使用を含み、ここで、第１および第２のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸によって互いに異なり、アミノ酸の違いがない二重特異性抗体と比較して少なくとも１つのアミノ酸の違いが、プロテインＡに対する二重特異性抗体の結合を低下させる。一実施態様において、第１のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエキソンナンバリングによって；ＥＵナンバリングによってＨ４３５Ｒ）のようなプロテインＡ結合を低下させるか、または消失させる突然変異を含む。第２のＣ_Ｈ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによって；ＥＵによってＹ４３６Ｆ）をさらに含んでもよい。第２のＣ_Ｈ３内に見いだされうるさらなる修飾としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７ＭおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによって；ＥＵによってＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２ＮおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによってＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２ＮおよびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９ＱおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによって；ＥＵによってＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９ＱおよびＶ４２２Ｉ）が含まれる。上記の二重特異性抗体フォーマットにおける変化は、本発明の範囲内に企図される。

治療製剤および投与
本発明は、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適した担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、結合剤、滑沢剤、滑剤、崩壊剤、吸着剤、防腐剤および改善された導入、送達、耐性などをもたらす他の薬剤を用いて製剤化される。多くの適当な製剤は、すべて薬剤師に知られている処方集：レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Remington's Pharmaceutical Sciences）、マック・パブリシング・カンパニー（Mack Publishing Company）、イーストン（Easton）、ＰＡに見いだすことができる。これらの製剤には、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ゼリー、ロウ、オイル、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（例えばリポフェクチン（商標）（LIPOFECTIN^TM）、ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）、カールズバッド（Carlsbad）、ＣＡ）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト剤、水中油型および油中水型乳剤、乳剤カーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。また、Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311を参照のこと。

患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢および体格、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変化してもよい。好ましい用量は、典型的に体重または体表面積に応じて計算する。抗ＰＣＳＫ９抗体を投与するための有効用量およびスケジュールは、経験的に決定してもよい。例えば、患者の経過は、定期的な評価］よってモニターし、それに応じて用量を調整することができる。さらに、用量の種間スケーリングは、当分野でよく知られた方法を用いて実施することができる（例えば、Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351）。

種々の送達システム、例えば、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、突然変異ウイルスを発現できる組換え細胞、受容体介在性エンドサイトーシスが知られており、本発明の医薬組成物を投与するために用いることができる（例えば、Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照のこと）。導入の方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が含まれるが、それらに限定されるわけではない。組成物は、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜、など）を通した吸収によっていずれかの都合のよい経路によって投与してもよく、他の生物活性剤と共に投与してもよい。投与は全身または局所であることができる。

本発明の医薬組成物は、標準の針およびシリンジで皮下または静脈内に送達することができる。さらに、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の医薬組成物の送達における用途を容易に有する。このようなペン型送達デバイスは再使用可能または使い捨てであることができる。再使用可能なペン型送達デバイスは、一般に医薬組成物を含む交換可能なカートリッジを用いる。一旦、カートリッジ内のすべての医薬組成物を投与し、カートリッジが空になったら、空のカートリッジを容易に廃棄して、医薬組成物を含む新たなカートリッジと交換することができる。次いで、ペン型送達デバイスを再使用することができる。使い捨てのペン型送達デバイスには、交換可能なカートリッジがない。つまり、使い捨てのペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバー中に保持された医薬組成物で予め充填されることになる。一旦、リザーバーから医薬組成物が空になったら、デバイス全体を廃棄する。

多くの再使用可能なペンおよび自己注射器送達デバイスは、本発明の医薬組成物の皮下送達における用途を有する。ほんの少し例を挙げれば、例としては、オートペン（商標）（AUTOPEN^TM）（オーウェンマンフォード社（Owen Mumford, Inc.）、ウッドストック、英国）、ディセトロニック（商標）ペン（DISETRONIC^TMpen）（ディセトロニックメディカルシステムズ（Disetronic Medical Systems）、ベルグドルフ、スイス）、ヒューマログミックス７５／２５（商標）ペン（HUMALOG MIX 75/25^TM pen）ヒューマログ（商標）ペン（HUMALOG^TMpen）ヒューマリン７０／３０（商標）ペン（HUMALIN 70/30^TM pen）（イーライリリー社（Eli Lilly and Co.）、インディアナポリス、ＩＮ）、ノボペン（商標）（NOVOPEN^TM）I、ＩＩおよびＩＩＩ（ノボノルディスク（Novo Nordisk）、コペンハーゲン、デンマーク）、ノボペンジュニア（商標）（NOVOPEN JUNIOR^TM）（ノボノルディスク（Novo Nordisk）、コペンハーゲン、デンマーク）、ＢＤ（商標）ペン（ベクトンディキンソン（Becton Dickinson）、フランクリンレイクス、ＮＪ）、オプティペン（商標）（OPTIPEN^TM）、オプティペンプロ（商標）（OPTIPEN PRO^TM）、オプティペンスターレット（商標）（OPTIPEN STARLET^TM）およびオプティクリック（商標）（OPTICLIK^TM）（サノフィ・アベンティス（sanofi-aventis）、フランクフルト、ドイツ）、が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本発明の医薬組成物の皮下送達に用途を有する使い捨てのペン型送達デバイスの例としては、ほんの少し例を挙げれば、ソロスター（商標）ペン（SOLOSTAR^TMpen）（サノフィ・アヴェンティス（sanofi-aventis））、フレックスペン（商標）（FLEXPEN^TM）（ノボノルディスク（Novo Nordisk））、およびクイックペン（商標）（KWIKPEN^TM）（イーライリリー（Eli Lilly））、シュアクリック（商標）自己注射器（SURECLICK^TMAutoinjector）（アムジェン（Amgen）、サウザンドオークス、ＣＡ）、ペンレット（商標）（PENLET^TM）（商標）（ハーゼルマイヤー（Haselmeier）、シュツットガルト、ドイツ）、エピペン（EPIPEN）（デイ（Dey）、Ｌ．Ｐ．）、およびヒュミラ（商標）ペン（HUMIRA^TMPen）（アボットラボラトリーズ（Abbott Labs）、アボットパークＩＬ）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

特定の状況において、医薬組成物は、放出制御システムで送達することができる。一実施態様において、ポンプを使用してもよい（Langer, 前出；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201を参照のこと）。別の実施態様では、ポリマー物質を使用できる；Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (編), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Floridaを参照のこと。さらに別の実施態様において、放出制御システムは、組成物の標的の近くに配置することができ、そのため、全身用量の一部しか必要ではない（例えば、Goodson, 1984, Medical Applications of Controlled Release, 前出, 第2巻, 第115-138頁中を参照する）。他の放出制御システムは、Langer, 1990, Science 249:1527-1533による総説において議論される。

注射用製剤は、静脈内、皮下、皮内および筋肉注射、点滴注入などのための剤形を含んでもよい。これらの注射用製剤は、公知の方法によって製造してもよい。例えば、注射用製剤は、例えば、上記の抗体またはその塩を、注射に慣用的に用いられる滅菌水性媒体または油性媒体中に溶解、懸濁または乳化することによって製造してもよい。注射用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖および他の補助剤を含有する等張性溶液などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などのような適当な可溶化剤と組み合わせて用いてもよい。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などがあり、これらは、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどのような可溶化剤と組み合わせて用いてもよい。したがって、製造された注射剤は、適当なアンプル中に充填されることが好ましい。

好都合なことに、上記の経口または非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に合わせて適した単位用量の剤形に製造される。このような単位用量の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが含まれる。前述の抗体の含有量は、一般に、単位用量中の剤形当たり約５〜約５００ｍｇである。特に注射剤の形態では、前述の抗体は、約５〜約１００ｍｇ、他の剤形については約１０〜約２５０ｍｇで含まれることが好ましい。

抗体の治療的使用
本発明は、薬剤に使用するための、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む、抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明は、それを必要とする対象に、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む治療組成物（例えば、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体）を投与することを含む方法を含む。治療組成物は、本明細書に開示された抗ＰＣＳＫ９抗体のいずれかまたはそのフラグメントを含むことができる。本明細書に用いるように、「それを必要とする対象」という表現は、高コレステロール血症の１つもしくはそれ以上の症状もしくは徴候を示す、または高コレステロール血症と診断された、または、そうでなければ、総血清コレステロール、ＬＤＬ、トリグリセリドもしくはＶＬＤＬの低下から利益を得られるであろう、もしくはＨＤＬの上昇から利益を得られるであろうヒトまたは非ヒト動物を意味する。また、本発明は、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体（例えば、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体）を投与することによってリポタンパク質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］レベルを低下させる方法を含む。

いくつかの場合、本発明の治療製剤で治療される患者は、コレステロール、脂質、トリグリセリドまたはリポタンパク質の上昇したレベルを示すことを除いて、それ以外は健常である。例えば、患者は、治療時に心血管性、血栓性または他の疾患または障害の他のいずれかのリスクファクターを示さなくてもよい。しかし、他の例において、患者は、血清コレステロール、脂質、トリグリセリドまたはリポタンパク質の上昇と相関するか、またはこれらに付随して生じる疾患または障害を有するか、またはそれらを発症するリスクがあると診断されたことに基づいて選択する。例えば、本発明の医薬組成物の投与時に、またはその前に、患者は、例えば、冠動脈疾患、急性心筋梗塞、無症候性頸動脈アテローム性動脈硬化、脳卒中、末梢動脈閉塞性疾患などのような心血管疾患または障害を有すると診断されるか、または発症するリスクがあると確定されてもよい。心血管疾患または障害は、いくつかの場合、高コレステロール血症である。例えば、患者が例えばヘテロ接合性家族性高コレステロール血症（ｈｅＦＨ）、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ｈｏＦＨ）、および家族性高コレステロール血症（ｎｏｎＦＨ）とは異なる高コレステロール血症の発生といったような高コレステロール血症状態を有すると診断されたか、またはそれらを発症するリスクがあると確定された場合、この患者は本発明の医薬組成物を用いた治療に対して選択されうる。

他の場合、本発明の医薬組成物の投与時に、またはその前に、患者は、血栓性閉塞性疾患または障害（例えば、例えば肺塞栓症、網膜中心静脈閉塞、など）を有すると診断されるか、またはそれらを発症するリスクがあると確定されてもよい。特定の実施態様において、患者は、上記の疾患または障害の２つまたはそれ以上の組合せを有するか、またはそれらを発症するリスクがあると診断されたことに基づいて選択される。例えば、本発明の医薬組成物の投与時に、またはその前に、患者は、冠動脈疾患および肺塞栓症を有すると診断されるか、または発症するリスクがあると確定されてもよい。また、他の診断上の組合せ（例えば、アテローム性動脈硬化および網膜中心静脈閉塞、ｈｅＦＨおよび脳卒中、など）も、本発明の医薬組成物を用いて治療可能な患者集団の定義に含まれる。

また、本発明の医薬組成物は、代謝性症候群、真性糖尿病、甲状腺機能低下症、ネフローゼ症候群、腎不全、クッシング症候群、胆汁性肝硬変、糖原病、肝細胞癌、胆汁うっ滞、成長ホルモン欠乏症からなる群から選択される基礎疾患もしくは障害によって生じるか、またはそれらに関連する高コレステロール血症または脂質異常症の治療にも有用である。また、本発明の医薬組成物は、エストロゲン療法、プロゲステロン療法、ベータ遮断薬もしくは利尿薬のような以前の治療法によって生じた、またはそれらに関連する高コレステロール血症または脂質異常症の治療にも有用である。

さらに他の場合、本発明の医薬組成物で治療される患者は、年齢（例えば、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０歳より高齢）、人種、性別（男性または女性）、運動習慣（例えば、定期的に運動する人、運動しない人）、他の既存の医学的状態（例えば、ＩＩ型糖尿病、高血圧、など）、および現在の投薬状態（例えば、スタチン［例えば、セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、など］、ベータ遮断剤、ナイアシン、などを現在使用中である）からなる群から選択される１つまたはそれ以上の因子に基づいて選択される。本発明は、本発明の医薬組成物（例えば、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＫＳ９抗体を含む組成物）を、スタチン不耐性、スタチンアレルギー性である患者または従来のスタチン療法に対する反応が不完全または不十分である患者に投与することを含む方法を含む。潜在的患者は、本発明の方法で治療する前に、これらの因子の１つまたはそれ以上に基づいて（例えば、質問表、診断上の評価、などによって）選択／スクリーニングすることができる。

また、本発明は、対象にＰＣＳＫ９阻害剤を投与することによって対象における経腸コレステロール排泄（ＴＩＣＥ）を高める方法を含む。例えば、本発明は、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体を対象に投与することによって対象におけるＴＩＣＥを高める方法を提供する。特定の実施態様によれば、本発明は、ＴＩＣＥの増強が有益となるであろう対象を特定するか、またはＴＩＣＥ不全を示す対象を特定し、対象にＰＣＳＫ９阻害剤を投与することを含む方法を含む。

スタチンが、患者のＰＣＳＫ９レベルを上方制御するということは知られている（例えば、Dubuc et al., Aug. 2004, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24:1454-1459を参照のこと）。従来の抗ＰＣＳＫ９治療剤を受けるスタチン治療患者は、スタチン療法を受けていない患者よりも速い血清からの抗ＰＣＳＫ９クリアランスを示す。理論に拘束されるわけではないが、スタチン使用患者における上昇したＰＣＳＫ９レベルは、標的介在性クリアランス（target-mediate clearance）の過程を通して抗ＰＣＳＫ９抗体のより迅速な排泄を招いているかもしれないと提案されている。したがって、スタチン使用中の患者は、最適なコレステロール低下を達成するために従来の抗ＰＣＳＫ９治療剤（例えば、抗ＰＣＳＫ９抗体）の用量を高め、かつ／または投与頻度を増やす必要がありうる。本明細書に用いるように、「従来の抗ＰＣＳＫ９治療剤」という用語は、ｐＨ依存性結合特性を示さないあらゆるＰＣＳＫ９結合分子、すなわち、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合を示さない分子を意味する。本発明者らは、スタチン誘導性の標的介在性クリアランスの現象は、スタチン療法中の患者の体内で効果的に再利用される抗ＰＣＳＫ９抗体を用いて回避するか、または避けることがありうると考えている。したがって、本発明は、スタチン治療法中の対象に、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体の治療有効量を投与することによって抗ＰＣＳＫ９結合剤のスタチン誘導性の標的介在性クリアランスを克服／回避する方法を含む。また、本発明は、適切なコレステロール低下作用を達成するため、スタチン使用患者に投与する必要がある抗ＰＣＳＫ９薬剤の量を減らす方法、および／または抗ＰＣＳＫ９薬剤をスタチン使用患者に投与する頻度を減らす方法を含み、ここで、このような方法は、患者に最初に投与される従来の抗ＰＣＳＫ９薬剤を、ｐＨ依存性結合特性を示す抗ＰＣＳＫ９抗体に代えることによって患者の治療投与療法を変更することを含む。本明細書に記載されたｐＨ依存性抗ＰＣＳＫ９抗体のいずれかは、前述の方法の文脈に関して用いてもよい。

併用療法
また、本発明は、１つまたはそれ以上のさらなる治療剤と組み合わせて本明細書に記載された例示的な抗ＰＣＳＫ９抗体のいずれかを含む医薬組成物を投与することを含む治療方法を提供する。本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体と組み合わせて投与されうる例示的なさらなる治療剤としては、例えば、スタチン（アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、など）、ナイアシン、フィブリン酸、胆汁酸分離剤（例えば、コレスチラミン）、コレセベラム、コレスチポール、エゼチミブ、抗高血圧剤、抗糖尿病薬、アンギオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）またはアンギオポエチン様タンパク質４（ＡＮＧＰＴＬ４）のアンタゴニスト（例えば、抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体［例えば、ＷＯ２００８／０７３３００またはＵＳ７，９３５，７９６中に記載された抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体］または抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体［例えば、ＷＯ２００６／００７４２２８またはＷＯ２００７／１０９３０７またはＷＯ２０１１／０７９２５７中に記載された抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体］）、ならびに上記のさらなる治療剤のいずれかの組合せが含まれる。

さらなる治療活性剤は、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を投与する直前に、それと同時に、またはその直後に投与してもよい（本開示の目的では、このような投与療法は、さらなる治療活性剤「と組み合わせた」抗ＰＣＳＫ９抗体の投与とみなされる）。本発明は、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体が、本明細書に他の箇所に記載された１つまたはそれ以上のさらなる治療活性成分と同時に製剤化（co-formulate）される医薬組成物を含む。

また、本発明は、本発明の医薬組成物の投与時に、またはその直前に、高コレステロール血症または関連した状態の治療のための治療法中にある患者に、本明細書に記載された例示的な抗ＰＣＳＫ９抗体のいずれかを含む医薬組成物を投与することを含む治療方法を提供する。例えば、以前に高コレステロール血症と診断されたことがある患者は、別の薬物を処方され、その薬物の安定した投与レジメンを本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を含む医薬組成物の投与前に、かつ／または同時に、受けていることもある。以前のまたは同時の治療法は、例えば、（１）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル（ＨＭＧ）−補酵素Ａ（ＣｏＡ）レダクターゼを阻害することによってコレステロール合成の細胞枯渇を誘導する薬剤、例えばスタチン（例えば、セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、など）；（２）コレステロール取り込みまたは胆汁酸再吸収を阻害する薬剤；（３）リポタンパク質異化作用を高める薬剤（例えばナイアシン）；および／または（４）２２−ヒドロキシコレステロールのようなコレステロール除去において役割を果たすＬＸＲ転写因子の活性化剤を含んでもよい。特定の実施態様において、患者は、抗ＰＣＳＫ９抗体の投与前、またはそれと同時に、例えばシンバスタチン＋エゼチミブ；スタチンと胆汁樹脂（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）；ナイアシン＋スタチン（例えば、ナイアシンとロバスタチン）；または他の脂質低下剤、例えばオメガ−３−脂肪酸エチルエステル（例えば、オマコール）との決まった組合せの治療剤を使用中である。

用量
本発明の方法および投与療法に従って対象に投与される抗ＰＣＳＫ９抗体の量は、一般に治療有効量である。本明細書に用いるように、「治療有効量」という成句は、血清ＬＤＬ−Ｃの減少が検出可能となる抗ＰＣＳＫ９抗体の用量、または高コレステロール血症および／もしくは関連する状態の進行を阻害する、防止する、弱める、もしくは遅らせる抗ＰＣＳＫ９抗体の用量を意味する。ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体の場合、治療有効量は、抗ＰＣＳＫ９抗体約０．０５ｍｇから約６００ｍｇまで、例えば、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１．０ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２．０ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２７０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２９０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３１０ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３３０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３７０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約３９０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４１０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４３０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４７０ｍｇ、約４８０ｍｇ、約４９０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５１０ｍｇ、約５２０ｍｇ、約５３０ｍｇ、約５４０ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５６０ｍｇ、約５７０ｍｇ、約５８０ｍｇ、約５９０ｍｇまたは約６００ｍｇであることができる。

個々の用量内に含まれる抗ＰＣＳＫ９抗体の量は、患者体重キログラム当たりの抗体ミリグラム（すなわち、ｍｇ／ｋｇ）によって表してもよい。例えば、抗ＰＣＳＫ９は、約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量で患者に投与してもよい。

投与療法
本発明の特定の実施態様によれば、複数の用量の本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体（例えば、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む医薬組成物）を定められた時間経過にわたって対象に投与してもよい。本発明のこの態様による方法は、対象に複数の用量の抗ＰＣＳＫ９抗体を順に投与すること含む。本明細書に用いるように、「順に投与すること」は、それぞれの用量の抗ＰＣＳＫ９抗体が、異なる時点で、例えば、予め定められた間隔（例えば、数時間、数日、数週間あるいは数ヶ月）を隔てた異なる日に対象に投与されることを意味する。本発明は、初回用量の抗ＰＣＳＫ９抗体を１回、続いて第２の用量の抗ＰＣＳＫ９抗体を１回またはそれ以上、そして場合により、続いて第３の用量の抗ＰＣＳＫ９抗体を１回またはそれ以上、患者に順に投与することを含む方法を含む。

「初回用量」、「第２の用量」および「第３の用量」という用語は、抗ＰＣＳＫ９抗体を投与する時間経過の順序のことをいう。したがって、「初回用量」は、治療法の開始時に投与される用量であり（「ベースライン用量」ともいう）；「第２の用量」は、初回用量の後に投与される用量であり；そして「第３の用量」は、第２の用量の後に投与される用量である。初回、第２および第３の用量は、すべて同じ量の抗ＰＣＳＫ９抗体を含んでもよいが、一般に投与の頻度に関して互いに異なることになる。しかし、特定の実施態様において、初回、第２および／または第３の用量に含まれる抗ＰＣＳＫ９抗体の量は、治療の経過中に互いに異なることになる（例えば、必要応じて上方または下方に調整する）。特定の実施態様において、２回またはそれ以上（例えば、２、３、４または５回）の用量が、治療法の開始時に「負荷量」、続いてより少ない頻度で投与されるその後の用量（例えば、「維持量」）として投与される。負荷量は、例えば、週に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、月に１回、２ヵ月毎に１回、３ヵ月毎に１回などの頻度で投与してもよい。

本発明の１つの例示的な実施態様において、それぞれ第２および／または第３の用量は、直前の用量の１〜６０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０またはそれ以上）週後に投与される。「直前の用量」という成句は、本明細書に用いるように、一連の複数の投与において、順序として間に入る用量がなく、ちょうど次の用量を投与する前に、患者に投与される抗ＰＣＳＫ９抗体の用量を意味する。

本発明のこの態様による方法は、患者に第２および／または第３の用量の抗ＰＣＳＫ９抗体を任意の回数投与することを含んでもよい。例えば、特定の実施態様において、第２の用量は１回しか患者に投与されない。別の実施態様において、第２の用量は２回またはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回またはそれ以上）患者に投与される。同様に、特定の実施態様において、第３の用量は１回しか患者に投与されない。別の実施態様において、第３の用量は２回またはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回またはそれ以上）患者に投与される。第２および／または第３の用量は、場合によっては、複数の年数の間または対象の生涯にわたって特定の頻度で投与してもよい。

複数回の第２の用量を含む実施態様において、それぞれの第２の用量は、他の第２の用量と同じ頻度で投与してもよい。例えば、それぞれの第２の用量は、直前の用量の１〜６０週後に患者に投与してもよい。同様に、複数回の第３の用量を含む実施態様において、それぞれの第３の用量は、他の第３の用量と同じ頻度で投与してもよい。例えば、それぞれの第３の用量は、直前の用量の１〜６０週後に患者に投与してもよい。あるいは、第２および／または第３の用量を患者に投与する頻度は、治療法の経過にわたって変化してもよい。また、投与頻度は、治療の経過中に、臨床検査による個々の患者の必要に応じて医師が調整してもよい。

以下の実施例は、本発明の方法を実施するやり方ならびに本発明の組成物を製造および使用するやり方の完全な開示および説明を当業者に提供するために記載するのであって、発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定しようとするものではない。使用した数に関しては（例えば、量、温度、など）正確さを保つように努めているが、実験的な誤差および偏差がいくらか含まれているはずである。特に明記しない限り、部は質量による部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、そして圧力は大気圧またはその付近である。

〔実施例１〕ヒトＰＣＳＫ９に対するヒト抗体の生成
米国特許第８,０６２,６４０号に記載されたようなヒト抗ＰＣＳＫ９抗体を生成した。表１は、選択された抗ＰＣＳＫ９抗体およびそれらの対応する抗体表示の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列対、ならびにＣＤＲアミノ酸配列についての配列識別子を示す。核酸配列は、表１中に偶数の配列識別子に対応する奇数の配列識別子によって表される。例えば、配列番号：１は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり；配列番号：３は配列番号：４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、など。

以下の非限定的な実施例に説明するように、それぞれの重鎖および軽鎖可変ドメインおよび／またはＣＤＲのアミノ酸配列に対する参照を有する表１に記載された抗ＰＣＳＫ９抗体のいずれかを、ｐＨ依存性ヒスチジン置換変異体抗体を誘導することができる親抗体として用いてもよい。

〔実施例２〕ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体のヒスチジン置換突然変異体の作製
３００Ｎと表示された抗ＰＣＳＫ９抗体は、酸性ｐＨでＰＣＳＫ９に対する低下した結合親和性を有する中程度のｐＨ依存性結合特性、および増強された薬物動態を有することが知られている（米国特許第８,０６２,６４０号を参照のこと）。さらにより大きなｐＨ依存性結合特性（すなわち、中性ｐＨと比較して低いｐＨで低下した結合）および改善されたin vivo有効性（例えば、より長い抗体血清半減期、延長されたコレステロール低下活性、など）を有する３００Ｎの変異体を生成する試みにおいて一連の変異型抗体を作製した。特に、３００Ｎの相補性決定領域（ＣＤＲ）内の各アミノ酸がそれぞれヒスチジンに突然変異した３００Ｎの突然変異体バージョンを作製した。表１に示すように、親３００Ｎ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は配列番号：２１８のアミノ酸配列を含み、そして親３００Ｎ抗体の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）は配列番号：２２６のアミノ酸配列を含む。親３００Ｎ抗体のＣＤＲ配列を表２に示す。Ｈｉｓ置換突然変異は、３００Ｎから誘導されたヒスチジン置換変異型抗体に対応する抗体表示とともに表３に示す（例えば、ＶＨ−Ｇ２６Ｈ、ＶＨ−Ｆ２７Ｈ、など）。

表３に記載された各変異型抗体について、すべてのＣＤＲ配列は、表に示した突然変異ＣＤＲ配列を除いて、親３００Ｎ抗体（配列番号：２２０、２２２、２２４、２２８、２３０、２３２のＣＤＲ配列を含む）と同一である。例えば、「ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ」と表示されたヒスチジン置換変異型抗体は、配列番号：２２０、２２２、７８８、２２８、２３０、２３２のアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む（ここでは、配列番号：２２４のＨＣＤＲ３配列が配列番号：７８８の変異型ＨＣＤＲ３配列で置換される）。同様に、「ＶＫ−Ｌ３０Ｈ」と表示されたヒスチジン置換変異型抗体は、配列番号：２２０、２２２、２２４、８０２、２３０、２３２のアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む（ここでは、配列番号：２２８のＬＣＤＲ１配列が配列番号：８０２の変異型ＬＣＤＲ１配列で置換される）。

〔実施例３Ａ〕中性および酸性ｐＨでの変異型抗ＰＣＳＫ９抗体の結合特性
実施例２のヒスチジン置換変異型抗体を、ヒトＰＣＳＫ９に対するｐＨ依存性結合について試験し、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Biacore T200）アッセイを用いて２５℃で、ｐＨ５．７５およびｐＨ７．２のいずれかで実施した。本実験の目的は、どのヒスチジン置換変異型抗体が、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでヒトＰＣＳＫ９に対して低下した結合を示したかを特定することであった。

ビアコアＣＭ４（Biacore CM4）センサーチップを、ヒト抗体を捕捉するモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体で誘導体化した。ヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で一時的に発現させた後、培地から抗ヒトＦｃセンサー表面上へ捕捉させた。３．１２５ｎＭから５００ｎＭの範囲から種々の濃度のＣ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグ（ｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨ）を有するヒトＰＣＳＫ９（配列番号：７５５）を５０μｌ／分の流速で抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体捕捉表面上に注射した。抗体−抗原結合を４分間または５分間モニターし、次いで捕捉されたモノクローナル抗体からの抗原の解離を５分間または８分間モニターした。スクラバー２．０（Scrubber 2.0）曲線適合ソフトウェアを用いてデータを処理し、１：１結合モデルに適合させることによって動態学的結合（ｋ_ａ）および解離（ｋ_ｄ）速度定数を決定した。結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）は、動態学的速度定数：Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ；およびｔ_１／２（分）＝、（ｌｎ２／（６０^＊ｋ_ｄ）から計算した。

ｐＨ７．２（中性）およびｐＨ５．７５（酸性）でヒトＰＣＳＫ９に結合するヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体のそれぞれについてのＫ_Ｄ値およびｔ_１／２値、ならびにこれらのそれぞれの値についてのｐＨ５．７５／ｐＨ７．２比を表４に示す。親３００Ｎ抗体の値も表の最下段に示す。Ｋ_Ｄ値はモル濃度（Ｍ）表し、ｔ_１／２値は分（分）で表す。

表４（すべて２５℃での測定値）に示すように、親（３００Ｎ）抗体は、ｐＨ７．２およびｐＨ５．７５の両方で中程度の結合親和性（Ｋ_Ｄ約０．９〜１．０ｎＭ）を示し、ｐＨ７．２と比較してｐＨ５．７５でｔ_１／２は３倍を超えて短くなった（すなわち、ｐＨ５．７５でより速い解離；ｐＨ５．７５／ｐＨ７．２比＝０．２６）。

単一ヒスチジン置換のいくつかでは、ｐＨ５．７５およびｐＨ７．２の両方で実質的に低下した結合が得られ、他の置換は、元の配列と比較してｐＨ依存性結合において最小限の作用しか有しなかった。しかし、重要なことに、単一ヒスチジン突然変異のいくつかでは、親抗体と比べて、ｐＨ７．２と比較してｐＨ５．７５で実質的により速い解離速度を示す抗体が得られた（ｐＨ５．７５のｔ_１／２は、ｐＨ７．２のｔ_１／２より少なくとも５倍短い）。このようなｐＨ依存性結合特性を有する抗体は、重鎖ＣＤＲ置換を有する抗体：ＶＨ−Ｗ３３Ｈ、ＶＨ−Ｑ５３Ｈ、ＶＨ−Ｉ１００Ｈ、ＶＨ−Ｖ１０４Ｈ、ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ、ＶＨ−Ｍ１０７ＨおよびＶＨ−Ｙ１１２Ｈ；ならびに軽鎖ＣＤＲ置換を有する抗体：ＶＫ−Ｌ２９Ｈ、ＶＫ−Ｌ３０Ｈ、ＶＫ−Ｎ３３Ｈ、ＶＫ−Ｌ９７Ｈ、ＶＫ−Ｔ９９ＨおよびＶＫ−Ｐ１００Ｈを含む。ヒスチジン置換変異型抗体ＶＨ−Ｄ１０６ＨおよびＶＫ−Ｌ３０Ｈは特に顕著なｐＨ依存性結合を示し、これらをさらなる検査のために選択した。

ヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体ＶＨ−Ｄ１０６ＨおよびＶＫ−Ｌ３０Ｈ、ならびに二重ヒスチジン置換変異体（ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ／ＶＫ−Ｌ３０Ｈ）のｐＨ依存性結合特性をさらに調べるため、抗体を精製し、上記と類似した条件を用いて中性ｐＨ（ｐＨ７．４）（表６）および酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）（表７）でヒトＰＣＳＫ９に対する結合について試験した。中性ｐＨに対する酸性ｐＨでの結合特性の比率を表８に示す。また、これらの実験には、いくつかの対照／コンパレーター抗体が含まれていた。本アッセイで試験した抗体の一覧を表５に示す。すべての測定値は２５℃で得た。

ｐＨ依存性結合は、ｋ_ｄおよびＫ_Ｄの酸性／中性比の高い値（例えば、約１２より大きい）によって、そしてｔ１／２の酸性／中性比の低い値（例えば、約０．２０未満）によって示される。これらの基準によって、ヒスチジン置換変異型抗体ＶＫ−Ｌ３０Ｈおよび二重突然変異型ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ／ＶＫ−Ｌ３０Ｈは、試験したすべての抗体のうち最も実質的なｐＨ依存性結合特性を示した。特に、これらの抗体は、それぞれ約２８を超えるｋ_ｄの酸性／中性比、約１４を超えるＫ_Ｄの酸性／中性比、および０．０５未満のｔ１／２の酸性／中性比を示した。

〔実施例３Ｂ〕ヒトＰＣＳＫ９に対するヒスチジン変異型抗ＰＣＳＫ９抗体の結合特性：中性ｐＨでの結合ならびに中性および酸性ｐＨ範囲での解離
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体のｐＨ依存性結合特性をさらに評価するため、結合実験を実施し、ここでは、抗体／抗原結合段階を中性ｐＨで観察し、そして抗体／抗原解離段階を３７℃で中性または酸性ｐＨの範囲で観察した。

ビアコアＣＭ４（Biacore CM4）センサーチップを、ヒト抗体を捕捉するためＦａｂ’
２ポリクローナル抗ヒトＦｃ抗体で誘導体化した。精製された選択ヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体（ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ、ＶＫ−Ｌ３０ＨおよびＶＨ−Ｄ０１６Ｈ／ＶＫ−Ｌ３０Ｈ）を、親抗体（３１６Ｐおよび３００Ｎ）およびコンパレーター抗体（コンパレーター１−７は、表５を参照のこと）と共に抗ヒトＦｃセンサー表面上へ捕捉させた。３．１２５ｎＭから５０ｎＭまでの範囲の異なる濃度のＣ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグ（ｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨ）を有するヒトＰＣＳＫ９を、３０μｌ／分の流速で抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体捕捉表面上に注射した。抗体−抗原結合をｐＨ７．４で６分間モニターし、次いで捕捉されたモノクローナル抗体からの抗原の解離をｐＨ７．４、７．２、６．０または５．７５のいずれかで５分間モニターした。スクラバーバージョン２．０（Scrubber version 2.0）曲線適合ソフトウェアを用いてデータを処理し、適合させることによって解離（ｋ_ｄ）速度定数を決定した。解離半減期（ｔ_１／２）は、ｔ_１／２（分）＝（ｌｎ２／ｋ_ｄ）／６０として解離速度定数から計算した。種々のｐＨ条件下で抗体の結合／解離特性を示すセンサーグラムを図３Ａ〜３Ｇに図示する。

これらの実験からの結果は、ヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ、ＶＫ−Ｌ３０ＨおよびＶＨ−Ｄ０１６Ｈ／ＶＫ−Ｌ３０Ｈが、親抗体と比較して低いｐＨでＰＣＳＫ９抗原からのより迅速な解離を示すことを裏付けている（図３Ａ〜３ＧにｐＨ６．０および５．７５の実験の３６０秒の時点での反応レベルの急激な低下として示される）。

〔実施例４〕変異型抗ＰＣＳＫ９抗体の受容体遮断活性
最初に、ＥＬＩＳＡベースの免疫測定法を用いて、選択されたヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体を、中性ｐＨでヒトＬＤＬＲ（ｈＬＤＬＲ）に対する組換えヒトＰＣＳＫ９結合を遮断する能力について試験した。

簡潔に言えば、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌで、Ｃ末端ヒトＦｃタグ（「ｈＬＤＬＲ ＥＧＦＡｈＦｃ」）で発現されたヒトＬＤＬＲ（配列番号：７５８のアミノ酸３１３〜３５５）の上皮増殖因子様ドメインＡを９６ウェルマイクロタイタープレート上に４℃で一夜コートし、続いてＰＢＳ中０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの溶液でブロッキングした。このプレートを用いて、表９Ａに示すように中性ｐＨ（ｐＨ７．２）で種々の濃度の抗ｈＰＣＳＫ９抗体（親またはヒスチジン置換変異体）により予め平衡にしたｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨの溶液中で遊離ＰＣＳＫ９を測定した。

中性ｐＨ（ｐＨ７．２）での抗体の遮断特性を決定する最初の実験として、一定の最終濃度５００ｐＭのｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨ（実施例３を参照のこと）を、０ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲の抗体の連続的希釈により予備混合し、続いて室温で１時間インキュベーションし、結合を平衡に到達させた。次いで、平衡試料溶液を、上記のように調製したＬＤＬＲ ＥＧＦＡｈＦｃコーティングプレートに移した。１時間インキュベーション後、受容体コーティングプレートを洗浄し、ＨＲＰ結合抗ｍｙｃ二次抗体（ノーバス（Novus）、＃ＮＢ６００−３４１）を用いて、プレートに結合したｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨを検出し、ＴＭＢ ＨＲＰ基質（ＢＤバイオサイエンシズ（BD Biosciences）、＃５５５２１４）を用いて比色シグナルを発生させた。４５０ｎｍでの吸光度を記録して、プレートコーティングされたＬＤＬＲ受容体に結合可能な、予備平衡ＰＣＳＫ９−抗体溶液中の遊離ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈの濃度を示した。抗体を含まない試料からのｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨの結合シグナルの５０％減少を生じる抗体濃度として定義されたＩＣ_５０値を、プリズム（Prism）ソフトウェア（グラフパッド（GraphPad））を用いてデータから決定し、表９Ａに示す。（２つの別個の実験を行った；表９Ａにダッシュ記号［−−］によって示すように、各実験ですべての抗体を試験したわけではなかった）。

親抗体３００Ｎは、約０．２０ｎＭのＩＣ_５０値を示した。ヒスチジン置換変異型抗体は、一般に３００Ｎと比較して効力における僅かな低下を示したが、すべてＩＣ_５０値＜１．０ｎＭを保持していた。ＶＫ−Ｌ３０Ｈ変異体は、親抗体のものに近い遮断効力を保持していた（２つの別個の測定では０．１７および０．２０ｎＭのＩＣ_５０値）。

次いで、類似したＥＬＩＳＡベースの免疫測定法を用いて、本発明のヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体およびコンパレーター抗体のサブセットを、中性および低いｐＨ条件でヒトＬＤＬＲ（ｈＬＤＬＲ）に結合する組換えヒトＰＣＳＫ９を遮断する能力について試験した。

簡潔に言えば、ｈＬＤＬＲ ＥＧＦＡｈＦｃを、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬで９６ウェルマイクロタイタープレート上に４℃で一夜コーティングし、続いてＰＢＳ中０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの溶液でブロッキングした。このプレートを用いて、中性（ｐＨ７．２）または低い（ｐＨ５．７５）ｐＨで種々の濃度の抗ｈＰＣＳＫ９抗体により予め平衡にしたｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨの溶液中で遊離ｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨを測定した。

ブロッキング実験のため、一定の最終濃度５００ｐＭのｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨ（実施例３を参照のこと）を０ｎＭから約２００ｎＭまでの範囲で抗体の連続的希釈により予備混合し、続いて室温で１時間インキュベーションして結合を平衡に到達させた。これらの混合物の１セットをｐＨ７．２の緩衝液中で予め結合させ、第２のセットをｐＨ５．７５の緩衝液中で予め結合させた。次いで、平衡試料溶液をＬＤＬＲ ＥＧＦＡｈＦｃコーティングプレートへ移した。１時間インキュベーション後、受容体コーティングプレートを洗浄し、ＨＲＰ結合抗ｍｙｃ二次抗体（ノーバス（Novus）、＃ＮＢ６００−３４１）を用いて、プレートに結合したｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨを検出し、ＴＭＢ ＨＲＰ基質（ＢＤバイオサイエンシズ（BD Biosciences）、＃５５５２１４）を用いて比色シグナルを発生させた。４５０ｎｍでの吸光度を記録して遊離ｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨ濃度を示し、抗体濃度に対してプロットした。抗体の存在なしで遊離ｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨシグナルの５０％減少を生じる抗体量として定義されるＩＣ_５０値を、プリズムソフトウェア（GraphPad）を用いてデータから決定した。ベースラインは、ｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨがない場合の４５０ｎｍでの緩衝溶液の吸光度に設定した。２つのアッセイのＩＣ_５０値を遮断能力のｐＨ依存性を示す比率計算値と共に表９Ｂに示す。

表９Ｂに示すように、ほとんどのコンパレーター抗体は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで遮断活性の低下を全くまたは僅かしか示さなかった（例えば、コンパレーター２、５、６、７、８および９を参照すると、すべて中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでの遮断活性における低下が３倍未満であった）。コンパレーター３および４は、それぞれ３５．９および１９．２の酸性／中性ＩＣ_５０比を有し、遮断能力における中程度の低下を示した。対照的に、本発明の２つの例示的なヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体、ＶＫ−Ｌ３０ＨおよびＶＨ−Ｄ１０６Ｈ／ＶＫ−Ｌ３０Ｈは、酸性／中性ＩＣ_５０比が約２００を超え、酸性ｐＨでＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ遮断活性の劇的な低下を示した。

本実験の結果は、本発明のヒスチジン変異型抗ＰＣＳＫ９抗体のｐＨ依存性結合特性が、これらの抗体によって中性および酸性ｐＨでＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの間の相互作用を遮断できる程度を示すことを裏付けている。

〔実施例５〕in vitroでのＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９介在性阻害を遮断する変異型抗ＰＣＳＫ９抗体の能力
選択されたヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体のin vitroでのＬＤＬ取り込みを高める能力を、ヒト肝細胞性肝癌細胞系統（ＨｅｐＧ２、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６５）を用いて決定した。ＨｅｐＧ２細胞を、ＤＭＥＭの５％リポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ、ミリポア（Millipore）、＃ＬＰ４）中、２×１０^４細胞／ウェルで９６ウェルプレート上へ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一夜インキュベートしてＨｅｐＧ２単層を形成した。２ｎＭ組換えヒトＰＣＳＫ９（配列番号：７５５、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグおよびＤ３７４Ｙ突然変異；「ｈＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ−ｍｍＨ」で発現）または５０ｎＭ組換えカニクイザルＰＣＳＫ９（Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ；ＭｆＰＣＳＫ９−ｍｍＨで発現；配列番号：７６１）を、ＬＰＤＳ培地中の種々の濃度（連続希釈で５０ｎＭから０．０９８ｎＭまで）の抗体を加えた。一夜インキュベーション後、ＬＰＤＳ培地中のＢＯＤＩＰＹＬＰＬ（インビトロゲン（Invitrogen）、Ｌ３４８３）を細胞に加えて０．０１ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。３７℃で６時間インキュベーション後、３９０ｎｍ／５２０ｎｍに設定した励起／放出フィルターを用いて蛍光プレートリーダー（モレキュラーデバイスフレックスステーションＩＩＩ（Molecular Devices Flexstation III））によってＢＯＤＩＰＹＬＰＬの取り込みを検出した。試験した各抗ＰＣＳＫ９抗体のＩＣ_５０値を表１０に示す（ＩＣ_５０＝ＬＤＬ取り込みが５０％高まる抗体濃度）。

表１０に示すように、本アッセイで試験したヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体のすべては、５ｎＭ未満のＩＣ_５０値でｈＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ−ｍｍＨ介在性ＬＤＬ取り込み阻害を遮断し（すなわち、ＬＤＬ取り込みを促進し）、そして２２ｎＭ未満のＩＣ_５０値でＭｆＰＣＳＫ９−ｍｍＨ介在性ＬＤＬ取り込み阻害を遮断した（すなわち、ＬＤＬ取り込みを促進した）。

また、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体およびコンパレーター抗体のサブセット（表５を参照のこと）のin vitroでのＬＤＬ取り込みを高める能力を、上記と同じヒト肝細胞性肝癌腫細胞系統アッセイプロトコールであるが、組換え野生型ヒトＰＣＳＫ９（配列番号：７５５、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ；「ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈ」で発現）を用いて決定した。１００ｎＭで一定のｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨを、ＬＰＤＳ培地中の種々の濃度（連続希釈で２０００ｎＭから０．０３４ｎＭまで）の抗体と一緒に加えた。試験した各抗ＰＣＳＫ９抗体のＩＣ_５０値を表１１Ａに示す（ＩＣ_５０＝ＬＤＬ取り込みが５０％高まる抗体濃度）。

表１１Ａに示すように、試験した１０種の抗ＰＣＳＫ９抗体は、２６ｎＭと３７ｎＭの間のＩＣ_５０値でｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈを阻害した。コンパレーター１は、１８ｎＭのＩＣ_５０値でｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈを部分的に阻害しただけであった。

また、本発明の１つの抗ＰＣＳＫ９抗体およびコンパレーター抗体のサブセット（表５を参照のこと）のin vitroでのＬＤＬ取り込みを高める能力を、組換え野生型ヒトＰＣＳＫ９（配列番号：７５５、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ；「ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈ」で発現）、ヒトＰＣＳＫ９（配列番号：７５５、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグおよびＤ３７４Ｙ突然変異；「ｈＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ−ｍｍＨ」で発現）、または組換えカニクイザルＰＣＳＫ９（Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ；ＭｆＰＣＳＫ９−ｍｍＨで発現；配列番号：７６１）を用いて、上記と同じヒト肝細胞性肝癌細胞系統アッセイプロトコールを用いて決定した。５０ｎＭで一定のｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨ、２ｎＭで一定のｈＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ−ｍｍＨまたは５０ｎＭで一定のＭｆＰＣＳＫ９−ｍｍＨを、ＬＰＤＳ培地中の種々の濃度の抗体（ｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨまたはＭｆＰＣＳＫ９−ｍｍＨブロッキングのため、抗体濃度は５００ｎＭから出発して１：２で連続希釈した；ｈＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ−ｍｍＨブロッキングのため、抗体濃度は５０ｎＭから出発して１：２で連続希釈した）と一緒に加えた。試験した各抗ＰＣＳＫ９抗体のＩＣ_５０値を表１１Ｂに示す（ＩＣ_５０＝ＬＤＬ取り込みが５０％高まる抗体濃度）。

表１１Ｂに示すように、ＶＫ−Ｌ３０Ｈは、９ｎＭのＩＣ_５０値でｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨを遮断したのに対して、３１６（ｖ１）および３００Ｎ（ｖ２）は、それぞれ７．８ｎＭおよび１０．３ｎＭのＩＣ_５０値でｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨを遮断した。このアッセイで試験したコンパレーター抗体は、８．９ｎＭから３９．３ｎＭまでの範囲のＩＣ_５０値でｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨを遮断した。ＶＫ−Ｌ３０Ｈは、３．３ｎＭのＩＣ_５０値でｈＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ−ｍｍＨを遮断したのに対して、３１６（ｖ１）および３００Ｎ（ｖ２）は、いずれも２ｎＭのＩＣ_５０値でｈＰＣＳＫ９−ｍｍＨを遮断した。コンパレーター７は、０．９７ｎＭのＩＣ_５０値でｈＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ−ｍｍＨを遮断したのに対して、コンパレーター９は、１０．６ｎＭのＩＣ_５０値でｈＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ−ｍｍＨを部分的に遮断し、そしてコンパレーター８は、ｈＰＣＳＫ９−Ｄ３７４Ｙ−ｍｍＨの測定可能な遮断をなんら示さなかった。ＶＫ−Ｌ３０Ｈは、２６．４ｎＭのＩＣ_５０値でＭｆＰＣＳＫ９−ｍｍＨを遮断したのに対して、３１６（ｖ１）および３００Ｎ（ｖ２）は、それぞれ１０．３ｎＭおよび１５．７ｎＭのＩＣ_５０値でＭｆＰＣＳＫ９−ｍｍＨを遮断した。コンパレーター７および９は、それぞれ１０．４ｎＭおよび３３．９ｎＭのＩＣ_５０値でＭｆＰＣＳＫ９−ｍｍＨを遮断したのに対し、コンパレーター８はＩＣ_５０値７７．２ｎＭでＭｆＰＣＳＫ９−ｍｍＨを部分的に遮断した。

〔実施例６〕野生型およびＰＣＳＫ９ヒト化マウスにおける変異型抗ＰＣＳＫ９抗体の薬物動態分析
３つのヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体（ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ、ＶＫ−Ｌ３０ＨおよびＶＨ−Ｄ１０６Ｈ／ＶＫ−Ｌ３０Ｈ）のそれらの親抗体分子（３００Ｎ）に対する薬物動態クリアランス速度の比較を、野生型（ＷＴ）マウスおよびマウスＰＣＳＫ９の代わりにヒトＰＣＳＫ９を発現するため、すべてのマウスについて同じ系統のバックグラウンド（７５％Ｃ５７ＢＬ６および２５％１２９Ｓｖ）を有するマウス同種接合（ヒト化ＰＣＳＫ９マウス）において行った。各抗体を、５匹のＷＴおよび５匹のヒト化ＰＣＳＫ９マウスで試験した。すべての抗体を１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。抗体注射の１日前に集めたブリード（bleed）（プレブリード（pre-bleed））に加えて、注射後、６時間、１、２、３、４、７、１０、１４、２１、３０、３９、５０、６０および７４日でブリードを集めた。ブリードからの血清画分を分離し、ＥＬＩＳＡ免疫測定法を用いた総ヒト抗体分析にかけた。簡潔に言えば、ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（ジャクソンイムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）、＃１０９−００５−０９８）を、１μｇ／ｍＬの濃度で、４℃で一夜インキュベートすることによって９６ウェルプレート上へコーティングした。その翌日、プレートをＢＳＡでブロックし、次いで洗浄した。次いで、６用量連続希釈の血清試料および１２用量連続希釈のおよびそれぞれの抗体の標準試料をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄して未結合抗体を除去した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ジャクソンイムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）、＃１０９−０３５−０９８）と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を用いてプレートに捕捉されたヒト抗体を検出した。プレートを洗浄し、次いで、製造元の（ＢＤファーミンジェン（BD Pharmingen））推奨に従って比色テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質によって呈色させた。吸光度を４５０ｎｍで測定し、試料プレートで作成した参照標準曲線を用いて血清試料のヒトＩｇＧの濃度を計算した。結果を図１および２Ａに説明し、これらは、それぞれ、ＷＴおよびヒト化マウスで試験した４つの抗ＰＣＳＫ９抗体の濃度変化の時間経過を示す。実験の経過にわたる各コホートについての平均血清抗体濃度（μｇ／ｍｌ±ＳＥＭ）を表１２（日１４、２１および３０）、表１３（日３９、５０および６０）および表１４（日７４）に示す。

図１に示すように、試験した４つのすべて抗体は、日１〜２付近で同様のＣ_ｍａｘに達し、ＷＴマウスでは同様のクリアランス速度を示し、薬物動態プロファイルが重なった。ヒト化ＰＣＳＫ９マウス（図２Ａ）では、親抗体、３００Ｎは、試験したヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体と比較してより速いクリアランスを示した。３００Ｎの抗体濃度は、ＷＴマウスの約８μｇ／ｍｌと対照的に、ヒト化ＰＣＳＫ９マウスでは日１４に検出限界より下（＜０．０２μｇ／ｍｌ）にあり、親抗体の迅速なヒトＰＣＳＫ９介在性クリアランスを示唆している。ヒスチジン置換変異型抗体ＶＨ−Ｄ１０６Ｈは、ヒト化ＰＣＳＫ９マウスの親抗体よりも遅いクリアランス速度を示し、ヒト化ＰＣＳＫ９マウスにおいて日１４で約０．７μｇ／ｍｌの平均抗体濃度を有した。ＶＨ−Ｄ１０６Ｈの抗体濃度は、ヒト化ＰＣＳＫ９マウスでは日５０付近までに検出限界より下に低下した。ヒスチジン置換変異型抗体ＶＫ−Ｌ３０ＨおよびＶＨ−Ｄ１０６Ｈ／ＶＫ−Ｌ３０Ｈは、ＶＨ−Ｄ１０６Ｈまたは親抗体と比較して、ヒト化ＰＣＳＫ９マウスにおいてより遅いクリアランス速度を示し、日１４で、それぞれ約１０μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの平均血清抗体濃度を有した。ＶＫ−Ｌ３０ＨおよびＶＨ−Ｄ１０６Ｈ／ＶＫ−Ｌ３０Ｈについての抗体の血清レベルは、少なくとも日７４まで検出可能範囲（＞０．０２μｇ／ｍｌ）にとどまった。特に、ＶＫ−Ｌ３０Ｈの血清中濃度は、ヒト化ＰＣＳＫ９マウスにおいて日７４まで０．２５μｇ／ｍｌより上にとどまった。

次に、ＶＨ−Ｄ１０６ＨおよびＶＫ−Ｌ３０Ｈの薬物動態クリアランス速度を、それらの親抗体（３００Ｎ）および６つのコンパレーター抗ＰＣＳＫ９抗体（表５に定義されたコンパレーター１、２、３、４、５および６）と比較した。この一連の実験を、７５％Ｃ５７ＢＬ６および２５％１２９Ｓｖの系統バックグラウンドを有するヒト化ＰＣＳＫ９マウスにおいて行った。各抗体を一群５匹のマウスで試験し、すべての抗体を１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。抗体注射の１日前に集めたブリード（プレブリード）に加えて、注射後、６時間、１、２、３、４、７、１０、１４、２１、３０、３９、５０、６０および７４日でブリードを集めた。ヒトＩｇＧ Ｆｃを検出するためＥＬＩＳＡを用いて、個々の試料中の総ヒト抗体の分析を実施した。結果を、図２ｂの総ヒト抗体レベルの時間−経過としてプロットする。時間に対する各コホート（μｇ／ｍｌ±ＳＥＭ）の平均血清抗体濃度を、表１５（日１４、２１および３０）および表１６Ａ（日４５および７４）に示す。

図２ｂに示すように、すべての試験抗体は、日１〜２付近で最大血清中濃度（Ｃｍａｘ）に達し、６つの抗体（３００Ｎ、ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ、ＶＫ−Ｌ３０Ｈ、コンパレーター１、コンパレーター３およびコンパレーター４）は、同様のＣ_ｍａｘを示し、その他の３つの抗体（コンパレーター２、コンパレーター５およびコンパレーター６）は、約２〜３倍低いＣ_ｍａｘを示している。抗体３００Ｎ、コンパレーター２、コンパレーター５およびコンパレーター６は、他の試験抗体と比較してより速いクリアランスを示した。表１５に示すように、これらの４つの抗体の抗体濃度は、日１４で検出限界（＜０．０２μｇ／ｍｌ）より下にあった。対照的に、抗体ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ、コンパレーター１およびコンパレーター４は、日１４で０．５μｇ／ｍＬから２μｇ／ｍＬまでの範囲の血清中濃度を示し、抗体ＶＫ−Ｌ３０Ｈおよびコンパレーター３は、日１４の約７μｇ／ｍＬの血清中濃度を示した。日３０で、抗体ＶＨ−Ｄ１０６Ｈ、コンパレーター１、ＶＫ−Ｌ３０Ｈおよびコンパレーター３は、それぞれ０．０７、０．０７、１．０４および１．８５μｇ／ｍＬの各群の平均薬物血清中濃度を有しており、なお検出可能であった。ＶＫ−Ｌ３０Ｈおよびコンパレーター３についての抗体の血清レベルは、少なくとも日７４まで検出可能範囲（＞０．０２μｇ／ｍＬ）にとどまった（表１６Ａ）。

次いで、３１６Ｐ（ｖ１）、３１６Ｐ（ｖ２）、３００Ｎ（ｖ１）、３００Ｎ（ｖ２）、ＶＫ−Ｌ３０Ｈを含む抗ＰＣＳＫ９抗体、および３つのコンパレーター抗ＰＣＳＫ９抗体（表５に定義されたコンパレーター７、８および９）の薬物動態クリアランス速度を比較するためさらなる研究を実施した。この一連の実験は、７５％Ｃ５７ＢＬ６および２５％１２９Ｓｖの系統バックグラウンドを有するヒト化ＰＣＳＫ９マウスにおいて行った。各抗体を一群５匹のマウスで試験し、すべての抗体を１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。抗体注射の１日前に集めたブリード（プレブリード）に加えて、注射後、１、２、３、４、８、１０、１４、２１および３０日でブリードを集めた。ヒトＩｇＧ Ｆｃを検出するためＥＬＩＳＡを用いて個々の試料中の総ヒト抗体の分析を実施した。結果を、図２Ｃに総ヒト抗体レベルの時間−経過としてプロットする。時間に対する各コホート（μｇ／ｍＬ±ＳＥＭ）の平均血清抗体濃度を表１６Ｂ（日１４、２１および３０）に示す。

図２Ｃに示すように、すべての試験抗体は、日１付近で最大血清中濃度（Ｃｍａｘ）に達しており、７つの抗体［３１６Ｐ（ｖ１）、３１６（ｖ２）、３００Ｎ（ｖ１）、３００Ｎ（ｖ２）、コンパレーター７、コンパレーター８およびコンパレーター９］は、同様のＣｍａｘを示し、ＶＫ−Ｌ３０Ｈは、約１．５〜２倍高いＣｍａｘを示している。抗体３１６Ｐ（ｖ１）、３１６Ｐ（ｖ２）、３００Ｎ（ｖ２）およびコンパレーター７は、他の試験抗体と比較してより速いクリアランスを示した。表１６Ｂに示すように、これらの４つの抗体の抗体濃度は、日１４で検出限界より下（＜０．０２μｇ／ｍＬ）にあった。対照的に、抗体３００Ｎ（ｖ１）、コンパレーター８およびコンパレーター９は、日１４で０．４μｇ／ｍＬから０．７μｇ／ｍＬまでの範囲の血清中濃度を示し、抗体ＶＫ−Ｌ３０Ｈは、日１４で約７μｇ／ｍＬの血清中濃度を示した。日３０で、抗体ＶＫ−Ｌ３０Ｈおよびコンパレーター８は、これらの２つの群について、それぞれ３．３４μｇ／ｍＬおよび０．０９の平均薬物血清中濃度を有しており、なお検出可能であった。

この実施例から、ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体（例えば、ＶＨ−１０６Ｈ、ＶＫ−Ｌ３０ＨおよびＶＨ−Ｄ１０６Ｈ／ＶＫ−Ｌ３０Ｈ）は、ｐＨ依存性結合特性を有していない、または中程度のｐＨ依存性結合特性しか有していない抗ＰＣＳＫ９抗体（例えば、３００Ｎおよびコンパレーター２、５および６）と比較して、増強された薬物動態性質（例えば、より長い期間より高い血清抗体レベル）を示すことがわかる。

〔実施例７〕in vivoでの変異型抗ＰＣＳＫ９抗体のコレステロール低下活性
in vivoでの血清ＬＤＬ−Ｃレベルにおける抗ヒトＰＣＳＫ９抗体の作用を、マウスＰＣＳＫ９の代わりにヒトＰＣＳＫ９を発現するためホモ接合であり、かつ、またマウスＬＤＬＲを発現するためヘテロ接合であるマウス（Ｐｃｓｋ９^{ｈｕｍ／ｈｕｍ} Ｌｄｌｒ^＋／−）において決定した。実験の５日前にマウスから予め採血し（pre-bleed）、群全体で平均ＬＤＬ−Ｃレベルが等しくなるようにそれらのＬＤＬ−Ｃレベルに基づいて処置群に選別した。次いで、抗ＰＣＳＫ９抗体または特異性と関連がないアイソタイプ対照抗体のいずれかを、１０ｍｇ／ｋｇの用量で本研究の日０に、マウスに皮下注射した。本研究では、２つの非修飾親抗ＰＣＳＫ９抗体（３１６Ｐおよび３００Ｎ）および２つのヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体（ＶＫ−Ｌ３０ＨおよびＶＨ−Ｄ１０６Ｈ）を用いた。本実施例では、２つのバージョンの３１６Ｐ、３１６Ｐ（ｖ１）および３１６Ｐ（ｖ２）を用いた。３１６Ｐ（ｖ１）はヒトＩｇＧ１ Ｆｃを有するのに対して、３１６Ｐ（ｖ２）はヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する。他のすべての試験抗体は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有した。（本実施例で用いる「３００Ｎ」抗体は、本明細書の実施例３で用いた「３００Ｎ（ｖ２）」抗体と同じである）。各処置群に５匹のマウスを用いた。

注射後、日４、７、１４、２０、２６、３３、４２、４６および５２にマウスから採血した。ＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００ケミストリー化学システム（ADVIA(R) 1800 Chemistry System）（シーメンス（Siemens））を用いて血清のＬＤＬ−Ｃレベルを決定した。次いで、各処置群の各時点について血清の平均的ＬＤＬ−Ｃを計算し、そして結果を（平均±ＳＥＭ）で表し、表１７に示す。値は、平均ＬＤＬ−Ｃレベル（ｍｇ／ｄＬ）（±ＳＥＭ）として表す。ベースラインからのＬＤＬ−Ｃレベルのパーセント低下を表１８に示す。

表１７および１８に示すように、Ｐｃｓｋ９^{ｈｕｍ／ｈｕｍ} Ｌｄｌｒ^＋／−マウスに投与されたヒスチジン置換変異型抗体（ＶＫ−Ｌ３０ＨおよびＶＨ−Ｄ１０６Ｈ）の１０
ｍｇ／ｋｇ単回投与は、それぞれ、日７でベースラインから約４５％を超えるＬＤＬ−Ｃの低下、および日１４でベースラインから約４４％を超えるＬＤＬ−Ｃの低下をもたらした。さらに、ＶＫ−Ｌ３０Ｈの単回投与で処置したマウスは、３３日までの間にベースラインから少なくとも３３％のＬＤＬ−Ｃにおける持続性の低下を示した。ＶＫ−Ｌ３０Ｈで処置したマウスのＬＤＬ−Ｃレベルは、１０ｍｇ／ｋｇ単回投与の後、日４６でベースラインの約２０％下にとどまった。ＶＨ−Ｄ１０６Ｈを投与したマウスは、ＬＤＬ−ＣにおいてＶＫ−Ｌ３０Ｈと同様の初期低下を有したが、しかしＬＤＬ−Ｃレベルは、日３３までベースラインからわずか約１３％しか低下しなかった。また、３１６Ｐ（ｖ１）の単会投与によってＶＫ−Ｌ３０Ｈとほぼ同じベースラインからのＬＤＬ−Ｃにおける初期パーセント低下が導かれたが（抗体投与後の日７でベースラインから約４９％の低下が達成された）しかし、ＬＤＬ−Ｃ低下作用は、ヒスチジン置換突然変異体ほど延長されなかった。３１６Ｐ（ｖ２）および３００Ｎは、最大の短期ＬＤＬ−Ｃ低下作用を示した（各抗体について日７でベースラインから約５８％の低下）が、しかし、ヒスチジン置換突然変異体と比較して持続作用はより短かった。

また、各治療群のマウスからの循環ヒト抗体のレベルを、標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定した。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（ジャクソンイムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）、＃１０９−００５−０９８）を用いて、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌで、４℃で１８時間プレートをコーティングした。次いで、プレートを、室温（ＲＴ）で３時間ブロックした。標準曲線を作成するため、各抗体を２倍希釈系列でプレートに加えた。抗体注射後の日４、７、１４、２０、２６、３３、４２および４６のマウス血清を１：１００、１：２００、１：５００、１：２０００、１：４０００および１：８０００の希釈度でプレートに加え、次いで、室温で２時間インキュベートした。捕捉された抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ結合抗体（ジャクソンイムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）、＃１０９−０３５−０９８）を用いて検出し、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＭＰバイオメディカルズ（MP Biomedicals）、＃１５２３４６）基質を用いて比色シグナルを発生させた。反応を２．０Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４により停止し、次いで、吸光度を４５０ｎｍで記録してマウス血清中のヒト抗体の総量を測定した。試験した処置群の各時点での平均抗体レベルを計算し、結果を表１９に示す。値を平均総血清抗体レベル（μｇ／ｍＬ）（±ＳＥＭ）として表す。

親抗体３１６Ｐ（ｖ１）、３１６Ｐ（ｖ２）および３００Ｎは、それぞれ日１４、２０および２６までに血行から消失し、示した時点で、これらの抗体で処置されたマウスの血清試料からヒト抗体は検出されなかった。対照的に、ヒスチジン置換変異型抗体ＶＫ−Ｌ３０ＨおよびＶＨ−Ｄ１０６Ｈで処置されたマウスの血清サンプルでは、少なくとも日５５までヒト抗体が検出された。ヒト抗体のレベルは、種々の時点で観察されたコレステロール低下の程度とほぼ相関関係がある。したがって、本発明のヒスチジン置換変異型抗体は、親抗体よりも長期間、処置動物の血行中にとどまり、それに対応して親抗体よりも長期間、血清ＬＤＬ−Ｃを低下させた。

最後に、各処置群のマウスからの血清中のヒトＰＣＳＫ９の総量を各時点で測定した。結果を、ヒトＰＣＳＫ９のｎｇ／ｍＬによって表し、表２０に示す。

ヒスチジン置換変異型抗体ＶＫ−Ｌ３０ＨおよびＶＨ−Ｄ１０６Ｈで処置したマウスでは、総ＰＣＳＫ９レベルは、抗体投与後、少なくとも４２日間、１５００ｎｇ／ｍＬより上にとどまった。対照的に、他のすべての処置群では、総ＰＣＳＫ９レベルは、日２０またはそれ以前までに１０００ｎｇ／ｍＬより下に低下した。

次に、ヒスチジン置換変異型抗ＰＣＳＫ９抗体ＶＫ−Ｌ３０Ｈを、血清ＬＤＬ−Ｃレベルにおけるそれらの作用に関して、Ｐｃｓｋ９^{ｈｕｍ／ｈｕｍ} Ｌｄｌｒ^＋／−マウスを用いて、種々のコンパレーター抗ＰＣＳＫ９抗体（表５に定義されたコンパレーター１、２、３および４）に対して評価した。実験の８日前にマウスから予め採血し、群全体の平均ＬＤＬ−Ｃレベルが等しくなるように、それらのＬＤＬ−Ｃレベルに基づいて処置群に選別した。次いで、抗ＰＣＳＫ９抗体または特異性と関連がないアイソタイプ（ｈＩｇＧ４）対照抗体のいずれかを１０ｍｇ／ｋｇの用量で、本研究の日０に皮下注射によってマウス（ｎ＝５／処置群）に投与した。抗体注射後、日７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、６３および７７にマウスから採血し、ＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００ケミストリー化学システム（ADVIA^(R) 1800 Chemistry System）（シーメンス（Siemens））によって血清中のＬＤＬ−Ｃレベルを決定した。次いで、各処置群の各時点について血清の平均ＬＤＬ−Ｃを計算し、結果を平均ＬＤＬ−Ｃレベル（ｍｇ／ｄＬ）（±ＳＥＭ）として表し、表２１に示す。表２２は、ベースライン（すなわち、日８）からのＬＤＬ−Ｃレベルにおけるパーセント低下を示す。

表２１および２２に示すように、Ｐｃｓｋ９^{ｈｕｍ／ｈｕｍ} Ｌｄｌｒ^＋／−マウスに投与されたヒスチジン置換変異型ＶＫ−Ｌ３０Ｈの１０ｍｇ／ｋｇ単回投与は、測定した全７７日間、ベースラインから３０％を超えるＬＤＬ−Ｃの持続性低下をもたらし、日１４でベースラインから約５２％の最大パーセント低下があった。比較して、コンパレーター２を投与されたマウスは、抗体投与後、日７に達成されたＬＤＬ−Ｃにおける約４０％の最大低下を示したが、しかし、この低下の程度は、抗体投与の１４日後、またはその後のいずれの時点でも明白ではなかった。コンパレーター１の単回投与は、ＬＤＬ−Ｃにおける延長された低下を示したが（日１４でベースラインから約３７％の最大パーセント低下）、しかし、ベースラインからのＬＤＬ−Ｃ低下の程度は、日４２から日７７の実験終了までわずか約９％〜２４％であった。コンパレーター３および４は、いずれもＬＤＬ−Ｃの低下において測定可能な有効性を示さなかったが、血行中の抗体の存在はＥＬＩＳＡによって確認された。

総ヒトＩｇＧ Ｆｃを検出するためＥＬＩＳＡプロトコールを用いて、各処置群のマウスからの循環ヒト抗体のレベルを決定した。試験した処置群の日７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、６３および７７のマウス血清についての平均抗体レベルを計算し、結果を平均総血清抗体レベル（μｇ／ｍＬ）（±ＳＥＭ）として表し、表２３に示した。

コンパレーター２およびコンパレーター４は、それぞれ日２８および７７までに血行から消失し、示した時点の後に、これらの抗体で処置されたマウスの血清サンプルからヒト抗体は検出されなかった。対照的に、ヒスチジン置換変異型抗体（ＶＫ−Ｌ３０Ｈ）で処置されたマウスの血清サンプルならびにコンパレーター１および３では、日７７にヒト抗体が検出された。日７７で、ＶＫ−Ｌ３０Ｈ処置群は、すべての他の処置群と比較してヒト抗体で最も高い測定可能なレベルを有した。

最後に、各処置群のマウスからの血清中のヒトＰＣＳＫ９の総量を各時点で測定した。結果を、平均ヒトＰＣＳＫ９レベル（ｎｇ／ｍＬ）（±ＳＥＭ）として表し、表２４に示す。

本実験では、ヒスチジン置換変異型抗体ＶＫ−Ｌ３０Ｈおよびコンパレーター３で処置されたマウスでは、抗体投与後、総ヒトＰＣＳＫ９レベルは、少なくとも７７日間、２５００ｎｇ／ｍＬより上にとどまった。対照的に、コンパレーター２およびコンパレーター４処置群では、総ＰＣＳＫ９レベルがそれぞれ日２１および４２までに１０００ｎｇ／ｍＬより下に低下した。コンパレーター１処置群の総ＰＣＳＫ９レベルが１０００ｎｇ／ｍＬよりも上に上昇することはなかった。

本発明は、本明細書に記載された特定の実施態様によって範囲を限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されたものに加えて本発明の種々の変更は、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲内に帰属するものとする。

Claims (10)

1. ヒトプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）を結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、ここで：
   （ａ）抗体またはそのフラグメントは、表面プラズモン共鳴によって測定して、酸性ｐＨよりも中性ｐＨで少なくとも１３倍大きな親和性によってＰＣＳＫ９を結合する；
   （ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定して、２５℃でＰＣＳＫ９に結合する該抗体または抗原結合性フラグメントの酸性／中性Ｋ_D比が約１２．５を超える；
   （ｃ）表面プラズモン共鳴によって測定して、２５℃でＰＣＳＫ９に結合する該抗体または抗原結合性フラグメントの酸性／中性Ｋ_D比が約７．５を超える；
   （ｄ）表面プラズモン共鳴によって測定して、２５℃でＰＣＳＫ９に結合する該抗体または抗原結合性フラグメントの酸性／中性ｔ１／２比が約０．１４未満である；
   （ｅ）２５℃および酸性ｐＨで約４．５分未満の解離半減期（ｔ１／２）によってＰＣＳＫ９を結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、２５℃および中性ｐＨで約３５分を超えるｔ１／２によってＰＣＳＫ９を結合する；
   （ｆ）表面プラズモン共鳴によって測定して、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のｔ１／２よりも少なくとも１０倍短いｔ１／２によって酸性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する；または
   （ｇ）酸性ｐＨよりも中性ｐＨで少なくとも１２倍より大きな親和性によってＰＣＳＫ９を結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、中性ｐＨでＰＣＳＫ９に結合する抗体のｔ１／２よりも少なくとも１０倍短いｔ１／２によって酸性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する；
   ここで、酸性ｐＨは６．０またはそれ未満のｐＨを意味し、中性ｐＨは約７．０〜約７．４のｐＨを意味する；
   そしてここで、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、
   該ＨＣＤＲ１が、配列番号：２２０を含み、
   該ＨＣＤＲ２が、配列番号：２２２を含み、
   該ＨＣＤＲ３が、配列番号：２２４または７８８を含み、
   該ＬＣＤＲ１が、配列番号：８０２を含み、
   該ＬＣＤＲ２が、配列番号：２３０を含み、および
   該ＬＣＤＲ３が、配列番号：２３２を含む；
   上記単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
2. 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、酸性ｐＨよりも中性ｐＨで少なくとも１４倍、または少なくとも１５倍大きな親和性によってＰＣＳＫ９を結合する、請求項１の（ａ）に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
3. 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、２５℃および酸性ｐＨで約２分未満、または約１．５分未満の解離半減期（ｔ１／２）によってＰＣＳＫ９を結合し、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、２５℃および中性ｐＨで約３５分を超えるｔ１／２によってＰＣＳＫ９を結合する、請求項１の（ｅ）に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
4. 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、中性ｐＨでｈＰＣＳＫ９に結合する抗体のｔ１／２よりも少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍短いｔ１／２によって酸性ｐＨでＰＣＳＫ９を結合する、請求項１の（ｆ）に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
5. 酸性ｐＨでの抗体またはその抗原結合性フラグメントのＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ遮断ＩＣ₅₀値よりも少なくとも３６倍より小さいＩＣ₅₀によって中性ｐＨで、ＰＣＳＫ９と低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）との間の相互作用を遮断する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
6. 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントを約１０ｍｇ／ｋｇの単回投与で対象に投与したとき、血清ＬＤＬ−Ｃがベースラインから少なくとも３３％低下し、該血清ＬＤＬ−Ｃの低下が、投与後、少なくとも２６日間、または少なくとも３３日間持続する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
7. 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントを約１０ｍｇ／ｋｇの単回投与で対象に投与したとき、血清ＬＤＬ−Ｃがベースラインから少なくとも１５％低下し、該血清ＬＤＬ−Ｃの低下が、投与後、少なくとも４２日間、または少なくとも５５日間持続する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメントであって、
   （ａ）ＨＣＶＲが、配列番号：２１８を含み、そしてＬＣＶＲが、Ｌ３０Ｈのアミノ酸置換を含む配列番号：２２６の変異体を含む；
   または
   （ｂ）ＨＣＶＲが、Ｄ１０６Ｈのアミノ酸置換を含む配列番号：２１８の変異体を含み、そしてＬＣＶＲが、Ｌ３０Ｈのアミノ酸置換を含む配列番号：２２６の変異体を含む；
   上記単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
9. 薬剤に使用するための請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
10. 高コレステロール血症の治療に使用するための、または血清ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させるための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合
    性フラグメント、または請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物。

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