JP6301263B2 - ヒト臍帯組織由来細胞の検出 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、合衆国特許仮出願６１／５７９，７１０（２０１１年１２月２３日出願）に基づく優先権を主張し、当該出願に記載された全ての記載内容を援用するものである。

（発明の分野）
本発明は、治療用細胞による治療を受けた患者からの標本において、ヒト臍帯由来細胞などの治療用同種細胞を検出する方法に関する。

同種細胞療法は、未だ満たされていない多くの医療ニーズの治療に関する有望な新技術である。しかし、細胞療法は特異な療法であり、開発プロセスでは幾つかの特異な課題が生じる。この技術の具体例の一つは、多くの臨床適応のために、ヒト臍帯組織由来細胞（「ｈＵＴＣ」）を開発することである。ｈＵＴＣを患者に投与した後、患者の血液内に検出される細胞の存在及び／又は細胞数を測定することは、細胞治療産物としてのｈＵＴＣの薬物動態に関わる望ましい情報となる。しかし、ｈＵＴＣは患者の血液から得られる細胞に類似の性質を持つことがあるため、ここに課題が生じる。したがって、ｈＵＴＣを他の細胞から区別することが必要となる。

創薬中の臨床試験には、生体内における薬物の吸収、分布、代謝、及び排泄のパラメーターを分析するための薬物動態学的研究が含まれる。被験者における薬物暴露の程度を測定することは、投与薬物動態学的研究の重要な要素である。通常、これは、血液サンプル中の薬物濃度分析を通じて行われる。暴露の程度は、有効性及び安全性の結果との関連において評価される。ｈＵＴＣなどの細胞治療産物の場合、臨床試験でのｈＵＴＣの生体内分布又は薬物動態を研究することには課題が生じる。なぜなら、被験者自身の細胞と、ｈＵＴＣ（又は他の細胞）とを区別する方法が確立されていないからである。そのため、ｈＵＴＣの生物学的利用能性を測定することは困難である。

治療用同種細胞（ｈＵＴＣ等）が血液循環中に存在するかどうかを測定するにあたって、現在において認められているアプローチは、男性ドナーから得られた治療用同種細胞（ｈＵＴＣ等）を用いて、女性の被験者に静脈内輸液をすることが必要である。例えば、Ｂａｄｅｒ， Ｐ．ら、「Ｈｏｗ ａｎｄ ｗｈｅｎ ｓｈｏｕｌｄ ｗｅ ｍｏｎｉｔｏｒ ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ ａｆｔｅｒ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ？」Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００５；３５：１０７〜１１９を参照。Ｄｕｒｎａｍ，ＤＭら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｙ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ，」Ｂｌｏｏｄ，１９８９；７４：２２２０〜２２２６も参照。被験者の血液サンプル中のＹ染色体を検出するためには、リアルタイムＰＣＲが使用され、その結果は、血液サンプル中の治療用同種細胞（ｈＵＴＣ等）の存在又は不存在を示す相対定量又は二値信号を提供する。Ｂａｄｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌを参照。このアプローチでは、臨床試験におけるｈＵＴＣの薬物動態分析から，女性細胞（ｈＵＴＣ等）ドナー及び男性被験者の排除が必要である。そのため、細胞投与後の患者において、ｈＵＴＣ等の同種細胞を検出する方法が未だ必要とされている。

本発明は、ヒト末梢血単核球サンプル中における治療用同種細胞の存在を検出する方法を提供する。本発明は、治療用細胞の核型（ＸＹ対ＸＸ）及び被移植者（患者）の性別による制限を受けることなく、その治療用細胞の検出を可能にする。

本発明の一実施形態は、血液中の治療用同種細胞を検出する方法であって、（ａ）治療用同種細胞及びヒト末梢血単核球を分析して、治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを同定することと、（ｂ）治療用同種細胞による治療を受けた患者から血液サンプルを提供することと、（ｃ）患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上の特異なマーカーを検出する分析方法を使用して、そのサンプルを分析することと、（ｄ）患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上の特異なマーカーの検出に基づき、患者の末梢血単核球と治療用同種細胞とを区別することと、を含む。一実施形態では、患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーには、ＣＤ４５が含まれる。別の方法としては、血液中の治療用同種細胞を検出する方法であって、（ａ）治療用同種細胞及びヒト末梢血単核球を分析して、治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを同定することと、（ｂ）治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーと、患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーとを比較して、治療用同種細胞と患者の末梢血単核球とを区別する特異な１つ又は２つ以上のマーカーを同定することと、（ｃ）治療用同種細胞による治療を受けた患者から血液サンプルを提供することと、（ｄ）治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上の特異なマーカーを検出する分析方法を使用して、そのサンプルを分析することと、（ｅ）１つ又は２つ以上の特異なマーカーの検出に基づき、患者の末梢血単核球と治療用同種細胞とを区別することと、を含む。

この方法は、所望の治療用同種細胞の検出に適している。例えば、治療用同種細胞は、ヒト臍帯組織由来細胞、ヒト臍帯血由来細胞、胎盤由来細胞、間葉系幹細胞由来細胞、肝細胞、膵島細胞、心筋細胞、及び不溶性コラーゲン骨基質細胞からなる群から選択することができる。この方法は、血液サンプル中の２つ以上の種類の治療用同種細胞を検出するために使用してもよい。

これらの方法には、例えばフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、核酸検出、ＰＣＲ、及びそれらの組み合わせなど、多様な分析方法を用いることができる。加えて、これらの方法では、段階（ａ）と（ｂ）との間に濃縮する段階を含めることができる。濃縮する段階には、磁気捕捉技術を含めることができる。区別する段階には、患者に投与した治療用同種細胞と、患者の末梢血単核球とを差別化することが含まれる。患者は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、犬又は豚であってもよい。

本発明は、血液サンプル中の治療用同種細胞を検出する方法に使用できるキットも提供する。このキットには、治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー及び患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを有するマーカープロフィールが含まれてもよい。

本発明の他の実施形態は、血液中のヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、（ａ）ヒト臍帯組織由来細胞及びヒト末梢血単核球を分析して、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及びヒト末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを同定することと、（ｂ）ヒト臍帯組織由来細胞による治療を受けた患者から血液サンプルを提供することと、（ｃ）患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを検出する分析方法を使用して、そのサンプルを分析することと、（ｄ）患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーの検出に基づき、患者の末梢血単核球と治療用同種細胞とを区別することと、を含む。別の方法としては、血液中のヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、（ａ）ヒト臍帯組織由来細胞及びヒト末梢血単核球を分析して、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを同定することと、（ｂ）ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーと、ヒト末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーとを比較して、臍帯組織由来細胞と患者の末梢血単核球とを区別する１つ又は２つ以上の特異なマーカーを同定することと、（Ｃ）ヒト臍帯組織由来細胞による治療を受けた患者から血液サンプルを提供することと、（ｄ）ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上の特異なマーカーを検出するｈ分析方法を用いて、そのサンプルを分析することと、（ｅ）１つ又は２つ以上の特異なマーカーの検出に基づき、患者の末梢血単核球とヒト臍帯組織由来細胞とを区別することと、を含む方法。患者は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、犬又は豚であってもよい。

一実施形態においては、患者の末梢血単核球に対して陽性のマーカーがＣＤ４５であり、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーがＣＤ１０である。他の実施形態においては、患者の末梢血単核球に対するマーカー及びヒト臍帯組織由来細胞に対するマーカーには、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＮＲＰ１、ＣＤ４５、ＬＡＭＰ１、ＤＫＫ３、ＮＲＰ１又はＬＡＭＢ１のうちの１つ又は２つ以上が含まれる。この方法には、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、核酸検出、ＰＣＲ、及びそれらの組み合わせなど、多様な分析技術を用いることができる。ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上の特異なマーカーは、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＮＲＰ１、ＬＡＭＰ１、ＤＫＫ３、ＮＲＰ１、ＬＡＭＢ１及びそれらの組み合わせであってもよい。

この方法には、段階（ａ）と（ｂ）との間に濃縮する段階の実施を更に含めることができる。濃縮する段階は、磁気捕捉技術であってもよい。本発明の他の実施形態は、血液サンプル中におけるヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法に使用するキットであって、これは、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを有するマーカープロフィールを含むキットである。本発明は、本発明の方法とともに使用するシステムも提供する。

本発明の他の実施形態は、血液中のヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、ヒト臍帯組織由来細胞及びヒト末梢血単核球を分析して、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及びヒト末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを同定する段階と、ヒト臍帯組織由来細胞を含む血液サンプルを提供する段階と、血液サンプルからヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分離する段階と、末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０又はＣＤ１３に関するフローサイトメトリーにより、ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析する段階と、ヒト末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０又はＣＤ１３の検出に基づき、ヒト末梢血単核球及びヒト臍帯組織由来細胞の存在を検出する段階と、を含む方法である。

分析する段階には、末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１３に関するフローサイトメトリーにより、ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析することを含んでもよい。別の方法としては、分析する段階に、末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０に関するフローサイトメトリーにより、ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析することを含んでもよい。この方法には、ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析する前に、磁気捕捉技術などの濃縮する段階を実施することを更に含んでもよい。

本発明の他の実施形態は、血液中のヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、ヒト臍帯組織由来細胞を含む血液サンプルを提供する段階と、血液サンプルからヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分離する段階と、血漿を除去する段階と、末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１３に関するフローサイトメトリーにより、ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析する段階と、ヒト末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１３の検出に基づき、ヒト末梢血単核球及びヒト臍帯組織由来細胞の存在を検出する段階と、を含む方法である。この方法には、ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析する前に、磁気捕捉技術などの濃縮する段階を実施することを更に含んでもよい。この方法には、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０の検出を更に含んでもよい。

ヒト臍帯組織由来細胞は、血液が実質的に含まれないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、分化する潜在能力を有する。一実施形態では、ヒト臍帯組織由来細胞が、血液が実質的に含まれないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、かつ以下の特性を有する：（１）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＨＬＡ−ＡＢＣの発現、（２）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１１７の不発現、並びに（３）ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの不発現。別の方法としては、ヒト臍帯組織由来細胞が、血液が実質的に含まれないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、かつ以下の特性を有する。（１）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＨＬＡ−ＡＢＣの発現、（２）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１１７の不発現、（３）ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの不発現、（４）酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質の発現、並びに（４）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞と比較しての、インターロイキン８又はレチクロン１の濃度上昇の発現。

本発明の他の実施形態は、血液中のヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、（ａ）ヒト臍帯組織由来細胞による治療を受けた患者の血液サンプルを提供する段階、（ｂ）ヒト末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを検出する分析方法を使用して、サンプルを分析する段階、（ｃ）ヒト末梢血単核球と、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを区別する段階を含む。一実施形態においては、ヒト末梢血単核球に対して陽性のマーカーがＣＤ４５であり、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーがＣＤ１０である。分析する段階では、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、核酸検出、及び／又はＰＣＲを含んでもよい。この方法には、段階（ａ）と段階（ｈ）との間に濃縮する段階の実施を更に含んでもよい。濃縮する段階は、磁気捕捉技術であってもよい。

本発明の更に他の実施形態は、血液中のヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、（ａ）ヒト臍帯組織由来細胞を含む血液サンプルを提供する段階と、（ｂ）血液サンプルからヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分離する段階と、（ｃ）末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０に関するフローサイトメトリーにより、ヒト末梢血単核球及びヒト臍帯組織由来細胞の分画を分析する段階と、を含む方法である。

本発明の別の実施形態は、血液中のヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、ヒト臍帯組織由来細胞を含む血液サンプルを提供する段階と、血液サンプルからヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分離する段階と、血漿を除去する段階と、末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１３に関するフローサイトメトリーにより、ヒト臍帯組織由来細胞／ヒト末梢血単核球の分画を分析する段階と、を含む方法である。

本発明の他の特徴及び有利点は、以下の「発明を実施するための形態」及び実施例から、明らかとなるであろう。

上記の概要及び本発明の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより深い理解がなされるであろう。本発明を説明する目的のため、図面は本発明の各実施形態を示している。しかしながら本発明は、示される正確な構成、実施例、及び手段に限定されない点は理解されるべきである。
実施例１の試験１で使用した２４のサンプルと、各サンプルの細胞培養齢を示している。特に、図１Ａの表は、マイクロアレイ分析に使用した２４のサンプルを示し、図１Ｂのチャートは、これら２４の各サンプルにおける細胞培養齢を示している。 ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）、及びヒトＰＢＭＣを構成する各種の血液細胞におけるＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）遺伝子の相対的発現を示している。 ｈＵＴＣ、及びヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を構成する各種の血液細胞におけるＭＭＥ（ＣＤ１０）遺伝子の発現に関する比較を示している。 ｈＵＴＣ、及びヒトＰＢＭＣを構成する各種の血液細胞におけるＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）遺伝子の発現に関する比較を示している。 ｈＵＴＣにおける発現がヒトＰＢＭＣにおける発現よりも多量である選択された遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。 ｈＵＴＣにおける細胞表面マーカーの検出のためのフローサイトメトリー分析結果を示している。図４Ａに関して、枠Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１及びＥ１は、無染色対照を示している。枠Ａ２は、ＣＤ１３及び７ＡＡＤを示している。枠Ｂ２は、ＣＤ１０及び７ＡＡＤを示している。枠Ｃ２は、ＮＲＰ１及び７ＡＡＤを示している。枠Ｄ２は、ＣＤ４５及び７ＡＡＤを示している。枠Ｅ２は、ＬＡＭＰ１及び７ＡＡＤを示している。 ヒトＰＢＭＣにおける細胞表面マーカーの検出のためのフローサイトメトリー分析結果を示している。図４Ｂに関して、枠Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１及びＥ１は、無染色対照を示している。枠Ａ２は、ＣＤ１３及び７ＡＡＤを示している。枠Ｂ２は、ＣＤ１０及び７ＡＡＤを示している。枠Ｃ２は、ＮＲＰ１及び７ＡＡＤを示している。枠Ｄ２は、ＣＤ４５及び７ＡＡＤを示している。枠Ｅ２は、ＬＡＭＰ１及び７ＡＡＤを示している。 ＰＢＭＣ及びｈＵＴＣにおける内部マーカーＤＫＫ３及びＬＡＭＰ１を検出するためのフローサイトメトリー分析結果を示している。 フローサイトメトリーを使用して、ヒト血清１ｍｌの存在下で、ｈＵＴＣ（１，５００〜１，７００個／ｍＬの範囲）及びヒトＰＢＭＣ（１００万個／ｍＬ）からなる混合物におけるｈＵＴＣの検出量を示している。 フローサイトメトリーを使用して、ヒト血清１ｍｌの存在下で、ｈＵＴＣ（１，７００〜１１０，０００個／ｍＬの範囲）及びヒトＰＢＭＣ（１００万個／ｍＬ）からなる混合物におけるｈＵＴＣの検出量を示している。

本出願は、患者（例えばヒト）の血液中で循環する前駆細胞などの治療用同種細胞を検出する方法に関する。細胞治療産物の構成要素である前駆細胞又は他の改変細胞は、多数の臨床適応に向けて開発が行われている。例えばｈＵＴＣなど、これらの細胞は、静脈内投与などを通じて患者に投与されている。細胞治療産物としてのこれらの細胞の薬物動態を評価するため、及び治療の効果をより正確に判定するためには、血液中を循環するこれらの細胞の体内動態を判定することが必要である。しかしながら、ヒトの血液は複数種の血液細胞から構成されており、１つ又は２つ以上の種類の血液細胞から発現するタンパク質の幾つかは、前駆細胞又は改変細胞においても発現することがある。更に、被移植者の血液中における大過剰の細胞から、これらの少数の細胞（ｈＵＴＣなど）の検出が可能となるほどに十分な感受性のあるアッセイを開発することが重要である。したがって、ヒト血液の存在下におけるこれらの細胞の検出は、課題として、十分な感受性及び特定性の獲得を必要としている。以上により、ヒト血液細胞から前駆細胞又は改変細胞の同定及び区別を可能とするアッセイに対する必要性が存在している。

Ｉ．定義
ここで使用する「サンプル」とは、所望の分析物を含む可能性のある任意の物質を意味する。サンプルは、全血又は全血構成物などの生体液であってもよい。これには、赤血球、白血球、血小板、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液、及び身体の他の構成物が含まれる。

末梢血単核球を含む血液サンプル中において、本発明の方法を用いて同定可能な細胞を、一般的に、分娩後細胞又は分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）という。更に具体的には、細胞は、「臍由来細胞」、「臍帯由来細胞」（ＵＤＣ）、「臍帯組織由来細胞」（ＵＴＣ）又は「ヒト臍帯組織由来細胞」（ｈＵＴＣ）である。更には、それらの細胞は、幹細胞又は前駆細胞であるとして説明することができ、後者の用語は、広義に使用される。「由来する」という用語は、その細胞が、それらの生物学的起源から得られ、インビトロで、増殖されているか又は他の方法で操作されている（例えば、増殖培地中で培養されて、その集団を増殖させ、及び／又は細胞株を産生する）ことを示すために使用される。臍幹細胞のインビトロ操作、及び本発明の臍由来細胞の独自の特徴が、以下で詳細に説明される。

「幹細胞」は、単一細胞の、自己複製する能力、並びに自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞、及び最終分化細胞を含めた子孫細胞を産生するために分化する能力の双方によって定義される、未分化細胞である。幹細胞はまた、インビトロで、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）から、様々な細胞系統の機能的細胞へと分化する能力によって、並びに、移植後に、複数の胚葉の組織を生じさせる能力、及び胚盤胞内への注射後に、全てではないが殆どの組織に、実質的に寄与する能力によって、特徴付けられる。

幹細胞は、その発達能によって、（１）全能性、（２）多能性、（３）複能性、（４）少能性、及び（５）単能性として分類される。全能性細胞は、全ての胚細胞型及び胚体外細胞型を生じさせることが可能である。多能性細胞は、全ての胚細胞型を生じさせることが可能である。「複能性」細胞には、細胞系統のサブセットで、特定の組織、臓器、又は生理系内の全てを生じさせることが可能であるものが含まれる。例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血球限定の少能性前駆細胞、並びに血液の正常構成要素である全ての細胞型及び成分を含む子孫を生成することができる。「少能性」細胞は、複能性幹細胞より制限された細胞系統サブセットを生じさせることができる。「単能性」細胞は、単一の細胞系統（例えば精子発生幹細胞など）を生じさせることができる。

幹細胞はまた、それらの幹細胞を得ることができる供給源に基づいても分類される。成体幹細胞は、全般的には、複数の分化細胞型を含む組織内に見出される、複能性の未分化細胞である。成体幹細胞は、自己複製することができる。通常の状況下では、成体幹細胞はまた、その細胞が起源とする組織の、特殊化した細胞型、また恐らくは他の組織型を産生するように、分化することもできる。胚幹細胞は、胚盤胞期の胚の内部細胞塊からの、多能性細胞である。胎生幹細胞は、胎児組織又は胎膜を起源とする幹細胞である。分娩後幹細胞は、出産後に入手可能な胚体外組織、すなわち、臍帯を実質的に起源とする、複能性若しくは多能性の細胞である。これらの細胞は、迅速な増殖、及び多くの細胞系統への分化に関する潜在能力を含めた、多能性幹細胞に固有の特徴を保有することが見出されている。分娩後幹細胞は、血液由来（例えば、臍帯血から得られる幹細胞のような）又は非血液由来（例えば、臍帯の非血液組織から得られるような）とすることができる。

培養中の細胞を説明するうえで様々な用語が用いられる。「細胞培養物」とは、全般的には、生体から取得され、制御条件下で増殖される（「培養下」又は「培養される」）細胞を指す。「初代細胞培養物」は、最初の継代培養の前に、生物から直接取得された細胞、組織、又は器官の培養物である。細胞は、細胞の増殖及び／又は分裂を促進する条件下で、増殖培地内に置かれると培養中で「増殖」して、より大きな細胞集団を形成する。細胞を培養中で増殖させる場合、細胞増殖の速度は、細胞の数が倍加するのに必要な時間の量によってしばしば測定される。これは「倍加時間」と呼ばれる。

「細胞系」という用語は、全般的に、初代細胞培養物の１つ又は２つ以上の継代培養物によって形成される細胞集団を意味する。継代培養の各回は、継代数と呼ばれる。細胞が継代培養される場合、細胞が「継代」されたと称する。特定の細胞の集団又は細胞株は、細胞が継代された数によってしばしば呼ばれるか又は特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞集団はＰ１０培養物と呼ばれる場合がある。初代培養、すなわち、組織から細胞を単離した後の最初の培養はＰ０と称される。最初の継代培養の後、細胞は２次培養（Ｐ１又は継代数１）といわれる。２回目の継代培養の後では、細胞は３次培養（Ｐ２又は継代数２）となる、といった具合である。継代の期間中には、多くの集団倍加が存在し得るため、培養物の集団倍加の数は、継代の数よりも大きいことが、当業者には理解されるであろう。それぞれの継代間の期間における細胞の増殖（すなわち、集団倍加数）は、播種密度、支持体、培地、培養条件、及び継代間の時間等を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存する。

「分化」は、特殊化されていない（「分化決定していない」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。「分化した」細胞は、細胞の系統の範囲内で、より特殊化した（「分化決定した」）状態を呈している細胞である。分化プロセスに適用された際の用語「確定した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ったりすることができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。「脱分化」とは、細胞が、細胞系においてより専門化（又は分化決定）されていない位置にまで戻るプロセスのことを指す。ここで使用する「細胞系」は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞から由来したか、またどの細胞を生じさせることができるかを規定する。ある細胞の系統とは、所定の発生及び分化の遺伝体系内にその細胞を位置付けるものである。

広義では、「前駆細胞」とは、それ自身よりも分化した後代を産生する能力を有し、かつ、前駆体のプールを補充する能力も保持する細胞を意味する。その定義によれば、幹細胞自体もまた、最終分化細胞へのより直接的な前駆細胞であるため、前駆細胞である。以下でより詳細に説明されるように、本発明の細胞に言及する場合、この広い意味での前駆細胞の定義を使用することができる。より狭義には、前駆細胞は、分化経路での中間体である細胞として定義される場合が多く、すなわち、前駆細胞は、幹細胞から生じるものであり、成熟細胞型又は細胞型のサブセットを産生する際の中間体である。このタイプの前駆細胞は、全般的には、自己複製が不可能である。したがって、このタイプの細胞が本明細書で言及される場合には、その細胞は、「非複製前駆細胞」又は「中間的前駆体」若しくは「中間的前駆細胞」と称される。

一般的に、「栄養因子」は、細胞の生存、成長、増殖、及び／又は成熟を促進するか、あるいは細胞の活性の増大を刺激する物質として定義される。

ここで使用する「標準成長条件」という用語は、５％のＣＯ_２を含み、相対湿度が約１００％で維持された標準空気中において、３７℃で細胞の培養を行うことをいう。前述の条件は、培養に関して有用であるが、そのような条件は、細胞を培養するための、当該技術分野において利用可能な選択肢を認識する当業者によって、変更することが可能である点を理解されたい。

ここで使用する「分離」という用語は、全般的に、その自然な環境から単離された細胞を指す。この用語には、その自然な環境からの総体的な物理的分離、例えばドナー動物からの除去が含まれる。好ましい実施形態においては、単離細胞は組織内に存在しない。すなわち、細胞は、その細胞が通常は接触している近隣細胞からは分離又は解離されている。好ましくは、細胞は細胞懸濁液として投与される。ここで使用する「細胞懸濁液」という表現は、培地に接触していて、かつ、例えば組織片を穏やかな粉砕にかけることによって、解離されている細胞を含む。

ここで使用する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）という用語は、円形の核を有する任意の血液細胞を含む。代表的な末梢血単核球には、リンパ球、単球及びマクロファージが含まれるが、これらに限定されない。

ＩＩ患者の血液サンプル中の治療用同種細胞の検出方法
本出願は、治療用同種細胞が患者に投与された後に、患者の血液中の治療用同種細胞を検出する方法を提供する。これらの方法は、（ａ）治療用同種細胞による治療を受けた患者の血液サンプルを提供する段階、（ｂ）患者の末梢血単核球（「ＰＢＭＣ」）（例えば、円形の核を有する任意の血液細胞）に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び／又は治療用細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを検出する分析方法を使用して、そのサンプルをを分析する段階、（ｃ）ヒト末梢血単核球と、治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーであってヒト末梢血単核性からは発現しないマーカーとの間で区別する段階を含む。ヒト末梢血単核性に対するマーカーと、治療用細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーであって末梢血単核性からは発現しないマーカーとの間で区別するためには、まず、これらのマーカーを同定する必要がある。そのため、これらの方法には、これらのマーカーを分析する段階も更に含む。本発明の方法は、治療用細胞の核型（すなわち、ＸＹ対ＸＸ）及び患者の性別による制限を受けることなく、その細胞の検出を可能にする。したがって、これらの方法は、性別による制約を受けることなく、かつ、女性患者において男性の治療用同種細胞（ＸＸ）を同定することだけに限定されることもない。

一実施形態においては、本発明は、血液サンプル中のヒト臍帯組織由来細胞を検出又は同定する方法を提供する。これらの方法は、（ａ）ヒト臍帯組織由来細胞による治療を受けた患者の血液サンプルを提供する段階、（ｂ）ヒト末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを検出する分析方法を使用して、サンプルを分析する段階、（ｃ）ヒト末梢血単核球と、ヒト臍帯組織由来細胞とを区別する段階を含む。区別を可能とするには、特異なマーカープロフィールを分析して、特徴的かつ特異なマーカープロフィールを選択できるようにする必要がある。ｈＵＴＣの量を定量化する段階を、更に実施してもよい。一実施形態では、実施例３に示すマーカーを使用してもよい。

他の実施形態では、本発明は、ヒトへの静脈内投与後におけるｈＵＴＣ細胞治療産物の区別及び／又は測定をする方法を記述する。これらの方法は、血液中に通常において存在する細胞、すなわち、末梢血単核球（「ＰＢＭＣ」）と比較したときに、ｈＵＴＣにおいて著しく高いレベルで発現する分子マーカーを同定する。これらの方法は、ｈＵＴＣの同定にあたって特異なマーカープロフィールに依拠するため、ｈＵＴＣの核型（ＸＹ対ＸＸ）及び患者の性別による制限を受けることなく、その細胞の検出を可能にする。これらの方法は、性別の制約を受けることはなく、かつ、男性ｈＵＴＣのみに限定されることもない。したがって、これらの方法は、男性と女性の両方のｈＵＴＣを、男性と女性の両方の対象者において、任意の組み合わせで分析することを可能にする。

本発明の方法は、多様な入手源から得られた患者血液中における治療用同種細胞を区別することに適している。特に、本発明の方法は、被移植者の大過剰な血液の存在下において、少量のｈＵＴＣを検出することに適している。この方法は、哺乳類系に属する任意の構成員に適用でき、ヒト由来のものに限定されない。例えば、本発明の方法は、ヒトにおいてｈＵＴＣなどの治療用同種細胞をＰＢＭＣと区別するために使用することができる。あるいは、この方法は、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、犬又は豚においてｈＵＴＣなどの治療用同種細胞をＰＢＭＣと区別するために使用することができる。

これらの方法は、ｈＵＴＣ及び他の治療用同種細胞をＰＢＭＣから区別することを容易にするとともに、細胞治療産物の投与を受けた対象者における薬物動態の監視を容易にすることができる。

本発明の方法は、細胞治療を受けた患者の血液サンプルにおける治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど）の検出に適している。そのため、本発明の方法は、事前に投与された可能性のある治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど）の検出に適している。本発明の方法は、例えばヒト臍帯組織由来細胞、胎盤由来細胞、間葉系幹細胞及び間葉系幹細胞由来細胞、ｈＵＴＣ、心筋細胞などの治療用細胞、又は特定のタンパク質若しくは所望のタンパク質を発現する標的細胞の検出に適している。これらの方法に使用する他の好適な細胞には、肝細胞、膵島細胞、線維芽細胞、及び不溶性コラーゲン骨基質由来（ＩＣＢＭ）細胞が含まれる。

これらの方法は、細胞治療を受けた患者の血液サンプルにおける２つ又はそれ以上の種類の治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど）の検出にも適している。例えば、これらの方法は、血液サンプル中において、ヒト臍帯組織由来細胞及び胎盤由来細胞の両方を検出するために使用できる。別の方法としては、これらの方法は、血液サンプル中において、ヒト臍帯組織由来細胞及び皮膚線維芽細胞を検出することに使用できる。これらの方法は、血液サンプル中において、ヒト臍帯組織由来細胞、胎盤由来細胞及び皮膚線維芽細胞を検出するためにも使用できる。

Ａ．特徴的かつ特異なマーカープロフィールの同定
本発明の方法には、ＰＢＭＣを含む患者血液サンプル中における治療用細胞（ヒト臍帯組織由来細胞など）の存在に基づき、特徴的かつ特異なマーカープロフィールを同定する段階が含まれる。

この特異なマーカープロフィールを導くには、遺伝子の発現、及び細胞表面マーカーの存在を、その細胞（ヒト臍帯組織由来細胞など）とＰＢＭＣとの間で比較することが必要である。ＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学などのタンパク質を基本とする技術、並びに原位置ハイブリダイゼーションなどの核酸を基本とする技術を含む、複数の技術を、血液中のｈＵＴＣの存在を検出するために使用できる。あるいは、ＰＣＲ技術を使用することもできる。以下の実施例において説明するように、ＰＢＭＣ及び／又は治療用同種細胞における多様な遺伝子の発現レベルは、公開済みの情報源から入手することもできる。

これら多様な遺伝子の発現レベルに基づき、一定の特異なマーカー遺伝子を同定することができる。特に迅速なスクリーニングに適した一実施形態では、マーカーは、細胞表面マーカーである。

以下の実施例において説明するように、ｈＵＴＣに対する分子マーカーは、これらの細胞の発現プロフィールと、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の発現プロフィールとを比較することによって同定することができる。ｈＵＴＣ及びＰＢＭＣの発現プロフィールを比較することにより、血液循環中に通常の場合に存在する細胞と比較したときにｈＵＴＣにおいて非常に高いレベルで発現するマーカー、及び非常に高いレベルでは発現しないマーカーが、各患者について同定される。同定されるマーカーには、ＣＤ４５、ＣＤ１３、及びＣＤ１０が含まれる。ｈＵＴＣ及び循環する細胞の両方が動的な発現レベルを示し得るため、この方法は、ｈＵＴＣと、被移植者の血液中を循環する細胞とを区別することができる複数のマーカーに依存する。

特異なマーカープロフィールは、存在が分析の対象とされている同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを含んでもよい。したがって、ヒト臍帯組織由来細胞を分析する場合、マーカープロフィールには、ｈＵＴＣに対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーが含まれていてもよい。別の方法としては、同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーであって、同種細胞と末梢血単核球とを区別するために十分なマーカーのみを使用して、存在が分析の対象とされている同種細胞を同定してもよい。

ＰＢＭＣにおけるｈＵＴＣの同定に特に有益な一実施形態では、特異なマーカープロフィールには、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＮＲＰ１、ＣＤ４５、ＬＡＭＰ１、ＤＫＫ３、ＮＲＰ１又はＬＡＭＢ１のうち１つ又は２つ以上が含まれる。一実施形態では、特異なマーカープロフィールには、ｈＵＴＣに対する少なくとも１つ又は２つ以上のマーカー特性（例えば陽性）、及びＰＢＭＣに対する少なくとも１つ又は２つ以上のマーカー特性（例えば陽性）（ＣＤ４５など）が含まれる。

同様にＰＢＭＣにおけるｈＵＴＣの同定に特に有益な他の実施形態では、特異なマーカープロフィールには、ｈＵＴＣに対して陽性の１つ又は２つ以上の特異なマーカーであって、末梢血単核球からｈＵＴＣを区別するために十分なマーカーが含まれる。これらの１つ又は２つ以上の特異なマーカーには、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＮＲＰ１、ＬＡＭＰ１、ＤＫＫ３、ＮＲＰ１又はＬＡＭＢ１のうち１つ又は２つ以上が含まれていてもよい。

当業者は、使用するマーカーの選択が、どの技術を使用するかによって異なり得ることを認識するであろう。例えば、マイクロアレイ分析（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨＴ ＨＧ−Ｕ１３３＋ＰＭアレイ）を使用する場合、ＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）、ＬＡＭＰ１及びＬＡＭＢ１では区別をするのに不十分であって、区別をするのに十分なのは他の１つ又は２つ以上のマーカーである場合がある。同様に、ＲＴ−ＰＣＴを使用した場合、ｈＵＴＣとＰＢＭＣとを区別する特異なマーカープロフィールの一部としてＬＡＭＰ１は適切ではないことがあり、区別をするのに十分なのは他の１つ又は２つ以上のマーカーである場合がある。一実施形態では、細胞表面フローサイトメトリーによるｈＵＴＣのスクリーニングに使用する特異なマーカープロフィールには、ＤＫＫ３及びＬＡＭＢ１は含まれない。他の実施形態では、細胞内サイトメトリーにおける特異なマーカープロフィールには、ＬＡＭＰ１及びＤＫＫ３が含まれる。

選択された技術を使用した場合に、ＰＢＭＣサンプルにおいてｈＵＴＣを同定するために好適なマーカーの例を、以下に示す。

したがって、一実施形態では、特異なマーカープロフィールには、ｈＵＴＣに対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーとしてのＣＤ１０、及びＰＢＭＣに対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーとしてのＣＤ４５が含まれる。他の実施形態では、特異なマーカープロフィールには、ｈＵＴＣに対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーとしてのＣＤ１０及び／又はＣＤ１３、並びにＰＢＭＣに対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーとしてのＣＤ４５が含まれる。

分析方法としてフローサイトメトリーを使用する他の実施形態では、ＰＢＭＣにおいてｈＵＴＣを同定するための特異なマーカープロフィールには、末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーとしてのＣＤ１０が含まれる。

本発明の他の実施形態では、ｈＵＴＣとＰＢＭＣとを区別するマーカープロフィールには、フローサイトメトリーを使用した場合において、ＣＤ４５、ＣＤ１０及びＣＤ１３が含まれ、ＣＤ１０及びＣＤ１３はｈＵＴＣに対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーであり、ＣＤ４５はＰＢＭＣに対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーである。

ＰＢＭＣサンプル中において、選択された治療用細胞を同定するために好適なマーカーの例を、以下に示す。

特異なマーカープロフィールは、以下の手順、及び実施例に記載の方法を使用して取得することができる。以下に記載する手順は、特異なマーカープロフィールの取得と、その正確性の確認の両方を含んでもよい。確認する段階にはサンプルの分析を含んでもよい一方で、この段階を、特異なマーカー遺伝子又はタンパク質を検出する特定の手順の正確性及び試験限界を判定するために必要としてもよい。この実施形態では、マーカーを同定するためにフローサイトメトリーを使用してもよい。

特異なマーカープロフィールの取得。複数の情報源に由来するｈＵＴＣの遺伝子発現プロフィールは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨＴ ＨＧ−Ｕ１３３＋ＰＭを使用して作成した。ヒト及びラットのＰＢＭＣ、並びに他の種類の血液細胞の遺伝子発現プロフィールは、公開データベースから入手した。遺伝子発現プロフィールの結果からは、ｈＵＴＣにおいて高度に発現するマーカーのセット、及びヒトＰＢＭＣにおいて高度に発現するマーカーのセットを同定することができる。このようにして、６１の遺伝子が同定された。これらのサブセットについて、更に詳細な研究が行われた。この６１の遺伝子リストから、ｈＰＢＭＣに対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５が、ｈＵＴＣに対して陽性の２つのマーカーとしてのＣＤ１０及びＣＤ１３が同定された。

マーカープロフィールの試験方法の確認。対象者の血液中におけるｈＵＴＣの数は少量であることが予想されるため、上記にて同定したマーカーを使用して、大過剰なヒトＰＢＭＣの存在下における少量のｈＵＴＣを検出及び定量化できるかどうかを判定した。この目的のため、既知の数量のｈＵＴＣが、１ｍｌのヒト血清における約１００万のＰＢＭＣに対して添加された。次に、各サンプルのアリコートについて、ｈＰＢＭＣに対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びｈＵＴＣに対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０又はＣＤ１３に関してフローサイトメトリー分析を行った。細胞は、遠心分離によって収集され、ＰＢＳによって１回洗浄し、次に固定及び透過処理を行った。細胞のアリコートを、以下によって培養した：（１）ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５（Ａｂｅａｍ，Ｃａｔ ＃ ２７２８７）；（２）ＣＤ１０に対するマウスモノクローナル（Ａｂｅａｍ，Ｃａｔ ＃３４１７５）、その後にＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＡｂ（Ａｂｅａｍ，Ｃａｔ ＃６７８５）；及び（３）ＣＤ１３に対するマウスモノクローナル（Ａｂｅａｍ，Ｃａｔ ＃７４１７）、その後にＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＡｂ（Ａｂｅａｍ，Ｃａｔ ＃６７８５）。生細胞のみを次の分析へと通過させる生存性監視のために、各サンプルにはよう化プロピジウム（ＰＩ）を加えた。この手順を用いて、フローサイトメトリーを使用したＣＤ１０、ＣＤ１３及びＣＤ４５を含むマーカープロフィールの試験により、ｈＵＴＣ及びＰＢＭＣを効果的に同定できることが確認された。

一実施形態では、特異なマーカープロフィールは、特異なマーカープロフィールの検査用物質を含むキットの一部として提供してもよい。

特異なマーカープロフィールを同定する段階には、関連する規則に準拠して、特異なマーカープロフィールの正確性及び可能性ある検証内容を確認する段階が含まれてもよい。

Ｂ．患者サンプルの取得
患者サンプルを取得する段階には、患者から血液サンプルを採取する段階が含まれる。上述のとおり、一実施形態においては、患者は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、犬又は豚であってもよい。血液サンプルは、細胞を分離させるために、更に精製又は濃縮してもよい。例えば、一実施形態では、血漿を血液から除去してもよい。血漿は、遠心分離など、当該技術分野において標準的な技術を用いて除去してもよい。

更なる分析に用いた患者サンプル（例えば、分画）には、所望の治療用同種細胞及びその患者の末梢血単核球が含まれる。一実施形態では、患者サンプルには、ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画が含まれる。

一実施形態では、患者サンプルを取得する段階には、ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を、血液サンプルから分離することが更に含まれる。この実施形態には、血漿を除去する段階が更に含まれていてもよい。

他の実施形態では、患者サンプルを取得する段階には、フィコール抽出の使用が含まれる。

Ｃ．患者サンプルの分析
一般的に、分析する段階には、患者の血液サンプルの採取、及び治療用同種細胞（例えば、ｈＵＴＣ）に対する特徴的かつ特異なマーカーの存在に関して当該サンプルへの試験実施が含まれる。分析する段階には、上記のとおり決定された特異なマーカーに基づき、ＰＢＭＣの存在を判定することが含まれていてもよい。例えば、患者サンプルの分析する段階には、治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーについて試験を行う分析方法の使用が含まれる。したがって、分析する段階には、上記のとおり分析された特異なマーカープロフィールに基づき、細胞の存在を検出することが含まれる。別の方法としては、患者サンプルの分析する段階には、治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上の特異なマーカーであって、末梢血単核球からこれらの治療用同種細胞を区別するために十分なマーカーに関して、試験を行う分析方法の使用が含まれる。

一実施形態では、分析する段階には、患者の血液サンプル中において、末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを検出することが含まれる。他の実施形態では、分析する段階には、患者の血液サンプル中において、ｈＵＴＣに対して陽性の１つ又は２つ以上の特異なマーカーであって、ＰＢＭＣからｈＵＴＣを区別するために十分なマーカーを検出することが含まれる。患者の血液サンプルは、ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画とすることができる。

分析する段階は、多様かつ標準的な実験技術を使用して実施することができる。一実施形態では、分析する段階には、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、核酸検出、ＰＣＲ、又はそれらの組み合わせを使用してもよい。

ＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学などのタンパク質を基本とする技術、並びに原位置ハイブリダイゼーションなどの核酸を基本とする技術を含む、複数の技術を、血液中のｈＵＴＣの存在を検出するために使用できる。あるいは、ＰＣＲ技術を、血液サンプル中におけるｈＵＴＣの相対定量を容易にするために使用してもよい。

本発明の好ましい一実施形態では、本発明の方法を、ヒトｈＵＴＣとヒトＰＢＭＣとを区別するために使用する。一実施形態では、特異なマーカープロフィールには、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＮＲＰ１、ＣＤ４５、ＬＡＭＰ１、ＤＫＫ３、ＮＲＰ１又はＬＡＭＢ１のうちの１つ又は２つ以上が含まれ、分析する段階には、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、核酸検出、ＰＣＲ、又はそれらの組み合わせを使用してもよい。他の実施形態では、分析する段階には、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０及び／又はＣＤ１３、並びにヒト末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５を試験するためのフローサイトメトリーが含まれる。他の実施形態では、本発明の方法は、ＰＢＭＣとｈＵＴＣとを区別するために十分な１つ又は２つ以上の特異な陽性のマーカー（ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＮＲＰ１、ＬＡＭＰ１、ＤＫＫ３、ＮＲＰ１又はＬＡＭＢ１など）の存在に基づき、ＰＢＭＣとｈＵＴＣとを区別するために使用される。

Ｄ．任意の濃縮する段階
本発明の方法は、１つ又は２つ以上の濃縮する段階を更に含んでもよい。ここで使用する「濃縮」という用語は、処理済みの分析サンプル中において、非標的物質（ＰＢＭＣなど）に対する標的バイオエンティティー（例えば、治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど））の比率を、当初の生物学的サンプルにおける比率と比較して、大幅に増加させるプロセスを意味する。

特に、治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど）の検出に高めの精度が必要となる場合、患者のサンプルを分析する前に、濃縮する段階が必要となることがある。例えば、濃縮する段階は、血液細胞の数と比較して治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど）の数が少なすぎる場合、又は治療用同種細胞の数が実験技術の検出限界を下回る場合において必要となり得る。濃縮を用いた場合、本発明の方法は、患者の血液中に治療用同種細胞が非常に低い濃度で存在するときであっても、治療用同種細胞の同定及び定量化を可能にするとともに、所与のサンプル中に存在する細胞の定量化を容易にするメカニズムを提供することができる。

１つ又は２つ以上の濃縮する段階には、多様かつ標準的な技術を用いることができる。これらの技術には、濃縮における選択的培地の使用及び特定の種類の細胞枯渇、選択的な付着方法、物理的及び生物学的な細胞分離の方法、濃度勾配電気泳動、遠心分離などが含まれるが、これらに限定されない。濃縮技術の例としては、免疫親和カラム、免疫親和ビーズ、スクロースを通じた遠心分離、又はフィコールグラジエントが挙げられる。

したがって、血液１ｍｌ中におけるｈＵＴＣの数、及びＰＢＭＣ １００万個に対するｈＵＴＣの数によっては、分析の前にｈＵＴＣの分画を分離又は濃縮することが必要となり得る。この目的において、電磁ビーズと接合した抗ＣＤ４５抗体を用いることができる（以下の説明を参照）。

電磁ビーズによる細胞分離
濃縮する段階には、電磁粒子／ビーズによる細胞分離が含まれていてもよい。磁性粒子は、免疫的及びその他生物特異的親和性反応において利用されるように、当該技術分野において周知である。一般には、磁気又は重力分離を容易にする任意の物質がこの目的で利用できる。電磁ビーズを使用した濃縮手順の例は、参照により本明細書に援用する米国特許第７，８６３，０１２号及び米国特許公開出願第２０１１／０１４７１８０号に記載している。

磁性粒子は、寸法に基づいて、大（１．５〜約５０マイクロメートル）、小（約０．７〜１．５マイクロメートル）、又はコロイド状（＜２００ｎｍ）（ナノ粒子とも呼ばれる）に分類できる。第三の物質は、フェロフルード又はフェロフルード様物質としても知られ、古典的なフェロフルードの性質の多くを有し、本明細書においてはコロイド状超常磁性粒子と称する場合もある。

上記の種類の小磁性粒子は、生物特異的親和性反応などの解析に非常に有用であり、生体機能性ポリマー（例えば、タンパク質）でうまく覆われると、非常に大きい表面積をもたらして、適度な反応速度が得られる。約０．７〜１．５マイクロメートルの範囲の磁性粒子は、例として、米国特許第３，９７０，５１８号、同第４，０１８，８８６号、同第４，２３０，６８５号、同第４，２６７，２３４号、同第４，４５２，７７３号、同第４，５５４，０８８号、及び同第４，６５９，６７８号などの特許文献に記載されている。これらの粒子のうち、免疫学的試薬の有用な固体担体となる特定のものが開示される。

磁気分離を実施できる効率、並びに磁気標識された細胞の回収率及び純度は、多くの要因によって決定される。これらの要因には、分離される細胞数、その細胞のレセプター又はエピトープ密度、細胞当たり磁気装荷、磁性物質の非特異的結合（ＮＳＢ）、封入された非標的細胞のキャリーオーバ、用いた手技、容器の性質、容器表面の性質、媒質の粘度、及び使用した磁気分離装置などが挙げられる。通常そうであるように、ある系の非特異的結合の程度が実質的に一定である場合、標的集団が減ると、純度も落ちる。

例として、元の混合物の０．２５％である集団の８０％が回収される、ＮＳＢが０．８％の系では、純度は２５％である。一方、初期集団が０．０１％（１０^６個のバイスタンダー細胞中１個の標的細胞）であり、かつＮＳＢが０．００１％であった場合、純度は８％となる。したがって、試料混合物における標的物質が高純度であれば、標的物質をより特異的かつ効果的に収集することができる。非特異的結合が極低であることは、血液循環中に存在する上皮由来腫瘍細胞などの希少細胞の検出及び解析を容易化するために必要又は有利である。

標的細胞集団（ｈＵＴＣなど）が小さければ小さいほど、磁気標識及び回収が困難になる。更に、標識化及び回収率は、用いる磁性粒子の性質に顕著に左右される。例えば、細胞をＤｙｎａｌ（登録商標）電磁ビーズ（インビトロジェン）などの大磁性粒子とインキュベートすると、効率的に拡散するにはビーズが大きすぎるため、この系の混合によって生じる衝突によって細胞が標識される。したがって、ある細胞が、血液１ｍＬ当たり１個の細胞、又はそれ以下の頻度で集団中に存在する場合、標的細胞の標識率は、系に加えられた磁性粒子の数、及び混合時間の長さに関連する。細胞をそのような粒子と長時間混合することは有害であるため、粒子濃度をできるだけ高めることが必要になる。しかしながら、分離の際、大量の磁性粒子に混入されている希少細胞の代わりに別の血液細胞に混入されている希少細胞を用いるとき、添加できる磁性粒子の量には限界がある。この後者の条件では、対象とする細胞を数え上げる、又はこれらを検査する能力は著しく改善されない。

一実施形態では、濃縮する段階の実施に使用する磁性粒子は、コロイドとしてふるまう。このような粒子は、通常は約２００ナノメートル（ｎｍ）（０．２０マイクロメートル）未満であるマイクロメートル未満の粒径、及び長時間にわたる溶液からの重力分離に対する安定性を特徴とする。多くのその他利点に加え、この寸法範囲により、粒子は、細胞解析に一般的に用いられる解析手法に対して本質的に不可視になる。約９０〜１５０ｎｍの範囲内で、約７０〜９０％の磁気質量を有する粒子は、本発明での使用が意図される。好適な磁性粒子は、磁性コアに結合、例えば、物理的吸収又は共有結合され、安定的なコロイド状特性を付与する分子によって取り囲まれる、超常磁性物質の結晶性コアからなる。コーティング材料は、サンプル中にある生体高分子と磁性コアとの間の非特異的相互作用を阻止するのに有効な量で、好ましくは適用されなくてはならない。これらの生体高分子には、非標的細胞表面上のシアル酸残留物、レクチン、糖タンパク質、及び他の膜構成物などの炭水化物がふくまれ得る。加えて、この材料は、ナノ粒子ごとの磁気質量を可能な限り多く含有しなくてはならない。コアを含む磁性結晶の寸法は十分に小さく、完全な磁区を含有しない。ナノ粒子の寸法は十分に小さく、ブラウンエネルギーが磁気モーメントを超える程である。結果として、Ｎ極、Ｓ極の整列、及び続くこれらコロイド状磁性粒子の相互引力／反発力は、適度に強い磁場であっても起こらないように見え、溶液安定性に寄与している。最後に、磁性粒子は、高磁場勾配外部分離器で分離可能であるべきである。この特徴が、サンプルの取り扱いを容易にし、強電磁ビーズ又はスチールウールが含まれたより複雑な内部勾配カラムに対して、経済的利点をもたらす。上記の特性を有する磁性粒子は、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許第４，７９５，６９８号、同５，５９７，５３１号、及び同５，６９８，２７１号に記載する基材を変更することで生成できる。

小型のナノ粒子（３０〜７０ｎｍ）は拡散が容易であるため、より大型のナノ粒子に比べて、優先的に細胞を標識する。内部勾配カラムなどにおいて、高い勾配を用いたときは、これらの物質の性能には、寸法にかかわらず、大きな違いを生じない。他方で、外部勾配を用いたとき、又はマイクロビーズ若しくはスチールウールカラム上で生成できる、より小さい勾配を用いたときは、細胞上における小型ナノ粒子の占有は重大な影響をもたらす。このことは、ＤＣナノ粒子を分級して、回復時の影響を観察することにより、確定的に示されている。これらの研究及び他の最適化実験に基づき、過度に小型又は大型のナノ粒子を有しないベースコーティングされた磁性ナノ粒子が生成可能である場合に、ナノ粒子を磁気的に又はコラム上で分級する方法が確立された。例えば、ベースコーティングされ、平均直径が１００ｎｍである粒子を生成することができ、これに含まれる８０ｎｍよりも小さい物質、又は１３０ｎｍを超える物質は、微量にとどまった。同様に、約１２０ｎｍの物質を生成することができ、９０〜９５ｎｍよりも小さい物質及び１６０ｎｍを超える物質は、検出できなかった。これらの物質は、回復に関して最適な性能を示し、６０〜７０ｎｍナノ粒子が含有することで準最適な性能を示した。本発明の実施にあたって使用するために好適な粒子寸法の１つは、例えばＢＳＡコーティングされたマグネタイトなど、ベースコーティングされた磁性粒子の場合において、９０〜１５０ｎｍの範囲である。

以上に基づき、所望の細胞サブセットを真核細胞の混合集団（例えば、末梢血単核球における治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど））から分離するために最適な方法は、所望のサブセットが集団全体のうちのごく一部を構成する場合には特に、高磁性、低い非特異的結合かつコロイド磁性の粒子を用いた外場装置による高勾配磁気分離である。このような物質は、その拡散特性から、血中腫瘍細胞などの希少な現象を容易に見つけ出し、磁気標識する。一実施形態では、治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど）を効果的に分析するための磁気分離にあたって、磁性粒子は、治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど）には存在しないエピトープに特異的である必要がある。

電磁ビーズを使用する濃縮する段階には、モノクローナル抗体で標識された磁性ナノ粒子（上記のものなど）の使用が含まれる。これらのモノクローナル抗体には、末梢血単核球を同定する抗体であってもよいが、治療用同種細胞であることはできない。ナノ粒子に付着するモノクローナル抗体は、末梢血単核球に結合し、その後、磁気的方法を用いて分離できる。典型的には、この分離は、高磁性勾配外場分離器の使用を通じて達成できる。磁気的方法による分離をする最適な技術の例は、その開示内容を本明細書に援用する米国特許第６，３６５，３６２号に記載されている。一実施形態では、磁性粒子と結合した抗ＣＤ４５抗体が使用される。別の方法としては、濃縮する段階は、Ｔ細胞を除去するため、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体の使用を含む。

他の実施形態では、濃縮する段階には、治療用同種細胞を同定するモノクローナル抗体が含まれる。更に他の実施形態では、治療用同種細胞はｈＵＴＣであり、抗体は抗ＣＤ１０又はＣＤ１３抗体のうち１つ又は２つ以上を含む。

一実施形態では、本発明の方法には、ｈＵＴＣ及びＰＢＭＣの検出に最適化されたセルサーチシステム（Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ（Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ））の使用が含まれる。

患者サンプル中における治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど）の近似値が不明である場合があるため、本発明の方法は、追加分析を実施するために、十分な患者サンプルを保存する段階を更に含んでもよい。これは、治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど）の存在量が、使用した分析技術の検出限界を下回るために、当初の分析において治療用同種細胞を検出できない可能性がある場合に、特に有用となり得る。したがって、一実施形態では、当初において治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど）が検出されなかった場合、この方法には、患者サンプルの追加分析が更に含まれる。この追加分析には、上述した１つ又は２つ以上の濃縮する段階も含まれる。

Ｅ．患者の血液サンプル中における治療用同種細胞及び末梢血単核球の存在判定
本発明の方法は、末梢血単核球のサンプル中において、治療用同種細胞の存在を判定することを更に含む。当該細胞の存在を判定する段階には、サンプルの分析結果と、上記のとおり分析された特異なマーカーとの比較が含まれ、治療用同種細胞に対する特異なマーカーの存在は、サンプル中における治療用同種細胞の存在を示している。判定の段階には、結果と、ＰＢＭＣに対して上記のとおり同定された特異なマーカーとの比較も含まれていてもよい。したがって、判定の段階には、治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど）に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー及びＰＢＭＣに対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーに関する結果と、上記のマーカープロフィールとを比較することが含まれる。

他の実施形態では、本発明の方法は、末梢血単核球（ヒト又はげっ歯類など）のサンプル中におけるヒト臍帯由来細胞の存在を判定することが含まれる。当該細胞の存在を判定する段階には、サンプルの分析結果と、上記のとおり分析された特異なマーカーとの比較が含まれ、治療用同種細胞に対する特異なマーカーの存在は、サンプル中におけるｈＵＴＣ細胞の存在を示している。判定の段階には、結果と、ＰＢＭＣに対して上記のとおり同定された特異なマーカーとの比較も含まれていてもよい。判定の段階には、上述のとおり、ｈＵＴＣに対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー及びＰＢＭＣに対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーが含まれていてもよい。

判定の段階には、ヒト末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーの検出に基づき、ヒト末梢血単核球とヒト臍帯組織由来細胞とを区別することも含まれる。判定の段階には、患者に投与されたヒト臍帯組織由来細胞と、患者の末梢血単核球とを区別することも含まれる。

細胞の存在を判定する段階には、細胞の定量化も含まれていてもよい。一実施形態では、ｈＵＴＣの存在を判定する段階には、サンプル中におけるｈＵＴＣの数の定量化も含まれる。

存在を判定する段階には、特異なマーカープロフィール（例えば、ｈＵＴＣに対して陽性の１つ以上のマーカー）の存在に基づき、１つ以上のヒト臍帯組織由来細胞を選択することが更に含まれていてもよい。

判定の段階には、ヒト末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０又はＣＤ１３の検出に基づき、ヒト末梢血単核球及びヒト臍帯組織由来細胞の存在を検出することが更に含まれていてもよい。

他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、治療用同種細胞をラットＰＢＭＣから区別することに適する可能性があり、このことは、ラット疾患モデルにおける監視に特に有益であり得る。

一実施形態では、本発明は、血液中におけるｈＵＴＣの同定方法を記述する。この方法は、（ａ）ヒト臍帯組織由来細胞による治療を受けた患者の血液サンプルを提供する段階、（ｂ）ヒト末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを検出する分析方法を使用して、サンプルを分析する段階、（ｃ）ヒト末梢血単核球と、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ以上のマーカーとを区別する段階を含む。ｈＵＴＣの量を定量化する段階を、更に実施してもよい。一実施形態では、実施例３に示す１つ又は２つ以上のマーカーが使用される。

他の実施形態では、本発明の方法は、濃縮する段階に依存することなく、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＰＢＭＣ １００万の存在下における約１，７００／ｍｌ以上のｈＵＴＣを同定することに適している。

ＩＩＩ．血液サンプル中における治療用同種細胞の試験用キット及びシステム
本発明の他の実施形態は、本発明の方法を用いて、血液サンプル中におけるｈＵＴＣなどの治療用同種細胞の存在を試験するためのキットである。

このキットは、特徴的かつ特異なマーカープロフィール、及び１つ又は２つ以上の分析手順に従って特徴的かつ特異なマーカープロフィールを同定するために好適な構成要素を含み得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して特徴的かつ特異なマーカープロフィールを区別するために好適なキットには、特異なマーカープロフィール遺伝子の増幅に好適なＰＣＲプライマーが含まれるであろう。同様に、抗体結合アッセイによる特徴的かつ特異なマーカープロフィールの区別に好適なキットには、マーカーに結合する抗体が含まれるであろう。

一実施形態では、キットは、ＰＢＭＣの集団におけるｈＵＴＣを検出するよう設計されている。他の実施形態では、キットには、特異なマーカープロフィールＣＤ１０、ＣＤ１３及びＣＤ４５、並びにフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、核酸検出、ＰＣＲ又はそれらの組み合わせのうち１つ又は２つ以上を使用してＣＤ１０、ＣＤ１３及びＣＤ４５を同定するための他の好適な構成要素が含まれる。

更に他の実施形態は、ＰＢＭＣの集団における治療用同種細胞（ｈＵＴＣなど）を検出するシステムである。このシステムには、本発明の方法を実施するために必要な部材が含まれる。

ＩＶ．ヒト臍帯組織由来細胞
本発明の方法は、宿主細胞から治療用細胞（例えば、前駆細胞／肝細胞）を区別し得ることが意図されているが、好ましい実施形態では、細胞は、ヒト臍帯組織由来細胞（「ｈＵＴＣ」又は「ＵＴＣ」）とすることができる。有用なヒト臍帯組織由来細胞は、血液が実質的に含まれないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、分化する潜在能力を有する。本発明の方法による同定に好適なｈＵＴＣ及びＵＴＣの集団は、本明細書において以下に詳述するとともに、米国特許第７，５１０，８７３号、同第７，５２４，４８９号、及び米国特許出願第２００５／００５８６３１号にも詳述されている。

Ａ．臍帯組織由来細胞の分離及び増殖
本明細書で説明される方法によれば、哺乳類の臍帯は、満期産若しくは早期産のいずれかの終了時に、又はその直後に、例えば、出産後の圧出の後に回収される。この分娩後組織は、出産場所から、実験室へと、フラスコ、ビーカー、培養皿、又は袋などの、滅菌容器内で移送することができる。この容器は、溶液又は培地を含み得、それらの溶液又は培地としては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ダルベッコ最小必須培地とも呼ばれる）若しくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの、食塩水、又はウィスコンシン大学液若しくはペルフルオロ化合物溶液などの、移植に使用される器官の移送のために使用される、任意の溶液が挙げられるが、これらに限定されない。限定するものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、１種以上の抗生物質及び／又は抗真菌剤を、培地若しくは緩衝液に添加することができる。分娩後組織は、ヘパリン含有溶液などの抗凝固溶液で、すすぐことができる。この組織は、ＵＴＣの抽出の前に、約４〜１０℃に保つことが好ましい。この組織は、ＵＴＣの抽出の前に凍結させないことが、更により好ましい。

ＵＴＣの単離は、好ましくは、無菌環境内で実施される。臍帯は、当該技術分野において既知の手段によって、胎盤から分離することができる。血液及び残滓は、ＵＴＣの単離前に、分娩後組織から除去することが好ましい。例えば、この分娩後組織は、緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水を含むがこれに限定されない）で洗浄することができる。この洗浄緩衝液はまた、１種以上の抗真菌剤及び／又は抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンを含むがこれらに限定されない）も含み得る。

臍帯又はその断片若しくは切片を含む分娩後組織は、機械的な力（細断力又は剪断力）によって脱凝集される。現時点で好ましい実施形態では、この単離手順はまた、酵素消化プロセスも利用する。多くの酵素が、培養下での増殖を促進するための、複合組織マトリックスからの個々の細胞の単離に関して有用であることは、当該技術分野において既知である。弱い消化性（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、及び中性プロテアーゼであるディスパーゼ）から、強い消化性（例えば、パパイン及びトリプシン）の範囲にわたる消化酵素が市販されている。本明細書に適合する酵素の非網羅的なリストとしては、粘液溶解酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、又はエラスターゼなど）、及びデオキシリボヌクレアーゼが挙げられる。メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及び粘液溶解活性から選択される酵素活性が、現時点で好ましい。例えば、コラゲナーゼは、組織から様々な細胞を単離するために有用であることが既知である。デオキシリボヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡを消化することができ、単離中の細胞凝集を最小限に抑えることができる。好ましい方法には、例えばコラゲナーゼ及びディスパーゼで、又はコラゲナーゼ、ディスパーゼ及びヒアルロニダーゼで、酵素処置することが含まれる。特定の実施形態において、コラゲナーゼと中性プロテアーゼディスパーゼの混合物が、この分離する段階に使用される。より具体的な実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来の少なくとも１種のコラゲナーゼ、並びにプロテアーゼ活性のディスパーゼ、及びサーモリシンのいずれかの存在下での消化を採用する。更に別の実施形態では、コラゲナーゼとディスパーゼ両方の酵素活性での消化を採用する。また、コラゲナーゼ活性及びディスパーゼ活性に加えて、ヒアルロニダーゼ活性での消化を含む方法も利用される。様々な組織源から細胞を単離するための、そのような多くの酵素処理が、当該技術分野において既知であることが、当業者には理解されるであろう。例えば、商標名ＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））として販売されている組織解離用酵素配合物が、当該方法での使用に好適である。他の酵素の供給源が既知であり、当業者はまた、そのような酵素を、それらの天然源から直接取得することもできる。当業者はまた、本発明の細胞を単離する際の有用性に関して、新たな、又は追加的な酵素若しくは酵素の組み合せを評価するための設備も、十分に備えている。好ましい酵素処理は、０．５時間、１時間、１．５時間、又は２時間以上の長さである。他の好ましい実施形態では、組織は、この解離する段階の酵素処理の間、３７℃でインキュベートされる。

本発明の一部の実施形態では、分娩後組織は、例えば、胎盤の新生児、新生児／母体、及び母体の態様などの、様々な組織の態様を含む切片へと分離される。次いで、分離された切片は、本明細書で説明される方法にしたがって、機械的解離及び／又は酵素的解離によって解離される。新生児系統又は母体系統の細胞は、当該技術分野において既知の任意の手段によって、例えば、Ｙ染色体に関する、核型分析又は原位置ハイブリダイゼーションによって、同定することができる。

分離された細胞又はＵＴＣが由来する臍組織は、細胞培養を開始又は播種するのに使用することができる。細胞外マトリックス又はリガンド、例えば、ラミニン、コラーゲン（ネイティブ、変性、又は架橋）、ゼラチン、フィブロネクチン、及びその他の細胞外マトリックスタンパク質によりコーティングしていない又はコーティングした組織培養用滅菌容器に単離細胞を移入する。本明細書で開示する培養培地に加えて、ＵＴＣは、細胞の生育を維持することのできる任意の培養培地で培養することができ、これには例えば、ＤＭＥＭ（高又は低グルコース）、アドバンストＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ ２０１、イーグル基本培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）、イスコフ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、及び商標名ＣＥＬＬ−ＧＲＯ−ＦＲＥＥ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ））として販売されている無血清培地（ｓｅｒｕｍ／ｍｅｄｉａ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）などが挙げられるがこれらに限定されない。この培養培地は、例えば、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）；ウマ血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ）；好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ又は２−ＭＥ）；１種以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血球阻止因子（ＬＩＦ）、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；例えば、単独若しくは組み合せでの、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、微生物汚染を制御するための、１種以上の抗生物質並びに／あるいは抗真菌剤を含めた、１種以上の構成成分を添加することができる。培養培地は、下記の実施例で定義される増殖培地を含んでもよい。

細胞は、細胞増殖を可能にする密度で、培養容器中に播種される。好ましい実施形態では、細胞は、ＣＯ_２濃度約０〜約５体積％（空気中）下で培養される。一部の好ましい実施形態では、細胞は、空気中約２〜約２５パーセントのＯ_２で、好ましくは、空気中約５〜約２０パーセントのＯ_２で培養される。細胞は、好ましくは、約２５〜４０℃の温度で培養し、更に好ましくは３７℃で培養する。好ましくは、細胞は、インキュベータの中で培養する。培養容器内の培地は、静的状態とすることができ、又は例えばバイオリアクターを使用して攪拌することもできる。ＵＴＣは、好ましくは、低酸化ストレス下で（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、カタラーゼ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステインを添加して）増殖される。「低酸化ストレス」とは、本明細書で使用するとき、フリーラジカルが培養細胞に損傷を与えないか、又は損傷が最低限に抑えられる条件を指す。

最も適切な細胞培地、培地調製、及び細胞培養技術の選択方法は、当該技術分野において周知であり、Ｄｏｙｌｅら（編）、１９９５年、「Ｃｅｌｌ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ）；Ｈｏ及びＷａｎｇ（編）、１９９１年、「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ」、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（Ｂｏｓｔｏｎ）を含めた、様々な出典で説明され、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。

単離された細胞又は組織断片を、十分な期間にわたって培養した後に、分娩後組織からの遊走、若しくは細胞分裂のいずれか、又は双方の結果として、ＵＴＣが増殖することとなる。本発明の一部の実施形態では、ＵＴＣは、継代され、又は、最初に使用されたものと同じタイプ、若しくは異なるタイプの新鮮培地を収容する、別個の培養容器に取り出され、その細胞の集団は、有糸分裂的に増殖することができる。本発明の細胞は、継代数０と老化との間の任意の時点で、使用することができる。この細胞は、好ましくは、約３回〜約２５回継代され、より好ましくは、約４回〜約１２回継代され、好ましくは、１０回又は１１回継代される。クローニング及び／又はサブクローニングを実行することにより、細胞のクローン集団が単離されていることを確認することができる。

特定の実施形態では、分娩後組織に存在する多種の細胞が、亜集団に分画され、これらの亜集団からＵＴＣを単離することができる。分画又は選択は、細胞分離のための標準的技術を使用して達成することができ、それらの標準的技術としては、分娩後組織をその構成細胞へと解離する酵素処理、その後の特定の細胞型のクローニング及び選択、例えば、形態学的マーカー及び／又は生化学的マーカーに基づく選択；所望される細胞の選択的増殖（正の選択）、不必要な細胞の選択的破壊（負の選択）；例えば大豆凝集素を使用するような、混合集団中での示差的な細胞凝集能に基づく分離；凍結−解凍手順；混合集団中での示差的な細胞付着特性；濾過；従来の遠心分離法及びゾーン遠心分離法；遠心溶出法（対向流遠心分離法）；単位重力分離法；向流分布法；電気泳動；及び蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。クローン選択及び細胞分離技術の概説に関しては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９９４，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。

培養培地は、例えば、必要に応じて、例えばピペットで、皿から培地を慎重に吸引して、新鮮培地を補充することによって変更される。インキュベーションは、十分な数又は密度の細胞が、皿内に蓄積するまで継続される。標準的技術を使用して、又はセルスクレーパーを使用して、元の外移植組織の切片を取り出し、残余の細胞をトリプシン処理することができる。トリプシン処理の後、細胞を収集して、新鮮培地に取り出し、上記のようにインキュベートする。一部の実施形態では、培地は、トリプシン処理の約２４時間後に、少なくとも１回交換して、あらゆる浮遊細胞を除去する。培養下に残存する細胞が、ＵＴＣであると見なされる。

ＵＴＣは、凍結保存することができる。したがって、自家移入に関する（母又は子のいずれかに関する）ＵＴＣは、子供の誕生後に適切な分娩後組織から誘導して、次いで、それらのＵＴＣが後に移植に必要とされる事象で利用可能となるように、凍結保存することができる。

Ｂ．臍帯組織由来細胞の特性
上記のとおり、及び以下の実施例に示すとおり、ｈＵＴＣはＣＤ４５、ＣＤ１３及びＣＤ１０並びにその他のマーカーの存在に基づいてＰＢＭＣと区別が可能であるが、ｈＵＴＣは、他の特異な特性を多様に有している。

ＵＴＣは、例えば、増殖特性（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代数）、核型分析（例えば、正常核型；母体系統又は新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学及び／又は免疫細胞化学（例えば、エピトープの検出に関する）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、及び従来のＰＣＲ））、タンパク質アレイ、タンパク質分泌（例えば、血漿凝固アッセイ又はＰＤＣ−馴化培地の分析によるもの、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるもの）、混合リンパ球反応（例えば、ＰＢＭＣの刺激の尺度として）、及び／又は当技術分野において既知の他の方法によって、特徴付けることができる。

臍組織由来の好適なＵＴＣの例は、２００４年６月１０日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託されており、以下のＡＴＣＣアクセッション番号が割り当てられている：（１）菌株表示ＵＭＢ ０２２８０３（Ｐ７）は、アクセッション番号ＰＴＡ−６０６７が割り当てられ；（２）菌株表示ＵＭＢ ０２２８０３（Ｐ１７）は、アクセッション番号ＰＴＡ−６０６８が割り当てられている。

様々な実施形態では、ＵＴＣは、以下の増殖の特徴のうちの１つ又は２つ以上を保有する：（１）培養下での増殖のためにＬ−バリンを必要とする；（２）約５％〜少なくとも約２０％の酸素を含有する大気中での増殖が可能である；（３）老化に到達する前に、培養下で少なくとも約４０回倍加する潜在能力を有する；（４）コーティングされた、若しくはコーティングされていない組織培養容器上に付着して増殖し、このコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンのコーティングを含む。

特定の実施形態では、ＵＴＣは、その細胞が継代される際に維持される、正常核型を有する。核型分析に関する方法は、当業者に利用可能であり、既知である。

他の実施形態では、ＵＴＣは、（１）組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つの産生；（２）フローサイトメトリーによって検出されるような、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの産生を含めた、特定のタンパク質の産生によって特徴付けることができる。他の実施形態では、ＵＴＣは、フローサイトメトリーによって検出されるような、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの産生の欠如によって、特徴付けることができる。組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンのうちの少なくとも２つを産生する細胞が、特に好ましい。タンパク質組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンの３つ全てを産生するような細胞も、好ましい。

他の実施形態では、ＵＴＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜の骨髄細胞である、ヒト細胞と比べて、インターロイキン８；レチクロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性、α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；腫瘍壊死因子、及びα誘導タンパク質３のうちの、少なくとも１つをコードする遺伝子に関して増大する、遺伝子の発現によって特徴付けることができる。

更に他の実施形態において、ＵＴＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜の骨髄細胞のヒト細胞と比べて、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上狭窄症、ウィリアムズ−ビューレン症候群）；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２由来）；間葉ホメオボックス２（増殖停止特異的ホメオボックス）；ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１（ドロソフィラ）；クリスタリン、α Ｂ；形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ関連アクチベータ２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１の類似体；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）及びシステイン豊富ドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；ｒｕｎｔ関連転写因子３；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ドロソフィラ）；仮定的遺伝子ＢＣ００８９６７；コラーゲン、ＶＩＩＩ型、α１；テネイシンＣ（ヘキサブラキオン）；ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５；へファエスチン；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ホモサピエンスｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４；インテグリン、β７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ；ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２（ドロソフィラ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）；ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリックスタンパク質１；初期成長応答３；ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓホメオボックス５；仮定的タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＩＩ型）；バイグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリン、β様１（ＥＧＦ様リピートドメインを有する）；ホモサピエンスｍＲＮＡ完全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）；仮定的タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）のうちの、少なくとも１つをコードする遺伝子に関して減少する、遺伝子の発現によって特徴付けることができる。

他の実施形態では、ＵＴＣは、培養をしたときに、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ｂ、１３０９、ＭＤＣ ＲＡＮＴＥＳ及びＴＩＭＰＬのうち少なくとも１つの分泌によって特徴付けることができる。さらに、ＵＴＣは、培養をしたときに、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１Ａ及びＶＥＧＦのうち少なくとも１つの分泌の欠如によって特徴付けることができる。

幾つかの好ましい実施形態において、ＵＴＣは、実質的に血液を含まない臍帯組織から誘導され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、増殖のためにＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で増殖可能であり、かつ、次の特性のうち少なくとも１つを含む：培養下で少なくとも約４０回倍加する潜在能力を有する；コーティングされた若しくはコーティングされていない組織培養容器（ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンのコーティングを含む）上に付着して増殖する；ビメンチン及びα−平滑筋アクチンの産生；ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０の産生；並びに、遺伝子の発現が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜の骨髄細胞であるヒト細胞と比べて、インターロイキン８及びレチクロン１をコードする遺伝子に関して増大する。幾つかの実施形態において、そのようなＵＴＣは、ＣＤ４５及びＣＤ１１７を産生しない。

好ましい実施形態では、その細胞は、上記の増殖特性、タンパク質／表面マーカーの産生特性、遺伝子発現特性、又は物質分泌特性のうちの２つ以上を含む。これらの特性のうち３つ、４つ、５つ又はそれ以上を含む細胞が、より好ましい。それらの特性のうちの６つ、７つ、又は８つ又はそれ以上を含むＵＴＣが、更により好ましい。上記特性のすべてを含む細胞が、更に好ましい。

幾つかの態様で本発明と共に使用するために、現時点で好ましい細胞は、とりわけ、上述の特性を有する分娩後細胞であり、より具体的には、それらの細胞が、正常核型を有し、継代で正常核型を維持する場合であり、更には、それらの細胞が、マーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現する場合であり、それらの細胞が、列記されたマーカーに対応する、免疫学的に検出可能なタンパク質を産生する場合である。前述に加えて、フローサイトメトリーによって検出されるような、マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれに対応するタンパク質も産生しないような細胞が、更により好ましい。

一実施形態では、ＵＴＣは、実質的に血液が含まれないヒト臍帯組織由来細胞から単離され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、分化をする潜在能力を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生が欠如しており、ＣＤ１０及びＣＤ１３を発現し、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現をしない。これらのＵＴＣは、酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を任意追加的に発現し、並びに／若しくは、ＣＤ３１又はＣＤ３４を発現せず、並びに／若しくは、ヒト線維芽細胞に比べて、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞に対するインターロイキン８又はレチクロン１の濃度上昇を発現し、並びに／若しくはＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現する。

他の実施形態では、ＵＴＣは、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、分化をする潜在能力を有し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ９０及びＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７及びＨＬＡ−ＤＲを発現しない。任意追加的に、これらの細胞は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない。一実施形態では、細胞は、ＣＤ４４及びＣＤ４３を更に発現する。更に他の実施形態では、細胞は、ＣＤ３１を発現しない。これらのＵＴＣは、（ｉ）酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を任意追加的に発現し、並びに／若しくは（ｉｉ）ヒト線維芽細胞に比べて、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞に対するインターロイキン８又はレチクロン１の濃度上昇を発現する。

他の実施形態では、ＵＴＣが、血液が実質的に含まれないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、かつ以下の特性を有する：（１）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＨＬＡ−ＡＢＣの発現、（２）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１１７の不発現、並びに（３）ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの不発現。他の実施形態では、ＵＴＣが、血液が実質的に含まれないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、かつ以下の特性を有する。（１）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＨＬＡ−ＡＢＣの発現、（２）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１１７の不発現、（３）ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの不発現、（４）酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質の発現、並びに（５）ヒト線維芽細胞との対比で、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞に対するインターロイキン５又はレチクロン１の濃度上昇の発現。

一実施形態では、ｈＵＴＣは、細胞集団として提供され、これらは同質であり得る。幾つかの実施形態では、細胞集団は、不均質であり得る。本発明の不均質な細胞集団は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の、本発明のＵＴＣを含み得る。本発明の不均質細胞集団は更に、幹細胞又はその他の前駆細胞（例えば筋芽細胞又はその他の筋肉前駆細胞、血管芽細胞、又は血管前駆細胞）を含み、あるいは更に、完全に分化した骨格筋細胞、平滑筋細胞、周細胞、又は血管内皮細胞を含み得る。幾つかの実施形態では、集団は実質的に。

更に、以下の実施例、及びあらゆる仕様において用いられる場合、スクリーニング方法を使用して同定できるｈＵＴＣは、米国特許第７，５１０，８７３号、同第７，５２４，４８９号、及び米国特許出願第２００５／００５８６３１号（それらがｈＵＴＣの説明、単離及び特徴付けに関連する限りにおいて、参照により本明細書に援用する）の開示内容に従って、単離及び特徴付けをすることができる。さらに、電磁ビーズを使用した濃縮する段階は、米国特許第７，８６３，０１２号及び米国特許出願第２０１１／０１４７１８０号（それらが濃縮する段階及び電磁ビーズに関連する限りにおいて、参照により本明細書に援用する）に記述されている。

更なる説明を行わずとも、当業者であれば、上記の説明及び以下の例示的な実施例を利用することで、本発明を行い及び使用し、特許請求される方法を実施することが可能であるものと考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであって、本開示の残りの記載をいかなる意味においても限定するものとして解釈されるべきではない。

（実施例１）
ｈＵＴＣの単離、維持及び増殖
ヒト臍帯組織由来細胞は、４人のドナーから単離され、米国特許第７，５１０，８７３号、同７，５２４，４８９４号、及び米国特許出願第２００５／００５８６３１号、並びに以下の実施例に記述するとおり、１５％のウシ胎児血清を補充した増殖培地下で増殖された。初期継代培養は、凍結保存され、それぞれＤＣＢ及びＷＣＢと名付けられた開発セルバンク及びワーキングセルバンクを作成した。生きたｈＵＴＣの培養は、以下の方法のうち１つを使用して維持された。１）組織培養フラスコ中での懸垂培養、並びに２）スピナーフラスコ及び撹拌タンクバイオリアクター中での浮遊培養。細胞は、まず、後者の方法に関して、マイクロキャリア上に播種された。

これら３セットのサンプルに対して、以下のとおりマイクロアレイ分析を行った：（１）試験１（ドナーマイクロアレイ試験）；（２）試験２（温度逸脱試験）；及び（３）試験３（バイオマーカー試験）。

試験１（ドナーマイクロアレイ試験）
このサンプルセットでは、細胞は、スピナーフラスコ内で培養され、初期継代細胞系の集団倍加ＰＤＬ５から開始し、ＰＤＬ４４で終了した。

典型的な培養は、新鮮な増殖培地に、約５×１０^５細胞／ｍｌを播種し、４日間平静にした。このとき、ピーク生存細胞密度（ＶＣＤ約３−４×１０^６細胞／ｍＬ）が達成された。培養物のアリコートを定期的に採取し、全３２のサンプルを得た。下表１−１は、試験のサンプルを列挙している。

細胞の採取は、図１（右側）に示す４日間の増殖日数のうち、任意の日において実施した。３２サンプルのリストから、マイクロアレイ分析に２４を選択した。図１は、集団倍加レベル（ＰＤＬ）及び特定のサンプルが採取されたときの増殖曲線の領域を示している。

試験２（温度逸脱試験）
このサンプルセットでは、細胞は、採取前に、最長１８時間、２５℃〜４２℃の温度範囲で維持された。この試験で使用したサンプルを、下表１−２に示す。

試験３（バイオマーカー試験）
この試験では、８つのサンプルのセットを使用した。細胞は、撹拌タンクバイオリアクターで増殖され、ＰＤＬ３０で採取された。この試験で使用したサンプルを、下表１−３に示す。

データ分析
マイクロアレイデータ生成には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨＴ ＨＧ−Ｕ１３３＋ＰＭアレイを使用した。データは、２段階で分析された。第１段階では、温度逸脱試験（試験２，表１−２）からマイクロアレイデータが生成され、ｈＵＴＣの発現プロフィールと、ヒトＰＢＭＣの発現プロフィールが比較された。ＰＢＭＣにおける多様な遺伝子の発現レベルは、国立衛生研究所が管理する国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースを含む公的な情報源から取得された。第２段階では、試験１から生成されたマイクロアレイデータ、及び試験３（表１−１及び１−３を参照）において生成された８つのサンプルからの保存データを使用した。ｈＵＴＣの発現プロフィールと、（１）ヒトＰＢＭＣ及び（２）ラットＰＢＭＣの発現プロフィールを比較した。ヒトＰＢＭＣの発現プロフィールは健康なヒト被験者から取得され（ＮＣＢＩデータベース試験ＧＳＥ１４６４２）、ラットＰＢＭＣの発現プロフィールはＮＣＢＩデータベース試験ＧＳＥ１１０８３及びＧＳＥ１９５３７から取得された。ヒト血液細胞（Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、リンパＴ細胞、骨髄系単核細胞、及び好中球）のサブタイプにおける発現プロフィールは、ＮＣＢＩデータベース（試験ＧＳＥ２２８８６及び試験ＧＳＥ３９８２）からも取得された。更に、遺伝子オントロジー及びＥｎｔｒｅｚデータベースを検索して、３９７６ヒトプラズマ細胞膜タンパク質遺伝子（ＧＯ：０００５８８６）、３５５細胞表面タンパク質遺伝子（ＧＯ：０００９９８６）及び３４９ ＣＤ抗原遺伝子を同定した。２６１４ヒト及びラットのプラズマ細胞膜タンパク質遺伝子並びに２８８細胞表面タンパク質遺伝子のサブセットを、ヒト及びラットのマイクロアレイ上の遺伝子と適合させるとともに、３１５ ＣＤ抗原遺伝子を、ヒトマイクロアレイと適合させた上で、本試験に含められた。

発現シグナル（すなわち、全データセットにおける高度な発現シグナルの閾値として１０以上のｌｏｇ２（強度））の動態に基づき、両種類のサンプルにおいて高度に発現した２００を超える遺伝子から、３１４のプローブセットのリストが同定された。いずれの場合においても、ｈＵＴＣにおける発現がヒトＰＢＭＣにおける発現よりも劇的に異なっている遺伝子が、選択された上でランク付けされた。表１−４は、試験２で産生した遺伝子であって、ｈＵＴＣにおける発現がヒトＰＢＭＣにおける発現よりも劇的に異なっている遺伝子のリストを示している。これらには、細胞表面及びプラズマ細胞膜タンパク質、並びに細胞内タンパク質が含まれる。

表１−４では、３つのサンプルセットすべてにおいて同定された遺伝子には、下線が引かれている。より詳細な検査を行った遺伝子は、太字で表示している（これらには、ＤＫＫ３、ＬＡＭＢ１、ＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）、ＬＡＭＰ１（ＣＤ１０７ａ）、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）、ＭＭＥ（ＣＤ１０）及びＮＲＰ１が含まれる）。

表１−５は、ｈＵＴＣにおける発現レベルがヒトＰＢＭＣにおける発現レベルよりも大きく異なっている遺伝子（試験１及び試験２において産生）のリストを示している。表１−５では、下線は３つのサンプルセット全て（すなわち、試験１、２及び３）において同定された遺伝子を示している（これらは、ＬＡＭＢ１、ＤＫＫ３及びＣＡＰ２を含む）。より詳細な検査を行った遺伝子は、太字で表示している（これらには、ＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）、ＬＡＭＰ１（ＣＤ１０７ａ）、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）、ＭＭＥ（ＣＤ１０）及びＮＲＰ１が含まれる）。

表１−５に示されるとおり、試験２及び３を構成するサンプルセットの分析により、１１の遺伝子が同定された。このうち３つの遺伝子は、全サンプルセットにおいて同定された。これらの１１の遺伝子のうち、７つの遺伝子（ＮＲＰ１、ＤＫＫ３、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＢ１，ＭＭＥ（ＣＤ１０）、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）及びＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３））について、更に詳細な検討を行った。

これらの７つの遺伝子のうち、ＮＲＰ１、ＤＫＫ３、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＢ１及びＭＭＥ（ＣＤ１０）は細胞表面マーカーであり、発現したタンパク質であるＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）及びＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）は細胞内に局在していた。３つの遺伝子、すなわちＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）（遺伝子ＩＤ ＃２０７２３８）、ＭＭＥ（ＣＤ１０）（遺伝子ＩＤ ＃２０３４３４）及びＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）（遺伝子ＩＤ ＃２０２８８８）について、ｈＵＴＣにおける発現レベルと、ＰＢＭＣである多様なヒト血液細胞における発現レベルが比較された。細胞表面タンパク質遺伝子であるＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）、ＭＭＥ（ＣＤ１０）及びＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）の、ｈＵＴＣにおける発現と、ＰＢＭＣである多様なヒト血液細胞における発現との比較は、図２Ａ、Ｂ及びＣにそれぞれ示されている。

（実施例２）
同定されたマーカーのＲＴ−ＰＣＲによる確認
ｈＵＴＣ及びヒトＰＢＭＣにおける選択された遺伝子であって、実施例１で同定された遺伝子の転写レベルが、ＲＴ−ＰＣＲによって確認された。選択された遺伝子であって、そのｈＵＴＣにおける発現とヒトＰＢＭＣにおける発現とが比較された遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ結果は、図３に示されている。

これらの結果を得るために、各ｈＵＴＣ調製物からの全ＲＮＡが単離され、その後、これからｃＤＮＡが調製された。次に、ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、各遺伝子に特異的な蛍光プローブを、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施するために使用した。

図３は、ｈＵＴＣ及びＰＢＭＣにおけるＭＭＥ（ＣＤ１０）、ＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）、ＤＫＫ３、ＬＡＭＢ１、ＮＲＰ１、ＧＡＰＰＤ及びＨＰＲＴ１に関するＲＴ−ＰＣＲの結果を示している。ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨ及びＨＰＲＴを例外として、試験対象としたすべての遺伝子が、ヒトＰＢＭＣと比較して、ｈＵＴＣにおいて豊富に存在することが示された。陰性対照として使用され、ヒトＰＢＭＣにおいて高度に発現することが知られているＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）の発現のみが、ＰＢＭＣの場合と比較して、ｈＵＴＣにおいて豊富ではなかった。図３に関して、ＣＴ値が高いことは、転写量が少ないことを示している。

ＰＢＭＣは多種の血液細胞によって構成されているため、これら多様な各細胞において発現した遺伝子のうち、選択した遺伝子の遺伝子発現プロフィールについて、ｈＵＴＣにおける遺伝子発現プロフィールと比較をした。図２Ｂに示されるとおり、ＰＢＭＣにおけるＭＭＥ（ＣＤ１０）の相対的発現は、ｈＵＴＣにおける場合と比較して低かったが、好中球におけるその相対的発現は高かった。同様に、ｈＵＴＣにおけるＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）の発現はＰＢＭＣにおける場合と同等であったが、Ｔ細胞及びマクロファージにおけるその相対的発現は、ｈＵＴＣにおける場合よりも高かった。

（実施例３）
ＰＢＭＣにおけるｈＵＴＣのフローサイトメトリーによる検出
ｈＵＴＣ及びヒトＰＢＭＣにおいて示差的発現を示した遺伝子のリスト（表１−４及び１−５を参照）からは、細胞表面及び／又はプラズマ細胞膜上で遺伝子産物を発現する５つの遺伝子サブセットが選択された。更に、細胞内で対応するタンパク質産物を発現する２つの遺伝子が選択された。これらのマーカーには、ＮＲＰ１、ＤＫＫ３、ＬＡＭＢ、ＬＡＭＰ１、ＭＭＥ（ＣＤ１０）、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）及びＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）が含まれていた。

フローサイトメトリー分析に関して、細胞は、指数増殖期において採取され、その後、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入したキットを使用して固定及び透過処理が行われた。ｈＵＴＣの表面上に存在するとして同定された選択済みマーカー（すなわち、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４５、ＮＲＰ１及びＬＡＭＰ１）に対する抗体をもって、この調製物のアリコートを培養した。過剰な抗体を除去した後、細胞を、蛍光標識された二次抗体をもって培養した。次に、細胞を、フローサイトメーターによって分析した。

細胞表面、プラズマ細胞膜及び細胞内マーカーの検出のためのフローサイトメトリー分析結果は、図４Ａから４Ｃに示されている。図４Ａは、上部パネルを対照として、ｈＵＴＣを使用して試験をした細胞表面マーカーを示している。図４Ｂは、上部パネルを対照として、ＰＢＭＣを使用して試験をした細胞表面マーカーを示している。図４Ｃは、ＰＢＭＣ及びｈＵＴＣにおける内部マーカーＤＫＫ３及びＬＡＭＰ１を検出するためのフローサイトメトリー分析結果を示している。

図４Ａに関して、ｈＵＴＣ集団の９０％がＣＤ１３に対して陽性（ＣＤ１３^＋）であると観察され、ｈＵＴＣ集団の７５％がＣＤ１０に対して陽性（ＣＤ１０^４）であると観察され、ｈＵＴＣ集団の１７％がＮＲＰ１に対して陽性（ＮＲＰ１^＋）であると観察された。ｈＵＴＣ集団のいずれも、ＣＤ４５又はＬＡＭＰ１に対して陽性であるとは観察されなかった。

図４Ｂに関して、ＰＢＭＣ集団の６％がＣＤ１３に対して陽性（ＣＤ１３^＋）であると観察され、ＰＢＭＣ集団の２％がＣＤ１０に対して陽性（ＣＤ１０^＋）であると観察され、ＰＢＭＣ集団の４％がＮＲＰ１に対して陽性（ＮＲＰ１^＋）であると観察され、ＰＢＭＣ集団の７２％がＣＤ４５に対して陽性（ＣＤ４５^＋）であると観察された。ＰＢＭＣ集団のいずれも、ＬＡＭＰ１に対して陽性であるとは観察されなかった。

図４Ｃは、細胞内マーカーＤＫＫ３及びＬＡＭＰ１に関するフローサイトメトリーデータを示している。ｈＵＴＣ集団の５２％が、ＤＫＫ３陽性であると観察された。ＰＢＭＣ集団の２３％が、ＤＫＫ３陽性であると観察された。図４Ｃは、ＬＡＭＰ１がｈＵＴＣの内部マーカーとして有効であることを示している。

ＮＲＰ１を例外として、細胞表面タンパク質遺伝子マーカーは、血清中にＰＢＭＣを含む混合サンプルにおいて、完全かつ生存するｈＵＴＣの検出に使用することができた（図４Ａ及び４Ｂを参照）。ＮＲＰ１は、ヒトＰＢＭＣにおける転写レベルに比較して、ｈＵＴＣにおいて高い転写レベルを示したが（図３）、ＮＲＰ１はフローサイトメトリーによってはｈＵＴＣにおいて検出できなかった（図４Ａを参照）。ＣＤ４５に関して、予期されたとおり、ヒトＰＢＭＣの表面においてのみ高レベルのＣＤ４５が発現した（図４Ｂを参照）。更に、ヒトＰＢＭＣにおける場合と比較してｈＵＴＣにおいて高い発現を示す２つの細胞内マーカーである、ＬＡＭＰ１及びＤＫＫ３（特異的に発現した遺伝子のリストから、表１−４）も分析された（図４Ｃを参照）。これらのマーカーは、ｈＵＴＣの同一性を追加確認するために使用することができる。

フローサイトメトリーによって分析されたｈＵＴＣとヒトＰＢＭＣとの差異は、下表３−１に示されている。

下表３−２は、上記実施例２におけるＲＴ−ＰＣＲ及び本実施例におけるフローサイトメトリーにより分析したｈＵＴＣとＰＢＭＣとの差異を要約している。表３−２において、ＮＤは「判定せず」を意味する。

（実施例４）
ｈＵＴＣ及びヒトＰＢＭＣの混合物におけるｈＵＴＣの検出
血液中のｈＵＴＣの検出を実証するため、様々な濃度を１００万のヒトＰＢＭＣと混合した。この混合物を、ＣＤ４５（ＰＢＭＣに対して陽性のマーカー）、ＣＤ１０及びＣＤ１３（ｈＵＴＣに対して陽性のマーカー）を使用してフローサイトメトリーにより分析した。特に、ｈＵＴＣ（１，５００細胞／ｍｌから１１０，０００細胞／ｍＬまでの範囲）及びヒトＰＢＭＣ（１００万細胞／ｍＬ）を含む混合物中におけるｈＵＴＣの検出は、図５Ａ及び５Ｂに示されている。

２種類の細胞は、室温にて、ヒト血清１ｍｌ中で混合された。その後、すみやかに、ｈＵＴＣに対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０、及びＰＢＭＣに対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５を使用して、フローサイトメトリーによって混合物のアリコートを分析した。図５Ａでは、ｈＵＴＣの濃度は１，５００から１，７００細胞／ｍｌの範囲内にあり、ヒトＰＢＭＣの濃度は１００万細胞／ｍｌの範囲内にあった。図５Ｂでは、ｈＵＴＣの濃度は１，７００から１１０，０００細胞／ｍｌの範囲内にあり、ヒトＰＢＭＣの濃度は１００万細胞／ｍｌの範囲内にあった。

図５Ａに示されるとおり、サンプル中、１００万のヒトＰＢＭＣの存在下において１，７００／ｍｌ以上のｈＵＴＣが含まれる場合、フローサイトメトリーを使用した判定の精度は高い（Ｒ^２＝０．９４）。図５Ａに示されるとおり、サンプル中、１００万のヒトＰＢＭＣの存在下において、１，５００から１，７００／ｍｌ以上のｈＵＴＣが含まれる場合（図５Ｂ）、フローサイトメトリーを使用した判定の精度は低くなる（Ｒ^２＝０．５１）。

（実施例５）
ｈＵＴＣの単離
臍細胞の単離。臍帯は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から得た。それらの組織は、正常分娩の後に得たものであった。細胞単離プロトコルを、層流フード内で、無菌的に実行した。血液及び残滓を除去するため、ペニシリン１００単位／ｌｍ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ、及びアンホテリシンＢ ０．２５μｇ／ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在下において、臍帯をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で洗浄した。

次いで、それらの組織を、１５０ｃｍ^２の組織培養プレート内で、５０ｍＬの培地（ＤＭＥＭ−低グルコース又はＤＭＥＭ−高グルコース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で、組織が微細なパルプ状に細断されるまで機械的に解離させた。細断した組織を、５０ｍＬのコニカルチューブに移した（チューブ１本当り組織約５グラム）。

次に、ＤＭＥＭ−低グルコース培地又はＤＭＥＭ−高グルコース培地（それぞれペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ、及びアンホテリシンＢ ０．２５μｇ／ｍＬを含む）、及び消化酵素にて、細胞を消化した。一部の実験では、コラゲナーゼとディスパーゼとの酵素混合物を使用した（「Ｃ：Ｄ」）（ＤＭＥＭ−低グルコース培地において、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５００単位／ｍｌ；及びディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０単位／ｍＬ）。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ及びヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）を使用した（ＤＭＥＭ−低グルコースにおいて、Ｃ：Ｄ：Ｈ＝コラゲナーゼ、５００単位／ｍｌ；ディスパーゼ、５０単位／ｍｌ；及びｈｙａｌｕｒヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５単位／ｍｌ）。これらの組織、培地、及び消化酵素を入れたコニカルチューブを、２２５ｒｐｍの軌道振盪器（Ｅｎｖｉｒｏｎ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ）内で、３７℃で２時間インキュベートした。

消化の後、１５０ｘｇで５分間、組織を遠心分離して、上清を吸引した。ペレットは２０ｍｌの増殖培地において再懸濁された（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；既定のウシ胎児血清；ロット番号ＡＮＤ１８４７５；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、及びアンホテリシンＢ ０．２５μｇ／ｍｌ（それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから））。細胞懸濁液を７０μｍのナイロン製ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に通して濾過した。増殖培地を含む、追加の５ｍＬの洗液を、濾過器に通過させた。次いで、その細胞懸濁液を、孔径４０μｍのナイロン製細胞濾過器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に通過させ、続いて、増殖培地の洗液を追加で５ｍＬ通過させた。

この濾液を、増殖培地（総容積５０ｍｌ）中に再懸濁させ、１５０ｘｇで５分間、遠心分離した。上清を吸引して、５０ｍｌの新鮮増殖培地中に、細胞を再懸濁させた。この過程を更に２回繰り返した。

最終的な遠心分離の後に、上清を吸引して、５ｍｌの新鮮増殖培地中に、細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー染色を使用して、生存細胞の数を判定した。次いで、標準条件下で、細胞を培養した。

臍帯から単離した細胞を、上述のような抗生物質／抗真菌剤添加した増殖培地中で、ゼラチンコーティングＴ−７５ｃｍフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上に、５，０００個／ｃｍ^２で播種した。２日後、消費した培地及び未付着の細胞を、フラスコから吸引した。ＰＢＳで付着細胞を３回洗浄して、残渣及び血液由来細胞を除去した。次いで、細胞に、増殖培地を補充して、コンフルエンスまで増殖させ（継代数０から約１０日）、継代数１とした。その後の継代（継代数１から継代数２へ、など）の際には、細胞は、４、５日でサブコンフルエンス（７５〜８５％コンフルエンス）に到達した。これらの後続の継代に関しては、細胞を、５，０００細胞／ｃｍ^２で播種した。細胞は、３７℃、二酸化炭素５％、かつ、加湿した培養器内で増殖された。

幾つかの実験では、細胞は、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（２．５ｍｇ／ｍｌ、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ３；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，．ＩＮ）及びヒアルロニダーゼ（５単位／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）による消化後、ＤＭＥＭ−低グルコース培地において、分娩後組織から単離された。組織の消化、及び細胞の単離は、上記の他のプロテアーゼ消化に関する説明と同様であるが、Ｃ：Ｄ又はＣ：Ｄ：Ｈ酵素混合物の代わりに、ＬＩＢＥＲＡＳＥ／ヒアルロニダーゼ混合物を使用した。ＬＩＢＥＲＡＳＥを使用する組織の消化は、分娩後組織から、容易に増殖する細胞集団の単離をもたらした。

種々の酵素の組み合せを使用して、臍帯から細胞を単離するための手順を比較した。消化に関して比較する酵素には、ｉ）コラゲナーゼ；ｉｉ）ディスパーゼ；ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ；ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ：Ｄ）；ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）；ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）；ｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）を含めた。これらの種々の酵素消化条件を使用して、細胞単離の差異を観察した（表５−１を参照）。

種々の手法によって臍帯から細胞のプールを単離するために、他の試みを行なった。一例では、臍帯を薄切りにして、増殖培地で洗浄し、血餅及びゼラチン状物質を取り除いた。血液、ゼラチン状物質、及び増殖培地の混合物を収集して、１５０ｘｇで遠心分離した。ペレットを再懸濁させ、ゼラチンコーティングされたフラスコ上に、増殖培地中で播種した。これらの実験から、容易に増殖する細胞集団が単離された。

細胞はまた、ＮＤＲＩから入手した臍帯血サンプルからも単離されている。単離プロトコルは、Ｈｏらの国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ第２００２／０２９９７１号に記載するものを使用した。臍帯血（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ）のサンプル（それぞれ５０ｍｌ及び１０．５ｍｌ）は、溶解用緩衝液（フィルター殺菌済み１５５ｍＭの塩化アンモニウム、１０ミリモルの重炭酸カリウム、ｐＨ ７．２に緩衝された０．１ｍＭのＥＤＴＡ（全要素はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから））と混合された。１：２０の、臍帯血と溶解緩衝液との比率で、細胞を溶解させた。得られた細胞懸濁液を、５秒間ボルテックス攪拌して、周囲温度で２分間インキュベートした。この溶解液を、遠心分離した（２００ｘｇで１０分間）。細胞ペレットは、１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ ＵＴ）、４ｍＭのグルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む完全最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）において再懸濁された。再懸濁した細胞を、遠心分離して（２００ｘｇで１０分間）、上清を吸引し、完全培地中で細胞ペレットを洗浄した。Ｔ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（ＮＹ））、Ｔ７５ラミニンコーティングフラスコ、又はＴ１７５フィブロネクチンコーティングフラスコ（双方ともＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））内に、細胞を直接播種した。

細胞集団が種々の条件下で単離され、単離の直後に様々な条件下で増殖することが可能か否かを判定するために、上記の手順に従って、０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を有する増殖培地中、又は有さない増殖培地中で、Ｃ：Ｄ：Ｈの酵素の組み合せを使用して、細胞を消化させた。全細胞は、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの存在下において増殖された。全ての試験条件下で、細胞は、継代数０〜１の間でにおいて、良好に付着して増殖した（表４−２）。条件５〜８及び条件１３〜１６の細胞は、播種の後、継代数４まで良好に増殖することが実証され、その時点で、それらの細胞を凍結保存した。

Ｃ：Ｄ：Ｈの組み合せが、単離の後の、最良の細胞収量をもたらし、他の条件よりも、多くの世代にわたって培養下で増殖する細胞を生じさせた（表５−１）。コラゲナーゼ又はヒアルロニダーゼを単独で使用しても、増殖可能な細胞集団は得られなかった。この結果が、試験したコラゲナーゼに特異的なものであるか否かを判定する試みは、行なわなかった。

細胞は、酵素消化及び増殖に関して試験した全ての条件下で、継代数０〜１の間に、良好に付着して増殖した（表５−２）。実験条件５〜８及び実験条件１３〜１６の細胞は、播種の後、継代数４まで良好に増殖し、その時点で、それらの細胞を凍結保存した。全細胞は、更なる分析のために凍結保存された。

有核細胞が付着し、急速に増殖した。これらの細胞は、フローサイトメトリーによって分析したところ、酵素消化によって得られた細胞と同様であった。

これらの調製物は、赤血球及び血小板を含有するものであった。最初の３週間は、有核細胞が付着及び分裂することはなかった。播種の３週間後に、培地を交換したが、細胞の付着及び増殖は観察されなかった。

酵素併用コラゲナーゼ（メタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）及びヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を破壊する粘液溶解酵素）を効果的に使用して、臍組織から細胞集団を単離することができた。コラゲナーゼと中性プロテアーゼとの配合物であるＬＩＢＥＲＡＳＥも使用することができる。コラゲナーゼ（４ Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｇ）及びサーモリシン（１７１４カゼイン単位／ｇ）である、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ３もまた、細胞を単離するために、ヒアルロニダーゼと共に使用した。これらの細胞は、ゼラチンコーティングされたプラスチック上の増殖培地中で培養した場合、多数回の継代にわたって、容易に増殖した。

細胞はまた、臍帯内の残留血液からも単離されたが、臍帯血からは単離されなかった。使用した条件下で付着及び増殖する、この組織から洗い流された血餅中の細胞の存在は、解剖プロセス中に細胞が遊離することによるものである可能性がある。

（実施例６）
細胞の核型分析
細胞療法に使用される細胞株は、好ましくは、均質であり、いずれの汚染性の細胞型も含まない。細胞治療に使用されるヒト細胞は、通常の構造を有する染色体を通常数４６において有していなければならない。均質であり、かつ、非分娩後組織起源の細胞を含まない、臍由来細胞株を同定するために、細胞サンプルの核型を分析した。

新生男児の分娩後組織由来のＵＴＣを、増殖培地中で培養した。新生男児由来の分娩後組織（Ｘ，Ｙ）を選択することにより、新生児由来細胞と母体由来細胞（Ｘ，Ｘ）との識別が可能となった。細胞を、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））内の増殖培地中に、５，０００細胞／平方センチメートルで播種し、８０％の集密度まで増殖させた。細胞を収容するＴ２５フラスコは、首部分まで増殖培地で充填した。臨床細胞遺伝学研究所に、急送便でサンプルを配送した（研究所間の推定輸送時間は、１時間である）。染色体分析は、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪに所在するＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓが実施した。細胞は、染色体が最も良好に可視化される、分裂中期の間に分析した。計数した分裂中期の２０個の細胞のうち、５個の細胞を、正常の均質な核型の数（２）に関して分析した。細胞サンプルは、２つの核型が観察された場合には、均質として特徴付けられた。細胞サンプルは、３つ以上の核型が観察された場合には、不均質として特徴付けられた。不均質な核型の数（４）が識別された場合、更なる分裂中期細胞を計数して、分析した。

染色体分析に送付した全細胞サンプルは、細胞遺伝学研究所のスタッフによって、通常の外観を有していると解釈された。分析された１６の細胞株のうちの３つは、新生児起源及び母体起源の双方に由来する細胞の存在を示す、不均質な表現型（ＸＸ及びＸＹ）を呈した（表６−１）。各細胞サンプルは、均質であると特徴付けられた。（表６−１）。

染色体分析は、臨床細胞遺伝学研究所によって解釈されるように、核型が正常を表す臍由来細胞を同定した。核型分析はまた、均質な核型によって判定されるように、母体細胞を含まない細胞株も同定した。

（実施例７）
細胞表面マーカーのフローサイトメトリー評価
フローサイトメトリーによる、細胞表面タンパク質又は「マーカー」の特性評価を使用して、細胞株の同一性を判定することができる。この発現の一貫性は、複数のドナーから、並びに種々の処理及び培養条件に曝された細胞内で、判定することができる。臍から単離された分娩後細胞株を、フローサイトメトリーによって特徴付けることにより、これらの細胞株の同定に関するプロファイルが提供された。

血漿処理されたＴ７５、Ｔ１５０、及びＴ２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）内で、細胞をコンフルエンスまで培養した。２％（ｗ／ｖ）のゼラチン（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を、室温で２０分間インキュベートすることによって、これらのフラスコの増殖表面をゼラチンでコーティングした。

フラスコ内の付着細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＭＯ）中で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して剥離させた。細胞を回収して遠心分離し、１×１０^７個細胞／ｍＬの濃度で、３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ／ＰＢＳに再懸濁した。製造元の仕様書に従って、１００μＬの細胞懸濁液に、目的の細胞表面マーカーに対する抗体（下記参照）を添加し、その混合物を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離することにより、非結合の抗体を除去した。５００μＬのＰＢＳ中に、細胞を再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ計器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して実行した。

細胞表面マーカーに対する以下の抗体を使用した。

臍由来細胞を、継代数８、１５、及び継代数２０で分析した。

ドナー間の差異を比較するため。異なるドナーから得られた臍帯由来細胞を比較した。更に、ゼラチンコーティングフラスコ上で培養した臍由来細胞を、非コーティングフラスコ上で培養した臍由来細胞と比較した。

細胞の単離及び調製に関して使用される、４つの処理を比較した。１）コラゲナーゼ；２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ；３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ；４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼを使用する処理によって、分娩後組織から得られた細胞を比較した。

フローサイトメトリーによって分析された、継代数８、１５、及び２０での臍帯由来細胞は、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、このことは、ＩｇＧ対照と比較しての蛍光の増大によって示された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性であり、このことは、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示された。

フローサイトメトリーによって分析された、別個のドナーから単離された臍帯由来細胞のそれぞれは、ＩｇＧ対照と比較しての蛍光値の増大に反映される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生について陽性を示した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。

ゼラチンコーティングフラスコ及び非ゼラチンコーティングフラスコ上で増殖して、フローサイトメトリーにより分析された臍帯由来細胞は、すべてＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生に関して陽性であり、ＩｇＧ対照と比較して増加した蛍光値を有していた。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。

フローサイトメトリーによる臍帯由来細胞の分析を通じて、これらの細胞株の同一性が実証された。これらの臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関しては陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性であった。この同一性は、ドナー、継代数、培養容器の表面コーティング、消化酵素、及び胎盤の層を含めた変数が変動しても、一貫していた。個々の蛍光値ヒストグラム曲線の平均及び範囲には、ある程度の変動が観察されたが、全ての試験条件下での、全ての陽性曲線は正常であり、発現した蛍光値は、ＩｇＧ対照よりも大きく、それゆえ、これらの細胞が、マーカーの陽性発現を有する均質な集団を含むことが確認された。

（実施例８）
オリゴヌクレオチドアレイによる細胞分析
オリゴヌクレオオチドアレイを使用して、臍由来細胞及び胎盤由来細胞の遺伝子発現プロファイルを、繊維芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、及びヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この解析により、分娩後に誘導された細胞の特性評価が提供され、これらの細胞に関係する固有の分子マーカーが特定された。

分娩後組織由来細胞。ヒト臍帯及びヒト胎盤は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ））より、患者の同意を得て、正常な満期分娩から得た。Ｃ：Ｄ：Ｈの混合物による消化後、実施例５に記述されるとおり、組織の受領及び細胞の単離が行われた。細胞は、ゼラチンコーティングされたプラスチック製組織培養フラスコ上の増殖培地において増殖された。この培養物を、５％のＣＯ_２を使用して、３７℃でインキュベートした。

線維芽細胞ヒト皮膚繊維芽細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ロット番号９Ｆ０８４４）及びＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）より購入した。双方の株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養した。細胞は、標準の組織培養処理済みプラスチック上で増殖された。

ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６、及び２Ｆ１６５７）より購入し、製造元の仕様書に従って、ＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で培養した。これらの細胞は、５％のＣＯ_２を使用して、３７℃で、標準的な組織培養プラスチック上で増殖させた。

ヒト腸骨稜骨髄細胞（ＩＣＢＭ）。ヒト腸骨稜の骨髄は、患者の同意を得て、ＮＤＲＩより受け取った。この骨髄を、Ｈｏらによって概説される方法（国際公開第０３／０２５１４９号）にしたがって処理した。この骨髄を、溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ_３、及び０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ ７．２）と、骨髄１部対溶解緩衝液２０部の比率で混合した。この細胞懸濁液を、ボルテックス攪拌して、周囲温度で２分間インキュベートし、５００ｘｇで１０分間、遠心分離した。上清を廃棄して、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清及び４ｍＭグルタミンを添加した最小必須培地−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、細胞ペレットを再懸濁させた。これらの細胞を、再び遠心分離して、新鮮培地中に細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー色素排除（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、生存単核細胞を計数した。単核細胞は、５×１０^４細胞／ｃｍ^２にて、プラスチック製細胞培養フラスコにおいて播種された。細胞を、３７℃で、５％のＣＯ_２、標準大気のＯ_２又は５％のＯ_２によって培養した。培地を交換することなく、細胞を５日間培養した。５日間の培養の後、培地及び非付着細胞を除去した。付着細胞は、培養下に維持した。

活発に増殖する細胞培養物を、低温のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、細胞スクレーパによってフラスコから除去した。これらの細胞を、３００ｘｇで５分間、遠心分離した。上清を除去して、新鮮なＰＢＳ中に細胞を再懸濁させ、再び遠心分離した。上清を除去して、細胞ペレットを速やかに凍結して−８０℃で保存した。細胞ｍＲＮＡを抽出して、ｃＤＮＡに転写した。次に、ｃＤＮＡをｃＲＮＡに転写して、ビオチンで標識した。ビオチン標識済みｃＲＮＡについて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ ＨＧ−Ｕ１３３Ａオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によってハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション及びデータ収集は、製造元の仕様に従って実施した。データ分析は、「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピューターソフトウェア（Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．ら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：５１１６〜５１２１）を使用して、分析を実行した。分析ソフトウェアのライセンスは、Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙを通じて入手可能であり、詳細情報はＤｅｐ’ｔ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおけるＰｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉのウェブサイトにおいて、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ上から入手可能である。

１４の異なる細胞集団を、この試験において分析した。これらの細胞を、継代情報、培養基質、及び培養培地と共に、表８−１に列記する。細胞株については、分析時の継代を伴う識別コード、細胞増殖基質、及び増殖培地を列記した。

データは、上述したＳＡＭソフトウェアによる主成分分析で評価した。分析により、試験対象の細胞において、異なる相対量で発現した２９０の遺伝子が明らかとなった。この分析は。集団間の相対的比較を提供した。

表８−２は、細胞対の比較のために算出された、ユークリッド距離を示す。これらのユークリッド距離は、細胞型間で示差的に発現した２９０の遺伝子に基づく、細胞の比較に基づいたものである。ユークリッド距離は、２９０の遺伝子の発現における類似性と反比例している。ユークリッド距離は、細胞の種類ごとに異なる発現をした２９０の遺伝子を仕様して、各種類の細胞について計算した。細胞間の類似性は、ユークリッド距離に反比例している。

表８−３、８−４、及び表８−５は、胎盤由来細胞内で増大した遺伝子の発現（表８−３）、臍帯由来細胞内で増大した遺伝子の発現（表８−４）、並びに臍帯由来細胞及び胎盤由来細胞内で低減した遺伝子の発現（表８−５）を示す。

表８−６、８−７、及び表８−８は、ヒト繊維芽細胞（表８−６）、ＩＣＢＭ細胞（表８−７）、及びＭＳＣ（表８−８）内で増大した遺伝子の発現を示す。

本実施例は、臍帯由来細胞及び胎盤由来細胞の分子の特性評価を提供するために実行された。この分析には、３つの異なる臍帯及び３つの異なる胎盤に由来する細胞を含めた。この試験にはまた、皮膚繊維芽細胞の２つの異なる株、間葉系幹細胞の３つの株、及び腸骨稜の骨髄細胞の３つの株も含めた。これらの細胞が発現したｍＲＮＡを、２２，０００遺伝子に関するオリゴヌクレオチドプローブを含有するＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイ上で分析した。

分析により、これら５つの異なる種類の細胞には、２９０の遺伝子の転写産物が異なる量で存在していることが明らかとなった。これらの遺伝子には、胎盤由来細胞内で特異的に増大している１０の遺伝子、及び臍帯由来細胞内で特異的に増大している７の遺伝子が含まれる。５４の遺伝子が、胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞において、特異的に低い発現レベルを示した。

（実施例９）
細胞の表現型の免疫組織化学的評価
ヒト臍帯組織に見出される細胞の表現型を、免疫組織化学によって分析した。

ヒト臍帯組織を採取し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドにより４℃で一晩浸漬固定した。免疫組織化学は、以下のエピトープに対する抗体を使用して実行した（表８−１を参照）：ビメンチン（１：５００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、デスミン（１：１５０、抗ウサギ；Ｓｉｇｍａ；又は１：３００、抗マウス；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、及びＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）。更には、以下のマーカーを試験した：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ））、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及び抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。外科用メスを使用して、固定標本をトリミングし、エタノールを含有するドライアイス浴上の、ＯＣＴ包理化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ））内部に定置した。次いで、凍結ブロックを、標準的なクリオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して切片（厚さ１０μｍ）とし、染色のためにスライドグラス上に載置した。

以前に行われた試験に類似した免疫組織化学を実施した。（例えば、Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒａｌ．，２００３；１８４：８１６−８２９）。組織切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ））、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００；Ｓｉｇｍａ）を含有するタンパク質ブロッキング溶液に、１時間曝した。目的のエピトープが、細胞表面上に位置している場合には（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１）、エピトープの損失を防ぐために、この手順の全ての段階で、Ｔｒｉｔｏｎを省略した。更には、一次抗体がヤギに対して産生された場合には（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）、手順全体を通して、ヤギ血清の代わりに、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を使用した。次いで、ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体を、室温で４時間にわたって、これらの切片に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））及び／又はヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）若しくはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にブロックを含有する、二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。培養物を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化した。

免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ））上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。陽性染色は、対照染色を上回る蛍光シグナルによって表された。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。次いで、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））を使用して、階層モンタージュを調製した。

ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、及びＣＤ３４マーカーは、臍帯内部に見出される細胞のサブセットで発現した（データ示さず）。具体的には、ｖＷＦ及びＣＤ３４の発現は、臍帯内部に含まれる血管に限定されていた。ＣＤ３４に対して陽性（ＣＤ３４^＋）の細胞は、最深層に存在した（ルーメン側）。ビメンチンの発現は、臍帯のマトリックス及び血管の全域に見出された。ＳＭＡは、動脈並びに静脈の、マトリックス及び外壁に限定されたが、血管自体には含まれなかった。ＣＫ１８及びデスミンは、血管内部のみに観察され、デスミンは、中層及び外層に限定された。

これらのマーカーのいずれも、臍帯内部では観察されなかった（データ示さず）。

ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、ヴォン・ヴィレブランド因子、及びＣＤ３４は、ヒト臍帯内部の細胞内で発現する。ビメンチン及びα−平滑筋アクチンのみが発現することを示したインビトロ特性分析に基づくと、データは、臍帯由来細胞を単離する本プロセスが細胞の亜集団を採取するものであること、又は単離した細胞がマーカーの発現を変化させてビメンチン及びα−平滑筋アクチンを発現することを示唆している。

（実施例１０）
栄養因子の分泌
選択された栄養因子のＵＴＣからの分泌を測定した。血管由来活性を有する因子が選択された。例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎら、Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．，１９９７；２１２：２１５〜２６）；単核走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏら、Ｂｌｏｏｄ，２０００；９６；３４〜４０）；インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３；１７０：３３６９〜７６）；ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）；塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．２００４；７７：８１２〜８）；マトリックスメタロプロテアーゼの組織阻害剤１（ＴＩＭＰ１）；アンジオポチエン２（ＡＮＧ２）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦｂｂ）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ヘパリン結合表皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）；間質由来因子１α（ＳＤＦ−１ａｌｐｈａ），神経栄養／神経保護活性（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００３；２５８；３１９〜３３）；インターロイキン−６（ＩＬ−６）；顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）；トランスフォーミング成長因子β２（ＴＧＦｂｅｔａ２））；又はケモカイン活性（マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α）；マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１ｂｅｔａ）；単核ケモアトラクタント−１（ＭＣＰ−１）；Ｒａｎｔｅｓ（活性化における制御、通常Ｔ細胞の発現及び分泌）；Ｉ３０９；胸腺及び活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ）；エオタキシン；マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）；並びに（ＩＬ−８）。

臍帯、並びにヒト新生児包皮由来のヒト繊維芽細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコ上の増殖培地により培養した。継代数１１で、細胞を凍結保存し、液体窒素中で保存した。細胞の解凍後、それらの細胞に増殖培地を添加し、その後、１５ｍＬ遠心管に移して、１５０ｘｇで５分間、それらの細胞を遠心分離した。４ｍＬの増殖培地中に、細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を計数した。細胞は、それぞれ１５ｍｌの増殖培地を含むＴ７５フラスコ内において、５，０００細胞／ｃｍ^２で播種し、２４時間の培養を行った。培地を、無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ））に変えて、８時間培養した。インキュベーションの終了時に、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離を行い無血清馴化培地を回収し、−２０℃で保存した。

各フラスコ内の細胞数を推算するため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して分離した。８ミリリットルの増殖培地の添加によって、トリプシン活性を抑制した。これらの細胞を、１５０ｘｇで５分間、遠心分離した。上清を除去し、１ｍｌの増殖培地中に、細胞を再懸濁させた。細胞数は、血球計によって推算した。

細胞を、５％二酸化炭素及び大気酸素下で、３７℃で増殖させた。各細胞サンプルによって産生された、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、及びＴＧＦ−β２の量を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｎ．）によって判定した。全てのアッセイは、製造元の使用説明書に従って実行した。提示された値は、１ｍｌごと、細胞１００万個ごとのピクトグラムである（ｎ＝２，ｓｅｍ）。

ケモカイン（ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、エオタキシン、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、及び血管新生因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦ）を、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔプロテオームアレイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を使用して測定した。このプロテオームアレイは、ウェル当り２〜１６のタンパク質を定量測定するための、多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。これらのアレイは、９６ウェルプレートの各ウェル内に、２×２、３×３、又は４×４パターンの、４〜１６の種々の捕捉抗体をスポットすることによって作製される。サンドイッチＥＬＩＳＡ手順の後に、プレート全体を画像化して、プレートの各ウェル内部の各スポットで生成された、化学発光シグナルを捕捉する。各スポット内で生成されるシグナルの量は、元の標準又はサンプル中の、標的タンパク質の量に比例する。

ＭＣＰ−１及びＩＬ−６は、臍由来ＰＰＤＣ並びに皮膚繊維芽細胞によって分泌された（表１０−１）。ＳＤＦ−１α及びＧＣＰ−２は、線維芽細胞によって分泌された。ＧＣＰ−２及びＩＬ−８は、臍由来ＰＰＤＣによって分泌された。ＴＧＦ−β２は、いずれの種類の細胞においても、ＥＬＩＳＡによって検出されなかった。

ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ（商標）多重ＥＬＩＳＡアッセイ。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、及びＩＬ−８は、臍由来ＰＰＤＣから分泌された（表１０−２及び表１０−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ又はＰＤＧＦｂｂは、検出されなかった。

臍由来細胞は、多数の栄養因子を分泌した。ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１、及びＩＬ−８などの、これらの栄養因子のうちの一部は、血管新生に重要な役割を果たす。ＢＤＮＦ及びＩＬ−６などの他の栄養因子は、神経再生又は保護に重要な役割を果たす。

（実施例１１）
テロメラーゼ活性の分析
テロメラーゼは、染色体の完全性を保護し、また細胞の複製寿命を延長するために役立つ、テロメア繰り返し体を合成するように機能する（Ｌｉｕ，Ｋら、ＰＮＡＳ，１９９９年：９６：５１４７〜５１５２）。テロメラーゼは、テロメラーゼＲＮＡテンプレート（ｈＴＥＲ）、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の、２つの成分からなる。テロメラーゼの調節は、ｈＴＥＲではなく、ｈＴＥＲＴの転写によって決定される。ｈＴＥＲＴｍＲＮＡに関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、それゆえ、細胞のテロメラーゼ活性を判定するための、公認された方法である。

細胞単離
リアルタイムＰＣＲ実験を実行して、ヒト臍帯組織由来細胞のテロメラーゼ産生を判定した。ヒト臍帯組織由来細胞は、上記実施例及び米国特許第７，５１０，８７３号に定める例に従って調製した。全般的には、正常な分娩後の、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から得た臍帯を洗浄して、血液及び残渣を除去し、機械的に解離させた。次いで、その組織を、培養培地中、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼを含む消化酵素と共に、３７℃でインキュベートした。ヒト臍帯組織由来細胞は、‘０１２出願の実施例に定める方法に従って培養した。間葉系幹細胞及び通常の皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９ロット番号９Ｆ０８４４）は、Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．から取得した。多能性ヒト精巣胎児性癌（テラトーマ）細胞株ｎＴｅｒａ−２細胞（ＮＴＥＲＡ−２ ｃｌ．Ｄ１）（Ｐｌａｉａら，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００６；２４（３）：５３１〜５４６を参照）は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から購入し、米国特許第７，５１０，８７３号に定める方法に従って培養した。

総ＲＮＡの隔離
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ．））を使用して、ＲＮＡを細胞から抽出した。ＲＮＡは、５０μｌのＤＥＰＣ処理水により溶離させ、−８０℃で保存した。ＲＮＡは、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎｅ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａ．）を併用したランダムへキサマーを使用して、逆転者した。各試料を−２０℃で保存した。

リアルタイムＰＣＲ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイとしても既知）を、製造元の仕様（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って使用して、ｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを実行した。この市販のキットは、ヒト細胞内のテロメラーゼに関してアッセイするために、広く使用される。簡潔には、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ遺伝子）（Ｈｓ００１６２６６９）及びヒトＧＡＰＤＨ（内部対照）を、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ７０００ ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に７０００配列検出システムを使用して、ｃＤＮＡ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックスと混合した。熱サイクル条件は、最初に５０℃で２分間及び９５℃で１０分間とし、その後に、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルとした。ＰＣＲデータは、製造元の仕様書に従って分析した。

ヒト臍帯由来細胞（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６７）、線維芽細胞、及び間葉系幹細胞を、ｈＴｅｒｔ及び１８Ｓ ＲＮＡに関してアッセイした。表１１−１に示すように、ｈＴＥＲＴ、よってテロメラーゼは、ヒト臍帯組織由来細胞内では検出されなかった。

ヒト臍帯組織由来細胞（単離株０２２８０３、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６７）及びｎＴｅｒａ−２細胞のアッセイを行ったところ、それらの結果は、ヒト臍帯組織由来細胞の２つのロットでは、テロメラーゼの発現を示さなかったが、一方で、テラトーマ細胞株は、高レベルの発現を表した（表１１−２）。

それゆえ、ここに開示するヒト臍帯由来細胞は、テロメラーゼを発現しないということを、結論付けることができる。

以上、本発明を、様々な特定の材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に説明及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。当業者には認識されるように、このような細部には多くの変更を行い得ることが示唆される。本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されるものである。本出願において引用される参照文献、特許及び特許出願は、いずれもそれらの全容を本明細書に援用するものとする。

〔実施の態様〕
（１） 血液中の治療用同種細胞を検出する方法であって、
ａ．治療用同種細胞及びヒト末梢血単核球を分析して、治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを同定することと、
ｂ．前記治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び前記患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを比較して、前記治療用同種細胞と前記患者の末梢血単核球とを区別する１つ又は２つ以上の特異なマーカーを同定することと、
ｃ．治療用同種細胞による治療を受けた患者から血液サンプルを提供することと、
ｄ．前記治療用同種細胞に対して陽性の前記１つ又は２つ以上の特異なマーカーを検出する分析方法を使用して、前記サンプルを分析することと、
ｅ．前記１つ又は２つ以上の特異なマーカーの検出に基づき、前記患者の末梢血単核球と治療用同種細胞とを区別することと、
を含む、方法。
（２） 実施態様１に記載の方法であって、前記患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーにＣＤ４５が含まれる、方法。
（３） 実施態様１に記載の方法であって、段階ｂの分析方法が、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、核酸検出、ＰＣＲ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
（４） 実施態様１に記載の方法であって、段階（ａ）と段階（ｂ）との間に濃縮する段階を実施することを更に含む、方法。
（５） 実施態様４に記載の方法であって、前記濃縮する段階が、磁気捕捉技術である、方法。

（６） 実施態様１に記載の方法であって、前記区別する段階が、前記患者に投与した治療用同種細胞と、前記患者の末梢血単核球と、を差別化することを含む、方法。
（７） 実施態様１に記載の方法であって、前記患者が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、犬、又は豚である、方法。
（８） 血液サンプル中における治療用同種細胞を検出する実施態様１に記載の方法に使用するキットであって、治療用同種細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを有するマーカープロフィールを含む、キット。
（９） 実施態様１に記載の方法であって、前記治療用同種細胞が、ヒト臍帯組織由来細胞、ヒト臍帯血由来細胞、胎盤由来細胞、間葉系幹細胞由来細胞、肝細胞、膵島細胞、心筋細胞、及び不溶性コラーゲン骨基質細胞からなる群から選択される、方法。
（１０） 血液中のヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、
ａ．ヒト臍帯組織由来細胞及びヒト末梢血単核球を分析して、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを同定することと、
ｂ．前記ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーと、前記ヒト末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーと、を比較して、前記臍帯組織由来細胞と前記患者の末梢血単核球とを区別する、１つ又は２つ以上の特異なマーカーを同定することと、
ｃ．ヒト臍帯組織由来細胞による治療を受けた患者から血液サンプルを提供することと、
ｄ．ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上の特異なマーカーを検出する分析方法を使用して、前記サンプルを分析することと、
ｅ．前記１つ又は２つ以上の特異なマーカーの検出に基づき、前記患者の末梢血単核球とヒト臍帯組織由来細胞とを区別することと、
を含む、方法。

（１１） 実施態様１０に記載の方法であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーが、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＮＲＰ１、ＣＤ４５、ＬＡＭＰ１、ＤＫＫ３、ＮＲＰ１又はＬＡＭＢ１のうちの１つ又は２つ以上を含む、方法。
（１２） 実施態様１０に記載の方法であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞に対する１つ又は２つ以上の特異なマーカーが、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＮＲＰ１、ＬＡＭＰ１、ＤＫＫ３、ＮＲＰ１又はＬＡＭＢ１を含む、方法。
（１３） 実施態様１０に記載の方法であって、前記患者の末梢血単核球に対する陽性のマーカーが、ＣＤ４５であり、前記ヒト臍帯組織由来細胞に対する陽性のマーカーが、ＣＤ１０である、方法。
（１４） 実施態様１３に記載の方法であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞に対する陽性のマーカーとしてＣＤ１３を更に含む、方法。
（１５） 実施態様１３に記載の方法であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞に対する陽性のマーカーとしてＮＲＰ１、ＤＫＫ３及びＬＡＭＰ１のうち１つ又は２つ以上を更に含む、方法。

（１６） 実施態様１０に記載の方法であって、段階ｂの分析方法が、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、核酸検出、ＰＣＲ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
（１７） 実施態様１０に記載の方法であって、段階（ｃ）と段階（ｄ）との間に濃縮する段階を実施することを更に含む、方法。
（１８） 実施態様１７に記載の方法であって、前記濃縮する段階が、磁気捕捉技術である、方法。
（１９） 実施態様１０に記載の方法であって、前記区別する段階が、前記患者に投与したヒト臍帯組織由来細胞と、前記患者の末梢血単核球と、を差別化することを含む、方法。
（２０） 実施態様１０に記載の方法であって、前記患者がヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、犬、又は豚である、方法。

（２１） 血液サンプル中におけるヒト臍帯組織由来細胞を検出する実施態様１０に記載の方法に使用するキットであって、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを有するマーカープロフィールを含む、キット。
（２２） 実施態様１０に記載の方法であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞が、血液が実質的に含まれないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、かつ以下の特性：（１）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＨＬＡ−ＡＢＣの発現、（２）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１１７の不発現、並びに（３）ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの不発現、を有する、方法。
（２３） 血液中のヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、
ａ．ヒト臍帯組織由来細胞及びヒト末梢血単核球を分析して、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及びヒト末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを同定することと、
ｂ．ヒト臍帯組織由来細胞を含む血液サンプルを提供することと、
ｃ．前記血液サンプルから前記ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分離することと、
ｄ．末梢血単核球に対する陽性のマーカーとしてのＣＤ４５と、ヒト臍帯組織由来細胞に対する陽性のマーカーとしてのＣＤ１０又はＣＤ１３と、に関するフローサイトメトリーにより、前記ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析することと、
ｅ．ヒト末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５と、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０又はＣＤ１３と、の検出に基づき、前記ヒト末梢血単核球及び前記ヒト臍帯組織由来細胞の存在を検出することと、
を含む、方法。
（２４） 実施態様２３に記載の方法であって、前記分析する段階が、末梢血単核球に対する陽性のマーカーとしてのＣＤ４５と、ヒト臍帯組織由来細胞に対する陽性の特異なマーカーとしてのＣＤ１０と、に関するフローサイトメトリーにより、前記ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析することを含む、方法。
（２５） 実施態様２３に記載の方法であって、前記分析する段階が、末梢血単核球に対する陽性のマーカーとしてのＣＤ４５と、ヒト臍帯組織由来細胞に対する陽性の特異なマーカーとしてのＣＤ１３と、に関するフローサイトメトリーにより、前記ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析することを含む、方法。

（２６） 実施態様２３に記載の方法であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析する前に、濃縮する段階を実施することを更に含む、方法。
（２７） 実施態様２６に記載の方法であって、前記濃縮する段階が磁気捕捉技術である、方法。
（２８） 実施態様２３に記載の方法であって、前記検出する段階が、前記患者に投与したヒト臍帯組織由来細胞と、前記患者のヒト末梢血単核球と、を差別化することを含む、方法。
（２９） 血液中のヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、
ａ．ヒト臍帯組織由来細胞を含む血液サンプルを提供することと、
ｂ．前記血液サンプルから前記ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分離することと、
ｃ．血漿を除去することと、
ｄ．末梢血単核球に対する陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対する陽性のマーカーとしてのＣＤ１３に関するフローサイトメトリーにより、前記ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析することと、
ｅ．ヒト末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１３の検出に基づき、前記ヒト末梢血単核球及び前記ヒト臍帯組織由来細胞の存在を検出することと、
を含む、方法。
（３０） 実施態様２９に記載の方法であって、ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０に関する分析を更に含む、方法。

（３１） 実施態様２９に記載の方法であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞が、血液が実質的に含まれないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、かつ以下の特性：（１）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＨＬＡ−ＡＢＣの発現、（２）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１１７の不発現、（３）ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの不発現、（４）酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン（reticulon）、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質の発現、並びに（５）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞と比較しての、インターロイキン８又はレチクロン１の濃度上昇の発現、を有する、方法。
（３２） 実施態様２９に記載の方法であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析する前に、濃縮する段階を実施することを更に含む、方法。
（３３） 実施態様３２に記載の方法であって、前記濃縮する段階が、磁気捕捉技術である、方法。
（３４） 実施態様２９に記載の方法であって、前記検出する段階が、前記患者に投与したヒト臍帯組織由来細胞と、前記患者のヒト末梢血単核球と、を差別化することを含む、方法。

Claims (23)

1. 血液中の循環ヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、
   ａ．ヒト臍帯組織由来細胞及びヒト末梢血単核球を分析して、循環ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及び患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを同定することと、
   ｂ．循環ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の前記１つ又は２つ以上のマーカーと、ヒト末梢血単核球に対して陽性の前記１つ又は２つ以上のマーカーと、を比較して、前記循環臍帯組織由来細胞と前記患者の末梢血単核球とを区別する、１つ又は２つ以上の特異なマーカーを同定することと、
   ｃ．循環ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上の特異なマーカーを検出する分析方法を使用して、ヒト臍帯組織由来細胞による治療を受けた患者からの血液サンプルを分析することと、
   ｄ．前記１つ又は２つ以上の特異なマーカーの検出に基づき、前記患者の末梢血単核球と循環ヒト臍帯組織由来細胞とを区別することであって、循環ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の前記１つ又は２つ以上のマーカー、及び患者の末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーが、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＮＲＰ１、ＣＤ４５、ＬＡＭＰ１、ＤＫＫ３、ＮＲＰ１又はＬＡＭＢ１のうちの１つ又は２つ以上を含むことと、
   を含む、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、循環ヒト臍帯組織由来細胞に対する前記１つ又は２つ以上の特異なマーカーが、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＮＲＰ１、ＬＡＭＰ１、ＤＫＫ３、ＮＲＰ１又はＬＡＭＢ１を含む、方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、患者の末梢血単核球に対する前記陽性のマーカーが、ＣＤ４５であり、循環ヒト臍帯組織由来細胞に対する前記陽性のマーカーが、ＣＤ１０である、方法。
4. 請求項３に記載の方法であって、循環ヒト臍帯組織由来細胞に対する前記陽性のマーカーとしてＣＤ１３を更に含む、方法。
5. 請求項３に記載の方法であって、循環ヒト臍帯組織由来細胞に対する前記陽性のマーカーとしてＮＲＰ１、ＤＫＫ３及びＬＡＭＰ１のうち１つ又は２つ以上を更に含む、方法。
6. 請求項１に記載の方法であって、段階ｂの分析方法が、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、核酸検出、ＰＣＲ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
7. 請求項１に記載の方法であって、前記血液サンプルを分析する前に濃縮する段階を実施することを更に含む、方法。
8. 請求項７に記載の方法であって、前記濃縮する段階が、磁気捕捉技術である、方法。
9. 請求項１に記載の方法であって、前記区別する段階が、前記患者に投与した循環ヒト臍帯組織由来細胞と、前記患者の末梢血単核球と、を差別化することを含む、方法。
10. 請求項１に記載の方法であって、前記患者がヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、犬、又は豚である、方法。
11. 請求項１に記載の方法であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞が、血液が実質的に含まれないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、かつ以下の特性：（１）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＨＬＡ−ＡＢＣの発現、（２）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１１７の不発現、並びに（３）ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの不発現、を有する、方法。
12. 血液中の循環ヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、
    ａ．ヒト臍帯組織由来細胞及びヒト末梢血単核球を分析して、循環ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカー、及びヒト末梢血単核球に対して陽性の１つ又は２つ以上のマーカーを同定することと、
    ｂ．循環ヒト臍帯組織由来細胞を含む血液サンプルから前記循環ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分離することと、
    ｃ．末梢血単核球に対する陽性のマーカーとしてのＣＤ４５と、循環ヒト臍帯組織由来細胞に対する陽性のマーカーとしてのＣＤ１０又はＣＤ１３と、に関するフローサイトメトリーにより、前記循環ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析することと、
    ｄ．ヒト末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５と、循環ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０又はＣＤ１３と、の検出に基づき、前記ヒト末梢血単核球及び前記循環ヒト臍帯組織由来細胞の存在を検出することと、
    を含む、方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、前記分析する段階が、末梢血単核球に対する陽性のマーカーとしてのＣＤ４５と、ヒト臍帯組織由来細胞に対する陽性の特異なマーカーとしてのＣＤ１０と、に関するフローサイトメトリーにより、前記循環ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析することを含む、方法。
14. 請求項１２に記載の方法であって、前記分析する段階が、末梢血単核球に対する陽性のマーカーとしてのＣＤ４５と、循環ヒト臍帯組織由来細胞に対する陽性の特異なマーカーとしてのＣＤ１３と、に関するフローサイトメトリーにより、前記循環ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析することを含む、方法。
15. 請求項１２に記載の方法であって、前記循環ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析する前に、濃縮する段階を実施することを更に含む、方法。
16. 請求項１５に記載の方法であって、前記濃縮する段階が磁気捕捉技術である、方法。
17. 請求項１２に記載の方法であって、前記検出する段階が、前記患者に投与した循環ヒト臍帯組織由来細胞と、前記患者のヒト末梢血単核球と、を差別化することを含む、方法。
18. 血液中の循環ヒト臍帯組織由来細胞を検出する方法であって、
    ａ．循環ヒト臍帯組織由来細胞を含む血液サンプルから前記循環ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分離することと、
    ｂ．血漿を除去することと、
    ｃ．末梢血単核球に対する陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及び循環ヒト臍帯組織由来細胞に対する陽性のマーカーとしてのＣＤ１３に関するフローサイトメトリーにより、前記循環ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析することと、
    ｄ．ヒト末梢血単核球に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ４５、及びヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１３の検出に基づき、前記ヒト末梢血単核球及び前記循環ヒト臍帯組織由来細胞の存在を検出することと、
    を含む、方法。
19. 請求項１８に記載の方法であって、循環ヒト臍帯組織由来細胞に対して陽性のマーカーとしてのＣＤ１０に関する分析を更に含む、方法。
20. 請求項１８に記載の方法であって、前記ヒト臍帯組織由来細胞が、血液が実質的に含まれないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己複製及び増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、かつ以下の特性：（１）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＨＬＡ−ＡＢＣの発現、（２）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１１７の不発現、（３）ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの不発現、（４）酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質の発現、並びに（５）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞と比較しての、インターロイキン８又はレチクロン１の濃度上昇の発現、を有する、方法。
21. 請求項１８に記載の方法であって、前記循環ヒト臍帯組織由来細胞／末梢血単核球の分画を分析する前に、濃縮する段階を実施することを更に含む、方法。
22. 請求項２１に記載の方法であって、前記濃縮する段階が、磁気捕捉技術である、方法。
23. 請求項１８に記載の方法であって、前記検出する段階が、前記患者に投与した循環ヒト臍帯組織由来細胞と、前記患者のヒト末梢血単核球と、を差別化することを含む、方法。

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