JP6300793B2 - 血漿及び全血中のトロンビン産生と血餅強度との同時測定 - Google Patents

Description

(発明の分野)
本発明は、血漿若しくは全血、又は血液に由来する任意の適切な生物学的試料中の、タンパク質分解酵素産生と血餅強度との同時測定に関する。この測定方法は、標的とするタンパク質分解酵素との反応時に放出され得る部分を含む検出可能な基質の使用、並びに血餅強度の粘度の増大の測定のための手段を包含する。

本発明は、詳細には、血液試料中又は血液に由来する生物学的試料中のトロンビンの産生と血餅の強度とを同時に測定するための方法に関する。トロンビン産生は、トロンビンによる切断によりシグナルを放出する基質によって検出される。血餅強度は、血餅形成中の粘度の増大に基づいて検出される。

本発明の状況では、トロンビン産生と血餅強度との両方を測定することが可能な、特別なプレート-コーン型レオメーターが設計された。該レオメーターの試料ホルダーは、トロンビン感受性の基質によって放射される蛍光の移動を可能にする透明な底部を有する。トロンビン産生の検出については、トロンビンに対する基質が蛍光部分を含み、かつその蛍光部分が試料の下部に位置する場合、蛍光検出器が使用されることが好都合である。

したがって、本発明は、生理学的又は個々の病理学的環境における凝血をもたらす、止血(hemostasis又はhaemostasis)及び血栓症の分野に関する。

したがって、本発明は、止血及び凝血の調査に適した手段及び方法に関する。したがって、本発明は、血液、又は血漿などの血液産物を含む生物学的試料における、止血、凝血、又は凝固障害の検出のための手段、具体的には、化合物、装置、キット、及び方法を提供する。

本発明は特に、診断分野に適用され、したがって、患者の臨床状態の検出のための、特に患者における病理学的状態、例えば血栓症又は出血リスクの診断のためのスクリーニング試験において包含されるのに適した手段を提供する。本発明はまた、治療計画のための関連データを提供することを目的とするスクリーニング試験に包含され得る手段を提供する。

本発明はさらに、特に患者が薬物治療中である場合の、該患者の治療モニタリングに関する。

本発明はまた、凝血及びフィブリン血餅形成のプロセスに対する医薬品又は薬物の活性の決定のために、又は、こうしたプロセスにおける薬物候補の活性の評価のために使用することができる。

止血は、血栓形成促進状態と出血状態とのバランスである。止血の成分は、凝血タンパク質を含有する、血液に由来する溶液である血漿部分と、血小板、赤血球、及び白血球などの血液細胞を含有する、血液の細胞部分とに分けることができる。血管への損傷が生じた場合、血管が止血システムとインビボで相互作用することによって、過度の血液喪失が防止される。止血システムにおける主要な凝血タンパク質の1つが、トロンビンである。トロンビンは、凝血カスケードの最後に形成されて、フィブリノゲンをフィブリンに変換させる。形成されたフィブリンは、血小板及び赤血球を捕獲する目の詰まった網を形成し、このようにして血管を封鎖する栓を生じる。トロンビン産生の測定は、血栓形成促進又は出血表現型についての指標であることが知られており、フィブリンの形成は、手術中のケアデバイスの位置に関連する出血表現型の指標であることが示されている。血餅は、損傷の部位での血圧及びせん断応力に抵抗するはずであるので、血餅の堅さは、インビボでの止血の重要な機能的パラメーターである。

医学界は、何十年にわたって、病態生理学に関連する止血システムの変化を測定することを可能にしてきている。50年代の初期には、トロンビンが止血における主要な役割を有すること、また、トロンビンの産生を測定することが、凝血システム全体の状態の優れた指標を与えることが発見された。Hemker教授(NL)のグループは、較正物質の存在下で時間内のトロンビン産生を測定するための分析の設計に、かなりの努力を費やしてきた。彼らは、全血、血漿、及び多血小板血漿において、そのようなものとして使用される方法(これは自動較正トロンボグラフィー(Calibrated Automated Thrombography)(WO 03/093831)として知られている)を設計及び製造することに成功した。現在では、この方法は、多くの研究所で使用されている。血漿及び全血におけるトロンビン産生を測定するためには、いくつかの方法を使用することができる。Hemkerらは、赤血球不活性化に感受性のないローダミンベースの基質との組み合わせで赤血球の効果を減じる薄層の原理を示した(WO 2006/117246)。この組み合わせは、全血中のトロンビン産生を測定するための強力な手段であると証明されている。

現時点では、トロンビン産生を測定するためのすべての方法は、主にトロンビン感受性の蛍光/発色性基質の変換による、トロンビンの単独検出に基づいている。トロンビンは、フィブリノゲンをフィブリンに変換する重要な酵素である。さらに、トロンビン変換の速度とフィブリンの厚さ及び枝分かれとの間の関係が示されている。トロンビン、及びトロンビンと出血又は血栓形成促進表現型との関係の重要性にもかかわらず、フィブリン、それによって血餅強度が、トロンビンとは独立して影響され得るいくつかの条件が存在する。Koningsらのグループは、凝固第XIIa因子が、トロンビンとは独立してフィブリン網を増強することを示した［1］。したがって、トロンビン産生と血餅の強度との同時測定の必要性が存在する。さらに、トロンビン産生と血餅強度との同時測定によって、血餅開始に必要な最小量のトロンビンを容易に決定することができる。

本発明は、この必要性を満たすことを可能にする方法、装置、及びキットを提供する。これらの手段はさらに、止血又は血栓症に関与する様々なタンパク質分解酵素活性と血餅の強度との同時測定に適合させることができる。

(本発明に関連する止血及び凝血の原理)
(トロンビン産生の機構)
血漿におけるトロンビン産生の機構は、次の通りに例示することができる。組織因子(TF)は、血管壁内に、独占的にではないが豊富に存在する。血管が損傷すると、血液が組織に入り、血漿タンパク質第VIIa(VIIa)因子が、TFと相互作用することができる。これが、血漿タンパク質と血小板との間の複雑な一連の相互作用を誘発し、時間も空間も限られたままである、トロンビンの一過性の爆発的増大をもたらす。したがって、創傷は出血を止めるが、凝血は、体の残りの部分には伝播しない。

この機構は、正及び負のフィードバック反応を多分に伴い、非常に複雑であるので、その一部の知識からその作用を予測することができない(単純化できない複雑さ)ことを示し得る。したがって、止血システムの機能を評価したければ、体内で、又は体から離れた部分、すなわち血液又は多血小板血漿の試料中で、それが起こる通りにトロンビン産生を調査しなければならない。血小板と血漿因子との相互作用は、特に重要であり、乏血小板血漿から得られる情報が、基本的に不足している［3-5］。

凝血中の血漿内で形成されるすべてのトロンビンのかなりの部分(約30%)が、フィブリン血餅に結合する。血餅と結合したトロンビンは、その血栓形成特性を確実に保持し、フィブリノゲンを凝固させ、第V、第VIII、及び第XI因子、並びに血小板を活性化することができる［3-5］。しかし、これは、抗トロンビンによって部分的に阻害されるだけである。したがって、凝血システムの機能を調べる場合、フィブリンが存在することが不可欠である。

先述の通り、外傷の部位で生じるトロンビン活性は、その後に起こる止血-血栓形成反応の程度の重要な決定因子である。トロンビンの多く(＞95%)は、凝血のしばらく後に産生されるので、凝血時間は、自ずと、トロンビン活性の好適な指標とはならない。凝血中の血液におけるトロンビン活性は、一過性の現象であるので、凝血プロセス中に測定されるべきである。

凝血中の血液又は血漿におけるトロンビン形成の典型的な推移(トロンビン産生曲線とも呼ばれる)を、図1(実線)に示す。観察できないトロンビンが形成される期間の後、濃度は急激に上昇し、ピークに到達し、その後再び低下する。トロンビン形成の典型的なパラメーターは、ラグタイム、曲線下面積(AUC)(内因性トロンビン能(ETP;下記参照)とも呼ばれる)、ピーク高、及びピークに到達するまでの時間である。

(血餅強度)
溶解に比較的抵抗性のあるフィブリン血餅の形成は、組織損傷の修復をもたらす、血液凝固における最終ステップに相当する。血餅形成の複雑なプロセスは、フィブリノゲンからのフィブリノペプチドA及びBとして公知であるN末端ペプチドの切断によって開始される。これらの活性化されたフィブリノゲン分子は、フィブリンとフィブリノゲン分子(フィブリンモノマー)との可溶性の複合体を形成することができる。持続性のトロンビン活性の場合、可溶性のフィブリンの濃度は上昇し、長い二本鎖の原線維を形成する。その後、これらの原線維は、横方向に結びついて、様々な直径のフィブリン線維を形成し、可溶性のフィブリンが重合して、共有結合した重合した不溶性のフィブリンとなる。

フィブリン血餅の構造は、局所的なpH、イオン強度、並びにカルシウム及びフィブリノゲンの濃度を含めた、いくつかの変数によって影響を受ける可能性がある。重要なことには、その部位に存在するトロンビンの濃度が、フィブリン血餅構造に対する最も深い生理学的影響を有する。低トロンビン濃度は、厚い、ゆるく編まれたフィブリン鎖から構成される、非常に乱れた透過性の高いフィブリン血餅を生じる。より高いトロンビン濃度は、比較的薄いフィブリン鎖の高密度網から構成される、比較的乱れていない、透過性の低い血餅を生じる。第XIII因子のトロンビン依存性の活性化によって、異なるフィブリン鎖の間の共有結合が形成され、フィブリン血餅内のフィブリン接触部が補強され、それによって、フィブリン血餅の粘弾特性が増大する。フィブリン構造は、血餅の力学的安定性及び線維素溶解安定性を強く決定付け、また、重要な生理学的意味を有する可能性がある。線維素溶解に抵抗性のある堅固な血餅は、血栓症を起こしやすいのに対し、線維素溶解を非常に受けやすい脆弱な血餅は、尚早な溶解及び出血をもたらす。

血餅形成の大抵の研究は、一定量の精製されたトロンビンをフィブリノゲンに添加することによって実施されている。しかし、インビボでは、血餅形成は、連続的な変動する濃度のトロンビンの存在下で起こる。外因性のトロンビンの添加によって産生される、血餅中に存在する均一な線維構造に対して、これらの複雑な動力学は、インサイチューでのトロンビン産生中に形成される血餅において、比較的不均一なフィブリン構造をもたらす。さらに、トロンビン産生とは独立した、FXIIaなどの凝血システムのさらなる成分が関与する可能性は、フィブリン血餅構造に影響を与える可能性がある。これらをまとめると、トロンビン産生とフィブリン形成/血餅強度との同時測定の必要性が存在する。

(従来技術の方法)
(従来技術におけるトロンビン産生の決定)
トロンビン産生曲線は、伝統的に、凝血中の血液又は血漿から短い間隔で採取される少量の副次試料中のトロンビン含有量の決定を介して得られていた［6、7］。この方法は、一般に、副次試料の別々の分析を必要とし、熟練の実験室研究者の継続的従事により、わずか3〜5の曲線の決定だけが同時に可能である。非常に集約的な労働なので、臨床的又は医薬的な日常業務においては、その適用は排除される。

欧州特許A-0420332号(又は米国特許第5,192,689号)は、凝血中に人工の基質から産生される生成物の量を測定することによる、凝血中の血液又は血漿の試料中に存在しているトロンビンの量を決定するための方法を開示している。この量は、内因性トロンビン能(ETP)と呼ばれるトロンビン産生曲線下の面積に比例する。この方法は、トロンビン形成活性化因子を、トロンビン基質(ここでは、トロンビン基質の量、さらには動力学的特性は、試料中で産生されるトロンビンの量が、前記トロンビン基質を完全に消費できないように選択される)と共に、凝血中の血液又は血漿の試料に添加することと、それによって、変換生成物を産生させることと、このようにして産生された前記変換生成物の量を測定することと、ここから、この試料における内因性トロンビン能を決定することとを含む。このETP方法は、以下の反応によって例示することができる:
1)凝固因子(V〜XII)→プロトロンビナーゼ(活性化因子による)
2)プロトロンビン→トロンビン(プロトロンビナーゼによる)
3)トロンビン+抗血栓物質→不活性な複合体
4)基質→シグナル分子(トロンビンによる)。

すべての反応は、不可逆性であるので、トロンビンは、反応混合物中に、一時的にのみ存在する。トロンビンが存在する以上、トロンビンが反応4に関与し、その結果、基質の変換の程度は、トロンビンがこの反応を触媒してきた時間を示す。

基質の量は、トロンビンが消失する前に枯渇してはならないことが重要である。発現されたトロンビン活性の総量の厳密な表示となる、変換された基質の量については、反応速度は、いかなる時点においても、トロンビンの濃度に比例するはずである。このETP方法の本質は、潜在的なトロンビンが、トロンビン/時間曲線それ自体の決定を伴わないエンドポイント法として決定されることである。基質が、短時間測定されるならば、エンドポイントは、単に、形成される生成物の最大量となり、こうした図は、いずれにせよ意味を持たないであろう。

さらに、ETP方法は、光学濃度測定を介して検出される、発色性基質、すなわち色素産生脱離基を伴う基質を用いて、実際の実務において実施される。フィブリノゲン、したがって血小板は、血漿から除去される必要がある。何故なら、トロンビンによるフィブリノゲン-フィブリン変換に由来する濁りが、さらなる測定を不可能にするからである。しかし、フィブリノゲン及び血小板は、トロンビン形成の過程に影響を与える凝血システムの必須成分である。これは、検出方法としての光学濃度の適用可能性に、深刻な制限を課す。したがって、血小板及び/又はフィブリノゲンを含有する血漿におけるETPの評価は、可能ではないだろう。

適切なトロンビン基質を凝血試料に添加し、アミド分解による分解生成物の出現の経時変化をモニタリングすることによる、トロンビン濃度の連続的モニタリングが試みられている。例えば、発色性基質が使用され、p-ニトロ-アニリンの発現をモニタリングするように光学濃度が測定される［8、9］。こうした試験における反応速度が、トロンビン濃度のみに依存するならば、かつ、シグナルが、生成物の量に比例するならば、生成物曲線の傾斜は、存在するトロンビンの量に比例し、その結果、トロンビン産生曲線は、比例定数(Kc)が公知である場合、生成物曲線の第1の導関数から得ることができるであろう。

しかし、実際には、反応速度は、トロンビン濃度のみに依存するわけではない。シグナルは、生成物の量に比例するとは限らず、Kcは未知である。理由は以下である:

A:基質消費:シグナルは、試料中のトロンビンの活性に依存するだけでなく、基質の量にも依存し、酵素それ自体の活性という理由で、やがては低下する。この影響は、過剰量の基質を添加することによって(いくらかの限度までではあるが)減じることができる。基質は、トロンビンの活性中心と可逆的に結合し、それによって、トロンビンを天然の抗トロンビンによる不活性化から保護する。基質消費の影響を許容可能な程度まで消失させることは、実験を延長させて約2時間持続させることによって行われる(添加される基質の量が多くなるほど、多くの酵素分子が使用され、天然の不活性化プロセスに利用できなくなる。これによって、実験の期間が延長される。1×Kmでは、実験は、30分で終了し、5Kmでは、基質消費の実質的な独立性は得られるが、実験は90分持続する)。また、基質のこうした濃度では、トロンビン阻害が、フィードバック反応を妨げ、天然のプロセスが測定されることは、もはや保証されない。これはまた、変換された基質の総量から曲線下面積を評価することを意図する方法では、過剰量の基質が添加される必要があり、その結果、実験を実質的に可能にするために、余分な抗トロンビンが添加される必要があるという理由である(先に記述した欧州特許A-0420332号参照)。B:血漿試料の凝血を通じて光学濃度の変化が起こる:発色性基質の使用は、凝血時の光の散乱によるODの擬似的増大を引き起こすフィブリノゲン、したがって、血小板の除去を伴う。しかし、フィブリノゲン及び血小板は、トロンビン形成の過程に影響を与える凝血システムの必須成分である(上記参照)。これは、検出方法としての光学濃度の適用可能性に、深刻な制限を課す。この問題は、蛍光生成物をもたらす基質を使用することによって回避することができる［10］。しかし、これは、次の問題を導入する:C:蛍光測定では、シグナルは、生成物の量と線形関係ではない。特に、蛍光シグナルは、蛍光生成物の濃度に対して線形従属ではない。何故なら、蛍光分子は、他の生成物分子からの光を吸収するからである(いわゆる「内部フィルター効果」)。蛍光生成物を用いる場合、基質消費の影響を制限するのに必要とされる通りに、基質濃度を数倍のKmまで増大させることはまた、自動的に、内部フィルター効果を増大させる。

問題Aは、すべての継続する方法に共通である。問題Bは、蛍光発生基質を使用することによって回避することができるが、これは、問題Cを導入する。D:たとえ問題A、B、及びCが存在しないとしても、トロンビン濃度に対する反応速度間の相対的関連性を確立する、すなわち較正定数Kcを決定するという問題は残存する。この関連は、実験の設定によって変動する(例えば、異なる蛍光光度計で異なる)、また、試料によって(例えば、血漿の色の変動により)変動する。公知の標準の量のトロンビンを試料に添加することは、不可能である。何故なら、添加される酵素は、生理学的反応を妨害するであろうからである。並行する非凝血試料にトロンビンを添加することも不可能である。トロンビンが、血漿中で不活性化されるであろうからである。

これらの欠点は、好都合なことに、特許出願WO03/093831に記載されている通りに、適切なシグナル基質の分解をモニタリングして、これを、並行する試料中の一定の公知のトロンビン活性と比較することによって、血小板の有無にかかわらず、凝血中の血漿内のトロンビンの濃度を測定することによって回避された。この方法は、ある種の物質が、一定のトロンビン様活性を呈するという発見に基づいている。トロンビンは、凝血中の血漿に出現し、かつ消失するので、これを適切に使用して、トロンビンによって分解される分子から得られるシグナルの第1の導関数に絶対値(nM)を割り当てることができる。適切かつ特に好ましい較正物質は、α₂-マクログロブリン(本明細書ではα₂Mとも呼ぶ)とトロンビンとの不可逆的複合体である。トロンビンとα₂Mとの結合によって、トロンビンは、血漿中に存在する天然の不活性化因子に対して影響を受けなくなるが、小さな基質(これは、切断時に、光吸収性、蛍光性、又は他のシグナルを有する特性を伴う分子を放出する)を分解する元の能力は残る。

より具体的には、試料のある部分において、トロンビン産生(すなわち凝血)が、当技術分野で公知の方法によって誘発される。他の部分には、先に記述した通りの、独立に決定された不変のトロンビン活性を有する調製物、好ましくはα₂M-トロンビン複合体が添加される。生成物形成は、2種の試料において、好ましくは同時に測定される。凝血試料中にあらゆる時点で存在するトロンビンの厳密なモル量は、その試料からのシグナルを、公知の不変のトロンビン活性を有する調製物が添加されているが、トロンビン形成が誘発されていない試料からの測定されたシグナルと比較することによって得られる。この方法によって生じた、得られた曲線は、ラグタイム、曲線下面積、ピーク高、上昇する傾斜の勾配、ピークまでの時間としてのパラメーター、並びに、数学的関数T=a.t b.exp-ct(ラグタイムの後に開始する)と類似する曲線のさらなるすべてのパラメーターを特徴とする。トロンビンの濃度は一般的に、ゼロから始まり、通常50から500ナノモルの値のピーク高まで上昇し、再びゼロに戻る。ラグタイムは通常、0から20分の値であり、トロンビンが約10ナノモル超の濃度になるとすぐに終了する。この時点では、血餅の形成も見られるが、ピークは数分後に起こる。トロンビン産生曲線(Thrombogram(登録商標)(Synapse B.V.の登録商標)とも呼ばれる)のパラメーターは、相互作用する凝固因子の一連の濃度及び反応定数によって影響を受ける複合パラメーターである。これらは、例えば臨床、治療、又は他の環境において生じる、止血・血栓形成システムの機能に影響を与える、これらの変数のすべての変動を反映する。これまで測定された止血・血栓形成システムに関連するすべての抗血栓症及びすべての疾患が、これらのパラメーターに対する影響を有する。あらゆる種類の抗血栓治療又は止血凝血異常の間は、ラグタイム及びピーク値までの時間は通常、増大し、ピーク高及び曲線下面積は通常、低下する。一方、凝固亢進状態では、これらのパラメーターは、逆方向に移行する。このようにして、Thrombogramは、血液の凝固性(clottability)を真に反映し、血栓形成又は止血リスクについての指標を与える。

Hemker及び共同研究者によって開発されたこの自動較正トロンボグラム(CAT)分析を使用して、血漿中のトロンビン産生は、最も正確に測定される。しかし、血餅を沈殿させる、凝集させる、及び血餅を収縮させるヘモグロビン及び赤血球による蛍光シグナルの可変の消光は、非常に不安定なシグナルをもたらす可能性がある。その後、赤血球によって引き起こされる問題が、試料ホルダー中で血液を分散させ、それによって血液の薄層を作成することによって克服できることが実証されている(WO 2006/117246及びWO 2009/098313)。シグナル発生生成物としてのローダミン-110、高量子収率を有する蛍光発生基質、ヘモグロビンの吸収スペクトルとあまり重複せずかつ時間と共にあまり消費されない励起及び発光波長を使用することによって、このシステムはまた、改良されてもいる(寄稿されている)。

図1は、全血CATについての、生の蛍光データ(点線)のトロンビン活性への変換を示す。α2M-トロンビン活性の形成による蛍光強度の増分を、総蛍光強度から引いた(破線)。この較正された蛍光-時間曲線の第1の導関数、及び較正物質を用いる蛍光強度の変換によって、nMとして表されるトロンビン活性を有するトロンボグラムがもたらされる(実線)。このトロンボグラムから、以下のパラメーターを算出することができる:内因性トロンビン能(ETP、曲線下面積;nM.分)、ラグタイム(分)、トロンビンピーク(nM)、及びトロンビンピークまでの時間(分)。

特許出願WO2011/094185は、欧州特許A-0420332号において先に記載されている基本的方法に関し、改良された蛍光光度計を使用する、時間の関数としての血液の試料中のトロンビンの産生を測定するための方法を開示している。活性化された試料を形成するために、血液の試料に、蛍光発生基質とトロンビン活性化因子が添加される。蛍光光度計の使用により蛍光が測定され、測定された蛍光から、トロンビン産生が、時間の関数として算出される。

文献WO 2008/099179は、血液試料の導入のためのギャップを含有する、基本面と振動面とを含む振動式レオメーターを使用する、凝血中の血液のレオロジー特性を測定する方法を開示している。回転モードと比較した場合の振動モードの主な欠点は、以下である:(1)より静的測定と似ている、振動モードにおける極度に低いずり速度;(2)回転モードよりも試験の期間が2〜3倍長い;回転モードでは、ヒト体内と同様に、試験は主に層流で行われる。

文献US 6571610は、平板の形状の基本エレメントと円錐の形状の回転エレメントとを有する回転式レオメーターを開示している。試験される試料の導入のためのギャップは、基本エレメントと回転エレメントとの間に形成される。円錐及び平板形状の重要な特徴は、試料の中央及び端における均一な流動特性を可能にする、ギャップ全体を通した均一なずり速度又は直線的な速度プロファイルである。

(従来の技術における血餅の強度の決定)
フィブリン形成は、粘度の増大の検出によってモニタリングすることができる。この「粘度検出」方法では、磁気エレメントが、血漿内に配置される。凝血反応、すなわちフィブリン形成の開始により、磁気エレメントの動きがゆっくりになり、この動きの速度を検出することができる。このシステムの欠点としては、形成されたフィブリン塊の形状に依存する、変動する結果が生じることが挙げられる。さらに、凝血は、粘度が特定の水準に到達した時のみ測定することができる。例えば、日常の止血分析器は、誘導センサーを介する磁気球振動振幅の変動を測定することによって、血餅形成を決定する。この球の動きは、2つの独立したコイルによってもたらされる交流電磁場によって得られる。振動振幅は、周囲流体の粘度が一定である限りは一定のままであるが、環境粘度が増大する場合には減少する。キュベット内の球の位置は、受信コイルによって受信されるシグナルを決定する。これらの磁場変動は、振動振幅及び凝血時間を決定する。

別の技術、トロンボエラストグラフィ(TEG)は、振動システムにおける血餅形成(又は溶解)を機械的に調べる［11］。従来のTEGでは、カップが、測定ピンの周囲の振動運動であるのに対し、ROTEM(回転式トロンボエラストメトリー)では、カップが固定され、ピンは振動回転運動にかけられる。血餅形成の開始時に、フィブリン鎖が形成され、ピンとカップとの間のトルクの増大がもたらされる。トルクのこの変化は、電子的に(TEG)又は光学的に(ROTEM)検出することができる。凝血の誘発後の粘弾性の変化は、形成されるフィブリン網に、ある程度起因し、また、活性化された血小板、ヴォン・ヴィレブランド因子(VWF)、及びフィブリンの凝集に、ある程度起因する。したがって、これは、全血凝固における血小板及びフィブリノゲンレベルに対して感受性が高い。重要なことには、最初のフィブリン鎖の形成で終了する従来の凝血試験の多くとは対照的に、TEGは、最終的な血餅溶解/収縮まで、データを産生し続ける。その結果、TEGは、日常の凝血試験からは一般に入手できない線維素溶解活性及び血小板機能に関する情報を提供する。例えば、US 2010/0273206 A1に概説されている通り、粘弾性の変化の決定を使用して、VWFと血小板との相互作用の低下をもたらす、ヴォン・ヴィレブランド因子の量的/質的欠陥、及び血小板機能の欠陥を評価することができる。TEGの見込まれる欠点は、これが、低ずり条件下(1秒あたり0.1)で実施されて、フィブリン網内の赤血球塊の閉じ込めがもたらされ、もしかするとフィブリン鎖の広がりを、又はフィブリンと血小板との相互作用を妨げるかもしれないことである。したがって、TEGは、血液試料のヘマトクリット値と共に分析されるべきである。他のインビトロ方法と同様、これは、内皮細胞のインビボ寄与又は局所的血餅形成及び線維素溶解に対する血流のずり応力を反映できない［11］。基質としてのフィブリノゲンが急速に枯渇するので、TEGにおいて測定されるフィブリンは、凝血プロセスの初期段階でのトロンビン産生について知らせるに過ぎないという事実を踏まえると、全血におけるトロンビン産生の指標としてフィブリンを使用することは、TEGと同様に、患者におけるトロンビン産生能力全体を反映しない。トロンビン産生曲線に似せることを目的とするTEGシグナルの数学的処理は、混乱をもたらすだけである［12、13］。

本発明は、従来の技術の欠点を少なくともある程度克服する方法であって、インビトロで分析される生物学的試料中のトロンビン産生とフィブリン形成/血餅強度との同時測定に頼る方法を提供することを目的とする。本発明は、プラスミンなどの、止血又は血栓症に活性がある他のタンパク質分解酵素の産生の測定に適用可能な、したがって、タンパク質分解酵素活性とフィブリン形成/血餅強度との同時測定を可能にする方法をさらに提供する。

こうした方法は、特に、インビボで生じる酵素活性、特にトロンビン活性を反映する測定システムを提供する。

トロンビン変換の速度とフィブリン厚さとの間の強い関連にもかかわらず、フィブリンがトロンビンとは独立して影響され得るいくつかの条件が存在し、トロンビン産生とフィブリン形成との同時検出の必要性を裏付けている。本発明は、タンパク質分解活性、特にトロンビン産生と、血餅強度とのリアルタイムでの同時測定を可能にする方法に関する。

本発明は、トロンビン産生と血餅の強度との同時測定に関する。トロンビン産生は、ある方法、好ましくは、Hemkerらによって記載されている［2］、また、以下のページ及び実施例に例示されている通りのCAT方法によって測定することができる。血餅強度は、特別に設計されたレオメーターを使用して粘度の増/減を検出することによって測定される。

トロンビン産生は、トロンビン感受性の基質によって放射される蛍光の検出によって測定されることが好ましい。血餅強度の検出に関しては、生物学的試料(血液又は血漿)が、フィブリンの形成による粘度の増大を検出するのに十分な感受性であるように設計されたレオメーターに適用される。重要なことには、この特別に設計されたレオメーターの使用は、凝血反応に対する異なるずり速度の適用を可能にする。それによって、本発明は、インビボの静脈及び動脈血流におけるずり速度に似せた条件で、トロンビン産生及び血餅強度をインビトロで研究して、血小板機能及び線維素溶解に関する関連情報を提供する方法を記載している。トロンビン産生と血餅強度との同時測定は、血餅開始に必要なトロンビンの最小量を容易に決定する追加の利点を有する。

本発明はまた、試験される試料の導入のための、基本エレメント及び回転エレメント、これらの間隔を決定付ける測定ギャップ、回転エレメントの回転速度を測定するための手段、及び/又は、回転エレメントに適用されるトルクを備える、生物学的試料の特性、特に血餅強度を測定するための回転式レオメーターに関する。ここでは、前記レオメーターは、生物学的試料によって放射される蛍光シグナルを数量化するための蛍光光度計を備える。

レオメーターの特定の実施態様では、回転エレメントは、円錐体を備え、基本エレメントは、プレートを備え、測定ギャップは、前記円錐体のチップと前記プレートとの間に形成される。本発明の方法を実施するのに適した測定ギャップは、レオメーター測定システム(例えばレオメーターの円錐体のチップ)とレオメーターの基部の上部プレート又は試料のホルダーの底面との間に決定され、例えば10μmから2mm、好ましくは最大で100μmである。
好ましくは、基本エレメント及び試料ホルダーは、試料によって放射される蛍光シグナルの、その表面を通した蛍光光度計による検出及び数量化を可能にする、透明な表面を備える。

図1は、全血CATに基づく分析によって作成される、全血における典型的なトロンビン産生曲線を示す。 図2は、トロンビン産生と血餅強度との同時測定を可能にする、本発明によるレオメーターの概略図を示す。 図3は、前記レオメーターの一部の断面図を示す。 図4は、振動モードの特別に設計された(蛍光光度計が組み込まれた)レオメーターによって、血液試料において得られた、同時に測定されたトロンビン産生曲線と粘度プロットを示す。 図5は、蛍光光度計が組み込まれた、本発明の特別に設計されたレオメーターによって、乏血小板血漿(a)及び全血(b)試料において得られた、同時に測定されたトロンビン産生曲線と粘度プロットを示す。静脈及び動脈流をシミュレーションするために、異なるずり速度が使用された。 図6は、特別に設計されたレオメーターによって測定される乏血小板血漿における粘度プロット及びトロンビン産生曲線に対する、Doolittleペプチドの効果を示す。 図7は、特別に設計されたレオメーターによって、脱フィブリン化-対-対照の乏血小板血漿における、同時に測定されたトロンビン産生結果(ETP値)と粘度プロットを示す。 図8は、乏血小板血漿におけるプラスミン産生の生の蛍光データと共に、同時に測定された粘度プロットを示す。

(発明の詳細な説明)
止血及び血栓形成システムの以下の典型的な説明では、その最も重要な酵素、トロンビンを重視しながら、本発明について考慮されている。しかし、本発明はまた、他の酵素、及び他の生理学的システム、例えば、プラスミン及び血液及び血漿中の線維素溶解システムの他の活性化された成分を含めた、血液及び血漿中の凝血システムの他の活性化されたタンパク質分解酵素(因子)、並びに血液及び血漿中の活性化された補体因子にも関することに留意するべきである。

タンパク質分解酵素産生、特にトロンビン産生と、血餅強度とを同時に測定するために、インビボの生理学的条件を模倣する様々なせん断応力条件でのフィブリンの形成による粘度の増大の検出を可能にするように設計されたレオメーターに、分析される生物学的試料が適用される。エアベアリング(air beared)レオメーターは、フィブリンの形成による粘度の増大を検出するのに十分に感受性が高い。試料ホルダーの透明な底部は、内蔵の蛍光光度計を用いて容易に検出可能な、トロンビン感受性の基質によって放射される蛍光の移動を可能にする。

生物学的試料中の、決定されたタンパク質分解酵素活性の推移と、形成されたフィブリン血餅の強度との、インビボの血流条件をシミュレーションしながらのリアルタイムでのインビトロ同時決定のための本発明の方法は、以下のステップを含む:
a)生物学的試料における凝血を可能にするように、前記生物学的試料におけるタンパク質分解酵素産生を誘発することと、前記生物学的試料を、産生されたタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物と関連する検出可能なシグナルを引き起こす前記シグナル基質と接触させることと、
b)a)で得られた試料混合物を薄層として広げることと、測定システムと、シグナル基質とタンパク質分解酵素との反応後に得られた検出可能なシグナルの測定に適した容器内に保持された、a)で得られた試料混合物との間の測定ギャップ、特にゼロギャップを設定することと、
c)b)で得られた試料混合物に回転力を適用し、それによって、決定されたインビボでの生理学的又は臨床的状態の静脈又は動脈血流をシミュレーションすることと、
d)生物学的試料における検出可能なシグナル発生の経時変化を決定して、経時的なタンパク質分解酵素活性の結果を、特に曲線として提供することと、
e)前記誘発された生物学的試料に関して、回転式レオメーターを用いて、経時的な粘度の増大を、該生物学的試料におけるフィブリンの形成の測定と同時にモニタリングすること。

用語「タンパク質分解酵素産生」、及び特に用語「トロンビン産生」は、誘発された生物学的試料における、タンパク質分解酵素活性、特にトロンビン活性の、経時的な出現及び消失を示す。したがって、用語「タンパク質分解酵素産生」及び「タンパク質分解酵素活性」は、互換的に使用される。

用語「リアルタイム」は、本明細書で使用される場合、媒体中のタンパク質分解酵素濃度の推移が、反応容器内で続いている試料の生物学的活性化及び不活性化と同時に示されることを示すことが意図される。

本明細書で使用される場合、用語「シグナル基質」は、媒体中に存在する分析される生物学的試料中で産生されるタンパク質分解酵素によって切断され、そこから切り離された脱離基が検出可能である基質を意味する。本発明の特定の実施態様では、シグナル基質は、蛍光発生基質であり、これの脱離基は、蛍光検出によって検出可能である。特に、「シグナル基質」は、トロンビンによって切断される基質である。トロンビンに適した蛍光発生シグナル基質は、当業者に周知であり、特にEP 0420332又はWO 03/093831に開示されている。

表現「薄層」は、厚さが0.05から5mmの範囲内、特に1から3mmの範囲内、例えば2mm以下である、分析される試料の層を意味する。

本発明によれば、生物学的試料におけるフィブリン形成の決定としての粘度の測定と、前記試料におけるタンパク質分解酵素産生の決定は、同時であるとされる。何故なら、これらは、単一の試料又は副次試料に対して、例えば、ある単一の試料容器又はホルダーにおいて実施されるからである。

好都合なことに、本発明の特定の実施態様では、フィブリン形成の測定とタンパク質分解酵素産生の決定は、単一の装置、例えばレオメーター、特に、蛍光光度計をさらに含むように特別に設計された本発明による回転式レオメーターを使用して実施される。

分析される試料は、通常、血液、すなわち全血、又は血液に由来する生成物、例えば血漿、特に多血小板血漿(PRP)、乏血小板血漿(PPP)、又は無血小板血漿(PFP)から構成される生物学的試料である。血液は通常、血液中の遊離のカルシウムイオンが結合して、試料収集及び保管中のタンパク質分解酵素形成、特にプラスミン又はトロンビン形成、及び凝血が妨げられるように、クエン酸ナトリウム又はEDTAなどを含有する管内に収集される。

本発明は、20〜60μl程度から最大約1mlの範囲の生物学的試料、特に血液試料を使用する可能性を提供する。

本発明によれば、タンパク質分解酵素産生の誘発は、活性化因子を用いる公知の方式で実施される。活性化因子(本発明の方法の実施についてはプロテアーゼ活性化因子とも呼ばれる)としては、リン脂質、組織因子、特に可溶性の組織因子、又は組み換え型ヒト組織因子、トロンボプラスチン、カオリン、及びエラグ酸が挙げられる。これらを、使用される生物学的試料に応じて、第1の副次試料中に添加して、タンパク質分解酵素活性を誘発することができる。これらはまた、好都合なことに、一定の公知のタンパク質分解酵素活性、特にプラスミン又はトロンビン活性を引き起こす混合物に添加することができる。活性化因子は、凝血反応を開始するのに必要な又は好都合なさらなる成分、例えばカルシウムイオンと共に使用することもできる。

実際には、タンパク質分解酵素産生、特にプラスミン又はトロンビン産生を誘発する反応を開始するために、測定の開始の直前に、カルシウムを添加するべきである。本発明の一実施態様では、実施例に例示した通り、カルシウムは、FluCaとして、すなわち蛍光発生基質とCaCl2との混合物として添加される。このFluCa混合物は、実施例に開示した通りに調製することができる。しかし、血液が、クエン酸ナトリウムなどの中で収集されない場合、カルシウムのこの添加は、必須ではない可能性があり、したがって、蛍光発生基質は、溶液として添加される。これは、この方法が、血液採取後数分以内に実験を開始可能である様式で使用される場合に、当てはまる可能性がある。

本発明の特定の実施態様では、該方法は、トロンビン活性の推移と、形成されたフィブリン血餅の強度との、リアルタイムでのインビトロ同時決定を提供する。

タンパク質分解酵素が、トロンビンである場合、時間に対するトロンビン活性は、微量のトロンビンを提供する開始段階、それに続く活性の爆発的増大を特徴とするトロンボグラム(Thrombogram)(商標)(TG)の曲線として表すことができる。血液は、この爆発的増大の非常に初期に血餅を形成し、血餅が形成された後に、ほとんどすべてのトロンビンが形成される。このように、トロンボグラム(Thrombogram)(商標)は、ラグタイム、増殖段階、ピークまでの時間及びピーク高、並びにETPを含めた、様々な段階を示す。

用語「ラグタイム」は、本明細書で使用される場合、トロンビン形成が開始されるまでの時間(分)を示すことが意図される。

本明細書で使用される場合、用語「ピーク高」(nM)は、試験される試料に対する分析中に達成される最大のトロンビン活性を意味する。

用語「ピークまでの時間」(分)は、本明細書で使用される場合、反応の開始から、ピークに到達する瞬間までの時間を意味する。

用語「ETP」(内因性トロンビン能)は、本明細書で使用される場合、(ほぼ)ゼロのトロンビン活性に到達する瞬間までの曲線の時間積分(曲線下面積(nM.分)に相当する)を意味する。

本発明の方法に使用されるシグナル基質は、脱離基を含む化合物の群から選択されることが好ましい。前記脱離基は、前記化合物と形成されたタンパク質分解酵素との反応時に、検出可能な変換生成物を提供する。この変換生成物は、分光法によって決定される。特定の実施態様では、シグナル基質は、蛍光発生基質であり、その脱離基は、蛍光を放射する。したがって、本発明の特定の実施態様では、前記脱離基は、蛍光の基である。トロンビン活性測定に関する本発明の特定の実施態様では、脱離基、特に蛍光の基は、トロンビンに対して感受性であり、かつ脱離基の分離反応を受ける基質上に存在する。

特定の実施態様では、シグナル基質は、トロンビンに対する中程度の結合親和性及び低い動力学定数を有する、トロンビンによって選択的に加水分解される蛍光発生基質であり、特に、蛍光分子と結合させた、トロンビンに対する合成の基質である。

本発明の特定の実施態様では、蛍光発生基質は、蛍光分子と結合させた、2から30個のアミノ酸残基の配列を有するオリゴペプチドである。一例を挙げれば、オリゴペプチドは、蛍光分子と結合するための末端リシン又はアルギニンを有する。

全血又は血漿に対して蛍光検出器を使用する本発明の方法を実施するのに適した好ましいシグナル基質は、(Z-Gly-Gly-Arg)₂Rho110、すなわちローダミンベースのトロンビン基質である。ローダミンは、その高量子収率、ヘモグロビンの吸収スペクトルとあまり重複しない励起及び発光波長を考慮すると、また、分析の時間中にあまり消費されないことから、きわめて有用である。

或いは、血漿測定については、トロンビン基質としてZ-Gly-Gly-Arg-AMC(スイスBacken社)を使用することができる。これは、AMC(7-アミノ-4-メチルクマリン)を放出し、390nm励起及び460nm発光フィルターセットによって測定される。

測定されるタンパク質分解酵素産生が、プラスミンの産生である場合、基質は、ビス-(CBZ-L-フェニルアラニル-L-アルギニンアミド)、すなわちローダミン110に結合した二塩化水素化物であり得る。プラスミン産生の検出に適した別の蛍光発生基質は、H-Ala-Leu-Lys-AMC(フランスStago社)である。

従来の技術では、トロンビン産生の測定の特定の場合では、トロンビンとその基質が互いに線形的には反応しないことが報告されている。トロンビンとその基質との反応速度の非線形性を補うために、生物学的試料中のトロンビン濃度に応じて、一定の公知のトロンビン活性を引き起こす混合物の測定が、分析される試料の非凝血第2部分(第2の副次試料)と並行して実施される。このステップは、該試料の第1部分におけるタンパク質分解酵素活性測定に対する較正を提供する。このように、較正は、測定されるタンパク質分解酵素が、トロンビン活性である場合に、好都合に実施される。逆に、プラスミン産生測定は、較正ステップを伴わずに実施することができる。

したがって、特定の実施態様では、タンパク質分解酵素活性の較正を含めた本明細書に記載する発明を実施するという目的のために、該方法は、以下を含む:
-生物学的試料を、第1の副次試料と第2の副次試料を含めた、副次試料と呼ばれる少なくとも2つの部分に分割する最初のステップと、
-決定されたタンパク質分解酵素産生とフィブリン形成との本発明の同時検出の方法のステップa)からe)を実施することが、第1の副次試料に対して実施されることと、
-タンパク質分解酵素活性の測定の結果の較正のために、第2の副次試料に対して以下のステップを実施すること:
f)凝血しない第2の副次試料に、前記決定されたタンパク質分解酵素のためのシグナル基質に対する一定の安定した活性を有するか、又は副次試料の凝血反応においては不活性である(血液中の生理学的抗トロンビン剤に対して不活性である)較正化合物を添加することと、前記較正化合物と第2の副次試料との得られた混合物を、シグナル基質と前記第2の副次試料のタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物に関連する検出可能なシグナルをもたらすシグナル基質と接触させることと、
g)第2の副次試料との、ステップf)で得られた前記混合物を、本明細書で定義した発明の方法のステップb)及びc)にかけることと、
h)第2の副次試料における検出可能なシグナル発生の経時変化を決定して、経時的なタンパク質分解酵素活性の結果を、特に曲線として提供することと、
i)ステップg)で得られた結果を、ステップd)で得られたタンパク質分解酵素活性の結果と比較して、第1の副次試料における時間内のタンパク質分解酵素活性の較正された結果を、特に、較正された曲線として得ること。

上で定義した通りの、本発明の方法を実施するための一定の公知の安定したタンパク質分解活性を有する適切な較正化合物としては、α₂M-トロンビン複合体(α2-M-T)、スタフィロコアグラーゼ-プロトロンビン複合体、及びγトロンビンが挙げられる。或いは、(そのタンパク質分解のための活性中心は完全なままであるが、反応混合物中でのタンパク質とのその機能的相互作用は消失しており、その結果、反応混合物中で起こる凝血反応においては不活性であるとみなされるので)その第2の認識部位において修飾された任意のタンパク質分解酵素を使用することができる。

本発明の方法及び試薬は、フィブリン血餅を形成する血液の特性及びタンパク質分解酵素産生に関する血液の特性を測定する際の使用に適している。

タンパク質分解酵素産生の測定、及び血餅強度の同時測定を実施するために設計された、本発明の一実施態様によるレオメーターを、図2及び3に示す。前記レオメーターは、円錐エレメント4をその下端で支持するシャフト3を駆動するモーター2を有する頭部1を備える。円錐エレメント4のチップ5は、下向きであり、基部7の上部プレート6と面している。円錐体4の角度θは、例えば0.1°から5°、好ましくは0.5°である。

頭部1はまた、シャフト3の回転速度、及び/又はモーター2によってシャフト3に及ぼされるトルクを測定するための手段8を備える。任意に、シャフト3上に暗色フード9がスライド可能なように備え付けられる。この場合、フード9の位置は、対応する手段10によって調節することができる。円錐体4のチップ5と基部7の上部プレート6との間の、又は円錐体4のチップ5とホルダー14の底面14’との間の、ギャップg(測定ギャップ)を設定するために、基部7に対する頭部1の位置は、手段11によって制御される。

上部プレート6上に置かれた試料13によって放出される蛍光シグナルを数量化するために、蛍光光度計12は、基部7に備え付けられる。試料13は、例えば、カップ様ホルダー14に入れられる。ホルダー14と上部プレート6は両方とも、少なくとも部分的に透明であり、試料13によって放出された蛍光シグナルの数量化が可能になる。

分析中、試料ホルダー14は、基部7の上部プレート6上に置かれ、円錐体4は、ギャップgを調節するために、手段11によって下げられる。前記ギャップは、例えば10μmから2mm、好ましくは最大で100μmである。フード9はまた、試料ホルダー14をカバーして蛍光シグナルのいかなる喪失も防止するために下げられる。

分析中、試料13によって放出された蛍光シグナルはまた、経時的なトロンビン濃度の変化を決定するために、ホルダー14及び上部プレート6を通って、蛍光光度計12によって測定される。

本発明によれば、レオメーターを使用する場合、生物学的試料に適用される回転力は、前記血管環境における血液を反映するように選択される。したがって、動脈環境については、ずり速度は、800から3000s-1の範囲内であり;静脈環境では、回転力は、50から800s-1の範囲内である。振動力が適用される場合、これは、0.1s-1から300s-1の範囲内であり得る。

本発明の方法は、ステップa)において生物学的試料を用いて得られた混合物に回転力を適用して実施される。測定システムを回転させることによって、インビボで生じる静脈及び動脈血流のずり速度をシミュレーションすることができ、インビトロでの流動中の血液凝固/血餅溶解を研究することが可能になり、インビボ状況に、より厳密に似せた条件下での血小板機能及び線維素溶解に関する情報が提供される。

したがって、本発明は、凝血傾向を決定するために、生理学的環境における、或いは、特に患者の臨床状態を決定するために若しくはモニタリングするために又は治療法計画若しくは治療法モニタリングを実施するために、病理学的環境における、止血を研究するための試薬及び方法を提供する。特定の実施態様では、本発明の方法、試薬、及びキットは、患者における血栓症又は出血に直面するリスクの決定のために使用される。

本発明は、インビボでの血流を模倣する操作条件を提供することにおいて、様々な血管環境、特に動脈、静脈、又は腫瘍微小循環を研究するために使用することができる。

本発明の特定の態様によれば、分析される生物学的試料の前記第1の副次試料は、研究中のタンパク質分解システム、例えば止血-血栓形成システムに対するその影響について試験されることとなる薬物又は医薬品をさらに含む。本発明の方法において試験することができる適切な医薬品は、抗血栓剤、例えば抗血小板剤及び抗凝血剤、例えばヘパリン、デルマタン硫酸、直接トロンビン阻害剤、例えばヒルジン、アルガトロバン、又はメラガトラン、及び第Xa因子阻害剤、例えばダニ抗凝固タンパク質である。

別の本発明の態様によれば、該方法は、患者に投与された薬物の、止血-血栓形成システムに対する効果をモニタリングするために実施される。こうした薬物としては、抗凝血薬、特にすべてのタイプのヘパリン、直接トロンビン阻害剤、又は他の抗血栓剤、例えば上に引用したものなどが挙げられる。

分析される生物学的試料を含有するプレートと測定システムとの間に形成される、生物学的試料の薄層における蛍光を測定することによって、先に記載した内部フィルター効果の影響が小さくなる。

本発明はまた、以下のために使用される場合の、本明細書で定義した通りの方法に関する:
-決定された物質、特に薬物又は医薬品の、生物学的試料中のトロンビン活性及び血餅強度に対する効果を検出する又はモニタリングするために(ここでは、前記決定された物質(1又は複数)は、分析されることとなる試料に添加される、又はトロンビン産生中に添加される)、又は
-薬物の、この薬物で治療中の患者の生物学的試料に対する効果をモニタリングするために、又は
-物質をスクリーニングして、該物質のトロンビン産生又は線維素溶解又は凝血との相互作用能力を決定するために、
-止血-血栓形成システムにおける分子の欠乏を評価するために、又は
-血餅開始を開始するのに必要なトロンビンの最小量を決定するために。

本発明はまた、タンパク質分解酵素活性の推移の決定のための、また、生物学的試料中の形成されたフィブリン血餅の強度の同時決定のためのキットであって、以下を含むキットに関する:
-回転式レオメーター上での使用に適した透明な底面を有する使い捨ての試料ホルダー中の、シグナル基質と、誘発された試料中で産生されるタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物に関連する検出可能なシグナルをもたらすシグナル基質の組成物、並びに該試料中のタンパク質分解酵素活性を誘発するための組成物、
-任意に、シグナル基質に対する一定の安定したタンパク質分解酵素活性を有する較正化合物、
-任意に、生物学的試料への添加に適した緩衝液、例えば、20mM HEPES及びウシ血清アルブミン5mg/mlを含む、pH=7.35のBSA5緩衝液。

本発明を、これから、本発明の範囲をいかなる点でも限定すると解釈されるべきではない以下の実施例によって、さらに例示することとする。

(実験)
(反応混合物)

血液は、静脈穿刺によって入手した(9体積の血液に対して1体積のクエン酸三ナトリウム0.13M)。自由流又は最小吸引が用いられ、また、真空容器は避けられるべきである。乏血小板血漿(PPP)は、血液の2630gで10分間の2回の遠心分離によって入手した。

ポリブレン又はCa⁺⁺を含有しない組み換え型再リン酸化(relipidated)組織因子(rTF)を、Dade Behring社(ドイツ、Marburg)から得た。各実験のために、組織因子(TF)とリン脂質ベシクル(PL)(Avanti社、アメリカ合衆国アラバマ州Alabaster)との新鮮な混合物を調製し、5pM TF及び4μM PL(5mg/l BSA(Sigma社、A-7030)を含有するHepes緩衝液(20mM、pH 7.35)中)の最終濃度をもたらした。組み換え型組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)は、ドイツ、Boehringer Ingelheim社から、actylase(商標)として入手した。蛍光発生基質(Z-Gly-Gly-Arg)₂Rho110は、Diagnostica Stago社(フランス、Asnieres)から入手し、300μMの濃度で使用した。これは、トロンビンによって分解される際に蛍光のローダミン(Rho)を放出し、これを、470nm励起及び520発光フィルターセットによって測定する。蛍光発生プラスミン基質、H-Ala-Leu-Lys-AMCは、Diagnostica Stago社から入手し、200μMの最終濃度で使用した。プラスミンによって放出された蛍光の7-アミノ-4-メチルクマリン(AMC)を、365nm励起及び430nm発光フィルターセットによって測定する。各実験について、蛍光発生基質とCaCl₂との新鮮な混合物(FluCa)を37℃で調製し、300μM Rho及び16.7mM CaCl₂(60g/l BSAを含有するHepes緩衝液(20mM、pH 7.35)中)の最終濃度をもたらした。

較正物質、すなわちα2M-トロンビン複合体(α2MT)を、以前に記載されている通りに［2］研究室内で調製した。α2M-トロンビンの濃度は、発色性基質S2238を加水分解するその能力によって測定される。該調製物のアミド分解活性を、最終反応物において100nMヒトトロンビンと同じ活性を有するように調節した。ウシ抗トロンビン及びヘパリン(LEO)を添加した後、この材料は、トロンビン較正物質として使える状態であった。

蛍光の脱離基を伴うシグナル基質を使用して、蛍光検出器を介してトロンビン産生を測定した。形成されたフィブリン血餅の強度を、特別に設計されたレオメーター(Physica MCR 301、Ostfildern、Anton Paar Germany社)の振動又は回転測定システムによってモニタリングした。

合計700μl(血漿の場合)又は800μl(血液の場合)の試料及び基質を、レオメーターの37℃の温度制御された試料ホルダー上に添加した。この混合物は、試料(468μl血漿又は700μl血液);TF-PLミックス(又は較正物質)(血漿の場合116μl;血液の場合50μl)及びFluCa(血漿の場合116μl;血液の場合50μl)を含有していた(以下の順序で添加することによって調製した)。FluCaの添加の直後に、10秒ごと及び1秒ごとに、それぞれ470/520nmで、粘度(測定システムの振動の場合トルク)及び蛍光を測定した。

(実施例1)
(粘度検出に基づく血餅強度と関連するトロンビン産生)
トロンビン産生を、内蔵の蛍光光度計を備えたMCR301レオメーターのガラス上で、先に示した通りに全血中で誘発した。FluCa溶液の添加の直後に、レオメーターの測定システムを、ゼロギャップポジションに設定し、10Hzの頻度及び1°の角度で振動にかけた。誘発された試料(試料の第1の部分、すなわち、第1の副次試料)と、較正物質を含有する試料(試料の第2の部分、すなわち、第2の副次試料)との両方について、トルク及び蛍光を、先に示した通りに測定した。較正物質の使用によって、蛍光の光の吸収及び消光による、蛍光シグナルのドナー依存性の影響が防げられる。依然として基質を変換する能力がある、試料中に存在するα2M-トロンビンの補正後、較正物質曲線に基づいて、先に記載した通りに、誘発された試料についてのトロンビン産生曲線を決定した。2回の測定の平均を、図3(上のパネル)に示す。血餅開始(下のパネルにおいてトルクとして示される)は、トロンビン産生の最初に既に始まっている。興味深いことに、300U/mlの濃度の組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)を添加することによって、血液試料(内線)中で線維素溶解を起こすことができた。

(実施例2)
(粘度検出;血流のシミュレーションに基づくフィブリン形成と関連するトロンビン産生)
トロンビン産生を、内蔵の蛍光光度計を備えたMCR301レオメーターのガラス上で、先に示した通りに乏血小板血漿又は全血中で誘発した。FluCa溶液の添加の直後に、レオメーターの測定システムを、ゼロギャップポジションに設定し、回転を施した。測定システムのこの回転は、血流のシミュレーションを可能にし、100〜300/sのずり速度は、静脈血流に、800/s超のずり速度は動脈血流に相当する。誘発された試料と、較正物質を含有する試料との両方について、粘度及び蛍光を、先に示した通りに測定した。測定は3連で行い、平均を図5a(乏血小板血漿)及び5b(全血)に示す。乏血小板血漿では、100/sよりも大きいずり速度は、トロンビン産生及び血餅強度の低下をもたらした。血餅強度に対する効果は、全血で繰り返されたが、トロンビン産生に対する効果は、異なっていた。

(実施例3)
(トロンビン産生及び血餅強度に対するDoolittleペプチドの効果の視覚化)
トロンビン産生を、内蔵の蛍光光度計を備えたMCR301レオメーターのガラス上で、先に示した通りに乏血小板血漿中で誘発した。この試料及び対応する較正物質に、0.5mMから2mMまでの漸増濃度のDoolittleペプチド(Gly-Pro-Arg-Pro)を添加した。Doolittleペプチドは、高親和性でフィブリノゲンと結合し、フィブリン重合の阻害がもたらされる。FluCa溶液の添加の直後に、レオメーターの測定システムを、ゼロギャップポジションに設定し、回転を施し、300/sのずり速度をもたらした。誘発された試料と、較正物質を含有する試料との両方について、粘度及び蛍光を、先に示した通りに測定した。測定は2連で行い、平均を図6に示す。予想通り、漸増量のDoolittleペプチドは、対照試料と比較して、試料の粘度を有意に低下させた(上のパネル)。トロンビン産生に対する影響は最小限であった(下のパネル)。

(実施例4)
(対照-対-脱フィブリン化血漿におけるトロンビン産生及び血餅強度)

トロンビン産生を、内蔵の蛍光光度計を備えたMCR301レオメーターのガラス上で、先に示した通りに対照及び脱フィブリン化血漿中で誘発した。FluCa溶液の添加の直後に、レオメーターの測定システムを、ゼロギャップポジションに設定し、回転を施し、300/sのずり速度をもたらした。粘度及び蛍光を、先に示した通りに測定した。結果を図7に示す。予想通り、血漿の脱フィブリン化は、トロンビン産生に対する明らかな影響を伴わずに(ETPとして示す;下のパネル)、粘度の増大の完全な消失(上のパネル)をもたらした。

(実施例5)
(組織プラスミノゲン活性化因子によって誘発された乏血小板血漿におけるプラスミン産生及び血餅強度)

血餅開始を、内蔵の蛍光光度計を備えたMCR301レオメーターのガラス上で、100U/ml tPAの存在下で、先に示した通りに乏血小板血漿中で誘発した。Caを含有するプラスミン基質溶液の添加の直後に、レオメーターの測定システムを、測定ギャップポジションに設定し、回転(300/s)を施した。誘発された試料と、較正物質を含有する試料との両方について、蛍光及び粘度を、先に示した通りに測定した。生の蛍光及び粘度データを、それぞれ、図8の上及び下のパネルに示す。結果は、フィブリンの分解(粘度の低下)をもたらす、tPAによるプラスミンの活性化を明らかに示す。

したがって、本発明は、血液/血漿試料における、タンパク質分解活性、特にトロンビン活性の推移と、血餅の強度とを同時にかつリアルタイムで決定する便利な試験方法を提供する。この試験は、連続的なシグナルを提供し、それによって、形成された生成物の量のエンドポイント決定のみを使用する方法と比較した場合に、ラグタイム、ピーク高、及びピークまでの時間などのパラメーターに関する、より価値のある正確な情報が与えられる。重要なことには、本発明は、静脈及び動脈血流におけるインビボでのずり速度に似せた条件で、トロンビン産生及び血餅強度のインビトロ調査を可能にし、血小板機能及び線維素溶解に関する価値ある情報を可能にする。血餅が、損傷の部位で、せん断応力に耐えなければならないという事実を踏まえると、静脈及び動脈血流のずり速度をシミュレーションすることは重要である。
（参考文献）

Claims (23)

1. 生物学的試料中において、タンパク質分解酵素活性と形成されたフィブリン血餅の強度の両方を、インビボでの血流条件をシミュレーションしながら、リアルタイムにインビトロで同時決定するための方法であって、以下のステップを含む、前記方法：
   a) 該生物学的試料における凝血を可能にするように、該生物学的試料におけるタンパク質分解酵素の産生を誘発することと、その生物学的試料を、シグナル基質と産生されたタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物と関連する検出可能なシグナルを引き起こす該シグナル基質と接触させ、それによって、試料混合物を提供することと、
   b) a)で得られた試料混合物を薄層として試料ホルダーに広げることと、レオメーター測定システムと、a)で得られた試料混合物との間の測定ギャップを設定することと、ここで、該試料ホルダーは、該シグナル基質とタンパク質分解酵素との反応後に得られた検出可能なシグナルの測定に適したものである、
   c) b)で得られた試料混合物に該レオメーター測定システムによって回転力を適用し、それによって、決定されたインビボでの生理学的又は臨床的状態の、インビボでの静脈又は動脈血流をシミュレーションすることと、
   d) c)で得られた試料混合物における検出可能なシグナルの発生を一定期間にわたり測定することによって、タンパク質分解酵素活性を決定することと、
   e) 該レオメーター測定システムを用いて、一定期間にわたりc)で得られた試料混合物の粘度の増大を測定することによって、c)で得られた試料混合物中で形成されたフィブリン血餅の強度を同時に決定すること。
2. ステップb)において、前記試料ホルダー中の試料の層が、0.05から5mmの範囲内、又は1から3mmの範囲内、又は2mmの厚さを有する、請求項１記載の方法。
3. ステップd)において、一定期間にわたる前記タンパク質分解酵素活性の結果が、曲線として提供される、請求項１又は２記載の方法。
4. ステップb)において、前記レオメーター測定システムと前記試料混合物との間で設定された前記測定ギャップが、ゼロギャップである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
5. 決定されたタンパク質分解酵素活性と、前記アッセイされた生物学的試料中で形成されたフィブリン血餅の強度とをリアルタイムで決定するための請求項１〜４のいずれか一項記載の方法であって、
   該生物学的試料を、第1の副次試料と第2の副次試料を含めた副次試料と呼ばれる少なくとも2つの部分に分割する最初のステップを更に含み、
   請求項１記載のステップa)からe)が、第1の副次試料に対して実施され、かつ以下のステップf)からi)が、決定されたタンパク質分解酵素の活性の測定結果の較正のために、第2の副次試料に対して実施される、前記方法：
   f) 凝血しない副次試料である第2の副次試料に、前記決定されたタンパク質分解酵素のためのシグナル基質に対する一定のかつ安定した活性を維持するか、又は該副次試料の凝血反応においては不活性である較正化合物を添加することと、該較正化合物と第2の副次試料との得られた混合物を、シグナル基質と該第2の副次試料のタンパク質分解酵素との反応時に放出される変換生成物に関連する検出可能なシグナルをもたらす該シグナル基質と接触させることと、
   g) 第2の副次試料を用いてステップf)で得られた混合物を、請求項１で定義したステップb)及びc)にかけることと、
   h) g)で得られた試料混合物における検出可能なシグナルの発生を一定期間にわたり測定することによって、タンパク質分解酵素活性を決定することと、
   i) ステップh)で第2の副次試料に対して得られたタンパク質分解酵素活性を、ステップd)で第1の副次試料に対して得られたタンパク質分解酵素活性と比較して、第1の副次試料についての経時的なタンパク質分解酵素活性の較正された結果を提供すること。
6. ステップh)において、前記経時的なタンパク質分解酵素活性の結果が、曲線として提供される、請求項５記載の方法。
7. ステップi)において、前記第1の副次試料についての経時的なタンパク質分解酵素活性の較正された結果が、較正された曲線として提供される、請求項５又は６記載の方法。
8. ステップb)で得られた混合物に、回転力に加えて、振動力が適用される、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
9. 前記生物学的試料が、全血、多血小板血漿、乏血小板血漿、及び無血小板血漿からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
10. 前記タンパク質分解酵素活性が、活性化された凝固因子活性、活性化された線維素溶解因子活性、及び補体系活性の活性化された成分からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
11. 前記タンパク質分解酵素活性が、トロンビン活性である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
12. 前記シグナル基質が、該シグナル基質と形成されたタンパク質分解酵素との反応時に、検出可能な変換生成物として選択的に放出される脱離基を含む化合物からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
13. 前記形成されたタンパク質分解酵素が、トロンビンであり、かつ前記シグナル基質が、トロンビンに対する中程度の結合親和性及び低い動力学定数を有する、トロンビンによって選択的に加水分解される蛍光発生基質である、請求項１２記載の方法。
14. 前記シグナル基質が、蛍光分子と結合された、トロンビンに対する合成の基質である、請求項１３記載の方法。
15. 前記蛍光発生基質が、蛍光分子と結合された、2から30個のアミノ酸残基の配列を有するオリゴペプチドである、請求項１３記載の方法。
16. 前記オリゴペプチドが、蛍光分子と結合するための末端リシン又はアルギニンを有する、請求項１５記載の方法。
17. 前記シグナル基質が、(Z-Gly-Gly-Arg)₂Rho110又はZ-Gly-Gly-Arg-AMCである、請求項１６記載の方法。
18. 前記生物学的試料を誘発するプロテアーゼ活性化因子が、リン脂質、組織因子、可溶性の組織因子、トロンボプラスチン、カオリン、及びエラグ酸からなる群から選択され、かつ、凝血反応を誘発する試薬が、カルシウムイオンである、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
19. 止血又は血栓形成疾患を検出する又はモニタリングするために使用される場合の、請求項１〜１８のいずれか一項記載の方法。
20. 以下のために使用される場合の、請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法:
    -生物学的試料中のトロンビン活性及び血餅強度に対する決定された物質の効果を検出する又はモニタリングすること(ここで、該決定された物質は、分析される試料に添加されるか、又はトロンビン産生中に添加される)、又は
    -薬物による治療中の患者の生物学的試料に対する該薬物の効果をモニタリングすること、又は
    -物質をスクリーニングして、該物質のトロンビン産生又は線維素溶解又は凝血との相互作用能力を決定すること、
    -止血-血栓形成システムにおける分子の欠乏を評価すること、又は
    -血餅開始を引き起こすのに必要なトロンビンの最小量を決定すること。
21. 前記決定された物質が、薬物又は医薬品である、請求項２０記載の方法。
22. 請求項１〜２１のいずれか一項記載の、生物学的試料中において、タンパク質分解酵素活性と形成されたフィブリン血餅の強度を、インビボでの血流条件をシミュレーションしながら、リアルタイムにインビトロで同時決定するための方法における、生物学的試料の血餅強度及び該生物学的試料から放出される蛍光シグナルの両方を測定するための回転式レオメーターの使用であって、該回転式レオメーターが、
    a. プレート(14')を備える基本エレメント(6)、及び
    b. 円錐体(4)を含む回転エレメント(4)、
    ここで、該基本エレメント(6)及び回転エレメント(4)は、それらの間に、試験される試料(13)の導入のために、該円錐体(4)のチップ(5)と該プレート(14')との間に形成されている測定ギャップ(g)を画定し、該試料は、試料ホルダー(14)に含有されている、
    c. 該回転エレメント(4)の回転速度、若しくは該回転エレメント(4)に適用されるトルクのいずれか、又はその両方を測定するための手段(8)、
    d. 該生物学的試料(13)から放出された蛍光シグナルを数量化するための蛍光光度計(12)、
    ここで、該基本エレメント(6)は透明な表面(7、14)を備え、該表面(7、14)の下方に設置された蛍光光度計(12)によって、該表面(7、14)を通過した試料(13)から放出された蛍光シグナルの検出及び数量化を可能にする、
    を備える、前記使用。
23. 材料を前記試料ホルダーに配置して、血液凝固に対する該材料の効果を研究し、該材料生体適合性を研究することができる、請求項２２記載の回転式レオメーターの使用。

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