JP6395925B2

JP6395925B2 - 遺伝子解析システム

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Publication number: JP6395925B2
Application number: JP2017511414A
Authority: JP
Inventors: 麻衣子田邉; 白井　正敬; 正敬白井; 友幸坂井
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Publication date: 2018-09-26
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Description

本発明は、任意の遺伝子領域の解析を行うシステムに関する。より具体的には、単一細胞レベルで任意の遺伝子領域の情報を解析することのできるシステム、方法及びキットに関する。

生物は、ゲノム上に保持された遺伝子情報をmRNAに転写して（遺伝子発現）、その情報を基にタンパク質を合成する。そして、タンパク質の生体機能によって生命活動を行っている。近年、そのような生体機能を分子レベルで網羅的に解析して、生物を包括的に理解しようとする研究が急速に進展している。このような網羅的な解析で得られた知見より、例えば病態細胞や免疫細胞の機能を解明することができ、疾病の原因解明や新薬の開発へ応用することが可能となる。

網羅的な解析を行う手段として注目を集めているのが、生体機能情報をより直接的に取得できるゲノム解析や、mRNAの発現量及び配列に基づく遺伝子発現解析である。解析試料には、通常、多数の細胞からなる組織や培養細胞が用いられている。しかし、同じ組織内の細胞でも、遺伝子の発現状況は細胞ごとに、また時間ごとに異なる。従って、組織の機能を正確かつ詳細に理解するためには、組織を構成する細胞を、複数ではなく1細胞ごとに解析し、その遺伝子発現情報に基づいて組織全体を包括的に捉える必要がある。1細胞中の遺伝子発現解析方法としては、近年の大容量次世代DNAシークエンサの技術発展により、膨大な数の遺伝子について発現状況を詳細に知ることができるようになっている。

解析対象となる生体組織において、細胞は個々に独立して活動しているわけではなく、相互に情報交換を行いながら互いに関与し合っている。そのため、生命現象の詳細を知るには、解析対象の細胞の周辺に存在する多くの細胞に対し、細胞の位置情報を含めた1細胞解析を行うことが必要となる。その解析対象となる細胞群を構成する細胞数は、数百、場合によっては数万以上に及ぶ。細胞群について1細胞ごとに遺伝子発現解析を行う場合には、細胞ごとに個別の反応槽で反応を行わなくてはならない。細胞をひとつずつ個別の反応槽へ分離する一般的な手段としては、セルソーターや、マイクロ流路を用いたデバイスが用いられているが、これらの方法では事前に細胞を個々に分離する必要があるため、細胞の位置情報と遺伝子発現解析データを対応付けることができない。また、反応槽へ試薬を分注する際には、マニュアルまたはロボットによることが想定されるが、分注精度の問題より試薬を含む反応液量はμL相当となり、解析細胞数が多くなるほど試薬コストが高価となる。

この問題を解決するためのアプローチとして、特許文献１〜３には、多孔質メンブレン及びスライドガラスを利用した相補鎖DNA（cDNA）ライブラリーの製造方法が開示されている。これらの方法では、多数の細胞又は生体組織の切片をデバイス上に配置してmRNAを抽出することで、各細胞直下に存在する複数の領域に細胞ごとのmRNAを捕捉できる。そのため、細胞が捕捉される領域（以下細胞保持領域と記載）ごとに配列が異なるタグ配列と、抽出されたmRNAを捕捉するための配列を持つ核酸プローブをデバイス上に配し、各核酸プローブを起点にcDNAを合成することで、細胞ごとに異なるタグ配列をcDNAへ導入することができる。この製造方法で構築した複数の細胞保持領域から成るcDNAライブラリーアレーより、一括して大容量DNAシーケンサでタグ配列を含む遺伝子配列を解析することで、位置情報を保持した状態で1細胞由来の遺伝子発現解析を行うことが可能となる。また、デバイス上で多数の細胞を1細胞ごとに並列処理することが可能となるため、必要な試薬量を約1/100以下に低減することが可能となり、試薬コストが低減できる。しかし、この方法ではmRNAの3’末端の配列にしかタグ配列を導入できない。大容量DNAシーケンサで解析するためには、塩基配列解析に都合のよい長さに調整する必要があるが、現状の方法で任意の遺伝子領域の解析を行うためには、cDNAを都合のよい長さに切断した後に断片にタグ配列を導入する必要がある。その場合、cDNAを切断した際にデバイス上の各細胞保持領域間で切断断片が混在してしまう。また、タグ配列付ランダム配列によりmRNAまたはcDNAを鋳型として、都合の良い長さの相補配列を合成する方法も考えられるが、異なるタグ配列付ランダム配列をデバイス上の細胞保持領域ごとに導入しなければならないためにロボットを使用する必要があり、結果として試薬コストの低減が難しくなるという問題が生じてしまう。

WO 2011/068088号公報 WO 2014/020657号公報 US 2014/0066318号公報

本発明の目的は、上記課題を解決するために、細胞保持領域ごとに1細胞由来のcDNAライブラリーを作製し得る複数の細胞保持領域を含むデバイスを用いて、各細胞由来の遺伝子の任意の遺伝子領域について識別可能な遺伝子解析システムを開発し、提供することである。また、その遺伝子解析システムを用いて数百以上の細胞群から、位置情報を保持して細胞ごとに遺伝子発現を一括解析する方法を提供することである。

上記問題を解決するために種々検討した結果、本発明者らは、複数の細胞捕捉領域を含むデバイス上及び内部に捕捉された1細胞又は複数の細胞由来のmRNAを鋳型としてcDNAを作製した後に、該cDNAを領域間での混合を生じさせずに再度捕捉した上で、各cDNAの領域ごとに固有のタグ配列を導入し得る新たな技術を開発した。

すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）基板上に配置された細胞保持領域と、該細胞保持領域内に配置され、細胞から抽出された一本鎖核酸を捕捉するための配列を有する第１プローブとを含む、一本鎖核酸捕捉手段と、
捕捉された一本鎖核酸と同じか又は相補的な配列を有する核酸を反応産物として前記細胞保持領域内で合成する反応産物合成手段と、
前記細胞保持領域内に配置され、前記反応産物を捕捉するための配列を有する第２プローブを含む反応産物捕捉手段と、
前記反応産物の核酸と同じか又は相補的な配列を有し、かつ前記細胞保持領域に固有のタグ配列を有するタグ配列導入産物を合成するタグ配列導入手段と、
前記タグ配列導入産物を増幅する核酸増幅手段と、
を含む、遺伝子解析システム。
（２）前記反応産物合成手段が、捕捉された一本鎖核酸と相補的な核酸を反応産物として前記細胞保持領域内で合成するものであり、
前記タグ配列導入手段が、前記反応産物の核酸と相補的な配列を有するタグ配列導入産物を合成するものである、（１）に記載のシステム。
（３）前記反応産物合成手段が、捕捉された一本鎖核酸と相補的な配列を有する核酸を第１の反応産物として前記細胞保持領域内で合成し、次いで前記第１の反応産物の核酸と相補的な配列を有する核酸を第２の反応産物として合成するものであり、
前記タグ配列導入手段が、前記第２の反応産物の核酸と相補的な配列を有するタグ配列導入産物を合成するものである、
（１）に記載のシステム。
（４）前記第１プローブ及び第２プローブが異なる配列を有し、第２プローブが各細胞保持領域に固有のタグ配列を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載のシステム。
（５）前記第１プローブ及び第２プローブが同じプローブであり、各細胞保持領域に固有のタグ配列を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載のシステム。
（６）前記第２プローブが核酸増幅のためのプライマーとして機能する共通配列及び／又は核酸増幅補正配列をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載のシステム。
（７）前記反応産物を、一本鎖核酸の一部に相補的な配列を含むプライマーを用いて合成する、（１）〜（６）のいずれかに記載のシステム。
（８）前記プライマーが、核酸増幅のためのプライマーとして機能する共通配列をさらに含む、（７）に記載のシステム。
（９）前記第１プローブ及び／又は第２プローブが、細胞保持領域内に保持された同一の又は異なる担体に固定される、（１）〜（８）のいずれかに記載のシステム。
（１０）前記第１プローブ及び／又は第２プローブが、接合分子を介して細胞保持領域又は該領域に保持された担体に固定される、（１）〜（９）のいずれかに記載のシステム。
（１１）前記核酸増幅手段が、前記共通配列と、前記タグ配列導入産物と相補的な配列とを用いた酵素反応による増幅を行うものである、（６）〜（１０）のいずれかに記載のシステム。
（１２）試料中の細胞を保持することが可能な領域に細胞を保持する工程と、
上記細胞から抽出された一本鎖核酸を第１プローブとハイブリダイズさせて捕捉する工程と、
前記一本鎖核酸と同じか又は相補的な配列を有する核酸を反応産物として合成する工程と、
前記第１プローブと同じか又は異なり、前記反応産物を捕捉するための配列を有し、かつ前記領域に固有のタグ配列を有する第２プローブとハイブリダイズさせて捕捉する工程と、
前記反応産物の核酸と同じか又は相補的な配列を有し、かつ前記細胞保持領域に固有のタグ配列を有するタグ配列導入産物を第２プローブと連結して合成するタグ配列導入工程と、
前記タグ配列導入産物を増幅させる工程と、
を含む、遺伝子解析方法。
（１３）（１２）に記載の方法に使用するための遺伝子解析用キットであって、
細胞保持領域を一個又は複数個含む基板と、前記細胞保持領域内に配置され、細胞から抽出された一本鎖核酸と相補的な配列を含む第１プローブと、前記細胞保持領域内に配置され、前記反応産物を捕捉するための配列を有する第２プローブと、を含む遺伝子解析用デバイス、
前記各工程で使用する酵素及び反応試薬、及び
核酸合成のためのヌクレオチド
を含む、キット。
（１４）細胞保持領域を一個又は複数個含む基板と、前記細胞保持領域内に配置され、細胞から抽出された一本鎖核酸と相補的な配列を含む第１プローブと、前記細胞保持領域内に配置され、前記反応産物を捕捉するための配列を有する第２プローブと、を含む遺伝子解析用デバイス、
前記各工程で使用する酵素及び反応試薬、及び
核酸合成のためのヌクレオチド
を含む遺伝子解析用キットであって、前記一本鎖核酸の一部とハイブリダイズして反応産物を合成することができるプライマーを含む、前記キット。
（１５）前記酵素が、反応産物の末端へ特異的に核酸を付加する酵素を含む、（１３）又は（１４）に記載のキット。

本発明によれば、単一細胞の解析に要する労力と同じ労力で、1細胞ごとに多数の細胞の遺伝子情報を網羅的に解析することができる。

また、本発明は、遺伝子診断、創薬、及び癌等の疾患の解明や再生医療への応用が可能であり、生命科学の発展にも寄与し得る。

本発明の遺伝子解析システムにおける基板構成の一実施形態を示す概略図である。（ａ）各細胞がそれぞれ１つの細胞保持領域に保持され、プローブが細孔メンブレンに直接固定されている態様、（ｂ）１細胞が複数の細胞保持領域に保持され、プローブが細孔メンブレンに直接固定されている態様、（ｃ）複数の細胞が１つの細胞保持領域に保持され、プローブが細孔メンブレンに直接固定されている態様。本発明の遺伝子解析システムにおける基板構成の一実施形態を示す概略図である。（ｄ）各細胞がそれぞれ１つの細胞保持領域に保持され、プローブが担体に固定されている態様、（ｅ）各細胞がそれぞれ１つの細胞保持領域に保持され、プローブが細孔メンブレンに直接固定されている態様。実施例１で用いた遺伝子解析システムにおける核酸プローブ構成及び各反応工程の例を概略的に示した図である。本発明の遺伝子解析システムにおける核酸プローブ構成の例を示した図である。本発明の反応フローの一実施形態を示した図である。実施例２で用いた遺伝子解析システムにおける核酸プローブ構成及び核酸プローブの固定形態を示した図である。本発明の遺伝子解析システムにおける核酸プローブ構成及び各反応工程の例を概略的に示した図である。本発明の反応フローの一実施形態を示した図である。実施例３で用いた遺伝子解析システムにおける基板構成、核酸プローブ構成及び核酸プローブの固定形態を示した図である。（ａ）及び（ｂ）は、遺伝子解析システムの基板内の細胞保持領域の構成を、（ｃ）は、核酸プローブの担体への固定形態を示す。本発明の遺伝子解析システムにおける核酸プローブ構成及び各反応工程の例を概略的に示した図である。実施例４で用いた遺伝子解析システムにおける基板構成、核酸プローブ構成及び核酸プローブの固定形態を示した図である。（ａ）は、各細胞がそれぞれ１つの細胞保持領域に保持され、プローブが担体に固定されている態様の基板構成を、（ｂ）及び（ｃ）は、核酸プローブの担体への異なる固定形態を示す。本発明の反応フローの一実施形態を示した図である。

１．遺伝子解析システム
本発明の遺伝子解析システムの構成について説明する。本発明の遺伝子解析システムは、基板、第１プローブ及び／又は第２プローブを必須の構成要素とするデバイスを含む。
１−１．基板
本発明の遺伝子解析システムにおいて「基板」とは、細胞保持領域を単数または複数個含む支持体をいう。

基板の素材は、DNA及びRNAの遺伝子発現解析のために当技術分野で一般的に使用されている材料で作製されたものであれば特に限定されるものではない。例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等やステンレス等の合金からなる金属；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ及び感光性ガラス等のガラス材料（これらの材料は基本的に透明である）；ポリエステル樹脂、ポリスチレン、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂（Acrylonitrile Butadiene Styrene樹脂）、ナイロン、アクリル樹脂及び塩化ビニル樹脂等のプラスチック（一般には透明でないが光学計測を可能とするために透明とすることが望ましい）；アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、ニトロセルロース、キチン、キトサンが挙げられる。

基板は、異なる二以上の素材から構成されていてもよい。例えば、基板底部に細孔付きシート（細孔メンブレン）を有する基板の場合、基板骨格が前記プラスチックや金属等で構成され、細孔付きシートが、例えば、アルミナ、ガラス、及びシリコン製のフィルム；アクリルアミドゲル、ゼラチン、修飾ポリエチレングリコール、修飾ポリビニルピロリドン、及びハイドロゲル製のゲル薄膜；又はセルロースアセテート、ニトロセルロース又はこれらの混合メンブレン、及びナイロンメンブレン製のメンブレンで構成される場合等が該当する。

基板は、必要に応じてハウジング等の加工を行うことができる。また、波長300nm〜10000nmの光のうちの少なくとも一部の波長の光に対して透明な、すなわちこれらの波長の光を透過可能な材料で作製されていることが好ましい。これは、遺伝子発現の解析を基板上で光学的に行うことが可能となるためである。

「細胞保持領域」とは、基板上に配置された微小空間からなる区画であって、基板に供給された複数の細胞を一細胞ごとに保持可能なように構成することがでできる。細胞保持領域の形状は特に限定しない。例えば、平面状、円柱形、略円柱形、楕円柱形、略楕円柱形、直方形、略直方形、立方形、略立方形、円錐形、略円錐形、角錐形、略角錐形等が該当する。細胞保持領域の開口径は、細胞の直径よりも小さい大きさから細胞一つがちょうど収まる程度の大きさであればよい。つまり、1つの細胞を複数の領域または1領域で保持すればよい。例えば、直径5μm〜50μmの範囲にあればよい。あるいはまた、複数の細胞が１領域に保持される態様とすることもできる。細胞保持領域の深さは、細胞一つがちょうど収まる程度の深さ、例えば、5〜100μmの範囲にあればよい。また、組織切片等を解析する場合は深さや領域は上記範囲に限定されない。つまり、1領域あたり複数の細胞の全て、もしくは一部が保持されていても良い。一基板あたりの細胞保持領域の数は特に限定はしない。通常は、10〜10⁵個の範囲にあればよい。細胞保持領域は、基板上及び内部で反応セルとして機能することができる。

細胞保持領域は、後述する第１プローブ及び／又は第２プローブをその内部に配置するが、細胞及びプローブが同一区画内に存在し、細胞から抽出された核酸が同一区画に存在するプローブに捕捉される構成としても、あるいは、細胞及びプローブが別の区画に存在して、細胞から抽出された核酸が移動して別の区画に存在するプローブに捕捉される構成としても良い。

１−２．第１プローブ
本発明の遺伝子解析システムにおいて「第１プローブ」とは、核酸で構成されたプローブである。第１プローブは、原則としてDNAで構成されるが、それに限定するものではなく、例えば、RNAや人工核酸を含んでいてもよい。

第１プローブは細胞から抽出された核酸を捕捉する配列（以下核酸捕捉配列と記載）を含み、前記細胞保持領域内に配置される。必要に応じて、第１プローブは、タグ配列、及び／又は共通配列、及び／又は核酸増幅補正配列をさらに含む。以下、第１プローブを構成する各配列について具体的に説明する。

「核酸捕捉配列」とは、第１プローブを構成する必須の配列で、細胞保持領域に保持された細胞から抽出された一本鎖核酸の塩基配列の一部に相補的な配列、又はランダムな配列を含み、抽出された一本鎖核酸を捕捉するように構成されている。核酸捕捉配列の塩基配列は、標的である前記一本鎖核酸とハイブリダイズして、それを捕捉することができれば特に限定されない。それ故、核酸の種類及び配列を考慮して適宜設計することができる。本発明において、標的となる一本鎖核酸としては、メッセンジャーRNA（mRNA）、非コードRNA（ncRNA）、microRNA、及び一本鎖DNA、並びにそれらの断片が挙げられる。核酸捕捉配列の長さは、ハイブリダイゼーションによって標的となる一本鎖核酸を捕捉しうる長さであればよい。核酸捕捉配列は、一本鎖核酸の塩基配列の3’末端側又はそれに近い配列に相補的な配列であることが好ましい。

例えば、標的となる一本鎖核酸がmRNAの場合には、核酸捕捉配列としてmRNAの配列の一部であるポリA配列に相補的なオリゴ(dT)配列を用いることができる。オリゴ(dT)配列を構成するdTの重合度は、mRNAのポリA配列をハイブリダイゼーションによって捕捉しうる重合度であればよい。例えば、8〜40個、好ましくは8〜30個である。また核酸捕捉配列としてオリゴ(dT)配列を用いる場合には、その3'末端に2塩基のランダム配列を付加することが好ましい。それにより、mRNAの捕捉効率を上昇させ、またcDNAを合成する際のアーティファクトの量を大幅に低減させることが可能になる。そのようなランダム配列として、例えば、VN配列（VはA、G又はCであり、NはA、G、C又はTである）が挙げられる。

また、標的となる一本鎖核酸がmicroRNAやゲノムDNA由来の一本鎖核酸である場合には、ランダム配列を核酸捕捉配列として用いることができる。更に、一本鎖核酸の塩基配列の一部に相補的な配列を用いることによって、特定の配列を有する標的のみを捕捉することができる。

「タグ配列」とは、選択配列であって、細胞保持領域内の反応産物に付すべき細胞保持領域ごとの識別タグである。従って、細胞保持領域が複数個存在する場合には、タグ配列は、各細胞保持領域に固有の塩基配列を含む。タグ配列は、任意の長さの既知の塩基配列から構成される。例えば、タグ配列が5塩基長からなる場合には、4⁵（＝1024）種類の異なる細胞保持領域に固有のタグ配列を付与することができる。同様に、例えば、タグ配列が10塩基長からなる場合には、4¹⁰（＝1048576）種類の異なる細胞保持領域に固有のタグ配列を付与することができる。従って、タグ配列の長さは、遺伝子解析システム上の細胞保持領域の位置及び／又は数に応じて、それらを識別できるように適宜決定すればよい。具体的には、5〜30塩基とすることが好ましい。

タグ配列を構成する塩基配列は、細胞保持領域が基板上に複数個存在する場合、原則として細胞保持領域ごとに異なるが、複数の領域に共通していてもよい。例えば、一基板上において、5つの細胞保持領域ごとに共通のタグ配列を使用する場合が該当する。この場合、共通のタグ配列を使用する5つの細胞保持領域を一細胞保持領域とみなすこともできる。

「共通配列」とは、選択配列であって、本発明の遺伝子解析システムを用いた遺伝子解析方法の核酸増幅工程において、反応産物を増幅する際のフォワード（Fw）プライマー配列として機能し得る配列である。従って、原則としてプローブの5’末端側に配置されるが、限定するものではない。共通配列の塩基長は、プライマーとして適切な長さであれば特に限定されない。例えば、8〜60塩基長、好ましくは10〜50塩基長とすることができる。共通配列の塩基配列も特に制限はしないが、プライマー配列として適当なTm値を有する配列となるように設計することが好ましい。通常は、Tm値が50℃以上、好ましくは60℃以上となるようにすればよい。

「核酸増幅補正配列」とは、本発明の遺伝子解析システムを用いた遺伝子解析方法の核酸増幅工程における増幅バイアスを補正する配列である。一般に、核酸増幅工程では増幅対象の核酸断片の長さや配列構成、その存在位置等の諸条件によって各核酸断片の増幅効率にバイアスが生じるため、増幅産物の正確な定量を行うことが難しい。本方法において、個々の核酸断片に対して異なる核酸増幅補正配列を導入すれば、シークエンス解析の際に、同一の核酸増幅補正配列を有する複数のデータを同一の反応産物由来と見なして補正できる。そのため各工程で生じた増幅バイアスを補正することができる。核酸増幅補正配列の塩基長は、特に限定されない。例えば、5〜30塩基、好ましくは10〜20塩基、より好ましくは10〜15塩基の範囲にあればよい。核酸増幅補正配列の塩基配列もランダム配列を有するように設計し得る。

第１プローブが、核酸捕捉配列に加えて、タグ配列、共通配列、及び核酸増幅補正配列を含む場合、核酸捕捉配列が第１プローブの3’末端側に、また共通配列が第１プローブの5’末端側に配置されていれば、他の配列の並びは特に限定はしない。

第１プローブ及び後述する第２プローブ（本明細書では、しばしばこれらをまとめて「核酸プローブ」と称する。）は、細胞保持領域内に配置される。予め核酸プローブを細胞保持領域内に配置しておくことにより、細胞又は組織にダメージを及ぼすことなく、また後にロボット等で細胞領域ごとに供給することなく、個々の細胞に由来する核酸からの遺伝子情報を得ることが可能となる。特に、細胞又は組織にダメージを及ぼすことがないため、そのダメージに起因する遺伝子発現の変化を回避することができる。

ここでいう「配置」とは、所定の位置に適当な方法で直接的に及び／又は間接的に固定することをいう。

核酸プローブを細胞保持領域内に直接的に固定する例として、細胞保持領域内部の表面に固定する場合が挙げられる。固定する位置は問わない。例えば、細胞保持領域の底面、壁面、又は全面のいずれであってもよい。ここで、細胞保持領域が細孔メンブレンを有する場合には、細孔内部表面やメンブレンの繊維表面も細胞保持領域内部の表面に含まれる。

第１プローブを細胞保持領域内に間接的に固定する例として、細胞保持領域内の表面に保持された担体の表面に固定される場合が挙げられる。本明細書において「担体」は、細胞保持領域と核酸プローブを連結する介在物質で、核酸プローブをその表面に固定し、自身も細胞保持領域の内部表面に、必要に応じて解離可能な状態で固定されている。担体の素材は限定されず、例えば、樹脂材料（ポリスチレン等）、酸化物（ガラス、シリカ等）、金属（鉄、金、白金、銀等）、高分子多糖支持体（例えば、セファロース若しくはセファデックス）、セラミックス、ラテックス及びこれらの組み合わせで構成される。担体の形状は、特に限定はしないが、ビーズのような球体粒子は、結合表面積が大きく、操作性も高いことから好ましい。磁性ビーズは、後の回収操作等を考慮すれば、担体として特に好適である。

核酸プローブは、当技術分野で公知の任意の固定方法により細胞保持領域内に配置されている。固定方法としては、例えば、細胞保持領域内部の表面や担体の表面に生物学的結合、共有結合、イオン結合、又は物理吸着が挙げられる。また、スペーサー配列を介して両プローブを細胞保持領域内部の表面及び担体に固定することも可能である。

生物学的結合の例としては、ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンとの結合、抗原と抗体との結合等のような接合分子を介した結合が挙げられる。例えば、アビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンが結合した細胞保持領域内部の表面又は担体表面と、ビオチン修飾した核酸プローブを反応させることにより達成できる。

共有結合の場合、例えば、核酸プローブに官能基を導入し、その官能基に対して反応性の官能基を細胞保持領域内部の表面又は担体表面に導入して、両者を反応させることにより達成できる。具体的には、例えば、核酸プローブにアミノ基を導入し、細胞保持領域内部の表面又は担体表面に活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基又はイソシアネート基を導入することにより共有結合を形成できる。また、核酸プローブにメルカプト基を導入し、細胞保持領域内部の表面又は担体表面に活性エステル基、マレイミド基又はジスルフィド基を導入してもよい。官能基を細胞保持領域内部の表面又は担体表面に導入する方法として、所望の官能基を有するシランカップリング剤によって細胞保持領域内部の表面又は担体表面を処理する方法が挙げられる。カップリング剤の例としては、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン、N-β-(アミノエチル)-γ-アミノプロピルトリメトキシシラン、N-β-(アミノエチル)-β-アミノプロピルメチルジメトキシシラン等を用いることができる。官能基を細胞保持領域内部の表面又は担体表面に導入する他の方法として、プラズマ処理が挙げられる。

物理吸着の例としては、細胞保持領域内部の表面又は担体表面をポリ陽イオン（ポリリシン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン等）で表面処理し、核酸プローブの荷電を利用して静電結合させる方法等が挙げられる。尚、細胞保持領域内部や担体は、他の物質（核酸やタンパク質等）が吸着しないように、予め表面コーティングを行うことが好ましい。

１−３．第２プローブ
本発明の遺伝子解析システムにおいて「第２プローブ」とは、第1プローブと同様に核酸で構成されたプローブである。第２プローブも原則としてDNAで構成されるが、それに限定するものではなく、例えば、RNAや人工核酸を含んでいてもよい。尚、本発明の一部の態様においては、同じ核酸プローブを第１プローブ及び第２プローブとして使用することができるが、本明細書においては、便宜的に一本鎖核酸を捕捉するためのプローブを「第１プローブ」と、反応産物を捕捉してタグ配列導入産物を増幅するためのプローブを「第２プローブ」として記載する。

第２プローブは、「一本鎖核酸由来の反応産物を捕捉する配列（以下、反応産物捕捉配列と記載）」及び「タグ配列」を必須配列として含み、細胞保持領域内に配置される。第２プローブは、必要に応じて、共通配列、及び／又は核酸増幅補正配列をさらに含むことができる。第２プローブが反応産物捕捉配列、タグ配列、共通配列、及び／又は核酸増幅補正配列を含む場合、反応産物捕捉配列が第２プローブの3’末端側に、また共通配列が第２プローブの5’末端側に配置されていれば、他の配列の並びは特に限定はしない。

ここで言う「反応産物」とは、第１プローブで捕捉された一本鎖核酸由来の反応産物のことである。具体的には、上記一本鎖核酸または一本鎖核酸の相補鎖を鋳型として、酵素反応により合成された相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸のことをいう。「反応産物捕捉配列」は、上記より、反応産物の塩基配列の一部に相補的な配列、又はランダムな配列を含み、合成された反応産物を捕捉するように構成されている。反応産物捕捉配列の塩基配列は、標的である前記反応産物とハイブリダイズして、それを捕捉することができれば特に限定されない。例えば、反応産物作製後に核酸配列が修飾された場合は、その相補配列も該当する。それ故、反応産物捕捉配列は、反応産物である核酸の種類や配列、反応後の処理等を考慮して適宜設計することができる。本発明において、標的となる反応産物としては、一本鎖DNAが挙げられるがその限りではない。反応産物捕捉配列の長さは、ハイブリダイゼーションによって標的となる反応産物を捕捉しうる長さであればよい。反応産物捕捉配列は、反応産物の塩基配列の3’末端側又はそれに近い配列に相補的な配列であることが好ましい。

「タグ配列」は第２プローブを構成する必須の配列で、細胞保持領域内の反応産物に付すべき細胞保持領域ごとの識別タグである。第１プローブに記載のタグ配列と基本的には同一の構成であり、同じ細胞保持領域に存在する第１、第２プローブのタグ配列は同一の配列のものを用いることが望ましい。

「共通配列」及び「核酸増幅補正配列」は、第１プローブに記載の配列と同一の構成であることから、ここでは具体的な説明を省略する。

２．遺伝子解析方法
本発明の遺伝子解析方法について説明する。本発明の遺伝子解析方法は、本発明の遺伝子解析システムを用いる。

本発明の遺伝子解析方法は以下の第１〜６工程で構成される。以下、各工程について説明する。
（第１工程）
「第１工程：細胞保持工程」は、本発明の遺伝子解析システムの基板上に複数の細胞を流し、細胞保持領域に一細胞ずつ保持させる工程である。

本発明において解析に用いる試料は、遺伝子発現を解析しようとする生体由来試料であれば特に限定されるものではなく、細胞試料、組織試料、液体試料等の任意の試料を用いることができる。具体的には、1細胞からなる試料、複数の細胞を含む試料、組織切片試料、複数の個々の細胞を2次元的に保持したアレー状に配列させた試料等が挙げられる。

また試料の由来となる生体も特に限定されるものではなく、脊椎動物（例えば哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、両生類等）、無脊椎動物（例えば昆虫、線虫、甲殻類等）、原生生物、植物、真菌、細菌、ウイルス等の任意の生体に由来する試料を用いることができる。
（第２工程）
「第２工程：一本鎖核酸捕捉工程」は、第１工程で細胞保持領域に保持した細胞から核酸を抽出し、得られた一本鎖核酸を細胞保持領域内の第１プローブで捕捉する工程である。

第２の工程において、細胞保持領域内に保持した細胞から抽出された一本鎖核酸は、細胞保持領域内に配置された第１プローブへのハイブリダイズにより捕捉される。本工程において、捕捉すべき標的となる一本鎖核酸としては、限定されるものではないが、生体組織を構成する細胞内のメッセンジャーRNA（mRNA）、非コードRNA（ncRNA）、microRNA、及び一本鎖DNA、並びにそれらの断片が挙げられる。細胞からの核酸の抽出は、当技術分野で公知の方法により行えばよい。例えば、Proteinase Kのようなタンパク質分解酵素、チオシアン酸グアニジン・グアニジン塩酸といったカオトロピック塩、Tween及びSDSといった界面活性剤、あるいは市販の細胞溶解用試薬を用いて、細胞を溶解し、それに含まれる核酸、すなわちDNA及びRNAを溶出することができる。
（第３工程）
「第３工程：反応産物合成工程」は、第２工程で捕捉した一本鎖核酸由来の反応産物を合成する工程である。

第３工程における反応産物は、捕捉した一本鎖核酸の一部に相補的な配列を持つ反応産物合成プライマーを起点として合成することができる（図２及び図６）。あるいはまた、反応産物は、捕捉した一本鎖核酸を鋳型として第１プローブが起点となって連結した相補鎖（第１の反応産物）を合成し、同相補鎖の一部に相補的な配列を持つ反応産物合成プライマーを起点として合成されたもの（第２の反応産物）でもよい（図９）。

ここで用いる反応産物合成プライマーはランダムな配列でもよく、鋳型となる核酸（一本鎖核酸又は第１の反応産物）へハイブリダイズし、反応産物を合成できる配列であれば特に限定されない。また、反応産物合成プライマーの5’末端に、後に示す第６工程（増幅工程）で用いる共通配列、及び／又は核酸増幅補正配列を付加してもよい（図６）。

本発明において、反応産物（図９に示す態様では第１及び第２の反応産物）の合成は、当技術分野で公知の方法により行うことができる。例えば一本鎖核酸がmRNA等のRNAの場合には、例えば逆転写酵素を用いた逆転写反応によって反応産物を合成することができる。また核酸がDNAの場合には、例えばDNAポリメラーゼを用いた複製反応によって反応産物及び相補鎖を合成することができる。反応産物の合成に用いる酵素には、鎖置換の性質を持つ酵素を用いることも可能である。この場合、反応産物合成プライマー同士が近隣、例えば100塩基以内にハイブリダイズしても、100塩基以上の反応産物を得ることができるためにリダンダントな配列解析が可能となり、配列解析の正確性が向上できる。
（第４工程）
「第４工程：反応産物捕捉工程」は、第３工程で合成された反応産物を同一の細胞保持領域内で捕捉する工程である。

一本鎖核酸由来の反応産物（又は第２の反応産物）は、二本鎖を形成していた対応する一本鎖核酸（又は第１の反応産物）から解離した後、一本鎖核酸が捕捉された同一の細胞保持領域に再度捕捉される。一部の態様では、反応産物は、第２プローブの近隣の細胞保持領域内部の表面又は担体表面等に直接結合して捕捉される。再捕捉のタイミングとしては、鋳型より反応産物が解離した直後に捕捉されることが望ましい。解離の方法としては、鋳型がmRNAの場合はRNaseHによる酵素処理が、またDNA、RNAいずれにおいても熱変性やバッファーの組成の変化による解離の方法が挙げられる。同工程の再捕捉により、他の細胞捕捉領域へ反応産物が拡散することなく、後の工程で同細胞捕捉領域由来のタグ配列を導入することが可能となる。

反応産物の捕捉方法としては、同一の細胞保持領域内に配置された第２プローブの反応産物相補配列にハイブリダイズする方法が挙げられる。また、反応産物の捕捉方法として、反応産物の末端を修飾することにより捕捉する方法が挙げられる。例えば、反応産物の3’末端へヌクレオチドを付加して（以下核酸修飾配列と記載）捕捉することができる。具体的には、例えばTerminal Deoxynucleotidyl Transferase（以下TdTと記載）やポリAポリメラーゼを用いて反応産物の3’末端にポリAを付加した場合、ポリAが付加された反応産物はポリT配列を反応産物捕捉配列として持つ第２プローブにより捕捉する事ができる。他にもTdT等の修飾酵素を用いることで、3’末端にアデニン以外のヌクレオチドを付加することもできる。その場合、核酸修飾配列に相補的な配列を含む第２プローブを用いて反応産物を再捕捉すればよい。

また、反応産物の別の捕捉方法として、核酸プローブが保持された細胞保持領域内部の表面、又は細胞保持領域内に保持された担体に直接捕捉する方法が挙げられる。この場合、細胞保持領域内部の表面若しくは担体表面、及び反応産物の双方に、再捕捉可能な修飾を施すことができる。このような修飾の例として、核酸プローブが固定化されている細胞保持領域表面又は担体にアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンを、反応産物にビオチンを結合させ、これらの接合分子の特異的結合を利用して捕捉する方法が挙げられる（図９）。
（第５工程）
「第５工程：タグ配列導入工程」は、捕捉された反応産物に細胞保持領域ごとにタグ配列を導入する工程を含む。

第４工程で反応産物が第２プローブに捕捉された後、第５の工程において、第２プローブを起点として反応産物を鋳型にDNAポリメラーゼにより相補鎖を合成する。この反応により、第２プローブに連結して反応産物と相補的な配列が導入される（タグ配列導入産物と記載）。その結果、反応産物由来の配列に細胞保持領域固有のタグ配列を導入することができる（図２、図６）。

第４工程において、反応産物が細胞保持領域内部の表面若しくは担体に接合分子の結合によって捕捉された場合は、同細胞領域内部に保持され、且つ捕捉位置の近隣に存在する第２プローブへ反応産物がハイブリダイズし、反応産物を鋳型としてDNAポリメラーゼにより第２プローブを起点として連結する相補鎖を合成することでタグ配列を導入することが可能となる（図９）。
（第６工程）
「第６工程：増幅工程」は、第５工程で得られるタグ配列導入産物の、全部又は一部を増幅する工程を示す。

増幅工程では、タグ配列導入産物に相補的な配列を含む増幅用プライマーを、細胞保持領域の内部表面又は担体に保持されている同産物にハイブリダイズさせて、第２プローブに含まれる各配列を含む相補鎖を生成する。相補鎖を合成する増幅用プライマーには、タグ配列導入産物の３’末端領域に相補的な配列を含むリバースプライマーを用いることができる。この場合、同プライマーはタグ配列導入産物へ結合し、増幅反応の起点となる配列であればよく、例えばランダム配列も可能である。また、反応産物合成プライマーの5’末端に共通配列（例えば、第２プローブに含まれる共通のフォワードプライマー配列とは異なる配列を持つ共通のリバースプライマー配列）を付加し、これをリバースプライマーとして用いてもよい（図６）。あるいはまた、リバースプライマーは、標的に特異的な配列として、特定の反応産物のみが増幅されるように設計することもできる。更に、タグ配列導入産物の3’末端へヌクレオチドを更に付加し、その核酸修飾配列の相補配列を含むリバースプライマーを用いることもできる。

相補鎖を合成した後、第２プローブの共通配列（共通のフォワードプライマー）と上記リバースプライマーを用いて増幅反応を行うことで、増幅工程を簡便かつ効率的に実施することが可能となる。増幅方法としては当技術分野で公知の任意の方法を用いることができ、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、Nucleic Acid Sequence-Based Amplification（NASBA）法、Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法、ローリングサークル増幅（RCA）反応が挙げられる。また当業者であれば、採用する増幅反応に応じて、使用する第２プローブや増幅用プライマーを適宜設計することができる。

本発明の第５の工程により得られた産物を鋳型として核酸増幅を行い、増幅産物を当技術分野で公知の任意の方法により遺伝子配列を解析することができる。また、配列解析を行うことにより遺伝子発現解析も可能である。例えば、一実施形態では、増幅産物の配列を決定することにより、解析対象の遺伝子の発現の有無、発現量（核酸増幅補正配列に基づいて補正する）等を解析することができる。配列解析を行う際には、解析に用いる大規模シークエンサのプロトコルに従い、必要となる増幅用プライマー配列を、上記フォワード及びリバースプライマーの共通配列へ設計すればよい。また別の実施形態では、タグ配列導入産物に対して相補的な配列を有する標識したプローブを利用して、cDNA又は得られる増幅産物に該プローブをハイブリダイズさせ、標識に基づいて解析対象の遺伝子発現を検出する（例えば光学的に検出する）ことができる。そのような検出に使用するプローブは、当業者であれば適宜設計することができる。使用する標識もまた当技術分野で公知の任意の標識を用いることができ、例えば蛍光標識（Cy3、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等）、化学発光標識（ルシフェリン等）、酵素標識（ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、放射性標識（トリチウム、ヨウ素¹²⁵等）が挙げられる。さらに別の実施形態では、上記遺伝子特異的配列に対して相補的な配列を有するプローブを利用して核酸増幅反応を行い、増幅の有無を化学発光又は蛍光に基づいて検出することによって、解析対象の遺伝子の発現を解析することができる。

本発明においては、上述のとおり得られたcDNAにおける遺伝子解析結果と、試料（細胞、組織等）の二次元位置情報とを対応させることにより、細胞又は組織における特定の位置と遺伝子発現との相関データを得ることも可能である。そのような試料の二次元位置情報は、例えば細胞試料又は組織切片試料の顕微鏡像、他の標識法により得られる蛍光像又は化学発光像等である。

３．遺伝子解析用キット
本発明は、単一細胞からの遺伝子解析のためのキットを提供する。前記キットは、本発明の遺伝子解析システムを用いる際に必要となるデバイス及び試薬を含めたキットであり、本発明の遺伝子解析方法により解析できる。前記キットは、各細胞保持領域に第１プローブ及び／又は第２プローブが保持された基板のほか、プライマーや酵素、その他酵素反応に必要な試薬類を含んだものとして構成される。上記酵素としては、細胞溶解や反応産物合成、一本鎖核酸分解、反応産物修飾、タグ配列導入に用いる酵素が挙げられる。上記酵素は２．で記載しており、ここでは詳しく記載しない。

以下、本発明の実施形態の具体例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。

［実施例１］
本実施例では、複数の細胞保持領域（１）を有する基板と、第１プローブと第２プローブを前記各細胞保持領域内に配置する遺伝子解析システムを用いて、第１プローブで捕捉された1細胞由来の一本鎖核酸を鋳型として得られる反応産物を第２プローブで捕捉する例を示す。

本構成例の基板は、それぞれが1つ又は複数の細胞（２）を保持することができる1つの細胞保持領域（１）が複数個並列して構成されている。図１（ａ）〜（ｃ）では、細胞保持領域（１）が平面状であり、それぞれの下部の細孔メンブレン（３）内に第１及び第２プローブが直接固定されている。図１（ｄ）では、細胞保持領域（１）は、細胞（２）の直径よりやや小さい口径を有する細胞保持部と、第１及び第２プローブが固定された担体（４）が保持された担体保持部から構成され、底面に細孔メンブレン（３）を有する構成としたものである。図１（ｅ）では、細胞保持領域（１）は細胞（２）の直径と同等もしくはそれよりも大きい直径20〜50μm程度の口径を有する細胞保持部と底面の細孔メンブレン（３）からなる構成としたものである。本実施例における基板の構成は図１に記載のもの全てを使用することが可能である。

本実施例では細胞から抽出した一本鎖核酸としてmRNAを想定している。それ故、図２に示す第１プローブ（５）は、例えば配列番号１で示される塩基配列を有し、3’末端側に12塩基のオリゴ(dT)配列と2塩基のVN配列とからなる核酸捕捉配列（６）を含む。また、第１プローブ（５）は5’末端側から順番に、例えば30塩基の共通配列（７）、7塩基のランダム配列からなる核酸増幅補正配列（８）、そして7塩基のタグ配列（９）、そして14塩基の核酸捕捉配列（６）からなる。一方、第２プローブ（１０）は、例えば配列番号２で示される塩基配列を有し、5’末端から順番に、30塩基の共通配列（７）、7塩基のランダム配列からなる核酸増幅補正配列（８）、そして7塩基のタグ配列（９）、そして7塩基のランダム配列からなる反応産物捕捉配列（１１）で構成されている。

本実施例の上記遺伝子解析システムを用いた反応工程は、図２で示すように、細胞保持工程（Ｉ）において細胞保持領域に保持させた細胞（２）から一本鎖核酸であるmRNA（１２）を抽出し、第１プローブ（５）の捕捉配列（６）にハイブリダイズさせて捕捉する一本鎖核酸捕捉工程（ＩＩ)と、捕捉したmRNA（１２）を鋳型として、同mRNAに相補的な配列を持つ7塩基のランダム配列からなる反応産物合成プライマー（１３）をハイブリダイズさせた後に、同プライマーの3’末端を起点にcDNA（反応産物）（１４）を合成する反応産物合成工程（ＩＩＩ）と、捕捉した一本鎖核酸であるmRNAを分解（１６）すると共に反応産物（１４）中の反応産物捕捉配列の相補配列（１５）を直ちに第２プローブ（１０）の反応産物捕捉配列（１１）とハイブリダイズさせて捕捉する反応産物捕捉工程（ＩＶ)、及び捕捉した反応産物（１４）を鋳型として第２プローブ（１０）の3'末端よりDNA鎖（タグ配列導入産物（１７））を合成することで、反応産物由来の配列にタグ配列を導入するタグ配列導入工程（ＶＩ）からなる。

次に、第１プローブ及び第２プローブを細胞保持領域（１）内に固定する構成の一例を図３に示す。図３では、第１プローブ（５）及び第２プローブ（１０）を、細胞保持領域（１）底部を構成する細孔メンブレン（３）の細孔表面に固定した例を示す。各核酸プローブの5’末端には固定化のためにアミノ基が修飾され、共有結合によって細孔メンブレンに直接固定されている。本実施例では、細孔メンブレンとして細孔の大きさが0.1〜0.2μm程度の市販のアノディスク(GE Healthcare)を用いている。細孔メンブレンの厚さは60μmであり、その表面には核酸プローブを固定できる。通常、固体表面に固定できる核酸プローブの密度は、核酸プローブ1個/30-100nm²であり、従って1つの細孔内壁に5×10⁵個程度の核酸プローブを固定することができる。細孔の体積は約1.8×10^-16Lであり、従って、核酸プローブの密度は、5mMになる。例えば細孔メンブレンに固定される核酸プローブの比率を第１プローブ：第２プローブ=1：3程度にすると、第１プローブの密度は0.8mM程度、第２プローブの密度は4mM程度となり、共に高い効率で反応を行うのに十分な濃度であり、反応産物捕捉のロスの確率も0%以下となることが見込まれる（Biophysical journal 69. 2243-2255 (1995), Biophysical journal 20. 193-219 (1997), Biophysical journal 66. 255-600 (1994)）。尚、この比率は各実験条件により変更が可能であり、この限りではない。

本実施例では、核酸プローブ（５、１０）を細孔メンブレン（３）へ固定化するためのシランカップリング剤と、表面を親水化するシラン化されたMPCポリマーとを適切な割合で同時に細孔表面に共有結合にて固定して、DNAの高密度固定を行った。実際には、まず0.1μm孔径のアノディスク(GE Healthcare)をエタノール溶液に3分浸漬後、0.1% Tween20＋10mM Tris (pH8.0)溶液で2回洗浄し、乾燥させた。その後、UVO₃処理を3分間行い、シラン化MPCポリマーであるMPC monomer（例えば、Langmuir 26.13028-13032 (2010)）3mg/mLと0.3mg/mLのシランカップリング剤GTMSi（GTMSi：3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane；信越化学）を含むエタノール溶液に1時間浸漬した。エタノールで洗浄後、オーブンにて120℃で1時間加熱処理した。次に、上記処理したアノディスクの上に20μm直径の区画を持つ厚さ0.1μm のPDMSシートを重ねた。PDMSシート上の各区画内の細孔メンブレン（３）に核酸プローブ（５、１０）を固定化するために、第１プローブ（５）(1mM)、第２プローブ（１０）(5mM)、1％グリセロールと0.15M NaClを含む0.05Mホウ酸バッファ（pH 8.5）をシート上にインクジェットプリンタと同じ技術によって、100pLずつ各領域に吐出した。その後、加湿チャンバ内において、アノディスク上のエポキシ基と核酸プローブの5’末端のアミノ基を25℃で2時間反応させた。最後にアノディスク上の未反応の官能基をブロックし、過剰な核酸プローブを除去するために、十分量の10mM Lys、0.01％ SDS及び0.15M NaClを含むホウ酸バッファ（pH 8.5）で5分間洗浄し、この洗浄液を除去した後、0.01％ SDSと0.3M NaClを含む30mMクエン酸ナトリウムバッファ（2 x SSC, pH 7.0）を用いて60℃にて洗浄し、過剰DNAを除去した。これによって、核酸プローブの固定と表面処理を完了した。

次に、上記構成の遺伝子解析システムを用いて細胞を捕捉する方法を説明する。まず、約1000個の細胞を500μLの1×PBSで洗浄後、4℃に冷却された1×PBSを50μL加えて細胞溶液を調製した。この細胞溶液を図１（ａ）の各細胞保持領域にアレー状に配列させた。具体的には、一辺20μmの区画を持つ厚さ0.1μm の細胞保持領域が1000個配置されたPDMSシートとプローブ固定化用のアノディスクを積層してなる本実施例の遺伝子解析システムの基板上部から底部に向けて細胞溶液を流通することで、各細胞は各細胞保持領域に保持され、残った溶液は、廃液としてアノディスクの下部より排出された。これにより約80％程度の細胞を各細胞保持領域に1個ずつ捕捉することができた。

続いて、基板上で捕捉した細胞を、細胞溶解試薬を用いて常法により溶解し、得られたmRNAを第１プローブにて捕捉した後、上記した反応工程によりタグ配列導入産物を得た。尚、本実施例では、反応産物合成工程（ＩＩＩ）でmRNAの相補鎖を合成する逆転写酵素としてSuperScript III(Invitrogen)を、反応産物捕捉工程（ＩＶ）でRNAを分解する酵素としてRNaseH(Invitrogen)を、タグ配列導入工程（Ｖ)で使用するDNAポリメラーゼとしてPlatinum Taq DNA polymerase High Fidelity （Life Technologies）を用いた。細胞溶解試薬及び逆転写反応試薬、RNaseH試薬、DNAポリメラーゼ反応試薬の組成を表１〜４に示す。

次に、図４に本実施例の反応フローを示し、具体的な反応条件を以下で説明する。約1000細胞が捕捉された上記基板からなる細胞捕捉基板（１８）に、細胞溶解試薬（１９）を5μL添加して、室温で5分間放置し細胞を溶解した。細胞を溶解すると同時に、各細胞保持領域に存在する細孔内の第１プローブによってmRNAが捕捉される。その後、7塩基のランダム配列からなる反応産物合成プライマー（1μM）と逆転写酵素（200U）及び逆転写反応試薬からなる反応液（２０）を50μL添加して、反応装置（２１）にて室温10分、37℃ 10分、48℃ 50分間反応させた。その後、RNaseH(60U)とRNaseH反応試薬からなる反応液（２２）を5μL添加して、反応装置（２３）で37℃、1時間反応させた。さらに、DNAポリメラーゼ (5U)、及びDNAポリメラーゼ反応試薬を含む反応液（２４）を10μL添加し、反応装置（２５）で98℃ 10秒、40℃ 1分、68℃ 1分の後4℃に温度を下げる反応を行った。以上の反応により、第１プローブをプライマーとして、捕捉されたmRNAの塩基配列の相補配列を有するcDNA（反応産物）が合成され、得られた反応産物をRNaseH処理時に速やかに第２プローブで捕捉して、DNAポリメラーゼによりDNA相補鎖を合成することで、細胞保持領域ごとに固有のタグ配列が付加された二本鎖の反応産物を得ることができた。

最後に、本実施形態により得られた、第２プローブに連結した状態で合成されたタグ配列導入産物（１７）を鋳型として、共通配列（７）の５’末端より11塩基から構成されるフォワードプライマー（例えば配列番号３で示す）、10塩基からなるランダム配列を含むリバースプライマー（例えば配列番号４で示す）を用いて増幅工程（ＶI）を行い、得られた増幅産物のシークエンス解析を行った。増幅産物に含まれるタグ配列の情報を取得することによって、デバイス上の領域又は領域範囲ごとに特定の遺伝子配列を決定することが可能となる。

尚、本実施例は、一本鎖核酸捕捉工程、反応産物捕捉工程、タグ配列導入工程の全て、又はいずれかを同時に行うことも可能である。

［実施例２］
本実施例は、図１（ｂ）に示す複数の細胞保持領域を持つ基板と、図５、６に示す第１プローブを前記各細胞保持領域内に配置する遺伝子解析システムを用いて、第１プローブで捕捉された1細胞由来の一本鎖核酸を鋳型として得られる反応産物を修飾して第１プローブで再度捕捉する例を示す。

本構成例の基板は、複数の細胞保持領域が1つの細胞を保持するように構成されている。細胞保持領域（１）は、細胞（２）の直径よりも小さい直径5〜15μm程度の口径を有する細胞保持部と底面の細孔メンブレン（３）からなる（図１（ｂ））。

本実施例に用いる第１プローブは、図５で示すように細胞保持領域（２６）及び（２７）の底部を構成する細孔メンブレン（３）の細孔壁表面に固定されている。このとき、１細胞が複数の領域（図５では２領域）上で保持されており、細胞保持領域（２６）下部に固定されている第１プローブ（５）（例えば配列番号１で示す）のタグ配列（９）と、細胞保持領域（２７）下部に固定されている第１プローブ（２８）（例えば配列番号５で示す）のタグ配列（２９）は異なる配列となっている。

本実施例では実施例１と同様に、細胞から抽出した一本鎖核酸としてmRNAを想定している。第１プローブ（５）及び（２８）は、5’末端から順番に、30塩基の共通配列（７）、7塩基のランダム配列からなる核酸増幅補正配列（８）、そしてそれぞれ領域ごとに異なる7塩基のタグ配列（９）、（２９）、そして12塩基のオリゴ(dT)配列と2塩基のVN配列からなる核酸捕捉配列（６）から構成されている。

次に、本実施例の上記遺伝子解析システムを用いた反応工程を図６に示す。ここでは、プローブとして第１プローブ（５）のみを使用する場合（すなわち第１プローブが第２プローブとしても機能する場合）を記載する。細胞保持工程（Ｉ）において細胞保持領域に保持させた細胞（２）から一本鎖核酸であるmRNA（１２）を抽出し、第１プローブ（５）の捕捉配列（６）にハイブリダイズさせて捕捉する一本鎖核酸捕捉工程（ＩＩ)と、捕捉したmRNA（１２）を鋳型として、5’末端に共通配列（３０）を持ち、且つ同mRNAに相補的な配列を持つ7塩基のランダム配列からなる反応産物合成プライマー（３１）（例えば配列番号６で示す）をハイブリダイズさせた後に、同プライマーの3’末端を起点にcDNA（反応産物）（３２）を合成する反応産物合成工程（ＩＩＩ）と、反応産物の3’末端へポリA配列（３３）を付加して修飾反応産物（３４）とした後に、捕捉した一本鎖核酸であるmRNAを分解（１６）して、直ちに第１プローブ（５）の捕捉配列（６）と修飾反応産物（３４）のポリA配列（３３）をハイブリダイズさせて再捕捉する反応産物捕捉工程（ＩＶ)、及び捕捉した修飾反応産物（３４）を鋳型として第１プローブ（５）の3'末端よりDNA鎖（タグ配列導入産物（３５））を合成し、反応産物（cDNA）由来の配列にタグ配列及び共通配列（３０）の相補配列（３６）を導入するタグ配列導入工程（Ｖ）からなる。

尚、本実施例において、反応産物の3’末端への核酸修飾は、ポリA以外でも良い。例えば、TdTを用いてポリT配列を付加することも可能である。その場合は、捕捉配列（６）としてポリA配列を含む、第１プローブとは異なる第２プローブを細胞保持領域内へ固定することで、反応産物を捕捉することができる。尚、本実施例の反応工程は図１（ｂ）の構成を用いているが、図１に記載の構成全てを使用することが可能である。

次に、第１プローブ（５）及び（２８）を細胞保持領域（２６）、（２７）内に固定する方法を示す。各核酸プローブの5’末端には固定化のためにビオチンが修飾されている。本実施例では細孔メンブレンに細孔の大きさが0.1〜0.2μm程度の市販のアノディスク(GE Healthcare)を用いた。固定化密度及び固定量に関しては実施例１に記載のとおりである。

本実施例では、実施例１と同様に、シランカップリング剤と、親水性を維持するシラン化されたMPCポリマーとを適切な割合で同時に細孔表面に共有結合にて固定して、DNAの高密度固定を行った。実際には、まず0.2μm孔径のアノディスク(GE Healthcare)をエタノール溶液に3分浸漬後、0.1% Tween20＋10mM Tris (pH8.0)溶液で2回洗浄し、乾燥させた。その後、UVO₃処理を4分間行い、シラン化MPCポリマーであるMPC monomer（例えば、Langmuir 26.13028-13032 (2010)）3mg/mLと0.3mg/mLのシランカップリング剤GTMSi（GTMSi：3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane；信越化学）を含むエタノール溶液に1時間浸漬した。エタノールで洗浄後、オーブンにて120℃で1時間加熱処理した。次に、1mg/mLに調整したストレプトアビジン溶液へ16時間、4℃環境下で浸漬し、アノディスク上のエポキシ基とストレプトアビジンのアミノ基を反応させて固定した。上記処理したアノディスクの上に一辺5μmの区画を持つ厚さ0.1μm のPDMSシートを重ねた。PDMSシート上の各区画内の細孔メンブレン（３）に第１プローブ（５、２８）を固定化するために、第１プローブ (5mM)を含むプローブ固定試薬（表５）をシート上にインクジェットプリンタと同じ技術によって、100pLずつ各領域に吐出した。その後、アノディスク上のストレプトアビジンと核酸プローブの5’末端のビオチンを37℃で1時間反応させた。最後にアノディスク上の過剰な核酸プローブを除去するために、0.01％ SDS及び0.15M NaClを含むホウ酸バッファ（pH 8.5）で5分間洗浄し、この洗浄液を除去した後、0.01％ SDSと0.3M NaClを含む30mMクエン酸ナトリウムバッファ（2 x SSC, pH 7.0）を用いて60℃にて2回洗浄し、過剰DNAを除去した。これによって、核酸プローブの固定と表面処理を完了した。その後、更に直径20μmの区画を持つ厚さ0.1μm のPDMSシートを重ねた。上記構成の遺伝子解析システムを用いて細胞を捕捉する方法は実施例１と同様の方法で行った。

続いて、基板上で捕捉した細胞を、細胞溶解試薬を用いて常法により溶解し、得られたmRNAを第１プローブにて捕捉した後、上記した反応工程によりタグ配列導入産物を得た。尚、本実施例では、反応産物合成工程（ＩＩＩ）でmRNAの相補鎖を合成する逆転写酵素としてSuperScript III(Invitrogen)を、反応産物捕捉工程（ＩＶ）で反応産物の末端にポリAを修飾する修飾酵素としてTdT (Invitrogen)を、RNAを分解する酵素としてRNaseH(Invitrogen)を、タグ配列導入工程（Ｖ)で使用するDNAポリメラーゼとしてPlatinum Pfx DNA ポリメラーゼ（Invitrogen）を用いた。細胞溶解試薬及び逆転写反応試薬、RNaseH試薬の組成は表１〜３に示すものと同じである。本実施例での修飾酵素反応試薬の組成を表６に、DNAポリメラーゼ反応試薬の組成を表７に示す。

図７に本実施例の反応フローを示し、具体的な反応条件を以下で説明する。約1000細胞が捕捉された上記基板からなる細胞捕捉基板（３７）に、細胞溶解試薬（３８）を5μL添加して、室温で5分間放置し細胞を溶解した。細胞を溶解すると同時に、各細胞保持領域に存在する細孔内の第１プローブによってmRNAが捕捉される。その後、反応産物合成プライマー（1μM）と逆転写酵素（200U）及び逆転写反応試薬からなる反応液（３９）を順番に添加して、反応装置（４０）にて室温10分、37℃ 10分、48℃ 50分間反応させた。その後、修飾酵素（0.2U）と修飾酵素反応試薬からなる反応液（４１）を20μL添加して、反応装置（４２）で37℃、15分間反応させた。次に、RNaseH(60U)とRNaseH反応試薬からなる反応液（４３）を5μL添加して、反応装置（４４）で37℃、30分反応させた。さらに、DNAポリメラーゼ (1U)、及びDNAポリメラーゼ反応試薬を含む反応液（４５）を10μL添加し、反応装置（４６）で94℃ 15秒、40℃ 30秒、68℃ 2分の後4℃に温度を下げる反応を行った。以上の反応により、第１プローブにより捕捉されたmRNAの塩基配列の相補配列を有するcDNA（反応産物）が合成され、反応産物の3'末端をポリA修飾した後にもう一度第１プローブで捕捉してDNAポリメラーゼによりDNA鎖を合成することで、細胞保持領域ごとに固有のタグ配列が付加された反応産物を得ることができた。最後に、本実施形態により得られた第１プローブに連結して合成されたタグ配列導入産物（３５）を鋳型として、共通配列（７）をフォワードプライマー、共通配列（３０）の相補配列（３６）をリバースプライマーとして増幅工程（ＶＩ）を行い、得られた産物のシークエンス解析を行った。増幅産物に含まれるタグ配列の情報を取得することによって、デバイス上の領域又は領域範囲ごとに特定の遺伝子配列を決定することが可能となる。本実施例は、反応産物修飾反応、mRNA分解、反応産物捕捉工程、タグ配列導入工程の全て、又はいずれかを同時に行うことも可能である。

［実施例３］
本実施例は、図１（ｄ）に示す分離された複数の細胞保持領域を持つ基板と、図８に示す第１プローブと第２プローブを前記各細胞保持領域内に配置する遺伝子解析システムを用いて、第１プローブで捕捉された1細胞由来の一本鎖核酸を鋳型として得られる反応産物を第２プローブに捕捉する例を示す。

本構成例の基板は、各細胞保持領域が1つの細胞を保持するように構成されている。細胞保持領域（１）の開口径は、細胞（２）の直径よりも小さい直径5〜15μm程度とする。基板は、上記開口径の貫通孔と、第１及び第２プローブが固定された担体が保持される担体保持部と、底面の細孔メンブレン（３）からなる。

本実施例に用いる第１プローブ及び第２プローブは、図８で示すように担体に固定され、核酸プローブを固定化した担体（核酸プローブ固定化担体）が基板の細胞保持領域内に図８（ａ）及び（ｂ）の構成で配置されている。

図８（ａ）は、第１プローブ（４７）と第２プローブ（４８）が同一の担体（４９）上に固定され、その担体（４９）を細胞保持領域（１）に配置する構成を示す。図８（ｂ）は、第１プローブ（４７）と第２プローブ（４８）がそれぞれ異なる担体上に固定された構成で、第１プローブ（４７）を担体（５０）に、第２プローブ（４８）を担体（５１）にそれぞれ固定し、両担体を混合して細胞保持領域（１）に配置する構成を示す。

本実施例で使用した担体は、直径1μmのストレプトアビジンがコートされた市販の磁性ビーズ(Invitrogen)で、ビーズ1個当たりに固定できる核酸プローブの数は、約10⁵個である。例えば、直径30μm、深さ70μmの細胞保持領域を用いた場合には、一領域あたり約6×10⁴個のビーズを収納でき、核酸プローブの総数は約6×10⁹個となる。配置したビーズの隙間で各反応は行われ、その体積は細胞保持領域の数分の１と見積もることができるので、反応部分の核酸プローブの密度はmMオーダーとなる。すなわち、本実施例の構成であれば、非常に迅速に、かつ効率よく、合成された反応産物と第２プローブを反応させることができ、反応産物を再捕捉によりロスする確率も極めて低い。

図８（ｃ）は、図８（ａ）に示した担体（４９）上の核酸プローブの構成と、第１プローブ（４７）及び第２プローブ（４８）の配列構成を示す。第１プローブ（４７）は、実施例１で用いた第１プローブ（５）と同じ配列番号１で示す塩基配列を有する。また、第２プローブ（４８）も、実施例１の第２プローブ（１０）と同じ配列番号２で示す塩基配列を有する。各プローブの5’末端には、担体へ固定化するためにビオチンが修飾されている。

尚、本実施例において、第２プローブ（４８）は、細胞保持領域（１）の下部に、例えば、80℃で溶解するアガロースゲル内に包埋して細胞保持領域（１）と細孔メンブレン（３）の間に設置しても良く、この場合、反応産物捕捉工程の前、もしくは開始時に80℃以上の熱処理を加えることによりゲルを溶解することで、第２プローブ（４８）を細胞保持領域内へ展開できる。

本実施例では、担体に上述した直径1μmのストレプトアビジンがコートされた磁性ビーズ（Invitrogen）を用いた。図８（ａ）の構成では、担体（４９）には、第１プローブ（４７）を約1×10¹¹分子/10⁷ビーズ/μL、第２プローブ（４８）を約5×10¹¹分子/10⁷ビーズ/μLとなるように固定した。また図８（ｂ）の構成では、担体（５０）及び（５１）に第１プローブ（４７）及び第２プローブ（４８）がそれぞれ5×10¹¹分子/10⁷ビーズ/μLになるように固定し、それぞれが1:5の比で存在するように混合した。核酸プローブの担体への固定方法は、磁性ビーズのマニュアルに従った。両核酸プローブが固定された担体、及びそれぞれの核酸プローブがそれぞれ異なる担体に固定された混合担体は、個別にインクジェットプリンタヘッドに充填し、細胞保持領域ごとに固有のタグ配列が固定されたビーズを個別に細胞保持領域へ6nLずつ充填することで、1細胞保持領域あたり3×10⁹個のプローブを配置した。

次に、本実施例の遺伝子解析システムを用いて細胞を捕捉する方法を説明する。まず、1000個以下の細胞を500μLの1×PBSで洗浄後、4℃に冷却された1×PBS 100μLに懸濁した。この細胞溶液を図１（ｄ）の各領域にアレー状に配列させた。具体的には、上径5μm、下径75μmの貫通孔が1000個配置された厚さ80μmのPDMSシートに、0.1μm孔径を持つアノディスクを積層した。核酸プローブを固定した担体は、前記PDMSシートとアノディスクの積層によって形成された細胞保持領域内部に充填された。本実施形態のアノディスクは、実施例１の遺伝子解析システムと異なり、担体を保持する役割を持つ。PDMSシートやアノディスクには親水処理が施されているため、溶液は貫通孔を通過できる。上記のように調整した細胞溶液を基板上部から底部に向けて細胞溶液を流通することで、細胞は溶液流に乗って移動し、細胞保持領域の上部へ到達する。本実施例の細胞保持領域の開口径は細胞の直径よりも小さいため、ここに細胞が固定される状態で捕捉される。捕捉された細胞は、溶液流に対して栓の役割を果たすので、流れはまだ細胞を捕捉していない細胞保持領域の上部へ、まだ捕捉されていない細胞と共に移動する。

続いて、基板上に捕捉した細胞を、細胞溶解試薬を用いて常法により溶解し、得られたmRNAを第１プローブにて捕捉した後、タグ配列が導入された反応産物を得た。方法及び反応フローは図２、及び図４で示した実施例１と同様である。以下、具体的な反応条件を、図４をもとに説明する。約1000細胞が捕捉された上記基板からなる細胞捕捉基板（１８）へ、細胞溶解試薬（１９）を100μL、流速20μL/分となるように添加して、室温で5分間反応させ、細胞を溶解した。溶液を流動させることで細胞を溶解すると同時にmRNAが細胞直下の細胞保持領域へ移動し、細胞保持領域に存在する第１プローブによりmRNAが捕捉される。この際、細胞溶解液を継続的に流動させる代わりに、電圧をかけて核酸を担体方向へ移動させても良い。その後、７塩基のランダム配列からなる反応産物合成プライマー（1μM）を添加した後に、逆転写酵素（200U）及び逆転写反応試薬からなる反応液（２０）を50μL、流速500nL/分となるように添加して、反応装置（２１）にて室温 10分、37℃ 10分、50℃ 50分間反応させた。その後、RNaseH(60U)とRNaseH反応試薬からなる反応液（２２）を10μL添加して、反応装置（２３）で37℃、15分間反応させた。さらに、DNAポリメラーゼ (5U)、及びDNAポリメラーゼ反応試薬を含む反応液（２４）を10μL添加し、反応装置（２５）で98℃ 10秒、40℃ 1分、68℃ 1分の後4℃に温度を下げる反応を行った。以上の反応により、第１プローブをプライマーとしてmRNAの塩基配列の相補配列を有するcDNA（反応産物）が合成され、得られた反応産物を第２プローブで捕捉してDNAポリメラーゼによりDNA鎖を合成することで、細胞保持領域ごとに固有のタグ配列が付加された反応産物を得ることができた。尚、本実施例の反応工程は図１（ｄ）の構成を用いているが、図１に記載の構成全てを使用することが可能である。

次に、本実施例でも得られたタグ配列導入産物を鋳型として増幅工程（ＶI）を行った。以下に増幅方法を説明する。タグ配列導入工程（Ｖ）の後、タグ配列導入産物の3’末端へポリA配列を付加する修飾反応を行った。反応の方法は実施例２に記載の方法を用いて行った。その後、修飾された核酸配列（ポリA配列）の相補配列であるポリT配列30塩基をリバースプライマー（配列番号７で示す）、第２プローブの共通配列（７）の5’末端から15塩基までをフォワードプライマー（配列番号８で示す）として増幅反応を行った。本実施例では、タグ配列導入産物への修飾核酸配列としてポリAの場合を記載しているが、こちらも実施例２と同様にポリA以外の配列でも良い。その場合は、増幅反応に用いるリバースプライマーの配列として修飾核酸配列の相補配列を用いればよい。

増幅工程により得られた増幅産物のシークエンス解析を行うと、増幅産物に含まれるタグ配列の情報に基づいて、デバイス上の細胞保持領域又は細胞保持領域範囲ごとに特定の遺伝子配列を決定することが可能となる。また、本実施例の反応工程は、mRNA分解、反応産物捕捉工程、タグ配列導入工程の全て、又はいずれかを同時に行うことも可能である。

［実施例４］
本実施例では、図１（ｅ）に示す分離された複数の細胞保持領域内にDNAプローブを固定した担体が導入された基板と、図９、１０に示すような第１プローブと第２プローブを前記各細胞保持領域内に配置する遺伝子解析システムを用いて、第１プローブで捕捉された1細胞由来の一本鎖核酸を鋳型として第１プローブより相補鎖（第１の反応産物）を合成し、次いで同相補鎖を鋳型として反応産物合成用プローブより得られる反応産物（第２の反応産物）を修飾することにより細胞保持領域内に再度捕捉し、捕捉した反応産物由来の配列を第２プローブへ導入する方法を示す。

図９で示すように、本実施例では第１プローブ（５２）と第２プローブ（５３）が同一の担体（５４）に固定される構成の遺伝子発現システムを用いた。第１プローブ（５２）の配列（配列番号９で示す）は、核酸捕捉配列（５５）の塩基長が配列番号１及び５で示す第１プローブの核酸捕捉配列（６）と異なる。第２プローブは配列番号２で示され、実施例１及び３の実施形態と同じである。本実施例で用いた担体（５４）は、ストレプトアビジンが固定されているものを用い、各プローブの5’末端には、担体に固定化するためにビオチンが修飾されている。本実施例の上記遺伝子解析システムを用いた反応工程は、細胞保持工程（Ｉ）において細胞保持領域に保持させた細胞（２）から一本鎖核酸であるmRNA（１２）を抽出し、第１プローブ（５２）の核酸捕捉配列（５５）とハイブリダイズさせることにより捕捉する一本鎖核酸捕捉工程（ＩＩ）と、捕捉したmRNA（１２）を鋳型として第１プローブ（５２）の3’末端を起点として第１の反応産物（５６）を合成した後にmRNAを分解（１６）して、同第１の反応産物（５６）を鋳型に反応産物合成プライマー（５７）及び（５８）の3’末端を起点に第２の反応産物（５９）、（６０）を合成する反応産物合成工程（ＩＩＩ）と、第２の反応産物の3’末端をビオチン修飾し、その後に加熱することで、ビオチン修飾反応産物（６１）、（６２）と第１の反応産物（５６）が解離し、ビオチン修飾反応産物（６１）、（６２）が担体（５４）上のストレプトアビジンに結合する反応産物捕捉工程（ＩＶ）と、第２プローブ（５３）の反応産物捕捉配列（１１）とビオチン修飾反応産物（６１）の一部をハイブリダイズさせて、ビオチン修飾反応産物（６１）を鋳型としてDNA鎖（タグ配列導入産物（６３））を合成することで、反応産物由来の配列にタグ配列を導入するタグ配列導入工程（Ｖ）からなる。また、本実施例の一本鎖核酸捕捉工程（ＩＩ）で、目的の核酸としてDNAを捕捉する場合は、前記RNAを分解する工程は不要となる。また、反応産物捕捉工程（ＩＶ）、タグ配列導入工程（Ｖ）の全て又はいずれかを同時に行うことも可能である。

タグ配列導入工程により得られたタグ配列導入産物（６３）を鋳型として、共通配列（７）をフォワードプライマー、実施例１で用いた配列番号３で示すランダム配列をリバースプライマーとして増幅工程（ＶＩ）を行い、得られた増幅産物のシークエンス解析を行うと共に、それに含まれるタグ配列の情報に基づいてデバイス上の細胞保持領域又は細胞保持領域範囲ごとに特定の遺伝子配列を決定することが可能となる。尚、本実施例ではリバースプライマーにランダム配列を用いたが、実施例２及び３で示したように、共通配列付き反応産物合成プライマー（配列番号４）を用いた際には共通配列の相補鎖を、タグ配列導入産物の3’末端へ核酸修飾をした場合は、核酸修飾配列の相補鎖をリバースプライマーとして用いることができる。

次に、本実施例で用いる分離された複数の領域内にDNAプローブを固定した担体が導入された基板の構成を図１０（ａ）、プローブの固定構成を図１０（ｂ）、（ｃ）に示す。

まず、図１０（ａ）に示すように、細胞保持領域（１）の内部にDNAプローブを固定化した担体（５４）を添加した。細胞は領域内に保持され、抽出された核酸は、担体上に存在する第１プローブ（５２）にハイブリダイズする。この際、細孔メンブレン（３）は担体（５４）を保持する役割を持つ。

次にプローブの固定構成を説明する。図１０（ｂ）では、第１プローブ（５２）及び第２プローブ（５３）を同一の担体（５４）の表面に固定した構成を示す。また、図１０（ｃ）では、第１プローブ（５２）を担体（６４）に、第２プローブ（５３）を担体（６５）に固定し、それぞれの担体を混合した構成を示す。

本実施例では、担体として実施例３と同じ直径1μmのストレプトアビジンがコートされた磁性ビーズ（Invitrogen）を用いた。図１０（ｂ）及び（ｃ）の構成における担体への核酸プローブ固定量は、実施例２と同様である。核酸プローブが固定された担体又は混合担体を個別にインクジェットプリンタヘッドに充填し、異なる配列が固定されたビーズを個別に図１０（ａ）に示す細胞保持領域（１）に6nLずつ充填した。尚、図１（ｅ）に示すように、実施例１、２と同様に、第１及び第２プローブを細孔メンブレン（３）に直接固定する方法を用いることも可能である。また、本反応工程は図１（ｅ）の構成の基板を用いているが、図１に記載の構成全てを使用することが可能である。

次に、本実施例の遺伝子解析システムを用いて細胞を捕捉する方法を説明する。まず、1000個以下の細胞を500μLの1×PBSで細胞を傷つけないように洗浄後、溶液を除去し、4℃に冷却された1×PBSを500μL加えた。この細胞溶液を図１０（ａ）の各領域にアレー状に配列させた。具体的には、10μm直径の細胞保持領域が1000個配置された厚さ0.1mmのPDMSシートと0.1μmの孔径を持つアノディスク（GE. Healthcare）を積層した。本実施例の遺伝子解析システムの基板上部から底部に向けて細胞溶液を流通することで、各細胞は各細胞保持領域に保持される。これにより80％程度の細胞を各細胞保持領域に一個ずつ捕獲することができた。

続いて、基板上に保持した細胞を、細胞溶解試薬を用いて常法により溶解し、得られたmRNAを第１プローブにて捕捉した後、第１プローブを起点に相補鎖を合成し、RNaseHによりRNAを分解した。その後、反応産物合成プライマーを起点として、相補鎖を鋳型として反応産物を合成し、反応産物の3’末端をビオチン修飾することにより細胞保持領域内に反応産物を捕捉した。その後、捕捉した反応産物を鋳型として第２プローブよりDNA鎖を合成することによりタグ配列を導入した。本実施例では、図９に示す通り、反応産物の3’末端にTdTにてビオチン標識dUTPを付加させることでビオチン修飾した。その後、熱変性により相補鎖と反応産物が解離するとともに、ビオチン化された修飾反応産物を、細胞保持領域内のストレプトアビジンがコートされた担体でビオチン‐ストレプトアビジン結合により捕捉した。ビオチンに対するストレプトアビジンのアフィニティーは、解離定数が10^-15 Mと非常に強固である。そのため、ビオチン修飾反応産物が熱変性後に担体表面へ即座に結合することが可能となり、本実施例の構成により反応産物の再捕捉によるロスをほぼ0％に低減することが可能となる。捕捉後にビオチン修飾反応産物の相補配列を介して第２プローブとハイブリダイズさせ、DNAポリメラーゼにより第２プローブをプライマーとして反応産物の相補鎖を合成した。尚、本実施例では、逆転写酵素としてSuperScript III(Invitrogen)を、RNAを除去する酵素としてRNaseH(Invitrogen)を、ビオチン修飾酵素としてTdT（Thermoscientific）を、そしてDNAポリメラーゼとしてPlatinum Taq Hi Fidelity DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を用いた。細胞溶解試薬及び逆転写反応試薬、RNaseH試薬の組成は、表１〜３に示したものと同様である。ビオチン修飾酵素反応試薬及びDNAポリメラーゼ反応試薬の組成を表８、９に示す。

図１１に本実施例の反応フローを示し、具体的な反応条件を以下で説明する。約1000細胞が捕捉された上記基板からなる細胞捕捉基板（６６）に、細胞溶解試薬（６７）を100μL、流速20μL/分となるように添加して、室温で5分間反応させ、細胞を溶解した。実施例３と同様に、溶液を流動させることで細胞を溶解すると同時にmRNAが細胞直下の細胞保持領域へ移動し、細胞保持領域に存在する第１プローブによりmRNAが捕捉される。この際、細胞溶解液を継続的に流動させる代わりに、電圧をかけて核酸を担体方向へ移動させても良い。その後、逆転写酵素（200U）及び逆転写反応試薬からなる反応液（６８）50μLを、流速500nL/分で添加して、反応装置（６９）にて50℃で50分間反応させた。その後、RNaseH(60U)とRNaseH反応試薬を含む反応液（７０）を10μL添加し、反応装置（７１）で37℃、15分間反応させた。反応後、反応産物合成プライマー（1μM）とDNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ反応試薬（７２）を12μL加えて反応装置（７３）にて98℃ 10秒、40℃ 60秒、68℃ 180秒間反応させて反応産物を合成した。その後、ビオチン修飾酵素(2U)、ビオチン修飾酵素反応液試薬からなる反応液（７４）を11μL添加して、反応装置（７５）で37℃、30分間反応させた後、80℃ 180秒間熱変性を行い、ビオチンが修飾された反応産物を細胞捕捉領域内に捕捉した。反応後、遺伝子解析システムに0.1% Tween20/10mM Tris (pH8.0)からなる洗浄液（７６）を50μL、流速20μL/分で添加して洗浄し、DNAポリメラーゼとDNAポリメラーゼ反応試薬を含む反応液（７７）を10μL添加して、反応装置（７８）にて98℃ 10秒、43℃ 60秒、68℃ 180秒間反応させて第２プローブに連結して反応産物の相補鎖を合成した。以上の反応により、第１プローブをプライマーとしてmRNAの相補鎖であるcDNAを合成し、RNA分解後に同相補鎖を鋳型として反応産物を合成した。その後、反応産物にビオチン修飾を行い、第２プローブに反応産物の相補鎖を合成することにより、細胞保持領域ごとのタグ配列が付加された反応産物由来の配列を得ることができた。本実施例において、増幅工程（ＶＩ）は、実施例１から３の方法により行うことが可能である。その場合は、各工程において、必要な試薬及びプライマーを用いて反応をすることができる。

本発明によって、生体分子由来の遺伝子の配列決定や定量、同定が、多数の培養細胞や多数の免疫細胞や（血中）がん細胞等に対して実行でき、どのような状態にある細胞群がどの程度の数だけ生体に存在するかを計測することが可能となる。これは、がん等の早期の診断やiPS細胞のヘテロジェナイエティを計測することも可能となる。

1, 26, 27 : 細胞保持領域
2 : 細胞
3 : 細孔メンブレン
4, 49, 50, 51, 54, 64, 65 : 担体
5, 28, 47, 52 : 第１プローブ
6, 55 : 核酸捕捉配列
7, 30 : 共通配列
8 : 核酸増幅補正配列
9, 29 : タグ配列
10, 48, 53 : 第２プローブ
11 :反応産物捕捉配列
12：一本鎖核酸（mRNA）
13, 31, 57, 58：反応産物合成プライマー
14, 32：反応産物
15：反応産物捕捉配列の相補配列
16：mRNA分解産物
17, 35, 63：タグ配列導入産物
18, 37, 66：細胞捕捉基板
19, 38, 67：細胞溶解試薬
20, 39：反応産物合成プライマー／逆転写酵素、及び逆転写酵素反応試薬
21, 23, 25, 40, 42, 44, 46, 69, 71, 73, 75, 78: 反応装置
22, 67, 43, 70: RNaseH、RNaseH反応試薬
24, 45, 77：DNAポリメラーゼ、及びDNAポリメラーゼ反応試薬
33：核酸修飾配列
34：修飾反応産物
36：核酸修飾配列の相補配列
41：修飾酵素、及び修飾酵素反応試薬
56：第１の反応産物
59, 60：第２の反応産物
61, 62：ビオチン修飾反応産物
68：逆転写酵素、及び逆転写反応試薬
72：反応産物合成プライマー、DNAポリメラーゼ、及びDNAポリメラーゼ反応試薬
74：ビオチン修飾酵素、及びビオチン修飾酵素反応試薬
76: 洗浄液

配列番号1：人工配列の説明：本発明の実施例１、２、３、４で使用する第１プローブ
配列番号２：人工配列の説明：本発明の実施例１、３、４で使用する第２プローブ
配列番号３：人工配列の説明：本発明の実施例１で使用する増幅用フォワードプライマー
配列番号４：人工配列の説明：本発明の実施例１、４で使用する増幅用リバースプライマー
配列番号５：本発明の実施例２で使用する第１プローブ
配列番号６：人工配列の説明：本発明の実施例２で使用する反応産物合成プライマー
配列番号７：人工配列の説明：本発明の実施例３で使用する増幅用リバースプライマー
配列番号８：人工配列の説明：本発明の実施例３で使用する増幅用フォワードプライマー
配列番号９：本発明の実施例４で使用する第１プローブ
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

基板上に配置された細胞保持領域と、該細胞保持領域内に配置され、細胞から抽出された一本鎖核酸を捕捉するための配列を有する第１プローブとを含む、一本鎖核酸捕捉手段と、
捕捉された前記一本鎖核酸と同じか又は相補的な配列を有する核酸を反応産物として前記細胞保持領域内で合成する反応産物合成手段と、
一本鎖核酸分解手段と、
前記一本鎖核酸から解離した前記反応産物を、前記細胞保持領域内に配置され、前記反応産物を捕捉するための配列を有する第２プローブと結合させるために、前記反応産物の3'末端にヌクレオチドを付加する反応産物修飾手段と、
前記第２プローブを含む、修飾された反応産物を捕捉する反応産物捕捉手段と、
前記反応産物の核酸と同じか又は相補的な配列を有し、かつ前記細胞保持領域に固有のタグ配列を有するタグ配列導入産物を合成するタグ配列導入手段と、
前記タグ配列導入産物を増幅する核酸増幅手段と、
を含む、遺伝子解析システム。
前記反応産物合成手段が、捕捉された一本鎖核酸と相補的な核酸を反応産物として前記細胞保持領域内で合成するものであり、
前記タグ配列導入手段が、前記反応産物の核酸と相補的な配列を有するタグ配列導入産物を合成するものである、請求項１に記載のシステム。
前記反応産物合成手段が、捕捉された一本鎖核酸と相補的な配列を有する核酸を第１の反応産物として前記細胞保持領域内で合成し、次いで前記第１の反応産物の核酸と相補的な配列を有する核酸を第２の反応産物として合成するものであり、
前記タグ配列導入手段が、前記第２の反応産物の核酸と相補的な配列を有するタグ配列導入産物を合成するものである、
請求項１又は２に記載のシステム。
前記第１プローブ及び第２プローブが異なる配列を有し、前記第２プローブが各細胞保持領域に固有のタグ配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
前記第１プローブ及び第２プローブが同じプローブであり、各細胞保持領域に固有のタグ配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
前記第２プローブが核酸増幅のためのプライマーとして機能する共通配列及び／又は核酸増幅補正配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
前記反応産物を、一本鎖核酸の一部に相補的な配列を含むプライマーを用いて合成する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のシステム。
前記プライマーが、核酸増幅のためのプライマーとして機能する共通配列をさらに含む、請求項７に記載のシステム。
前記第１プローブ及び／又は第２プローブが、細胞保持領域内に保持された同一の又は異なる担体に固定される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のシステム。
前記第１プローブ及び／又は第２プローブが、接合分子を介して細胞保持領域又は該領域に保持された担体に固定される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
前記核酸増幅手段が、前記共通配列と、前記タグ配列導入産物の配列と相補的な配列とを用いた酵素反応による増幅を行うものである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
試料中の細胞を保持することが可能な細胞保持領域に細胞を保持する工程と、
前記細胞から抽出された一本鎖核酸を第１プローブとハイブリダイズさせて捕捉する工程と、
前記一本鎖核酸と同じか又は相補的な配列を有する核酸を反応産物として合成する工程と、
前記一本鎖核酸を分解して前記反応産物と解離させる工程と、
前記一本鎖核酸から解離した反応産物を、前記第１プローブと同じか又は異なり、前記反応産物を捕捉するための配列を有し、かつ前記細胞保持領域に固有のタグ配列を有する第２プローブと結合させるために、反応産物の3'末端にヌクレオチドを付加する修飾を行う工程と、
修飾した前記反応産物を前記第２プローブとハイブリダイズさせて捕捉する工程と、
前記反応産物の核酸と同じか又は相補的な配列を有し、かつ前記細胞保持領域に固有のタグ配列を有するタグ配列導入産物を前記第２プローブと連結して合成するタグ配列導入工程と、
前記タグ配列導入産物を増幅させる工程と、
を含む、遺伝子解析方法。
請求項１２に記載の方法に使用するための遺伝子解析用キットであって、
細胞保持領域を一個又は複数個含む基板と、前記細胞保持領域内に配置され、細胞から抽出された一本鎖核酸と相補的な配列を含む第１プローブと、前記細胞保持領域内に配置され、前記反応産物を捕捉するための配列を有する第２プローブと、を含む遺伝子解析用デバイス、
各工程で使用する酵素及び反応試薬、及び
核酸合成のためのヌクレオチド
を含み、前記酵素及び反応試薬が、前記反応産物を修飾する酵素及び／又は反応試薬を含む、キット。
前記酵素が、前記反応産物の末端へ特異的に核酸を付加する酵素を含む、請求項１３に記載のキット。