JP6379531B2 - 新規β−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｒ体のβ−アミノ酸を選択的に製造する方法に関する。

光学活性アミノ酸は、医薬品、農薬及び食品などの分野で多くの需要があるが、β−アミノ酸は、光学的に純粋なアミノ酸、特に発酵法などの産物（天然のアミノ酸）として得ることが難しい。従って、β−アミノ酸の光学活性体を、いかにして効率的に製造するかは、産業上重要な課題となっている。

この課題に対して、ペニシリンＧアシラーゼを用いる方法、ブタ腎臓由来アシラーゼを用いる方法、グルタリル７−アミノセファロスポラン酸アシラーゼを用いる方法、アミノアシラーゼを用いる方法等、酵素法によるβ−アミノ酸の光学活性体の製造方法が開発されているが、産業利用において、より優れた製造方法が望まれている。（特許文献１、２、３）。

特表２００５−５２０５５２ 特許４２２２９３９ 特許５１１９７８３

Ｓａｋａｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４５（１４），４４５２−６２

本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、工業的な規模においてＲ体のβ−アミノ酸を高収率で製造することができる新規な製造方法を提供することにある。

本発明者は、上記目的を達成するために、Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸加水分解能力を指標として様々な微生物をスクリーニングした結果、アクロモバクター属由来の酵素が、Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸の加水分解活性を有することを見出した。本発明者はさらに検討を進め、前記酵素がＲ体のβ−アミノ酸の製造において有用な立体認識も有しており、前記酵素をＮ−サクシニル−β−アミノ酸のラセミ体に作用させてＮ−サクシニル−β−アミノ酸のＲ体を不斉加水分解することでＲ体のβ−アミノ酸を選択的に製造することができることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．
下記の（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つで表されるタンパク質
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠如、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質；
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を示すＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質であり、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質。
項２．
以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれか１つで表されるＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠如、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を示すＤＮＡであり、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
項３．
項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
項４．
項３に記載のベクターを含む形質転換体。
項５．
項４に記載の形質転換体を培養することを含む、項１〜３のいずれかに記載のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼの製造方法。
項６．
項１に記載のタンパク質を用いてＮ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する工程を含む、Ｒ体のβ−アミノ酸の製造方法。
項７．
Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸がＮ−サクシニル−（Ｒ、Ｓ）−β−フェニルアラニンである、項６に記載の方法。

本発明のＲ体のβ−アミノ酸の製造方法で使用するタンパク質は、Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸のサクシニル基を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性（本明細書では、前記活性をＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性とも記載する。）が格段に高い酵素である。従って、本発明によれば、医薬品原料などとして有用なＲ体のβ−アミノ酸を、工業的な規模において高収率で得ることが可能となる。

本発明の実施形態の一つは、
下記（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つで表されるタンパク質を用いてＮ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する工程を含む、Ｒ体のβ−アミノ酸の製造方法である。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠如、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質;
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を示すＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質;
（ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質であり、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質。

本発明で使用するタンパク質は、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を選択的に加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する能力を有するものであれば特に限定されない。このようなものとして、例えば、アクロモバクター ピエチャウディー（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ）、アクロモバクター キシロソキシランス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、アクロモバクター デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アクロモバクター アルセニコキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ａｒｓｅｎｉｃｏｘｙｄａｎｓ）、アクロモバクター ルーランディ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｈｌａｎｄｉｉ）、アクロモバクター ペスティファー（ Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｅｓｔｉｆｅｒ） などのアクロモバクター属由来の酵素が挙げられる。具体的には、（ａ）配列番号２からなる遺伝子によってコードされるタンパク質、または（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が例示される。配列番号２は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ ＮＢＲＣ１０２４６１由来の塩基配列であり、配列番号１は、配列番号２の塩基配列に対応するアミノ酸配列である。

本発明で用いるタンパク質は、（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質、または（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質であっても良い。

本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当するに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件とする。

また、「１または数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造やＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個である。ただし、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を含むアミノ酸配列の場合には、３０℃、ｐＨ７〜８の条件下で配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を保持していることが望ましい。

本発明において使用するタンパク質のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性は、後述の方法で測定することによって定義される。

本発明で用いるタンパク質は、（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を示すＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質、または、（ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質であり、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質であってもよい。

アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、算出する。

次に、本発明のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法について説明する。本発明の前記タンパク質は、一般的な方法により製造することができる。具体例としては、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子、または、配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。

ベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター、ウィルスベクター等が包含される。組換えベクターの調製は、常法に従って行えばよく、例えば、これらのベクターに、本発明のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有するタンパク質の遺伝子を適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより容易に行うことができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。

また、宿主細胞としては、従来公知のものが使用可能であり、組換え発現系が確立しているものであれば特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌、放線菌、麹菌、酵母といった微生物ならびに昆虫細胞、動物細胞、高等植物などが挙げられ、より好ましくは微生物が挙げられ、特に好ましくは大腸菌（例えば、Ｋ１２株、Ｂ株など）が挙げられる。形質転換体の調製は、常法に従って行えばよい。

得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適当な培養条件で一定期間培養すれば、組込まれた遺伝子から本発明のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有するタンパク質が発現されて、形質転換体中に蓄積する。

形質転換体中に蓄積した本発明のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有するタンパク質は、未精製のまま用いることができるが、精製したものを使用しても良い。この精製方法としては、従来公知のものが使用可能であり、例えば、培養後の形質転換体あるいはその培養物を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこからタンパク質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。

次に、β−アミノ酸を製造する方法について説明する。本発明によれば、β−アミノ酸は、Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有するタンパク質を用いて、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を効率的に加水分解する工程によって製造される。

この工程は、具体的には、適当な溶液中に、本発明のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有するタンパク質と原料のＮ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸を溶解させて反応液を調製し、この反応液を適当な条件で反応させることによって行うことができる。これにより、前記酵素はＮ−サクシニル−β−アミノ酸のラセミ体のうちＲ体を選択的に不斉加水分解することでＲ体のβ−アミノ酸を選択的に製造することができる。

ここで、「Ｒ体に対して選択的に反応」とは、Ｓ体に対して全く反応しないことを必ずしも意味しない。Ｒ体の光学純度が鏡像体過剰率（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ、以下ｅｅとも略称）として１％ｅｅを越えていれば良い。好ましくはＲ体の光学純度が１０％ｅｅ、さらに好ましくは３０％ｅｅ、さらに好ましくは５０％ｅｅ、さらに好ましくは６０％ｅｅ、さらに好ましくは７０％ｅｅ、さらに好ましくは８０％ｅｅ、さらに好ましくは９０％ｅｅ、さらに好ましくは９７％ｅｅ、さらに好ましくは９９％ｅｅ、さらに好ましくは１００％ｅｅである。Ｓ体が検出されないことがもっとも好ましい。

なお、本明細書において、変換率及び光学純度は、下記、計算式にて、算出することができる。

変換率（％）＝生成物量／（残存基質量＋生成物量）×１００
光学純度（％ｅｅ）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）

使用する溶液は、蒸留水でもよいが、必要により、リン酸塩やトリスなどの緩衝剤を使用してもよい。緩衝剤を使用する場合、その濃度は２０〜２００ｍＭであることが好ましく、ｐＨは６〜８であることが好ましい。

本発明のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有するタンパク質は、反応液中１０〜３０００ｍｇ／Ｌの濃度で使用されることが好ましい。

本発明において、原料となるＮ−サクシニル−β−アミノ酸は、種々の公知の方法によって合成することができ、例えば非特許文献１に記載の方法によって合成することができる。原料となるサクシニルアミノ酸の種類は、製造したいβ−アミノ酸の種類に応じて適宜選択すればよく、天然に存在する２０種のアミノ酸および非天然アミノ酸およびその誘導体であることができる。そのような原料として、例えば、Ｎ−サクシニル−β−フェニルアラニンが挙げられる。反応液中のＮ−サクシニル−β−アミノ酸の濃度は、特に限定されないが、一般的に１重量％〜３０重量％である。

本発明のβ−アミノ酸の製造方法では、反応液を反応させる温度は、本発明のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有するタンパク質が十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には５〜６０℃が好ましく、１０〜５５℃がより好ましく、２０〜５０℃がさらに好ましい。また、反応時のｐＨは、本発明のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有するタンパク質が十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ６〜８がより好ましい。基質濃度は、０．０１重量％〜３０重量％で行うことが好ましい。反応時間は、特に限定されないが、一般的に１〜７日程度である。反応時間は、製造したいβ−アミノ酸の種類と所望の収量、収率、使用する酵素や基質の量、量比、反応温度や反応ｐＨなどを考慮し、実験的に適宜選択することができる。

なお、本発明のβ−アミノ酸の製造方法で使用するＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有するタンパク質は、精製されたものや未精製のもの（粗酵素液など）に限定されず、形質転換体中に含まれた状態のものであってもよい。この場合は、形質転換体を反応系に添加して、形質転換体を培養させながら同時に反応を進行させるか、又は予め培養された形質転換体を反応系に添加すればよい。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。

［Ｎ−サクシニル−β−フェニルアラニン及びβ−フェニルアラニンの分析］
本実施例において、Ｎ−サクシニル−β−フェニルアラニンの定量は、特に記載がない場合は、以下の分析条件で定量した。
サクシニル体を定量する場合は、ジ一エルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３」（５μｍ、４．６×１００ｍｍ）を利用した高速液体クロマ卜グラフィ一により行った。

Ｎ−サクシニル−β−フェニルアラニンの分析
移動相：ｐＨ２．３リン酸水溶液／アセトニトリル＝７５／２５
流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ

Ｎ−サクシニル−β−フェニルアラニンが加水分解（脱サクシニル化）されて生成する遊離体のβ−フェニルアラニンの光学純度を分析する際は、ダイセル化学工業株式会社光学分割カラムＤＡＩＣＥＬ ＣＨＩＲＡＬ ＰＡＫ ＷＨ（１０μｍ、４．６×２５０ｍｍ）により行った。

（Ｓ、Ｒ）−β−フェニルアラニンの分析
移動相：２ｍＭ硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃
検出：ＵＶ２５４ｎｍ

［Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性］
本発明において使用するタンパク質のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性は、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この形質転換体、この形質転換体の菌体破砕液もしくは精製した酵素タンパク質を以下に記載の方法で測定することによって求めることができる。
１０ｍＭ Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−フェニルアラニン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び酵素溶液を含む反応液を３０℃にて１５ｍｉｎから３ｈｒ、適当な時間反応させ、ＨＰＬＣの移動相にて反応を停止させる。生成した（Ｒ）−β−フェニルアラニンをＨＰＬＣにより定量し、酵素活性を算出する。酵素活性はＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−フェニルアラニンから（Ｒ）−β−フェニルアラニンが１分間に１μｍｏｌ生成された場合を１Ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義した。

［実施例１］Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼのスクリーニング
本発明菌株は、２種類の方法によって、選抜された。まず、土壌中からのスクリーニングを行った。培地として、硝酸アンモニウム０．２％、リン酸二水素カリウム０．２％、リン酸水素二ナトリウム０．３％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％、酵母エキス０．０１％、ポリペプトン０．０１％、誘導物質Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸０．２％を含むｐＨ７．５の培地に少量の土壌を加え、３０℃で試験管振盪培養することで、土壌より集積培養を数回実施した。同様の培地成分にて寒天培地を作成し、集積培養を行った培養液をプレートアウトし、単離コロニーとした。単離されたコロニーを、再度上記培地で試験管振盪培養し、得られた培養液のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性をＨＰＬＣにて分析したが、活性のあるものは得られなかった。続いて、微生物株保存機関等から分譲可能な菌株を用いて前記と同様のスクリーニングを行った結果、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ ＮＢＲＣ１０２４６１がＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を持つことを発見した。なお、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ ＮＢＲＣ１０２４６１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構から購入することができる。

［実施例２］Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ ＮＢＲＣ１０２４６１株由来Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ遺伝子のクローニング
（１）Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ ＮＢＲＣ１０２４６１株からのＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼの調製
５００ｍＬフラスコに１００ｍＬ培地を加え、オートクレーブ滅菌したＬＢ液体培地にＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ ＮＢＲＣ１０２４６１株を一白金耳、植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで１日間浸とう培養し、種培養液を得た。この種培養液を１０Ｌ容ジャーファーメンターに入った６ＬのＬＢ培地に接種し、振とう数４２０ｒｐｍ、２５℃で１日間培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離にて集菌し、２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）に懸濁し、フレンチプレス破砕機を用いて破砕した。得られた粗酵素液の硫安分画処理を行った後、１００ｍｌのＰＳセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）、５０ｍＬのＤＥＡＥセファロースＦａｓｔＦｌｏｗカラム（ＧＥヘルスケア社製）、さらにＳｕｐｅｒｄｅｘＳ−２００カラム（ＧＥヘルスケア社製）により分離精製した。続いて、本方法により得られたＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析に供した。結果、分子量、５０〜７０ｋダルトンと２０〜３０ｋダルトンの２本のメインバンドを確認することが出来た。
（２）部分アミノ酸配列の決定
次に、５０〜７０ｋダルトンのバンドをゲルから切り出し、トリプシンで消化させた後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析を行った。その結果、ＳＮＮＷＴＩＧＧＱＨＴＤＴＧＫ及びＡＬＮＳＡＤＰＡＶＮＤＡＬＧＬＬＫの部分配列を取得できた。
（３）遺伝子配列の決定
この同定したアミノ酸配列をもとに縮重プライマーを合成し（表１の配列番号３、４，５，６）、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ ＮＢＲＣ１０２４６１より公知の方法で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとＰＣＲを行った。該ＰＣＲで増幅されたＰＣＲ産物をクローニングキットＴａｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）に形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ（商標登録）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により遺伝子配列を確認し、部分配列９５５ｂｐを取得した。 次に上記のようにして得られたゲノムＤＮＡを用いて全長配列を取得するために以下の操作を行った。ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ ＰＣＲ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、既知配列からＮ末端、Ｃ末端方向へのＤＮＡ断片を増幅させることに成功し、開始コドン、終止コドンを含む全長配列までの塩基配列を決定した。なお、全長配列の取得に用いたプライマーの配列を、配列番号７及び配列番号８にそれぞれ示す。また、得られた全長ＤＮＡ配列を配列番号２に示す。配列番号１は、配列番号２の塩基配列に対応するアミノ酸配列である。

［実施例３］Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼの調製
（１）発現ベクターの作成
実施例２で得られたＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ遺伝子のＮ末端、Ｃ末端部分に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位を結合させた配列を有するプライマー（表１の配列番号９及び配列番号１０）を用いて、この間のＤＮＡを実施例２で得たゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより増幅することでオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩで切断し、同酵素で切断、脱リン酸化したベクタープラスミドｐＢＳＫと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ラーゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにライゲーションしたＤＮＡをエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換し、該形質転換体を取得した。このようにしてＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ遺伝子を大量に発現できる大腸菌組換え株を取得した。
（２）酵素の調製
上記で得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した５ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌後、３０℃で２０時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、２５ｍＭリン酸緩衝溶液(ｐＨ７．５)に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、各種由来の形質転換体におけるＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ粗酵素液を取得した。これら粗酵素液を用いて、酵素活性を測定したところ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を確認することができた。続いて、
５００ｍＬの坂口フラスコに入った６０ｍＬのＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌し、振とう数１８０ｒｐｍで３０℃、１６時間培養し、種培養液とした。この種培養液を１０Ｌ容ジャーファーメンターに入った６ＬのＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に接種し、振とう数４２０ｒｐｍ、３０℃で２１時間培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離にて集菌し、２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）に懸濁し、フレンチプレス破砕機を用いて破砕した。得られた粗酵素液の硫安分画処理を行った後、ＨｉＴｒａｐ Ｏｃｔｙｌ ＦＦカラム５ｍＬ（ＧＥヘルスケア社製）、ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦカラム５ｍＬ（ＧＥヘルスケア社製）により分離精製した。本方法により得られたＤ−サクシニルアシラーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析に供し、ほとんど不純蛋白質が存在しないことが確認できたので、これを用いて、以下のβ−アミノ酸製造を行った。

［実施例４］Ｎ−サクシニル−（Ｒ、Ｓ）−β−フェニルアラニンからの（Ｒ）−β−フェニルアラニンの調製
５％Ｎ−サクシニル−（Ｒ、Ｓ）−β−フェニルアラニン（ｐＨ７．５）５ｍｌを基質として用い、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質１．０Ｕを添加し、３７℃で２４時間反応させ、変換率及びβ−フェニルアラニンの光学純度を算出した。
変換率は、上記記載のジ一エルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３」を利用した高速液体クロマ卜グラフィ一で酵素反応前と反応後の基質のピーク面積値を測定することによって算出した。光学純度（鏡像体過剰率）は、上記記載のダイセル化学工業株式会社製「ＤＡＩＣＥＬ ＣＨＩＲＡＬ ＰＡＫ ＷＨ」で生成した遊離体のアミノ酸の光学純度を測定することによって算出した。結果、変換率４５％、光学純度９９％ｅｅで、（Ｒ）−β−フェニルアラニンが生産された。

Ｎ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸に作用し、Ｒ体のβ−アミノ酸の合成に活用できる有用な酵素タンパク質を見出した。本発明は、医薬品原料などとして有用なβ−アミノ酸を、工業的な規模、時間において高収率で得るために有用である。

Claims (1)

1. 下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つで表されるタンパク質を用いてＮ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解する工程を含む（Ｒ）−β−フェニルアラニンの製造方法。
   （ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
   （ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠如、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質
   （ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を示すＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質
   （ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質であり、かつ、Ｎ−サクシニル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸中のＮ−サクシニル−（Ｒ）−β−アミノ酸を加水分解して、（Ｒ）−β−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質