JP6372921B2

JP6372921B2 - 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法

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Publication number: JP6372921B2
Application number: JP2014533096A
Authority: JP
Inventors: 理恵佐々木; 有基片山
Original assignee: Kyowa Medex Co Ltd; Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co Ltd; Minaris Medical Co Ltd
Current assignee: Minaris Medical Co Ltd
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2018-08-15
Anticipated expiration: 2033-08-30
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Description

本発明は、検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定試薬及び測定用キットに関する。

生体中のリポ蛋白は、その比重により高密度リポ蛋白（以下、HDLと略記する）、低密度リポ蛋白（以下、LDLと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、VLDLと略記する）、カイロミクロン（以下、CMと略記する）に分類されており、それぞれ主にアポ蛋白の種類の違いによって生体中での働きが大きく異なっており、脂質組成も様々である。その中で、HDLは、動脈壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るために細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化症疾患の発症予知の有用な指針となることが知られている。

従来のHDL中のコレステロール（以下、HDLコレステロールと略記する）の測定は、超遠心法、免疫化学的方法、電気泳動法、沈殿法による分画操作とコレステロール定量の２段階からなる。しかしながら、分画操作は、操作が煩雑であり、長時間を要するものであり、また、安全性の点でも問題があった。従って、これらの分離操作を伴う測定法は極めて効率が悪く、実用化に適さない方法であった。

近年、上記の問題を解決するために、種々の測定法が報告されている。例えば、血清又は血漿を、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、及び胆汁酸塩又は胆汁酸誘導体又はジオクチルスルホサクシネートを含有する緩衝液中で当該酵素とを反応させ、HDLコレステロールを特異的に分別定量する方法（特許文献１参照）、血清を、特定のpH及び特定の温度の下、膵臓由来のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、胆汁酸群の界面活性剤、及び、非イオン系界面活性剤を含有する緩衝液中で当該酵素と反応させることによりHDLコレステロールを測定する方法（特許文献２参照）が知られている。特許文献２に記載の測定方法では、まず、LDLコレステロールと当該酵素との反応が進行し、次いで、HDLコレステロールの測定が可能となる。しかしながら、これらの測定は、測定に長時間を要し、また、必ずしも、HDLコレステロールに特異的な測定法ではなかった。

HDL以外のリポ蛋白を凝集させてHDLコレステロールを測定する方法としては、例えばデキストラン硫酸等のHDL以外のリポ蛋白を凝集させる試薬、２価の金属塩、及び、化学的に修飾された酵素を用いる方法（特許文献３参照）、ポリアニオン等のHDL以外のリポ蛋白と複合体を形成する試薬と、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物等のリポ蛋白を溶解しない界面活性剤とを用いる測定法（特許文献４参照）、デキストラン硫酸等のポリアニオン、２価の金属塩、特定の非イオン性界面活性剤及び試料由来のアルブミンとは別異のアルブミンとを用いる測定法（特許文献５参照）、血清又は血漿を、リポ蛋白分画剤（デキストラン硫酸等のポリアニオンとマグネシウムイオン等の２価の陽イオンとの組合せ）を含む溶液で処理し、得られた混合液を固体及び液体の分離処理することなく、アニオン性界面活性剤（アルキルスルホン酸又は胆汁酸もしくはその誘導体）の存在下に、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼと反応させ、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする血清又は血漿中のHDLコレステロールを測定する方法（特許文献６参照）等が知られている。

HDL以外のリポ蛋白を凝集させずにHDLコレステロールを測定する方法としては、例えば、生体試料と、膵臓由来のコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとを胆汁酸もしくはその塩及びアルブミン存在下に反応させ、当該酵素反応により消費又は生成する化合物を測定することによる生体試料中のHDLコレステロールの測定法（特許文献７参照）、HDL分画に対して反応選択性をもつHLB値が16以上の非イオン性界面活性剤の存在下に、検体と、HDL画分に優先的に作用するリポプロテインリパーゼ及び／又はコレステロールエステラーゼならびにコレステロール酸化酵素とを反応させて、検体中のHDLコレステロールを測定する方法（特許文献８参照）等が知られている。また、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルによりHDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを優先的に過酸化水素へ変換し、生成した過酸化水素を消去した後、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの添加によりHDLコレステロールを酵素的に測定する方法（特許文献９参照）も知られている。

また、検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素、又は、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素とを、非イオン性界面活性剤、ポリアニオン及びアルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中のHDLコレステロールの測定方法（特許文献１０参照）や、検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素、又は、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素とを、特定の構造の第四級アンモニウム塩又はアミン類と、ポリアニオンとを含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定することを特徴とするHDLコレステロールの測定方法（特許文献１１参照）も知られている。

光学的手法により検体中の特定物質の測定を行う場合、肝・胆道疾患の患者由来の検体では、リン脂質及び遊離型コレステロールが増加した異常リポ蛋白(LpX)が出現し、LpXが測定系に光学的な影響を与え、正常な測定値が得られないことが問題となっている。この光学的な影響を回避するために、反応液中の塩類を高濃度とし、水不溶性蛋白に起因する濁りを解消させる方法が一般的に知られている。しかしながら、HDLコレステロールの測定においては、高濃度の塩類を存在させることにより、HDLコレステロールに対する特異性の低下や、さらには含有されている酵素の失活を招く恐れがある。

特開昭６２−６９９９９号公報特開昭６３−１２６４９８号公報特開平８−１３１１９７号公報特開平８−２０１３９３号公報特開平９−２８５２９８号公報特開平８−１１６９９６号公報国際公開第９７／４０３７６号パンフレット国際公開第００／５２４８０号パンフレット特開平９−２９９号公報国際公開第２００４／０３５８１６号パンフレット国際公開第２００６／１１８１９９号パンフレット

本発明の目的は、簡便で、かつ、正確な測定ができるHDLコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キットを提供することにある。

本発明の発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討し、ピリジニウム塩又は第四級アンモニウム塩の構造を有する特定の含窒素物質及びポリアニオンの共存下、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素がHDLコレステロールに特異的に作用するという知見を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記［１］〜［１３］に関する。
［１］検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素、又は、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素とを、一般式（Ｉ）

（式中、Ｒ^１は、置換若しくは非置換の、炭素数８〜１４のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ_ａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質、及び、一般式（ＩＩ）

（式中、Ｒ^２は、置換若しくは非置換の、炭素数６〜３０のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ^３は、置換若しくは非置換の、炭素数１〜６のアルキル又は炭素数２〜６のアルケニルを表し、Ｒ^４は、水素原子、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ならびに、ポリアニオンを含有する水性媒体中で反応させて過酸化水素又は還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
［２］水性媒体が、さらにアルブミンを含有する［１］記載の方法。
［３］ポリアニオンが、デキストラン硫酸又はその塩である［１］又は［２］記載の方法。
［４］一般式（Ｉ）

（式中、Ｒ^２は、置換若しくは非置換の、炭素数６〜３０のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ^３は、置換若しくは非置換の、炭素数１〜６のアルキル又は炭素数２〜６のアルケニルを表し、Ｒ^４は、水素原子、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、及び、過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
［５］一般式（Ｉ）

（式中、Ｒ^２は、置換若しくは非置換の、炭素数６〜３０のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ^３は、置換若しくは非置換の、炭素数１〜６のアルキル又は炭素数２〜６のアルケニルを表し、Ｒ^４は、水素原子、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、及び、酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
［６］さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する［５］記載の試薬。
［７］さらに、アルブミンを含有する［４］〜［６］のいずれかに記載の試薬。
［８］ポリアニオンが、デキストラン硫酸又はその塩である［４］〜［７］のいずれかに記載の試薬。

［９］第１試薬及び第２試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キットであって、一般式（Ｉ）

（式中、Ｒ^２は、置換若しくは非置換の、炭素数６〜３０のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ^３は、置換若しくは非置換の、炭素数１〜６のアルキル又は炭素数２〜６のアルケニルを表し、Ｒ^４は、水素原子、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質、及び、ポリアニオンを第１試薬に含有し、コレステロール酸化酵素を第２試薬に含有し、過酸化水素測定用試薬を第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とするキット。

［１０］第１試薬及び第２試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キットであって、一般式（Ｉ）

（式中、Ｒ^２は、置換若しくは非置換の、炭素数６〜３０のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ^３は、置換若しくは非置換の、炭素数１〜６のアルキル又は炭素数２〜６のアルケニルを表し、Ｒ^４は、水素原子、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質、及び、ポリアニオンを第１試薬に含有し、コレステロール脱水素酵素を第２試薬に含有し、酸化型補酵素を第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とするキット。
［１１］さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有する［１０］記載のキット。
［１２］さらに、アルブミンを第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有する［９］〜［１１］のいずれかに記載のキット。
［１３］ポリアニオンが、デキストラン硫酸又はその塩である［９］〜［１２］のいずれかに記載のキット。

本発明により、簡便で、かつ、正確なHDLコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キットが提供される。

本発明のHDLコレステロールの測定方法は、HDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することなく、HDLコレステロールを特異的に測定する方法である。

本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば、全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿及び血清が好ましい。

本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。

コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素も、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。

市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、例えば、コレステロールエステラーゼ“Amano”2（CHE2；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ“Amano”3（CHE3；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼEST“Amano”2（天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ（LPL311；東洋紡社製）、リポプロテインリパーゼ“Amano”6（LPL6；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ［COE313（化学的に修飾されたコレステロールエステラーゼ）；東洋紡社製］等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。

コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾する基（化学修飾基）としては、例えば、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールの共重合体を有する基、水溶性他糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えば、デキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。

コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、上記化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基又は構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基（N-ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、無塩化物、アルデヒド、エポキシド基、1,3-プロパンスルトン、1,4-ブランスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基又は構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等が挙げられる。

化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とN-ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトME-50CS、サンブライトMEAC-50HS及びサンブライトMEC-50HS（いずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトAKMシリーズ（例えば、サンブライトAKM-1510等）、サンブライトADMシリーズ及びサンブライトACMシリーズ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するEPOX-3400及びM-EPOX-5000（いずれもSheawater Polymers社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン-N,N,N’’,N’’-ペンタ無水酢酸（DTPA anhydride；同仁化学社製）等が挙げられる。

コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾方法は特に制限はなく、例えば、コレステロールエステル加水分解酵素をpH8.0以上の緩衝液（例えばHEPES緩衝液）に溶解し、0〜5℃で0.01〜500倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分間〜５時間撹拌することにより行うことができる。本発明に使用する化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素としては、この反応液そのもの、必要に応じて限外ろ過膜等による未反応の化学修飾剤等を除去したものを使用することもできる。

本反応の方法に用いられるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で0.01〜200 U/mLの濃度であることが好ましく、0.02〜100 U/mLであることがより好ましい。

本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく。例えば、動物、植物又は微生物由来のコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ“Amano”I（CHOD1；天野エンザイム社製）、コレステロールオキシダーゼ（CHO-PEL；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（COO321；東洋紡社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、2種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。

コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば、前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法による作製することができる。

本反応の方法に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で0.01〜200 U/mLの濃度であることが好ましく、0.02〜100 U/mLの濃度であることがより好ましい。

本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ“Amano”5（CHDH5；天野エンザイム社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、2種類以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。コレステロール脱水素酵素は、無修飾の酵素であても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作成することができる。

本反応の方法に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で0.01〜200 U/mLの濃度であることが好ましく、0.02〜100 U/mLの濃度であることがより好ましい。

本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補酵素が使用される。酸化型補酵素としては、例えばNAD⁺、NADP⁺、チオ-NAD⁺、チオ-NADP⁺等が挙げられる。

本発明においては、ポリアニオンと共に、一般式（Ｉ）

（式中、Ｒ^１は、置換若しくは非置換の、炭素数８〜１４のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ_ａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質［以下、化合物（Ｉ）という］、及び、一般式（ＩＩ）

（式中、Ｒ^２は、置換若しくは非置換の、炭素数６〜３０のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ^３は、置換若しくは非置換の、炭素数１〜６のアルキル又は炭素数２〜６のアルケニルを表し、Ｒ^４は、水素原子、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質［以下、化合物（ＩＩ）という］が使用される。

Ｒ^１において、置換もしくは非置換の炭素数８〜１４のアルキルにおけるアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル等が挙げられ、炭素数１２〜１４のアルキルが好ましい。

Ｒ^１において、置換もしくは非置換の炭素数８〜１４のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えばオクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニルが挙げられ、炭素数１２〜１４のアルケニルが好ましい。

Ｒ^１において、炭素数８〜１４の置換アルキル、及び、炭素数８〜１４の置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。

Ｒ_ａにおいて、置換もしくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜２０のアルキル等が挙げられる。炭素数１〜２０のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。

Ｒ_ａにおいて、置換もしくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数２〜２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数２〜２０のアルケニルとしては、例えばビニル、プロペニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。

Ｒ_ａにおいて、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。

ピリジン環上に２つ以上の置換基がある場合、置換基は同じであっても異なっていてもよい。化合物（Ｉ）におけるＸ⁻は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-、CH₃CH₂OSO₃ ^-、(CF₃SO₂)₂N^-等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl^-、Br^-、I^-等が挙げられる。

化合物（Ｉ）として、Ｒ^１が炭素数１２〜１４の置換若しくは非置換のアルキル又はアルケニル、Ｒ_ａが水素原子である化合物（Ｉ）が好ましい。

化合物（Ｉ）の具体例（製品）としては、例えばラウリルピリジニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド（いずれも東京化成工業社製）等が挙げられる。

Ｒ^２において、置換若しくは非置換の炭素数６〜３０のアルキルにおけるアルキルとしては、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられ、炭素数８〜２０のアルキルが好ましく、炭素数８〜１８のアルキルがより好ましい。

Ｒ^２において、置換若しくは非置換の炭素数６〜３０のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えばヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル、ヘネイコセニル、ドコセニル、トリコセニル、テトラコセニル、ペンタコセニル、ヘキサコセニル、ヘプタコセニル、オクタコセニル、ノナコセニル、トリアコンセニル等が挙げられ、炭素数８〜２０のアルケニルが好ましく、炭素数８〜１８のアルケニルがより好ましい。

Ｒ^２において、炭素数６〜３０の置換アルキル、及び炭素数６〜３０の置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、アルコキシル基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。

Ｒ^３において、置換若しくは非置換の炭素数１〜６のアルキルにおけるアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられ、炭素数１〜４のアルキルが好ましい。

Ｒ^３において、置換若しくは非置換の炭素数２〜６のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えばビニル、プロペニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等が挙げられ、炭素数２〜４のアルケニルが好ましい。

Ｒ^３において、炭素数１〜６の置換アルキル、及び、炭素数２〜６の置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、アルコキシル基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。

Ｒ^４において、置換若しくは非置換のアリールにおけるアリールとしては、例えばフェニル、ナフチル等が挙げられる。

Ｒ^４において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜２０のアルキル等が挙げられる。炭素数１〜２０のアルキルとしては、例えば前述の炭素数１〜２０のアルキル等が挙げられる。

Ｒ^４において、置換アリール及び置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、アルコキシル基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。

化合物（ＩＩ）におけるＹ⁻は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-、CH₃CH₂OSO₃ ^-、(CF₃SO₂)₂N^-等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl^-、Br^-、I^-等が挙げられる。

化合物（ＩＩ）として、Ｒ^２が炭素数８〜１８の置換若しくは非置換の、アルキル又はアルケニル、Ｒ^３が炭素数１〜４の置換若しくは非置換のアルキル又は炭素数２〜４の置換若しくは非置換のアルケニル、Ｒ^４が水素原子、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のアルキルである化合物（ＩＩ）が好ましい。

化合物（ＩＩ）の具体例（製品）としては、例えばエソカードＣ／１２［ヤシ油アルキルビス(2-ヒドロキシエチル)メチルアンモニウムクロライド；ライオン社製］、エソカードＣ／２５［ポリオキシエチレンヤシ油アルキルメチルアンモニウムクロライド；ライオン社製］、臭化ドミフェン［ジメチルドデシル（2-フェノキシエチル）アンモニウムブロマイド；東京化成社製］等が挙げられる。尚、エソカードＣ／１２及びエソカードＣ／２５におけるヤシ油アルキルは、炭素数８〜１８のアルキルであり、炭素数８〜１８のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）等が挙げられる。

本発明のHDLコレステロールの測定において、化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）の反応液中の濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、通常0.001〜3%であり、0.002〜0.3%が好ましい。

本発明において用いられるポリアニオンとしては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とするポリアニオンであれば特に制限はなく、例えばデキストラン硫酸もしくはその塩、ヘパリンもしくはその塩、リンタングステン酸又はその塩、硫酸化シクロデキストリン又はその塩、硫酸オリゴ糖もしくはその塩、カラギーナン等が挙げられるが、デキストラン硫酸もしくはその塩が好ましい。デキストラン硫酸としては、例えば分子量が4万、8万、20万、50万、100万、200万等のデキストラン硫酸が挙げられる。硫酸化オリゴ糖としては、例えば硫酸化アガロース、硫酸化トレハロース、コンドロイチン硫酸等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。また、本発明においてはポリアニオンを２種類以上用いてもよい。

本発明のHDLコレステロールの測定において、ポリアニオンの反応液中の濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、通常0.001〜10%であり、0.01〜1%が好ましい。

本発明において用いられるアルブミンとしては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とするアルブミンであれば特に限定はなく、例えばウシ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミン等が挙げられるが、ウシ血清アルブミン（以下、BSAと略記する）が好ましい。また、遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。本発明においては、２種類以上のアルブミンも組み合わせて使用することもできる。

本発明のHDLコレステロールの測定方法において、アルブミンの反応液中の濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、通常0.001〜10%であり、0.01〜1%が好ましい。

本発明のHDLコレステロール測定方法において使用される水性媒体としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。

緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。グッドの緩衝剤としては、例えば2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）、ビス（2-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、N-（2-アセトアミド）イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン-N,N’-ビス（2-エタンスルホン酸）(PIPES)、N-（2-アセトアミド）-2-アミノエタンスルホン酸(ACES)、3-モルホリノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸(BES)、3-モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N-〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕-2-アミノエタンスルホン酸(TES)、2-〔4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、3-〔N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）アミノ〕-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N-〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン-N,N’-ビス（2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）(POPSO)、3-〔4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル〕-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、3-〔4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル〕プロパンスルホン酸[(H)EPPS]、N-〔トリス（ヒドロキシメチル）〕グリシン(Tricine)、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）グリシン(Bicine)、N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)、N-シクロヘキシル-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。

緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はないが、通常、0.001〜2.0 mol/Lであり、0.005〜1.0 mol/Lが好ましい。

以下に、本発明のHDLコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キットを具体的に説明する。

（HDLコレステロールの測定方法）
本発明のHDLコレステロールの測定方法としては、例えば以下の態様の方法が挙げられる。
測定方法１
（１）検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素、又は、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素とを、化合物（Ｉ）若しくは化合物（ＩＩ）、及び、ポリアニオンを含有する水性媒体中で反応させ、過酸化水素又は還元型補酵素を生成させ、
（２）生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した、HDLコレステロール濃度と過酸化水素又は還元型補酵素の測定値との関係を示す検量線とから、検体中のHDLコレステロール濃度を算出することにより、検体中のHDLコレステロール濃度を決定することができる。

測定方法２
（１）検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素、又は、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素とを、化合物（Ｉ）若しくは化合物（ＩＩ）、ポリアニオン及びアルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、過酸化水素又は還元型補酵素を生成させ、
（２）生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した、HDLコレステロール濃度と過酸化水素又は還元型補酵素の測定値との関係を示す検量線とから、検体中のHDLコレステロール濃度を算出することにより、検体中のHDLコレステロール濃度を決定することができる。

本測定方法においては、（１）の反応は、例えば10〜50℃で、好ましくは、20〜40℃で、1〜60分間、好ましくは2〜30分間行う。

生成した過酸化水素の量は、例えば、直接過酸化水素電極で測定することもできるが、過酸化水素測定用試薬により測定することもできる。過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば、色素、発光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば、後述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。

過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を定量することにより、過酸化水素を定量することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応してフォトンを生じ、生じたフォトンを定量することにより、過酸化水素を定量することができる。

酸化発色型色原体としては、例えば、ロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。

ロイコ型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、10-N-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10-フェノチアジン(CCAP)、10-N-メチルカルバモイル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10-フェノチアジン(MCDP)、N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩(DA-64)、10-N-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10-フェノチアジンナトリウム塩(DA-67)、4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔3-ビス（4-クロロフェニル）メチル-4-ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。

酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。

２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。カプラーとしては、例えば4-アミノアンチピリン(4-AA)、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。アニリン類としては、N-（3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メチルアニリン(TOOS)、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメチルアニリン(MAOS)、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン(DAOS)、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3-メチルアニリン(TOPS)、N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)、N,N-ジメチル-3-メチルアニリン、N,N-ジ（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメチルアニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（3-メチルフェニル）-N’-サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N-エチル-N-（3-メチルフェニル）-N’-アセチルエチレンジアミン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-4-フルオロ-3,5-ジメトキシアニリン(F-DAOS)等が挙げられる。フェノール類としては、フェノール、4-クロロフェノール、3-メチルフェノール、3-ヒドロキシ-2,4,6-トリヨード安息香酸(HTIB)等が挙げられる。

過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてペルオキシダーゼを用いる場合は、通常1〜100 kU/Lである。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、通常0.01〜10 g/Lである。

還元型補酵素の測定方法としては、例えば生成した還元型補酵素の吸光度を測定する方法、還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等が挙げられる。還元型補酵素の吸光度を測定する方法における吸光度としては、通常300〜500 nmであり、330〜400 nmが好ましく、340 nm付近がより好ましい。還元型補酵素測定用試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等が挙げられる。検出可能な物質が色素の場合の還元型補酵素測定用試薬としては、例えばジアホラーゼ、電子キャリアー及び還元発色型色原体を含有する試薬が挙げられる。電子キャリアーとしては、例えば1-メトキシ-5-メチルフェナジウムメチルサルフェート等が挙げられる。還元型補酵素測定用試薬として、ジアホラーゼ、電子キャリアー及び還元発色型色原体を含有する試薬を用いる場合には、還元発色型色原体が変換されて生成した色素を定量することにより、還元型補酵素を定量することができる。

還元発色型色原体としては、例えば3-（4,5-ジメチル-2-チアゾリル）-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド(MTT)、2-（4-ヨードフェニル）-3-（4-ニトロフェニル）-5-（2,4-ジスルホフェニル）-2H-テトラゾリウムモノナトリウム塩(WST-1)、2-（4-ヨードフェニル）-3-（2,4-ジニトロフェニル）-5-（2,4-ジスルホフェニル）-2H-テトラゾリウムモノナトリウム塩(WST-3)等が挙げられる。

（HDLコレステロール測定用試薬）
本発明のHDLコレステロール測定用試薬は、本発明のHDLコレステロールの測定方法に用いられ得る。

本発明のHDLコレステロール測定用試薬としては、例えば以下の態様の試薬が挙げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
試薬１
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬２
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
試薬３
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。

試薬４
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬５
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
試薬６
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。

（HDLコレステロール測定用キット）
本発明のHDLコレステロール測定用試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてもよい。キットの形態としては、特に制限はなく、２試薬系、３試薬系等のいずれであってもよいが、２試薬系が好ましい。本発明のHDLコレステロール測定用キットは、本発明のHDLコレステロール測定方法に用いられ得る。

第１試薬と第２試薬とからなる２試薬系のHDLコレステロール測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素と、コレステロール酸化酵素又はコレステロール脱水素酵素とは、第１試薬と第２試薬に別々に含有されても、第２試薬に一緒に含有されてもよいが、第１試薬と第２試薬に別々に含有される場合には、コレステロールエステル加水分解酵素が第１試薬に、コレステロール酸化酵素又はコレステロール脱水素酵素が第２試薬に含有される態様が好ましい。コレステロール脱水素酵素を用いた測定法において使用される酸化型補酵素は、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有されてもよい。

化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質は、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、第１試薬に含有されることが好ましい。ポリアニオンは、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、第１試薬に含有されることが好ましい。アルブミンは、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、第１試薬に含有されることが好ましい。

過酸化水素測定用試薬は、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、一対の酸化カップリング型色原体の一方は第１試薬に、もう一方は第２試薬に含有される態様、すなわち、過酸化水素測定用試薬が第１試薬及び第２試薬の両方に含有される態様が好ましい。還元性補酵素測定用試薬は、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、第１試薬、第２試薬の両方に含有されることが好ましい。

本発明のHDLコレステロール測定用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
キット１
第１試薬
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第２試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
キット２
第１試薬
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第２試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素

キット３
第１試薬
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第２試薬
コレステロール脱水素酵素
キット４
第１試薬
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、酸化型補酵素
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素

キット５
第１試薬
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第２試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
キット６
第１試薬
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第２試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素

キット７
第１試薬
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第２試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
キット８
第１試薬
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、過酸化水素測定用試薬
第２試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素

キット９
第１試薬
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第２試薬
コレステロール脱水素酵素
キット１０
第１試薬
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、酸化型補酵素
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素

キット１１
第１試薬
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第２試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
キット１２
第１試薬
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第２試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素

本発明のHDLコレステロール測定用試薬及びキットにおいては、前述の本発明のHDLコレステロールの測定方法において挙げられた、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、過酸化水素測定用試薬、還元型補酵素測定用試薬を用いることができる。

本発明のHDLコレステロール測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、シュークロース、塩化カルシウム等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられる。

本発明のHDLコレステロール測定用試薬及び測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬を用いて検体中のHDLコレステロールを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解されて使用される。凍結乾燥された状態の試薬の溶解に使用される水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。

本発明のHDLコレステロール測定用試薬及び測定用キットにおけるコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素の含量としては、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.01〜1,200 U/mLとなる含量であり、0.02〜600 U/mLとなる含量が好ましい。

本発明のHDLコレステロール測定用試薬及び測定用キットにおける化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）の含量としては、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.001〜10%となる含量であり、0.002〜1%となる含量が好ましい。本発明のHDLコレステロール測定用試薬及び測定用キットにおけるポリアニオンの含量としては、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.001〜30%となる含量であり、0.01〜3%となる含量が好ましい。

本発明のHDLコレステロール測定用試薬及び測定用キットにおけるアルブミンの含量としては、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.001〜30%となる含量であり、0.01〜3%となる含量が好ましい。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。HEPES（Calbiochem社製）、EMSE（ダイトーケミックス社製）、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量50万）（ＰＫケミカルズ社製）、牛血清アルブミン（BSA；Millipore社製）、硫酸ナトリウム（関東化学社製）、4-AA（埼京化成社製）、ぺルオキシダーゼ（東洋紡社製）、EST“Amano”2（コレステロールエステル加水分解酵素；天野エンザイム社製）、CHO-PEL（コレステロール酸化酵素；キッコーマン社製）、ラウリルピリジニウムクロリド（東京化成工業社製）、臭化ドミフェン（東京化成工業社製）、エソカードＣ／１２（ライオン社製）、エソカードＣ／２５（ライオン社製）、カチオンＢＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド；日油社製）。

以下の第１試薬及び第２試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第１試薬（試薬A）
HEPES (pH7.5) 10 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸ナトリウム 5.0 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量50万） 0.2 g/L
BSA 2.0 g/L
ぺルオキシダーゼ 10 kU/L
ラウリルピリジニウムクロリド 0.025 g/L
第２試薬（試薬a）
HEPES (pH7.0) 10 mmol/L
4-AA 0.3 g/L
ぺルオキシダーゼ 20 kU/L
EST“Amano”2 100 kU/L
CHO-PEL 1.2 kU/L

以下の第１試薬及び第２試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第１試薬（試薬B）
HEPES (pH7.5) 10 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸ナトリウム 5.0 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量50万） 0.2 g/L
BSA 2.0 g/L
ぺルオキシダーゼ 10 kU/L
臭化ドミフェン 0.03 g/L
第２試薬（試薬a）
HEPES (pH7.0) 10 mmol/L
4-AA 0.3 g/L
ぺルオキシダーゼ 20 kU/L
EST“Amano”2 100 kU/L
CHO-PEL 1.2 kU/L

以下の第１試薬及び第２試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第１試薬（試薬C）
HEPES (pH7.5) 10 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸ナトリウム 5.0 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量50万） 0.2 g/L
BSA 2.0 g/L
ぺルオキシダーゼ 10 kU/L
エソカードＣ／１２ 0.035 g/L
第２試薬（試薬a）
HEPES (pH7.0) 10 mmol/L
4-AA 0.3 g/L
ぺルオキシダーゼ 20 kU/L
EST“Amano”2 100 kU/L
CHO-PEL 1.2 kU/L

以下の第１試薬および第２試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第１試薬（試薬D）
HEPES (pH7.5) 10 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸ナトリウム 5.0 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量50万） 0.2 g/L
BSA 2.0 g/L
ぺルオキシダーゼ 10 kU/L
エソカードＣ／２５ 0.075 g/L
第２試薬（試薬a）
HEPES (pH7.0) 10 mmol/L
4-AA 0.3 g/L
ぺルオキシダーゼ 20 kU/L
EST“Amano”2 100 kU/L
CHO-PEL 1.2 kU/L

［比較例１］ HDLコレステロール測定用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第１試薬（試薬E）
HEPES (pH7.5) 10 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸ナトリウム 5.0 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量50万） 0.2 g/L
BSA 2.0 g/L
ぺルオキシダーゼ 10 kU/L
第２試薬（試薬a）
HEPES (pH7.0) 10 mmol/L
4-AA 0.3 g/L
ぺルオキシダーゼ 20 kU/L
EST“Amano”2 100 kU/L
CHO-PEL 1.2 kU/L

［比較例２］ HDLコレステロール測定用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第１試薬（試薬F）
HEPES (pH7.5) 10 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸ナトリウム 5.0 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量50万） 0.2 g/L
BSA 2.0 g/L
ぺルオキシダーゼ 10 kU/L
カチオンＢＢ 0.14 g/L
第２試薬（試薬a）
HEPES (pH7.0) 10 mmol/L
4-AA 0.3 g/L
ぺルオキシダーゼ 20 kU/L
EST“Amano”2 100 kU/L
CHO-PEL 1.2 kU/L

実施例１のキットを用いて、日立７１７０Ｓ型自動分析装置によりヒト血清40検体中のHDLコレステロールを測定した。
（１）検量線の作成
標準液として、生理食塩水（HDLコレステロール濃度0.0 mg/dL）および血清（HDLコレステロール濃度60.0 mg/dL）を、キットとして実施例１のキットを用いて日立７１７０Ｓ型自動分析装置により、HDLコレステロール濃度と「吸光度」との関係を示す検量線を作成した。
ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された2つの吸光度（E1およびE2）を基に、E2からE1を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液(3μL)と第１試薬(0.24 mL)とを添加し37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E1)を主波長600 nm、副波長700 nmで測定し、次いで、この反応液に第２試薬(0.08 mL)を添加しさらに37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E2)を主波長600 nm、副波長700 nmで測定した。
（２）ヒト血清検体と実施例１のキットとの反応による当該検体における「吸光度」の算出
（１）の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外は、（１）の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体における「吸光度」を算出した。
（３）ヒト血清検体中のHDLコレステロール濃度の決定
（２）で算出した「吸光度」と、（１）で作成した検量線とから、各検体中のHDLコレステロール濃度を決定した。

実施例１のキットの代わりに実施例２のキットを用いる以外は実施例５と同様の方法により、日立７１７０Ｓ型自動分析装置によりヒト血清40検体中のHDLコレステロールを測定した。

実施例１のキットの代わりに実施例３のキットを用いる以外は実施例５と同様の方法により、日立７１７０Ｓ型自動分析装置によりヒト血清40検体中のHDLコレステロールを測定した。

実施例１のキットの代わりに実施例４のキットを用いる以外は実施例５と同様の方法により、日立７１７０Ｓ型自動分析装置によりヒト血清40検体中のHDLコレステロールを測定した。

［比較例３］
実施例１のキットの代わりに比較例１のキットを用いる以外は実施例５と同様の方法により、日立７１７０Ｓ型自動分析装置によりヒト血清40検体中のHDLコレステロールを測定した。

次に、実施例５〜８及び比較例３の各測定において用いたヒト血清40検体を用いて、クリニカルケミストリー第45巻、10号、p.1803-1812（1999年）に記載された方法(DCM：Designated Comparison Method)を基準法として用い、当該検体中のHDLコレステロールを測定し、各実施例での値と比較した。
実施例５〜８及び比較例３の各測定と、DCMによる測定との相関係数を第１表に示す。

第１表から明らかな様に、化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）を含有する実施例１〜４の各キットを用いる測定においては、基準法であるDCMによる測定との間に良好な相関関係が認められたが、化合物（Ｉ）も化合物（ＩＩ）も含まない比較例１のキットを用いる測定においては、基準法であるDCMによる測定との間に良好な相関関係は認められなかった。

検体として肝・胆道疾患患者より得られた、異常リポ蛋白であるLpXを多く含む２つの血清（LpX検体１とLpX検体２）を用い、測定用キットとして実施例１〜４及び比較例１〜２の各キットを用いて、実施例５と同様の方法により、日立７１７０Ｓ型自動分析装置により、当該LpX検体中のHDLコレステロール濃度を決定した。その結果、及び、基準法であるDCMにより決定された当該LpX検体中のHDLコレステロール濃度を第２表に示す。第２表において、括弧内の値は、各LpX検体について、基準法であるDCMにより決定されたHDLコレステロール濃度を0とした場合の、各方法により決定されたHDLコレステロール濃度の差を表す。

第２表から明らかな様に、化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）を含有する実施例１〜４の各キットを用いる各方法により決定されたLpX検体中のHDLコレステロール濃度は、基準法であるDCMにより決定されたLpX検体中のHDLコレステロール濃度とほぼ一致したのに対して、化合物（Ｉ）も化合物（ＩＩ）も含有しない比較例１のキットを用いる方法により決定されたLpX検体中のHDLコレステロール濃度は、基準法であるDCMにより決定されたLpX検体中のHDLコレステロール濃度と大きく乖離した。また、化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）の代わりに第四級アンモニウム塩であるカチオンＢＢを含む比較例２のキットを用いる方法において、HDLコレステロール濃度が負の値として決定されたことから、カチオンＢＢを含む比較例２のキットを用いる方法では、LpX検体中のHDLコレステロール濃度を正確に測定できないことが分かった。従って、化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）を含有する本発明のキットを用いることにより、異常検体である、LpXを多く含む検体においても、検体中のHDLコレステロールを正確に測定できることが明らかとなった。

本発明により、メタボリックシンドローム等の診断に有効な検体中のHDLコレステロールの測定方法、測定用試薬、及び、測定用キットが提供される。

Claims

検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素、又は、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素とを、一般式（Ｉ）
（式中、Ｒ^１は、非置換の、炭素数８〜１４のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ_ａは、水素原子を表し、ｎは、５の整数を表し、Ｘ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質、及び、一般式（ＩＩ）
（式中、Ｒ^２は、置換若しくは非置換の、炭素数６〜３０のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ^３は、置換若しくは非置換の、炭素数１〜６のアルキル又は炭素数２〜６のアルケニルを表し、Ｒ^４は、水素原子、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ならびに、ポリアニオンを含有する水性媒体中で反応させて過酸化水素又は還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
水性媒体が、さらにアルブミンを含有する請求項１記載の方法。
ポリアニオンが、デキストラン硫酸又はその塩である請求項１又は２記載の方法。
一般式（Ｉ）
（式中、Ｒ^１は、非置換の、炭素数８〜１４のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ_ａは、水素原子を表し、ｎは、５の整数を表し、Ｘ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質、及び、一般式（ＩＩ）
（式中、Ｒ^２は、置換若しくは非置換の、炭素数６〜３０のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ^３は、置換若しくは非置換の、炭素数１〜６のアルキル又は炭素数２〜６のアルケニルを表し、Ｒ^４は、水素原子、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、及び、過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
一般式（Ｉ）
（式中、Ｒ^１は、非置換の、炭素数８〜１４のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ_ａは、水素原子を表し、ｎは、５の整数を表し、Ｘ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質、及び、一般式（ＩＩ）
（式中、Ｒ^２は、置換若しくは非置換の、炭素数６〜３０のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ^３は、置換若しくは非置換の、炭素数１〜６のアルキル又は炭素数２〜６のアルケニルを表し、Ｒ^４は、水素原子、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、及び、酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する請求項５記載の試薬。
さらに、アルブミンを含有する請求項４〜６のいずれかに記載の試薬。
ポリアニオンが、デキストラン硫酸又はその塩である請求項４〜７のいずれかに記載の試薬。
第１試薬及び第２試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キットであって、一般式（Ｉ）
（式中、Ｒ^１は、非置換の、炭素数８〜１４のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ_ａは、水素原子を表し、ｎは、５の整数を表し、Ｘ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質、及び、一般式（ＩＩ）
（式中、Ｒ^２は、置換若しくは非置換の、炭素数６〜３０のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ^３は、置換若しくは非置換の、炭素数１〜６のアルキル又は炭素数２〜６のアルケニルを表し、Ｒ^４は、水素原子、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、及び、ポリアニオンを第１試薬に含有し、コレステロール酸化酵素を第２試薬に含有し、過酸化水素測定用試薬を第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とするキット。
第１試薬及び第２試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キットであって、一般式（Ｉ）
（式中、Ｒ^１は、非置換の、炭素数８〜１４のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ_ａは、水素原子を表し、ｎは、５の整数を表し、Ｘ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質、及び、一般式（ＩＩ）
（式中、Ｒ^２は、置換若しくは非置換の、炭素数６〜３０のアルキル又はアルケニルを表し、Ｒ^３は、置換若しくは非置換の、炭素数１〜６のアルキル又は炭素数２〜６のアルケニルを表し、Ｒ^４は、水素原子、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ⁻は、１価のアニオンを表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、及び、ポリアニオンを第１試薬に含有し、コレステロール脱水素酵素を第２試薬に含有し、酸化型補酵素を第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とするキット。
さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有する請求項１０記載のキット。
さらに、アルブミンを第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有する請求項９〜１１のいずれかに記載のキット。
ポリアニオンが、デキストラン硫酸又はその塩である請求項９〜１２のいずれかに記載のキット。