JP6363612B2 - オキシントモジュリンと免疫グロブリンのフラグメントとを含むタンパク質結合体の液状製剤 - Google Patents

Description

本発明は、オキシントモジュリンの誘導体、変異体、前駆体、又はフラグメントなどを含むオキシントモジュリンペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域が結合し、天然型に比べて生理活性の持続期間が増加した持続型オキシントモジュリン誘導体結合体が長期間安定して維持され得るアルブミン非含有液状製剤、及び前記製剤の製造方法に関する。

肥満とは、異常又は過剰な脂肪が蓄積されて健康を脅かす状態と定義され、エネルギー摂取がエネルギー消費より多いエネルギー不均衡の結果である。過去には、肥満は健康における重要な問題でなかったが、経済的に豊かになるにつれて肥満人口が急速に増加する傾向にあり、肥満に関連して発生する様々な疾患も増加している。世界保健機関（World Health Organization, WHO）によれば、全世界的に１５億人以上の成人が過体重であり、そのうち５億人以上が肥満であり、１９８０年から２００８年の間に肥満人口は約２倍に増加した（非特許文献１）。高収入の国だけでなく、現在では低収入の国でも肥満人口の割合が増加する傾向にある。過体重及び肥満は、血圧とコレステロール値を増加させることにより、各種疾患の発病又は悪化の原因となっている。また、子供や青少年においては肥満の問題がさらに深刻であり、糖尿病、心臓疾患、高血圧、高脂血症の発病率を増加させ、死亡や障害を引き起こす可能性もある。

このように、肥満は全世界的な疾病であると共に社会的問題であるが、個人の努力により克服できると信じられており、過去には治療に大きな比重が置かれていなかった。しかし、肥満は、食欲調節及びエネルギー代謝の作用機序に関連する複雑な疾患であるので、意外に治療が容易でない。よって、肥満を治療するためには、患者自身の努力だけでなく、食欲調節及びエネルギー代謝に関連する異常な作用機序を治療する方法が同時に行われなければならないので、そのための医薬品を開発する努力が続けられている。

そのような努力の結果として、Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ（Sanofi-Aventis）、Ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎｅ（Abbott）、Ｃｏｎｔｒａｖｅ（Takeda）、Ｏｒｌｉｓｔａｔ（Roche）などの薬剤が開発されているが、これらは致命的な副作用があったり、肥満治療効果が不十分であるという欠点がある。Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ（Sanofi-Aventis）は中枢神経障害の副作用があり、Ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎｅ（Abbott）とＣｏｎｔｒａｖｅ（Takeda）は心血管系副作用があり、Ｏｒｌｉｓｔａｔ（Roche）は服用１年で約４ｋｇの体重減少効果を示すにすぎないことが報告されている。よって、現在、肥満患者に安全に処方できる肥満治療剤はほとんど存在しないのが現状である。

最近はグルカゴン誘導体に関心が集まっている。グルカゴンは、薬物治療、疾病、ホルモンや酵素欠乏などの原因で血糖が減少し始めると膵臓から産生される。グルカゴンは、肝細胞が貯蔵しておいたグリコーゲンをグルコースに分解して血液に分泌するようにし、血糖値を正常レベルまで引き上げる役割をする。それだけでなく、グルカゴンは、血糖上昇効果以外に、食欲を抑制し、脂肪細胞のホルモン感受性リパーゼ（hormone sensitive lipase）を活性化して脂肪分解を促進することにより、抗肥満効果を示すことが報告されている。このようなグルカゴン誘導体の１つであるグルカゴン様ペプチド−１（glucagon-like peptide-1, GLP-1）は、糖尿患者の高血糖症を減少させる治療剤として開発中の物質であり、インスリンの合成と分泌を促進し、グルカゴンの分泌を阻害し、胃の空腹を抑制し、グルコースの使用を増進すると共に、食物摂取を阻害する機能を有する。トカゲ毒（lizard venom）から作られるエキセンディン−４（exendin-4）は、ＧＬＰ−１と約５０％のアミノ酸相同性を有し、ＧＬＰ−１受容体を活性化して糖尿患者の高血糖症を減少させることが知られている。しかし、前記ＧＬＰ−１を含む肥満治療用薬剤は、嘔吐と吐気の副作用を伴うという問題のあることが報告されている。

よって、前記ＧＬＰ−１の代案として、ＧＬＰ−１とグルカゴンの両ペプチドの受容体に結合するオキシントモジュリン（oxyntomodulin）が脚光を浴びている。前記オキシントモジュリンは、グルカゴンの前駆体であるプレグルカゴン（pre-glucagon）から作られるペプチドであり、ＧＬＰ−１の食物摂取阻害、満腹感増進の効能と、グルカゴンの脂肪分解機能を有することから、抗肥満治療剤としての可能性を高めている。

このようなオキシントモジュリンペプチドの二重機能（dual function）に基づき、肥満治療を目的とする薬剤を開発する研究が盛んに行われている。例えば、特許文献１には、ヒトの過体重を治療するための経口、非経口、粘膜（mucosal）、直腸、皮下又は経皮投与用薬学的組成物が開示されており、これは有効成分としてオキシントモジュリンを含む。しかし、オキシントモジュリンを含む肥満治療剤は、生体内での半減期が短く、１日３回高用量を投与しても肥満治療効果は低レベルであることが報告されている。よって、オキシントモジュリンを修飾することにより、生体内での半減期を延長するか、又は肥満治療効果を増大する努力が続けられている。

例えば、デュアルアゴニストオキシントモジュリン（Merck社）は、オキシントモジュリンの２番目のアミノ酸Ｌ−セリンをＤ−セリンに置換してジペプチジルペプチダーゼＩＶ（dipeptidyl peptidase-IV, DPP-IV）に対する抵抗性を向上させると共に、Ｃ末端にコレステロール部分を付着して血中半減期を延長させたものである。ＺＰ２９２９（Zealand）は、オキシントモジュリンの２番目のアミノ酸Ｌ−セリンをＤ−セリンに置換してＤＰＰ−ＩＶ抵抗性を向上させ、１７番目のアミノ酸であるアルギニンをアラニンに置換してプロテアーゼに対する抵抗性を向上させ、２７番目のアミノ酸であるメチオニンをリシンに置換して酸化的安定性を向上させ、２０番目と２４番目のアミノ酸であるグルタミンと２８番目のアミノ酸であるアスパラギンをそれぞれアスパラギン酸、アラニン及びセリンに置換して脱アミド化に対する安定性（deamidation stability）を向上させたものである。しかし、半減期を延長させたデュアルアゴニストオキシントモジュリン（Merck社）の場合も、天然型オキシントモジュリンの半減期である８〜１２分より長くなったが、依然として１．７時間と生体内での半減期が非常に短く、薬物の投与用量も数ｍｇ／ｋｇと非常に高いレベルである。よって、オキシントモジュリン又はその誘導体は、依然として短い半減期と低い薬効により毎日投与しなければならず、過剰量の薬物を投与しなければならないという２つの大きな欠点がある。これらの欠点を解消するために、生体内でオキシントモジュリンの活性を保持しながらも、その血中半減期を延長させる方法を研究し、オキシントモジュリン誘導体を開発した。また、先行技術を用いて、前記オキシントモジュリン誘導体にキャリアを結合させて非ペプチド性重合体を作製し、そのタンパク質結合体が生体内で活性を保持しながらも、その血中半減期を延長させ、より優れた抗肥満効果を示すことを確認することにより、タンパク質結合体を発明した（特許文献２）。

一般に、タンパク質及びペプチドは半減期が非常に短く、不適切な温度、水・空気界面への露出、高圧、物理的／機械的ストレス、有機溶媒、微生物による汚染などにさらされると、単量体の凝集による沈殿及び容器表面への吸着などの変性現象が生じる。このような変性現象は不可逆的であるので、変性したタンパク質及びペプチドは本来の物理化学的性質及び生理活性効果を失う。また、不安定で、温度、湿度、酸素及び紫外線などの外部要素に容易に影響を受ける傾向があり、凝集、重合及び酸化などの物理的又は化学的変化を経て活性が大きく消失することになる（特許文献３）。

また、吸着したタンパク質及びペプチドは変性過程で凝集しやすく、凝集した変性タンパク質及びペプチドは、人体に投与されると、人体内で抗体形成の原因として作用するので、タンパク質及びペプチドは十分に安定した状態で投与しなければならない。よって、溶液状態のタンパク質及びペプチドの変性を防止するために様々な方法が研究されている（非特許文献２，３，４，５，６）。

一部のタンパク質及びペプチド薬品は凍結乾燥方法で安定性問題を解決しているが、凍結乾燥製品は使用する際に再び注射用水に溶解しなければならないという不便があり、凍結乾燥過程が生産工程に含まれるので、大容量の凍結乾燥器を用いなければならないなど、大規模な投資を必要とする。噴霧乾燥器で粉末化する方法も用いられているが、この方法は、収率が低いので経済性に劣るという欠点があり、高温にさらされるので安定性に悪影響を及ぼすこともある。

このような限界を解決する代案として、溶液状態のタンパク質及びペプチドに安定化剤を添加し、薬物の物理化学的変化を抑制しつつ長期間保存を行った後も生体内で薬効を維持する研究を行った。タンパク質の一種であるヒト血清アルブミンは、様々なタンパク質薬物の安定化剤として幅広く用いられており、その性能が立証されている（非特許文献７）。

しかし、ヒト血清アルブミンは、精製過程において、マイコプラズマ、プリオン、バクテリア及びウイルスなどの生物学的汚染物を不活性化する過程や、少なくとも１つの生物学的汚染物又は病源体に対して生物学的物質をスクリーン又は検査する過程を含むが、これらが完全に除去又は不活性化されないまま患者に作用する危険性が存在する。例えば、スクリーン過程は、血液提供者のヒト血液に対して特定ウイルスに関する検査を含むが、これらの過程が常に信頼できるわけではなく、特に、非常に少数で存在する特定ウイルスを検出することはできない。

異なるタンパク質は、化学的差異により、保存期間中に異なる比率及び異なる条件下で徐々に不活性化される。すなわち、安定化のために用いられる物質による保存期間延長効果は異なるタンパク質に対して同等でないので、保存安定性を付与するために用いられる安定化剤は、標的タンパク質の物理化学的特性によって好ましい比率、濃度及び種類が様々である。安定化剤を併用すると、互いの競合作用及び副作用により、目的とするところと異なる逆効果をもたらすことがあり、保存期間中に保存タンパク質の本質や濃度が変化するので、異なる効果を示すことがある。よって、溶液中のタンパク質を安定化するためには多くの努力と注意を要する。

特に、オキシントモジュリンの免疫グロブリンＦｃ結合体の場合、生理活性ペプチドであるオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した形態であるため、分子量及び体積が一般的なオキシントモジュリンと明確に異なるので、タンパク質を安定化するための特別な組成が求められる。

また、生理活性ペプチドであるオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域は、それぞれ物理化学的特性が異なるペプチド又はタンパク質であるので、生理活性ペプチドであるオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域を同時に安定化しなければならない。しかし、前述したように、異なるペプチド又はタンパク質は、それらの物理化学的差異により、保存期間中に異なる比率及び異なる条件下で徐々に不活性化することがあり、それぞれのペプチド又はタンパク質に適した安定化剤を併用すると、互いの競合作用及び副作用により、目的とするところと異なる逆効果をもたらすことがある。よって、持続型オキシントモジュリン結合体においては、生理活性ペプチドであるオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域を同時に安定化する安定化剤の組成を見出すことが非常に困難である。

こうした背景の下、本発明者らは、持続型オキシントモジュリン結合体をウイルス汚染の恐れなく長期間保管できる安定した液状製剤を提供するために鋭意努力した結果、緩衝液、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤を含み、さらに等張化剤やアミノ酸などの添加剤（additive）、及び繰り返し使用のための保存剤を含む安定化剤を用いて持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を向上させることにより、経済的で安定した液状製剤を製造できることを確認し、本発明を完成するに至った。

韓国登録特許第９２５０１７号公報 韓国公開特許第１０−２０１２−０１３９５７９号公報 韓国登録特許第１０−０３８９７２６号公報

World Health Organization, Fact sheet on obesity and overweight, 2011 John Geigert, J.Parenteral Sci. Tech., 43, No5, 220-224, 1989 David Wong, Pharm.Tech. October, 34-48, 1997 Wei Wang., Int.J.Pharm.,185, 129-188, 1999 Willem Norde, Adv.Colloid Interface Sci., 25, 267-340, 1986 Michelle et al., Int.J.Pharm. 120, 179-188, 1995 Edward Tarelli et al., Biologicals (1998) 26, 331-346

本発明は、生理活性オキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量のオキシントモジュリン誘導体結合体及びアルブミン非含有安定化剤を含むオキシントモジュリン結合体液状製剤を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記液状製剤を製造する方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、生理活性ペプチドであるオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合したオキシントモジュリン結合体液状製剤を含む、肥満又は糖尿病の予防又は治療用組成物を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記液状製剤を個体に投与するステップを含む、肥満又は糖尿病の予防又は治療方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するための一態様として、本発明は、生理活性ペプチドであるオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量のオキシントモジュリン結合体及びアルブミン非含有安定化剤を含み、前記安定化剤は、緩衝液、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤を含有する持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤を提供する。

本発明における用語「液状製剤」とは、医薬品の形態を液状にして製剤化した加工薬剤を意味し、これは液状の内用製剤と外用製剤の両方を含むものである。従来は、本発明のオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量のオキシントモジュリン結合体に適した液状製剤は存在しなかった。よって、本発明の液状製剤は、オキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量のオキシントモジュリン結合体及びアルブミン非含有安定化剤を含み、前記安定化剤は、緩衝液、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤を含有するものであってもよい。また、本発明の液状製剤は、保存剤をさらに含むものであってもよい。

本発明における安定化剤は、等張化剤、糖類、多価アルコール及びアミノ酸からなる群から選択される１個又はそれ以上の成分をさらに含むものであってもよい。前記糖アルコールは、マンニトール、ソルビトール及びグリセリンからなる群から選択される少なくとも１つであってもよく、糖アルコールの濃度が溶液全体の２〜１５％（ｗ／ｖ）であってもよい。また、前記緩衝液は、クエン酸、酢酸、ヒスチジン及びリン酸緩衝液からなる群から選択される少なくとも１つであってもよく、そのｐＨ範囲がｐＨ４．５〜ｐＨ７．０であってもよい。前記等張化剤は塩化ナトリウムであってもよく、前記非イオン性界面活性剤はポリソルベート又はポロキサマーであってもよく、非イオン性界面活性剤の濃度が０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）であってもよい。前記アミノ酸はメチオニンであってもよい。よって、本発明の液状製剤は、安定化剤として、ｐＨ４．８〜ｐＨ６．０の範囲の緩衝液、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択される１個以上の糖アルコール、並びにポリソルベート２０を含むものであってもよい。

また、本発明の液状製剤は、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコールからなる群から選択される１個又はそれ以上の保存剤をさらに含むものであってもよい。液状製剤は、溶液全体の０．００１〜１％（ｗ／ｖ）の保存剤を含むものであってもよい。

特に、本発明の液状製剤は、薬理学的有効量の持続型オキシントモジュリン結合体、５ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、２〜１５％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬメチオニン、及び０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含むものであってもよい。また、上記構成に０．００１〜１％（ｗ／ｖ）のｍ−クレゾールをさらに含むものであってもよい。

本発明における用語「安定化剤」とは、製剤において有効成分などの構成成分を所定期間安定して維持する物質であり、本発明においては、特に持続型オキシントモジュリン結合体が安定して保存されるようにする物質を意味する。持続型オキシントモジュリン結合体などのタンパク質において、保存安定性は正確な投与量を保証するためだけでなく、オキシントモジュリン誘導体結合体に対する抗原性物質の潜在的な生成を抑制するために重要である。

本発明の前記安定化剤は、持続型オキシントモジュリン結合体に安定性を付与するために、緩衝液、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。また、等張化剤、糖類、多価アルコール及びアミノ酸からなる群から選択される１個又はそれ以上の成分をさらに含むことも好ましい。

緩衝液は、持続型オキシントモジュリン結合体を安定させるために、液状製剤のｐＨが急激に変化しないように、溶液のｐＨを維持する役割を果たす。緩衝液は、アルカリ塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム又はそれらの水素又は二水素塩）、クエン酸ナトリウム／クエン酸、酢酸ナトリウム／酢酸、ヒスチジンをはじめとする、当業界で公知の任意の製薬上許容されるｐＨ緩衝剤を含んでもよく、それら緩衝剤の混合物を用いることもできる。前記緩衝液は、クエン酸又はヒスチジン緩衝液であることが好ましく、ヒスチジン緩衝液であることがより好ましい。緩衝液の濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、５ｍＭ〜５０ｍＭであることがより好ましい。緩衝液のｐＨはｐＨ４．０〜ｐＨ８．０であることが好ましく、ｐＨ４．５〜ｐＨ７．０であることがより好ましく、ｐＨ５．０〜ｐＨ６．０であることがさらに好ましい。

本発明の一実施例によれば、液状製剤を構成する緩衝液のｐＨによる持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を測定した結果、緩衝液のｐＨを様々に変化させて持続型オキシントモジュリン結合体を２５℃で０〜４週間保管した後の残存量を分析した結果、ｐＨ５．６、ｐＨ５．８及びｐＨ６．０でさらに安定することが分かった（実施例３及び表２〜５，実施例７及び表１８〜２１，実施例８及び表２２〜２５）。よって、本発明で最も安定した緩衝液のｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜ｐＨ６．０の範囲であることが確認された。本発明の一実施例によれば、液状製剤を構成する緩衝液の各種類における持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を測定した。０．０２％ポリソルベート２０と０．１ｍｇ／ｍＬメチオニン及び５％マンニトールを基準とし、２５℃で０〜４週間保管した後の残存量を分析した。ＳＥ−ＨＰＬＣの結果、同一のｐＨ条件において緩衝液の種類による大きな差はなかった。ＩＥ−ＨＰＬＣ又はＲＰ−ＨＰＬＣの結果、同一のｐＨ条件においてヒスチジンが最も安定することが分かった（実施例８及び表２２〜２５）。

糖アルコールは、持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を向上させる役割を果たすが、本発明における糖アルコールは、マンニトール、ソルビトール及びグリセリンからなる群から選択される少なくとも１つであり、マンニトールであることが好ましい。本発明に用いられる糖アルコールの濃度は、溶液全体の１〜２０％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、２〜１５％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。

本発明の一実施例によれば、安定化剤としての糖アルコールの種類が持続型オキシントモジュリン結合体の安定性に及ぼす影響について実験した。ｐＨ５．６のクエン酸緩衝液を基準とし、２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。同一濃度では、マンニトール又はソルビトールがグリセリンより安定していた。ＲＰ−ＨＰＬＣの結果、マンニトールがソルビトールより僅かに安定していた（実施例４及び表６〜９）。すなわち、マンニトール又はソルビトールを添加した場合に安定性が優れていたが、マンニトールが最も安定することが確認された。

本発明の一実施例によれば、安定化剤としての糖アルコールの濃度が持続型オキシントモジュリン結合体の安定性に及ぼす影響について実験した。２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。２％マンニトール又は１５％マンニトールにおいてタンパク質の沈殿が生成され、５％マンニトール又は１０％マンニトールが安定していた（実施例５及び表１０〜１３，実施例７及び表１８〜２１）。

非イオン界面活性剤は、タンパク質溶液の表面張力を低くするので、疎水性表面にタンパク質が吸着したり、凝集することを防止する。本発明に用いられる非イオン界面活性剤の好ましい例としては、ポリソルベート系非イオン界面活性剤及びポロキサマー系非イオン界面活性剤などが挙げられ、これらを単独で用いてもよく、少なくとも２つを組み合わせて用いてもよい。前記非イオン界面活性剤を液状製剤に高濃度で用いることは好ましくなく、本発明の溶液剤形には前記非イオン界面活性剤が０．２％（ｗ／ｖ）以下の濃度で含まれることが好ましく、０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）の濃度で含まれることがより好ましい。

本発明の安定化剤は、メチオニンなどのアミノ酸を含んでもよい。メチオニンは、タンパク質の酸化反応などにより生じ得る不純物の生成を抑制し、タンパク質をより安定化させる効果がある。

本発明の一実施例によれば、安定化剤としての非イオン界面活性剤の濃度とアミノ酸の有無が持続型オキシントモジュリン結合体の安定性に及ぼす影響について実験した。ｐＨ５．６のクエン酸緩衝液及び１０％マンニトールを基準とし、２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。０．０２％ポリソルベート２０に０．１ｍｇ／ｍＬメチオニンを添加したものが最も安定していた（実施例６及び表１４〜１７）。

等張化剤は、持続型オキシントモジュリン結合体を溶液状で体内に投与する際に、浸透圧を適切に維持する役割を果たし、前記持続型オキシントモジュリン結合体を溶液状でより安定化させる付随的な効果も期待することができる。このような等張化剤の代表的な例としては、水溶性無機塩である塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムが挙げられる。等張化剤の濃度は０〜２００ｍＭであることが好ましく、適切な含有量を調節することができる。

本発明の前記安定化剤は、アルブミンを含有しないことが好ましい。タンパク質の安定化剤として用いられるヒト血清アルブミンは、ヒトの血液から製造されるのでヒト由来の病原性ウイルスによる汚染の可能性があり、ゼラチンやウシ血清アルブミンは疾患を引き起こしたり、一部の患者にアレルギー反応を誘発する可能性がある。本発明のアルブミン非含有安定化剤は、ヒト又は動物由来の血清アルブミンや精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないのでウイルス感染の恐れがない。

持続型オキシントモジュリン結合体の保存安定性を向上させるためにさらに含まれる糖類及び多価アルコールのうち、糖類の好ましい例としては、マンノース、グルコース、フルクトース、キシロースなどの単糖類や、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デキストランなどの多糖類などが挙げられ、多価アルコールの好ましい例としては、プロピレングリコール及び低分子量のポリエチレングリコール、グリセリン、低分子量のポリプロピレングリコールなどが挙げられ、これらを単独で用いてもよく、少なくとも２つを組み合わせて用いてもよい。

本発明の液状製剤には、前述した緩衝液、等張化剤、糖アルコール、アミノ酸及び非イオン界面活性剤以外に、本発明の効果を失わない範囲で当業界において公知のその他の成分や物質が選択的にさらに含まれてもよい。

本発明の持続型オキシントモジュリン結合体の液状製剤は、生理活性ペプチドであるオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量の持続型オキシントモジュリン結合体及びアルブミン非含有安定化剤を含み、前記安定化剤は、ｐＨ４．８〜ｐＨ７．０の範囲の緩衝液、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択される少なくとも１つの糖アルコール、並びにポリソルベート２０を含むものであってもよい。また、より具体的には、前記安定化剤は、ｐＨ５．０〜ｐＨ６．０の範囲の緩衝液、マンニトール及びポリソルベート２０を含んでもよい。また、前記安定化剤は、等張化剤、糖類、多価アルコール及びアミノ酸からなる群から選択される１個又はそれ以上の成分をさらに含んでもよい。

持続型オキシントモジュリン結合体に安定性を提供する、本発明によるアルブミン非含有持続型オキシントモジュリン結合体高濃度液状製剤は、ウイルス感染の恐れがないだけでなく、簡単な剤形で優れた保存安定性を示すので、他の安定化剤や凍結乾燥製剤に比べて経済的な提供が可能な製剤である。

また、本発明の液状製剤は、天然型に比べて生理活性の持続期間が増加した持続型オキシントモジュリン結合体を含むので、通常のオキシントモジュリン製剤に比べて人体内でタンパク質活性を長期間保持することができ、効率的な薬物製剤として用いることができ、高濃度の持続型オキシントモジュリン結合体に対しても優れた安定性を提供できる製剤である。

本発明における用語「オキシントモジュリン」とは、グルカゴンの前駆体であるプレグルカゴン（pre-glucagon）から作られるペプチドを意味し、天然型オキシントモジュリン、前駆体（precursor）、誘導体（derivatives）、フラグメント（fragments）、変異体（variants）などを含む。ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡのアミノ酸配列（配列番号１）を有することが好ましい。

本発明における用語「オキシントモジュリン誘導体」とは、前記オキシントモジュリンの一部のアミノ酸を付加、欠失又は置換して修飾することにより、ＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体の両方を活性化させることができ、天然型オキシントモジュリンに比べて前記各受容体を高いレベルで活性化できる、ペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド模倣体などを含む。本発明におけるオキシントモジュリン誘導体は、配列番号２〜３４のいずれかのアミノ酸配列を有するもの、配列番号２３又は２５のアミノ酸配列を有するもの、又は配列番号２５のアミノ酸を有するものが好ましい。

本発明における用語「オキシントモジュリンフラグメント」とは、オキシントモジュリンのＮ末端又はＣ末端に少なくとも１つのアミノ酸が追加又は除去された形態を意味し、追加されるアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）であってもよい。このようなオキシントモジュリンフラグメントは体内で血糖調節機能を有する。

本発明における用語「オキシントモジュリン変異体」とは、オキシントモジュリンとアミノ酸配列が少なくとも１つ異なるペプチドであり、ＧＬＰ−１とグルカゴン受容体の活性化機能を有するペプチドを意味し、天然型オキシントモジュリンから一部のアミノ酸の置換（substitution）、追加（addition）、除去（deletion）及び修飾（modification）のいずれかの方法又はそれらの方法の組み合わせにより作製することができる。

オキシントモジュリン誘導体、フラグメント、変異体において用いられる各作製方法は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。例えば、アミノ酸配列が少なくとも１つ異なり、Ｎ末端アミノ酸残基に脱アミノ化（deamination）されたＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体の両方に対する活性化機能を有するペプチドも含まれる。

本発明におけるアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に従って次のように略語で記載した。
アラニン Ａ
アルギニン Ｒ
アスパラギン Ｎ
アスパラギン酸 Ｄ
システイン Ｃ
グルタミン酸 Ｅ
グルタミン Ｑ
グリシン Ｇ
ヒスチジン Ｈ
イソロイシン Ｉ
ロイシン Ｌ
リシン Ｋ
メチオニン Ｍ
フェニルアラニン Ｆ
プロリン Ｐ
セリン Ｓ
トレオニン Ｔ
トリプトファン Ｗ
チロシン Ｙ
バリン Ｖ

本発明におけるオキシントモジュリン誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列においてアミノ酸の置換、付加、欠失又は翻訳後修飾（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、分子内の共有結合）が生じ、ＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体を同時に活性化し得る任意のペプチドを含む。前記アミノ酸の置換又は付加の際に、ヒトタンパク質において通常観察される２０種のアミノ酸だけでなく、非定型又は非天然アミノ酸を用いることができる。非定型アミノ酸の商業的出所には、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ、Ｇｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと定型的なペプチド配列は、商業化されたペプチド合成会社、例えば米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎにおいて合成及び購入することができる。

本発明の一態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、一般式１のアミノ酸を含む新規なペプチドである。
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−ＧＴＦＴＳＤ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｒ２（配列番号５０）（一般式１）

前記式において、Ｒ１はヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジル（desamino-histidyl）、ジメチル−ヒスチジル（N-dimethyl-histidyl）、β−ヒドロキシイミダゾプロピオニル（beta-hydroxyimidazopropionyl）、４−イミダゾアセチル（4-imidazoacetyl）、β−カルボキシイミダゾプロピオニル（beta-carboxy imidazopropionyl）又はチロシンであり、Ｘ１はＡｉｂ（aminoisobutyric acid）、ｄ−アラニン、グリシン、Ｓａｒ（N-methylglycine）、セリン又はｄ−セリンであり、Ｘ２はグルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘ３はロイシン又はチロシンであり、Ｘ４はセリン又はアラニンであり、Ｘ５はリシン又はアルギニンであり、Ｘ６はグルタミン又はチロシンであり、Ｘ７はロイシン又はメチオニンであり、Ｘ８はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｘ９はグルタミン酸、セリン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、Ｘ１０はグルタミン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン又は欠失した配列であり、Ｘ１１はアラニン、アルギニン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ１２はアラニン、アルギニン、セリン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ１３はリシン、グルタミン、アルギニン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、Ｘ１４はアスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン又は欠失した配列であり、Ｘ１５はフェニルアラニン又は欠失した配列であり、Ｘ１６はイソロイシン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ１７はアラニン、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、Ｘ１８はトリプトファン又は欠失した配列であり、Ｘ１９はアラニン、イソロイシン、ロイシン、セリン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ２０はアラニン、リシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン又は欠失した配列であり、Ｘ２１はアスパラギン又は欠失した配列であり、Ｘ２２はアラニン、グリシン、トレオニン又は欠失した配列であり、Ｘ２３はシステイン、リシン又は欠失した配列であり、Ｘ２４はアラニン、グリシン及びセリンの組み合わせで構成された２〜１０個のアミノ酸を有するペプチド又は欠失した配列であり、Ｒ２はＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３５）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３７）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（配列番号３８）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤＫ（配列番号３９）、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＫ（配列番号４０）又は欠失した配列である（ただし、一般式１のアミノ酸配列が配列番号１と同じ場合は除く）。

本発明のオキシントモジュリン誘導体は、野生型オキシントモジュリンのＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体に対する活性を向上させるために、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目のアミノ酸であるヒスチジンのα炭素を欠失させた４−イミダゾアセチル（4-imidazoacetyl）、Ｎ末端アミノ基を欠失させたデスアミノ−ヒスチジル（desamino-histidyl）、Ｎ末端アミノ基を２つのメチル基で修飾したジメチル−ヒスチジル（N-dimethyl-histidyl）、Ｎ末端アミノ基をヒドロキシ基に置換したβ−ヒドロキシイミダゾプロピオニル（beta-hydroxyimidazopropionyl）、又はＮ末端アミノ基をカルボキシ基に置換したβ−カルボキシイミダゾプロピオニル（beta-carboxy imidazopropionyl）に置換することができる。また、ＧＬＰ−１受容体と結合する部位を、疎水性結合とイオン結合を強化するアミノ酸に置換するか、又はそれらを組み合わせることができる。また、オキシントモジュリン配列の一部の配列をＧＬＰ−１のアミノ酸配列又はエキセンディン-４（Ｅｘｅｎｄｉｎ−４）のアミノ酸配列に置換してＧＬＰ−１受容体の活性を向上させることができる。

また、オキシントモジュリン配列の一部の配列を、αヘリックスを強化する配列に置換することができる。一般式１のアミノ酸配列の１０、１４、１６、２０、２４及び２８番目のアミノ酸が、αヘリックスをサポートすることで知られているＴｙｒ（４−Ｍｅ）、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（４−Ｍｅ）、Ｐｈｅ（４−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４−ＣＮ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ₂）、Ｐｈｅ（４−ＮＨ₂）、Ｐｈｇ、Ｐａｌ、Ｎａｌ、Ａｌａ（２−チェニル、２−ｔｈｉｅｎｙｌ）又はＡｌａ（ベンゾチエニル、ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）で構成されるアミノ酸又はアミノ酸誘導体に置換することができ、挿入され得るαヘリックスをサポートするアミノ酸又はアミノ酸誘導体の種類及び数は限定されないことが好ましい。また、１０番目と１４番目、１２番目と１６番目、１６番目と２０番目、２０番目と２４番目、及び２４番目と２８番目を、それぞれグルタミン酸又はリシンに置換して環を形成することができ、挿入される環の数も限定されないことが好ましく、一般式２〜６から選択されるアミノ酸配列を有するオキシントモジュリン誘導体であることが最も好ましい。

本発明の具体的一態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンのアミノ酸配列に、エキセンディン−４（Exendin-4）又はＧＬＰ−１の配列に置換した一般式２のアミノ酸を含む新規なペプチドである。
Ｒ１−Ａ−Ｒ３（配列番号５１）（一般式２）

本発明の具体的一態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の一部とエキセンディン−４（Exendin-4）又はＧＬＰ−１の配列の一部を好ましいアミノ酸リンカーで連結した一般式３のアミノ酸を含む新規なペプチドである。
Ｒ１−Ｂ−Ｃ−Ｒ４（配列番号５２）（一般式３）

本発明の具体的一態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の一部を、ＧＬＰ−１受容体との疎水性結合力を向上させるアミノ酸に置換した、例えば２６番目のＬｅｕを、疎水性を増加させるアミノ酸であるＩｌｅ又はＶａｌに置換した一般式４を含む新規なペプチドである。
Ｒ１−ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｄ４−Ｄ５−ＬＦＶＱＷ−Ｄ６−Ｄ７−Ｎ−Ｄ８−Ｒ３（配列番号５３）（一般式４）

本発明の具体的一態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、固有のオキシントモジュリンのＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体の活性を向上させるために、アミノ酸配列の一部を除去又は挿入したり、アミノ酸の一部を他のアミノ酸に置換した一般式５を含む新規なペプチドである。
Ｒ１−Ｅ１−ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ−Ｅ２−Ｅ３−ＲＡ−Ｅ４−Ｅ５−ＦＶ−Ｅ６−ＷＬＭＮＴ−Ｅ７−Ｒ５（配列番号５４）（一般式５）

一般式２〜５において、Ｒ１は一般式１における構成と同一であり、ＡはＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号４１）、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＴ（配列番号４２）、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＱＤＦＶＡＷＬＫＮＴ（配列番号４３）、ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４４）、ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４５）、ＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＡＡ（配列番号４６）及びＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＧ（配列番号４７）からなる群から選択され、ＢはＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号４１）、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＴ（配列番号４２）、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＱＤＦＶＡＷＬＫＮＴ（配列番号４３）、ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４４）、ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４５）、ＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＡＡ（配列番号４６）、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＧ（配列番号４７）、ＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷ（配列番号４８）及びＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤ（配列番号４９）からなる群から選択され、Ｃはアラニン、グリシン及びセリンの組み合わせで構成された２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドであり、Ｄ１はセリン、グルタミン酸又はアルギニンであり、Ｄ２はアルギニン、グルタミン酸又はセリンであり、Ｄ３はアルギニン、アラニン又はバリンであり、Ｄ４はアルギニン、バリン又はセリンであり、Ｄ５はグルタミン、アルギニン又はリシンであり、Ｄ６はイソロイシン、バリン又はセリンであり、Ｄ７はメチオニン、アルギニン又はグルタミンであり、Ｄ８はトレオニン、グリシン又はアラニンであり、Ｅ１はセリン、Ａｉｂ、Ｓａｒ、ｄ−アラニン又はｄ−セリンであり、Ｅ２はセリン又はグルタミン酸であり、Ｅ３はアルギニン又はリシンであり、Ｅ４はグルタミン又はリシンであり、Ｅ５はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｅ６はグルタミン、システイン又はリシンであり、Ｅ７はシステイン、リシン又は欠失した配列であり、Ｒ３はＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３５）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）又はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３７）であり、Ｒ４はＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（配列番号３８）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤＫ（配列番号３９）又はＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＫ（配列番号４０）であり、Ｒ５はＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３５）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３７）又は欠失した配列である（ただし、一般式２〜５のアミノ酸配列が配列番号１と同じ場合は除く）。

本発明のオキシントモジュリン誘導体は、一般式６の新規なペプチドであることが好ましい。
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−ＧＴＦＴＳＤ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｒ２（配列番号５５）（一般式６）

一般式６において、Ｒ１はヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジル（desamino-histidyl）、４−イミダゾアセチル（4-imidazoacetyl）又はチロシンであり、Ｘ１はＡｉｂ（aminoisobutyric acid）、グリシン、セリン又はｄ−セリンであり、Ｘ２はグルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘ３はロイシン又はチロシンであり、Ｘ４はセリン又はアラニンであり、Ｘ５はリシン又はアルギニンであり、Ｘ６はグルタミン又はチロシンであり、Ｘ７はロイシン又はメチオニンであり、Ｘ８はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｘ９はグルタミン酸、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、Ｘ１０はグルタミン、グルタミン酸、リシン、アルギニン又は欠失した配列であり、Ｘ１１はアラニン、アルギニン又は欠失した配列であり、Ｘ１２はアラニン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ１３はリシン、グルタミン、アルギニン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、Ｘ１４はアスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン又は欠失した配列であり、Ｘ１５はフェニルアラニン又は欠失した配列であり、Ｘ１６はイソロイシン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ１７はアラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、Ｘ１８はトリプトファン又は欠失した配列であり、Ｘ１９はアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ２０はアラニン、リシン、メチオニン、アルギニン又は欠失した配列であり、Ｘ２１はアスパラギン又は欠失した配列であり、Ｘ２２はトレオニン又は欠失した配列であり、Ｘ２３はシステイン、リシン又は欠失した配列であり、Ｘ２４はグリシンで構成された２〜１０個のアミノ酸を有するペプチド又は欠失した配列であり、Ｒ２はＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３５）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３７）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（配列番号３８）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤＫ（配列番号３９）、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＫ（配列番号４０）又は欠失した配列である（ただし、一般式６のアミノ酸配列が配列番号１と同じ場合は除く）。

本発明のオキシントモジュリン誘導体は、配列番号２〜３４のペプチドからなる群から選択されるものであることがより好ましい。実施例１の表１に示すオキシントモジュリン誘導体であることがさらに好ましい。

オキシントモジュリンは、ＧＬＰ−１とグルカゴンの２つのペプチド活性を有するが、ＧＬＰ−１にはインスリン分泌による血糖降下効力があるが、グルカゴンには血糖上昇効力があり、ＧＬＰ−１には食物摂取抑制と胃排出遅延、グルカゴンには脂肪分解及びエネルギー代謝量増加による体重減少効力など異なる生物学的効能がある。よって、１つのペプチドに前述した２つのペプチドが存在する場合、いずれか一方の効力が大きい場合、望ましくない効力、例えば、グルカゴンの効力がＧＬＰ−１の効力より大きい場合、血糖が上昇することがあり、ＧＬＰ−１の効力が大きい場合、吐気と嘔吐などの副作用が大きくなることがある。また、２つのペプチドの活性比率によって全体の効力が変化し得る。本発明のオキシントモジュリン誘導体及びその結合体は、無条件的に活性の増加のための誘導体のみを開示したものではない。

本発明における用語「オキシントモジュリン結合体」とは、オキシントモジュリンと他の要素とを含む結合体を意味する。前記他の要素は、血中半減期を延長させたり、腎臓排出を低減するなど、有利な機能を有するものであれば、いかなる物質であってもよい。本発明の結合体は、オキシントモジュリンに共有結合するか、ミクロスフェア（microsphere）を形成することにより、血中安定性の向上、腎臓への排出遅延、受容体との結合力の変化などを誘導することができる。オキシントモジュリンを含むタンパク質結合体を形成するキャリアは、結合後に血中安定性を向上させることのできるアルブミン、トランスフェリン、抗体、抗体フラグメント、エラスチン、ヘパリン、キチン（chitin）などのｐ多糖類（olysaccharide）、フィブロネクチン（fibronectin）などから選択され、免疫グロブリンＦｃ領域であることが好ましい。

本発明において有用な免疫グロブリンＦｃは、ヒト免疫グロブリンＦｃ、それに密接に関連する類似体の配列を有するもの、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよい。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭに由来するもの、又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリダイゼーション（hybridization）によるＦｃ領域であってもよい。本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、それぞれのドメインがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドであってもよく、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体であってもよい。ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭに由来するものであることが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることが知られているＩｇＧに由来するものであることが最も好ましい。免疫グロブリンＦｃは、天然ＩｇＧを特定のタンパク質分解酵素で処理することにより作製することができ、組換え技術を用いて形質転換された細胞からも作製することができる。大腸菌から作製した組換えヒト免疫グロブリンＦｃであることが好ましい。

一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明においては、これらの組み合わせ又はハイブリッド化も可能である。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであることが好ましく、補体依存性細胞傷害（CDC, Complement dependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）のほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であることが最も好ましい。すなわち、最も好ましい本発明の薬物キャリアである免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来のグリコシル化されていないＦｃ領域である。ヒト体内で抗原として作用し、それに対する新たな抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を引き起こし得る非ヒト由来のＦｃ領域に比べて、ヒト由来のＦｃ領域が好ましい。

本発明における前記オキシントモジュリン結合体は、非ペプチド性重合体を用いて結合したものであってもよく、遺伝子組換え技術により結合したものであってもよい。前記結合体は、オキシントモジュリン及び免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体により連結された形態であることが好ましい。

非ペプチド性重合体は、オキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域にそれぞれ共有結合することにより連結することができる。非ペプチド性重合体の両末端は、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びオキシントモジュリン誘導体のアミノ基又はチオール基（Thiol group）に結合することができる。

本発明におけるオキシントモジュリン結合体とは、効力の持続性が天然型オキシントモジュリンより向上したものを意味する。前記持続型結合体には、天然型オキシントモジュリンのアミノ酸が修飾、置換、追加又は除去された形態がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生分解性重合体に連結された結合体、アルブミンや免疫グロブリンなどの持続性に優れたタンパク質がオキシントモジュリンに連結された結合体、生体内アルブミンとの結合力を有する脂肪酸がオキシントモジュリンに連結された結合体、又は生分解性ナノパーティクルに封入された形態のオキシントモジュリンが含まれ得るが、持続型結合体の種類は本発明を限定されるものではない。

本発明における用語「非ペプチド性重合体」とは、繰り返し単位が少なくとも２つ結合された生体適合性重合体を意味し、前記繰り返し単位はペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。本発明における前記非ペプチド性重合体は、非ペプチド性リンカーと混用される。

従来のインフレームフュージョン（inframe fusion）方法で作製された融合タンパク質に用いられていたペプチド性リンカーの欠点は、生体内でタンパク質分解酵素により容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期延長効果を期待したほど得られないということである。しかし、本発明においては、タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体を用いるので、キャリアと同様にペプチドの血中半減期を維持することができる。よって、本発明に用いられる非ペプチド性重合体は、このような役割を果たすもの、すなわち生体内のタンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば制限なく用いられる。非ペプチド性重合体の分子量は、１〜１００ｋＤａの範囲、好ましくは１〜２０ｋＤａの範囲である。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域に結合される本発明の非ペプチド性重合体は、１種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよい。

本発明に用いられる非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域及びタンパク質薬物に結合される官能基を有する。前記非ペプチド性重合体の両末端の官能基は、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及びスクシンイミド（succinimide）誘導体からなる群から選択されることが好ましい。

前記スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートが用いられる。特に、前記非ペプチド性重合体が両末端にアルデヒド基の官能基を有する場合、非特異的反応を最小限に抑え、非ペプチド性重合体の両末端に生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンがそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合により連結されたものよりはるかに安定的である。アルデヒド官能基は、低いｐＨではＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリシン残基と共有結合を形成することができる。

前記非ペプチド性重合体の両末端の官能基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、一末端にはマレイミド基、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、又はブチルアルデヒド基を有してもよい。両末端にヒドロキシ官能基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前述した様々な官能基で活性化するか、商業的に入手可能な修飾された官能基を有するポリエチレングリコールを用いることにより、本発明の持続型タンパク質結合体を作製することができる。

本発明の結合体は、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域とオキシントモジュリン誘導体のアミノ基又はチオール基（Thiol group）に結合したものなどである。

一方、本発明における前記非ペプチド性重合体は、両末端に免疫グロブリンＦｃ領域とタンパク質薬物が結合される官能基を含み、前記官能基は、これらに限定されるものではないが、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド（maleimide）基、スクシンイミド（succinimide）誘導体（スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネート）などである。

前記非ペプチド性重合体の両末端の官能基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、前記非ペプチド性重合体の一末端には官能基としてマレイミド基を含み、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基などを含んでもよい。例えば、前記非ペプチド性重合体の一末端がアルデヒド基の官能基を含み、他の末端がマレイミド基の官能基を含む場合、非特異的反応を最小限に抑え、非ペプチド性重合体の両末端に生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンがそれぞれ結合するのに効果的である。本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸（polylactic acid、ＰＬＡ）及びポリ乳酸−グリコール酸（polylactic-glycolic acid。ＰＬＧＡ ）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくはポリエチレングリコールである。当該分野に公知のこれらの誘導体、及び当該分野の技術水準で容易に作製できる誘導体も本発明に含まれる。

本発明の実施例によれば、プロピオンアルデヒドを単独で含むか、又はマレイミド基とアルデヒド基を同時に含む非ペプチド性重合体のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用い、オキシントモジュリン又はその誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結して結合体を合成した。

本発明の結合体は、天然型オキシントモジュリンに比べてＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体に優れた活性を有し、Ｆｃ領域を結合させることにより、体内での血中半減期を延長させ、生体内で活性を長時間維持することができる。

本発明における用語「保存剤」とは、微生物汚染による異常反応や腐敗を防止するために用いられるものを意味し、本発明の液状製剤は、保存剤をさらに含むものであってもよい。一般に、保存剤は微生物汚染が最も懸念される複数回投与用製剤に用いられるが、これに限定されるものではなく、凍結乾燥製剤や単回投与用製剤にも微生物汚染を防止するために用いられる。本発明の液状製剤は、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つの保存剤をさらに含むものであってもよく、前記保存剤の濃度は、溶液全体の０．００１〜１％（ｗ／ｖ）であってもよい。特に、本発明の液状製剤にさらに含まれる保存剤はｍ−クレゾールであってもよい。本発明の液状製剤は複数回投与用であってもよい。

本発明の他の実施形態として、本発明は、前記持続型オキシントモジュリン結合体の液状製剤の製造方法を提供する。

具体的には、ａ）持続型オキシントモジュリン結合体を作製するステップと、ｂ）前記ステップで作製された持続型オキシントモジュリン結合体を緩衝液、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤を含有する安定化剤と混合するステップとにより、安定した持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤を製造することができる。

また、具体的には、ａ）持続型オキシントモジュリン結合体を作製するステップ及び、ｂ）前記ステップで作製された持続型オキシントモジュリン結合体を緩衝液、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤を含有する安定化剤及び保存剤を混合するステップとにより、安定した持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤を製造することができる。

前記ｂ）ステップにおいて、安定化剤は、等張化剤、糖類、多価アルコール及びアミノ酸からなる群から選択される１個又はそれ以上の成分をさらに含むものであってもよい。

本発明のさらに他の実施形態として、本発明は、前記液状製剤を含む、肥満や糖尿病の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

本発明における用語「予防」とは、目的とする疾患の発病を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味する。本発明における用語「予防」とは、本発明の結合体を投与することにより、血糖異常やインスリン分泌調節異常などの糖尿病症状、又は体重増加や体脂肪率増加などの肥満症状の発生を抑制又は遅延させることを意味する。

本発明における用語「治療」とは、発生した疾病の症状を軽減、改善又は緩和するあらゆる行為を意味する。本発明における用語「治療」とは、本発明の結合体を投与することにより、前記糖尿病症状や肥満症状が軽減、改善又は緩和され、血糖正常化、インスリン分泌正常化、体重減少、体脂肪率減少などの現象が現れることを意味する。

本発明における用語「肥満」とは、体内に脂肪組織が過剰に蓄積された状態であり、ボディマス指数（体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の２乗で割った値）が２５以上であれば肥満と定義される。通常、肥満は、長期間にわたりエネルギー消費量より栄養素を過剰に摂取する場合にエネルギー不均衡により誘発される。肥満は、身体全体に影響を及ぼす代謝疾患であり、糖尿病及び高脂血症に罹患する可能性が高くなり、性機能障害、関節炎、心血管系疾患の発症リスクが高くなり、場合によっては癌の発生にも関連する。

本発明における用語「糖尿病」とは、インスリンの分泌量が不足したり、正常な機能が行われないなどの代謝疾患の一種であり、血中ブドウ糖の濃度が高くなる高血糖を特徴とし、高血糖により様々な症状を引き起こし、尿によりブドウ糖を排出する疾病を意味する。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含んでもよい。本発明における用語「薬学的に許容」とは、治療効果を示す程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性別、薬物に対する感受性、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合、同時に用いられる薬物などの医学分野における公知の要素により当業者が容易に決定することができる。

本発明のさらに他の実施形態として、本発明は、前記液状製剤を個体に投与するステップを含む、肥満や糖尿病の予防又は治療方法を提供する。

前記液状製剤、肥満及び糖尿病は前述したとおりである。

前記個体は、肥満又は糖尿病が疑われる個体であり、前記疾患が発病しているか、発病する可能性のある、ヒト、又はマウス、家畜などを含む哺乳動物を意味するが、本発明の液状製剤で治療可能な個体は限定されることなく含まれる。

本発明の治療方法は、液状製剤を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含んでもよい。好適な総１日用量は正常な医学的判断の範囲内で担当医により決定され、１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が用いられるか否かをはじめとする具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と併用又は同時投与される薬物をはじめとする様々な因子と医薬分野で周知の類似因子に応じて異なる量を適用することが好ましい。

本発明による持続型オキシントモジュリン結合体の液状製剤は、緩衝液、糖アルコール及び非イオン界面活性剤を含んでおり、ヒト血清アルブミン及び人体に潜在的に有害な因子を含まないので、ウイルス感染の恐れがなく、オキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域の結合からなり、天然型に比べて分子量が大きく、生理活性の持続期間が増加した持続型オキシントモジュリン結合体に優れた保存安定性を提供する。

ＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 下記実施例３のｐＨによる持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜２週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例３のｐＨによる持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜２週間保管した後にＳＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例３のｐＨによる持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜２週間保管した後にＲＰ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例４の糖アルコールの種類及び等張化剤の有無による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例４の糖アルコールの種類及び等張化剤の有無による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＳＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例４の糖アルコールの種類及び等張化剤の有無による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＲＰ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例５の糖アルコールの濃度による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例５の糖アルコールの濃度による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＳＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例５の糖アルコールの濃度による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＲＰ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例６の界面活性剤の濃度及びアミノ酸の有無による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例６の界面活性剤の濃度及びアミノ酸の有無による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＳＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例６の界面活性剤の濃度及びアミノ酸の有無による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＲＰ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例７のｐＨ及び糖アルコールの濃度による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例７のｐＨ及び糖アルコールの濃度による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＳＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例７のｐＨ及び糖アルコールの濃度による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＲＰ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例８のｐＨ及び緩衝液の種類による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例８のｐＨ及び緩衝液の種類による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＳＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例８のｐＨ及び緩衝液の種類による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＲＰ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例９の保存剤の有無及び持続型オキシントモジュリンの濃度による安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例９の保存剤の有無及び持続型オキシントモジュリンの濃度による安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＳＥ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。 下記実施例９の保存剤の有無及び持続型オキシントモジュリンの濃度による安定性を評価したものであり、２５℃で０〜４週間保管した後にＲＰ−ＨＰＬＣ法で評価したグラフである。各棒は、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、下記実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。

オキシントモジュリン及びオキシントモジュリン誘導体の合成
本発明の液状製剤におけるオキシントモジュリン及びオキシントモジュリン誘導体の安定性を測定するために、下記アミノ酸配列を有するオキシントモジュリン誘導体を合成した（表１）。

表１において、太字で示すアミノ酸は環形成を意味し、Ｘと表記されたアミノ酸は非天然アミノ酸であるα−メチルグルタミン酸を意味する。また、ＣＡは４−イミダゾアセチル（4-imidazoacetyl）を意味し、ＤＡはデスアミノ−ヒスチジル（desamino-histidyl）を意味し、（ｄ）Ｓはｄ−ｓｅｒｉｎｅを意味する。

オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の作製（免疫グロブリンＦｃ領域結合オキシントモジュリン誘導体２５）
まず、ＭＡＬ−１０Ｋ−ＡＬＤ ＰＥＧをオキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）のアミノ酸配列の３０位のシステイン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）とＭＡＬ−１０Ｋ−ＡＬＤ ＰＥＧのモル比を１：３、タンパク質の濃度を３ｍｇ／ｍｌとし、常温で３時間反応させた。ここで、反応は、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に１Ｍのグアニジンが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、システインにモノペグ化オキシントモジュリン誘導体を精製した（Ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍｌ／分，勾配：Ａ０→１００％５０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのＮａ−ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ））（図１ａ）。図１ａはＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）を精製した結果を示すグラフである。

次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃをモル比を１：５とし、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍｌとして４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行われた。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラム（Ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍｌ／分，勾配：Ａ０→４％１分Ｂ→２０％８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））（図１ｂ）とＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラム（Ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ，流速：２．０ｍｌ／分，勾配：Ｂ０→１００％１００分Ａ,（Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１．１ＭのＡＳ））（図１ｃ）にかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した。図１ｂはＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフであり、図１ｃはＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。

上記過程により作製された持続型オキシントモジュリン結合体は、血中半減期延長のために開発されたものであり、免疫グロブリンＦｃ領域、非ペプチド性重合体及びオキシントモジュリンが共有結合により部位選択的に互いに連結されたオキシントモジュリン結合体であるので、血中半減期を画期的に増加させる。

ｐＨによる持続型オキシントモジュリン結合体の安定性評価
実施例２で作製された持続型オキシントモジュリン結合体の液状製剤における安定性を確認するために、下記表２に示す組成にて２５℃で０〜２週間保管した後にイオン交換クロマトグラフィー法（Ion Exchange-High Performance Liquid Chromatography, IE-HPLC）、サイズ排除クロマトグラフィー法（Size Exclusion-High Performance Liquid Chromatography, SE-HPLC）、逆相クロマトグラフィー法（Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC）を用いて分析した。緩衝液としてはクエン酸緩衝液を用い、糖アルコールとしてはマンニトールを用い、非イオン性界面活性剤としてはポリソルベート２０を用いた。表３、４、５において、ＩＥ−ＨＰＬＣ（％）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）であり、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。表３は保管後の持続型オキシントモジュリンのＩＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表４は保管後の持続型オキシントモジュリンのＳＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表５は保管後の持続型オキシントモジュリンのＲＰ−ＨＰＬＣ残存率を示す。

表３に示すように、ＩＥ−ＨＰＬＣ（％）の結果、ｐＨが低いほど安定しており、ＳＥ−ＨＰＬＣの結果、ｐＨ５．２で最も安定しており、ＲＰ−ＨＰＬＣの結果、ｐＨ５．６で最も安定していた。試験方法によって安定するｐＨは異なるが、ＲＰ−ＨＰＬＣ試験方法においてｐＨ間の残存率の格差が最も大きかった。よって、ｐＨ５．６が最も安定するｐＨである。

糖アルコールの種類及び等張化剤の有無による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性評価
本発明において、安定化剤としての糖アルコールの種類及び等張化剤としての塩化ナトリウムの有無が持続型オキシントモジュリン結合体の安定性に及ぼす影響について実験した。上記実施例により選択したｐＨ５．６のクエン酸緩衝液を基準とし、下記表６に示す組成にて２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。表７、８、９において、ＩＥ−ＨＰＬＣ（％）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）であり、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。表７は保管後の持続型オキシントモジュリンのＩＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表８は保管後の持続型オキシントモジュリンのＳＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表９は保管後の持続型オキシントモジュリンのＲＰ−ＨＰＬＣ残存率を示す。

表６〜９に示すように、持続型オキシントモジュリン結合体は、同じ濃度のマンニトール又はソルビトールを添加した場合に、グリセリンを添加した場合より安定していた。ＲＰ−ＨＰＬＣの結果、マンニトールがソルビトールより僅かに安定していた。また、持続型オキシントモジュリン結合体の安定性において、等張化剤としての塩化ナトリウムの有無による大きな差は認められなかった。

糖アルコールの濃度による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性評価
本発明において、安定化剤としての糖アルコールの濃度が持続型オキシントモジュリン結合体の安定性に及ぼす影響について実験した。上記実施例により選択したｐＨ５．６のクエン酸緩衝液及びマンニトールを基準とし、下記表１０に示す組成にて２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。表１１、１２、１３において、ＩＥ−ＨＰＬＣ（％）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）であり、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。表１１は保管後の持続型オキシントモジュリンのＩＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表１２は保管後の持続型オキシントモジュリンのＳＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表１３は保管後の持続型オキシントモジュリンのＲＰ−ＨＰＬＣ残存率を示す。

表１０〜１３に示すように、持続型オキシントモジュリン結合体は、５％マンニトール又は１０％マンニトールの存在下で安定していた。それに対して、２％マンニトール又は１５％マンニトールを添加した場合、タンパク質の沈殿が生成された。ＩＥ−ＨＰＬＣ又はＳＥ−ＨＰＬＣの結果、持続型オキシントモジュリン結合体は１０％マンニトールと５％マンニトールを添加した場合に類似した安定性を示した。ＲＰ−ＨＰＬＣの結果、持続型オキシントモジュリン結合体は１０％マンニトールが５％マンニトールより安定していた。

界面活性剤の濃度及びアミノ酸の有無による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性評価
本発明において、安定化剤としての界面活性剤の濃度及びアミノ酸の有無が持続型オキシントモジュリン結合体の安定性に及ぼす影響について実験した。上記実施例により選択したｐＨ５．６のクエン酸緩衝液及び１０％マンニトールを基準とし、下記表１４に示す組成にて２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。表１５、１６、１７において、ＩＥ−ＨＰＬＣ（％）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）であり、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。表１５は保管後の持続型オキシントモジュリンのＩＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表１６は保管後の持続型オキシントモジュリンのＳＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表１７は保管後の持続型オキシントモジュリンのＲＰ−ＨＰＬＣ残存率を示す。

表１４〜１７に示すように、０．０２％ポリソルベート２０に０．１ｍｇ／ｍＬメチオニンを添加した場合に持続型オキシントモジュリン結合体が最も安定していた。

ｐＨ及び糖アルコールの濃度による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性評価
本発明において、安定化剤としての糖アルコールの濃度及びｐＨが持続型オキシントモジュリン結合体の安定性に及ぼす影響について実験した。上記実施例により選択した０．０２％ポリソルベート２０及び０．１ｍｇ／ｍＬメチオニンを基準とし、下記表１８に示す組成にて２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。表１９、２０、２１において、ＩＥ−ＨＰＬＣ（％）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）であり、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。表１９は保管後の持続型オキシントモジュリンのＩＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表２０は保管後の持続型オキシントモジュリンのＳＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表２１は保管後の持続型オキシントモジュリンのＲＰ−ＨＰＬＣ残存率を示す。

表１８〜表２１に示すように、ＩＥ−ＨＰＬＣの結果、ｐＨ５．２、ｐＨ５．６、ｐＨ６．０の順で安定しており、ＲＰ−ＨＰＬＣの結果、ｐＨ６．０、ｐＨ５．６、ｐＨ５．２の順で安定していた。ＳＥ−ＨＰＬＣの結果、ｐＨ５．２、ｐＨ５．６、ｐＨ６．０に大きな差は認められなかった。すなわち、ＩＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣの全てにおいて安定していたのはｐＨ５．６であった。

ｐＨ５．６において、ＩＥ−ＨＰＬＣ又はＳＥ−ＨＰＬＣの結果、マンニトールの濃度に大きな差は認められなかった。それに対して、ｐＨ５．６において、ＲＰ−ＨＰＬＣの結果、５％マンニトールが１０％マンニトールや１５％マンニトールより安定していた。

ｐＨ及び緩衝液の種類による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性評価
本発明において、安定化剤としての緩衝液の種類及びｐＨが持続型オキシントモジュリン結合体の安定性に及ぼす影響について実験した。上記実施例により選択した０．０２％ポリソルベート２０、０．１ｍｇ／ｍＬメチオニン及び５％マンニトールを基準とし、下記表２２に示す組成にて２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。表２３、２４、２５において、ＩＥ−ＨＰＬＣ（％）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）であり、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。表２３は保管後の持続型オキシントモジュリンのＩＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表２４は保管後の持続型オキシントモジュリンのＳＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表２５は保管後の持続型オキシントモジュリンのＲＰ−ＨＰＬＣ残存率を示す。

表２２〜２５に示すように、ＳＥ−ＨＰＬＣ又はＲＰ−ＨＰＬＣの結果、ｐＨ５．６、ｐＨ５．８に大きな差は認められなかった。ＩＥ−ＨＰＬＣの結果、ｐＨ５．６がｐＨ５．８より安定していた。ＳＥ−ＨＰＬＣの結果、同じｐＨ条件において、緩衝液の種類に大きな差は認められなかった。ＩＥ−ＨＰＬＣ又はＲＰ−ＨＰＬＣの結果、同じｐＨ条件において、ヒスチジンが最も安定していた。

保存剤の有無及び持続型オキシントモジュリンの濃度による持続型オキシントモジュリン結合体の安定性評価
本発明において、安定化剤としての保存剤の有無及び持続型オキシントモジュリン結合体の濃度が安定性に及ぼす影響について実験した。上記実施例により選択したｐＨ５．６のヒスチジン緩衝液、０．０２％ポリソルベート２０、０．１ｍｇ／ｍＬメチオニン及び５％マンニトールを基準とし、下記表２６に示す組成にて２５℃で０〜４週間保管した後にＩＥ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。表２７、２８、２９において、ＩＥ−ＨＰＬＣ（％）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（％）及びＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ Ａｒｅａ％）であり、初期値に対する持続型オキシントモジュリン結合体の残存率を示す。表２７は保管後の持続型オキシントモジュリンのＩＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表２８は保管後の持続型オキシントモジュリンのＳＥ−ＨＰＬＣ残存率を示し、表２９は保管後の持続型オキシントモジュリンのＲＰ−ＨＰＬＣ残存率を示す。

前記２６〜２９に示すように、ＩＥ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ又はＲＰ−ＨＰＬＣの結果、保存剤を添加しても安定性に有意な差は認められず、持続型オキシントモジュリンの濃度によっても安定性に有意な差は認められなかった。

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
次に、本発明の好ましい態様を示す。
１． 生理活性ペプチドであるオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量の持続型オキシントモジュリン結合体及びアルブミン非含有安定化剤を含み、前記安定化剤は、緩衝液、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤を含有する、持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
２． 前記安定化剤は、等張化剤、糖類、多価アルコール及びアミノ酸からなる群から選択される１個又はそれ以上の成分をさらに含む、上記１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
３． 前記オキシントモジュリンは、グルカゴンの前駆体であるプレグルカゴン（pre-glucagon）から作られるペプチドであり、配列番号１のアミノ酸配列からなる、上記１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
４． 前記オキシントモジュリンは、天然型オキシントモジュリン、前駆体（precursor）、誘導体（derivatives）、フラグメント（fragment）、変異体（variants）である、上記１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
５． 前記誘導体は、配列番号２〜３４からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有する、上記４に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
６． 前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域である、上記１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
７． 前記免疫グロブリンＦｃ領域は、それぞれのドメインがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、上記６に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
８． 前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である、上記６に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
９． 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、上記６に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
１０． 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、上記９に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
１１． 前記結合体の結合方法は、非ペプチド性重合体を用いるか、組換え技術を用いて結合したものである、上記１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
１２． 前記非ペプチド性重合体は、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸（polylactic acid、ＰＬＡ）及びポリ乳酸−グリコール酸（polylactic-glycolic acid、ＰＬＧＡ）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる、上記１１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
１３． 前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコールである、上記１１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
１４． 前記糖アルコールは、マンニトール、ソルビトール及びグリセリンからなる群から選択される少なくとも１つである、上記１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
１５． 前記糖アルコールの濃度が、溶液全体の２〜１５％（ｗ／ｖ）である、上記１４に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
１６． 前記緩衝液は、クエン酸、酢酸、ヒスチジン及びリン酸緩衝液からなる群から選択される少なくとも１つである、上記１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
１７． 前記緩衝液のｐＨ範囲が、４．５〜７．０である、上記１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
１８． 前記等張化剤が、塩化ナトリウムである、上記２に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
１９． 前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート又はポロキサマーである、上記１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
２０． 前記非イオン性界面活性剤の濃度が、０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）である、上記１９に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
２１． 前記アミノ酸が、メチオニンである、上記２に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
２２． 前記安定化剤は、ｐＨ４．８〜ｐＨ６．０の範囲の緩衝液、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択される１個以上の糖アルコール、並びにポリソルベート２０を含む、上記１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
２３． ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコールからなる群から選択される１個又はそれ以上の保存剤をさらに含むことを特徴とする、上記１に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
２４． 前記保存剤の濃度が、溶液全体の０．００１〜１％（ｗ／ｖ）である、上記２３に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
２５． 前記保存剤が、ｍ−クレゾールである、上記２３に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
２６． 複数回投与用であることを特徴とする、上記２３に記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
２７． 生理活性ペプチドであるオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合した薬理学的有効量の持続型オキシントモジュリン結合体と、５ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、２〜１５％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬメチオニン及び０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する、持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤。
２８． ０．００１〜１％（ｗ／ｖ）のｍ−クレゾールをさらに含む、上記２７に記載の液状製剤。
２９． ａ）持続型オキシントモジュリン結合体を作製するステップ；及び、
ｂ）ａ）ステップで作製された持続型オキシントモジュリン結合体を緩衝液、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤を含有する安定化剤と混合するステップを含む、上記１〜２２及び２７のいずれかの持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤の製造方法。
３０． ａ）持続型オキシントモジュリン結合体を作製するステップ；及び、
ｂ）ａ）ステップで作製された持続型オキシントモジュリン結合体を緩衝液、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤を含有する安定化剤及び保存剤を混合するステップを含む、上記２３〜２６及び２８のいずれかの持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤の製造方法。
３１． 前記安定化剤は、等張化剤、糖類、多価アルコール及びアミノ酸からなる群から選択される１個又はそれ以上の成分をさらに含む、上記２９又は３０に記載の方法。

Claims (32)

1. 配列番号２４、２５、又は２６のいずれかのアミノ酸配列を有する生理活性ペプチドであるオキシントモジュリン誘導体と、免疫グロブリンＦｃ領域と、非ペプチド性重合体とを含む薬理学的有効量の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体及びアルブミン非含有安定化剤を含み、前記非ペプチド性重合体が前記オキシントモジュリン誘導体及び前記免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結させ、前記安定化剤は、ｐＨ４．８〜ｐＨ６．４の範囲の、クエン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液又はリン酸緩衝液；マンニトール、ソルビトール又はグリセリンを含む糖アルコール；及びポリソルベート２０を含有する、持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
2. 前記安定化剤は、１個又はそれ以上の、等張化剤、糖類、多価アルコール又はアミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
3. 前記オキシントモジュリン誘導体は、配列番号２４のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
4. 位置１２と１６の、又は、位置１６と２０のアミノ酸が環を形成する、請求項１又は２に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
5. 前記オキシントモジュリン誘導体は、配列番号２５のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
6. 前記オキシントモジュリン誘導体は、配列番号２６のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
7. 前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域である、請求項１〜６のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
8. 前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、請求項７に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
9. 前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である、請求項７に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
10. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項７に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
11. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１０に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
12. 前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸（polylactic acid、ＰＬＡ）及びポリ乳酸−グリコール酸（polylactic-glycolic acid、ＰＬＧＡ）などの生分解性高分子、脂質重合体、ヒアルロン酸又はそれらの組み合わせからなる、請求項１〜１１のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
13. 前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコールである、請求項１２に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
14. 前記ポリサッカライドは、デキストラン、キチン又はそれらの組み合わせである、請求項１２に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
15. 前記液状製剤中の前記糖アルコールの濃度が、２〜１５％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜１４のいずれかにに記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
16. 前記等張化剤が、塩化ナトリウムである、請求項２〜１５のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
17. 前記ポリソルベート２０の濃度が、０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜１６のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
18. 前記アミノ酸が、メチオニンである、請求項２〜１７のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
19. 前記安定化剤は、ｐＨ４．８〜ｐＨ６．０の範囲の緩衝液、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択される１個以上の糖アルコール、並びにポリソルベート２０を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
20. ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコールからなる群から選択される１個又はそれ以上の保存剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
21. 前記液状製剤中の前記保存剤の濃度が、０．００１〜１％（ｗ／ｖ）である、請求項２０に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
22. 前記保存剤が、ｍ−クレゾールである、請求項２０又は２１に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
23. 複数回投与用であることを特徴とする、請求項１〜２２のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
24. 配列番号２４、２５又は２６のいずれかのアミノ酸配列を有する生理活性ペプチドであるオキシントモジュリン誘導体と、免疫グロブリンＦｃ領域と、非ペプチド性重合体とを含む薬理学的有効量の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体と、５ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、２〜１５％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬメチオニン及び０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有し、前記非ペプチド性重合体が前記オキシントモジュリン誘導体及び前記免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結させる、持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
25. 前記オキシントモジュリン誘導体は、配列番号２４のアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
26. 位置１２と１６の、又は、位置１６と２０のアミノ酸が環を形成する、請求項２４に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
27. 前記オキシントモジュリン誘導体は、配列番号２５のアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
28. 前記オキシントモジュリン誘導体は、配列番号２６のアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
29. ０．００１〜１％（ｗ／ｖ）のｍ−クレゾールをさらに含む、請求項２４〜２８のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体液状製剤。
30. ａ）請求項１〜１９及び２４〜２８のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体を作製するステップ；及び、
    ｂ）ａ）ステップで作製された持続型オキシントモジュリン誘導体結合体をｐＨ４．８〜ｐＨ６．４の範囲の、クエン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液又はリン酸緩衝液；マンニトール、ソルビトール又はグリセリンを含む糖アルコール；及びポリソルベート２０を含有する安定化剤と混合するステップを含む、請求項１〜１９及び２４〜２８のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤の製造方法。
31. ａ）請求項２０〜２３及び２９のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体を作製するステップ；及び、
    ｂ）ａ）ステップで作製された持続型オキシントモジュリン誘導体結合体をｐＨ４．８〜ｐＨ６．４の範囲の、クエン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液又はリン酸緩衝液；マンニトール、ソルビトール又はグリセリンを含む糖アルコール；及びポリソルベート２０を含有する安定化剤及び保存剤と混合するステップを含む、請求項２０〜２３及び２９のいずれかに記載の持続型オキシントモジュリン結合体液状製剤の製造方法。
32. 前記安定化剤は、１個又はそれ以上の、等張化剤、糖類、多価アルコール又はアミノ酸をさらに含む、請求項３０又は３１に記載の方法。