[go: up one dir, main page]

JP6346265B2 - Ｄｎａインターカレーティング剤の細胞送達 - Google Patents

Ｄｎａインターカレーティング剤の細胞送達 Download PDF

Info

Publication number
JP6346265B2
JP6346265B2 JP2016504344A JP2016504344A JP6346265B2 JP 6346265 B2 JP6346265 B2 JP 6346265B2 JP 2016504344 A JP2016504344 A JP 2016504344A JP 2016504344 A JP2016504344 A JP 2016504344A JP 6346265 B2 JP6346265 B2 JP 6346265B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
active agent
agent
double
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2016504344A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2016523811A (ja
Inventor
シー． ゲッツ，ロバート
シー． ゲッツ，ロバート
カドゥシン，ジェームス
ゲオルク−ヴァインシュタイン，ミンディ
ゲルハルト，ジャクリン
ディルグジェリ，エマニュエラ
ローズ，ケリー
Original Assignee
ジェニスフィア・エルエルシー
ランケノー インスティテュート フォー メディカル リサーチ
ランケノー インスティテュート フォー メディカル リサーチ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ジェニスフィア・エルエルシー, ランケノー インスティテュート フォー メディカル リサーチ, ランケノー インスティテュート フォー メディカル リサーチ filed Critical ジェニスフィア・エルエルシー
Publication of JP2016523811A publication Critical patent/JP2016523811A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6346265B2 publication Critical patent/JP6346265B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

本発明は、活性剤が担体のＤＮＡにインターカレートしているＤＮＡ担体を用いた、該活性剤の細胞への送達に関する。該ＤＮＡ担体は、該ＤＮＡ担体を特定の細胞型に結合させる標的化剤をさらに含むことができ、それによりインターカレートされた活性剤の細胞への送達を促進することができる。
活性剤とＤＮＡの間の非共有結合性相互作用は、一般に、グルーブバインディングまたはインターカレーションのいずれかにより起こる。特に抗癌治療の分野から、インターカレーションというＤＮＡ塩基対の間に平面の薬物分子を挿入することを含む工程により、ＤＮＡと相互作用する複数の化学療法薬が製造された。これにより、ＤＮＡのらせん反転および伸長の減少が得られる。インターカレーションの会合定数は、好適な疎水性結合、イオン結合、水素結合およびファンデルワースル力により１０５〜１０−１１Ｍ−１になり得る。インターカレーションは、一般に、縮合環構造に関連づけられるが、非縮合環系も公知である。インターカレーションは、特に塩基性、陽イオン性または電子吸引性官能基が存在する場合にはほとんどが遺伝毒性であるため、抗腫瘍剤、抗悪性腫瘍剤、抗マラリア剤、抗生物質剤および抗真菌剤としてのこれらの化合物の有効な使用に大きく貢献するものと認識されている。
ＤＮＡデンドリマーは、相互に連絡した天然または合成モノマーオリゴヌクレオチドサブユニットから組み立てられる複雑で高度に分岐した分子である。ＤＮＡデンドリマーは、それぞれが２つのＤＮＡ鎖から生成されたＤＮＡモノマーから構築されており、ＤＮＡ鎖は各鎖の中心部分（「ウエスト」としても公知）に位置する配列相補性の領域を共有しているが、他のモノマーの「アーム」へのハイブリダイゼーションのために４つの非相補性の一本鎖「アーム」を有する。モノマーは、単一モノマーから開始して、相補性アームを介してさらなるモノマーにハイブリダイズして、デンドリマーに構築される。同様の手法で、それまでの層の中のモノマーアームにモノマーがハイブリダイズすることにより、さらなる層が付加される。層の数の変動、およびどのアームがさらなるモノマーにハイブリダイズするかにより、異なるサイズおよび形状のＤＮＡデンドリマーが生成される。ＤＮＡデンドリマーが経時的に崩壊するのを防ぐために、ソラレン架橋剤のインターカレーションおよび活性化を介し、ＵＶ光を利用して、化学的「点溶接部」を成長している構築物に付加することができる。デンドリマーは、典型的には超遠心分離後のショ糖勾配を変性させる際に、デンドリマーのサイズおよび分子に応じて精製させる。
ＤＮＡデンドリマーは、一般には外層上に存在するハイブリダイズされていないアームへの連結を介して、非常に多様な異なるタイプの分子および粒子に共有結合または非共有結合することもできる。これらの分子および粒子は、特異的分子ターゲットへのＤＮＡデンドリマーの標的化およびシグナリング分子の検出を介したターゲットへのデンドリマーの結合の検出を可能にする、ＤＮＡデンドリマー上のシグナリングおよびターゲティングデバイスであってもよい。シグナる発生部分としては、多数の蛍光色素、ハプテン、酵素および他の分子材料、ならびに金ナノ粒子および量子ドットなどの粒子が挙げられる。ターゲティングデバイスとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、アプタマー、ペプチドなどが挙げられる。モノマーの外層は、多くのハイブリダイズされていないアームを含むため、ＤＮＡデンドリマー構築物は、一般には特異的核酸およびタンパク質の検出のために、非常に多様なインビトロ適用においてシグナル増強剤として作用するが、電子デバイス内の検出デバイスとしても作用する。適用例としては、ＤＮＡおよびタンパク質マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＯＳＡ、ルミネックスビーズアッセイ、インサイチュハイブリダイゼーションなどでのシグナル増強剤が挙げられる。標識および標的化されたＤＮＡデンドリマーの使用は、調査研究において広範に発表されており、これらの材料は、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ ＬＬＣ（ペンシルバニア州ハットフィールド所在）により販売または製造される市販の検査用製品として入手できる。
ＤＮＡデンドリマーは、インビトロおよびインビボの両方の適用において送達およびトランスフェクションデバイスとしての潜在的用途を有することも示されている。例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２００５／００８９８９０号、ＷＯ２００８／１４７５２６号およびＷＯ２０１０／０１７５４４号を参照されたい。特にＤＮＡデンドリマーは、運搬物（例えば、薬物）の送達を受けるように標的化された細胞上の表面形状に結合する標的化デバイス（例えば、細胞内エンドサイトーシス性内在化イベントを誘発し得る細胞表面形状に特異的な抗体）と結合する。標的化されたＤＮＡデンドリマーと受動的に会合する運搬物は、単にデンドリマーとの空間的会合により細胞に侵入するが、運搬物は、外側のアームへの連結など、複数の付着方策を介してデンドリマーに結合することもできる。
本発明は、ＤＮＡ担体を用いた、活性剤の細胞への改善された送達方法に関する。
ＤＮＡ担体は、少なくとも一部が二本鎖形態であるＤＮＡと、二本鎖ＤＮＡ内にインターカレートする活性剤と、を含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ担体は、活性剤が送達される分子、細胞、または組織に結合する標的化剤も含む。特別な実施形態において、ＤＮＡ担体は、ＤＮＡデンドリマーであり、ＤＮＡデンドリマーの二本鎖部分にインターカレートされる活性剤を有する。標的化される分子、細胞または組織へのＤＮＡ担体の結合の際に、デンドリマーは、細胞によりエンドソームに内在化され、エンドソームの酸性ｐＨがＤＮＡからの活性剤放出を促進して、細胞毒性作用または他の生物学的作用を生成する。
ＬＹＳＯＳＥＮＳＯＲ色素による生存細胞の標識を示す。 内在化されたデンドリマーを含む細胞を示す。 図１Ａおよび１Ｂの結合画像であり、デンドリマーが細胞の酸性コンパートメントに内在化されていることを示している。 図２〜図Ｄは、実施例２の結果を示している：非処置細胞（図２Ａ）、非標的化Ｄｏｘデンドリマー（図２Ｂ）、Ｇ８ ｍＡｂがコンジュゲートされたＤｏｘデンドリマー（図２Ｃおよび２Ｄ）。
詳細な説明
本発明の複数の模範的実施形態を記載する前に、本発明が以下の説明に示された構築物または工程ステップの詳細に限定されないことが理解されなければならない。本発明は、他の実施形態で可能であり、様々な方法で実践または実行することが可能である。
本明細書全体を通して参照される「一実施形態」、「特定の実施形態」、「１つ以上の実施形態」または「実施形態」は、その実施形態と併せて記載された特別な特色、構造、材料または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。つまり、本明細書全体の様々な箇所にある「１つ以上の実施形態において」、「特定の実施形態において」、「一実施形態において」または「実施形態において」は、必ずしも本発明の同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特別な特色、構造、材料または特性が１つ以上の実施形態において任意の適切な手法で組み合わせられていてもよい。
第一の態様において、本発明は、インターカレートしている活性剤の細胞または組織への送達のための合成ＤＮＡ担体であって、該ＤＮＡが、全体的または部分的に二本鎖であり、該ＤＮＡが、該ＤＮＡの二本鎖部分にインターカレートされた活性剤を含む、合成ＤＮＡに関する。該合成ＤＮＡ担体のオリゴヌクレオチド成分は、直鎖状または分枝状オリゴヌクレオチドであってもよい。ＤＮＡ担体の各二本鎖ＤＮＡ部分は、５ｂｐ長以上、例えば約２０〜３５ｂｐ、約３５〜５０ｂｐ、約５０〜１００ｂｐ、または約１００〜２００ｂｐである。合成ＤＮＡ担体は、インビトロで構築され、好ましくは活性剤の負荷量を増加させるために複数の二本鎖部分を含む。複数の二本鎖部分を含む合成ＤＮＡ担体の例としては、ＤＮＡデンドリマーが挙げられる。合成ＤＮＡ担体が、直鎖状オリゴヌクレオチドを含む場合、該オリゴヌクレオチドは、１つの二本鎖部分または複数の二本鎖部分を含んでいてもよい。ＤＮＡ担体内のそのような直鎖状オリゴヌクレオチドの全長は、典型的には少なくとも１０ｎｔ、例えば１０〜２０ｎｔ長、１０〜５０ｎｔ長、１０〜８０ｎｔ長、１０〜１５０ｎｔ長、または１０〜２００ｎｔ長である。
一実施形態において、合成ＤＮＡ担体は、ＤＮＡ担体を選択された細胞または組織タイプに結合させるために該選択された細胞または組織タイプに結合する標的化剤をさらに含んでいてもよく、それにより選択された細胞または組織への活性剤の送達が促進される。選択された細胞または組織タイプへの標的化剤の結合は、細胞表面タンパク質または細胞表面受容体への標的化剤の結合を介していてもよい。適切な標的化剤としては、細胞表面タンパク質または細胞表面受容体に結合する抗体、リガンドまたはペプチドが挙げられる。標的化剤は、典型的には共有結合または非共有結合のいずれかでＤＮＡデンドリマーに連結する（例えば、標的化剤を、デンドリマーアームに相補性のオリゴヌクレオチドに連結させて、デンドリマーアームにハイブリダイズする）。
標的化剤により標的化され得る細胞表面受容体およびタンパク質の例としては、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ／ＣＤ７１）、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）、抗マラリア剤マーカ、および葉酸受容体が挙げられる。好ましくは細胞表面受容体またはタンパク質は、感染、損傷もしくは疾患を受けた細胞上で特異的に発現されるか、または感染、損傷もしくは疾患を受けた細胞上で過剰発現される。標的化剤の具体的例としては、抗トランスフェリン抗体またはＴｆＲ標的化ペプチド、例えばトランスフェリン受容体に結合し、様々な癌で過剰発現されるＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号：ｌ）が挙げられる。例として、標的化剤は、Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞の表面で見出されるおよそ１７０ｋＤａの部分に結合するＧ８モノクローナル抗体、およびその誘導体であってもよい。Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞は、骨格筋特異性転写因子ＭｙｏＤ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤ノギン、および細胞表面Ｇ８エピトープのためにｍＲＮＡの発現により同定される。有用な標的化部分の他の例としては、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦＲファミリー受容体、ＩＣＡＭ、ＣＤ受容体、ＭＭＰ−９、インターロイキン受容体、葉酸受容体、および当該技術分野で公知の他のものに結合するものが挙げられる。
別の実施形態において、該ＤＮＡ担体の二本鎖部分にインターカレートされる活性剤は、化学療法薬、抗感染剤、抗マラリア剤、および抗ウイルス剤または抗真菌剤である。そのような薬剤の具体的例としては、ベルベリン系薬剤（抗真菌剤、抗悪性腫瘍剤）、アクリジン系薬剤（例えば、プロフラビンまたはキナクリン、消毒薬）、癌化学療法薬（例えば、ダウノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、ボレロキシン）、クリプトレピン（抗マラリア性細胞毒性剤）、およびサリドマイド（多発性骨髄腫の処理）が挙げられる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、該ＤＮＡ担体は、二層、四層、六層または八層ＤＮＡデンドリマーをはじめとするＤＮＡデンドリマーを含んでいてもよい。該ＤＮＡデンドリマーのサイズは、必要に応じて、細胞および組織への活性剤の送達（例えば、循環系または局所注射を介して）を促進するため、および細胞によるＤＮＡ担体の取り込みを最大にするために選択される。一般に該ＤＮＡ担体は、約３〜２１６のオリゴヌクレオチド一本鎖を含む。
第二の態様において、本発明は、前述の実施形態のいずれかにおけるＤＮＡ担体と、少なくとも１種の医薬的に許容し得る賦形剤と、を含む医薬組成物に関する。該医薬的に許容し得る賦形剤は、患者、細胞または組織への投与のためにＤＮＡ担体を配合して、治療的または他の生物学的結果を実現するために用いられ得る任意の適切なビヒクルである。該賦形剤は、二本鎖ＤＮＡと適合性があり（即ち、それらは、選択された細胞または組織への送達前にＤＮＡ担体を変性させない）、加えて活性剤と、そして存在するならば標的化剤と適合性があるそれらの賦形剤から選択される。そのような医薬的賦形剤としては、生理学的緩衝剤、糖類およびオリゴ糖、安定化剤、増粘剤、滑沢剤、ワックス、キレート化剤、界面活性剤、希釈剤、抗酸化剤、結合剤、防腐剤、着色剤、乳化剤、脂質ミセル、または医薬配合剤の他の従来の構成成分が挙げられる。特定の実施形態において、該医薬組成物は、例えば注射または輸液により、患者に非経口送達されるように配合されている。この場合、該ＤＮＡ担体が循環から所望の細胞または組織タイプに向かうように、該ＤＮＡ担体が標的化剤を含むことが望ましい。他の実施形態において、該医薬組成物は、活性剤の送達が望ましい細胞または組織への経口投与または局所投与に適合されていてもよい（例えば、局所配合剤）。
さらなる態様において、本発明は、前述の実施形態のいずれかに記載されたＤＮＡ担体を作製する方法に関する。一実施形態において、該ＤＮＡ担体は、一本鎖ＤＮＡをハイブリダイズして全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを形成させること、および活性剤を該二本鎖部分にインターカレートさせる条件下で、全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを活性剤と混和すること、により構築される。余分な活性剤は、例えばクロマトグラフィーにより、除去されて、ＤＮＡ担体を生成する。具体的な実施形態において、余分な活性剤を除去するクロマトグラフィーは、スピンカラムを用いて実施される。
別の実施形態において、該活性剤は、一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションの間にＤＮＡ担体に組み込まれて、全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを構築した後、先に記載された通り余分な活性剤を除去することができる。
さらなる実施形態において、ＤＮＡ担体を作製する方法は、ＤＮＡデンドリマーの構築、活性剤を該ＤＮＡデンドリマーの二本鎖部分にインターカレートさせる条件下で、ＤＮＡデンドリマーを活性剤と混和すること、および余分な活性剤を、例えばクロマトグラフィー（例えば、スピンカラム）により、除去すること、を含む。
ＤＮＡ担体が標的化剤と連結された具体的な実施形態において、該ＤＮＡ担体は、一本鎖ＤＮＡから構築されて全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを形成し、標的化剤は、構築されたＤＮＡに連結される。ＤＮＡへの標的化剤の連結は、当該技術分野で公知の通り共有結合での付着により遂行されていてもよく、またはそれはハイブリダイゼーションなどの非共有結合的連結であってもよい。そのような方法としては、例えばジスルフィド結合を介した連結、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル依存性縮合反応、二官能基性架橋、電荷−電荷相互作用を介して標的化剤をＤＮＡ担体に架橋するためのポリカチオン性化合物の使用、またはＷＯ２０１０／０１７５４４号に記載される通りＤＮＡ担体への直接的もしくは間接的ハイブリダイゼーションが挙げられる。例えば一本鎖のキャプチャーオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡデンドリマーのアームに付加され、該キャプチャー配列に相補性の一本鎖オリゴヌクレオチドが、標的化剤に連結される。標的化剤の相補配列が、ＤＮＡデンドリマーのキャプチャー配列にハイブリダイズされて、標的化剤をＤＮＡデンドリマーに連結させる。ハイブリダイズされたキャプチャーおよび相補配列は、場合により架橋されてもよい。該活性剤は、全体的もしくは部分的に二本鎖のＤＮＡの構築の際、またはＤＮＡ担体への標的化剤の連結の後に、ＤＮＡ担体に組み込まれてもよい。標的化剤が、先に記載された通りキャプチャー配列を介してＤＮＡ担体にハイブリダイズされると、連結により形成された二本鎖ＤＮＡも、活性剤をインターカレートすることができる。
標的化剤に連結されたＤＮＡ担体を作製する別の実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドが、最初のステップにおいて標的化剤に付着され、その後、相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズされて、ＤＮＡ担体の全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを形成させる。
ＤＮＡ担体を作製する前述の方法のいずれかにおいて、ＤＮＡデンドリマーは、例えばＴ． Ｗ． Ｎｉｌｓｅｎ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｔｈｅｏｒ． Ｂｉｏｌ． （１９９７） １８７， ２７３−２８４に記載される通り、当該技術分野で公知の方法のいずれかにより構築されてもよい。
さらなる態様において、本発明は、活性剤を細胞または組織に送達する方法であって、該細胞または組織を、前述の実施形態のいずれかによるＤＮＡ担体と接触させて、ＤＮＡ担体を細胞に取り込ませ、該活性剤を細胞内部で放出させて細胞への細胞毒性または他の生物学的作用を生成することを含む、方法に関する。該細胞または組織をビンビボまたはインビトロでＤＮＡ担体と接触させてもよい。細胞をインビトロでＤＮＡ担体と接触させる場合、細胞は、典型的には細胞培養されており、ＤＮＡ担体は、その培地に添加され、細胞表面への結合を可能にする期間、細胞と共にインキュベートされて、余分なＤＮＡ担体が除去される。活性剤のエンドサイトーシスおよび放出に十分な期間の後、細胞に対する活性剤の細胞毒性または生物学的活性を、顕微鏡で視覚化することができる。細胞をインビボでＤＮＡ担体と接触させる場合、所望の作用部位への注射、輸液、局所投与を介して、または他の適切な方法により、細胞表面への結合およびエンドサイトーシスを可能にする期間、ＤＮＡ担体を患者または動物へ投与する。細胞内に放出される活性剤の細胞毒性または生物学的活性は、生理学的応答をモニタリングすることにより、または罹患した組織の試料の顕微鏡検査により決定することができる。
さらなる態様において、本発明は、細胞または組織への活性剤の前述のインビボ送達方法を利用して、ＤＮＡ担体を、必要とする患者に送達することにより、疾患または状態を処置する方法に関する。処置の特異性に関して、標的化剤は、一般に、細胞毒性または他の生物学的活性が望ましい細胞型にとって特異的であるように選択される。活性剤は、処置される疾患または状態に対して治療活性であるように選択され、ＤＮＡ担体は、疾患または状態の症状を処置、治癒または改善するのに十分な量および期間、患者に投与される。ＤＮＡ担体の投与により処置可能な疾患および状態としては、二本鎖ＤＮＡにインターカレートする活性剤が利用可能な任意の疾患または状態が挙げられる。非限定的例としては、癌、マラリア、真菌性疾患、ウイルス性疾患、線維性疾患などが挙げられる。
処置を実行するために、合成ＤＮＡ担体を、例えば組織または細胞への外用または注射により、処置される組織または細胞に局所投与してもよい。あるいは合成ＤＮＡ担体を、例えば静脈注射もしくは輸液により、または経口投与により、全身投与してもよい。いずれかの実施形態において、存在するならばＤＮＡ担体に連結された標的化剤が、処置される細胞型へのＤＮＡ担体の結合、およびその細胞型への活性剤の送達を促進する。
具体的な実施形態において、Ｇ８エピトープを標的化するモノクローナル抗体に連結されたＤＮＡデンドリマーと、ＤＮＡをインターカレートするサイトトキシンと、を含むＤＮＡ担体の投与により、後嚢混濁（ＰＣＯ）が予防されるか、またはその発症率が低下する。ＰＣＯは、白内障手術後の特定の成人および小児に起こり、水晶体上皮細胞および筋線維芽細胞が分化することにより発症して、水晶体を取り囲む嚢の透明性に影響を及ぼす。現在、ＰＣＯを予防するための有効な処置はない。ヒト水晶体組織内の筋線維芽細胞が、骨格筋特異性転写因子ＭｙｏＤ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤ノギン、およびＧ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により認識される細胞表面分子、を発現するＭｙｏ／Ｎｏｇ細胞を起源とすることが発見された。白内障手術を受けた患者から得たヒト水晶体組織の組織片培養におけるＭｙｏ／Ｎｏｇ細胞のディプリーションが、標的化剤としてのＧ８ ｍＡｂおよびインターカレートされたドキソルビシンを用いて、それらの細胞を本発明によるＤＮＡ担体（ＤＮＡデンドリマー）で溶解することにより完遂された。Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞は、以下の実施例に示す通り、特異的に排除された。このデータから、経時的な筋線維芽細胞の蓄積が予防されるであろうことも、推定することができる。
実施例
実施例１：横紋筋肉腫細胞におけるＧ８ ｍＡｂコンジュゲートデンドリマーの内在化
細胞
二層ＤＮＡデンドリマーの調製：ＤＮＡデンドリマーは、過去に開示された通り製造した（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる、特許明細書第５，１７５，２７０号、同第５，４８４，９０４号、同第５，４８７，９７３、同第６，１１０，６８７号および同第６，２７４，７２３号参照）。簡潔に述べると、各ＤＮＡ鎖の中心部分に相補的に配置された配列の一領域を共有する２つのＤＮＡ鎖から生成されたＤＮＡモノマーから、ＤＮＡデンドリマーを構築した。２つの鎖をアニーリングしてモノマーを形成するが、得られた構造は、４つの一本鎖「アーム」に隣接する中央の二本鎖「ウエスト」を有すると説明することができる。このウエスト＋アーム構造は、塩基性の３ＤＮＡ（登録商標）モノマーを含む。５つのモノマータイプそれぞれの端部にある一本鎖アームは、精密で特殊な方法により互いに相互作用するように設計されている。相補性モノマーのアームの間の塩基対合が、モノマー層の連続付加を通してデンドリマーの定方向の構築を可能にする。デンドリマーの各層の構築は、ＤＮＡ鎖が互いに共有結合する架橋工程を含み、それにより別の方法ではデンドリマー構造の変形を引き起こす変性条件に耐える完全に共有結合の分子を形成する。加えて、相補性キャプチャーオリゴとして働く３８塩基のオリゴヌクレオチドが、以下に示す通り、簡単なＴ４ ＤＮＡリガーゼ依存性ライゲーション反応により、利用可能なデンドリマーアームの５’末端にライゲートされる。
ＤＮＡデンドリマーへのキャプチャー配列の付着：Ｇ８モノクローナル抗体（Ｇ８ ｍＡｂ）をＤＮＡデンドリマーに付着させるために、キャプチャー配列を、最初、デンドリマーアームの１０〜１５％にライゲートさせた。このキャプチャー配列への相補性オリゴヌクレオチドを、市販の化学薬品（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ， ｗｗｗ．ｓｏｌｕｌｉｎｋ．ｃｏｍ）を用いてＧ８モノクローナル抗体にコンジュゲートして、利用可能なキャプチャー配列の全てを占有するモル比でハイブリダイズさせた。以下に要約する通り、デンドリマー分子あたりおよそ２〜５個のＧ８ ｍＡｂを付着させた。
デンドリマーアームおよびキャプチャーオリゴヌクレオチドの隣接部分を重複させる架橋オリゴヌクレオチドを使用した簡単な核酸ライゲーション反応により、低分子（１５〜１００ヌクレオチド）ＤＮＡまたはＲＮＡキャプチャーオリゴヌクレオチド（または他の生化学的類似体）をデンドリマーアームの末端に共有結合させて、それによりキャプチャーオリゴヌクレオチドをデンドリマーアームの末端に架橋させた。架橋したオリゴヌクレオチドは、核酸リガーゼ酵素（好ましくはＴ４ ＤＮＡリガーゼ酵素）のライゲーション活性を促進するために、隣接するデンドリマーアームおよびキャプチャーオリゴヌクレオチド配列のそれぞれの少なくとも５塩基を重複させたが、各配列の少なくとも７塩基の重複が好ましい。架橋したオリゴヌクレオチドは、デンドリマーが非デンドリマー核酸または他の分子の特異的標的化に用いられる場合には、その相補配列の核酸ブロッカーとして作用することもできる。
以下の成分をマイクロ遠沈管に添加した：
１．１×ＴＥ緩衝液 ５．４μＬ（２６８０ｎｇ）中の二層ＤＮＡデンドリマー（５００ｎｇ／μＬ）
２．ａ（−）ＬＩＧ−ＢＲ７架橋オリゴ（１４マー）（５０ｎｇ／μＬ） ２．７μＬ（１３４ｎｇ）
３．１０× リガーゼ緩衝液 １０．２μＬ
４．ヌクレアーゼ不含水 ８１．７μＬ
５．Ｃａｐ０３キャプチャーオリゴ（３８マー）（５０ｎｇ／μＬ） ４．０μＬ（２００ｎｇ）
６．Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μＬ） １０．０μＬ（１０単位）
最初の４つの反応体を一緒に添加し、６５℃に加熱後、室温に冷却した。その後、５番目と６番目の反応体を添加し、４５分間インキュベートした。０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液２．８μＬを添加して、ライゲーション反応を停止させた。１００ｋカットオフ遠心式フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）の使用により、ライゲートされていないオリゴヌクレオチドを除去し、精製洗浄の間に、緩衝液を１×滅菌ＰＢＳ，ｐＨ７．４に交換した。キャプチャーオリゴヌクレオチドは、デンドリマーの最初の一本鎖表面アームに連結する。
ＤＮＡデンドリマーの抗体付着および蛍光標識：細胞表面を標的化して内在化を開始するために、Ｇ８モノクローナル抗体をＤＮＡデンドリマーに連結させた。Ｇ８モノクローナル抗体は、予めデンドリマーにライゲートされたキャプチャー配列に相補性のオリゴヌクレオチドに共有結合により付着させた。手短に述べると、キャプチャー配列相補体（ｃｐｌＣａｐ０３） ５’−ＴＴＣＴＣＧＴＧＴＴＣＣＧＴＴＴＧＴ ＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：２）を、市販の化学薬品を用いて、３’末端によりＧ８モノクローナル抗体（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）に共有結合させ、ＨＰＬＣにより精製して余分な試薬を除去した。これらのコンジュゲートを、その後、試薬の最終的な構築の間にデンドリマーキャプチャー配列にハイブリダイズさせた（以下の３ＤＮＡ調製の節を参照）。加えて、ＤＮＡデンドリマーの外表面のアームに相補性の合成オリゴヌクレオチド（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３’および５’末端にそれぞれ１つずつとし、２つの蛍光標識（Ｃｙ３）を有するように調製した。このオリゴヌクレオチドを、その後、先に調製されたＧ８ ｍＡｂ標的デンドリマーの外側のアームに、オリゴヌクレオチド１８モル対ＤＮＡデンドリマー１モルの量でハイブリダイズした。Ｇ８ ｍＡｂ標的化Ｃｙ３で標識したＤＮＡデンドリマーを、横紋筋肉腫細胞による標的化および内在化試験に用いた。
横紋筋肉腫細胞におけるＣｙ３標識デンドリマーをコンジュゲートされたＧ８モノクローナル抗体の内在化
ヒト胎児型および胞巣型横紋筋肉腫細胞（ＡＴＣＣの細胞株１３６および２０６１）を、培地８ｍｌが入った１００ｎｍ組織培養皿中のガラス製カバースリップ（１２カバースリップ／プレート）上で２４時間培養した。１３６細胞株は、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭで培養した。２０６１細胞株は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩで培養した。カバースリップを以下の培地１ｍｌを含有する３５ｍｍ組織培養皿に移した（２枚カバースリップ／皿）：
１．２μＭ希釈標準溶液に１：５００希釈されたＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ １８９原液（１ｍＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地
２．２μＭ ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ＋１：７５希釈されたＧ８：４ｎ デンドリマー−Ｃｙ３を含む培地
細胞を空気中の５％ＣＯ２中、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を３７℃のＰＢＳですすぎ、２％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定した。細胞を落射蛍光顕微鏡測定により視覚化した。様々な希釈およびインキュベーション時間を、テストした。１時間インキュベートされた１：５００ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ＋１：７５ Ｇ８：デンドリマーが、最良の結果をもたらした。結果を図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示すが、それらは横紋筋肉腫細胞において標識されたデンドリマーの内在化成功を示している。図１Ａは、酸性ｐＨで緑色蛍光を発するＬＹＳＯＳＥＮＳＯＲ色素で標識された細胞を示す（図１Ａでは細胞内の黒いスポットに集まっている）。図１Ｂは、細胞内のＣｙ３標識デンドリマーからの赤色蛍光を示す（図１Ｂでは細胞内の黒いスポットに集まっている）。図１Ｃは、図１Ａおよび１Ｂの結合画像であり、緑色シグナルと赤色シグナルの共局在化を示し黄色として視覚化されており、図１Ｃでは細胞内の矢印により示された黒いスポットとして示されている。これらの結果から、ＤＮＡデンドリマーに連結されたＧ８ ｍＡｂが細胞の酸性コンパートメント（即ち、リソゾーム）に内在化されることが確認される。
実施例２：Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞の標的化ディプリーション
二層ＤＮＡデンドリマーの調製：二層ＤＮＡデンドリマーを、実施例１に記載された通り付着されたキャプチャー配列を用いて調製した。キャプチャー配列を、デンドリマーアームの１０〜１５％にライゲートさせた。
ＤＮＡデンドリマーへのＧ８ ｍＡｂの付着：Ｇ８モノクローナル抗体（Ｇ８ ｍＡｂ）を、同じく実施例１に記載された通りＤＮＡデンドリマーに付着させた。最初に、キャプチャー配列に相補性のオリゴヌクレオチド（ｃｐｌＣａｐ０３）の３’末端を、市販の化学薬品（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ， ｗｗｗ．ｓｏｌｕｌｉｎｋ．ｃｏｍ）を用いてＧ８モノクローナル抗体にコンジュゲートした。コンジュゲートをＨＰＬＣにより精製して、余分な試薬を除去した。キャプチャー配列およびそのキャプチャー配列の相補体を、その後、利用可能なキャプチャー配列の全てを占有するモル比でハイブリダイズさせた。以下に要約する通り、デンドリマー分子あたりおよそ２〜５個のＧ８ ｍＡｂを付着させた。
ドキソルビシン二本鎖オリゴヌクレオチドＧ８抗体の調製：Ｇ８ ｍＡｂオリゴヌクレオチドコンジュゲート（先に調製された通り）１．２８２μｇを、相補性オリゴヌクレオチド配列（配列番号：２）１．２８２μｇおよび２００μＭ Ｄｏｘ溶液 １５００μｌと混和し、以下の表に従って滅菌１×ＰＢＳを用いて、最終容量を３０００μｌに調整した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。３ｍＬ溶液中のＤｏｘの最終濃度は、１００μＭであった。Ｑｕｉｃｋｓｐｉｎ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、製造業者のプロトコルに従って試薬を精製した。５Ｍ ＮａＣｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１６μｌを添加して、８６ｍＭ ＮａＣｌ濃度を得た。最終的なドキソルビシンを、蛍光分析法により決定した。
Figure 0006346265
ドキソルビシン二層デンドリマーの調製（標的化なし）：二層Ｃａｐ ０３デンドリマー（３μｇ）を、２００μＭ Ｄｏｘ溶液 １５００μｌと混合し、以下の表に従って滅菌１×ＰＢＳを用いて、最終容量を３０００μｌに調整して、３７℃で３０分間インキュベートした。３ｍＬ溶液中のＤｏｘの最終濃度は、１００μＭであり、最終的なデンドリマー濃度は、１０ｎｇ／μｌであった。Ｑｕｉｃｋｓｐｉｎ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、製造業者のプロトコルに従って試薬を精製した。５Ｍ ＮａＣｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１６μｌを添加して、８６ｍＭ ＮａＣｌ濃度を得た。最終的なドキソルビシンおよびデンドリマー濃度を、蛍光分析法およびＵＶ／Ｖｉｓ分光法により決定した。
Figure 0006346265
ドキソルビシン二層Ｇ８標的化デンドリマーの調製：二層Ｃａｐ ０３デンドリマー（３μｇ）を、Ｇ８ ｍＡｂオリゴヌクレオチドコンジュゲート（先に調製された通り）１．２８２μｌおよび２００μＭ Ｄｏｘ溶液 １５００μｌと混合し、以下の表に従って滅菌１×ＰＢＳを用いて、最終容量を３０００μｌに調整した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。３ｍＬ溶液中のＤｏｘの最終濃度は、１００μＭであり、最終的なデンドリマー濃度は、１０ｎｇ／μｌであった。Ｑｕｉｃｋｓｐｉｎ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、製造業者のプロトコルに従って試薬を精製した。５Ｍ ＮａＣｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１６μｌを添加して、８６ｍＭ ＮａＣｌ濃度を得た。最終的なドキソルビシンおよびデンドリマー濃度を、蛍光分析法およびＵＶ／Ｖｉｓ分光法により決定した。
Figure 0006346265
ドキソルビシンをインターカレートされたＤＮＡデンドリマーをコンジュゲートされたＧ８モノクローナル抗体によるヒト水晶体組織中のＭｙｏ／Ｎｏｇ細胞の標的化：白内障手術の際に嚢切開により除去されたヒト前部水晶体組織を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＤＦ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に採取した。水晶体組織を、以下のものを含むＤＦ ２４０μｌを含む８ウェルチャンバー組織培養スライドに移した：
１．添加なし
２． Ｇ８Ａｂ／Ｃａｐ０３オリゴ／ＣＰＬ −Ｄｏｘ ＤＦに１：８希釈された
３． 二層Ｇ８ Ａｂ／Ｃａｐ０３オリゴ／Ｃｐｌオリゴ − ＤＦで１：８に希釈
４． 二層Ｃａｐ０３ − ＤＦ中に１：８に高度に希釈
レンズがスライドの底に沈むまで、レンズをチャンバー内で浮遊させた。レンズを空気中の５％ＣＯ２中、３７℃で２４時間培養した。組織をＰＢＳですすぎ、２％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、その後、Ｇ８抗体およびＡｌｅｘａ４８８でコンジュゲートされた抗マウスＩｇＭと、ローダミンチャネルの下で蛍光を発するＲＯＣＨＥ ＴＵＮＥＬキットの試薬で二重標識した。
Ｇ８＋およびＴＵＮＥＬ＋細胞の割合、ＴＵＮＥＬを含むＧ８＋細胞の割合、ならびにＧ８を含むＴＵＮＥＬ＋細胞の割合を、落射蛍光顕微鏡測定により決定した。結果を、以下の表に示す：
Figure 0006346265
未処置培養物では、１％未満の細胞がＴＵＮＥＬ＋であった（図２Ａ）。加えて、Ｄｏｘのみを含むデンドリマー（ＤＮＡ：ＤＯＸ）は、赤色の染色がないことから示される通り、Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞またはＧ８陰性水晶体細胞（図２Ｂ）においてアポトーシスを誘導しなかった。しかし、Ｄｏｘを含むＧ８ ｍＡｂにコンジュゲートされたデンドリマー（Ｇ８：ＤＮＡ：ＤＯＸ）は、Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞にアポトーシスを特異的に誘導した（図２Ｃおよび図２Ｄは異なる数の陽性細胞を含む培地の２つの異なる区分を示す）。Ｇ８含有細胞は緑色に染色され、アポトーシスを受けた細胞（ＴＵＮＥＬ＋）は、赤色に染色される。図２ＣのＴＵＮＥＬ＋細胞（赤色）は、黒色のスポットにより示され、図２ＤのＴＵＮＥＬ＋細胞（赤色）は、濃灰色のスポットにより示される。小さな黒色の斑点は、緑色に染色されたＧ８含有細胞である。
Ｄｏｘにインターカレートされた二本鎖オリゴにコンジュゲートされたＧ８ ｍＡｂもまた、Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞内にアポトーシスを特異的に誘導した（データを示さない）。
実施例３：膵臓腫瘍細胞の標的化ディプリーション
二層ＤＮＡデンドリマーの調製：二層ＤＮＡデンドリマーを、デンドリマーアームの１０〜１５％へのキャプチャー配列の付着をはじめとし、実施例１に記載された通り調製する。
Ｇ８ ｍＡｂの代わりに、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ／ＣＤ７１）標的化ペプチドＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（ＴｆＲペプチド、配列番号：１）をデンドリマーに連結させる。キャプチャー配列に相補性のｃｐｌＣａｐ０３オリゴヌクレオチドを、市販の化学薬品（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｗｗｗ．ｂｉｏｓｙｎ．ｃｏｍ）を用いてＴｆＲペプチドの３’末端により共有結合させ、ＨＰＬＣにより精製して余分の試薬を除去し、利用可能なキャプチャー配列の全てを占有するモル比でハイブリダイズさせる。以下に要約する通り、デンドリマー分子あたりおよそ２〜５個のペプチドが付着される。
ドキソルビシン二本鎖オリゴヌクレオチドＴｆＲペプチドの調製：Ｄｏｘを含むＧ８ ｍＡｂ二本鎖オリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製のために、実施例１に記載された通り、ＴｆＲペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート（先に調製された通り）をキャプチャーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、Ｄｏｘと混和する。
ドキソルビシン二層デンドリマーの調製（標的化なし）：ＴｆＲペプチドの標的化を含まないドキソルビシン二層デンドリマーも、既に記載された通り調製する。
ドキソルビシン二層ＴｆＲペプチドを標的化するデンドリマーの調製：Ｄｏｘを含むＧ８ ｍＡｂデンドリマーの調製のために、実施例１に記載された通り、先に調製された二層ＴｆＲペプチドを標的化するデンドリマーをＤｏｘと混和した。
インビボマウス試験：マウスにおいて腫瘍形成を誘導するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ ２０ｍｌ中のＰＡＮ０２−Ｌｕｃ細胞（ホタルルシフェラーゼを安定発現するネズミ膵臓癌細胞）２×１０５個を、Ｂ６マウスの膵臓に直接注射した。４週間後、マウスの眼窩後部に、１×ＰＢＳ（陰性対照）、ドキソルビシンを含むＴｆＲペプチド二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ドキソルビシンを含む非標的化ＤＮＡデンドリマー、またはドキソルビシンを含むＴｆＲ標的化ＤＮＡデンドリマーの１００μｌを注射する。注射は、１週間あたり２回を２週間とし、合計４回実施する。最後の投与後３日目にマウスを殺処分し、腫瘍、肝臓、脾臓を１０％ホルマリンで２時間固定し、パラフィン包埋切片を調製して、さらなる試験のためにスライド上に載せる。処置の結果である細胞死のレベルを決定するために、ＴＵＮＥＬアッセイを、Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて実施した。
インターカレートされたドキソルビシンを含むＴｆＲ標的化ＤＮＡデンドリマー、およびＴｆＲ標的化二本鎖オリゴヌクレオチドで処置されたマウスの腫瘍は、ＰＢＳ緩衝液対照またはＤｏｘを含む非標的化ＤＮＡデンドリマーのいずれかよりも有意に多くの細胞死を示した。
本明細書の発明は、特別な実施形態を参照して記載されているが、これらの実施形態が単に本発明の原理および適用例の例示であることは、理解されなければならない。本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な改良および変更を本発明の方法および装置に施し得ることは、当業者に明白であろう。つまり本発明は、添付の特許請求の範囲に含まれる改良および変更、ならびにその均等物を含むものとする。

Claims (16)

  1. 全体的または部分的に二本鎖の合成ＤＮＡ担体と、前記ＤＮＡ担体に連結された標的化剤と、前記ＤＮＡ担体の二本鎖部分にインターカレートされた活性剤とを含み、前記標的化剤が、Ｇ８抗原に結合する抗体またはペプチドである、
    細胞または組織への活性剤の送達のための組成物。
  2. 前記二本鎖ＤＮＡが、５塩基対を超える長さである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記活性剤が、水素結合を通して前記二本鎖ＤＮＡにインターカレートされている、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記合成ＤＮＡ担体がＤＮＡデンドリマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記ＤＮＡデンドリマーが、３〜２１６のハイブリダイズされたＤＮＡの一本鎖を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記活性剤が、化学療法薬、抗感染剤、抗マラリア剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記活性剤が、ベルベリン、アクリジン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、シスプラチン、カルボプラチンまたはサリドマイドである、請求項６に記載の組成物。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物と、医薬的に許容し得る賦形剤とを含む医薬組成物。
  9. 細胞または組織に活性剤を送達するためのＤＮＡ担体を作製する方法であって、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを構築して全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを形成させること、標的化剤を前記全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡに連結させること、および前記全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを活性剤と接触させて、前記活性剤を前記ＤＮＡの二本鎖部分にインターカレートさせることを含み、前記標的化剤が、Ｇ８抗原に結合する抗体またはペプチドである、方法。
  10. 前記全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを前記活性剤と接触させると同時に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが構築される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを、構築の後に前記活性剤と接触させる、請求項９に記載の方法。
  12. 前記活性剤と接触させる前に、前記標的化剤が前記全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡに連結している、請求項１１に記載の方法。
  13. 細胞または組織を、請求項８に記載の医薬組成物と接触させることによって活性剤を前記細胞または組織に送達する方法において使用するための請求項８に記載の医薬組成物。
  14. 請求項８に記載の医薬組成物を前記患者に投与することによって患者における疾患または状態を処置する方法において使用するための請求項８に記載の医薬組成物。
  15. 細胞または組織への活性剤の送達のための、請求項８に記載の医薬組成物。
  16. 患者における疾患または状態を処置するための、請求項８に記載の医薬組成物。
JP2016504344A 2013-03-21 2014-03-19 Ｄｎａインターカレーティング剤の細胞送達 Active JP6346265B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361803863P 2013-03-21 2013-03-21
US61/803,863 2013-03-21
PCT/US2014/031192 WO2014153394A1 (en) 2013-03-21 2014-03-19 Cellular delivery of dna intercalating agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2016523811A JP2016523811A (ja) 2016-08-12
JP6346265B2 true JP6346265B2 (ja) 2018-06-20

Family

ID=50736166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016504344A Active JP6346265B2 (ja) 2013-03-21 2014-03-19 Ｄｎａインターカレーティング剤の細胞送達

Country Status (5)

Country Link
US (3) US20160051693A1 (ja)
EP (1) EP2976109B1 (ja)
JP (1) JP6346265B2 (ja)
CN (1) CN105188764B (ja)
WO (1) WO2014153394A1 (ja)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2976109B1 (en) 2013-03-21 2018-07-25 Genisphere, LLC Cellular delivery of dna intercalating agents
WO2017127033A1 (en) * 2016-01-22 2017-07-27 Yeditepe Universitesi A preparation method for a dna origami based carrier system
JP7366541B2 (ja) 2016-02-19 2023-10-23 コード バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 核酸キャリア及び治療上の使用方法
EP3416691A4 (en) * 2016-02-19 2020-02-26 Genisphere, LLC SUPPORTS OF NUCLEIC ACIDS AND THEIR THERAPEUTIC METHODS OF USE
US20190269728A1 (en) 2018-03-02 2019-09-05 Sixfold Bioscience Ltd. Compositions for delivery of cargo to cells
US12383632B2 (en) * 2019-03-25 2025-08-12 University Of Maryland Doxorubicin containing nanoplexes and uses thereof
US20230183746A1 (en) 2019-08-30 2023-06-15 Sixfold Bioscience Ltd. Compositions for transfer of cargo to cells
CN116249547B (zh) * 2019-11-04 2025-11-14 代码生物疗法公司 脑特异性血管生成抑制剂1(bai1)抗体及其用途
EP4143316A2 (en) 2020-04-27 2023-03-08 Sixfold Bioscience Ltd. Compositions containing nucleic acid nanoparticles with modular functionality
CN113975399A (zh) * 2021-11-09 2022-01-28 启东启晨生物科技有限公司 一种dna作为药物载体的抗体偶联物抗肿瘤药物

Family Cites Families (170)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
US3641235A (en) 1968-11-01 1972-02-08 Miles Lab Immunological reagent and process for making same
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3966897A (en) 1973-04-02 1976-06-29 Marine Colloids, Inc. Medium for use in bioassay and method of using same
US3959078A (en) 1973-05-18 1976-05-25 Midwest Research Institute Enzyme immobilization with a thermochemical-photochemical bifunctional agent
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
SE388694B (sv) 1975-01-27 1976-10-11 Kabi Ab Sett att pavisa ett antigen exv i prov av kroppvetskor, med utnyttjande av till porost berarmaterial bundna eller adsorberande antikroppar
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
IL52322A (en) 1976-06-18 1980-10-26 Alfa Laval Ab Method of making reagent test device and device made accorording to this method
US4094647A (en) 1976-07-02 1978-06-13 Thyroid Diagnostics, Inc. Test device
US4196281A (en) 1976-10-20 1980-04-01 Regents Of The University Of California Psoralens
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4299916A (en) 1979-12-26 1981-11-10 Syva Company Preferential signal production on a surface in immunoassays
US4391904A (en) 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
US4347312A (en) 1980-03-20 1982-08-31 Research Triangle Institute Detection of antibiotics in milk
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
US4517288A (en) 1981-01-23 1985-05-14 American Hospital Supply Corp. Solid phase system for ligand assay
US4425438A (en) 1981-03-13 1984-01-10 Bauman David S Assay method and device
US5141875A (en) 1982-01-08 1992-08-25 Environmental Diagnostics, Inc. Rotary fluid manipulator
US5073484A (en) 1982-03-09 1991-12-17 Bio-Metric Systems, Inc. Quantitative analysis apparatus and method
DE3327642A1 (de) 1983-07-30 1985-02-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur bestimmung eines partners einer immunreaktion sowie reagens zur durchfuehrung dieses verfahrens
EP0149168B1 (en) 1983-12-19 1991-04-24 Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd. Immunoassay
US4695554A (en) 1984-02-14 1987-09-22 Becton Dickinson And Company Sac or liposome containing dye (sulforhodamine) for immunoassay
US4703017C1 (en) 1984-02-14 2001-12-04 Becton Dickinson Co Solid phase assay with visual readout
US4743560A (en) 1984-03-26 1988-05-10 Becton Dickinson And Company Solid phase assay
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
WO1987002671A1 (en) 1985-11-01 1987-05-07 International Genetic Engineering, Inc. Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
AU602694B2 (en) 1986-06-09 1990-10-25 Ortho Diagnostic Systems Inc. Improved colloidal gold membrane assay
US5514602A (en) 1986-06-09 1996-05-07 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Method of producing a metal sol reagent containing colloidal metal particles
US5175270A (en) 1986-09-10 1992-12-29 Polyprobe, Inc. Reagents for detecting and assaying nucleic acid sequences
US4960691A (en) 1986-09-29 1990-10-02 Abbott Laboratories Chromatographic test strip for determining ligands or receptors
USRE38430E1 (en) 1987-03-27 2004-02-17 Becton, Dickinson And Company Solid phase chromatographic immunoassay
CA1303983C (en) 1987-03-27 1992-06-23 Robert W. Rosenstein Solid phase assay
US4857453A (en) 1987-04-07 1989-08-15 Syntex (U.S.A.) Inc. Immunoassay device
ES2150428T3 (es) 1987-04-27 2000-12-01 Unilever Nv Ensayos de union especifica.
US5120643A (en) 1987-07-13 1992-06-09 Abbott Laboratories Process for immunochromatography with colloidal particles
US4956302A (en) 1987-09-11 1990-09-11 Abbott Laboratories Lateral flow chromatographic binding assay device
US5275785A (en) 1987-10-30 1994-01-04 Unilever Patent Holdings B.V. Test device for detecting an analyte in a liquid sample
ES2050697T3 (es) 1987-12-21 1994-06-01 Abbott Lab Metodos y dispositivos de ensayo de fijacion cromatografico.
AU2684488A (en) 1988-06-27 1990-01-04 Carter-Wallace, Inc. Test device and method for colored particle immunoassay
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US6352862B1 (en) 1989-02-17 2002-03-05 Unilever Patent Holdings B.V. Analytical test device for imuno assays and methods of using same
ATE118824T1 (de) 1989-03-10 1995-03-15 Amoco Corp Immobilisierte oligonukleotidsonden und ihre verwendungen.
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5168053A (en) 1989-03-24 1992-12-01 Yale University Cleavage of targeted RNA by RNAase P
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US5075078A (en) 1989-10-05 1991-12-24 Abbott Laboratories Self-performing immunochromatographic device
US5252496A (en) 1989-12-18 1993-10-12 Princeton Biomeditech Corporation Carbon black immunochemical label
KR910014706A (ko) 1990-01-10 1991-08-31 원본미기재 세척이 필요없는 개량된 이뮤노어세이(immunoassay)장치
US6395492B1 (en) 1990-01-11 2002-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
DE69123979T2 (de) 1990-10-12 1997-04-30 Max Planck Gesellschaft Abgeänderte ribozyme
US5998220A (en) 1991-05-29 1999-12-07 Beckman Coulter, Inc. Opposable-element assay devices, kits, and methods employing them
JP3267613B2 (ja) 1991-05-30 2002-03-18 アボツト・ラボラトリーズ イオン捕獲結合アッセイにおける非特異的結合遮断薬を含む試薬
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
AU3178993A (en) 1991-11-25 1993-06-28 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
FI92882C (fi) 1992-12-29 1995-01-10 Medix Biochemica Ab Oy Kertakäyttöinen testiliuska ja menetelmä sen valmistamiseksi
DE69433036T2 (de) 1993-09-03 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad Aminoderivatisierte nukleoside und oligonukleoside
PT653639E (pt) 1993-11-12 2000-06-30 Unilever Nv Equipamentos analiticos e metodos para a sua utilizacao
PL182237B1 (pl) 1994-03-07 2001-11-30 Dow Chemical Co Sposób przeprowadzania transfekcji komórek i osiagniecia biodostepnosci materialu genetycznego in vitro i ex vivo PL PL
GB9419267D0 (en) 1994-09-23 1994-11-09 Unilever Plc Assay devices
GB9505425D0 (en) 1995-03-17 1995-05-03 Unilever Plc Assay devices
US5653979A (en) 1995-03-30 1997-08-05 Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunotargeting of plasminogen activators to the pulmonary endothelium
US20010051350A1 (en) 1995-05-02 2001-12-13 Albert Nazareth Diagnostic detection device and method
SE9501671D0 (sv) * 1995-05-05 1995-05-05 Pharmacia Ab Method and composition for prevention of posterior capsule opacification
AU6720096A (en) 1995-08-09 1997-03-05 Quidel Corporation Test strip and method for one step lateral flow assay
US6072043A (en) 1996-06-04 2000-06-06 Polyprobe, Inc. Optimally fluorescent oligonucleotides
US5846737A (en) 1996-07-26 1998-12-08 Molecular Probes, Inc. Conjugates of sulforhodamine fluorophores with enhanced fluorescence
US6117631A (en) 1996-10-29 2000-09-12 Polyprobe, Inc. Detection of antigens via oligonucleotide antibody conjugates
GB2322192B (en) 1997-02-14 2001-01-31 Unilever Plc Assay devices
US6924153B1 (en) 1997-03-06 2005-08-02 Quidel Corporation Quantitative lateral flow assays and devices
WO1999005284A1 (fr) 1997-07-25 1999-02-04 Agene Research Institute, Co., Ltd. GENE HUMAIN RecQ4 CODANT HELICASE
EP1005573B1 (en) * 1997-07-29 2006-05-24 Polyprobe, Inc. Dendritic nucleic acids exhibiting maximal self-assembly
WO1999040438A1 (en) 1998-02-03 1999-08-12 Synbiotics Corporation Device and method to detect immunoprotective antibody titers
AU753303B2 (en) 1998-03-10 2002-10-17 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Enhancement of intracellular delivery and tissue targeting of drugs and genes
US6287765B1 (en) 1998-05-20 2001-09-11 Molecular Machines, Inc. Methods for detecting and identifying single molecules
AU762670B2 (en) 1998-05-21 2003-07-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Compositions and methods for prevention and treatment of uncontrolled formation of intravascular fibrin clots
US7041287B2 (en) 1998-05-21 2006-05-09 Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for selective dissolution of nascent intravascular blood clots
ATE310536T1 (de) 1998-08-04 2005-12-15 Univ Pennsylvania Zielrichtung und verlängerte assoziation von wirkstoffen an die luminale oberfläche der pulmonaren vaskularen endothelzellen
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
US7674466B2 (en) 1999-08-05 2010-03-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting and prolonging association of drugs to the luminal surface of the pulmonary vascular endothelial cells using antibodies that bind to ICAM-1
US6822086B1 (en) 1999-08-09 2004-11-23 The General Hospital Corporation Drug-carrier complexes and methods of use thereof
US6773928B1 (en) 1999-09-22 2004-08-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Compositions and methods for enhancing bioassay performance
US6180357B1 (en) 1999-10-08 2001-01-30 Arius Research, Inc. Individualized patient-specific anti-cancer antibodies
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US6506600B2 (en) 2000-03-22 2003-01-14 University Of Arkansas Secreting products from skin by adeno-associated virus (AAV) gene transfer
US20010036460A1 (en) 2000-04-06 2001-11-01 Sawicki Janet A. Targeted death cancer cells
EP1282449A2 (en) 2000-05-12 2003-02-12 The Regents Of The University Of California Treatment of human papillomavirus (hpv)-infected cells
ATE375516T1 (de) 2000-06-12 2007-10-15 Fujirebio Kk Immuntest zur messung des humanen c-peptides sowie reagenzienkit hierfür
ATE388402T1 (de) 2000-07-19 2008-03-15 Genisphere Inc Verfahren zur erkennung und zum assay von nukleinsäuresequenzen
US6770487B2 (en) 2001-05-01 2004-08-03 Ischemia Technologies, Inc. Bar code readable diagnostic strip test
US20070173473A1 (en) 2001-05-18 2007-07-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2002345847B2 (en) 2001-06-21 2008-05-29 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
GR1003966B (el) 2001-10-16 2002-08-06 Εμβαπτιζομενος χαρτης αποξηραμενων αντιδραστηριων και μεθοδος για την ανιχνευση η και προσδιορισμο ειδικων αλληλουχιων νουκλεικων οξεων
EP1461606A4 (en) 2001-12-05 2005-06-29 Univ Washington MICROFLUIDIC DEVICE AND SURFACE DECORATION PROCESS FOR SOLID PHASE AFFINITY BINDING ASSAYS
US20040023248A1 (en) 2001-12-07 2004-02-05 Whitehead Institiute For Biomedical Research Methods and reagents for improving nucleic acid detection
AU2002357932A1 (en) 2001-12-18 2003-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Fusion partner cells and uses thereof
US7175992B2 (en) 2002-04-10 2007-02-13 Response Biomedical Corporation Sensitive immunochromatographic assay
EP1530581A4 (en) 2002-06-12 2006-08-30 Datascope Investment Corp POLYMERIC MARKING MOLECULES
EP2392345A3 (en) 2002-07-18 2012-03-07 Cytos Biotechnology AG Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof
AU2003269557A1 (en) 2002-10-18 2004-05-04 Lg Life Sciences Ltd. Gene families associated with cancers
MXPA05004588A (es) 2002-10-29 2005-12-14 Coley Pharmaceutical Group Ltd Metodos y productos relacionados con el tratamiento y prevencion de infeccion de virus de hepatitis c.
DK2284266T3 (da) 2002-11-14 2014-01-13 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53
WO2004053104A2 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5’ cpg nucleic acids and methods of use
WO2004062602A2 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Arizeke Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for targeted biological delivery of molecular carriers
BRPI0407446A (pt) 2003-02-13 2006-01-31 Pharmacia Corp Anticorpos para c-met para o tratamento de cânceres
US20040220084A1 (en) 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Methods for nucleic acid delivery
CA2525367A1 (en) 2003-05-09 2004-11-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of citrate lyase inhibitors and tricarboxylate transporter inhibitors in the treatment of cancer
US7317532B2 (en) 2003-06-04 2008-01-08 Inverness Medical Switzerland Gmbh Flow sensing for determination of assay results
US7223544B2 (en) 2003-06-27 2007-05-29 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleic acid-engineered materials
US7445906B2 (en) 2003-06-30 2008-11-04 East Carolina University Method of detecting cancer using delta-catenin
US7238538B2 (en) 2003-09-19 2007-07-03 Freitag Helmut E Chromatographic assay device and methods
US20060228404A1 (en) 2004-03-04 2006-10-12 Anderson Daniel G Compositions and methods for treatment of hypertrophic tissues
US20050215507A1 (en) 2004-03-04 2005-09-29 Massachusetts Institute Of Technology Therapeutic anti-cancer DNA
KR101147147B1 (ko) 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
WO2005113571A2 (en) 2004-05-13 2005-12-01 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods for the delivery of oligomeric compounds
US20060040879A1 (en) 2004-08-21 2006-02-23 Kosak Kenneth M Chloroquine coupled nucleic acids and methods for their synthesis
US8445293B2 (en) 2005-02-09 2013-05-21 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method to increase specificity and/or accuracy of lateral flow immunoassays
US7189522B2 (en) 2005-03-11 2007-03-13 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Dual path immunoassay device
WO2006098804A2 (en) 2005-03-11 2006-09-21 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Dual path immunoassay device
US8067572B2 (en) 2005-05-25 2011-11-29 The University Of York Hybrid interfering RNA
EP1893292A2 (en) 2005-05-26 2008-03-05 Thomas Jefferson University Method to treat and prevent posterior capsule opacification
US20070015166A1 (en) 2005-07-14 2007-01-18 Nilsen Thor W Lateral flow methods and devices for detection of nucleic acid binding proteins
US20100136614A1 (en) 2005-10-18 2010-06-03 Dan Luo Dendrimer-like modular delivery vector
WO2008039206A2 (en) 2005-10-05 2008-04-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Fusion proteins for inhibition and dissolution of coagulation
US20120003727A1 (en) 2006-03-10 2012-01-05 Javanbakhsh Esfandiari Immunoassay Device for Detecting Antibodies and Antigens
US20070225213A1 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Kosak Matthew K Nucleic acid carriers for delivery of therapeutic agents
JP2008195613A (ja) 2006-12-19 2008-08-28 Nissei Bio Kk マイクロ微粒子製剤および医薬組成物
DK2308514T3 (da) 2007-03-23 2013-09-02 To Bbb Holding B V Konjugater til målrettet lægemiddeltransport gennem blod-hjerne barrieren
US9217151B2 (en) 2007-05-16 2015-12-22 California Institute Of Technology Versatile nucleic acid hairpin motif for programming biomolecular self-assembly pathways
WO2008147526A1 (en) * 2007-05-23 2008-12-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeted carriers for intracellular drug delivery
MX2010001194A (es) 2007-07-31 2010-07-30 Univ Louisiana State Conjugado de polipeptido-acido nucleico para inmunoprofilaxis o inmunoterapia para desordenes neoplasicos o infecciones.
US9029524B2 (en) 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
BRPI0821417A2 (pt) 2007-12-26 2015-06-16 Biotest Ag Método para diminuir a adesão de células de estroma a células tumorais que expressam cd138 em células tumorais de um indivíduo em necessidade do mesmo
WO2009086552A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting recombinant therapeutics to circulating red blood cells
US20090297479A1 (en) 2008-03-28 2009-12-03 Kiyoshi Ariizumi Dc-hil conjugates for treatment of t-cell disorders
US20110160090A1 (en) 2008-05-05 2011-06-30 Los Alamos National Laboratory Nanocrystal-Based Lateral Flow Microarrays and Low-Voltage Signal Detection Systems
EP2657342B1 (en) 2008-08-08 2015-11-18 Genisphere, LLC DNA dendrimers protected against nuclease degradation
WO2010045518A1 (en) 2008-10-16 2010-04-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions containing thrombomodulin domains and uses thereof
WO2010065920A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Lankenau Institute For Medical Research Compositions and methods for the treatment and prevention of lens fibrotic diseases
WO2010107960A1 (en) 2009-03-17 2010-09-23 Brody Jonathan R Methods for assessing the efficacy of gemcitabine or ara-c treatment of cancer using human antigen r levels
AU2010244428B2 (en) 2009-05-06 2015-01-29 Biotest Ag Uses of immunoconjugates targeting CD138
US20100323018A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Massachusetts Institute Of Technology Branched DNA/RNA monomers and uses thereof
US20110206611A1 (en) 2010-02-24 2011-08-25 Genisphere, Llc DNA Dendrimers as Thermal Ablation Devices
US20130018086A1 (en) 2010-03-16 2013-01-17 Massachusette Institute Of Technology Sirnas targeting exon 10 of pyruvate kinase m2
JP4638555B1 (ja) 2010-09-08 2011-02-23 田中貴金属工業株式会社 核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法及び核酸又は免疫クロマトグラフィー測定用キット
WO2012061402A2 (en) * 2010-11-01 2012-05-10 Syracuse University System and method for delivery of dna-binding chemotherapy drugs using nanoparticles
US20140212503A1 (en) 2011-03-17 2014-07-31 Hyukjin Lee Delivery system
EP2998320B1 (en) 2011-04-19 2018-07-18 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Human monoclonal antibodies specific for glypican-3 and use thereof
WO2013134768A1 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Lankenau Institute For Medical Research Compositions and methods for treating cancer
RU2644263C2 (ru) 2012-06-27 2018-02-08 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения селективных и мультиспецифических терапевтических молекул с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные нацеливающие группировки, и их применения
US9651549B2 (en) 2012-07-13 2017-05-16 Genisphere, Llc Lateral flow assays using DNA dendrimers
EP2895211B1 (en) 2012-09-12 2017-10-18 Boston Scientific Scimed, Inc. Adhesive stent coating for anti-migration
HK1214628A1 (zh) 2012-11-05 2016-07-29 Pronai Therapeutics, Inc. 寡核苷酸癌症療法的給藥和施用
CN105073141A (zh) 2013-02-01 2015-11-18 詹尼斯费尔公司 用于将基因递送到细胞的功能化dna树状聚合物
EP2976109B1 (en) 2013-03-21 2018-07-25 Genisphere, LLC Cellular delivery of dna intercalating agents

Also Published As

Publication number Publication date
EP2976109A1 (en) 2016-01-27
JP2016523811A (ja) 2016-08-12
CN105188764B (zh) 2020-03-20
EP2976109B1 (en) 2018-07-25
US20200148763A1 (en) 2020-05-14
CN105188764A (zh) 2015-12-23
WO2014153394A1 (en) 2014-09-25
US20160051693A1 (en) 2016-02-25
US20170312299A1 (en) 2017-11-02
US12195531B2 (en) 2025-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6346265B2 (ja) Ｄｎａインターカレーティング剤の細胞送達
JP7614094B2 (ja) 薬物コンジュゲート
Fu et al. Dual-modified novel biomimetic nanocarriers improve targeting and therapeutic efficacy in glioma
Sun et al. Simultaneous delivery of siRNA and paclitaxel via a “two-in-one” micelleplex promotes synergistic tumor suppression
Fujita et al. Brain tumor tandem targeting using a combination of monoclonal antibodies attached to biopoly (β-L-malic acid)
JP2015017124A (ja) 担体としてオリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子を使用する治療薬の送達
JP2019526624A (ja) 細胞透過性が向上したペプチド核酸複合体およびそれを含む薬学的組成物
JP7090343B2 (ja) 治療活性ペイロードの標的化送達のための送達システム
Shukla et al. Dendrimer-based nanoparticulate delivery system for cancer therapy
US20170209599A1 (en) Functionalized DNA Dendrimers For Gene Delivery To Cells
Xiong et al. Engineered Aptamer‐Organic Amphiphile Self‐Assemblies for Biomedical Applications: Progress and Challenges
US20190192686A1 (en) Targeted nanodroplet emulsions for treating cancer
US20210198671A1 (en) Protected antibody-drug and aptamer-drug conjugates
JP7311933B2 (ja) 金ナノ粒子－アプタマー結合体をベースとする抗体伝達体およびその製造方法
Tauser et al. Aptamer-Nanoconjugates as Potential Theranostics in Major Neuro-Oncological and Neurodegenerative Disorders
Bhattacharya et al. Targeted Delivery of Complexes of Biotin–PEG–Polyethylenimine and NF-κB Decoys to Brain-derived Endothelial Cells in Vitro
Kim et al. Dendrimer Conjugates with PD‐L1‐Binding Peptides Enhance In Vivo Antitumor Immune Response
US12139713B2 (en) Therapeutic compounds for red blood cell-mediated delivery of an active pharmaceutical ingredient to a target cell
Pathak et al. Avidin-based nanoparticles for drug delivery
KR101722948B1 (ko) 리간드가 결합된 이중나선 올리고 ｒｎａ 구조체 및 그 제조방법
Tam Improving efficacy of therapeutics by enhancing delivery using chemical engineering
TW202018080A (zh) Rna奈米結構，其製備方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170209

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20170209

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20170209

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170301

RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20170301

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20170301

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20171129

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180130

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180425

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20180515

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20180524

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6346265

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250