JP6343817B2

JP6343817B2 - 石川県の伝統水産発酵食品に由来する乳酸菌を含有するヨーグルト

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Publication number: JP6343817B2
Application number: JP2014036148A
Authority: JP
Inventors: 喬小柳; 松本　健司; 健司松本; 英彦熊谷; 博人宮前
Original assignee: Ishikawa Prefectural University
Current assignee: Ishikawa Prefectural University
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2018-06-20
Anticipated expiration: 2034-02-27
Also published as: JP2015159749A

Description

本発明は、石川県の伝統水産発酵食品に由来する乳酸菌を含有するヨーグルトおよびその製造方法に関するものである。

石川県は全国的にまれにみる発酵食品の宝庫であり、石川県能登および加賀地域では、豊かな海産資源を活かした発酵食品、即ち水産発酵食品が伝統的に多種製造されている。水産発酵食品の例として、あじなれずし、ぶりなれずし、さばなれずし、かぶらずし、大根ずし、いか麹漬け、いか黒造りなどがある。

例えば、あじなれずしは、あじを塩と酢で下漬けし、米飯、あじ、山椒・トウガラシを順に桶に敷き詰め、何層も繰り返し、最後にご飯を敷き、蓋をして重りを載せ、冷暗所に置き、通常４週間以上発酵させ作られる。このようななれずしの発酵は米飯の乳酸発酵によるもので、これによって保存性が付与され、特有の臭いや酸味が醸される。

乳酸菌は古来より醸造食品や漬物中に多く含まれ、その乳酸発酵により食品に風味を付与してきた。石川県では酒、味噌、醤油等のいわゆる醸造食品の他に、先に述べたなれずし等の多くの固有の伝統発酵食品があり、それらに乳酸菌が関与している。本願発明者らは、石川県の伝統発酵食品から分離した乳酸菌に関する種々の研究成果を特許出願している（特許文献１〜４）。

乳酸発酵とは乳酸菌が糖を代謝（発酵）してその大部分を乳酸に変える反応である。発酵の形式には二通りあり、一つはホモ発酵と呼ばれ、１モルのブドウ糖（グルコース）から２モルの乳酸が生成される。この発酵を行うことが知られている主な乳酸菌はStreptococcus thermophilus（ストレプトコッカス・サーモフィラス）、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス）、Enterococcus faecalis（エンテロコッカス・フェカリス）、Lactococcus lactis（ラクトコッカス・ラクティス）などである。もう一つはヘテロ発酵と呼ばれ、１モルのブドウ糖から１モルの乳酸の他にエチルアルコール、酢酸、グリセリン、炭酸ガスなどが生成される。この発酵を行うことが知られている主な乳酸菌はLactobacillus brevis（ラクトバチルス・ブレビス）、Lactobacillus buchneri（ラクトバチルス・ブフネリ）、Leuconostoc mesenteroides（ロイコノストック・メセンテロイデス）などである。また、特定の条件下のみにおいてヘテロ発酵を行う条件的ヘテロ発酵型の乳酸菌も存在し、これには、Lactobacillus plantarum（ラクトバチルス・プランタラム）、Lactobacillus sakei（ラクトバチルス・サケイ）等が含まれる。

ヨーグルトは、一般的にLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス）、Streptococcus thermophilus（ストレプトコッカス・サーモフィラス）を代表とする様々な乳酸菌をスターター（種菌）として用いて、その乳酸発酵作用により乳および脱脂粉乳などの乳製品から作られるものであり、糊状もしくは液状のもの、またはこれらを凍結したものであって、１ｍｌあたり１０^７個以上の乳酸菌を含むものをいう（食品衛生法に基づく「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令」に記載）。フローズンヨーグルトにおいても、この基準が適用される。

前記の通りヨーグルト製造用スターターとしては乳の発酵に適した特性をもつ菌種、例えばLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、Streptococcus thermophiles などが主に用いられるが、一般にヨーグルトの製造に用いられない菌種においても、発酵条件等を最適化することにより使用することができる。例えば、植物原料由来の乳酸菌の発酵能を促進するために原料乳に酒粕を添加する技術が報告されている（特許文献５）。

上記の石川県の伝統的な水産発酵食品から分離した乳酸菌をスターターとして利用し、ヨーグルトを調製し、フローズンヨーグルト化することにより、これまでに例のない新たな分離源から単離された乳酸菌による新たな付加価値が付与された高品質の乳発酵製品を製造することができる。水産発酵食品由来乳酸菌においては、未だヨーグルト製造およびフローズンヨーグルト製造のための種菌培養・保存方法、発酵方法に関する技術は確立されていない。

特開２０１３−０４８５８６号公報特開２０１３−１９３９９６号公報特開２０１３−２０２００８号公報特開２０１３−２０８０７１号公報特開２００９−１９５２５１号公報

本発明は、石川県の伝統的な水産発酵食品に由来する乳酸菌を利用した風味の良いヨーグルトおよびフローズンヨーグルト、ならびにその製造方法を提供することを課題とする。

前記課題の解決のために、本発明者らは、鋭意検討を重ね、石川県の伝統的な水産発酵食品から複数の乳酸菌を分離してヨーグルトの調製に使用し、良好な風味を持つヨーグルトおよびフローズンヨーグルトを作製できることを見出し、さらに検討することにより本発明を完成させるに至った。

本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の［１］〜［１６］を提供する。
［１］水産発酵食品に由来する乳酸菌を含有することを特徴とするヨーグルト。
［２］水産発酵食品が、あじなれずし、ぶりなれずし、さばなれずし、かぶらずし、大根ずし、いか麹漬け、およびいか黒造りからなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする前記［１］に記載のヨーグルト。
［３］乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する乳酸菌である前記［１］または［２］に記載のヨーグルト。
［４］乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＡＮＰ７−１（受託番号：ＮＩＴＥＰ−１２２４）である前記［３］に記載のヨーグルト。
［５］さらに、ブルーベリー果汁を含有することを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれか１項に記載のヨーグルト。
［６］さらに、酒粕を含有することを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載のヨーグルト。
［７］ヨーグルトがフローズンヨーグルトである前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載のヨーグルト。
［８］前記［１］〜［７］のいずれか１項に記載のヨーグルトを製造する方法であって、水産発酵食品に由来する乳酸菌をスターターとして用いることを特徴とする製造方法。
［９］水産発酵食品が、あじなれずし、ぶりなれずし、さばなれずし、かぶらずし、大根ずし、いか麹漬け、およびいか黒造りからなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする前記［８］に記載の製造方法。
［１０］牛乳または脱脂粉乳を保護剤として凍結乾燥保存または凍結保存した乳酸菌をスターターとして用いることを特徴とする前記［８］または［９］に記載の製造方法。
［１１］乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する乳酸菌である前記［８］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＡＮＰ７−１（受託番号：ＮＩＴＥＰ−１２２４）である前記［１１］に記載の製造方法。
［１３］ブルーベリー果汁をヨーグルト原料または発酵後のヨーグルトに添加することを特徴とする前記［８］〜［１２］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１４］酒粕を含有するヨーグルト原料を用いることを特徴とする前記［８］〜［１３］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１５］前記［１］〜［７］のいずれか１項に記載のヨーグルトを摂取することを特徴とする腸管免疫活性化方法。
［１６］水産発酵食品に由来する乳酸菌を、牛乳を保護剤として凍結乾燥または凍結保存することを特徴とする乳酸菌の保存方法。

本発明により、石川県の伝統的な水産発酵食品に由来する乳酸菌を利用した風味の良いヨーグルトおよびフローズンヨーグルト、ならびにその製造方法を提供することができる。本発明のヨーグルトおよびフローズンヨーグルトは、癖のない良好な風味をもち嗜好性の高いものである。

大豆ホエー培地における補助栄養の有無によるラクトバチルス・プランタラムＡＮＰ７−１の生育度を評価した結果を示す図である。ラクトバチルス・プランタラムＡＮＰ７−１の生育温度依存性をコントロール乳酸菌（Lactobacillus sakei）と比較した結果を示す図であり、Ａがラクトバチルス・プランタラムＡＮＰ７−１の結果、Ｂがコントロール乳酸菌の結果を示す図である。ラクトバチルス・プランタラムＡＮＰ７−１の保存安定性を評価した結果を示す図であり、Ａは凍結乾燥保存の結果、Ｂは急速凍結保存の結果を示す図である。酒粕凍結乾燥物を添加した牛乳をヨーグルト原料としてラクトバチルス・プランタラムＡＮＰ７−１でヨーグルトを製造したときのｐＨ推移（Ａ）と固化率（Ｂ）を示した図である。ブルーベリー入りフローズンヨーグルトの製造スキームを示した図である。マウスパイエル板由来免疫細胞に対するラクトバチルス・プランタラムＡＮＰ７−１のＩｇＡ抗体産生誘導能を検討した結果を示す図である。

本発明は水産発酵食品に由来する乳酸菌を含有することを特徴とするヨーグルトを提供する。水産発酵食品は特に限定されないが、例えば石川県の伝統的な水産発酵食品であるあじなれずし、ぶりなれずし、さばなれずし、かぶらずし、大根ずし、いか麹漬け、いか黒造りなどが挙げられる。水産発酵食品は公知の方法で製造することができる。また、市販の水産発酵食品を容易に入手することができる。水産発酵食品からの乳酸菌の分離・同定は、公知の方法により行うことができる。

本発明のヨーグルトに含有される乳酸菌は特に限定されず、例えば、ラクトバチルス（Lactobacillus）属の乳酸菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）属の乳酸菌、エンテロコッカス（Enterococcus）属の乳酸菌、ラクトコッカス（Lactococcus）属の乳酸菌、ロイコノストック（Leuconostoc）属の乳酸菌、ペディオコッカス（Pediococcus）属の乳酸菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の乳酸菌などが挙げられる。なかでもラクトバチルス（Lactobacillus）属の乳酸菌が好ましく、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する乳酸菌がより好ましい。特に好ましくは、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＡＮＰ７−１である。ＡＮＰ７−１は、石川県能登地方の伝統的な水産発酵食品であるあじなれずしから分離された乳酸菌であり、受託番号ＮＩＴＥＰ−１２２４として２０１２年２月３日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２２号室）に寄託されている。

本発明のヨーグルトは水産発酵食品に由来する乳酸菌をスターターに用いて製造されるが、スターターに用いる乳酸菌は、牛乳または脱脂粉乳を保護剤として凍結乾燥保存または凍結保存した乳酸菌であることが好ましい。牛乳を用いる場合は、牛乳（ｍｌ）に対して添加する菌体の湿重量（ｇ）が約１：０．５〜約１：２であることが好ましく、約１：０．８〜約１：１．５であることがより好ましく、約１：１であることがさらに好ましい。脱脂粉乳を用いる場合は、脱脂粉乳の濃度が菌体懸濁液の約２〜５０％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、約５〜３０％（ｗ／ｖ）であることがより好ましく、約５〜２０％（ｗ／ｖ）であることがさらに好ましく、約５〜１０％（ｗ／ｖ）であることがさらに好ましい。いずれを用いる場合も、他の保護剤（例えば、グリセロール、スクロース、トレハロース等）を併用してもよい。凍結乾燥保存または凍結保存は公知の方法で行うことができる。例えば、培養した菌体を洗浄し、上記の保護剤を含む菌体懸濁液を調製しこれを凍結することにより凍結保存することができる。また、一旦完全に凍結させてから凍結乾燥機を用いて乾燥処理することにより、凍結乾燥保存用の菌体を調製することができる。本発明には、水産発酵食品に由来する乳酸菌を、牛乳を保護剤として凍結乾燥または凍結保存することを特徴とする乳酸菌の保存方法が含まれる。

本発明のヨーグルトに含有される乳酸菌は、公知の方法で培養することができる。培地は、乳酸菌の培養に通常使用される炭素源、窒素源、ミネラル等を含むものであればよく、天然培地または合成培地等を用いることができる。好ましくは、液体培地を用いる。培養温度は約５〜４５℃とすることが好ましく、約２５〜３７℃とすることがより好ましい。培地のｐＨは、例えば約４〜８とすることが好ましく、約６〜７とすることがより好ましい。同時にｐＨを制御してもよく、酸またはアルカリを用いてｐＨの調整を行うことができる。培養時間は、通常約２４時間以上が好ましく、より好ましくは約４８〜９６時間である。培養は、好気条件下で行ってもよく、嫌気条件下で行ってもよい。好ましくは嫌気条件下で行う。

炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、スクロース、セロビオース、廃糖蜜、グリセロール等が挙げられ、好ましくはグルコース、スクロース等である。窒素源としては、無機態窒素源では、例えばアンモニア、アンモニウム塩等、有機態窒素源では、例えば尿素、アミノ酸、タンパク質等をそれぞれ単独もしくは２種以上を混合して用いることができ、好ましくはアンモニウム塩、アミノ酸等である。またミネラル源として、おもにＫ、Ｐ、Ｍｇ、Ｓなどを含む、例えばリン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム等を用いることができる。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸やビオチン、チアミン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することもできる。培地中の炭素源、窒素源等の濃度は、乳酸菌が生育できる通常の濃度であればよく、特に限定されない。通常、培養開始時の炭素源濃度は０．１〜１５％（ｗ／ｖ）程度が好ましく、より好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）程度である。培養開始時の窒素源の濃度は、通常０．１〜１５％（ｗ／ｖ）程度、好ましくは１〜１５％（ｗ／ｖ）程度、より好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）程度とすればよい。

本発明のヨーグルトに含有される乳酸菌は、大豆ホエーを含む培地で培養することができる。大豆ホエーは、大豆抽出液から豆腐等の大豆製品を製造する際に廃棄される大量の乳清状の溶液であり、タンパク質等の栄養成分を豊富に含んでいるがその利用性の低さからやむを得ず廃棄されている。大豆ホエーを含む培地は、大豆ホエーのみからなるものでもよいし、大豆ホエーにその他の成分を添加したものでもよい。その他の成分は特に限定されないが、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸やビオチン、チアミン等の各種ビタミン等の栄養素が挙げられる。

乳酸菌の培養に用いる大豆ホエーの調製方法は特に限定されず、目的に応じて公知の大豆ホエー調製方法から選択することができる。例えば、豆乳に凝固剤（例えば塩化カルシウム、硫酸カルシウム、塩化マグネシウム、グルコノデルタラクトンなど）を添加し、凝固物を生成させその上澄み液（大豆ホエー）を採取する。採取した大豆ホエーを必要に応じて濃縮して乳酸菌の培養に用いる。濃縮倍率は特に限定されず、培養する乳酸菌の増殖に適した濃縮倍率を適宜選択すればよい。濃縮倍率は、約２〜５倍が好ましく、約２〜３倍がより好ましい。濃縮方法は、例えば、逆浸透濃縮法、加熱濃縮法、減圧濃縮法、界面前進凍結濃縮法などの公知の方法を用いることができる。

本発明のヨーグルトは、水産発酵食品に由来する乳酸菌をスターターに用いて公知の方法で製造することができる。ヨーグルト原料には、乳原料および必要に応じて加えた配合剤を混合し、殺菌したものを用いることができる。ヨーグルト原料含まれる乳原料は、乳を原料とした素材であれば特に限定されず、牛乳、山羊乳などの乳の他に、脱脂粉乳、練乳、生クリーム、乳蛋白なども用いることができる。これら乳原料に、必要に応じて油脂、甘味料等その他従来のヨーグルト原料の配合剤として知られているものを添加することができる。配合剤としては、例えば、糖質、安定剤、乳化剤、酸味料、ｐＨ調整剤、着香料、着色料、風味調整剤、酸化防止剤などが挙げられる。

糖質としては、例えば、砂糖、果糖、ブドウ糖、水飴、還元水飴、はちみつ、異性化糖、転化糖、オリゴ糖（イソマルトオリゴ糖、還元キシロオリゴ糖、還元ゲンチオオリゴ糖、キシロオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、テアンデオリゴ糖、大豆オリゴ糖等）、トレハロース、糖アルコール（マルチトール、エリスリトール、ソルビトール、還元パラチノース、キシリトール、ラクチトール等）、砂糖結合水飴（カップリングシュガー）などを用いることができる。また、アスパルテーム、アリテーム、モナチン、カンゾウ抽出物（グリチルリチン）、甘茶抽出物（フィロズルチン）、ラカンカ抽出物（モグロシド）、サッカリン、サッカリンナトリウム、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテーム、ソーマチン、ラカンカ抽出物等の高甘味度甘味料を用いてもよい。

安定剤としては、例えば、アラビアガム、カラギーナン、寒天、アルギン酸類（アルギン酸、アルギン酸塩）、ローメトキシルペクチン（ＬＭペクチン）、ハイメトキシルペクチン（ＨＭペクチン）、グァーガム、タラガム、ローカストビーンガム、タマリンドシードガム、サイリウムシードガム、水溶性大豆多糖類、グルコマンナン、でん粉、化工でん粉、加工でん粉、デキストリン、ジェランガム、キサンタンガム、プルラン、カードラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース塩、メチルセルロース、キチン、キトサン、ゼラチン等が挙げられる。

各種の果実系香料やシュガーフレーバーなどの香料類を添加することもできる。香料は天然香料、合成香料および複合香料のいずれも用いることができる。
本発明のヨーグルトは、ブルーベリー果汁、特に石川県能登地方産のブルーベリー果汁を含有することが好ましい。ブルーベリー果汁はヨーグルト原料に添加してもよく、発酵後に添加してもよい。

ヨーグルト原料に酒粕を添加してもよい。酒粕を含有するヨーグルト原料を用いることによりヨーグルトの固化を促進することができる。酒粕は十分乾燥させたものを用いることが好ましく、例えば凍結乾燥酒粕を好適に用いることができる。酒粕の添加量は、ヨーグルト原料に対して約０．０１〜２０．０％（ｗ／ｖ）が好ましく、約０．０５〜１０．０％（ｗ／ｖ）がより好ましく、約０．１〜５．０％（ｗ／ｖ）がさらに好ましい。

ヨーグルトの発酵は、ヨーグルト原料にスターターの乳酸菌を添加して、発酵物１ｍｌあたり乳酸菌が１０^７個以上含まれるようになるまで発酵を続ければよい。通常２５〜４５℃で２〜７２時間行われる。フローズンヨーグルトは、得られた水産発酵食品に由来する乳酸菌を含むヨーグルトと、風味を調整するために必要に応じて牛乳を混合し、凍結することにより製造することができる。ヨーグルトおよび牛乳の混合物は、フローズンヨーグルトの全体重量の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）以上を占めることが望ましいが、ヨーグルト様の風味が付与される条件を満たせばこの限りではない。ヨーグルトおよび牛乳以外の成分として、石川県能登地方産のブルーベリー果汁もしくはその他の果汁を添加してもよく、あるいはグラニュー糖等を添加して酸味を調整してもよい。また、必要に応じてグァーガム、カラギーナン等を添加してもよく、食感を脱脂粉乳で調整してもよい。牛乳およびその他の上記の添加物は全て市販のものを用いることができる。

本発明は、上記本発明のヨーグルトを摂取することを特徴とする腸管免疫活性化方法を提供する。本発明者らは、本発明のヨーグルトに含まれる水産発酵食品に由来する乳酸菌の脱脂粉乳を含む懸濁液が、マウスのパイエル板由来免疫細胞に対してＩｇＡ抗体産生誘導活性を有することを見出した（実施例参照）。したがって、ヨーグルトを摂取することにより腸管免疫を活性化させることできる。ヨーグルトは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ等の家畜、イヌ、ネコ等のペットに摂取させることが好ましい。本発明の腸管免疫活性化方法は非治療的な方法である。ここで「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体または動物の体への処置行為を含まない概念である。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

実施例１
１−１種菌の前培養の方法
種菌にはラクトバチルス・プランタラムＡＮＰ７−１（受託番号：ＮＩＴＥＰ−１２２４）を使用した。ＡＮＰ７−１株は石川県能登地方の伝統的な水産発酵食品である「あじなれずし」から分離された菌株である。培地には、乳酸菌用完全栄養培地であるＭＲＳ培地（市販品、Difco 社製）または大豆ホエー培地を用いた。
ＭＲＳ液体培地は、５５ｇを最終液量が１Ｌとなるような濃度に純水で溶解して調製した。固体培養を行う場合は、終濃度２％になるように寒天を添加して作製したプレートを使用した。大豆ホエー培地は、特開２０１１−９７８６５号公報の記載に従い調製した。具体的には、豆乳に塩化カルシウム（凝固剤）を添加して豆乳を凝固させ、その上澄み液である大豆ホエーを得、大豆ホエーの浮遊物質を除去した後、苛性ソーダによりｐＨを６．８〜７．０に調整し、ポリアミド系複合膜からなる逆浸透装置に通過させながら循環させ、逆浸透液を排出して２倍濃縮することにより調製した。

４ｍｌ容バイアルにＭＲＳ液体培地または大豆ホエー培地４ｍｌを入れ１２１℃、１５分間オートクレーブ処理し、冷却後、滅菌したつまようじを用いて乳酸菌コロニーまたは冷凍保存菌体液を採取して培地に接種し、３０℃で１〜３日間培養した。いずれの培地を用いても乳酸菌は良好に増殖した。

１−２ヨーグルト製造のための種菌の培養（大量調製法）
前培養した乳酸菌を遠心分離により沈殿させ、菌体を滅菌生理食塩水で複数回洗浄し、５００〜１０００ｍｌの大豆ホエー培地に投入し、３０℃にて培養を行った。大豆ホエー培地単独以外に、酵母エキス、ペプトンまたは酵母エキスとペプトンの両方を大豆ホエー培地に添加した培地を使用した。
培養開示時と培養２４時間後の生菌数を図１に示した。図１からわかるように、酵母エキスやタンパク質分解物（ペプトン）を補助栄養として添加しなくても、大豆ホエー培地単独で１０^６個／ｍｌの乳酸菌（生菌）を２４時間で１０^９個／ｍｌまで増殖させることができた。また、培養中のｐＨ調整も不要であった。続いて、２００Ｌ容の大量菌体調製用培養槽を用いたテスト培養も行い、同様の菌体密度（１０^８個／ｍｌ以上）の培養液を得ることに成功した。

続いて、培養温度の違いによる乳酸菌の生育度を評価した。結果を図２に示した。コントロールとして用いた植物原料由来（日本酒酒母から分離）のラクトバチルス属乳酸菌（Lactobacillus sakei）（図２Ｂ）に比べて、ラクトバチルス・プランタラムＡＮＰ７−１（図２Ａ）はヨーグルト発酵温度（４３℃）における温度適正が高いことが判明した。

１−３ヨーグルト作製用種菌の保存方法
１−３−１乾燥保存
水産発酵食品由来の乳酸菌を高密度調製したのちに、菌体をいかに長く安定に生菌状態で維持しながら保存できるかが、菌株利用および商品流通上極めて重要である。そこで、培養後の菌体を乾燥粉末化した際の安定性について検討した。３０℃で培養した菌体を滅菌生理食塩水で２回洗浄し、−８０℃にて完全に凍結したのちに凍結乾燥を行った。乾燥菌体を４℃で保存し、定期的に滅菌スパーテルで粉末を量り取り、生理食塩水で段階希釈したのちにＭＲＳ寒天培地に塗沫し、生菌数を算出した。
結果を図３Ａに示した。図３Ａからわかるように、６か月の保存期間を経ても、乾燥粉末１ｇあたり１０^１０個以上の生菌数が確保されており、初発生菌数（１０^１２個弱）の１００分の１以上の生菌数を確保することができた。

また、凍結乾燥時に１０％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳および１０％（ｗ／ｖ）スクロースを含有する細胞保護液と２：１（細胞保護液ｍｌ：菌体湿重量ｇ）で混合することにより、より高い生菌数の確保に成功した（保存期間後の生菌数：７．２×１０^１０／凍結乾燥物重量（ｇ）が細胞保護液なしの場合の５．５倍）。

１−３−２凍結保存
続いて、乾燥粉末化はスプレードライや凍結乾燥機などの設備が必要となるため小企業での導入が難しいことも想定し、培養後の菌体を粉末化せずに、凍結状態でそのまま保存可能かについて検討した。凍結形態としては、菌体湿重量に対して１：１で牛乳に懸濁した液とした（牛乳１ｍｌと菌体１ｇを混合し凍結）。その結果、緩慢凍結（−２０℃に直接投入）および急速凍結（−８０℃に投入し２４時間後に−２０℃に移行）のいずれの場合も、同様の保存効果（凍結菌体液１ｍｌあたり生菌数約１０^１１個）を確認することができた。急速凍結の結果を図３Ｂに示した。

１−４ヨーグルト発酵
これ以降、特に記載の無い限り菌体の調製はＭＲＳ液体培地または大豆ホエー培地で３０℃にて２〜３日間培養を行い、滅菌生理食塩水で複数回菌体洗浄を行ったものを用いた（接種直後の菌数は、１０^７〜１０^８／牛乳（ｍｌ）となるよう調整した）。

１−４−１ラクトバチルス・プランタラムＡＮＰ７−１を用いたヨーグルトの製造
発酵槽内に滅菌乳およびＡＮＰ７−１菌体を投入し、４３℃にて数時間発酵後、固化前にカップ包装を施した。その後もカップ内で発酵を継続することにより約２０時間の発酵を経ることでカップ内容物の固化に至った。なお、カップ化した試作品についてはその後４℃で保存した際に、少なくとも２週間良好な風味を維持した。完成後の試作品についてガスクロマトグラフィー質量分析法による成分分析を行ったところ、ヨーグルト様風味に寄与するアセトインなどの物質が検出され、乳酸発酵が滞りなく進行したことが窺われた。

１−４−２発酵迅速化の検討
大豆ホエー、ブルーベリー果汁または酒粕凍結乾燥物を０．５〜３％（ｗ／ｖ）の濃度で牛乳に添加し、ヨーグルト原料の栄養源を補強したうえでＡＮＰ７−１を接種し、発酵および固化の迅速化がみられるかを検討した。ブルーベリー果汁は、果肉を圧搾して滲出したエキス分を用い、酒粕凍結乾燥物は、日本酒醸造時に発生する一般に市販品として購入可能なものを凍結乾燥して用いた。

その結果、大豆ホエーおよびブルーベリー果汁では３％添加条件においても固化の迅速化はみられなかった。これは、３％濃度では添加物中の栄養源が乳酸菌の生育を促進できないためと考えられた。一方、図４に示したように、酒粕凍結乾燥物を添加した際には明らかに固化が促進された。酒粕による植物性乳酸菌の生育促進効果については既報があり（特許文献５参照）、水産発酵食品に由来するラクトバチルス・プランタラムにおいても同様の効果が得られることが判明した。酒粕凍結乾燥物非添加時には発酵開始１８時間後において６０％程度の固化率しかみられなかったが、酒粕凍結乾燥物０．５〜３％添加区においては、同時間において固化率は９０％に達した。

実施例２
２−１ヨーグルト（ＡＮＰ７−１菌体入り）を用いたフローズンヨーグルトの製造
ＡＮＰ７−１菌体入りヨーグルトを用いて、ブルーベリー入りフローズンヨーグルトを製造する方法について検討した。製造スキームを図５に示した。

風味および食感の良好なフローズンヨーグルトを製造できる原料配合として、ブルーベリー１０００ｇ（１４％）、グラニュー糖１２５０ｇ（１７％）、ＡＮＰ７−１菌体入りヨーグルト３６００ｇ（４９％）、滅菌牛乳１４００ｍｌ（１９％）、脱脂粉乳１２５ｇ（１．７％）とし、必要に応じて安定剤（グァーガム、カラギーナン等）を２５ｇ（０．３％）添加した（製造総量７４００ｇ）（％は全体に占める重量の割合）。なお、必要に応じて牛乳分をヨーグルトに置き換えることも可能であり、この場合ヨーグルトの占める割合は最大７０％程度となる。

実施例３
３−１実験動物由来免疫細胞を用いたＩｇＡ抗体産生能の検討
発酵産物の付加価値を高めるには、ヨーグルトに高い健康機能性が付与される必要がある。そこで、ラクトバチルス・プランタラムＡＮＰ７−１の菌体を、上記の１０％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳および１０％（ｗ／ｖ）スクロースを含有する細胞保護液と混合し（細胞保護液ｍｌ：菌体湿重量ｇ＝２：１）凍結乾燥した試料について、マウスのパイエル板由来免疫細胞に対するＩｇＡ抗体の産生誘導試験を実施した。

パイエル板をマウス腸管より分離し、免疫細胞を採取したのちに乳酸菌体と混合し、腸管免疫の活性指標となるＩｇＡ抗体の分泌産生が向上したか否かをＥＬＩＳＡ法により確認した。ＥＬＩＳＡ法は、抗ＩｇＡ抗体を固定化したプレートにＩｇＡを結合させ、検出する手法（Matsuzaki et al. (2013) J. Appl. Microbiol. (doi: 10.1111/jam.12411)）に準じて行った。細胞保護液のみの凍結乾燥物をネガティブコントロール試験区として設け、免疫活性化能を有することが知られているグラム陰性細菌由来リポ多糖画分（ＬＰＳ）をポジティブコントロール試験区として設けた。バックグラウンドのＩｇＡ産生（ブランク）は、生理食塩水のみの添加区とした。

結果を図６に示した。図６から明らかなように、ラクトバチルス・プランタラムＡＮＰ７−１菌体を含有する試験区において、ポジティブコントロールであるＬＰＳよりもＩｇＡ産生誘導が強いことが確認され、ＡＮＰ７−１菌体は免疫活性向上能を持つことが明らかとなった。特に、乳由来成分である脱脂粉乳との混合状態でＩｇＡ産生誘導活性が認められたことから、ＡＮＰ７−１を種菌として製造したヨーグルトは免疫活性化能が付与されていると考えられた。

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

微生物の表示
識別の表示：ＡＮＰ７−１
受託番号：ＮＩＴＥＰ−１２２４
受託日
２０１２年２月３日
寄託機関
名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
住所：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２２号室

Claims

あじなれずし、ぶりなれずし、さばなれずし、かぶらずし、大根ずし、いか麹漬け、およびいか黒造りからなる群より選択される少なくとも１種の水産発酵食品に由来する乳酸菌をスターターとして用いる腸管免疫活性化用ヨーグルトの製造方法であって、乳酸菌がラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＡＮＰ７−１（受託番号：ＮＩＴＥＰ−１２２４）であることを特徴とする製造方法。
乳酸菌が牛乳または脱脂粉乳を保護剤として凍結乾燥保存または凍結保存した乳酸菌であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
ブルーベリー果汁をヨーグルト原料または発酵後のヨーグルトに添加することを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
酒粕を含有するヨーグルト原料を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。