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JP6261621B2 - アルファ−シヌクレイン抗体及びその使用 - Google Patents

アルファ−シヌクレイン抗体及びその使用 Download PDF

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Description

本発明は、α−シヌクレイン凝集物（例：アミロイドのフィブリル（fibril）、プロトフィブリル（protofibril）及びオリゴマー）に対する高親和性とα−シヌクレインモノマーに対する低親和性とを有する抗体又はそのフラグメントに関する。本発明は、また、α−シヌクレインに関係する神経病理学の診断、治療及び予防におけるこれらの抗体及びフラグメントの使用に関する。
シヌクレインは、神経組織において高レベルで表現される１４ｋＤａの小タンパク質のファミリーである。ファミリーのうちの３つのメンバーは、α−，β−，及びγ−のシヌクレインである。
α−シヌクレインは、主に脳組織に発現し、主に神経のシナプス前終末に位置する。α−シヌクレインのヒト形態の主要構造は、１４０アミノ酸ポリペプチドから成る。ヒトのα−シヌクレインの野生型の配列は図２０（配列番号：４９）に見出すことができる。α−シヌクレインは、通常、可溶性モノマータンパク質として存在するが、その環境に関係して幾つかの折り重なった確認（confirmations）を採ることができる。モノマーのα−シヌクレインは、また、凝集して、オリゴマー及び高分子量不溶性フィブリルになることができる。
シヌクレインの異常性に関係する病気は、しばしばシヌクレイン病（synucleinopathies）として参照付けられる。シヌクレイン病は、神経変性疾患の病態、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）を含む。シヌクレイン病では、ＰＤ及びＤＬＢの脳ホモジネートの可溶性α−シヌクレインオリゴマーが正常の脳に比して上昇することが示されている。さらに、しばしばＰＤ及びＤＬＢの最終段階を特徴付ける腫瘍性病変（neuropathologic lesions）（レビー小体）は、フィブリルのα−シヌクレインの沈着物からなることが広く判明している。
商業的に使用されているα−シヌクレイン抗体が、知られており、脳のＰＤ病理を特徴付けることに広く使用されている。しかし、そのような抗体は、非特異性であり（non-specific）、α−シヌクレインのモノマー形態及び凝集形態を共に認識しない。そして、α−シヌクレインのすべての凝集形態を認識しないかもしれない。
Ｓｙｎ−１（ＢＤバイサイエンス（BD Biosciences）社製）及びｍＡｂ ２１１（サンタ クルツ バイオテクノジィ（Santa Cruz Biotechnology）社製）を含んでいる。知られているα−シヌクレイン抗体は、α−シヌクレインのモノマー及び凝集形態に等しく結合することが知られている。
国際公開ＷＯ２０１１／１０４６９６号公報は、α−シヌクレインのプロトフィブリル形態を特異的に認識する抗体を開示する。これらの抗体は、α−シヌクレインのフィブリルとモノマーとに低結合親和性（low binding affinity）を示す。
本発明は、α−シヌクレイン凝集物に対する高結合親和性とα−シヌクレインのモノマー形態に対する低結合親和性とを有する抗体及びフラグメントを目指している。
本発明は、また、そのような抗体又はそのフラグメントを備える組成と、該抗体又はフラグメントを使って、α−シヌクレインの凝集物の存在を検出する方法、及びα−シヌクレインに関係する病気の診断でのそれらの使用とを目指している。
さらなる実施形態では、本発明は、そのような抗体又はそのフラグメントを備える組成と、該抗体又はフラグメントを使って、α−シヌクレインの病理学に関係する病気を治療又は診断する方法とを目指している。
α−シヌクレイン凝集物に対する特異性のある抗体を用いることは、ＰＤ及び他のシヌクレイン病の新規な病理学を現出させる助けとすることができる。
α−シヌクレインの凝集物に特異性がありかつα−シヌクレインのモノマーに対して低結合親和性を有する抗体を生産することによって、本発明は、α−シヌクレインに関係する神経変性疾患の進行を追尾する新規のツールを提供する。本発明の抗体は、また、α−シヌクレインに関係する病気の治療に使用することができる抗体を提供する。
α−シヌクレインのフィブリルに免疫のある宿主（宿主１９，２２及び２３）及びα−シヌクレインのオリゴマーに免疫のある宿主（宿主２１０，２１１及び２１２）とに対する力価検査の結果を示し、例１で説明される図。力価検査の結果を示し、例１で説明される図。 α−シヌクレイン凝集物（フィブリル（Ｆ）、オリゴマー（Ｏ）及びモノマー（Ｍ））に対する雑種細胞の特異性をスクリーニングしたドットプロットの結果を示し、例２で説明される図。 抗体Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３及びＳｙｎ−０４、並びにＳｙｎ−１（BD Bioscience）の抗体をコントロールとして用いて抑制ＥＬＩＳＡの結果を示し、例４で説明される図。 異なるタンパク質で形成されたアミロイドフィブリルに対する抗体Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，及びＳｙｎ−０４、並びに抗体Ｓｙｎ−１の交差反応性を示し、例５（Ａ）で説明される図。 β−シヌクレイン及びγ−シヌクレインによって形成されたアミロイドフィブリルに対する抗体Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，及びＳｙｎ−０４の抗体、並びにＳｙｎ−１の抗体の交差反応性を示し、例５（Ｂ）で説明される図。 α−シヌクレインのペプチドＮＡＣ（６１−９８），ＮＡＣ（６１−７５），及び切断されたα−シヌクレイン（１−１２２）に対する抗体Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，及びＳｙｎ−０４の抗体、並びに抗体Ｓｙｎ−１の交差反応性を示し、例５（Ｃ）で説明される図。 Biacore（商標）を使ってのｍＡｂのＳｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，Ｓｙｎ−０４，Ｓｙｎ−０３，Ｓｙｎ−０４及びｍＡｂ２１１（Santa Cruz Biotechnology社製）についてのセンサーグラムの結果を示し、例６で説明される図。についてのセンサーグラムの結果を示し、例６で説明される図。 ｍＡｂのＳｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，及びＳｙｎ−０４、並びにＳｙｎ−１の抗体（コントロールとしての抗体）についてのペプスカン（社名Pepscan）結果を、エピトープ決定のドットプロットにより示し、例７で説明される図。 ＥＬＩＳＡによるペプスカン結果を示し、例７で説明され、プレートが本発明Ａ）Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｂ）Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｃ）Ｓｙｎ−０１，Ｄ）Ｓｙｎ−０２，Ｅ）Ｓｙｎ−０３及びＦ）Ｓｙｎ−０４、並びにプレートがコントロール抗体Ｇ），Ｓｙｎ２１１，Ｈ）Ｎ−１９，Ｉ）ＦＬ−１，Ｊ）Ｓｙｎ−１，抗体Ｋ）３Ｂ６及びＬ）５Ｃ２により調べられている図。 ペプスカンＥＬＩＳＡのプレート上に置かれたのＸ線フィルムのプロットを示し、例７で説明され、コントロール抗体Ｎ−１９，ＦＬ−１４０，５Ｃ２，Ｓｙｎ−１，Ｓｙｎ−２１１，３Ｂ６のプロットは図１０のＡに示され、本発明の抗体Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，及びＳｙｎ−０４は、図１０のＢに示されている図。 α−シヌクレイン凝集物の検出についてのサンドイッチ法のＥＬＩＳＡの結果を示し、例８で説明され、抗体Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，及びＳｙｎ−０４、並びにＳｙｎ−１の抗体が捕獲抗体として使用され、ＦＬ−１４０が検出抗体として使用された図。 リン酸化したＳｅｒ１２９−α−シヌクレイン凝集物の検出についてのサンドイッチ法のＥＬＩＳＡの結果を示し、例９として説明され、抗体Ｓｙｎ−０２及びＳｙｎ−Ｆ２，並びにＳｙｎ−１が捕獲抗体として使用され、ウサギの抗ｐ−Ｓ１２９−α−シヌクレインが検出抗体として使用された図。 パーキンソン病無しの被験者のコントロール症例からの組織の免疫組織化学分析を示し、例１０で説明される図。 パーキンソン病の症例からの組織の免疫組織化学分析を示し、例１０で説明される図。 多系統萎縮症の症例からの組織の免疫組織化学分析を示し、例１０で説明される図。 パーキンソン保持ＰＤ患者（Ａ）、進行性ＤＬＢ患者（Ｂ）及び古典的なＰＤ患者からの組織試料におけるＳｙｎ−０２の染色の結果を示し、例１１で説明される図。 海馬のＣＡ２領域の脳セクション（Ａ）と嗅内皮質に脳セクション（Ｂ）との治療のＳｙｎ−Ｆ２抗体の染色結果を示し、例１２で説明され、各セクションは次の治療：１）前処理無しか、２）クエン酸緩衝における１０分、１２０℃のオートクレーブか、３）１５分間のギ酸におけるオートクレーブか、又は４）２０μｇ／ｍｌのプロテアーゼＫを受け、５）Ｓｙｎ−１抗体をもつコントロールがギ酸により１５分、処置された組織試料上で実施された図。 ＢｉＦＣ蛍光分析による穿刺（矢頭）の形成を示す入手写真を示し、例１４で説明される図。 各試験の抗体の斑点陽性細胞の％を示し、例１４で説明される図。 ヒトα−シヌクレインの野生型配列を示す図。
本発明は、α−シヌクレイン凝集物に対する高い結合親和性とα−シヌクレインモノマーに対する低い結合親和性とを有する抗体に関する。抗体は、モノマーのα−シヌクレイン形態に比してα−シヌクレイン凝集物に結合する親和性を増大されている。
１つの実施形態では、本発明は、α−シヌクレイン凝集物に対する高い結合親和性と、α−シヌクレインモノマーに対する低い結合親和性とを有する抗体又はそのフラグメントに関する。
別記しない限り、術語のα−シヌクレイン凝集物は、α−シヌクレインの早期可溶性の凝集物形態（例えば、プロトフィブリルを含む低分子量及び高分子量の可溶性オリゴマー）、及びα−シヌクレインの成熟した不溶性の凝集物形態（例えば成熟したフィブリル）をカバーすると、意図される。特に、抗体及びそのフラグメントは、α−シヌクレインのフィブリルに対する高結合親和性とα−シヌクレインのオリゴマーに対する高結合親和性とを有する。
α−シヌクレイン凝集物に対する高親和性を有することは、抗体又はフラグメントが、α−シヌクレイン凝集物に対して１０−７Ｍより小さい解離定数Ｋｄを有することを意味する。好ましくは、抗体は、１０−８Ｍより小さいか若しくは１０−９Ｍより小さいＫｄを有し、又はさらに好ましくは、１０−１０Ｍより小さいか又は１０−１１Ｍより小さいＫｄを有する。好ましくは、α−シヌクレインは、ヒトのα−シヌクレインである。
フィブリルは、α−シヌクレインの不溶性の高分子量の凝集物形態である。
α−シヌクレインの可溶性のオリゴマー形態は、種々のサイズでかつ形態で現れ、二量体、三量体、四量体及び多量体を含む。プロトフィブリルは、モノマー形態からα−シヌクレインフィブリルの形成途中の中間段階である。術語としてのα−シヌクレインのオリゴマー形態は、プロトフィブリルを含むことを意図される。
抗体に対するそのフラグメントとは、その活性フラグメント、すなわち、本発明による抗体の定義に使用される特徴と同一特徴を有するフラグメントを意味する。すなわち、α−シヌクレイン凝集物に対する高結合親和性と、α−シヌクレインモノマーに対する低結合親和性とを有すると言う特徴である。便宜上、術語としての抗体を使用するときは、該同一特徴を示すそのフラグメントも、考慮される。
α−シヌクレインモノマーに対する低結合親和性を有することは、α−シヌクレインモノマーに対する抗体又はフラグメントの結合度が、α−シヌクレイン凝集物に対する結合度より少なくとも１００倍小さく、好ましくは、α−シヌクレイン凝集物に比較してα−シヌクレインモノマーに対して約５００倍又は約１０００倍、低い結合親和性であることを意味する。１つの実施形態では、抗体又はそのフラグメントはモノマーのα−シヌクレインに対して１０−５Ｍより大きい解離定数Ｋｄを有する。
１つの実施形態では、抗体は、α−シヌクレインのオリゴマー形態に対してよりもα−シヌクレインのフィブリルに対して高い親和性を有してもよい。
抗体の結合親和性は、当該技術で認識されている種々の方法を使って決めることができる。該方法は、等温熱量及び表面プラズモン共鳴法を基本とするアプローチを含み、例えば、図６で説明する。結合（binding）は、例えばＥＬＩＳＡやＲＩＡｓのような免疫測定法（immunoassays：イノムアッセイ）を用いて評価することもできる。好ましくは、結合親和性は、ＢＩＡＣｏｒｅＴＭＸ−１００を用いた表面プラズモン共鳴法のアッセイを用いて決められる。
１つの実施形態では、抗体は、立体構造の抗体である。抗体は、立体構造のエピトープを認識する。すまわち、抗体が認識する該エピトープは、α−シヌクレインの凝集物の三次構造を含む。１つの実施形態では、抗体は、表５に記載されているように、直鎖ペプチドエピトープのどれよりもα−シヌクレインフィブリルに強く結合する。特に、抗体の結合度は、表５に記載されているように、直鎖ペプチドエピトープに対してよりもα−シヌクレインフィブリルに対しての方が少なくとも１０倍高く、好ましくは５００倍より高いか、又は好ましくは１０００倍より高い。
本発明の抗体は、α−シヌクレインのアミノ酸領域の１２７−１４０の範囲内の直鎖エピトープに弱く結合してもよい。弱く結合することによってとは、本発明の抗体の結合親和性が、α−シヌクレインのアミノ酸領域の１２７−１４０の範囲内の直鎖エピトープに対して、α−シヌクレイン凝集物に対する抗体の結合親和性よりも、少なくとも１００倍小さいこと、特には、α−シヌクレインフィブリルよりも少なくとも１００倍小さいことを意味する。好ましくは、α−シヌクレインのアミノ酸領域１２７−１４０の範囲の直鎖エピトープに対する結合親和性は、α−シヌクレイン凝集物に対する抗体の結合親和性にして、α−シヌクレイン凝集物に対する抗体の結合親和性より１０００倍小さい。１つの実施形態では、抗体は、α−シヌクレインの直鎖エピトープを認識しないか、結合しない。
１つの実施形態では、抗体によって認識されるエピトープは、α−シヌクレインのＣ末端領域を備える。α−シヌクレインのＣ末端領域を備えるエピトープを認識することによってとは、抗体がその能力で結合するエピトープの少なくとも一部がα−シヌクレインのＣ末端領域の少なくとも一部を含むことを意味する。
１つの実施形態では、本発明の抗体は、リン酸化したα−シヌクレインの凝集した形態にも結合できる。該抗体は、リン酸化されたα−シヌクレインの凝集形態に比較して、リン酸化されたα−シヌクレインのモノマー形態に対して低結合親和性を示す。例えば、該抗体の結合親和性は、凝集されてリン酸化されたα−シヌクレインに比較して、モノマーのリン酸化されたα−シヌクレイン形態に対して少なくとも１００倍小さく、好ましくは５００倍小さく、もっと好ましくは１０００倍小さい。α−シヌクレインのリン酸化は、Ｓｅｒ１２９に起こすことができる。
本発明の抗体は、また、他のアミロイドのタンパク質に対して低結合親和性を示す。該他のアミロイドのタンパク質には、β−シヌクレイン、γ−シヌクレインのモノマー、ＩＡＰＰ（islet amyloid polypeptide：膵島アミロイドポリペプチド）、β−アミロイドモノマー、Ｔａｕ及びＡＢｒｉが含まれる。例えば、該抗体の結合親和性は、α−シヌクレイン凝集物に対してよりも、これらのペプチド／タンパク質の１つ又はそれより多くに対しての方が少なくとも１００倍小さい。
１つの実施形態では、本発明のα−シヌクレイン凝集物の抗体の結合親和性は、α−シヌクレイン凝集物に対してよりもβ−シヌクレインに対して少なくとも１００倍小さく、好ましくは１０００倍小さい。特に、該抗体の結合親和性は、α−シヌクレインのフィブリルに対する結合親和性よりも、β−シヌクレインに対して、少なくとも１００倍、好ましくは１０００倍小さい。
１つの実施形態では、本発明のα−シヌクレイン凝集物の抗体の結合親和性は、α−シヌクレイン凝集物に対してよりもγ−シヌクレインに対して少なくとも１００倍小さく、好ましくは１０００倍小さい。特に、該抗体の結合親和性は、α−シヌクレインフィブリルに対する結合親和性よりも、γ−シヌクレインに対して、少なくとも１００倍、好ましくは１０００倍小さい。
本発明のさらなる実施形態は、可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖上のＣＤＲＩ−３領域の定義されたアミノ酸配列を備える。
本発明の１つの実施形態では、抗体は、可変重鎖（ＶＨ）を備え、該ＶＨは、配列番号（SEQ ID NO）２，６又は１０において示されるアミノ酸配列を備える。
抗体又はフラグメントは、免疫グロビン の軽鎖の可変領域（ＶＬ）を備えることができる。該ＶＬは、配列番号４，８，又は１２において示されるアミノ酸配列を備える。
特に、抗体又はフラグメントは、免疫グロビンの重鎖の可変領域（ＶＨ）と免疫グロビン の軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを備え、：
該ＶＨが配列番号２において示されるアミノ酸配列を備え、該ＶＬが配列番号４において示されるアミノ酸配列を備えるか；
該ＶＨが配列番号６において示されるアミノ酸配列を備え、該ＶＬが配列番号８において示されるアミノ酸配列を備えるか；又は
該ＶＨが配列番号１０において示されるアミノ酸配列を備え、該ＶＬがは配列番号１２において示されるアミノ酸配列を備える。
１つの実施形態では、抗体又はそのフラグメントは、ＶＨ鎖を備えることができ、該ＶＨ鎖において：
ＣＤＲ１領域は、配列番号１６，２８，又は４０のアミノ酸配列を有し、；
ＣＤＲ２領域は、配列番号１７，２９，又は４１のアミノ酸配列を有し、；かつ、
ＣＤＲ３領域は、配列番号１８，３０，又は４２のアミノ酸配列を有する。
特には、抗体又はその結合フラグメントは、ＶＨ鎖を備え、該ＶＨ鎖において、ＣＤＲ１領域は配列番号１６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域は配列番号１７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域は配列番号１８のアミノ酸配列を有する。
特には、抗体又はその結合フラグメントは、ＶＨ鎖を備え、該ＶＨ鎖において、ＣＤＲ１領域は配列番号２８のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域は配列番号２９のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域は配列番号３０のアミノ酸配列を有する。
特には、抗体又はその結合フラグメントは、ＶＨ鎖を備え、該ＶＨ鎖において、ＣＤＲ１領域は配列番号４０のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域は配列番号４１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域は配列番号４２のアミノ酸配列を有する。
さらなる実施形態では、抗体又はそのフラグメントは、ＶＬ鎖を備え、該ＶＬ鎖において：
ＣＤＲ１領域は、配列番号２２，３４，又は４６のアミノ酸配列を有し、；
ＣＤＲ２領域は、配列番号２３，３５，又は４７のアミノ酸配列を有し、；かつ
ＣＤＲ３領域は、配列番号２４，３６，又は４８のアミノ酸配列を有している。
特には、抗体又はそのフラグメントは、ＶＬ鎖を備え、該ＶＬ鎖において、ＣＤＲ１領域は配列番号２２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域は配列番号２３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域は配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
特には、抗体又はそのフラグメントは、ＶＬ鎖を備え、該ＶＬ鎖において、ＣＤＲ１領域は配列番号３４のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域は配列番号３５のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域は配列番号３６のアミノ酸配列を有する。
特には、抗体又はそのフラグメントは、ＶＬ鎖を備え、該ＶＬ鎖において、ＣＤＲ１領域は配列番号４６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域は配列番号４７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域は配列番号４８のアミノ酸配列を有する。
１つの実施形態では、抗体又はそのフラグメントはＶＨ鎖とＶＬ鎖とを備え、：
該ＶＨ鎖において、ＣＤＲ１領域は配列番号１６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域は配列番号１７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域は配列番号１８のアミノ酸配列を有し、 ；かつ
該ＶＬ鎖において、ＣＤＲ１領域は配列番号２２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域は配列番号２３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域は配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
特には、抗体又はその結合フラグメントはＶＨ鎖とＶＬ鎖とを備え、：
該ＶＨ鎖において、ＣＤＲ１領域は配列番号２８のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域は配列番号２９のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域は配列番号３０のアミノ酸配列を有し、；かつ
該ＶＬ鎖において、ＣＤＲ１領域は配列番号３４のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域は配列番号３５のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域は配列番号３６のアミノ酸配列を有する。
特には、抗体又はその結合フラグメントはＶＨ鎖とＶＬ鎖とを備え、：
該ＶＨ鎖において、ＣＤＲ１領域は配列番号４０のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域は配列番号４１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域は配列番号４２のアミノ酸配列を有し、；かつ
該ＶＬ鎖において、ＣＤＲ１領域は配列番号４６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域は配列番号４７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域は配列番号４８のアミノ酸配列を有する。
したがって、１つの実施形態では、本発明による抗体又は結合フラグメントは、６つのＣＤＲ配列（ＶＨ−ＣＤＲ１，ＶＨ−ＣＤＲ２，ＶＨ−ＣＤＲ３，ＶＬ−ＣＤＲ１，ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３）によって特徴付けられる。該６つのＣＤＲ配列は、表Ａにおける次のそれぞれの複数群のうちの各群から任意の組合せで独立に選択される。
さらに、単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントであって、ヒトのα−シヌクレインに特異的に結合するフラグメントが提供される。該抗体又は該フラグメントはＶＨとＶＬとを備え、該ＶＬは、配列番号２又は６又は１０に少なくとも９０％，９５％又は１００％、同一であるポリペプチド配列を備える。さらに、単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントであって、ヒトのα−シヌクレインに特異的に結合するフラグメントが提供される。該抗体又は該そのフラグメントはＶＨとＶＬとを備え、該ＶＬは、配列番号４又は８又は１２に少なくとも９０％，９５％又は１００％、同一であるポリペプチド配列を備える。
任意の特定のポリペプチドが、他のポリペプチドと少なくとも９０％又は９５％同一であるかは、当該技術において知られているコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて決めることができる。これらの変異ポリペプチドは、対応する親配列を有するポリペプチドと同一の性質を本質的に保持する。そのような変異体は、基準化合物に対して保存的な置換、例えば広義で同一の分子性質のアミノ酸間の変更を有する。例えば、“非本質的な”アミノ酸において保存置換又は変更につながるアミノ酸置換が行われてもよい。アミノ酸置換は、天然起源又は非天然のアミノ酸に１つ又はそれより多くのアミノ酸の置換を含むことができる。保存的な置換は、典型的には次の群のうちの置換：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン及びグルタミン；セリン及びスレオニン；リジン及びアルギニン；並びにフェニルアラニン及びチロシンを含む。
ポリペプチドは、融合してインフレームになるか、又はリンカー若しくは他の配列に抱合されるかしてもよい。ポリペプチドは、例えばα−シヌクレイン抗体又はそのフラグメントをコード化した部分と、少なくとも１つの異種性の部分とを備える融合部分を備えてもよい。
抗体、又はその抗原結合フラグメントをコード化している単離されたポリヌクレオチドが提供される。該ポリヌクレオチドは、例えば、１つ若しくはそれより多くのＣＤＲ、又はここで説明するα−シヌクレイン抗体可変重鎖領域若しくは可変軽鎖領域をコード化している核酸である。核酸はＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
本発明の１つの観点は、ここで説明するα−シヌクレイン抗体のＶＨ鎖をコード化しているポリヌクレオチドを提供する。特には、本発明の１つの実施態様は、単離されたポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドは、配列番号２，６又は１０のアミノ酸をコード化している核酸を備える。さらなる実施態様は、配列番号１，５，又は９の核酸配列を備えるポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別の観点は、α−シヌクレイン抗体のＶＬ鎖をコード化しているポリヌクレオチドを提供する。１つの実施態様では、該ポリヌクレオチドは、配列番号４，８又は１２のアミノ酸配列をコード化している核酸を備える。さらなる実施態様は、配列番号３，７，又は１１の核酸配列を備えるポリヌクレオチドを提供する。
１つの実施態様では、ポリヌクレオチドは、α−シヌクレイン抗体の重鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３の領域をコード化している。該ポリヌクレオチドは、配列番号１３，１４，１５，２５，２６，２７，３７，３８，及び／又は３９の核酸配列を備えることができる。
さらに、α−シヌクレイン抗体の軽鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２，及び／又はＣＤＲ３領域をコード化しているポリヌクレオチドが提供される。該ポリヌクレオチドは、配列番号１９，２０，２１，３１，３２，３３，４３，４４，及び／又は４５の核酸配列を備えることができる。
１つの実施態様では、本発明による抗体又はその結合フラグメントは、６つのＣＤＲ配列（ＶＨ−ＣＤＲ１，ＶＨ−ＣＤＲ２，ＶＨ−ＣＤＲ３，ＶＬ−ＣＤＲ１，ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３）によって特徴付けられる。各領域は、表Ｂからの、ＣＤＲ配列の次のそれぞれの複数群のうちの各群から任意の組合せで独立に選択した配列を有するポリヌクレオチドによってコード化されている。
さらに、ＶＨ−ＣＤＲ１，ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３の領域についての核酸配列を備えるポリヌクレオチドが提供される。各領域は、表Ｂから任意の組合せで、ＶＨ−ＣＤＲの配列のそれぞれの複数群のうちの各群から独立に選択される。
さらに、ＶＬ−ＣＤＲ１，ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３の領域についての核酸配列を備えるポリヌクレオチドが提供される。各領域は、表Ｂから任意の組合せで、ＶＬ−ＣＤＲの配列のそれぞれの複数群の各群から独立に選択される。
さらに、ここで定義されるポリヌクレオチド配列のポリヌクレオチド変異体が提供される。ポリヌクレオチド変異体は、ここで定義されるα−シヌクレイン抗体又はフラグメントをコード化しているポリヌクレオチド配列に実質的な同一性（identity）を有していてもよい。典型的には、ポリヌクレオチド変異体は、１つ又はそれより多くの置換、付加、削除及び／又は挿入を含むだろう。これらの置換等は、好ましくは、変異体のポリヌクレオチドによってコード化された抗体の結合親和性が実質的にここで明細に説明されるポリヌクレオチド配列によってコード化されている抗体に対して実質的に減らないように、される。例えば、コード化されたポリペプチドにおける非本質的なアミノ酸の残基において保存的な置換又は変更につながるヌクレオチド置換がなされてもよい。任意の特別のポリヌクレオチドが他のものに実質的に同一であるかは、当該技術において知られている方法、コンピュータのプログラム／ソフトウェアを用いて決めることができる。
軽鎖及び／又は重鎖の少なくとも可変ドメインをコード化しているポリヌクレオチドは、２つ又は唯一の免疫グロビン鎖の可変ドメインをコード化することができる。１つの実施態様は、ポリヌクレオチドを備える発現ベクターを提供する。
さらなる実施態様は、発現ベクターを備える宿主細胞に関する。好ましくは、宿主細胞は単離されている。１つの実施態様では、宿主細胞は、非ヒトの細胞である。発現ベクターは、挿入されたポリヌクレオチドを指示（direct）及び／又はコントロールする核酸配列を備えることができる。そのような核酸配列は制御配列（regulatory sequence）を含むことができる。該制御配列は、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化、配列、及びエンハンサー配列を含む。種々の細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現は知られている。
本発明による抗体の例は、伝統的な雑種細胞技術によって開発されている。抗体は、多クローンであるか、又は単クローンである。明細な実施形態では、抗体は単クローンである。
典型的には、抗体は、哺乳類の抗体、例えば霊長目の動物、ヒト、齧歯動物、ウサギ、ヒツジ、ブタ、又はウマの抗体である。抗体は、任意のクラス又はアイソタイプ、例えばＩｇＭ又はＩｇＧであり得る。好ましくは、抗体はＩｇＧである。
本発明の別の観点では、抗体は試料においてα−シヌクレイン凝集物の存在を検出する診断ツールとして用いることができる。抗体は。個体（individual）におけるα−シヌクレインに関係する神経変性疾患を監視及び／又は診断するのに用いられてもよい。
これらの抗体は、α−シヌクレインに関係する神経変性疾患の診断ツールとして適切であってもよい。該神経変性疾患には、限定しないが、パーキンソン病、レビー小体型認知症及びその他のα−シヌクレイン関係の神経変性疾患を含む。
１つの実施態様では、本発明は、α−シヌクレイン凝集物を検出する方法に関し、該方法は、：
抗体又はそのフラグメントを生物学試料に付加するステップ、；及び
α−シヌクレイン凝集物と抗体又はフラグメントとの間で形成される複合体の存在を検出するステップを備える。
複合体の検出は、該試料におけるα−シヌクレイン凝集物の存在を指し示す。
該方法は、さらに、形成された複合体のレベルを測定して、該レベルを基準レベルと比較するステップを備えることができる。該基準レベルは、典型的には、α−シヌクレイン症状を有しないと知られている個体（“正常な個体”）からの試料、又は試験される固体と同一の個体から早い段階の試験で得られた試料から計算される。
該方法は、α−シヌクレインのフィブリル及びオリゴマーを検出することができる。
該方法は、試験管内で組織の又は生物学流体の試料上で実施されることができる。個体から得られて試験される試料は、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、尿、唾液、又は脳、腸、大腸、皮膚若しくは唾液腺の組織であってもよい。特に好ましい方法では、試料はＣＳＦ試料である。別の好ましい方法では、該試料は、脳組織の試料である。
試料は、所定時間でかつ所定条件下で抗体と結合され、有効に試料内でのα−シヌクレイン凝集物に対する結合性を許容される。
試料は、測定される前に標準の方法を用いて処理されてもよい。１つの実施形態では、組織の試料は、抗体で試験する前に、前処理無しとされる。前処理とは、得られる組織が例えばオートクレーブ（高圧蒸気殺菌）、ギ酸及び／又はプロテイナーゼＫ処理のような任意の処理を受けないことを意味する。
当該技術において知られている標準の方法は、試料において抗体とα−シヌクレイン凝集物との間に形成された複合体のレベルを検出及び／又は測定することに用いられてもよい。
α−シヌクレインの存在の分析は、例えば次の方法で実施することができる。放射免疫測定法、酵素に関係する免疫測定（ELISA ：Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）、サンドイッチ免疫測定法（sandwich immunoassay）、蛍光免疫法、沈降反応、ゲル免疫アッセイ、凝集アッセイ、プロテインＡアッセイ、免疫電気泳動法（immunoelectrophoresis）、電気泳動法（electrophoresis）、ウエスタンブロット法である。試験する試料におけるα−シヌクレインの存在を測定及び／又は検出することができる他の適切な技術を用いることができる。
１つの実施形態では、抗体は、表面上、例えばマイクロウェルプレート又は診断試験ストリップを被覆されてもよく、試料は、抗体に付加され、結合を許容するのに有効な状況下に結合される。その次に、複合体の存在が検出できる。
好ましい方法では、ＥＬＩＳＡアッセイ（測定）は、α−シヌクレイン凝集物の量を検出及び／又は定量化する。１つの実施形態では、本発明は、サンドイッチＥＬＩＳＡに目指される。該サンドイッチＥＬＩＳＡは、マイクロプレートの表面が本発明による抗体により被覆された該マイクロプレートに、試験される試料を付加し、；該抗体に結合する試料における任意のα−シヌクレイン凝集物試料の存在を許容し、；かつ任意の抗体／α−シヌクレインの凝集物複合体の存在を検出することを備える。検出は、α−シヌクレインに結合する標識抗体を用いて実施することができる。
該方法は、神経変性疾患の診断及び／又は神経変性疾患の進行の監視に用いることができる。α−シヌクレイン凝集物の量及び／又はサイズが検出できる。
該神経変性疾患は、限定されないが、パーキンソン病、認知症（dementia）、アルツハイマー病、ダウン症候群、多系統萎縮症、精神病（psychosis）、統合失調症（schizophrenia）又はクロイツフェルト・ヤコブ病（Creutzfeldt-Jakob disease）を含む。認知症は、レビー小体型認知症であってもよい。
本発明は、α−シヌクレインに関係する神経変性疾患を診断する方法に関する。該方法は、本発明の抗体を個体に投与すること、及びα−シヌクレイン凝集物の存在又は非存在を検出することを備える。α−シヌクレイン凝集物と抗体との間に形成された複合体の存在又は非存在が検出できる。
α−シヌクレイン凝集物の存在は、個体が神経変性疾患を有すること指し示し、α−シヌクレイン凝集物の非存在は、該被験者（個体）が神経変性疾患を有しないこと指し示す。
１つの実施形態では、α−シヌクレインに関係する神経変性疾患を診断する方法は、：本発明の抗体を個体からの試料に付加すること、；α−シヌクレイン凝集物と抗体との間に形成された複合体の存在を検出すること、；及び個体がα−シヌクレインに関係する神経変性疾患を有するか否かを決定することを備える。
個体がα−シヌクレインに関係する神経変性疾患を有するか否かを決定することは、試料に形成された複合体のレベルを基準レベルと比較すること、及び該試料に形成された複合体のレベルが基準レベルに対して減少しているかを決定することを含む。
該方法は、さらに、神経変性疾患を治療するのに治療法上有効な量の薬を個体に投与することを備える。
さらなる実施形態では、α−シヌクレインに関係する神経変性疾患の進行を監視する方法は、：本発明の抗体を個体からの試料に付加すること、：α−シヌクレイン凝集物と抗体との間に形成された複合体の存在を検出すること、；及び試料に形成された複合体のレベルを基準レベルと比較することを備える。
該方法は、さらに、基準レベルに対する複合体の検出レベルの比較に基づいて個体の治療管理体制（treatment regime）を変更することを備える。該治療管理体制は、該病気の進行に関係して、該病気を治療するのに投与された薬を変更することによって、及び／又は薬の投与の頻度及び／又は量を変更することによって、変更することができる。ベースラインのレベルに比較される複合体の増大レベルは、個体がα−シヌクレイン症状を進める（develop）過程を有するか又は過程にあるかを典型的には指し示す。ベースラインレベルは、α−シヌクレイン症状を有しないことが知られている個体（“正常な個体”）からの試料からか又は試験される固体と同一の個体から早い段階の試験で得られた試料から典型的には計算される。
相関が、ＣＳＦのα−シヌクレインオリゴマーレベルと疾患重症度との間に存在することが示されている。試料のオリゴマー又はフィブリルの存在及び／又は量を検出することは、特に、パーキンソン病及びその他のα−シヌクレイン症状に関係する病気のバイオマーカーとして抗体を用いることにより、神経変性疾患の進行及び／又は重症度を追尾することに使用できる。
本発明の１つの実施形態では、抗体は、個体がパーキンソン病を有するかを診断することに用いられる。ＣＳＦ試料は、患者から採取される。抗体は、複合体が抗体と試料に存在する凝集されたα−シヌクレインとの間に形成されることを許容するのに有効な条件で試料と接触する。次に、抗体複合体の存在が検出できる。形成される複合体の量が、測定されて、基準レベルと比較される。
本発明の１つの実施形態では、抗体は、ＥＬＩＳＡに用いられて、ＣＦＳにおける凝集されたα−シヌクレインを測定することができる。抗体は、試料内の凝集されたα−シヌクレインを他の抗体を使うＥＬＩＳＡに比較して高い感度と特異性で測定することができる。特に、本発明の抗体を使用するＥＬＩＳＡは、ｍＡｂ２１１を捕獲抗体としてかつビオチン化２１１を検出抗体として使用するＥＬＩＳＡに比較して、α−シヌクレインのオリゴマー及びプロトフィブリルを検出する感度及び特異性を高める。
該方法は、分析の結果を用いることにより治療薬の有効性を監視することに用いることができる。有効な治療薬は、基準値に比較して、採取された試料に存在するα−シヌクレイン凝集物の減少を引き起こす薬として決めることができる。該基準値は、治療前に患者のα−シヌクレインの量を反映するか、未治療の患者に見い出されたα−シヌクレインの典型量を表すかもしれない。
抗体は、検出可能な標識（label）によって標識化されてもよい。標識は、抗体がα−シヌクレイン凝集物に結合されたときに抗体の検出を許容する標識となる。検出可能な標識は、限定しないが、蛍光標識、放射性標識及び造影剤を含む。
適切な放射標識は、例えばＦ１８，１１２３，Ｉｎ１１１，１１３１，Ｃ１４，Ｈ３，Ｔｃ９９ｍ，Ｐ３２，１１２５及びガリウム６８のようなものを含む。適切な蛍光標識は、蛍光及びローダミンを含むことができる。適切な造影剤は、例えばガドリニウム（ＧＤ）、ジスプロシウム及び鉄のようなレアアース、並びに磁性剤を含む。他の標識は、核磁気共嗚活性標識、ＰＥＴスキャナにより検出可能なポジトロン放出アイソトープ、化学発光の及び酵素のマーカーを含む。
抗体は、標準技術により標識化することができる。
本発明の別の観点において、抗体は、イメージング剤として用いることができる。特に、抗体は、ヒト及び動物の組織におけるα−シヌクレイン凝集物の検出と局在性及び／又は定量化とに使用することができる。
本発明は、α−シヌクレイン凝集物をイメージングする方法を提供する。該方法は、抗体へのα−シヌクレイン凝集物の結合を検出することをを備える。
１つの実施形態では、本発明の抗体は、試料に接触でき、次に、α−シヌクレイン凝集物に結合する試料における抗体が検出され得る。抗体は、好ましくは、標識化された抗体である。α−シヌクレイン凝集物の存在又は非存在は、適切なイメージング技術を用いて体内の脳で検出されてもよい。そのような体内方法において、該方法は、さらに、抗体を個体に投与すること、および抗体を検出することを備える。
適切なイメージング技術は、ポジトロン放出技術（ＰＥＴ）、ガンマシンチグラフィー、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、機能的磁気共鳴画像法（ＦＭＲＩ）、脳磁気図検査（ＭＥＧ）及び単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を含む。
α−シヌクレイン凝集物の存在又は非存在は、また、試験管内、例えば脳セクションのような組織試料において検出することができる。そのような実施形態では、適切なイメージング技術は、また、電子顕微鏡、共焦点顕微鏡又は光学顕微鏡を含んでもよい。
個体の脳に存在するα−シヌクレイン凝集物の個数及び／又はサイズは、病気に関係するα−シヌクレインの進行と相関関係がある。α−シヌクレイン凝集物の数及び／又はサイズの増大は、病気の進行を指し示し、α−シヌクレイン凝集物のサイズ又は個数の減少は、病気の退縮を指し示す。
該診断方法は、獣医学の使用も可能である。
本発明はキットにも関係する。該キットは、本発明による抗体を診断方法の実施用に備える。抗体は、インタクト（intact）の免疫グロビン又はそのフラグメント、例えばＦａｂ，Ｆ（ａｂ）２又はＦｖフラグメントのようなフラグメントであってもよい。抗体は、上述したように標識化されてもよい。該キットは、個体が神経変性疾患を有するかを決定する方法の使用用であり得る。
該キットは、該方法のどれもが実施できる１つ又はそれより多くの他の試薬又は器具を付加的に備えてもよい。そのような試薬又は器具は、限定はしないが、次の１又はそれより多くを含む。適切な緩衝液、個体から試料を得る手段、定量的反応がなされ得るウェルを備える支持体である。該キットは、上記の方法を実施する器具をオプションで備えてもよい。
本発明の１つの実施形態では、抗体及びそのフラグメントは、薬物として使用することができる。
本発明は、個体のα−シヌクレインに関係する神経変性疾患の治療に使用するための抗体又はそのフラグメントに関する。
本発明は、個体のα−シヌクレイン症状をもつ神経変性疾患を治療する方法に関する。該方法は、抗体又はそのフラグメントの治療上の有効量を個体に投与することを備える。
該神経変性疾患は、限定しないが、パーキンソン病、認知症、アルツハイマー病、ダウン症候群、多系統萎縮症、精神病、統合失調症又はクロイツフェルト・ヤコブ病である。認知症は、レビー小体型認知症であってもよい。
α−シヌクレイン凝集物は、抗体又はそのフラグメントの投与によって減少又は抑制され得る。抗体は、溶解可能なシヌクレインの種（species）を備える試料に投与されるか、又は個体に直接投与されてもよい。
抗体は、α−シヌクレイン凝集物の沈着物の部位に、例えばレビー小体に投与されてよく、投与は、典型的には脳に血を供給する血管に又は脳それ自体に注入することによって行われる。
個体は、ヒト又はヒトではない動物であってもよい。ここで述べる組成及び方法は、また、獣医学の実用に使用することができる。
用語の“治療（treatment）”及び“処置する（treating）”等は、状況（condition）の治療（curing）、解放（relieving）、逆転（reversing）、軽減（alleviating）、 管理（managing）又は発症（onset）の遅延（delaying the onset）を含むこと、又は状況の発症（developing）若しくは悪化（worsening）のリスクを減少させることを意図されている。該用語は、また、状況の対症（palliative）、予防（prophylactic）及び防止（preventative）の治療を含めることを意図されている。
本発明の１つの実施態様では、医薬組成物は、抗体又はそのフラグメント、及び医薬的に容認される希釈剤（diluent）又はキャリア（carrier）を備える。
一般的には、該キャリアの性質は、採用される投与の特定のモードに関係するだろう。医薬形態は、固体、溶液及び懸濁液を含む。適切な医薬キャリアは、不活性の希釈剤又は賦形剤（filler）、水、及び種々の有機溶剤を含む。組成物は、また、香料、結合剤＆賦形剤（xcipients）のような付加的な成分を含む。
経口投与に適切な形態は、錠剤（tablet）、 カプセル（capsule）、 ピル（pill）、 粉（powder）、 徐放製剤（sustained release formulation）、溶液（solution）及び懸濁液（suspension）を含む。ペアレンタルインジェクション（parental injection）の適切な形態は、無菌の溶液、懸濁液又は乳濁液を含む。
例示的なペアレンタル投与の形態は、無菌水溶液の状態、例えばプロピレン水溶液又はブドウ糖溶液のような無菌水溶液状態での懸濁液又は溶液を含む。
例えば錠剤の例示的な経口形態は、：例えば澱粉、アルギン酸崩壊剤及び複雑珪酸塩のような崩壊剤（disintegrant）、；例えばショ糖、ゲラチン、アカシアのような結合剤、；並びに例えばステアリン酸マグネシウム、硫酸ラウリルナトリウム及び滑石のような潤滑剤を含む。固体組成は、また、固体又は固いゲラチンカプセルを含んでもよい。好ましい材料は、ラクトース、乳糖及び高分子量のポリエチレングリコールを含む。
種々の医薬組成物の調製方法が当該技術において周知である。“レミントンの薬品科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）”が参照される。
本発明は、また、１つ又はそれより多くの治療薬と組み合わされる抗体及びフラグメントに関する。
次の実施例は、説明上、提供され、本発明をこれらの明細な実施例に限定することは意図されない。
例１
α−シヌクレイン凝集物抗体の調製
α−シヌクレインフィブリルの調製
精製された組換え型のα−シヌクレインが用いられる。新しく調製されたα−シヌクレイン（５０μＭ）の溶液が、凝集のためサーモミキサー（８００ｒｐｍ）内で３７℃、７日間インキュベートされた。α−シヌクレインの凝集過程は、チオフラビン−Ｓ（Ｔｈ−ｓ）の結合アッセイにより監視される。凝集物が完成すると、フィブリルは、一定分量化されて、小さな試料とされ、使用までは−８０℃で貯蔵された。
α−シヌクレインオリゴマーの調製
新しく調製されたα−シヌクレイン溶液は、ドーパミンと分子量比１：７（α−シヌクレイン：ドーパミン）で混合され、サーモミキサー（８００ｒｐｍ）内で３７℃、夜通しで混合された。翌日、オリゴマーを含む水溶液が、一定分量化されて、小さな試料とされ、使用までは−８０℃で貯蔵された。
免疫化
ＢＡＬＢ／ｃ系マウスが皮下免疫用にα−シヌクレインにより用いられた。各マウスは、フロイント完全アジュバントと（１：１ｖ／ｖ）混合された５０μｇのα−シヌクレイン溶液の初期免疫を受けた。初期免疫に後続して追加免疫は、３週間間隔で、フロイント不完全アジュバント（１：１ｖ／ｖ）と混合されたα−シヌクレインの２５μｇにより行われた。各追加免疫の１０日目に、血が尻尾の静脈から収集され、血清が分離された。ＥＬＩＳＡが実施されて、α−シヌクレインに対する宿主の免疫応答のチェックが実施された。
宿主の免疫応答性をチェックするＥＬＩＳＡ
９６のウェルのクリアのマキシソーププレート（96 well clear maxisorp plate （NUNC） ）が、ＰＢＳ内の夜通しのインキュベーションで１ウェルにつき１００μｌ（７０ｎｇ／ウェル）被覆された。プレートは、次に、ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回、洗浄し、次に、室温で１ｈ（ｈは時間）、ブロッキングバッファ（２．２５％のゲラチンを含むＰＢＳＴ）でインキュベートした。該プレートは、ＰＢＳで３回洗浄され、マウスからの連続して希釈された抗血清の１００μｌ（１／１００が１０倍の希釈により後続される）が複製でウェル（複数）に付加され、該プレートは室温で１ｈ、インキュベートされた。プレートがＰＢＳＴで洗浄された後、１：２００００に希釈したヤギの抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ウェルにつき１００μｌ、Jackson Immunoresearch（ジャクソン免疫研究社））が各ウェルに付加され、室温で１ｈ、インキュベートされた。プレートは、次に、ＰＢＳＴで３回洗浄され、ＴＭＢの基質（KPL, Gaitherburg, USA（ＫＰＬガイサブルグＵＳＡ社））の１００μｌで色が着くまでインキュベートした。反応は、Ｈ２Ｓ０４（０．６Ｎ，１ウェルに付き１００μｌ）を付加して停止させ、４５０ｎｍの吸光度がVictor（ビクター社）のＸ３マイクロタイタープレート読取器を使って測定された。良好な免疫反応を示す宿主が、次に、融合のため採取された。
α−シヌクレインフィブリル（宿主１９，２２及び２３）とα−シヌクレインオリゴマー（宿主２１０，２１１及び２１２）とにより免疫されている宿主の力価（titer）が採取され、結果が図１及び表１に示されている。宿主は、力価が前回の反応の半分に下がったときに融合のために採取された。
α−シヌクレインフィブリルにより免疫されたマウスは、第１回の追加免疫直後、非常に高い力価を示した。したがって、これらのマウスにはそれ以上の追加免疫は与えなかった。α−シヌクレインオリゴマーにより免疫されたマウスは、第２回の追加免疫後、満足できる応答を示した。融合用のマウスを採取する前、融合前の力価（１月休養後）が実施された。幾つかの宿主は、α−シヌクレイン凝集物の高い抗原性のために、２月休養後でさえ高い力価を示した。
Ｓｐ２／０の骨髄しゅ細胞による脾細胞の融合
前回の実験のマウスは、最後の腹腔内免疫に、初期の投与量の３倍、ＰＢＳで与えられた。３日後、マウスは犠牲になった。脾臓が無菌的に単離され、ＩＭＤＭ（Gibco（ギブコ社））で洗浄された。脾細胞が抽出され、計測され、５０％のＰＥＧ４０００（Merck（マーク社））を用いてＳＰ２／０の骨髄しゅ細胞と融合された。融合された細胞は、ＩＭＤＭの成長培地（２ｍＭのグルタマクス（GlutaMAXＴＭ Gibco社の登録商標）において再懸濁された。成長培地は、ＩＸ Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；Sigma（シグマ社））、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Sigma）、５０μＭ ２−メルカプトエタノール（Sigma）で、ＨＡＴ（ＩＸ，Sigma）とマクロファジとが追加された２０％胎児ウシの血清（Hyclone（ハイクロネ社））、６×１０５細胞／プレート（５−６週間の古いＢＡＬＢ／ｃ系マウスからの新しく単離された細胞）であった。該細胞は、（２００μｌ／ウェル）蒔かれ、９６−ウェルの組織培養皿（Nunc（ナンク社））とされ、３７℃の５％ＣＯ２で成長された。１週間のインキュベーションの後、プレートからの培地が、新しく調製されてＨＴ（ＩＸ，Sigma）が追加されたＩＭＤＡ成長培地に変化した。雑種細胞が、培地色が黄色に変化するまで成長を許容された。培養表面は、陽性クローンのスクリーニングに用いられた。
陽性クローンのスクリーニング
９６のウェルのクリアのマキシソーププレート（96 well clear maxisorp plate （NUNC） ）が、ＰＢＳ内のα−シヌクレインのフィブリル又はオリゴマーのウェル当たり１００μｌ（７０ｎｇ／ウェル）で夜通しのインキュベーションにより被覆された。プレートは、ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄され、ブロッキングバッファ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳＴ）で室温で１ｈ、インキュベートされた。その後、プレートは、融合プレートからの培養表面の１００μｌ／ウェルを付加された。プレートは、室温で１ｈ、インキュベートされた。プレートがＰＢＳＴ（３Ｘ）で洗浄された後、１：２００００に希釈したヤギの抗マウスのＩｇＧ−ＨＲＰ（ウェル当たり１００μｌ，Jackson Immunoresearch）が各ウェルに付加されて、室温で１ｈ、インキュベートされた。プレートはそれからＰＢＳＴで洗浄され、ＴＭＢの基質（ＫＰＬ，Gaitherburg, USA）で、色が着くまでインキュベートされた。反応は、１０μｌのＨ２Ｓ０４（０．６）を付加することによって停止させ、４５０ｎｍの吸光度がＶｉｃｔｏｒ３の１４２０マルチ標識マイクロタイタープレート読取器を使って測定された。陽性クローンは、２４ウェルのプレートに移され、再びスクリーンされて、安定的なクローンを識別した（identify）。
合計が１１００の陽性クローンが初期のスクリーニングで得られ、（α−シヌクレインフィブリルで免疫されたマウスからの）５７個の陽性クローンと、（α−シヌクレインオリゴマーで免疫されたマウスからの）４３個のクローンとがさらなる特徴のために選択された。陽性クローンのアイソタイプが、アイソタイピングのキット（Sigma）を用いて識別された。ＩｇＧクローンが、多数回継代されて、安定なクローンを識別し、単一の細胞クローニングのために採取された。
アイソタイプ
９６のウェルのクリアのマキシソーププレート（NUNC）が、ＰＢＳのｐＨ７．４において１／１０００に希釈の抗マウスの重鎖の抗体（Sigma，アイソタイプキット）の１００μｌ／ウェルで４℃での夜通しのインキュベーションにより被覆された。プレートは、ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｅ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄され、ブロッキングバッファ（２．５％のゲラチンと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０とを含むＰＢＳ；ウェル当たり４００μｌ）で室温、１ｈでインキュベートされた。プレートは、次に、ＰＢＳＴで３回洗浄され、各クローンから培養表面の１００μｌがウェルに付加された。プレートは、室温で１ｈ、インキュベートされ、プレートがＰＢＳＴで洗浄された後、１：２００００に希釈したヤギの抗マウスのＩｇＧ−ＨＲＰ（１００μｌ／ウェル）が各ウェルに付加され、１ｈ、室温でインキュベートされた。プレートは、それから、ＰＢＳＴで洗浄され、色が着くまで、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（ＫＰＬ，Gaitherburg, USA）でインキュベートされた。反応は、１００μｌ／ウェルのＨ２Ｓ０４（０．６Ｎ，）を付加することによって停止され、４５０ｎｍの吸光度がＶｉｃｔｏｒ３ １４２０マルチ標識マイクロタイタープレート読取器を使って測定された。ＩｇＧの陽性クローンがＴ−２５フラスコに移され、単一細胞クローニングのために採取された。
α−シヌクレインのフィブリル又はオリゴマーで免疫されたマウスから得られたアイソタイプのクローンが表２で示される。
識別されかつ選択された１００個のクローンから３３個の親クローンが、ＩｇＧアイソタイプであることが判明した。残りのクローンは、ＩｇＭであるか又はＩｇＧとＩｇＭアイソタイプの混合であった。該ＩｇＭ又は該混合されたアイソタイプのクローンは、冷凍され、さらなる特徴づけのために採取はしなかった。ＩｇＧクローンは、少なくとも３回継代され、１４個の安定したクローンが選択された。１０個のクローンはＩｇＧＩであると判明し、２個のクローンはＩｇＧ２ａであると判明し、２個のクローンはＩｇＧ２ｂのアイソタイプであると判明した。
単一細胞のクローニング
細胞は、陽性の雑種細胞クローンのＴ−２５フラスコから収集された。該細胞は、計数され、ＩＭＤＭ内で希釈化され、〜１００個の細胞が採取され、２０ｍｌの成長培地に付加された。成長培地は、グルタマクス（登録商標）（２ｍＭ，Gibco）と、ベンストレプ（Penstrep Sigma）と、５０μｇ／ｍｌのゲンタミシン（Gentamycin Sigma）と、５０μＭのベタ−ＭＥ（Sigma）と、２０％の胎児ウシの血清（Hyclone）と、若いＢＡＬＢ／ｃから新たに単離されたマクロファジ（６０００個の細胞／ウェル）とが追加されたＩＭＤＭであった。該細胞は、混合され、蒔かれた（２００μｌ／ウェル）。該プレートは、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベーとされた。雑種細胞は、成長を許容された、それら細胞が集密的（confluent）になるまで、単一細胞を含むウェルがマークされた。単一コロニーを示すウェルからの培養表面が、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングのために採取され、陽性のウェルからの細胞が２４ウェルのプレートに移され、Ｔ−２５フラスコへの移し前に再度スクリーンされた。Ｔ−２５フラスコからの培養表面が少なくとも３回スクリーンされて、安定したクローンを選択した。
各クローンから得られた単一細胞のクローンは２４ウェルのプレートに移され、さらに、安定のためにチェックされた。各親クローンからの少なくとも２つの単一細胞のクローンがさらなる特徴づけのためにＴ−２５フラスコに移された。
例２
ドットブロットによるα−シヌクレイン凝集物に対する雑種細胞の特異性のスクリーニング
フィブリル（Ｆ）、オリゴマー（Ｏ）又はモノマー（Ｍ）におけるα−シヌクレインの５０ｎｇ（ＰＢＳ内の５μｌ）が、ニトロセルロース膜上にスポットされ、室温で３０分間乾燥させた。該膜は、室温で１ｈ、ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）において５％の脱脂粉乳がブロックされる。１：１で希釈された培養表面により探索する前に、ＰＢＳＴで３回洗浄され、室温度で２ｈ、インキュベートされた。Ｓｙｎ−１抗体は、コントロールとして用いられた。膜がＰＢＳＴで洗浄された後、１：２００００の希釈されたヤギの抗体ＩｇＧ−ＨＲＰが付加され、室温で１ｈ、インキュベートされた。膜は、ＰＢＳＴで洗浄され、その後、ＰＢＳで２回続けた。膜は、Super signal West pico Chemiluminescent（スーパー シグナル ウェスト ピコ ケミルミネセンス社）の基質（Pierce）により開発された。
ドットプロットの残りが、図２に示される。ドットプロットにより試験された２７８個のクローンのうち、４５個のクローンが安定であることが判明し、そのうちの１４個がα−シヌクレイン凝集物に特異性があった。
例３
単クローン抗体の大量の培養及び精製
α−シヌクレイン凝集物に対して特異性であると識別された６個のクローンが大量培養のために採取された。これらのクローンは、Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３及びＳｙｎ−０４である。成長培地は、２ｍＭグルタマクス （登録商標（Gibco）と、ペンストレプ（Penstrep Sigma）と、５０μｈ／ｍｌのゲンタミシン（Gentamycin（Sigma））と、５０μＭのベタ−ミー（beta-ME Sigma）とが追加されたＣＤＭ４ｍＡｂ（ハイクローン社（Hyclone））であった。ひとたび細胞が集密でかつ培地色が黄色に変化すると、培養表面が集められ、−２０℃で使用まで貯蔵される。単クローンの抗体は、Protein G-Agarose（プロタイン Ｇ−アガロス社）のコラム（column）が用意され、２０ｍＭリン酸塩バッファのｐＨ７．２の２０ベッドボリューム（bed volume）と平衡とされる。培養表面（２００ｍｌ）は、４℃１０分間、１５００ｒｐｍでは遠心分離される。該表面は、収集され、〜１ｍｌ／分の流速を維持しつつ、コラムを還流する。該コラムは、２０ｍＭのリン酸塩バッファのｐＨ７．２の１５ベッドボリュームにより洗浄されて、タンパク質を除去される。結合抗体が、溶出バッファ（５０ｍＭグリシンのｐＨ２．５）を用いて溶出される。５００μｌの部分として溶出された。精製された抗体は、最終的にＰＢＳに対して透析された。別のバッチから精製された単クローンの抗体は、集められ、濃度がＢＣＡアッセイにより決定された。これらの単クローンの抗体は、凍結乾燥され、１００μｇの一定分量として−２０℃で使用まで貯蔵される。
例４
精製された抗体の特徴づけ
抑制ＥＬＩＳＡ
３８４個のウェルの黒のマキシソープ処理（ＮＵＮＣ）は、ＰＢＳのｐＨ７．４において４℃の夜通しのインキュベーションによりα−シヌクレインフィブリルの１つのウェルにつき５０μｌ（１．４μｇ／ｍｌ）で被覆される。プレートは、ＰＢＳＴ（０．０５％ＴｗｅｅｎをもつＰＢＳ）をもつ４回、洗浄され、ブロッキングバッファ（０．０５％ＴｅｅｎをもつＰＢＳにおける２．２５％ゲラチン）により１ｈ、室温でブロックされる。０．６ｍｌのケイ素管におけるα−シヌクレインのフィブリル、オリゴマー又はモノマーの連続２回の希釈が、ブロッキングバッファにおいて行われた（１８回の連続的な２倍希釈により後続される８０μＭからの出発）。各管に、等量２０ｎｇ／ｍｌの精製された単クローンの抗体（Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，Ｓｙｎ−０４）又はＳｙｎ−１（BD Bioscience）が、コントロールとして付加され、最終的に１０ｎｇ／ｍｌの濃度を付与し、室温で２．５ｈ、混合によって管をインキュベートした。プレインキュベートされた溶液は、それから、ＥＬＩＳＡのプレートに付加され、室温で１０分間インキュベートされた。該プレートをＰＢＳＴで（４回）洗浄した後、１／１５０００に希釈したヤギの抗マウスのＩｇＧ−ＵＲＰの抱合体（Dako（ダコ社））が付加され、該プレートは、室温で１ｈ、インキュベートされた。該プレートは、ＰＢＳＴで洗浄され、５０μｌの基質（SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Scientific）が付加され、直ちに、VictorのＸ３マイクロタイタープレート読取器を用いて読み取られた。ｘ軸上のα−シヌクレイン濃度とｙ軸上のＣＰＳ値とのログ希釈（log dilution）を採取して、グラフがプロットされた。
抑制ＥＬＩＳＡによるｍＡｂの結合親和性の対比結果が図３及び表３に見出すことができる。
全ての単クローン抗体Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３及びＳｙｎ−０４はα−シヌクレインのシヌクレインに特異性があることが見出された。
例５
抗体−ドットブロットの交差反応性の試験
Ａ）種々のアミロイドのフィブリルとペプチドの異なるタンパク質５０ｎｇ（５μｌのＰＢＳ，ｐＨ７．４に存在する）によって形成されたアミロイドのフィブリルとの交差反応性を試験するために、α−シヌクレインからのフィブリル（Ｆ）とモノマー（Ｍ）、Ｔａｕ，Ａ−ｂｅｔａ，ＩＡＰＰ及びＡＢｒｉがニトロセルロースの膜上にスポットされ、室温で３０分、乾燥させた。該膜はＰＢＳＴ（０．０５％のＴｅｅｎを含むＰＢＳ）内の５％の脱脂粉乳でブロックされて、室温で１ｈ、インキュベートされた。ＰＢＳＴで３回洗浄後、該膜は、（ＰＢＳＴ内の５０ｎｇ／ｍｌ）、室温で２ｈ、次のものでインキュベートされた。単クローンの抗体、Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，Ｓｙｎ−０４、又はコントロール抗体、α−シヌクレイン用のＳｙｎ−１（BD Bioscience）、Ｔａｕ用の５Ｅ２（Gift from Dr. D. Walsh, Harvard Medical School（ハーバード大医学部のＤ．Ｗａｌｓｈ博士からの贈り物））、Ａ−ｂｅｔａ用の８２ＥＩ（ＩＢＬ）、ＩＡＰＰ用のＲＩＯ／９９（Santa Cruz Biotechnology（サンタ クルツ バイオテクノロジイ社））、及びＡｂｒｉ用のウサギの抗ＡＢｒｉ血清。該膜は、洗浄され、１／２００００に希釈したヤギの抗マウスのＩｇＧ−ＨＲＰの抱合体（Jackson ImmunoResearch（ジャクソン イミューンリサーチ社））か又は１／１００００に希釈したヤギの抗ウサギのＩｇＧ−ＥｆＲＰの抱合体（Jackson ImmunoResearch）かで室温で１ｈ、インキュベートされた。ブロットが、それから、Super signal West Pico（スーパー シグナル ウェスト ピコ社）の化学発光基質で現像された。
種々のタンパク質によって形成されたアミロイドフィブリルとの交差反応性の結果が図４に見られる。本発明による単クローンのの抗体は、α−シヌクレインのアミロイドフィブリルに対して特異性があることが見出され、他のアミロイドフィブリル又はモノマーとは交差反応しない。
Ｂ）β−シヌクレイン及びγ−シヌクレインによって形成されたアミロイドフィブリルに対する本発明の、立体構造の単クローン抗体の交差反応性を試験するために、α−，β−及びγ−シヌクレインからのフィブリル（Ｆ）及びモノマー（Ｍ）の５０ｎｇが、ニトロセルロースの膜上にスポットされた。該膜は、ＰＢＳＴにおける５％の脱脂粉乳により１ｈ、ブロックされ、それから、我々の単クローン抗体（Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，Ｓｙｎ−０４）又はコントロール抗体、α−シヌクレイン用のＳｙｎ−１（BD Bioscience）、β−シヌクレイン用のＡｎｔｉ−Ｂｅｔａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ（Santa Cruz Biotechnology）、及びγ−シヌクレイン用のＣ−２０（Santa Cruz Biotechnology）で、２ｈ、室温で探索した。膜は、洗浄され、１／２００００に希釈したヤギの抗マウスのＩｇＧ−ＨＲＰの抱合体（ジャクソン イミューンリサーチ社（ackson ImmunoResearch））か又は１／３０００００に希釈したチキンの抗ヤギのＩｇＧ−ＨＲＰの抱合体（Santa Cruz Biotechnology）かで室温で１ｈ、インキュベートされた。ブロットが、それから、スーパー シグナル ウェスト ピスコ社（Super signal West Pico）の化学発光基質で現像された。
β−シヌクレイン又はγ−シヌクレインによって形成されたアミロイドフィブリルとの交差反応性の結果が図５に見られる。本発明による単クローン抗体はα−シヌクレインフィブリルに対して特異性があることが見出され、フィブリル又はモノマーの形態においてβ−シヌクレイン及びγ−シヌクレインのいずれにも反応しない。
Ｃ）α−シヌクレインの異なるフラグメントに対する我々の立体構造の単クローン抗体の交差反応性を試験するために、全長のα−シヌクレイン（１−１４０）及びペプチドフラグメントからのフィブリル（Ｆ）及びモノマー（Ｍ）、α−シヌクレイン（１−１２２）、ＮＡＣ（６１−９５）並びにＮＡＣ（６１−７８）がニトロセルロースの膜上にスポットされた。膜は、ＰＢＳＴ内の５％の脱脂粉乳により１ｈ、ブロックされ、それから、我々の単クローン抗体（Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，Ｓｙｎ−０４）及びコントロール抗体、α−シヌクレイン用のＳｙｎ−１（BD Bioscience）、並びに５Ｃ２（Santa Cruz Biotechnology）で２ｈ、室温で探索した。膜は、１／２００００に希釈したヤギの抗マウスのＩｇＧ−ＨＲＰの抱合体（Jackson ImmunoResearch）か又は１／３０００００に希釈したチキンの抗ヤギのＩｇＧ−ＨＲＰの抱合体（Santa Cruz Biotechnology）かで室温で１ｈ、インキュベートする前に、洗浄された。ブロットが、それから、Super signal West Picoの化学発光基質で現像された。
異なるα−シヌクレインフラグメントによって形成されたフィブリルとの交差反応性は図６に見ることができる。本発明による単クローン抗体は、切断（truncated）α−シヌクレイン、ＮＡＣ領域（６１−９５）又はＮＡＣ領域（６１−７８）のいずれかによって形成されたアミロイドフィブリルとは反応しなかったが、エビトープの部分がα−シヌクレインのＣ末端領域にあると暗示させる全長のα−シヌクレイン（１−１４０）によって形成されるフィブリルにのみ反応した。α−シヌクレインモノマーに対する我々のｍＡｂの無反応性は、また、我々のｍＡｂによって認識されるエピトープが立体構造特異性であるかもしれないことを暗示する。
例６
運動定数の決定
ビアコア（Biacore：商標）分析
我々のｍＡｂと−シヌクレインフィブリルとの間のとの間の運動定数は、バイアコアＸ１００（BIAcore X 100）器を用いて表面プラズモン共鳴測定器により決定された。α−シヌクレインフィブリルは、ＣＭ５センサーチョップに固定された。該チョップは、１０ｍＭの酢酸ナトリウムのバッファのｐＨ４．５に１２０μｇ／ｍｌの−シヌクレインフィブリルの３５μｌを注入することによって、−Ｎ（ヒドロキシコハク酸イミド）スクシンイミド（ＮＨＳ）と、Ｎエチル−Ｎ（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（carbofiimide）（ＥＤＣ）とに作動する。会合速度定数は、８つの異なる濃度のｍＡｂをＨＢＳの作動バッファに１０μｌ／分の低速で注入することによって得られる。なお、該ｍＡｂは、Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，Ｓｙｎ−０４、及びｍＡｂ２１１（Santa Cruz Biotechnology）であり、該バッファは、１０ｍＭのヘペス、０．１５ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．００５％の界面活性物質Ｐ２０のｐＨ７．４である。解離速度は、４０μｌ／分で測定された。センサーチップは、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３のｐＨ９．６を用いて再生された。センサーグラム（Sensograms）は、ＢＯＡ査定ソフトウェアを用いて分析された。
バイアコア社（Biacore）によるｍＡｂの比較を示す結果が図７及び表４に見ることができる。単クローン抗体は、１０−８より小さいＫｄを有することが見出された。ｍＡｂのＳｙｎ−０１は、ＫＤ１５．９ｐＭの最高の親和性を有していることが見出された。６つのｍＡｂの中で最低の親和性は、２．６ｍＭのＳｙｎ−Ｆ２であることが見出された。
例７
ｍＡｂに対するエピトープのマッピング
本発明のｍＡｂが線形又は立体構造のエピトープを発見するかを見い出すために、抗体の親和性がα−シヌクレイン配列をカバーするペプチドに対して試験された。ペプチドは、１４個分のアミノ酸長さであり、７つのアミノ酸が重複し、ヒトのα−シヌクレイン配列（表５参照）をカバーするものであり、このペプチドが合成された（Shanghai Hanhong Chemical Co., China（シャンハイ ハンホン ケミカル社 中国）。ペプチドは、高圧滅菌された水又はＤＭＳＯに溶解し、最終的に１ｍｇ／ｍｌの濃度になる。
ドットプロットによるペプスカン（Pepscan）
ニトロセルロースの膜は、０．１％のＥＤＣ（１−Ｅｔｙｌ−３−［３−ジメチルアミノプロピル］）のカルボジイミドと、ＰＢＳ内で１０分、室温で前処理され、空気乾燥される。２００ｎｇ（５μｌのＰＢＳでｐｈ７．４において）のペプチド１−１９（α−シヌクレインのペプチドライブラリ、表５）と、５０ｎｇのα−シヌクレインフィブリル（スポット２０）が膜上にスポットされた。−空気乾燥後、膜は、ＰＢＳＴ内の５％の脱脂粉乳をブロックし、１ｈ、室温でインキュベートした。膜は、Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，Ｓｙｎ−０４、又はＳｙｎ−１の単クローンの抗体（ＰＢＳＴ内の５０ｎ／ｍｌ）と共にインキュベートされる前に、３回、洗浄され、２ｈ、室温でインキュベートされた。膜は、ＰＢＳＴで洗浄され、（ＰＢＳＴにおいて）１：２００００で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ジャクソン免疫研究社（Jackson Immunoresearch）でインキュベートされた。ペプスカンの結果は図８において見ることができる。
ドットプロットを用いたペプスカンの結果は、ｍＡｂ、Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，Ｓｙｎ−０４、Ｓｙｎ−Ｆ１、Ｓｙｎ−Ｆ２は、線形のエピトープを認識しないことを暗示する。
ＥＬＩＳＡによるペプスカン
ドットプロットを用いたペプスカンの結果を確認するために、ｍＡｂは、また、ＥＬＩＳＡを用いたペプスカンにより試験された。３８４のウェルの黒のマキシソーププレート（ＮＵＮＣ）は、完全な可能を可能にする３７℃の夜通しのインキュベーションによって、０．２ＭのＮａＨＣＯ３のｐＨ９．６、内の５０μｌ（５００ｎｇ／ウェル）のペプチド（表５に詳説されているα−シヌクレインペプチド１−１９）と、ＰＢＳのｐＨ７．４内の５０μｌ（１００ｎｇ／ウェル）のα−シヌクレインフィブリルとで被覆された。プレートは、ＰＢＳＴで３回洗浄され、１００μｌのブロッキングバッファ（ＰＢＳＴ内の２．２５％ゲラチン）と共に１ｈ、室温でブロックした。該プレートをＰＢＳＴで３回の洗浄後、次のｍＡｂの５０μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）と次のコントロール抗体とが付加されて、１ｈ、室温でインキュベートされた。該次のｍＡｂとは、Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３及びＳｙｎ−０４である。該次のコントロール抗体とは、Ｓｙｎ−１（マウスの抗α−シヌクレイン；BD Bioscience）の５０μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｎ−１９（ヤギの抗α−シヌクレイン；サンタ クルツ バイオテクノロジイ社（Santa Cruz Biotechnology））の５０μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、２１１（マウスの抗α−シヌクレイン；Santa Cruz Biotechnology）の５０μｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬ−１４０（ウサギの抗α−シヌクレイン；Santa Cruz Biotechnology）の５０μｌ（２００ｎｇ／ｍｌ）、５Ｃ２（マウスの抗α−シヌクレイン；Santa Cruz Biotechnology）の５０μｌ（１μｇ／ｍｌ）、及び３Ｂ６（マウスの抗α−シヌクレイン；Santa Cruz Biotechnology）の５０μｌ（１μｇ／ｍｌ）である。プレートはＰＢＳＴで洗浄され、次の付加物が付加され、１ｈ、室温でインキュベートされる。該付加物とは、ヤギの抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抱合体（１／２００００；ジャクソン免疫研究社（Jackson Immunoresearch））又はヤギの抗ウサギのＩｇＧ−ＨＲＰ抱合体（１／５０００；Jackson Immunoresearch）又は希釈されたチキンの抗ヤギのＩｇＧ−ＨＲＰ抱合体（１／２００００）である。該プレートは、ＰＢＳＴで洗浄され、基質（SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Scientific）の５０μｌが付加され、直ちに、ビクターＸ３のマイクロタイタープレート読取器により読み取った。ＥＬＩＳＡの信号が測定された後、該プレートは、Ｘ線フィルムに感光され、スポットが現像された。
ＥＬＩＳＡによるベプスカンのスクリーニング結果は、図９及び図１０（コントロール抗体、Ａ、本発明の抗体、Ｂ）に見ることができる。ＥＬＩＳＡによるペプスカン方法は、また、抗体がいずれのペプチドにも反応しないが、Ｃ末端のペプチド（１２７−１４０）にはわずかに反応したことを示していた。このことは、立体構造のエピトープを形成することに関与していることを暗示する。
例８
α−シヌクレイン凝集物を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡ
３８４ウェルＥＬＩＳＡの黒のミクロプレート（Nunc Maxisorb, NUNC, Denmark）は、２００ｍＭのＮａＨＣＯ３において４℃での夜通しのインキュベーションにより我々の立体構造の単クローン抗体（Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３又はＳｙｎ−０４）（５０μｍ／ウェル）の１つの抗体の０．１μｇ／ｍｌで被覆された。
該プレートは、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳにより４回洗浄され、２ｈ、３７℃でブロッキングバッファ（２．５％のゲラチンと１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ）の１００μｌ／ウェルでインキュベートされた。
該プレートは、ＰＢＳＴで４回洗浄され、モノマー、オリゴ糖又は凝集物のα−シヌクレインの種々の濃度（ＰＢＳ内で１０，５，１，０．５，０．１，及び０．０５ｎＭ）の５０μｌが付加された。該プレートは、それから、３７℃で２．５ｈ、インキュベートされた。
ＰＢＳＴでの４回の洗浄後、ブロッキングバッファ内で１：１０００に希釈されたＦＬ−１４０（ウサギの多クローン抗体，Santa Cruz Biotechnology）の５０μｌが、付加され、３７℃で２ｈ、インキュベートされた。
ウェルがＰＢＳＴで４回洗浄され、ブロッキングバッファにおいて１：１０，０００に希釈されたヤギの抗ウサギのＩｇＧ ＨＲＰ（Jackson ImmunoResearch）の５０μｌ／ウェルが付加され、１．５ｈ、３７℃でインキュベートされた。
該プレートは、ＰＢＳＴで４回洗浄され、結合したＨＲＰの活動度が、増強された化学発光基質（SuperSignal ELISA Femto, Pierce Biotechnology）を用いて化学発光によって、効力を検定され、その後、相対光単位で化学発光度がパーキンエルマー社（PerkinElmer）のミクロプレート読取器により直ちに測定された。
立体構造のｍＡｂがα−シヌクレインの凝集物形態のみ検出し、α−シヌクレインのモノマー形態を検出しないことを確認するために、上述のＥＬＩＳＡアッセイが、Ｓｙｎ−１を捕獲抗体として用いて、コントロールとして実施された。
結果が図１１に示されている。該結果は、立体構造のｍＡｂがＳｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，及びＳｙｎ−０４が、α−シヌクレインのオリゴマー形態及び凝集形態の方法に反応していることを示している。Ｓｙｎ−１は、α−シヌクレインのモノマー形態及び凝集形態の方法に反応していることを示している。
ＥＬＩＳＡは、α−シヌクレインのモノマー形態を検出せず、α−シヌクレインのオリゴマー形態及びフィブリル形態の両方を全ｍＡｂ、検出することを示している。これに対し、ＥＬＩＳＡの結果は、Ｓｙｎ−Ｆ１及びＳｙｎ−Ｆ２に対してα−シヌクレインのオリゴマー形態のα−シヌクレインフィブリルのα−シヌクレインフィブリルの方に幾分の特異性があることを示した。
例９
凝集されリン酸化したＳｅｒ１２９−α−シヌクレイン（ｐ−Ｓ１２９−α−ｓｙｎ）
３８４ウェルＥＬＩＳＡ黒ミクロプレート（Nunc Maxisorb, NUNC, Denmark ）は、２００ｍＭのＮａＨＣＯ３において４℃での夜通しのインキュベーションにより我々の立体構造の単クローン抗体（Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０２）（５０μｌ／ウィル）のうちの１つの０．１μｇ／ｍｌにより被覆された。
該プレートは、０．．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳにより４回洗浄され、ブロッキングバッファ（２．５％のゲラチンと１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ）の１００μ／ウェルにより２ｈ、３７℃でインキュベートされた。
該プレートは、ＰＢＳＴで４回洗浄され、モノマーのｐ−Ｓ１２９−α−シヌクレイン又は凝集物のｐ−Ｓ１２９−α−シヌクレインの種々の濃度（ＰＢＳにおいて１，０．５，０．１，０．０５，０．０１，０．００５ｎＭ）の５０μｌが付加された。該プレートは、３７℃で２．５ｈ、インキュベートされた。
ＰＢＳＴで４回洗浄後、ブロッキングバッファにおいて１／１０００に希釈されたウサギの抗ｐ−Ｓ１２９−α−シヌクレイン（Epitomics（エピトミクス社））の５０μｌが付加され、３７℃で２ｈ、インキュベートされた。
ウェルがＰＢＳＴで４回洗浄された後、ブロッキングバッファにおいて１：１０，０００希釈されたヤギの抗ウサギのＩｇＧ ＨＲＰの（Jackson ImmunoResearch）の５０μｌ／ウェルが付加され、１．５ｈ、３７℃でインキュベートされた。
該プレートは、ＰＢＳＴで４回洗浄され、結合ＨＲＰの活性度が、増強された化学発光基質によって（SuperSignal ELISA Femto, Pierce Biotechnology）を用いて化学発光反応によって、効力を検定され、その後、相対光単位で化学発光度がPerkinElmer社のミクロプレート読取器により直ちに測定された。
立体構造のｍＡｂは、α−シヌクレインの凝集形態のみ検出され、α−シヌクレインのモノマー形態は検出れないのを確認するために、上述のさらなるＥＬＩＳＡの効力検定が、Ｓｙｎ−１を捕獲抗体として用いて、コントロールとして実施される。
その結果が図１２に見ることができる。該結果は、立体構造のｍＡｂのＳｙｎ−Ｆ２及びＳｙｎ−０２が、凝集されてリン酸化されたα−シヌクレイン形態に反応していることを示している。Ｓｙｎ−１は、類似したものを示したが、両場合共に、リン酸化したＳ１２９ α−シヌクレインのモノマー形態及び凝集形態に低反応を示した。
シヌクレインの凝集化及びリン酸化は、ＰＤの病変形成において重要な役割を果たしていると考えられる。それ故に、生物学的な流体においてα−シヌクレインのリン酸化又は非リン酸化形態の検出は、ＰＤに対して生物学的にマークする可能性として用いることができる。
ＥＬＩＳＡの効力検定は、α−シヌクレインの凝集形態は明細に検出し、α−シヌクレインのモノマー形態は検出しないように、開発が進んでいる。効力検定は、捕獲抗体として抗体Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，又はＳｙｎ−０４を用いる開発が進められている。そして、凝集されたα−シヌクレイン用のＦＬ−１４０（全長のα−シヌクレインに対して隆起するウサギの多クローン抗体，Santa Cruz Biotechnology）のような抗体、又はｐ−Ｓ１２９−α−シヌクレイン用にウサギの抗ｐ−Ｓ１２９−α−シヌクレインが後続している。
例１０
免疫組織化学
ｍＡｂは、パーキンソン病の症例からの脳セクションのペルオキシダーゼの免疫組織化学を用いて試験された。Ｓｙｎ−Ｆ１及びＳｙｎ−０２は、１００００分の１（０．１μｇ／ｍｌ）に希釈で用いられ、Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０３及びＳｙｎ−０４は５０００分の１（０．２μｇ／ｍｌ）の希釈で用いられた。マウスの陰性のコントロールスライド（control slide）が同時に処理され、すべての免疫組織化学的なステップが含まれるが、一次抗体は省略される。
結果
ｍＡｂは、パーキンソン病（ＰＤ）及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）の症例においてペルオキシダーゼの免疫組織化学を用いて働きを向上してきた。すべての抗体は、ＰＤ脳のレビー小体及びレビー神経炎における強い免疫染色（図１４）及び多系統萎縮症の白質グリア細胞質内封入体（図１５）を生成した。マウスの陰性のコントロールスライド（control slide）もまた処理されたが、セクションにおいてどんな免疫反応性も生成しなかった。
コントロール症例において（図１３）、画像は、我々のｍＡｂと、商業利用されているマウスの単クローンの抗α−シヌクレインの抗体（Ｓｙｎ−１）又はマウスの単クローンの抗リン酸化されたＳｅｒ１２９のα−シヌクレイン（phospho-syn）とに対する免疫染色されたセクションを示し、コントロール症例からの前帯状皮質におけるものである。マウス及びウサギの陰性のコントロールスライドもまた同時に処理された。すべてのセクションが、神経核及び膜を視覚化するために、クレシルバイオレット（青）（Cresyl violet （blue））で対比染色された。明るさに対して同一の調整がすべての画像に適用された。スケールバーは、２０μｍを表している（全パネルに適用）。
パーキンソン病の症例において（図１４）、画像は、我々のｍＡｂと、商業利用されているマウスの単クローンの抗α−シヌクレインの抗体（Ｓｙｎ−１）又はマウスの単クローンの抗リン酸化されたＳｅｒ１２９のα−シヌクレイン（phospho-syn）とに対するレビー小体の免疫活性を示し、パーキンソン病症例からの前帯状皮質におけるものである。すべてのセクションが、神経核及び膜を視覚化するために、クレシルバイオレット（青）で対比染色された。明るさに対して同一の調整がすべての画像に適用された。スケールバーは、２０μｍを表している（全パネルに適用）。
多系統萎縮症の症例において（図１５）、画像は、我々のｍＡｂと、商業利用されているマウスの単クローンの抗α−シヌクレインの抗体（Ｓｙｎ−１）又はマウスの単クローンの抗リン酸化されたＳｅｒ１２９のα−シヌクレイン（phospho-syn）とに対するグリア細胞質内封入体の免疫活性を示し、ＭＳＡの症例からの被殻におけるものである。セクションが、神経核及び膜を視覚化するために、クレシルバイオレット（青）で対比染色された。明るさに対して同一の調整がすべての画像に適用された。スケールバーは、２０μｍを表している（全パネルに適用）。
例１１
神経変性疾患を有すると知られている患者からの感謝脳組織の試料がＳｙｎ−０２抗体で試験された。抗体は、５０００分の１（０．２μｇ／ｍｌ）の希釈で用いられた。抗体は、全ての患者の試料において強い染色を生成した。
患者Ａは、パーキンソン遺伝子内のヘテロ接合性エクソンの欠失に関係するヘテロ接合性のミスセンス（missense）の変異を有する常染色体性で劣性早発性パーキンソン症候群を有するとして知られていた。図１６（Ａ）に示されるように、オリゴマーのα−シヌクレインが、シナプスと細胞プロセス（矢頭）において観察された。非常に少数の凝集物が、僅かのニューロメラニン含有ニューロンの細胞質内に見ることができた。
患者Ｂは、アプログレッシブ（aprogressive）なＤＬＢのパテント（patent）である。図１６（Ｂ）に示されるように、オリゴマーのα−シヌクレインの免疫活性がシナプス、レビー小体神経突起のような構造及び細胞外凝集物内に観察された。
患者Ｃは、、後発性特発性パーキンソンをもつ。図１６（Ｃ）に示されるように、オリゴマーのα−シヌクレインの免疫活性が、レビー小体類似の細胞質内封入体及び神経突起内に観察された。
これらの結果は、本発明の抗体がα−シヌクレインに関係する神経変性の病気を診断するのに使えることを示している。
例１２
脳組織の試料の異なるセクション（海馬のＣＡ２領域、嗅内皮質表面層１−３、嗅内皮質中性）が、Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，Ｓｙｎ−０４、Ｓｙｎ−Ｆ１及びＳｙｎ−Ｖ２抗体によって試験された。該抗体は、５０００分の１の希釈で用いられた。脳の試料は、４つの処置、１）前処理無し、２）クエン酸緩衝内での１２０℃、１０分のオートクレーブ、３）１５分のギ酸、４）２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ処理の４個のうちの１つで処理される。
インキュベーションは４℃で夜通しであった。検出は、色素体としてのロムリン（Romulin）を有するヒストステイン（Histostain）ＨＰキットにより行われた。コントロール抗体Ｓｙｎ−１は、１：１０００の希釈で用いられた。コントロール抗体で試験された組織の試料はギ酸で１５分前処理された。
結果は、抗体が脳組織の前処置無しでさえ働いたことを示した。しかしながら、抗体は前処理により、より良く採取された。タンパク質Ｋの処理された試料は、より良い結果を示した。プロテイナーゼＫ処理は、異常なシヌクレイン（すなわち、細胞内凝集物）の免疫性を高め、かつシナプスの染色の拡散を減少させることが知られている。コントロール抗体と、海馬（Ａ）及び海馬傍回（Ｂ）のＣＡ２領域におけるｓｙｎ−Ｆ２抗体との結果が図１７に示されている。
例１３
６つの抗体クローンＳｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，及びＳｙｎ−０４に対する重鎖及び軽鎖の種々の領域のポリヌクレオチド及びアミノ酸の配列が決定された。
ＲＮＡが、技術マニュアルによる“TRIzol（登録商標） Plus RNA purification System” （Invitrogen）を用いて、雑種細胞のクローンＳｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３，及びＳｙｎ−０４から抽出された。単離された全ＲＮＡは、アルゴスのゲルの電気泳動法によって分析された。
全ＲＮＡは、技術マニュアルによる“SuperscriptTMIII First-strand synthesis System ”を使って、アイソタイプ−明細（isotype-specific）のアンチセンスのプライマー又は普遍的なプライマーを用いて、逆転転写され、ｃＤＮＡにされた。ＶＨ及びＶＬの抗体フラグメントは、遺伝子記述のＲＡＣＥの標準作動手続により増幅された。
増幅された抗体フラグメントは、標準分子クローニング技術を用いて標準クローニングベクターにクローンされた。Colony PCRのスクリーニングが、正しいサイズの挿入によりクローンを識別するために実施された。正しいサイズのインサートを有し５より小さくない個数の単一クローンが各抗体フラグメントに配列された。
ＤＮＡ配列は、各ＶＨ及びＶＬ領域ごとに決定され、対応のアミノ酸配列が決定された。先頭の配列、フレームワーク領域（ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３及びＦＲ４）、及び相補性決定領域（complementarity determining regions）が、各重鎖及び軽鎖の変化領域ごとに決定された。結果は、表６に示されている。ＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のポリヌクチド及びアミノ酸の配列が配列番号１３−４８で示されている。
Ｓｙｎ−Ｆ１のＶＨ及びＶＬ領域をコードしたＤＮＡ配列が配列番号１及び３で提供される。Ｓｙｎ−Ｆ１のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列は、配列番号２及び４で提供される。Ｓｙｎ−Ｆ１のＶＨ領域のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、配列番号１３，１４及び１５でそれぞれ提示されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号１６，１７及び１８でそれぞれ提示される。Ｓｙｎ−Ｆ１のＶＬ領域のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、配列番号１３，１４及び１５でそれぞれ提示されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号２２，２３及び２４でそれぞれ提示される。
Ｓｙｎ−Ｆ２のＶＨ及びＶＬ領域をコードしたＤＮＡ配列が配列番号５及び７で提供される。Ｓｙｎ−Ｆ２のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列は、配列番号６及び８で提供される。Ｓｙｎ−Ｆ２のＶＨ領域のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、配列番号２５，２６及び２７でそれぞれ提示されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号２８，２９及び３０で提示される。Ｓｙｎ−Ｆ２のＶＬ領域のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、配列番号３１，３２及び３３でそれぞれ提示されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号３４，３５及び３６で提示される。
Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３及びＳｙｎ−０４のＶＨ及びＶＬ領域をコードしたＤＮＡ配列が配列番号９及び１１でそれぞれ提供される。Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３及びＳｙｎ−０４のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列は、配列番号１０及び１２で提供される。Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３及びＳｙｎ−０４のＶＨ領域のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、配列番号３７，３８及び３９でそれぞれ提示されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号４０，４１及び４２で提示される。Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３及びＳｙｎ−０４のＶＬ領域のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、配列番号４３，４４及び４５でそれぞれ提示されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号４６，４７及び４８で提示される。
Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−０３及びＳｙｎ−０４のＶＨ及びＶＬ領域の配列も同じであった。
先頭配列はイタリック体とされ、ＣＲＤ領域は下線付きとなっている。
例１４
ＢｉＦＣ培養システムにおけるｑ−シヌクレインの共凝集
ＢｉＦＣ（bimolecular fluorescence complementation：二分子蛍光相補性）を確立するために、培養システム，ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が、ＧＮ−ｌｉｎｋ−αＳｙｎ（Ｖ１Ｓ）又はαＳｙｎＧＣ（ＳＶ２）（Massachusetts General Hospital, Charlestown, MA（マサチューセッツ ゼネラル ホスピトル，チャールストン，ＭＡ））のパメラ マクリーン博士（Dr. Pamela McLean）から親切なギフト）による電気穿孔を用いて遺伝子導入された。遺伝子導入された細胞は、コロニーが現出するまでの２−３週間、６００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Invitrogen, Carlsbad, CA（インビトロゲン カールスバッド カリフォルニア））により選択された。この安定的な株化細胞は、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８で保守された。
ＳＶ２細胞は、ビーナス蛍光タンパク質のＣ端末のシヌクレインと融合する人のα−シヌクレインを安定的に過剰発現し、
μｇ／ｍｌの正常マウスのＩｇＧ又はα−シヌクレイン抗体（２７４，Ｓｙｎ−０１，Ｓｙｎ−０２，Ｓｙｎ−Ｆ１，Ｓｙｎ−Ｆ２，ＢＩ １Ｄ１２，Ｆ７Ａ１１）の存在においてα−シヌクレインをタグしたＮ末端のビーナスフラグメントを過剰表現するＶＩ Ｓの安定した株化細胞と共培養された。
インキュベーションの３日後、ＢｉＦＣ蛍光は、Olympus（Tokyo, Japan）（オリンパス社（東京，日本））のＦ Ｖ１０００の共焦点レーザースキャニング顕微鏡により分析された。
斑点（puncta）形成がセル内に観察された（矢頭）。斑点形成を含む細胞の個数が計数され、斑点陽性細胞の比が計算された。結果は、図１８及び図１９に示される。グラフは、α−シヌクレイン凝集物を含む細胞のパーセンテージを指示している。ここで説明された特定の例及び実施形態は、性質の例示したものであり、本発明を限定することを意図しない。さらなる実施形態及びその例は、本明細書を考慮して、当業者に明らかであり、本発明の特許請求の範囲内に含まれる。

Claims (23)

  1. α−シヌクレインオリゴマーに対する高結合親和性と、α−シヌクレインのフィブリルへの高結合親和性と、α−シヌクレインモノマーに対する低結合親和性とを有する抗体又はそのフラグメントであって、
    前記抗体又はそのフラグメントは、
    免疫グロビン重鎖の可変領域（ＶＨ）と免疫グロビン軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを備え、
    該ＶＨ鎖において、ＣＤＲ１領域が、配列番号１６，２８又は４０のアミノ酸配列を有し、
    該ＶＨ鎖において、ＣＤＲ２領域が、配列番号１７，２９又は４１のアミノ酸配列を有し、
    該ＶＨ鎖において、ＣＤＲ３領域が、配列番号１８，３０又は４２のアミノ酸配列を有し、
    該ＶＬ鎖において、ＣＤＲ１領域が、配列番号２２，３４又は４６のアミノ酸配列を有し、
    該ＶＬ鎖において、ＣＤＲ２領域が、配列番号２３，３５又は４７のアミノ酸配列を有し、
    該ＶＬ鎖において、ＣＤＲ３領域が、配列番号２４，３６又は４８のアミノ酸配列を有する、該抗体又はそのフラグメント。
  2. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントにおいて、
    該ＶＨが、配列番号２，６又は１０に示されるアミノ酸配列を備える抗体又はそのフラグメント。
  3. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントにおいて、
    該ＶＬが、配列番号４，８又は１２に示されるアミノ酸配列を備える抗体又はそのフラグメント。
  4. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントにおいて、
    該ＶＨと該ＶＬとが、それぞれ、配列番号２と４か、配列番号６と８か、又は配列番号１０と１２かに示されるアミノ酸配列を備える抗体又はそのフラグメント。
  5. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントが、ヒトのα−シヌクレインのオリゴマー及びフィブリルに対して１０−７Ｍより小さい解離定数Ｋｄを有する抗体又はそのフラグメント。
  6. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントが、モノマーのα−シヌクレインに対して１０−５Ｍより大きい解離定数Ｋｄを有する抗体又はそのフラグメント。
  7. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントにおいて、
    抗体が、α−シヌクレインのオリゴマー形態に対してよりもα−シヌクレインのフィブリルに対して高い親和性を有する抗体又はそのフラグメント。
  8. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントが、α−シヌクレインのＣ末端領域を備えるエピトープに結合する抗体又はそのフラグメント。
  9. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントが、立体構造の抗体である抗体又はそのフラグメント。
  10. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントが、α−シヌクレインの線形エピトープを認識しない抗体又はそのフラグメント。
  11. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントにおいて、
    抗体が、単クローン抗体である抗体又はそのフラグメント。
  12. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントと、医薬的に容認可能な希釈剤又はキャリアとを備える医薬組成物。
  13. 薬物として使用する請求項１記載の抗体又はそのフラグメント。
  14. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントであって、
    それを個体に投与して、該個体におけるα−シヌクレインの病理による神経変性疾患の治療に使用するためのものである、抗体又はそのフラグメント。
  15. 請求項１４記載の抗体又はそのフラグメントにおいて、
    前記神経変性疾患が、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、精神病、統合失調症又はクロイツフェルト・ヤコブ病である抗体又はそのフラグメント。
  16. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントを備える、神経変性疾患を個体が有するか否かの決定方法に使用するテストキット。
  17. α−シヌクレインのフィブリル及び凝集物を検出する方法であって、
    請求項１記載の抗体又はそのフラグメントを生物学試料に加えるステップと、
    α−シヌクレインのフィブリル及び／又は凝集物と、抗体又はそのフラグメントとの間に形成される複合体の存在を検出するステップとを備える方法。
  18. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントであって、
    それを被験者からの生物学試料に加えることと、
    α−シヌクレインの凝集物と、抗体又はそのフラグメントとの間に形成される複合体の存在又は非存在を検出することを備える方法による、
    α−シヌクレインに関係する神経変性疾患の診断に使用するためのものである、抗体又はそのフラグメント。
  19. イメージング剤として使用する請求項１記載の抗体又はそのフラグメント。
  20. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントであって、
    それを個体に投与することと、
    抗体を検出することとを備える方法による、
    α−シヌクレイン凝集物のイメージングに使用するためのものである、抗体又はそのフラグメント。
  21. 請求項２０記載の抗体又はそのフラグメントにおいて、
    前記抗体は検出可能な標識を備える抗体又はそのフラグメント。
  22. 請求項１記載の抗体又はそのフラグメントが、検出可能な標識によって結合されている抗体又はそのフラグメント。
  23. 請求項２２記載の抗体又はそのフラグメントにおいて、
    前記検出可能な標識は、蛍光標識、放射性標識、又は造影剤から選択されたものである抗体又はそのフラグメント。
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