JP6108425B2 - Recombinant measles virus for cancer treatment - Google Patents
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Description
本発明は、麻疹ウイルス（MV）-HL株を元にした組換え腫瘍溶解性ウイルスの発明に関し、そして腫瘍溶解性ウイルスを使用して癌を治療する方法の発明に関する。 The present invention relates to the invention of a recombinant oncolytic virus based on the measles virus (MV) -HL strain and to the invention of a method of treating cancer using an oncolytic virus.
乳癌は、乳房組織からもともと発生する癌の種類であり、女性の癌による死亡の最も多い原因である。乳癌は、ヒトおよびその他の哺乳動物の疾患であり、ヒトにおける症例の大多数は女性である。 Breast cancer is a type of cancer that originally arises from breast tissue and is the most common cause of cancer death in women. Breast cancer is a human and other mammalian disease, and the majority of cases in humans are women.
卵巣癌は、卵巣組織が癌性に増殖するものである。90%以上の卵巣癌は、“上皮”型と分類されるものであり、そして卵巣組織の上皮から発生するものと考えられている。しかし、例えば、フェロピア管由来の癌、胚細胞由来の癌、あるいは支持細胞由来の癌などの卵巣癌のそれ以外の型もまた、当該技術分野において知られている。 Ovarian cancer is a cancerous growth of ovarian tissue. Over 90% of ovarian cancers are classified as “epithelial” types and are thought to arise from the epithelium of ovarian tissue. However, other types of ovarian cancers are also known in the art, such as, for example, cancers derived from pheropian tubes, embryonic cells, or feeder cells.
大腸癌（結腸癌、直腸癌、および盲腸癌を総称的に呼ぶものである）は、結腸、直腸または盲腸における制御できない細胞増殖による癌である。症状には、典型的には、直腸出血および貧血が含まれ、しばしば体重の喪失および結腸直腸の状態の変化を伴う。 Colorectal cancer (which generically refers to colon cancer, rectal cancer, and cecal cancer) is a cancer due to uncontrolled cell growth in the colon, rectum, or cecum. Symptoms typically include rectal bleeding and anemia, often accompanied by weight loss and colorectal changes.
上述した癌などの癌の治療には、手術、薬剤の投与（ホルモン治療および化学療法が含まれる）、放射線治療、および／または免疫療法が含まれる。癌性組織を手術により除去することは、大きな利益をもたらす。ほとんどのタイプの化学療法は、体内において増殖している細胞に対して細胞死を引き起こす。放射線は、特に保存的な手術（乳癌にしばしば適用される）の後に必要とされ、そして実質的に局所的な癌の再発率を改善し、そして多くの事例において、全体的な生存も改善する。一般的に、当該技術分野において、治療成功率を向上させるため、これらの治療方法を組み合わせて使用することができる。 Treatment of cancers, such as those described above, includes surgery, administration of drugs (including hormone therapy and chemotherapy), radiation therapy, and / or immunotherapy. The removal of cancerous tissue by surgery provides significant benefits. Most types of chemotherapy cause cell death for cells that are proliferating in the body. Radiation is needed especially after conservative surgery (often applied to breast cancer) and substantially improves the local cancer recurrence rate and in many cases also improves overall survival . In general, these treatment methods can be used in combination in the art to improve the treatment success rate.
腫瘍溶解性ウイルス治療は、伝統的な治療方法と組み合わることができる、がん治療のための新しい戦略として、非常に有望である。現在のところ、多くのウイルス種由来の幅広いウイルスが、腫瘍溶解性薬剤として評価されている最中である（Vaha-Koskela MJ, et al., Cancer Lett 2007, 254: 178-216）。麻疹ウイルス（MV、Morbilliウイルス属、Paramyxoviridae科）は、膜を持つウイルスであり、分節化されていない（-）鎖のRNAゲノムを有する。レトロウイルスやいくつかのDNAと比較して、MVは完全に細胞質中で増殖し（Griffin DE. Measles virus. In: David M. et al., (eds). Fields Virology, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia: 2006, pp. 1401-1586）、そしてウイルス配列が宿主の染色体DNA中に組み込まれるリスクはない。近年、生きたままの減弱化MV Edmonstonワクチン株が、様々な種類の癌に対する、可能性のある腫瘍溶解性ウイルスとして研究されている（Msaouel P, et al., Prostate 2009, 69: 82-91; Allen C, et al., Expert Opin Biol Ther 2008, 8: 213-220; McDonald CJ, et al., Breast Cancer Res Treat 2006, 99: 177-184; and Blechacz B, et al., Hepatology 2006, 44: 1465-1477）。 Oncolytic virus therapy is very promising as a new strategy for cancer treatment that can be combined with traditional therapies. Currently, a wide range of viruses from many viral species are being evaluated as oncolytic agents (Vaha-Koskela MJ, et al., Cancer Lett 2007, 254: 178-216). Measles virus (MV, Morbilli virus genus, Paramyxoviridae family) is a virus with a membrane and has an unsegmented (-)-strand RNA genome. Compared with retroviruses and some DNA, MV grows completely in the cytoplasm (Griffin DE. Measles virus. In: David M. et al., (Eds). Fields Virology, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia : 2006, pp. 1401-1586), and there is no risk that the viral sequence will be integrated into the host chromosomal DNA. In recent years, live attenuated MV Edmonston vaccine strains have been studied as potential oncolytic viruses against various types of cancer (Msaouel P, et al., Prostate 2009, 69: 82-91 ; Allen C, et al., Expert Opin Biol Ther 2008, 8: 213-220; McDonald CJ, et al., Breast Cancer Res Treat 2006, 99: 177-184; and Blechacz B, et al., Hepatology 2006, 44: 1465-1477).
これまでに、3種類の細胞タンパク質が、MVレセプターとして同定されている。シグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocyte activation molecule；SLAM）は、免疫系の細胞上で主として発現されている（Sidorenko SP, and Clark EA. J Immunol 1993, 151: 4614-4624）。SLAMは、MVの野生型株およびMVのワクチン株の両方についてのレセプターとして機能する。CD46は、赤血球を除くすべてのヒト細胞上で遍在性に発現している（Dorig RE, et al., Cell 1993, 75: 295-305）。CD46は、MV EdmonstonなどのMVワクチン株に対してのみレセプターとして機能する。ポリオウイルスレセプター-関連4（PVRL4）は、MVの野生型株およびワクチン株の両方ともに対する上皮細胞レセプターとして、近年同定されたものである（Noyce RS, et al., PLoS Pathog 2011, 7: e1002240）。PVRL4は、免疫グロブリンスーパーファミリーの接着レセプターの構成分子であり、そして通常はカドヘリンとともに、接着結合部に局在している。この分子は、主として胎盤において発現しており、そして気管においてわずかに発現している（Reymond N, et al., J Biol Chem 2001, 276: 43205-43215）。近年の研究において、MVがRVRL4を標的として、気道中に出現することが示された（Muhlebach MD, et al., Nature 2011, 480: 530-533）。さらに、この分子は、乳房癌、肺癌、および卵巣癌についての腫瘍細胞マーカーであると報告された（Takano A, et al., Cancer Res 2009, 69: 6694-6703; Derycke MS, et al., Am J Clin Pathol 2010, 134: 835-845; and Fabre-Lafay S, et al., BMC Cancer 2007, 7: 73）。 So far, three types of cellular proteins have been identified as MV receptors. Signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) is mainly expressed on cells of the immune system (Sidorenko SP, and Clark EA. J Immunol 1993, 151: 4614-4624). SLAM functions as a receptor for both the wild-type strain of MV and the vaccine strain of MV. CD46 is ubiquitously expressed on all human cells except red blood cells (Dorig RE, et al., Cell 1993, 75: 295-305). CD46 functions as a receptor only for MV vaccine strains such as MV Edmonston. Poliovirus receptor-related 4 (PVRL4) has recently been identified as an epithelial cell receptor for both wild-type and vaccine strains of MV (Noyce RS, et al., PLoS Pathog 2011, 7: e1002240 ). PVRL4 is a constituent molecule of the immunoglobulin superfamily adhesion receptor and is usually located at the adhesion junction, along with cadherin. This molecule is mainly expressed in the placenta and slightly expressed in the trachea (Reymond N, et al., J Biol Chem 2001, 276: 43205-43215). Recent studies have shown that MVs target RVRL4 and appear in the airways (Muhlebach MD, et al., Nature 2011, 480: 530-533). Furthermore, this molecule has been reported to be a tumor cell marker for breast cancer, lung cancer, and ovarian cancer (Takano A, et al., Cancer Res 2009, 69: 6694-6703; Derycke MS, et al., Am J Clin Pathol 2010, 134: 835-845; and Fabre-Lafay S, et al., BMC Cancer 2007, 7: 73).
MVは、2種類のウイルス膜糖タンパク質、ヘモアグルチニン（H）タンパク質とフュージョン（F）タンパク質、を有する。Hタンパク質は、細胞レセプターと直接的に相互作用し、そしてFタンパク質が膜融合を生じるように誘引する。以前の研究において、そのレセプターとの相互作用のために必須なHタンパク質アミノ酸が同定され、そしてそれらの位置にアミノ酸置換を導入することにより、それぞれのレセプターを選択的に認識しない組換えMVを生成することができた。 MV has two types of viral membrane glycoproteins, hemoaglutinin (H) protein and fusion (F) protein. The H protein interacts directly with cellular receptors and attracts the F protein to cause membrane fusion. In previous studies, the H protein amino acids essential for interaction with their receptors were identified, and by introducing amino acid substitutions at those positions, recombinant MVs that did not selectively recognize each receptor were generated. We were able to.
ヒトの癌性疾患の検出ツールおよび治療方法における近年の改良にもかかわらず、転移が生じる場合には、従来の治療法によっては治療することが一般的に困難である。したがって、新たな治療戦略が必要とされている。 Despite recent improvements in human cancerous disease detection tools and treatment methods, when metastasis occurs, it is generally difficult to treat with conventional therapies. Therefore, new treatment strategies are needed.
本発明は、癌を治療するための効率的なツールを開発することを目的とする。 The present invention aims to develop an efficient tool for treating cancer.
本発明において、本発明の発明者らは、野生型MV HL株が、感染細胞中で効率的に増殖し、その結果としてSLAMを発現しない様々な癌細胞株においても、効率的な細胞死を引き起こすことを見出した。MVがヒトに感染すると、しばしば重篤な疾患である麻疹を引き起こすが、麻疹発症には、MVがSLAM発現細胞であるリンパ系細胞に感染することが重要であることが解明されている。この知見に基づいて、本発明の発明者らは、SLAMを認識しない組換えMV（rMV-SLAMblind）を作製することにより上記の課題を解決し、そして癌細胞（乳癌細胞など）に対する新規な治療剤としてのその潜在能力について研究した。本発明において、本発明の発明者らは、CD46に結合能力のない麻疹ウイルス野外株から、SLAMへの結合力も欠損させることにより、ヒトへのMVによる病原性は失わせた上で、この組換え麻疹ウイルスがPVRL4を高発現する多くの癌細胞にPVR4を介して入り、抗-癌性の腫瘍溶解作用を提供する能力を有することを見出し、併せてPVRL4に対する結合活性を有する麻疹ウイルスを含む癌を治療するための医薬組成物を提供することができることを見出した。 In the present invention, the inventors of the present invention have found that wild-type MV HL strains proliferate efficiently in infected cells, and as a result, efficient cell death in various cancer cell lines that do not express SLAM. Found to cause. When MV infects humans, it often causes measles, a serious disease, but it has been elucidated that it is important for MV to infect lymphoid cells that are SLAM-expressing cells. Based on this finding, the inventors of the present invention have solved the above-mentioned problems by producing a recombinant MV that does not recognize SLAM (rMV-SLAMblind), and a novel treatment for cancer cells (such as breast cancer cells). The potential as an agent was studied. In the present invention, the inventors of the present invention have lost the pathogenicity due to MV to humans by losing the binding ability to SLAM from a measles virus field strain that does not bind CD46. We found that the measles virus has the ability to enter many cancer cells that highly express PVRL4 via PVR4 and provide an anti-cancer oncolytic effect, including measles virus that has binding activity against PVRL4 It has been found that a pharmaceutical composition for treating cancer can be provided.
本発明の癌を治療するための医薬組成物中に含まれる新規な組換え麻疹ウイルは、感染細胞中で効率的な増殖を示し、結果として様々な癌細胞株において効率的な細胞死を引き起こす。 The novel recombinant measles virus contained in the pharmaceutical composition for treating cancer of the present invention exhibits efficient proliferation in infected cells, resulting in efficient cell death in various cancer cell lines .
腫瘍溶解性ウイルスは、従来から使用されている治療方式と組み合わせて使用することができる癌の新たな治療剤として、非常に有望である。麻疹ウイルス（MV）は、免疫系の細胞上に発現されるシグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocyte activation molecule；SLAM）を使用して細胞に侵入することが知られている。ヒト癌細胞株（例えば、乳癌細胞株）はSLAMを発現しないが、本発明者らは、野生型MV（HL株）が様々な乳癌細胞株に対して効率的に感染し、そしてその中で増殖し、結果としてSLAMを発現しない様々な癌細胞株（例えば、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、結腸直腸癌細胞株、など）の効率的な細胞死を引き起こすことを見出した。 Oncolytic viruses are very promising as new therapeutic agents for cancer that can be used in combination with conventionally used treatment modalities. Measles virus (MV) is known to invade cells using a signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) expressed on cells of the immune system. Although human cancer cell lines (eg, breast cancer cell lines) do not express SLAM, we have found that wild-type MV (HL lines) efficiently infect various breast cancer cell lines, and in which It has been found that it causes efficient cell death of various cancer cell lines that proliferate and consequently do not express SLAM (eg, breast cancer cell lines, ovarian cancer cell lines, colorectal cancer cell lines, etc.).
このような知見に基づいて、本発明の発明者らは、リバースジェネティクス手法を使用して、SLAMを選択的に利用することができない組換えMV（rMV-SLAMblind）を作製し、癌細胞（例えば、乳癌細胞）に対する新規な治療剤としてのそしてその潜在能力を研究した。本発明の発明者らは、rMV-SLAMblindが、SLAM-陽性リンパ球系細胞に対する感染性を失っているため、SLAM-陽性リンパ球系細胞の細胞生存率に対しては影響を与えないが、その一方で、SLAM-陰性癌細胞（例えば、乳癌細胞）に対して腫瘍溶解活性を維持していることを示した。 Based on such findings, the inventors of the present invention use a reverse genetics technique to produce a recombinant MV (rMV-SLAMblind) that cannot selectively utilize SLAM, and cancer cells ( For example, as a novel therapeutic agent for breast cancer cells) and its potential. The inventors of the present invention do not affect the cell viability of SLAM-positive lymphoid cells because rMV-SLAMblind has lost its infectivity to SLAM-positive lymphoid cells, On the other hand, it was shown to maintain oncolytic activity against SLAM-negative cancer cells (eg, breast cancer cells).
本発明の発明者らは、当該技術分野において以前に報告されているMVワクチン株とは異なり、MV-SLAMblindは、癌細胞（例えば、乳癌細胞株）に対して感染するためのリポーターとしてPVRL4を使用することができ、そして遍在性に発現されているCD46を使用することができないため、CD46-陽性の正常ヒト細胞に対してはほとんど感染しないことを示した。 Inventors of the present invention, unlike MV vaccine strains previously reported in the art, MV-SLAMblind uses PVRL4 as a reporter for infecting cancer cells (eg, breast cancer cell lines). CD46-positive normal human cells showed little infection because CD46, which can be used and ubiquitously expressed, cannot be used.
この知見と一致して、in vitroにおける腫瘍細胞でのEdmonston系列のワクチン株（rMV-Edmonston）の腫瘍溶解活性と比較して、rMV-SLAMblindは、顕著に高い腫瘍溶解活性を示した。一方、rMV-SLAMblindは、CD46-陽性の初代正常ヒト細胞に対しては細胞障害作用を引き起こさなかった。したがって、rMV-SLAMblindは、正常細胞に対しては感染しないが、癌細胞に対して特異的に感染することが示された。rMV-SLAMblindは、免疫欠損マウスにおけるヒト癌異種移植片（例えば、乳癌）に対して抗腫瘍活性を示し、そしてrMV-Edmonstonにより見出された作用と比較して、いくつかのがん細胞においてより高い作用が見出された。 Consistent with this finding, rMV-SLAMblind showed significantly higher oncolytic activity compared to the oncolytic activity of Edmonston series vaccine strain (rMV-Edmonston) on tumor cells in vitro. On the other hand, rMV-SLAMblind did not cause cytotoxic effects on CD46-positive primary normal human cells. Therefore, rMV-SLAMblind was shown not to infect normal cells but specifically to cancer cells. rMV-SLAMblind exhibits antitumor activity against human cancer xenografts (eg, breast cancer) in immune deficient mice, and in some cancer cells compared to the effects found by rMV-Edmonston A higher effect was found.
さらに、in vivo安全性を評価するため、MVに対する抗体陰性である3匹のサルに、rMV-SLAMblindを接種したところ、臨床的な症状は何も記録されなかった。これらの結果に基づいて、rMV-SLAMblindは、癌（例えば、乳癌）の治療のための新規な腫瘍溶解性ウイルスとして、有望な候補となりうると考えられる。 Furthermore, to evaluate in vivo safety, three monkeys that were negative for antibodies to MV were inoculated with rMV-SLAMblind, and no clinical symptoms were recorded. Based on these results, rMV-SLAMblind is considered to be a promising candidate as a novel oncolytic virus for the treatment of cancer (eg, breast cancer).
本発明の一態様において、本発明の発明者らは、ポリオウイルスレセプター-関連4（PVRL4）に対する結合活性を有する麻疹ウイルスを含む、癌を治療すための医薬組成物の発明を提供する。本発明における麻疹ウイルスは、PVRL4に対する結合活性を利用して、細胞上に発現するPVRL4に結合し、そして侵入することができる。これまでの検討の結果、PVRL4は、癌細胞（例えば、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、肺癌細胞株、結腸直腸癌細胞株、など）の細胞表面において発現されていることがしばしば見出されている。 In one aspect of the present invention, the inventors of the present invention provide an invention of a pharmaceutical composition for treating cancer comprising measles virus having binding activity against poliovirus receptor-related 4 (PVRL4). The measles virus in the present invention can bind to and invade PVRL4 expressed on cells using the binding activity to PVRL4. As a result of previous studies, PVRL4 is often found to be expressed on the cell surface of cancer cells (eg, breast cancer cell lines, ovarian cancer cell lines, lung cancer cell lines, colorectal cancer cell lines, etc.). ing.
その一方で、本発明における麻疹ウイルスは、シグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocyte activation molecule；SLAM）に対する結合活性またはCD46に対する結合活性を欠損している、これらの分子、SLAMやCD46は、正常な免疫系の細胞の細胞表面で発現されることが知られている分子である。そのため、このウイルスは、細胞表面にSLAMやCD46を通常発現している正常な免疫系の細胞には結合することも侵入することもできない。 On the other hand, the measles virus in the present invention is deficient in the binding activity to the signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) or the binding activity to CD46, these molecules, SLAM and CD46 are normal. It is a molecule known to be expressed on the cell surface of cells of the immune system. Therefore, this virus cannot bind or invade normal immune system cells that normally express SLAM or CD46 on the cell surface.
このような性質により、本発明のウイルスは、細胞上にPVRL4を発現する癌細胞に選択的に結合・感染し、感染された癌細胞に細胞死を誘導することができる、腫瘍溶解性ウイルスとして機能することが明らかになった。このウイルスが感染した癌細胞では、細胞内においてウイルスが増殖され、細胞を破壊してウイルスが放出されることにより、癌細胞に細胞死を誘導することができると考えられている。 Due to such properties, the virus of the present invention is an oncolytic virus capable of selectively binding to and infecting cancer cells expressing PVRL4 on cells and inducing cell death in the infected cancer cells. It became clear that it worked. In cancer cells infected with this virus, it is believed that the virus grows in the cells, destroys the cells and releases the virus, thereby inducing cell death in the cancer cells.
たとえば悪性度が高い癌細胞が、原発巣にとどまらず、他の組織に転移することが知られている。これまでの治療方法では、一旦癌細胞が転移の能力を有してしまうと、リンパ節などの多数の部位にばら撒かれてしまうため、手術によって身体から癌細胞を完全に除去することは困難である。そのため、癌に対する特異性が低い化学療法剤を使用せざるを得なかった。 For example, cancer cells with high malignancy are known to metastasize not only to the primary lesion but also to other tissues. In conventional treatment methods, once cancer cells have the ability to metastasize, it is difficult to completely remove cancer cells from the body by surgery, because they are scattered in many sites such as lymph nodes. It is. Therefore, chemotherapeutic agents with low specificity for cancer have to be used.
しかしながら、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、生体内のがん細胞に特異的に感染し，その中で増殖することができる。そのため、生体内にPVRL4を発現する細胞（すなわちがん細胞）が存在する場合には、感染し、増殖するというサイクルを繰り返すことができる。その結果、本発明のウイルスは、癌細胞が転移の能力を有した後であっても、細胞表面上にPVRL4を発現している限りは、転移巣においても癌細胞に結合・感染することができ、その結果として転移された癌細胞にも細胞死を誘導することができる。 However, the oncolytic virus of the present invention can specifically infect cancer cells in vivo and can grow therein. Therefore, when cells expressing PVRL4 (ie, cancer cells) exist in the living body, the cycle of infection and proliferation can be repeated. As a result, the virus of the present invention can bind to and infect cancer cells even in metastatic foci, even after cancer cells have the ability to metastasize, as long as PVRL4 is expressed on the cell surface. As a result, cell death can also be induced in metastasized cancer cells.
上述したような本発明のウイルスは、PVRL4に対しては結合する能力を有するが、SLAMやCD46に対しては結合する能力を有さないものである限りにおいて、自然界において発生した変異体であっても、遺伝子組み換え技術を使用して作出されたウイルス株であってもよい。本発明において好ましくは、組換えウイルスを使用する。 As described above, the virus of the present invention is a naturally occurring mutant as long as it has the ability to bind to PVRL4 but not to SLAM or CD46. Alternatively, it may be a virus strain created using genetic recombination technology. In the present invention, a recombinant virus is preferably used.
上述した組換えウイルスを作製するために使用する親株の麻疹ウイルス株として、種々の麻疹ウイルス株を使用することができる。たとえば、野生型麻疹ウイルス（たとえば、MV-HL株、など）、既存の弱毒生ワクチン株（たとえば、MV Edmonstonワクチン株、Schwarz-FF8株、AIK-C株、田辺株、TD97株、など）などを使用することができる。 Various measles virus strains can be used as the parent strain of measles virus used for producing the above-mentioned recombinant virus. For example, wild-type measles virus (for example, MV-HL strain), existing live attenuated vaccine strain (for example, MV Edmonston vaccine strain, Schwarz-FF8 strain, AIK-C strain, Tanabe strain, TD97 strain, etc.) Can be used.
本発明の一態様において、これらの麻疹ウイルス株のHタンパク質に変異を生じさせることにより、SLAMやCD46に対しては結合する能力を欠損させることができる。このようにSLAMやCD46に対して結合する能力を欠損させることにより、SLAMやCD46を有するがPVRL4は有さない麻疹ウイルスの通常の標的細胞である免疫系の細胞などには、本発明の組換えウイルスは感染することができなくなるため、治療対象（すなわち特定の癌に罹患した患者）に対してこの組換えウイルスを投与した場合であっても、麻疹を発症させる危険性をなくすことができる。 In one embodiment of the present invention, the ability to bind to SLAM or CD46 can be lost by causing mutations in the H protein of these measles virus strains. By deficient in the ability to bind to SLAM and CD46 in this manner, the cells of the immune system, which are normal target cells of measles virus having SLAM and CD46 but not PVRL4, etc. Since the replacement virus can no longer be infected, the risk of developing measles can be eliminated even when this recombinant virus is administered to a subject to be treated (ie, a patient suffering from a specific cancer) .
一方で、本発明のウイルスは、SLAMやCD46は有さないがPVRL4を有する特定の癌細胞に感染して、その細胞中で増殖し、細胞を破壊し、体液中に子孫ウイルスを放出することができる。従って、生体内において標的となるPVRL4を有する特定の癌細胞が存在する限りにおいて、本発明のウイルスの感染、感染細胞の溶解を繰り返すことができる。また、血流に乗って移動することも可能であり、癌細胞が転移した場合でも、その細胞が転移後もPVRL4を有する限りは、本発明の組換えウイルスは、転移巣においてがん細胞に対して感染し、細胞を溶解することができる。 On the other hand, the virus of the present invention infects a specific cancer cell that does not have SLAM or CD46 but has PVRL4, grows in the cell, destroys the cell, and releases the progeny virus into the body fluid Can do. Therefore, as long as there is a specific cancer cell having PVRL4 as a target in vivo, the infection of the virus of the present invention and the lysis of the infected cell can be repeated. In addition, even if a cancer cell has metastasized, the recombinant virus of the present invention can be transferred to the cancer cell in the metastasis as long as the cell still has PVRL4 after metastasis. It can infect and lyse cells.
SLAMやCD46に対しては結合する能力を欠損させた、このようなHタンパク質における変異としては、Hタンパク質のアミノ酸配列の533番目アミノ酸残基を、野生型株などにおけるアルギニンから、アラニンに置換する変異や、194番目をイソロイシンからセリンに置換する変異などを例として挙げることができる。この様な組換えウイルスは、例えば、麻疹ウイルスHL野生型株の全長アンチゲノムcDNAをコードするプラスミドpMV-HL（7+）を使用して、そのHタンパク質の533番目アミノ酸残基のアルギニンをアラニンによりアミノ酸置換したベクター（pMV-SLAMblind）を調製し、pMV-SLAMblindベクターを利用してリバースジェネティクス手法により調製される。ここで使用される、533番目アミノ酸残基のアルギニンをアラニンによりアミノ酸置換した麻疹ウイルスHL野生型株の全長アンチゲノムcDNAは、SEQ ID NO: 1に示される塩基配列を含んでおり、これが翻訳されることにより、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるNタンパク質、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列からなるリンタンパク質、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列からなるMタンパク質、SEQ ID NO: 5のアミノ酸配列からなるFタンパク質、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列からなるHタンパク質、SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列からなるLタンパク質、がそれぞれ生成され、結果としてウイルスを生成することができる。 As a mutation in such H protein that lacks the ability to bind to SLAM and CD46, the 533th amino acid residue of the amino acid sequence of H protein is replaced with alanine from arginine in wild type strains, etc. Examples include mutations and mutations in which the 194th is replaced from isoleucine to serine. Such a recombinant virus, for example, uses the plasmid pMV-HL (7+) encoding the full-length antigenomic cDNA of the measles virus HL wild type strain, and converts arginine at the 533st amino acid residue of the H protein to alanine. A vector (pMV-SLAMblind) with amino acid substitution is prepared by the above, and prepared by a reverse genetics technique using the pMV-SLAMblind vector. The full-length antigenomic cDNA of the measles virus HL wild-type strain in which arginine at the 533rd amino acid residue is substituted with alanine as used herein contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which is translated. N protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, phosphoprotein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, M protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, amino acid of SEQ ID NO: 5 An F protein consisting of the sequence, an H protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and an L protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 are generated, and as a result, a virus can be generated.
Hタンパク質の変異を生成させるもとのウイルス株は、上述した野生型MV-HL株以外の株であってもよいことから、本発明の組換えウイルスの態様は、上述のpMV-SLAMblindベクター（SEQ ID NO: 1）を利用したものには限定されない。たとえば、Edmonston Bワクチン株の全長アンチゲノムcDNAをコードするプラスミドp（+）MV2A（GenBankアクセッションno. Z66517）に対して、Hタンパク質の533番目アミノ酸残基をアラニンに置換する変異を導入して作製した変異ベクターを利用してリバースジェネティクス手法により調製することによっても、組換えウイルスを生成することもできる。 Since the original virus strain that generates the mutation of the H protein may be a strain other than the wild-type MV-HL strain described above, the embodiment of the recombinant virus of the present invention is the above-described pMV-SLAMblind vector ( It is not limited to those using SEQ ID NO: 1). For example, a mutation that replaces the 533th amino acid residue of H protein with alanine was introduced into plasmid p (+) MV2A (GenBank Accession no. Z66517) encoding the full-length antigenomic cDNA of Edmonston B vaccine strain. A recombinant virus can also be produced by preparing the mutant vector using a reverse genetics technique.
本発明の医薬組成物は、PVRL4に対する結合活性を有する麻疹ウイルスを必須の構成要素として含有するが、これ以外にどのような補助成分（例えば、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、免疫賦活剤など）を含んでいてもよい。 The pharmaceutical composition of the present invention contains measles virus having an activity of binding to PVRL4 as an essential component, but any other auxiliary component (for example, pharmaceutically acceptable carrier, excipient, immunity) An activator, etc.).
実施例1：材料と方法
細胞
B95a細胞、CHO-K1細胞、Vero細胞および293細胞は、以前から記載されているものである（Watanabe A, et al., J Virol 2010, 84: 4183-4193；およびKobune F, et al., J Gen Viral 1991, 72（ Pt 3）: 687-692）。SKBR3ヒト乳癌細胞およびMCF7ヒト乳癌細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターthe Cell Resource Center for the Biomedical Research Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University, Miyagi, Japanから入手した）を、5％ウシ胎児血清（FBS）を添加したRPMI培養液（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）中で維持した。MDA-MB-453ヒト乳癌細胞（ATCC, Manassas, VA, USA）を、5％FBSを添加したL-15培養液（Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）中で維持した。BHK細胞を、5％FBSを添加したDulbecco改変Eagle培養液（Sigma-Aldrich）中で増殖させた。NHDF細胞を、Cell Systems（Kirkland, WA, USA）から購入し、そしてCSC増殖因子（Cell Systems）および5％FBSを添加したCS-C培養液（Cell Systems）中で維持した。
Example 1: Materials and Methods Cells
B95a, CHO-K1, Vero and 293 cells have been previously described (Watanabe A, et al., J Virol 2010, 84: 4183-4193; and Kobune F, et al., J Gen Viral 1991, 72 (Pt 3): 687-692). SKBR3 human breast cancer cells and MCF7 human breast cancer cells (obtained from the Cell Resource Center for the Biomedical Research Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University, Miyagi, Japan) Maintained in RPMI medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplemented with% fetal bovine serum (FBS). MDA-MB-453 human breast cancer cells (ATCC, Manassas, VA, USA) were maintained in L-15 culture medium (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) supplemented with 5% FBS. BHK cells were grown in Dulbecco's modified Eagle medium (Sigma-Aldrich) supplemented with 5% FBS. NHDF cells were purchased from Cell Systems (Kirkland, WA, USA) and maintained in CS-C media (Cell Systems) supplemented with CSC growth factor (Cell Systems) and 5% FBS.
組換えMVの回収
pMV-HL（7+）プラスミドは、MV HL野生型株の全長アンチゲノムcDNAをコードする（Terao-Muto Y, et al., Antiviral Res 2008, 80: 370-376）。高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）遺伝子およびホタルルシフェラーゼ（luc）遺伝子をコードする追加の転写ユニットを有するpMV-EGFPおよびpMV-LUCが、以前に報告された（Terao-Muto Y, et al., Antiviral Res 2008, 80: 370-376; Watanabe A, et al., J Virol 2010, 84: 4183-4193）。R533A置換を部位特異的変異生成によりpMV-HL（7+）、pMV-EGFP、およびpMV-LUCに導入し、そして得られたプラスミドをそれぞれpMV-SLAMblind、pMV-EGFP-SLAMblind、およびpMV-luc-SLAMblindと命名した。pMV-SLAMblind、pMV-EGFP-SLAMblind、およびpMV-luc-SLAMblindのベクターのインサート構成は、図1dに概略を示す通りである。
Recombinant MV recovery
The pMV-HL (7+) plasmid encodes the full-length antigenomic cDNA of the MV HL wild type strain (Terao-Muto Y, et al., Antiviral Res 2008, 80: 370-376). PMV-EGFP and pMV-LUC with additional transcription units encoding the sensitive green fluorescent protein (EGFP) gene and firefly luciferase (luc) gene have been previously reported (Terao-Muto Y, et al., Antiviral Res 2008, 80: 370-376; Watanabe A, et al., J Virol 2010, 84: 4183-4193). The R533A substitution was introduced into pMV-HL (7+), pMV-EGFP, and pMV-LUC by site-directed mutagenesis and the resulting plasmids were pMV-SLAMblind, pMV-EGFP-SLAMblind, and pMV-luc, respectively. -It was named SLAMblind. The vector insert configuration of pMV-SLAMblind, pMV-EGFP-SLAMblind, and pMV-luc-SLAMblind is as outlined in FIG. 1d.
プラスミドp（+）MV2A（M.A. Billeterから贈与を受けた）は、Edmonston Bワクチン株の全長アンチゲノムcDNAをコードする（Radecke F, et al., EMBO J 1995, 14: 5773-5784）。本発明の発明者らは、p（+）MV2Aが、Edmonston B株の報告された配列データ（GenBankアクセッションno. Z66517）から、以下のヌクレオチドの変化：A3310G、C3627T、C4708T、T5703A、A5737G、C6414T、A6477G、T6546C、T7023C、T8353C、A8721C、およびA8745G、を有することを見出した。これらの変化のうち5つにおいて、P（M502V）タンパク質、M（P64S）タンパク質、F（M97V）タンパク質およびH（N484TおよびE492G）タンパク質におけるアミノ酸変化を生じた。 Plasmid p (+) MV2A (a gift from M.A. Billeter) encodes the full-length antigenomic cDNA of Edmonston B vaccine strain (Radecke F, et al., EMBO J 1995, 14: 5773-5784). The inventors of the present invention have determined that p (+) MV2A is from the reported sequence data of Edmonston B strain (GenBank Accession no. Z66517) with the following nucleotide changes: A3310G, C3627T, C4708T, T5703A, A5737G, It was found to have C6414T, A6477G, T6546C, T7023C, T8353C, A8721C, and A8745G. Five of these changes resulted in amino acid changes in P (M502V), M (P64S), F (M97V) and H (N484T and E492G) proteins.
組換えMV-HL（rMV）およびrMV-EGFPを、以前に記載されたように回収した（Terao-Muto Y, et al., Antiviral Res 2008, 80: 370-376）。SLAM-blind組換えMVを回収するため、MCF7細胞を、ウイルスの限定的なレセプター利用に基づくウイルス増幅のために使用した。p（+）MV2Aから回収されたウイルスは、rMV-Edmonstonと命名した。rMV-Edmonstonを回収するため、Vero細胞をウイルス増殖のために使用した。 Recombinant MV-HL (rMV) and rMV-EGFP were recovered as previously described (Terao-Muto Y, et al., Antiviral Res 2008, 80: 370-376). To recover SLAM-blind recombinant MVs, MCF7 cells were used for viral amplification based on limited receptor utilization of the virus. The virus recovered from p (+) MV2A was named rMV-Edmonston. Vero cells were used for virus propagation to recover rMV-Edmonston.
ウイルス力価
ウイルス力価を、Reed-Muench法（Reed LJ, et al., Am J Hyg 1938, 27: 493-497）により50％組織培養感染量（TCID50）として決定した。SLAM-blind組換えMVの力価は、レセプター使用制限によりPVRL4-発現細胞中でのみ測定することができ、そしてしたがって、MCF7細胞中でのみ力価を調べることができた。MCF7細胞におけるMV感染は、EGFPの蛍光により、または抗-Nタンパク質モノクローナル抗体（MAb）8G（Masuda M, et al., Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2006, 29: 157-165）を一次抗体としてそしてAlexa-Fluor-488-結合抗-マウス抗体（Invitrogen）を二次抗体としてそれぞれ使用して免疫染色することにより間接的に、検出した。本発明の発明者らは、MCF7細胞中で測定されたrMVおよびrMV-EGFPの力価が、B95a細胞において測定された力価と同様であり、そしてMCF7細胞中で測定されたrMV-Edmonstonの力価が、Vero細胞中で測定された力価と同様であったことに注目している。
Virus titer Virus titer was determined as 50% tissue culture infectious dose (TCID 50 ) by the Reed-Muench method (Reed LJ, et al., Am J Hyg 1938, 27: 493-497). The titer of SLAM-blind recombinant MV could only be measured in PVRL4-expressing cells due to receptor usage limitations, and therefore the titer could only be examined in MCF7 cells. MV infection in MCF7 cells is achieved by fluorescence of EGFP or with anti-N protein monoclonal antibody (MAb) 8G (Masuda M, et al., Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2006, 29: 157-165) as primary antibody and Alexa Detection was indirectly by immunostaining using -Fluor-488-conjugated anti-mouse antibody (Invitrogen) as secondary antibody respectively. The inventors of the present invention found that rMV and rMV-EGFP titers measured in MCF7 cells were similar to those measured in B95a cells and that rMV-Edmonston measured in MCF7 cells. Note that the titer was similar to the titer measured in Vero cells.
RT-PCR解析
全RNAを、ISOGEN（Nippon Gene, Tokyo, Japan）を使用して細胞から抽出し、そして2μgの全RNAをPrimeScript RTase（Takara, Shiga, Japan）を使用して、ランダムヘキサマープライミングにより逆転写した。得られたcDNAを、Thermo-start Taq DNAポリメラーゼ（ABgene, Epsom, UK）をSLAM mRNAに特異的なプライマー対またはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNAに特異的なプライマー対とともに用いて、PCR-増幅した。PCRアンプリコンを、アガロースゲル上で可視化した。
RT-PCR analysis Total RNA is extracted from cells using ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japan), and 2μg of total RNA is random hexamer primed using PrimeScript RTase (Takara, Shiga, Japan) Was reverse transcribed. Using the resulting cDNA, Thermo-start Taq DNA polymerase (ABgene, Epsom, UK) with a primer pair specific for SLAM mRNA or a primer pair specific for glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA PCR-amplified. PCR amplicons were visualized on agarose gels.
ウイルス増殖性試験
12-ウェルプレート中のMCF7細胞の単層を、MOI 0.01の組換えMVに感染させ、そして5％FCSを添加したRPMI培養液中でインキュベートした。様々な時点で、放出されたウイルスを培養上清から得て、そして細胞に結合したウイルスを凍結融解を3回繰り返すことにより感染細胞から回収した。ウイルス力価は、MCF7細胞中で測定した。
Virus growth test
Monolayers of MCF7 cells in 12-well plates were infected with recombinant MV with MOI 0.01 and incubated in RPMI medium supplemented with 5% FCS. At various time points, the released virus was obtained from the culture supernatant, and the virus bound to the cells was recovered from the infected cells by repeated freeze-thaw three times. Virus titer was measured in MCF7 cells.
抗体を使用した感染阻害アッセイ
96-ウェルプレート中のMCF-7細胞、MDA-MB-453細胞、SKBR3細胞、およびVero細胞の単層を、10μg/mlの抗-ヒトCD46 MAb（クローンM177；HyCult Biotechnology, Uden, Netherlands）（Iwata K, et al., J Biol Chem 1995, 270: 15148-15152）または抗-ヒトPVRL4ヤギポリクローナル抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を含有する培養液を用いて、37℃にて1時間、事前調製した。4種の細胞株の対照単層を、抗体を含まない培養液を用いて同様に処置した。
Infection inhibition assay using antibodies
Monolayers of MCF-7 cells, MDA-MB-453 cells, SKBR3 cells, and Vero cells in 96-well plates were collected at 10 μg / ml anti-human CD46 MAb (clone M177; HyCult Biotechnology, Uden, Netherlands) ( Iwata K, et al., J Biol Chem 1995, 270: 15148-15152) or an anti-human PVRL4 goat polyclonal antibody (R & D Systems, Minneapolis, Minn., USA) at 37 ° C. Pre-prepared for hours. Control monolayers of the four cell lines were similarly treated with antibody-free culture medium.
細胞を、それぞれMOI 0.1のrMV-EGFP、rMV-EGFP-SLAMblind、またはrMV-Edmonstonに感染させた。感染後、細胞を、抗体を含む培養液中または抗体を含まない培養液中でインキュベートした。rMV-Edmonstonに感染させた細胞は、抗-Nウサギポリクローナル抗体を使用した免疫染色により検出された。細胞を、2 dpi（Vero細胞の場合）または3 dpiに、蛍光顕微鏡の下で観察した。 Cells were infected with rMV-EGFP, rMV-EGFP-SLAMblind, or rMV-Edmonston with MOI 0.1, respectively. After infection, the cells were incubated in culture medium with or without antibody. Cells infected with rMV-Edmonston were detected by immunostaining using anti-N rabbit polyclonal antibody. Cells were observed under a fluorescence microscope at 2 dpi (for Vero cells) or 3 dpi.
CD46およびPVRL4を発現するプラスミドをトランスフェクトした細胞に対するウイルス感染性の解析
ヒトCD46 cDNA（C2アイソフォーム）およびヒトPVRL4 cDNAを、それぞれ293細胞およびMCF7細胞由来の全RNAのRT-PCRにより得た。cDNAをpCAGGS（Niwa H, et al., Gene 1991, 108: 193-199）中にサブクローニングした。得られたプラスミドを、pCAG-hCD46およびpCAG-hPVRL4と命名した。
Analysis of viral infectivity for cells transfected with plasmids expressing CD46 and PVRL4 Human CD46 cDNA (C2 isoform) and human PVRL4 cDNA were obtained by RT-PCR of total RNA from 293 cells and MCF7 cells, respectively. The cDNA was subcloned into pCAGGS (Niwa H, et al., Gene 1991, 108: 193-199). The resulting plasmids were named pCAG-hCD46 and pCAG-hPVRL4.
pCAG-hCD46のトランスフェクションに関して、CHO-K1細胞を6-ウェルプレートにまき、pCAG-hCD46またはpCAGGSのいずれかによりトランスフェクトした。一晩インキュベートした後、細胞をトリプシン処理によりプレートから剥がし、そして96-ウェルプレートにまいた。翌日、細胞を、MOI 1のrMV-SLAMblindまたはrMV-Edmonstonを接種し、37℃で1時間感染させた。ウイルス接種物は、融合阻害性ペプチド（z-D-Phe-Phe-Gly；Sigma-Aldrich）を含有する培養液に置換し、細胞-細胞融合およびウイルス子孫による融合を防止した。 For transfection of pCAG-hCD46, CHO-K1 cells were plated in 6-well plates and transfected with either pCAG-hCD46 or pCAGGS. After overnight incubation, the cells were detached from the plate by trypsinization and seeded in 96-well plates. The next day, cells were inoculated with MOI 1 of rMV-SLAMblind or rMV-Edmonston and infected at 37 ° C. for 1 hour. The virus inoculum was replaced with a culture medium containing a fusion inhibitory peptide (z-D-Phe-Phe-Gly; Sigma-Aldrich) to prevent cell-cell fusion and fusion by virus progeny.
インキュベーションは、37℃にて2日間継続し、そして細胞を4％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、そして抗-N MAbを使用して免疫染色した。ウェルあたりの感染細胞の数を、蛍光顕微鏡の下でカウントした。pCAG-hCD46またはpCAGGSによりトランスフェクトした細胞における比感染性を、3回のカウントの平均を、pCAGGSによりトランスフェクトした細胞における3回のカウントの平均により割り算することにより計算した。 Incubation was continued for 2 days at 37 ° C. and cells were fixed with 4% paraformaldehyde and immunostained with anti-N MAb. The number of infected cells per well was counted under a fluorescence microscope. Specific infectivity in cells transfected with pCAG-hCD46 or pCAGGS was calculated by dividing the average of 3 counts by the average of 3 counts in cells transfected with pCAGGS.
CHO-K1細胞はpCAG-hPVRL4によるトランスフェクションの後に死んでしまったため、本発明の発明者らは、BHK細胞を使用した。BHK細胞を、上述したようにpCAG-hPVRL4またはpCAGGSによりトランスフェクトし、MOI 0.1のrMV-SLAMblindまたはrMV-Edmonstonにより感染させた。pCAG-hPVRL4またはpCAGGSによりトランスフェクトした細胞における比感染性を、上述したように測定した。 Since CHO-K1 cells died after transfection with pCAG-hPVRL4, the inventors of the present invention used BHK cells. BHK cells were transfected with pCAG-hPVRL4 or pCAGGS as described above and infected with rMV-SLAMblind or rMV-Edmonston with MOI 0.1. Specific infectivity in cells transfected with pCAG-hPVRL4 or pCAGGS was measured as described above.
WST-1アッセイ
細胞生存率を、WST-1細胞増殖キット（Takara）を使用して測定した。96-ウェルプレートにおける細胞の単層に、様々なMOIの組換えMVを感染させた。培養液を、3 dpi、5 dpiおよび7 dpiに交換した。細胞生存率を、マイクロプレートリーダーモデル450（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）上で450 nmの吸光度で測定した。ウイルスに感染させた細胞の生存率を、3回の吸光値の平均を、非感染細胞の3回の吸光値の平均により割り算して算出し、そして％で表示した。
WST-1 assay Cell viability was measured using the WST-1 cell proliferation kit (Takara). Monolayers of cells in 96-well plates were infected with various MOI recombinant MVs. The culture medium was changed to 3 dpi, 5 dpi and 7 dpi. Cell viability was measured at 450 nm absorbance on a microplate reader model 450 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Viability of cells infected with the virus was calculated by dividing the average of the three absorbance values by the average of the three absorbance values of the uninfected cells and expressed in%.
in vivo腫瘍溶解活性の評価
すべての動物実験は、東京大学の実験動物委員会により承認を受けた。6週齢のメスSCIDマウスを、Clea Japan（Tokyo, Japan）から購入した。MCF7細胞（1.5×106）またはMDA-MB-453細胞（3×106）を、50μlのPBS中に懸濁し、そして懸濁物を50μlのMatrigel HC（BD Biosciences, San Diego, CA, USA）と混合し、その後皮下に注射した。MCF7群について、マウスに対して、105 TCID50のrMV-SLAMblind（n = 5）、rMV-Edmonston（n = 5）またはOpti-MEM（Invitrogen）（n = 5）を移植6日後に腫瘍内投与した。ウイルス投与を、3 dpiおよび19 dpiに繰り返した。MDA-MB-453群について、マウスに対して、106 TCID50のrMV-SLAMblind（n = 9）、rMV-Edmonston（n = 9）またはOpti-MEM（n = 8）を移植14日後に腫瘍内投与した。ウイルス投与を、14 dpiに繰り返した。腫瘍の直径を、キャリパーを用いて測定した。腫瘍の体積を、以下の式（幅×幅×長さ）／2に基づいて算出した。
Evaluation of in vivo oncolytic activity All animal experiments were approved by the Laboratory Animal Committee of the University of Tokyo. Six week old female SCID mice were purchased from Clea Japan (Tokyo, Japan). MCF7 cells (1.5 × 10 6 ) or MDA-MB-453 cells (3 × 10 6 ) are suspended in 50 μl PBS and the suspension is suspended in 50 μl Matrigel HC (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). ) And then injected subcutaneously. For MCF7 group, 10 5 TCID 50 rMV-SLAMblind (n = 5), rMV-Edmonston (n = 5) or Opti-MEM (Invitrogen) (n = 5) were injected into the tumor 6 days after transplantation. Administered. Viral administration was repeated at 3 and 19 dpi. For MDA-MB-453 group, 10 6 TCID 50 rMV-SLAMblind (n = 9), rMV-Edmonston (n = 9), or Opti-MEM (n = 8) tumor in mice 14 days after transplantation It was administered internally. Virus administration was repeated at 14 dpi. Tumor diameter was measured using calipers. Tumor volume was calculated based on the following formula (width × width × length) / 2.
組換えMVによるMDA-MB-453 異種移植片のin vivo感染の可視化
6週齢のメスBALB/cヌードマウスを、Clea Japanから購入した。11匹のマウスに対して、上述したようにMDA-MB-453細胞を皮下に移植した。5匹のマウスに対して、細胞-不含PBS／マトリゲル混合物（腫瘍不含対照）を注射した。移植後14日後に、マウスに対して、106 TCID50のrMV-luc-SLAMblindまたはOpti-MEM（培養液対照）の一回腫瘍内注射を投与した。In vivoBLIを、感染10時間後、1 dpi、2 dpi、4 dpi、7 dpi、14 dpi、および21 dpiに行った。それぞれのイメージングの前に、マウスに、200μlのPBSで希釈した3 mgのD-ルシフェリン（Gold Biotechnology, St. Louis, MO, USA）を注射した(Inoue Y, et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging 2009, 36: 771-779)。
Visualization of in vivo infection of MDA-MB-453 xenografts by recombinant MV
Six week old female BALB / c nude mice were purchased from Clea Japan. Eleven mice were implanted subcutaneously with MDA-MB-453 cells as described above. Five mice were injected with a cell-free PBS / Matrigel mixture (tumor-free control). Fourteen days after transplantation, mice received a single intratumoral injection of 10 6 TCID 50 of rMV-luc-SLAMblind or Opti-MEM (culture medium control). In vivo BLI was performed at 1 dpi, 2 dpi, 4 dpi, 7 dpi, 14 dpi, and 21 dpi 10 hours after infection. Prior to each imaging, mice were injected with 3 mg D-luciferin (Gold Biotechnology, St. Louis, MO, USA) diluted with 200 μl PBS (Inoue Y, et al., Eur J Nucl Med Mol). Imaging 2009, 36: 771-779).
画像を、ルシフェリン投与の約15分後に、Xenogen Ivis 100 System（Xenogen/Caliper Life Sciences, Alameda, CA, USA）を使用して取得した。IVIS 100冷却CCDカメラシステムを、放射光取得のために使用した。ルシフェラーゼ活性を、Living Image Software（version 2.5; Xenogen）を使用して解析した。ホタルルシフェラーゼレベルは、光子・sec-1 cm-2で表した。BLIとMRIとの融合画像は、以前の報告と同様の方法で得た（Inoue Y, et al., Mol Imaging 2010, 9: 163-172）。 Images were acquired using the Xenogen Ivis 100 System (Xenogen / Caliper Life Sciences, Alameda, CA, USA) approximately 15 minutes after luciferin administration. An IVIS 100 cooled CCD camera system was used for synchrotron radiation acquisition. Luciferase activity was analyzed using Living Image Software (version 2.5; Xenogen). Firefly luciferase levels were expressed in photons · sec −1 cm −2 . BLI and MRI fusion images were obtained in a similar manner as previously reported (Inoue Y, et al., Mol Imaging 2010, 9: 163-172).
サルへのrMV-SLAMblindの接種
4歳齢のメスのカニクイザル（Macaca fascicularis）および2頭の15ヶ月齢のオスアカゲザル（Macaca mulatta）を、日本野生動物研究所（Japan Wild Animal Research, Kagoshima, Japan）から取得し、MVに対する血清中抗体価が陰性であることを確認した。サルに対して、106 TCID50のrMV-SLAMblindを皮下に接種した。
Inoculation of monkeys with rMV-SLAMblind
4 year old female cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) and two 15 month old male rhesus macaques (Macaca mulatta) were obtained from Japan Wild Animal Research, Kagoshima, Japan, and in serum against MV It was confirmed that the antibody titer was negative. Monkeys were inoculated subcutaneously with 10 6 TCID 50 of rMV-SLAMblind.
白血球数
100μlの末梢血を、様々な時点で回収し、白血球数を、自動化血液解析装置（モデルKX-21NV; Sysmex, Kobe, Japan）を使用してカウントした。白血球、好中球、好酸球、好塩基球および単球の割合を、ギムザ染色薄層血液スメア上で測定した。
White blood cell count
100 μl of peripheral blood was collected at various time points and white blood cell counts were counted using an automated hematology analyzer (model KX-21NV; Sysmex, Kobe, Japan). The percentage of leukocytes, neutrophils, eosinophils, basophils and monocytes was measured on Giemsa stained thin blood smears.
末梢血単核球細胞（PBMC）中のウイルス排出量の検査
2 mlの末梢血を、2 dpi、4 dpi、7 dpi、14 dpi、および21 dpiに回収した。血液を、PBS中で10 mlに希釈し、3 mlの濃度勾配分離培地媒体（49.2％Percollおよび150mM NaCl）上に重層し、400 g、室温にて30分間遠心分離した。PBMCを界面から回収した。PBSにより2回洗浄した後、細胞を2 mlのRPMI培養液中に再懸濁した。ウイルス血症を、MCF7細胞との終点希釈共培養により定量した。PBMCの連続10倍希釈を、5％FBSを添加したRPMI培養液中で行った。PBMCの4つの複製物を、96-ウェルプレート中でMCF7細胞とともに共培養した。培養を、7日間維持し、そしてウイルス力価について抗-N MAbを使用して免疫染色した。
Examination of viral excretion in peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
2 ml of peripheral blood was collected at 2 dpi, 4 dpi, 7 dpi, 14 dpi, and 21 dpi. The blood was diluted to 10 ml in PBS and overlaid on 3 ml gradient media (49.2% Percoll and 150 mM NaCl) and centrifuged at 400 g for 30 minutes at room temperature. PBMC were collected from the interface. After washing twice with PBS, the cells were resuspended in 2 ml RPMI medium. Viremia was quantified by end point dilution co-culture with MCF7 cells. Serial 10-fold dilutions of PBMC were performed in RPMI medium supplemented with 5% FBS. Four replicates of PBMC were co-cultured with MCF7 cells in 96-well plates. Cultures were maintained for 7 days and immunostained using anti-N MAbs for virus titer.
フローサイトメトリー
細胞を、2 mM EDTAを用いて剥ぎとり、その後200 gで遠心分離することによりペレットにした。ペレットにした細胞を、サンプルバッファー（1％ウシ血清アルブミンと0.02％NaN3とを含むPBS）中で再懸濁した。細胞（106）を100μlのサンプルバッファー中0.5μgの一次抗体を用いて、氷上で30分間、インキュベートした。以下の抗体を、一次抗体として使用した：抗-ヒトSLAM MAb（クローン7D4；Biolegend, San Diego, CA, USA）、抗-ヒトCD46 MAb、抗-PVRL4ヤギポリクローナル抗体（R&D Systems）、マウス対照IgG1（R&D Systems）、およびヤギ対照IgG（R&D Systems）。細胞を、PBSにより1回洗浄し、そして100μlのサンプルバッファー中0.1μgのAlexa-488-結合抗-マウス抗体または抗-ヤギ抗体（Invitrogen）を用いて、氷上で30分間インキュベートした。PBSにより2回洗浄した後、細胞を4％パラホルムアルデヒドにより固定化し、そしてBD FACSCalibur（BD Biosciences）上で解析した。
Flow cytometry Cells were peeled using 2 mM EDTA and then pelleted by centrifugation at 200 g. The pelleted cells were resuspended in sample buffer (PBS containing 1% bovine serum albumin and 0.02% NaN 3 ). Cells (10 6 ) were incubated for 30 minutes on ice with 0.5 μg primary antibody in 100 μl sample buffer. The following antibodies were used as primary antibodies: anti-human SLAM MAb (clone 7D4; Biolegend, San Diego, CA, USA), anti-human CD46 MAb, anti-PVRL4 goat polyclonal antibody (R & D Systems), mouse control IgG1 (R & D Systems), and goat control IgG (R & D Systems). Cells were washed once with PBS and incubated for 30 minutes on ice with 0.1 μg Alexa-488-conjugated anti-mouse antibody or anti-goat antibody (Invitrogen) in 100 μl sample buffer. After washing twice with PBS, cells were fixed with 4% paraformaldehyde and analyzed on a BD FACSCalibur (BD Biosciences).
検討
潜在的な臨床的用途のための腫瘍溶解性MVを開発するため、本発明者らは、rMV-SLAMblindを生成した。サルにおいてそれは弱毒化されていた。患者および感染させたサルでの以前の研究からは、生体内でSLAM陽性細胞の分布がMV感染部位とよく相関することが示され（Yanagi Y, et al., Jpn J lnfect Dis 2006, 59: 1-5）、そしてSLAM-陽性のTリンパ球およびBリンパ球がMVの主要な標的であることが示された（de Swart RL, et al., PLoS Pathog 2007, 3: el78）。リンパ球減少症や免疫抑制を含むほとんどのMVの病理が、MV感染にSLAMが使用されていることにより説明することができることが示唆された。したがって、SLAMを使用することができない組換えMVは弱毒化されると考えられた。
Discussion To develop an oncolytic MV for potential clinical use, we generated rMV-SLAMblind. In monkeys it was attenuated. Previous studies in patients and infected monkeys showed that the distribution of SLAM positive cells in vivo correlated well with the site of MV infection (Yanagi Y, et al., Jpn J lnfect Dis 2006, 59: 1-5), and SLAM-positive T and B lymphocytes have been shown to be the primary targets of MV (de Swart RL, et al., PLoS Pathog 2007, 3: el78). It was suggested that most MV pathologies, including lymphopenia and immunosuppression, can be explained by the use of SLAM for MV infection. Therefore, it was considered that recombinant MVs that cannot use SLAM are attenuated.
rMV-SLAMblindに感染させたサルにおいて疾患の臨床的証拠が何も見出されなかったという結果により、この予想が確認され（図7）、SLAMを介した感染が、ウイルス毒性に必要であることがわかった。 The finding that no clinical evidence of disease was found in monkeys infected with rMV-SLAMblind confirmed this expectation (Figure 7) and that SLAM-mediated infection is required for viral toxicity I understood.
Hタンパク質中にR533A置換を導入された組換え野生型MV IC-B株は、rhesus monkeysにおいて弱毒化されていたことが以前に報告されている（Leonard VH, et al., J Virol 2010, 84: 3413-3420）。低レベルのウイルス血症がわずか1例において検出されたが、SLAM-blind IC-Bウイルスは、接種した6頭のサルのいずれにおいても麻疹-様の症状を引き起こさなかった。 It has been previously reported that recombinant wild type MV IC-B strain introduced with R533A substitution in H protein was attenuated in rhesus monkeys (Leonard VH, et al., J Virol 2010, 84 : 3413-3420). Low level viremia was detected in only one case, but SLAM-blind IC-B virus did not cause measles-like symptoms in any of the six inoculated monkeys.
本発明のデータは、rMV-SLAMblindおよび親株であるMV-HL株（rMV）の両方ともがPVRL4をレセプターとして利用するが、CD46をレセプターとして利用しないことを示した。MV-HL株は、増殖させたマーモセットリンパ芽球様細胞であるB95a細胞を使用して、麻疹患者血液中の白血球から単離された、野生型株である。したがって、野生型MV株は、レセプターとしてCD46を使用することができず(Yanagi Y, et al., Jpn J lnfect Dis 2006, 59: 1-5）、PVRL4を使用することができる（Muhlebach MD, et al., Nature 2011, 480: 530-533）という以前の知見と一致している。 The data of the present invention showed that both rMV-SLAMblind and the parental strain MV-HL (rMV) utilize PVRL4 as a receptor but not CD46 as a receptor. The MV-HL strain is a wild type strain isolated from white blood cells in the blood of measles patients using B95a cells, which are expanded marmoset lymphoblastoid cells. Therefore, the wild-type MV strain cannot use CD46 as a receptor (Yanagi Y, et al., Jpn Jlfect Dis 2006, 59: 1-5) and can use PVRL4 (Muhlebach MD, et al., Nature 2011, 480: 530-533).
CD46は、腫瘍においてしばしば過剰発現されており（Jurianz K, et al., Mol Immunol 1999, 36: 929-939）、そしてMV Edmonstonワクチン株誘導体は、高密度のCD46を有する細胞を選択的に殺す（Anderson BD, et al., Cancer Res 2004, 64: 4919-4926）。したがって、そのワクチン株誘導体が、様々な腫瘍型に対する治療剤として研究された。 CD46 is often overexpressed in tumors (Jurianz K, et al., Mol Immunol 1999, 36: 929-939) and MV Edmonston vaccine strain derivatives selectively kill cells with high density of CD46 (Anderson BD, et al., Cancer Res 2004, 64: 4919-4926). Therefore, the vaccine strain derivatives have been studied as therapeutic agents for various tumor types.
しかしながら、本発明の結果は、乳癌細胞株に対するrMV-SLAMblindの腫瘍溶解活性のために、CD46を使用することは必要ではないことを示している。実際、CD46は、赤血球を除くすべての正常ヒト細胞により遍在性に発現されており（Liszewski MK, et al., Curr Top Microbiol Immunol 1992, 178: 45-60）、そして腫瘍溶解のために以前に使用されたMV Edmonston株は、NHDFに対して効率的に感染しそして殺すことが報告され（Allen C, et al., Cancer Res 2006, 66: 11840-11850）、結果的に合胞体を生成する。対照的に、rMV-SLAMblindは、NHDFに対しては最小限にしか感染しなかった（図3）。したがって、SLAMおよびCD46を両方とも認識しないrMV-SLAMblindは、PVRL4-陽性乳癌細胞に対する特異性を向上させる点で、重要な利点を有する。さらに、乳癌治療のために以前に報告されたMV Edmonston株（McDonald CJ, et al., Breast Cancer Res Treat 2006, 99: 177-184）は、修飾されていないHタンパク質を有するが、これはすべての既知のMVレセプター：SLAM、CD46およびPVRL4と相互作用することができる。 However, the results of the present invention indicate that it is not necessary to use CD46 due to the oncolytic activity of rMV-SLAMblind against breast cancer cell lines. In fact, CD46 is ubiquitously expressed by all normal human cells except red blood cells (Liszewski MK, et al., Curr Top Microbiol Immunol 1992, 178: 45-60) and has previously been due to tumor lysis The MV Edmonston strain used in the study was reported to efficiently infect and kill NHDF (Allen C, et al., Cancer Res 2006, 66: 11840-11850), resulting in the formation of syncytia To do. In contrast, rMV-SLAMblind was minimally infected with NHDF (Figure 3). Thus, rMV-SLAMblind, which does not recognize both SLAM and CD46, has an important advantage in improving specificity for PVRL4-positive breast cancer cells. In addition, the previously reported MV Edmonston strain (McDonald CJ, et al., Breast Cancer Res Treat 2006, 99: 177-184) for breast cancer treatment has an unmodified H protein, all of which Known MV receptors: SLAM, CD46 and PVRL4.
以前の研究において、PVRL4は、乳腺由来の腫瘍において非常に発現していることが示された。PVRL4発現は、管腔-様マーカーと負の相関をしており、そして基底-様マーカーおよびHER2と正の相関を示した（Fabre-Lafay S, et al., BMC Cancer 2007, 7: 73; Athanassiadou AM, et al., Folia Histochem Cytobiol 2011, 49: 26-33）。さらに、PVRL4発現の増加は、病期の上昇、腫瘍サイズの増加、リンパ節浸潤の増加、そして生存の低下と強く相関した（Athanassiadou AM, et al., Folia Histochem Cytobiol 2011, 49: 26-33）。このように、rMV-SLAMblindは、様々な乳癌の中でも悪性型の癌に対して有効である可能性がある。さらに、肺癌、卵巣癌、および結腸直腸癌において、PVRL4が上方制御されているため（Takano A, et al., Cancer Res 2009, 69: 6694-6703; Derycke MS, et al., Am J Clin Pathol 2010, 134: 835-845）、rMV-SLAMblindもまた、それらの治療のために有用であると考えられる。 Previous studies have shown that PVRL4 is highly expressed in breast-derived tumors. PVRL4 expression was negatively correlated with lumen-like markers and positively correlated with basal-like markers and HER2 (Fabre-Lafay S, et al., BMC Cancer 2007, 7: 73; Athanassiadou AM, et al., Folia Histochem Cytobiol 2011, 49: 26-33). Furthermore, increased PVRL4 expression was strongly correlated with increased stage, increased tumor size, increased lymph node involvement, and decreased survival (Athanassiadou AM, et al., Folia Histochem Cytobiol 2011, 49: 26-33 ). Thus, rMV-SLAMblind may be effective against malignant cancers among various breast cancers. Furthermore, PVRL4 is up-regulated in lung cancer, ovarian cancer, and colorectal cancer (Takano A, et al., Cancer Res 2009, 69: 6694-6703; Derycke MS, et al., Am J Clin Pathol 2010, 134: 835-845), rMV-SLAMblind is also considered useful for their treatment.
rMV-SLAMblindは、rMV-Edmonstonが示すより高い腫瘍溶解活性を示した。MDA-MB-453細胞において、rMV-SLAMblindの腫瘍溶解活性は、in vitroおよびin vivoにおいて高かった（図4dおよび図5b）。しかしながら、MCF7細胞において、rMV-SLAMblindは、rMV-Edmonstonの細胞傷害性と同様のin vitro細胞傷害性を示したが、しかしin vivoでの腫瘍増殖抑制では、より高い有効性を示した（図4cおよび図5a）。このことは、in vitro培養条件と構造や周辺の生得的免疫系などの因子によりウイルスの広がりが潜在的に限定されうるin vivo環境との差に基づいているようであった。 rMV-SLAMblind showed higher oncolytic activity than rMV-Edmonston showed. In MDA-MB-453 cells, the oncolytic activity of rMV-SLAMblind was high in vitro and in vivo (FIGS. 4d and 5b). However, in MCF7 cells, rMV-SLAMblind showed in vitro cytotoxicity similar to that of rMV-Edmonston, but was more effective in inhibiting tumor growth in vivo (Fig. 4c and Figure 5a). This appeared to be based on differences between in vitro culture conditions and in vivo environments where the spread of the virus could potentially be limited by factors such as structure and surrounding innate immune system.
野生型およびEdmonstonワクチン株の間の比較研究の結果、細胞内生得的免疫応答の回避（Naniche D, et al., J Virol 2000, 74: 7478-7484; Ohno S, et al., J Gen Virol 2004, 85: 2991-2999）およびウイルス複製の亢進（Takeda M, et al., J Virol 2008, 82: 11979-11984）を含む、野生型MVの重要な特性が示された。これらの因子は、rMV-SLAMblindの腫瘍溶解活性の亢進の原因と考えられた。背景にあるメカニズムの解析は、現在のところ途上である。 Comparative studies between wild-type and Edmonston vaccine strains have shown that avoidance of the innate immune response in the cell (Naniche D, et al., J Virol 2000, 74: 7478-7484; Ohno S, et al., J Gen Virol 2004, 85: 2991-2999) and enhanced viral replication (Takeda M, et al., J Virol 2008, 82: 11979-11984) showed important properties of wild-type MVs. These factors were thought to be responsible for the enhanced oncolytic activity of rMV-SLAMblind. The analysis of the underlying mechanism is currently underway.
本研究において使用されたrMV-Edmonstonは、乳癌治療のために以前使用されたEdmonston株誘導体（MV-CEA）（McDonald CJ, et al., Breast Cancer Res Treat 2006, 99: 177-184）と同一ではない。MV-CEAは、ウイルス遺伝子発現の追跡可能なマーカーである癌胎児性抗原（CEA）をコードする追加的な転写ユニットを有した。さらに、本発明の発明者らは、rMV-Edmonstonを誘導したもとであるプラスミドp（+）MV2Aが、Edmonston B株の感染性cDNAクローンの報告された配列データ（GenBankアクセッションno. Z66517）とは、12ヌクレオチドおよび5アミノ酸の差異を有することを見出した。したがって、腫瘍溶解活性に関して、本発明の発明者らは、本発明のデータをMV-CEAのデータと直接的に比較することはできない。しかしながら、これらの差異は、Edmonston系列のすべての株がCD46を使用することからrMV-SLAMblindが改善された腫瘍特異性を有するという本発明における結論に影響を及ぼさない。 RMV-Edmonston used in this study is identical to Edmonston strain derivative (MV-CEA) previously used for breast cancer treatment (McDonald CJ, et al., Breast Cancer Res Treat 2006, 99: 177-184) is not. MV-CEA had an additional transcription unit encoding carcinoembryonic antigen (CEA), a traceable marker of viral gene expression. In addition, the inventors of the present invention have reported that the plasmid p (+) MV2A from which rMV-Edmonston was derived is reported sequence data of an infectious cDNA clone of Edmonston B strain (GenBank Accession no. Z66517). Was found to have 12 nucleotide and 5 amino acid differences. Therefore, regarding oncolytic activity, the inventors of the present invention cannot directly compare the data of the present invention with the data of MV-CEA. However, these differences do not affect the conclusion in the present invention that rMV-SLAMblind has improved tumor specificity since all strains of the Edmonston lineage use CD46.
MVに基づくベクターに関する主な障害は、治療効率を低下させる可能性がある患者体内において事前に存在する抗-MV抗体の存在である。腫瘍内に投与された場合に、腫瘍溶解性MVの効果は、マウスモデル中に受動的に移入させた抗-MV抗体の存在により損なわれないことが、以前の研究において示された（Grote D, et al., Blood 2001, 97: 3746-3754）。このことは、いったんウイルスが腫瘍に到達すると、抗体の存在下であっても退縮が生じうることを意味している。最終的な目標は、静脈内ウイルス投与により転移した癌細胞を消去することであるが、腫瘍内ウイルス投与により局在化した腫瘍を処理することが、論理的な第1の工程である。 A major obstacle for MV-based vectors is the presence of pre-existing anti-MV antibodies in the patient that can reduce therapeutic efficiency. Previous studies have shown that the effects of oncolytic MVs are not impaired by the presence of passively transferred anti-MV antibodies in mouse models when administered intratumorally (Grote D , et al., Blood 2001, 97: 3746-3754). This means that once the virus reaches the tumor, regression can occur even in the presence of antibodies. The ultimate goal is to eliminate cancer cells that have metastasized by intravenous virus administration, but treating the localized tumor by intratumoral virus administration is a logical first step.
本発明者は、腫瘍を移植したマウスに静脈内投与したrMV-SLAMblindが移植腫瘍部位に達して増殖することも確認した。また、本発明の発明者らは、既存の抗体により静脈内投与されたウイルスが中和されることを回避するストラテジーを検討中である。一つの可能性のあるストラテジーは、送達ビヒクルとしての細胞を使用することにより、ウイルス抗原を抗体から隠すことである（Willmon C, et al., Mol Ther 2009, 17: 1667-1676）。この戦略において、生体の細胞をin vitroで感染させ、そしてその後その細胞を全身性に戻し投与し、腫瘍細胞を標的とするための腫瘍溶解性ウイルスを保有するようにした。最近の研究により、腫瘍溶解性MVに感染させた細胞が、ウイルスを腫瘍部位に送達し、そして既存の抗-麻疹抗体により腫瘍を持つマウスの生存を延長することができることが示された（Mader EK, et al., Clin Cancer Res 2009, 15: 7246-7255; Liu C, et al., Mol Ther 2010, 18: 1155-1164）。 The inventor has also confirmed that rMV-SLAMblind administered intravenously to a tumor-implanted mouse reaches the transplanted tumor site and proliferates. The inventors of the present invention are also investigating strategies to avoid neutralizing intravenously administered viruses with existing antibodies. One possible strategy is to hide the viral antigen from the antibody by using the cell as a delivery vehicle (Willmon C, et al., Mol Ther 2009, 17: 1667-1676). In this strategy, living cells were infected in vitro and then administered systemically back to carry oncolytic virus to target tumor cells. Recent studies have shown that cells infected with oncolytic MV can deliver virus to the tumor site and prolong the survival of tumor-bearing mice with existing anti-measles antibodies (Mader EK, et al., Clin Cancer Res 2009, 15: 7246-7255; Liu C, et al., Mol Ther 2010, 18: 1155-1164).
以前の研究において、PVRL4-発現細胞におけるウイルス複製および融合活性は、SLAMまたはCD46-依存性の細胞-細胞融合に影響を与えることなく、野生型IC-B株のHタンパク質中に単一のN48IF置換またはN481Y置換を導入することにより、亢進された（Tahara M, et al., J Viral 2008, 82: 4630-4637）。HL株のHタンパク質は、481番目にアスパラギンを有する。このように、同一の置換を導入することにより、本発明の発明者らは、そのレセプター利用に影響を与えることなく、rMV-SLAMblindの腫瘍溶解活性を更新することができる。さらに、Edmonston系列のMV株のHタンパク質は、481番目にチロシンをすでに有しており、従ってこの戦略は利用できない。 In previous studies, viral replication and fusion activity in PVRL4-expressing cells is not affected by SLAM or CD46-dependent cell-cell fusion, with a single N48IF in the H protein of the wild type IC-B strain. It was enhanced by introducing substitutions or N481Y substitutions (Tahara M, et al., J Viral 2008, 82: 4630-4637). The H protein of the HL strain has asparagine at the 481st position. Thus, by introducing identical substitutions, the inventors of the present invention can update the oncolytic activity of rMV-SLAMblind without affecting its receptor utilization. In addition, the Edmonston lineage MV strain H protein already has a 481 tyrosine, so this strategy is not available.
結論として、本発明において、rMV-SLAMblindを作成し、そしてrMV-SLAMblindが癌異種移植片（たとえば乳癌）に対して腫瘍溶解活性を有し、そしてサルにおいて弱毒化されていたことを示した。rMV-SLAMblindは、CD46とは相互作用せず、そしてrMV-Edmonstonの腫瘍溶解活性と比較して、高い腫瘍溶解活性を示した。これらの結果は、癌治療のための新規な腫瘍溶解性ウイルスとしてのrMV-SLAMblindの潜在能力を示しており、この株をさらに検討していく予定である。 In conclusion, in the present invention, rMV-SLAMblind was generated and showed that rMV-SLAMblind had oncolytic activity against cancer xenografts (eg, breast cancer) and was attenuated in monkeys. rMV-SLAMblind did not interact with CD46 and showed high oncolytic activity compared to rMV-Edmonston oncolytic activity. These results indicate the potential of rMV-SLAMblind as a novel oncolytic virus for cancer treatment and this strain will be further investigated.
実施例2：SLAM-非依存的なMVの感染と、rMV-SLAMblindの生成
野生型MV HL株は、MCF7細胞、MDA-MB-453細胞、およびSKBR3細胞を含む様々なヒト乳癌細胞株に効率よく感染しそしてそれを殺す（図1a、上パネル）。 野生型MVは、SLAMを主要なレセプターとして使用することが知られているが（Tatsuo H, et al., Nature 2000, 406: 893-897）、SLAMは免疫系の細胞において発現される。しかしながら、RT-PCRおよびフローサイトメトリー解析から、これらの乳癌細胞株は、SLAM-陰性であることが示された（図1bおよび図1c）。このように、MV感染は、SLAM-非依存的なメカニズムを介して生じるものである。
Example 2: SLAM-independent MV infection and generation of rMV-SLAMblind Wild-type MV HL strains are efficient on various human breast cancer cell lines including MCF7 cells, MDA-MB-453 cells, and SKBR3 cells Infects well and kills it (Figure 1a, top panel). Wild-type MV is known to use SLAM as a major receptor (Tatsuo H, et al., Nature 2000, 406: 893-897), but SLAM is expressed in cells of the immune system. However, RT-PCR and flow cytometry analysis indicated that these breast cancer cell lines were SLAM-negative (FIGS. 1b and 1c). Thus, MV infection occurs through a SLAM-independent mechanism.
この知見から、組換えMVが、選択的にSLAMを使用することができないため、乳癌細胞に対する腫瘍溶解活性は維持しつつも、SLAM-陽性免疫細胞に対する細胞傷害性を喪失している可能性が示唆された。HL株についてのリバースジェネティクスシステム（Terao-Muto Y, et al., Antiviral Res 2008, 80: 370-376）を使用することにより、本発明において、一アミノ酸置換（R533A） (Vongpunsawad S, et al., J Virol 2004, 78: 302-313)をHタンパク質のORF（SEQ ID NO: 6）中に導入することにより、SLAM-blind組換えMVを生成した（図1d、SEQ ID NO: 1）。高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）遺伝子を含有するSLAM-blind組換えMV（rMV-EGFP-SLAMblind）は、SLAM-陽性B95a細胞に対して非常に低い効率で感染したが、一方rMV-EGFP-SLAMblindは、乳癌細胞株に対しては親rMV-EGFPと同程度の効率で感染した（図1a）。rMV-SLAMblindの増殖性を、MCF7細胞における親ウイルス（rMV）の増殖性およびEdmonston系列のワクチン株（rMV-Edmonston）の増殖性と比較した（図1e）。rMV-SLAMblindは、rMVよりもゆっくりと増殖したが、最大の力価は同程度であった。rMV-Edmonstonの増殖速度および最大力価は、rMV-SLAMblindの増殖速度および最大力価よりも低かった。 From this finding, it is possible that the recombinant MV cannot selectively use SLAM, so it maintains the oncolytic activity against breast cancer cells, but loses cytotoxicity against SLAM-positive immune cells. It was suggested. By using the reverse genetics system for HL strain (Terao-Muto Y, et al., Antiviral Res 2008, 80: 370-376), in the present invention, single amino acid substitution (R533A) (Vongpunsawad S, et al ., J Virol 2004, 78: 302-313) was introduced into the ORF of the H protein (SEQ ID NO: 6) to generate SLAM-blind recombinant MV (Fig. 1d, SEQ ID NO: 1) . SLAM-blind recombinant MV containing the sensitive green fluorescent protein (EGFP) gene (rMV-EGFP-SLAMblind) infected SLAM-positive B95a cells with very low efficiency, whereas rMV-EGFP-SLAMblind Infected the breast cancer cell line with the same efficiency as the parent rMV-EGFP (FIG. 1a). The growth of rMV-SLAMblind was compared to the growth of the parent virus (rMV) and the Edmonston lineage vaccine strain (rMV-Edmonston) in MCF7 cells (FIG. 1e). rMV-SLAMblind grew more slowly than rMV, but the maximum titer was similar. The growth rate and maximum titer of rMV-Edmonston was lower than that of rMV-SLAMblind.
実施例3：rMV-SLAMblindによる乳癌細胞株の感染におけるPVRL4の関与
SLAMに加えて、CD46およびPVRL4がMVに対するレセプターとして同定されれいる。CD46は、MVワクチン株についてのみのレセプターである。PVRL4は、MV野生型およびMVワクチン株の両方についてのレセプターとして最近同定され（Noyce RS, et al., PLoS Pathog 2011, 7: e1002240; Muhlebach MD, et al., Nature 2011, 480: 530-533）。両方の分子ともに、乳癌細胞株の表面に発現されている（図2a）。そこで、本発明の発明者らは、抗-CD46抗体および抗-PVRL4抗体を使用して感染阻害アッセイを行った（図2b）。抗-CD46抗体は、rMV-EGFPおよびrMV-EGFP-SLAMblindによる乳癌細胞の感染を阻害しなかったが、一方抗-PVRL4抗体は、ほぼ完全に感染を阻害した。rMV-Edmonstonによる乳癌細胞の感染は、いずれかの抗体のみによっては阻害されず、このことはMVワクチン株がCD46およびPVRL4の両方ともをレセプターとして使用するという事実と一致している。CD46-陽性かつPVRL4-陰性であるVero細胞（Noyce RS, et al., PLoS Pathog 2011, 7: e1002240; Muhlebach MD, et al., Nature 2011, 480: 530-533）は、rMV-Edmonstonにのみ効率的に感染し、そして感染は抗-CD46抗体によりほぼ完全に阻害された。さらに、MDA-MB-453細胞におけるrMV-Edmonstonの感染効率は、rMV-EGFPおよびrMV-EGFP-SLAMblindの感染効率よりも低かった。
Example 3: Involvement of PVRL4 in infection of breast cancer cell lines by rMV-SLAMblind
In addition to SLAM, CD46 and PVRL4 have been identified as receptors for MV. CD46 is a receptor only for the MV vaccine strain. PVRL4 has recently been identified as a receptor for both MV wild type and MV vaccine strains (Noyce RS, et al., PLoS Pathog 2011, 7: e1002240; Muhlebach MD, et al., Nature 2011, 480: 530-533 ). Both molecules are expressed on the surface of breast cancer cell lines (Figure 2a). Therefore, the inventors of the present invention conducted an infection inhibition assay using anti-CD46 antibody and anti-PVRL4 antibody (FIG. 2b). Anti-CD46 antibody did not inhibit breast cancer cell infection by rMV-EGFP and rMV-EGFP-SLAMblind, whereas anti-PVRL4 antibody almost completely inhibited infection. Infection of breast cancer cells with rMV-Edmonston is not inhibited by either antibody alone, consistent with the fact that MV vaccine strains use both CD46 and PVRL4 as receptors. CD46-positive and PVRL4-negative Vero cells (Noyce RS, et al., PLoS Pathog 2011, 7: e1002240; Muhlebach MD, et al., Nature 2011, 480: 530-533) are only in rMV-Edmonston Infected efficiently and infection was almost completely inhibited by anti-CD46 antibody. Furthermore, the infection efficiency of rMV-Edmonston in MDA-MB-453 cells was lower than that of rMV-EGFP and rMV-EGFP-SLAMblind.
CD46およびPVRL4が侵入用レセプターとして機能しているかどうかを調べるため、本発明の発明者らは、ヒトCD46をコードするプラスミド（pCAG-hCD46）またはヒトPVRL4をコードするプラスミド（pCAG-hPVRL4）をMVに対して非感受性な細胞（たとえば、CHOK1およびBHK細胞）にトランスフェクトした。rMV-Edmonstonの感染性は、空ベクター（pCAGGS）でトランスフェクトされた細胞と比較して、pCAG-CD46でトランスフェクトされた細胞においてより高く、しかしrMV-SLAMblindの感染性および親ウイルスの感染性は、2群のあいだで異ならなかった（図2c）。対照的に、すべてのウイルスは、対照細胞における感染性と比較して、pCAG-hPVRL4によりトランスフェクトされた細胞において高い感染性を示した（図2d）。これらの結果から、rMV-SLAMblindおよび親ウイルスは、PVRL4をレセプターとして使用するが、CD46は使用しないことが示された。 In order to determine whether CD46 and PVRL4 function as invasion receptors, the inventors of the present invention used a plasmid encoding human CD46 (pCAG-hCD46) or a plasmid encoding human PVRL4 (pCAG-hPVRL4) as MV. Insensitive cells (eg, CHOK1 and BHK cells) were transfected. rMV-Edmonston infectivity is higher in cells transfected with pCAG-CD46 compared to cells transfected with empty vector (pCAGGS), but rMV-SLAMblind infectivity and parent virus infectivity Was not different between the two groups (Figure 2c). In contrast, all viruses were highly infectious in cells transfected with pCAG-hPVRL4 compared to infectivity in control cells (FIG. 2d). These results indicated that rMV-SLAMblind and parental virus use PVRL4 as a receptor but not CD46.
実施例4：CD46-陽性初代正常ヒト細胞の感染
CD46は、遍在性に発現されており、そして正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）などの正常ヒト細胞はCD46-陽性である（図3a）。rMV-Edmonstonおよび以前に報告された腫瘍溶解性MV Edmonston株による感染とは対照的に（Allen C, et al., Cancer Res 2006, 66: 11840-11850）、rMV-SLAMblindは、NHDF細胞に対してはほとんど感染せず、合胞体を生成せず、そしてその生存率に影響を与えなかった（図3bおよび図3c）。PVRL4およびSLAMは、NHDFにおいて発現していない（図3a）。従って、その限定的なレセプター利用のために、rMV-SLAMblindは、CD46-陽性正常ヒト細胞に非常に低い効率で感染する。
Example 4: Infection of CD46-positive primary normal human cells
CD46 is ubiquitously expressed and normal human cells such as normal human dermal fibroblasts (NHDF) are CD46-positive (FIG. 3a). In contrast to the infection with rMV-Edmonston and the previously reported oncolytic MV Edmonston strain (Allen C, et al., Cancer Res 2006, 66: 11840-11850), rMV-SLAMblind is Were hardly infected, did not produce syncytia, and did not affect their viability (FIGS. 3b and 3c). PVRL4 and SLAM are not expressed in NHDF (Figure 3a). Thus, due to its limited receptor utilization, rMV-SLAMblind infects CD46-positive normal human cells with very low efficiency.
実施例5：rMV-SLAMblindのIn vitro細胞傷害性
本発明の発明者らは、B95a細胞をMOI 1のrMV-SLAMblindまたは親ウイルス（rMV）のいずれかにより感染させ、そして感染後の細胞生存率を測定した。rMVとは対照的に、rMV-SLAMblindは、B95a細胞の生存率に影響を与えなかった（図4a）。しかしながら、同じ用量でrMV-SLAMblindに感染させた乳癌細胞株の生存率は、感染後急速に低下した（図4b）。さらに、本発明の発明者らは、乳癌細胞株におけるMOI 0.1のrMV-SLAMblindおよびrMV-Edmonstonの細胞傷害性を比較した。rMV-SLAMblindは、rMV-Edmonstonの場合と比較して、MDA-MB-453細胞の生存率をより効率的に低下させた（図4d）。このことは、おそらくはそれらの感染性の差異によるものと思われた（図2b）。MCF7細胞およびSKBR3細胞では、細胞生存率の同様の減少が、両方とものウイルスについて観察された（図4cおよび図4e）。
Example 5: In vitro cytotoxicity of rMV-SLAMblind The inventors of the present invention infected B95a cells with either MOI 1 rMV-SLAMblind or parental virus (rMV) and cell viability after infection Was measured. In contrast to rMV, rMV-SLAMblind did not affect B95a cell viability (FIG. 4a). However, the survival rate of breast cancer cell lines infected with rMV-SLAMblind at the same dose decreased rapidly after infection (FIG. 4b). Furthermore, the inventors of the present invention compared the cytotoxicity of rMV-SLAMblind and rMV-Edmonston with MOI 0.1 in breast cancer cell lines. rMV-SLAMblind reduced the viability of MDA-MB-453 cells more efficiently compared to rMV-Edmonston (FIG. 4d). This was probably due to the difference in their infectivity (Figure 2b). In MCF7 and SKBR3 cells, a similar decrease in cell viability was observed for both viruses (FIGS. 4c and 4e).
実施例6：rMV-SLAMblindのIn vivo腫瘍溶解活性
rMV-SLAMblindおよびrMV-Edmonstonを、皮下にMCF7異種腫瘍細胞移植片を有する重症複合型免疫不全（severe combined immune deficiency；SCID）マウスに対して、腫瘍内投与した。両方のウイルスの投与（105 TCID50の3回の投与）により、腫瘍増殖の抑制が引き起こされたが、rMV-SLAMblindは、rMV-Edmonstonの場合よりも、大幅な抑制を引き起こした（図5a）。MDA-MB-453異種移植片において、両方のウイルスの腫瘍内投与（106 TCID50の2回の投与）によってもまた、腫瘍増殖の抑制が引き起こされたが、しかしrMV-SLAMblindは、rMV-Edmonstonと比較して、最初は腫瘍増殖を抑制した（図5b）。SKBR3細胞は、マウスにおいて腫瘍を形成できなかった（データは示さず）。
Example 6: In vivo oncolytic activity of rMV-SLAMblind
rMV-SLAMblind and rMV-Edmonston were administered intratumorally to severe combined immune deficiency (SCID) mice with MCF7 xeno-tumor cell grafts subcutaneously. Administration of both viruses (three doses of 10 5 TCID 50 ) caused suppression of tumor growth, but rMV-SLAMblind caused more significant suppression than rMV-Edmonston (Figure 5a). ). In MDA-MB-453 xenografts, intratumoral administration of both viruses (two doses of 10 6 TCID 50 ) also caused suppression of tumor growth, but rMV-SLAMblind was Compared to Edmonston, it initially suppressed tumor growth (Figure 5b). SKBR3 cells failed to form tumors in mice (data not shown).
実施例7：異種移植をしたマウスにおけるrMV-luc-SLAMblindの局在化
異種移植を受けたマウスにおけるウイルスの局在性を可視化するため、本発明の発明者らは、ホタルルシフェラーゼを発現するSLAM-blind組換えMV（rMV-luc-SLAMblind；図1d）を使用した。MDA-MB-453細胞を、11匹のヌードマウスの皮下に移植した。
Example 7: Localization of rMV-luc-SLAMblind in xenografted mice To visualize viral localization in mice receiving xenografts, the inventors of the present invention are SLAM expressing firefly luciferase. -blind recombinant MV (rMV-luc-SLAMblind; Fig. 1d) was used. MDA-MB-453 cells were implanted subcutaneously in 11 nude mice.
6匹のマウスには、106TCID50のrMV-Iuc-SLAMblindの1回の腫瘍内投与を与え、そして5匹のマウスには、培養液のみを与えた（培養液対照）。さらに5匹のヌードマウスに対して細胞を含まないPBS／Matrigel混合物を移植し、そして同一の部位にウイルスを皮下的に投与した（腫瘍不含対照）。D-ルシフェリンを基質として使用して、本発明の発明者らは、生物発光画像法（BLI）を行った。少なくとも感染後21日（dpi）までに、強力で局所的な発光が、ウイルスを投与した異種移植したマウスにおいて検出された（図6a）（図6d）。対照群のいずれにおいても発光は検出されなかった（図6bおよび図6c）。さらに、本発明の発明者らは、以前に記載されたように、10 dpiにおいて生物発光と磁気共鳴画像法（MRI）とを組み合わせた（Inoue Y, et al., Mol Imaging 2010, 9: 163-172）。1匹のマウスのBLI/MRI融合画像を、図6eに示す。BLIで観察されたウイルス局在化を、MRIで観察された腫瘍局在化と重ね合わせた。これらの結果から、ウイルス複製が、腫瘍内で局在化されたことが示された。 Six mice received a single intratumoral dose of 10 6 TCID 50 of rMV-Iuc-SLAMblind, and 5 mice received media only (medium control). In addition, 5 nude mice were implanted with a cell-free PBS / Matrigel mixture and the virus was administered subcutaneously at the same site (no tumor control). Using D-luciferin as a substrate, the inventors of the present invention performed bioluminescence imaging (BLI). At least 21 days after infection (dpi), intense local luminescence was detected in xenografted mice that received the virus (FIG. 6a) (FIG. 6d). Luminescence was not detected in any of the control groups (FIGS. 6b and 6c). In addition, the inventors of the present invention combined bioluminescence and magnetic resonance imaging (MRI) at 10 dpi as previously described (Inoue Y, et al., Mol Imaging 2010, 9: 163 -172). A BLI / MRI fusion image of one mouse is shown in FIG. 6e. The virus localization observed with BLI was superimposed on the tumor localization observed with MRI. These results indicated that viral replication was localized within the tumor.
実施例8：サルにおけるrMV-SLAMblindの安全性研究
in vivo安全性を評価するため、本発明においては、106 TCID50のrMV-SLAMblindをMVに対する血清抗体価陰性であることが確認された1頭のカニクイザルおよび2頭のアカゲザルに皮下的に接種した。接種後、カニクイザルを1ヶ月間モニタリングし、そしてアカゲザルを14日間モニタリングした。食欲不振、下痢、および発疹を含む麻疹の臨床症状は、いずれのサルにおいても検出されなかった（図7a）。体重に対する意味のある作用も見られなかった（図7b）。PBMCのウイルスレベルは、下限検出限界を下回っており（図7a）、そしてリンパ球数はウイルス接種後に減少しなかった（図7c）。好中球数の一過性の増加が0 dpiにカニクイザルにおいて見いだされたが、ウイルス接種前に血液が回収されたものであったため、無関係と考えられた。これらの結果は、感染させたサルに対して麻疹ウイルス血症およびリンパ球減少症を含む典型的な麻疹の臨床症状を引き起こす親野生型MV HL株およびその他の野生型MV株に関して報告された結果とは著しく異なっていた（Kobune F, et al., Lab Anim Sci 1996, 46: 315-320; Sato H, et al., Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2008, 31: 25-35; Takeda M, et al., J Virol 2000, 74: 6643-6647; El Mubarak HS, et al., J Gen Virol 2007, 88: 2028-2034; Zhu YD, et al., Virology 1997, 233: 85-92）。これらの結果から、rMV-SLAMblindは、in vivoで弱毒化されていることが示された。このように、本発明のウイルスは、安全なウイルスであると考えられる。
Example 8: Safety study of rMV-SLAMblind in monkeys
In order to evaluate in vivo safety, in the present invention, 10 6 TCID 50 of rMV-SLAMblind was inoculated subcutaneously into one cynomolgus monkey and two rhesus monkeys that were confirmed to have a negative serum antibody titer against MV. did. After inoculation, cynomolgus monkeys were monitored for 1 month and rhesus monkeys were monitored for 14 days. No clinical manifestations of measles including anorexia, diarrhea, and rash were detected in any monkey (FIG. 7a). There was no meaningful effect on body weight (Fig. 7b). Viral levels of PBMC were below the lower detection limit (Figure 7a) and lymphocyte counts did not decrease after virus inoculation (Figure 7c). A transient increase in neutrophil count was found in cynomolgus monkeys at 0 dpi, but was considered irrelevant because blood was collected prior to virus inoculation. These results are reported for parental wild-type MV HL strains and other wild-type MV strains that cause typical measles clinical symptoms, including measles viremia and lymphopenia, in infected monkeys (Kobune F, et al., Lab Anim Sci 1996, 46: 315-320; Sato H, et al., Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2008, 31: 25-35; Takeda M, et al J Virol 2000, 74: 6643-6647; El Mubarak HS, et al., J Gen Virol 2007, 88: 2028-2034; Zhu YD, et al., Virology 1997, 233: 85-92). From these results, it was shown that rMV-SLAMblind is attenuated in vivo. Thus, the virus of the present invention is considered to be a safe virus.
本発明は、新規な組換え麻疹ウイルスから構成される腫瘍溶解性ウイルスを提供することができ、このウイルスは、様々な癌細胞株において効率的に増殖し、感染された細胞に対して効率的に細胞死を引き起こすことができる。 The present invention can provide an oncolytic virus composed of a novel recombinant measles virus, which grows efficiently in various cancer cell lines and is efficient against infected cells. Can cause cell death.
SEQ ID NO: 1：HL野生型株の全長アンチゲノムcDNAのうち、Hタンパク質の533番目アミノ酸残基（SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号8867〜8869にコドンに対応）のアルギニンをアラニンによりアミノ酸置換した麻疹ウイルスrMV-SLAMblindの全塩基配列
SEQ ID NO: 2：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号108〜1685によりコードされるNタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 3：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号1807〜3330によりコードされるリンタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 4：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号3438〜4445によりコードされるMタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 5：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号5449〜7110によりコードされるFタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 6：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号7271〜9124によりコードされるHタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 7：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号9234〜15785によりコードされるLタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 1: Amino acid substitution of arginine at the 533th amino acid residue of the H protein (corresponding to the codons of nucleotide numbers 8867 to 8869 of SEQ ID NO: 1) in the full-length antigenomic cDNA of the HL wild type strain Complete base sequence of rMV-SLAMblind
SEQ ID NO: 2: amino acid sequence of the N protein encoded by nucleotide numbers 108 to 1685 of SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 3: amino acid sequence of the phosphoprotein encoded by nucleotide numbers 1807-3330 of SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 4: amino acid sequence of the M protein encoded by nucleotide numbers 3438 to 4445 of SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 5: amino acid sequence of the F protein encoded by nucleotide numbers 5449 to 7110 of SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 6: amino acid sequence of the H protein encoded by nucleotide numbers 7271 to 9124 of SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 7: amino acid sequence of the L protein encoded by nucleotide numbers 9234-15785 of SEQ ID NO: 1
Claims (7)
前記医薬組成物はPVRL4との結合活性を保持する麻疹ウイルスを含み、The pharmaceutical composition comprises measles virus that retains binding activity with PVRL4,
前記麻疹ウイルスは癌細胞上のPVRL4に結合して癌細胞に侵入することができる、The measles virus can bind to PVRL4 on cancer cells and enter cancer cells,
前記方法。Said method.
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