JP6195840B2 - 複数種の目的物質を同時に検出又は定量するための分析方法及び分析キット - Google Patents
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Description
本発明は、複数種の目的物質を同時に検出又は定量するための分析方法及び分析キットに関する。
複数の分析対象を同時に検出するための技術として、BIST(Beads array In Single Tip)が開発された（非特許文献１）。BISTとは、抗原や遺伝子などの測定対象物質と結合する抗体、抗原、あるいはDNA断片などの生体分子を固定化した直径1 mmのプローブビーズを円筒状のチップ（以下、「キャピラリー」と呼ぶ）部分に並べて封入したデバイスである。このBISTは、マグトレーション装置のノズルに嵌合できるので、核酸抽出と同じ自動化装置（例えば、Magtration（登録商標）System 6GC、Magtration（登録商標）System 12GC Plus（プレシジョン・システム・サイエンス社製） ）を用いて、ハイブリダイゼーション反応又は抗原抗体反応及び洗浄操作ができる。発生するシグナルはスキャナー(例えば、BISTnner（プレシジョン・システム・サイエンス社製）)で検出される。
BISTの技術的な最大の特徴としては、キャピラリー中に異なる目的物質を捕獲するためのプローブビーズが複数配置され、多項目の同時検出が可能な点にある。甲状腺刺激ホルモン（TSH: thyroid stimulating hormone）や、これと同時に検査されることで臨床上の有用性の高いFT3（Free Triiodo thyronine）、FT4(Free thyroxine)の定量検査への応用においては、実用上要求される検出濃度域が広範囲に及ぶ（TSH:0.05- 50uIu/mL, FT3:0.5-20pg/mL,FT4:0.1-10ng/dL、ダイナミックレンジで103程度）。このため、多項目同時検査を実現するためには、各プローブビーズからの信号光（目的物質の濃度に比例して強度が増加する光）を局在化させ、他のプローブビーズからの信号光との干渉を抑制しなければならない。しかし、これまでのところ、信号光の局在化は十分とは言えなかった。
遺伝子多型簡易測定法 シーエムシー出版刊「月刊バイオインダストリー2008年9月号」
本発明は、複数種の目的物質を同時に検出又は定量するために、プローブビーズからの信号光を局在化することを目的とする。
本発明者らは、鋭意努力した結果、BISTにおいて、光学フィルターを介してプローブビーズからの発光を測定することにより、所望のプローブビーズからの発光を選択的に受光できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）単一の容器内に収容された、複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ固定された複数の担体が発光し、この発光を容器外部から測定することで、複数種の目的物質を同時に検出又は定量するための分析方法であって、光学フィルターを介して担体からの発光を測定することにより、所望の担体からの発光を選択的に受光する前記方法。
（２）光学フィルターが容器表面に設置されるか、あるいは容器自体が光学フィルターとなる（１）記載の方法。
（３）容器自体が光学フィルターとなる（１）又は（２）記載の方法。
（４）測定対象の発光の波長帯における光線透過率が70%以下である光学フィルターを用いる（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）担体が球状である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）担体が1次元的又は2次元的に配置している（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）発光が化学発光又は蛍光であり、発光の波長帯が340-900nmの範囲内にある（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）単一の容器内に収容された、複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ固定された複数の担体が発光し、この発光を容器外部から測定することで、複数種の目的物質を同時に検出又は定量するための分析キットであって、複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ固定された複数の担体と、所望の担体からの発光を選択的に受光するための光学フィルターとを含む前記分析キット。
（９）容器自体が光学フィルターである（８）記載の分析キット。
（１０）発光が化学発光又は蛍光であり、発光の波長帯が340-900nmの範囲内にある（８）又は（９）に記載の分析キット。
（１）単一の容器内に収容された、複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ固定された複数の担体が発光し、この発光を容器外部から測定することで、複数種の目的物質を同時に検出又は定量するための分析方法であって、光学フィルターを介して担体からの発光を測定することにより、所望の担体からの発光を選択的に受光する前記方法。
（２）光学フィルターが容器表面に設置されるか、あるいは容器自体が光学フィルターとなる（１）記載の方法。
（３）容器自体が光学フィルターとなる（１）又は（２）記載の方法。
（４）測定対象の発光の波長帯における光線透過率が70%以下である光学フィルターを用いる（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）担体が球状である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）担体が1次元的又は2次元的に配置している（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）発光が化学発光又は蛍光であり、発光の波長帯が340-900nmの範囲内にある（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）単一の容器内に収容された、複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ固定された複数の担体が発光し、この発光を容器外部から測定することで、複数種の目的物質を同時に検出又は定量するための分析キットであって、複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ固定された複数の担体と、所望の担体からの発光を選択的に受光するための光学フィルターとを含む前記分析キット。
（９）容器自体が光学フィルターである（８）記載の分析キット。
（１０）発光が化学発光又は蛍光であり、発光の波長帯が340-900nmの範囲内にある（８）又は（９）に記載の分析キット。
本発明により、複数種の目的物質を同時に検出又は定量する系において、目的物質を捕獲するための物質が固定されたプローブビーズからの信号光を局在化させ、他のプローブビーズからの信号光との干渉を抑制することができるようになった。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2012‐232488の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2012‐232488の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、単一の容器内に収容された、複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ固定された複数の担体が発光し、この発光を容器外部から測定することで、複数種の目的物質を同時に検出又は定量するための分析方法であって、光学フィルターを介して担体からの発光を測定することにより、所望の担体からの発光を選択的に受光する前記方法を提供する。
容器は、発光を容器外部から測定可能であればいかなるものであってもよいが、透光性であるとよく、樹脂やガラスなどの光を透過する材質であることが好ましい。また、容器の形状は、特に限定されるものではないが、細管、ピペット状などの形状であるとよい。例えば、BISTの場合、容器は、内部に収容した液体の吸引吐出が可能な円筒状のチップである。
本発明の方法において、容器の透明度を高めることで、信号光の拡散を低減させることができる。容器の厚み1 mmのヘイズ値は20%以下であるとよく、好ましくは、10%以下であり、より好ましくは、1%以下である。厚み1 mmのヘイズ値が20%以下である容器の材質としては、ポリプロピレン、ポリカーボーネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、環状ポリオレフィン、ポリメチルペンテンなどを例示することができる。
ヘイズ値は、透明性の度合いを表す値であり、JIS K7136では、全光線透過率に対する拡散透過率の比として定義されている。
ヘイズ値は、透明性の度合いを表す値であり、JIS K7136では、全光線透過率に対する拡散透過率の比として定義されている。
また、発光又は放射の波長帯における容器の屈折率は、1.6以下であるとよく、好ましくは、1.55以下であり、より好ましくは、1.50以下である。屈折率が1.6以下の容器の材質としては、ポリプロピレン、ポリカーボーネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、環状ポリオレフィン、ポリメチルペンテンなどを例示することができる。
目的物質は、血液、血清、尿、リンパ液、口腔内粘膜、爪、喀痰などの生体試料、河川水、湖水、海水、土壌などの試料に含まれる分析対象となる物質でありうる。目的物質としては、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖などの生体物質、サルモネラ菌、大腸菌などの細菌類、コバルト、鉄、モリブデン、銅、亜鉛、ヒ素、カドミウム、バナジウムなどの金属などを例示することができる。
目的物質は、測定可能な標識がなされてもよく、測定可能な標識としては、蛍光標識、化学発光標識、電気化学発光標識、酵素標識、放射性標識、磁気標識などを例示することができる。標識物質としては、Marine Blue、 Cascade Blue、 Cascade Yellow、Fluorescein、Rhodamine、Phycoerythrin、CyChrome、PerCP、Texas Red、Allophycocyanin、PharRed、Oregon Green-488、Cy系色素（例えば、Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7など）、Alexa系色素（例えば、Alexa-488、Alexa-532、Alexa-546、Alexa-633、Alexa-680、Alexa-700、Alexa-750など）、BODIPY系色素（例えば、BODIPY FL, BODIPY TR-など）などの蛍光物質、ルミノール、アクリジン、アダマンチルジオキタセン、シュウ酸エステル、ロフィン、ルシゲニン、イゾルミノール誘導体などの化学発光物質、トリス−ビピリジン−（4-メチルスルホン）NHSエステルルテニウム(II)錯体、ジフェニルアントラセン、テトラフェニルアントラセンなどの電気化学発光物質、POD（Hydrogen peroxidase）、AP(alkaline phosphatase)、βガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース-6-燐酸脱水素酵素などの酵素などを例示することができる。この他にも、放射性同位元素（例えば、3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125Iなど）などの放射性物質などの標識物質を用いてもよい。
目的物質は、直接的に標識されてもよいし、間接的に標識されてもよい。例えば、後述の実施例においては、サンドイッチELISA法が用いられている。具体的には、担体に固定された一次抗体に、抗原である目的物質が結合した後、二次抗体であるビオチン標識抗体が目的物質に結合する。さらにこの二次抗体に対して、化学発光を触媒するストレプトアビジン化されたHRPが結合し、目的物質を標識する。
目的物質を捕獲するための物質は、目的物質と結合する物質であればよく、抗体、抗原、ＤＮＡ断片、金属錯体、その他低分子化合物などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
担体は、不定形粒子、球（ビーズ）、糸（ストランド）、磁性ビーズなどのいかなる形状であってもよいが、球状であることが好ましい。担体が球（ビーズ）又は磁性ビーズの形状をとる場合には、球（ビーズ）又は磁性ビーズのそれぞれに異なる目的物質を捕獲するための物質が固定されているとよい。担体が糸の形状をとる場合には、糸の異なる位置のそれぞれに異なる目的物質を捕獲するための物質が固定されているとよい。BISTの場合、担体は球（ビーズ）の形状をとる。
球（ビーズ）は、大きさは1mm程度で、プラスチックやセラミックなどの材質のものであるとよく、このような球（ビーズ）は、特開2000-346842号公報、特表平14-534657号公報などに記載されている。
磁性ビーズは、大きさは数十μmで、プラスチックやセラミックなどに鉄粉等を混ぜ、磁気化したものであるとよい。このような磁性ビーズは、特開平8-62224号公報（特許第3115501号明細書）、国際公開WO96/29602パンフレット、国際公開WO97/44671パンフレットなどに記載されている。
糸（ストランド）は、大きさは直径0.1mm程度で、樹脂系の材質のものであるとよく、このような糸は、特開2006-214759号公報、国際公開WO01/53831パンフレット、国際公開WO2003/7901パンフレットなどに記載されている。
担体は、1次元的又は2次元的に配置しているとよい。担体が1次元的に配置しているとは、観測された発光信号がどの担体に由来するものかを特定するために必要な位置情報が1次元であるような状態を意味し、例えば、BISTにおいて、担体（ビーズ）は一次元的に配置していると言える。担体が2次元的に配置しているとは、観測された発光信号がどの担体に由来するものかを特定するために必要な位置情報が２次元であるのような状態を意味し、例えば、プレート上に担体が単層で敷き詰められた測定キットは、担体が2次元的に配置されたものといえる。
目的物質を捕獲するための物質は、共有結合、化学吸着、物理吸着、電気的相互作用、疎水的相互作用、ファンデルワールス力、水素結合などにより、担体に固定されている。
目的物質の分析は、目的物質を捕獲するための物質と目的物質とを液体に浸漬された状態で接触させ、その後生じる発光を測定することにより行うことができる。
本発明の方法において、光学フィルターを介して担体からの発光を測定することにより、所望の担体からの発光を選択的に受光することができる。
本明細書において、「所望の担体からの発光を選択的に受光する」とは、例えば、BISTにおけるキャピラリー壁を伝搬する光や、受光面の法線に対して斜めから入射する光を垂直光に比して選択的に遮光するなど、複数の担体間の光学的交差を抑制することの他、バックグラウンド光の効果を低減することも含む。
本明細書において、「所望の担体からの発光を選択的に受光する」とは、例えば、BISTにおけるキャピラリー壁を伝搬する光や、受光面の法線に対して斜めから入射する光を垂直光に比して選択的に遮光するなど、複数の担体間の光学的交差を抑制することの他、バックグラウンド光の効果を低減することも含む。
本明細書において、「複数担体からの発光信号の光学的交差」とは、複数の担体からの発光信号が同時に検出器で受光され、各担体からの発光信号を分離できない状態をいう。
光学フィルターを介して発光を測定することで、信号光の拡散を低減させることができる。光学フィルターは、測定対象の発光の波長帯における光線透過率が70%以下であるとよく、好ましくは、測定対象の発光の波長帯における光線透過率が8%〜70%、より好ましくは、20%〜60%である。
光学フィルターは、ポリプロピレン、ポリカーボーネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、環状ポリオレフィン、ポリメチルペンテン、ポリエチレンテレフタレートなどの材料をアンスラキノン系着色剤、ペリノン系着色剤、複素環系着色剤、カーボンブラック、酸化チタンなどの着色剤で着色することにより、製造することができる。
光学フィルターは、容器とは別に用意してもよいし、容器自体を光学フィルターとしてもよい。容器とは別に光学フィルターを用意する場合には、光学フィルターは容器表面に設置するとよく、例えば、容器壁面形状に沿って、容器壁面に密着させた状態で設置するとよい。
光学フィルターは、容器とは別に用意してもよいし、容器自体を光学フィルターとしてもよい。容器とは別に光学フィルターを用意する場合には、光学フィルターは容器表面に設置するとよく、例えば、容器壁面形状に沿って、容器壁面に密着させた状態で設置するとよい。
発光は、化学発光、蛍光又は電気化学発光などでありうるが、化学発光又は蛍光であり、発光の波長帯が340-900nmであるとよい。発光は、蛍光計、分光光度計、シンチレーションカウンター、フォトダイオード、CCD、CMOS、光電子増倍管などの公知の技術を用いて、容器外部から測定することができる。
本発明の方法においては、複数種の目的物質が同時に検出又は定量される。複数種とは、少なくとも２種、例えば、２、３、４、５種又はそれ以上である。複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ複数の担体に固定される。例えば、BISTの場合、全長50 mmのキャピラリーに、プローブビーズ（目的物質を捕獲するための物資が固定されたビーズ）及び遮光ビーズを併せて50個程度のビーズを配置できる。プローブビーズには、ブランクと内部標準を含めてもよい。ブランクとは、捕獲物質が固定されていない担体である。内部標準とは、検体には含有し得ず、分析前に添加される既知濃度の標準物質を捕獲する物質が固定されている担体である。
複数種の目的物質を同時に検出又は定量するには、捕獲物質は他の捕獲物質の存在の有無に関わらず、特異的に目的物質を捕獲するため、異なる種類の捕獲物質が固定された複数種類の担体を、同一容器内に配置させ、液状の検体をこれらに接触させることで、複数種の目的物質を同時に検出できる。
また、本発明は、単一の容器内に収容された、複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ固定された複数の担体が発光し、この発光を容器外部から測定することで、複数種の目的物質を同時に検出又は定量するための分析キットであって、複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ固定された複数の担体と、所望の担体からの発光を選択的に受光するための光学フィルターとを含む前記分析キットを提供する。
担体、光学フィルター、容器、発光については上述した。
担体、光学フィルター、容器、発光については上述した。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに何ら影響されることはない。
BIST(Bead array In Straw Tip)は、抗体や核酸等、生体分子が固相された直径1mmのプローブビーズにより抗原や遺伝子等の目的物質を捕獲・検出するための技術として開発された。技術的な最大の特徴としては、円筒状のチップ（以下、「キャピラリー」）中に異なる目的物質を捕獲するためのプローブビーズが複数配置され、多項目の同時検出が可能な点にある。甲状腺刺激ホルモン（TSH: thyroid stimulating hormone）や、これと同時に検査されることで臨床上の有用性の高いFT3、FT4の定量検査への応用においては、実用上要求される検出濃度域が広範囲に及ぶ（TSH:0.05- 50uIu/mL, FT3:0.5-20pg/mL,FT4:0.1-10ng/dL、ダイナミックレンジで103程度）。このため、多項目同時検査を実現するためには、各プローブビーズからの信号光（目的物質の濃度に比例して強度が増加する光）を局在化させ、他のプローブビーズからの信号光との干渉を抑制しなければならない。本実施例においては、信号光局在化を目的として、キャピラリー着色の効果を検討した。
１．要旨
全長50mm程度のキャピラリーによるTSH検出において、6濃度水準の黒色顔料により着色されたキャピラリーを用いて、TSH（抗原濃度0.5及び25uIU/mL）の検出を行った。結果、キャピラリー着色の効果は、信号光強度の高い、TSH抗原濃度25uIU/mLで顕著に現れ、ピークの縦横比（（ピークの高さ）／（1/3,000幅））は、無着色時に比べ最大1.8倍程度となった。キャピラリーの着色は信号光の局在化に有効で、BISTの多項目化に対して有用な技術であることが確認された。
２．実験方法
２−１ キャピラリーの着色及び透過率の測定
住友ダウ株式会社製ポリカーボネートペレット（カリバー）を、サニーカラー株式会社製着色剤（ドライカラー Y-4-6033スモーク）によって5水準の濃度で着色（厚さ1mm、426nmに於ける透過率で約7.7%、19%、28%、62%、70%）した着色ペレットを調整した。
次いで、これらの着色ペレットを、厚さ1mmｘ3mm四方の板材に加工し、透過率測定用のテストピースを作製した。
このテストピースの透過率を、株式会社日立ハイテクノロジーズ社製分光光度計（U-3000）により、波長340-1000nmの領域で測定した。
２−２ TSH測定用BISTの作製
２−２−１ 抗体固層ビーズの作製
２−２−１-1 プローブビーズ30個を1ml の1×PBSにてサンプルチューブ内で数回転倒混和し洗浄した。これを2回繰り返した後、液を良く取り去り、1×PBS, 20ug/ml ・TSH; TSH183を300ul（10ul/ビーズ）添加し、4℃でO/N（19h）静置し、抗体を固層した。
２−２−１-2 抗体固層後、1ml の1×PBS, 0.05% Tween20にてサンプルチューブ内で数回転倒混和し洗浄した。これを2回繰り返した後、液を良く取り去り、1×PBS, 0.1% Tween20, 1%（w/w）Block Aceを300ul（10ul/ビーズ）添加し、RTで3h静置し、ブロッキングした。
２−２−１-3 ブロッキング後、1ml の1×PBS, 0.05% Tween20にてサンプルチューブ内で数回転倒混和し洗浄した。これを2回繰り返した後、液を良く取り去り、1×PBS を満たした。
２−２−２ 遮光ビーズの作製
２−２−２-1 SiCビーズを6.88g（約4000個）量り取り、15mlの1×PBSにてチューブ内で数回転倒混和し洗浄した。これを2回繰り返した後、液を良く取り去り、1×PBS, 0.1% Tween20, 1%（w/w）Block Aceを15ml添加し、RTで1hローテーターにてゆるやかに攪拌し、ブロッキングした。
２−２−２-2 ブロッキング後、15ml の1×PBS, 0.05% Tween20にてチューブ内で数回転倒混和し洗浄した。これを2回繰り返した後、液を良く取り去り、1×PBS を満たす。使用しない分は4℃保存した。
２−２−３ BISTの作製
TSHプローブビーズ1個と遮光ビーズ49個を図１のように充填した。
２−２−４ TSHの検出
２−２−４-1 下表のようにGC seriesカートリッジ（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社製に試薬を添加し、SX-12GC（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社製）にセットした。SX-12GCコンボラック（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社製）のHole-2にSheath DN-100（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社製）とともにBISTをセットし、約110分で反応が終了した。
２−２−４-2 反応が終了した後、well 1の溶液をキャピラリー内に満たし測定まで保存した。測定直前にキャピラリー内の溶液を抜き去った後、検出試薬（ECL western detection reagents, GEヘルスケアジャパン株式会社）を80ul吸引した。その後、PMT（Photomultipulator）及び走査式光ファイバー検出プローブを有するプレシジョン・システム・サイエンス株式会社製LuBEAにて測定した。
１．要旨
全長50mm程度のキャピラリーによるTSH検出において、6濃度水準の黒色顔料により着色されたキャピラリーを用いて、TSH（抗原濃度0.5及び25uIU/mL）の検出を行った。結果、キャピラリー着色の効果は、信号光強度の高い、TSH抗原濃度25uIU/mLで顕著に現れ、ピークの縦横比（（ピークの高さ）／（1/3,000幅））は、無着色時に比べ最大1.8倍程度となった。キャピラリーの着色は信号光の局在化に有効で、BISTの多項目化に対して有用な技術であることが確認された。
２．実験方法
２−１ キャピラリーの着色及び透過率の測定
住友ダウ株式会社製ポリカーボネートペレット（カリバー）を、サニーカラー株式会社製着色剤（ドライカラー Y-4-6033スモーク）によって5水準の濃度で着色（厚さ1mm、426nmに於ける透過率で約7.7%、19%、28%、62%、70%）した着色ペレットを調整した。
次いで、これらの着色ペレットを、厚さ1mmｘ3mm四方の板材に加工し、透過率測定用のテストピースを作製した。
このテストピースの透過率を、株式会社日立ハイテクノロジーズ社製分光光度計（U-3000）により、波長340-1000nmの領域で測定した。
２−２ TSH測定用BISTの作製
２−２−１ 抗体固層ビーズの作製
２−２−１-1 プローブビーズ30個を1ml の1×PBSにてサンプルチューブ内で数回転倒混和し洗浄した。これを2回繰り返した後、液を良く取り去り、1×PBS, 20ug/ml ・TSH; TSH183を300ul（10ul/ビーズ）添加し、4℃でO/N（19h）静置し、抗体を固層した。
２−２−１-2 抗体固層後、1ml の1×PBS, 0.05% Tween20にてサンプルチューブ内で数回転倒混和し洗浄した。これを2回繰り返した後、液を良く取り去り、1×PBS, 0.1% Tween20, 1%（w/w）Block Aceを300ul（10ul/ビーズ）添加し、RTで3h静置し、ブロッキングした。
２−２−１-3 ブロッキング後、1ml の1×PBS, 0.05% Tween20にてサンプルチューブ内で数回転倒混和し洗浄した。これを2回繰り返した後、液を良く取り去り、1×PBS を満たした。
２−２−２ 遮光ビーズの作製
２−２−２-1 SiCビーズを6.88g（約4000個）量り取り、15mlの1×PBSにてチューブ内で数回転倒混和し洗浄した。これを2回繰り返した後、液を良く取り去り、1×PBS, 0.1% Tween20, 1%（w/w）Block Aceを15ml添加し、RTで1hローテーターにてゆるやかに攪拌し、ブロッキングした。
２−２−２-2 ブロッキング後、15ml の1×PBS, 0.05% Tween20にてチューブ内で数回転倒混和し洗浄した。これを2回繰り返した後、液を良く取り去り、1×PBS を満たす。使用しない分は4℃保存した。
２−２−３ BISTの作製
TSHプローブビーズ1個と遮光ビーズ49個を図１のように充填した。
２−２−４ TSHの検出
２−２−４-1 下表のようにGC seriesカートリッジ（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社製に試薬を添加し、SX-12GC（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社製）にセットした。SX-12GCコンボラック（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社製）のHole-2にSheath DN-100（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社製）とともにBISTをセットし、約110分で反応が終了した。
２−２−４-2 反応が終了した後、well 1の溶液をキャピラリー内に満たし測定まで保存した。測定直前にキャピラリー内の溶液を抜き去った後、検出試薬（ECL western detection reagents, GEヘルスケアジャパン株式会社）を80ul吸引した。その後、PMT（Photomultipulator）及び走査式光ファイバー検出プローブを有するプレシジョン・システム・サイエンス株式会社製LuBEAにて測定した。
Binding Buffer: （PBS）
TSH:Human TSH（ヒト甲状腺刺激ホルモン（ヒト血清由来））
Biotin標識抗体:（抗ヒトＴＳＨ抗体をビオチン標識したもの）
Streptavidin-HRP: （Thermo scientific社製）
３．結果
抗原濃度0.5及び25uIU/mLのTSHをBISTにより測定した時の走査プロファイル（生データ）を図2-1、2-2に、キャピラリー材料の吸光度とピーク値の関係を図2-3に示す。発光のピーク値はキャピラリー素材の吸光度の増加（透過率の低下）とともに、ほぼ直線的に減少した。
これに対し、抗原濃度25uIU/mLのデータをピーク値で規格化したデータを図3-1に、キャピラリー材料の吸光度とピーク幅、の関係を図3-2に示す。ピーク幅はAbs=0 から 0.5の領域で急減に減少し、それ以上の吸光度領域では、大きな変化は見られなかった。
図3-3には、キャピラリー材料の吸光度と、ピーク値とピーク幅の比（P/W比）の関係をプロットしたグラフを示す。P/W比はAbs= 0 から0.2の領域で急激に増加し、0.2から0.8の領域で極大に達し、この時のP/W比は1.7-1.8程度であった。さらに吸光度が高くなる領域では、P/W比は再度減少するという結果になった。
４．考察
図3-3の結果から、BISTにおける信号光の局在化（P/W比の最大化）という課題において、キャピラリー材料の着色（信号光の遮蔽）は有効な手段であり、適度な着色によってP/W比を2倍弱まで増大させられる可能性が示された。本結果は、信号光分布の原因の一つが、キャピラリー壁を伝搬する光であることを示しており、材料の着色によりこの信号光のキャピラリー伝搬成分を選択的に低減させると考えられる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
抗原濃度0.5及び25uIU/mLのTSHをBISTにより測定した時の走査プロファイル（生データ）を図2-1、2-2に、キャピラリー材料の吸光度とピーク値の関係を図2-3に示す。発光のピーク値はキャピラリー素材の吸光度の増加（透過率の低下）とともに、ほぼ直線的に減少した。
これに対し、抗原濃度25uIU/mLのデータをピーク値で規格化したデータを図3-1に、キャピラリー材料の吸光度とピーク幅、の関係を図3-2に示す。ピーク幅はAbs=0 から 0.5の領域で急減に減少し、それ以上の吸光度領域では、大きな変化は見られなかった。
図3-3には、キャピラリー材料の吸光度と、ピーク値とピーク幅の比（P/W比）の関係をプロットしたグラフを示す。P/W比はAbs= 0 から0.2の領域で急激に増加し、0.2から0.8の領域で極大に達し、この時のP/W比は1.7-1.8程度であった。さらに吸光度が高くなる領域では、P/W比は再度減少するという結果になった。
４．考察
図3-3の結果から、BISTにおける信号光の局在化（P/W比の最大化）という課題において、キャピラリー材料の着色（信号光の遮蔽）は有効な手段であり、適度な着色によってP/W比を2倍弱まで増大させられる可能性が示された。本結果は、信号光分布の原因の一つが、キャピラリー壁を伝搬する光であることを示しており、材料の着色によりこの信号光のキャピラリー伝搬成分を選択的に低減させると考えられる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
本発明の方法は、複数の生体分子や生体分子と結合する低分子の検出及び定量的な解析に利用することができる。
Claims (7)
- 単一の容器内に収容された、複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ固定された複数の担体が発光し、この発光を容器外部から測定することで、複数種の目的物質を同時に検出又は定量するための分析方法であって、前記容器を着色することで、測定される発光を局在化させる前記方法。
- 測定される発光の波長帯における光線透過率が70%以下である着色容器を用いる請求項１記載の方法。
- 担体が球状である請求項１又は２に記載の方法。
- 担体が1次元的又は2次元的に配置している請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 発光が化学発光又は蛍光であり、発光の波長帯が340-900nmの範囲内にある請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 単一の容器内に収容された、複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ固定された複数の担体が発光し、この発光を容器外部から測定することで、複数種の目的物質を同時に検出又は定量するための分析キットであって、複数種の目的物質を捕獲するための物質がそれぞれ固定された複数の担体と、測定される発光を局在化させるように着色された容器とを含む前記分析キット。
- 発光が化学発光又は蛍光であり、発光の波長帯が340-900nmの範囲内にある請求項６記載の分析キット。
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