JP6169552B2 - ２−アミノピリジンによる糖鎖の標識法 - Google Patents
２−アミノピリジンによる糖鎖の標識法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6169552B2 JP6169552B2 JP2014212074A JP2014212074A JP6169552B2 JP 6169552 B2 JP6169552 B2 JP 6169552B2 JP 2014212074 A JP2014212074 A JP 2014212074A JP 2014212074 A JP2014212074 A JP 2014212074A JP 6169552 B2 JP6169552 B2 JP 6169552B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aminopyridine
- sugar chain
- labeled
- solution
- reducing end
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- ICSNLGPSRYBMBD-UHFFFAOYSA-N 2-aminopyridine Chemical compound NC1=CC=CC=N1 ICSNLGPSRYBMBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 86
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 title claims description 74
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title description 9
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 16
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 claims description 14
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 13
- RJTANRZEWTUVMA-UHFFFAOYSA-N boron;n-methylmethanamine Chemical compound [B].CNC RJTANRZEWTUVMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 7
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 claims description 5
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 5
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 3
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 3
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 3
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims description 3
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 102000004627 Iduronidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010003381 Iduronidase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 3
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108010061312 Sphingomyelin Phosphodiesterase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 claims description 3
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000010126 acid sphingomyelin phosphodiesterase activity proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 3
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 claims description 3
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 3
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 108010089296 galsulfase Proteins 0.000 claims description 3
- 229960005390 galsulfase Drugs 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 claims description 3
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 108010027520 N-Acetylgalactosamine-4-Sulfatase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 claims 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 claims 1
- 102100026001 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Human genes 0.000 claims 1
- 102000018740 N-Acetylgalactosamine-4-Sulfatase Human genes 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- 150000003927 aminopyridines Chemical class 0.000 description 18
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 230000008016 vaporization Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 3
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 2
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 description 2
- -1 aminopropyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 102100031491 Arylsulfatase B Human genes 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 101000840540 Homo sapiens Iduronate 2-sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 101710096786 Lysosomal acid alpha-glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- AHJMRMBEAYDQKG-UHFFFAOYSA-N pyridin-2-amine Chemical compound NC1=CC=CC=N1.NC1=CC=CC=N1 AHJMRMBEAYDQKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000009834 vaporization Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Description
本発明は，還元末端が２−アミノピリジンで標識された糖鎖を得るための方法に関する。
糖蛋白質の糖鎖構造の分析方法として，糖蛋白質をトリプシン処理し，次いでグリコシダーゼで処理して，糖蛋白質から糖鎖を遊離させた後，この糖鎖を２−アミノピリジンで標識（２−アミノピリジン標識）し，これを順相カラムクロマトグラフィーに付して分離分析する方法が知られている（非特許文献１）。
糖鎖の２−アミノピリジン標識は，例えば，糖鎖を含む試料に，２−アミノピリジン溶液を添加して加熱反応させてイミンを形成させた後，ボラン−ジメチルアミン錯体溶液を添加して加熱し，イミンを還元することにより行われる（非特許文献１）。次いで，未反応の２−アミノピリジン等を除去するため，反応後の溶液を，トリエチルアミンとメタノールの１：１混合液，及びトルエンを添加してから乾燥させて乾燥物とし，この乾燥物を，メタノール及びトルエンに溶解させた後，再度乾燥させてから，水性溶媒に溶解させ，この溶液を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して，２−アミノピリジン標識された糖鎖を分取する。このように，糖鎖を２−アミノピリジンで標識する方法は，トルエン等の人体に有害な有機溶媒を気化させて除去する工程を含む（特許文献１，非特許文献２）。従って，糖鎖を２−アミノピリジンで標識するために使用する特殊な装置（Ｔａｋａｒａ ＰＡＬＳＴＡＴＩＯＮｍｏｄｅｌ ４０００（タカラバイオ社））が市販されていた。
Ｋｕｒａｙａ Ｎ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２，１２２−６（１９９２）
Ｋｏｎｄｏ Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４．２１６９−７０（１９９０）
上記背景の下で，本発明の目的は，還元末端が２−アミノピリジンで標識された糖鎖を得るための新たな方法を提供することである。
上記目的に向けた研究において，本発明者は，鋭意検討を重ねた結果，糖鎖の還元末端を２−アミノピリジン標識させる反応において，反応過程において気化させて除去する有機溶媒の量を減じることができる新たな方法を見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。
（１）還元末端が２−アミノピリジンで標識された糖鎖を得るための方法であって，
還元末端を有する糖鎖と２−アミノピリジンとを含む溶液を加熱して，該還元末端と該２−アミノピリジンとを反応させることによりイミンを形成させた後，該溶液にボラン−ジメチルアミン錯体を添加して加熱し，該イミンを還元させることにより，還元末端が２−アミノピリジンで標識された標識化糖鎖を含む反応液を得るステップと，
該反応液にトルエンを添加し，該標識化糖鎖を沈殿させるとともに，未反応の２−アミノピリジンをトルエンとともに除去するステップと，
該沈殿を水性溶媒に溶解させて得られた溶液を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して，該標識化糖鎖を含有する画分を回収するステップとを，
この順で含んでなるものである方法。
（２）該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて，カラムに充填される樹脂の排除限界が，１．５×１０３Ｄａを超えないものである上記（１）に記載の方法。
（３）該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて，カラムに充填される樹脂の排除限界が，６．５×１０２〜７．５×１０２Ｄａである上記（１）に記載の方法。
（４）該糖鎖が，糖蛋白質から切り出して得られるものである，上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）該糖蛋白質が，組換え糖蛋白質である，上記（４）に記載の方法。
（６）該糖蛋白質が，イズロン酸−２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ（グルコシルセラミダーゼ），ガルスルファーゼ，リソソーム酸性リパーゼ，酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ），血液凝固第ＶＩＩ因子，血液凝固第ＶＩＩＩ因子，血液凝固第ＩＸ因子等の血液凝固因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，及び抗体からなる群から選択されるものである，上記（４）又は（５）に記載の方法。
（１）還元末端が２−アミノピリジンで標識された糖鎖を得るための方法であって，
還元末端を有する糖鎖と２−アミノピリジンとを含む溶液を加熱して，該還元末端と該２−アミノピリジンとを反応させることによりイミンを形成させた後，該溶液にボラン−ジメチルアミン錯体を添加して加熱し，該イミンを還元させることにより，還元末端が２−アミノピリジンで標識された標識化糖鎖を含む反応液を得るステップと，
該反応液にトルエンを添加し，該標識化糖鎖を沈殿させるとともに，未反応の２−アミノピリジンをトルエンとともに除去するステップと，
該沈殿を水性溶媒に溶解させて得られた溶液を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して，該標識化糖鎖を含有する画分を回収するステップとを，
この順で含んでなるものである方法。
（２）該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて，カラムに充填される樹脂の排除限界が，１．５×１０３Ｄａを超えないものである上記（１）に記載の方法。
（３）該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて，カラムに充填される樹脂の排除限界が，６．５×１０２〜７．５×１０２Ｄａである上記（１）に記載の方法。
（４）該糖鎖が，糖蛋白質から切り出して得られるものである，上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）該糖蛋白質が，組換え糖蛋白質である，上記（４）に記載の方法。
（６）該糖蛋白質が，イズロン酸−２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ（グルコシルセラミダーゼ），ガルスルファーゼ，リソソーム酸性リパーゼ，酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ），血液凝固第ＶＩＩ因子，血液凝固第ＶＩＩＩ因子，血液凝固第ＩＸ因子等の血液凝固因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，及び抗体からなる群から選択されるものである，上記（４）又は（５）に記載の方法。
本発明によれば，多量のトルエンを気化させることなく，還元末端が２−アミノピリジンで標識された糖鎖を得ることができる。
糖又は糖鎖の還元末端においては，環状構造をとる糖が開環して鎖状構造となったときにアルデヒド基又はケトン基が生じ得る。本発明において，２−アミノピリジン標識（又はアミノピリジン標識）というときは，糖又は糖鎖の還元末端を２−アミノピリジンと反応させることによりイミンを形成させ，次いでのこのイミンをボラン−ジメチルアミン錯体等を用いて還元させることにより，糖又は糖鎖の還元末端に２−アミノピリジンを付加させることをいう。また，本発明において，２−アミノピリジン標識化糖鎖，アミノピリジン標識化糖鎖，又は標識化糖鎖というときは，２−アミノピリジン標識（又はアミノピリジン標識）された糖又は糖鎖のことをいう。
アミノピリジン標識における，糖又は糖鎖の還元末端と２−アミノピリジンとを反応させてイミンを形成させる反応の一例を，下記の式（Ｉ）に示す。式（Ｉ）で示された反応は，糖鎖の還元末端に位置するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）と２−アミノピリジンとの反応である。
アミノピリジン標識における，イミンをボラン−ジメチルアミン錯体により還元させる反応の一例を下記の式（ＩＩ）に示す。式（ＩＩ）で示された反応は，式（Ｉ）の反応で生じたイミンの，ボラン−ジメチルアミン錯体による還元反応である。
本発明において，糖鎖の還元末端と２−アミノピリジンとを反応させてイミンを形成させるときの温度及び時間は，かかる反応が促進される温度及び時間であれば特に限定はないが，好ましくは７５〜８５℃で４０分〜２時間であり，より好ましくは約８０℃で約１時間である。また，ボラン−ジメチルアミン錯体により該イミンを還元させるときの温度及び時間は，かかる反応が促進される温度及び時間であれば特に限定はないが，好ましくは７５〜８５℃で４０分〜２時間であり，より好ましくは約８０℃で約１時間である。
本発明において，ボラン−ジメチルアミン錯体により該イミンを還元することにより，糖鎖の還元末端をアミノピリジンで標識する反応は完了する。しかし，反応後の溶液中には未反応の２−アミノピリジンが残存するので，糖鎖の分析を行うためには，上記還元反応後の溶液から未反応の２−アミノピリジンを除去する必要がある。未反応の２−アミノピリジンは，還元反応後の溶液にトルエンを添加し，トルエンで抽出することにより除去することができる。
未反応の２−アミノピリジンを除去するために還元反応後の溶液に添加するトルエンの量は，好ましくは当該溶液の２〜４倍容であり，より好ましくは約２．５倍容である。トルエンを添加して混和した後，遠心分離又は静置して，糖鎖を沈殿させるとともにトルエン層の上層を除去する。このトルエンにより未反応の２−アミノピリジンの除去する操作（トルエン抽出）は，好ましくは３〜５回，より好ましくは３回繰り返して行われる。最後のトルエン抽出の際には，沈殿を残すようにして，可能な限りの溶液を除去する。ここで除去したトルエンを含む液は，有機溶媒廃棄用の容器に回収されるので，この過程でトルエンが気化することはほとんどない。
トルエンにより未反応の２−アミノピリジンを除去した後，沈殿した糖鎖は乾燥される。このときの乾燥は，好ましくは減圧乾燥により行われる。このときトルエンが気化するが，その量は極わずかである。
減圧乾燥されたアミノピリジン標識化糖鎖は，水性溶媒に溶解されて，次いでゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付される。ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより，トルエン抽出により除去されなかった未反応の２−アミノピリジンが更に除去されるとともに，バファー交換がされる。このとき，アミノピリジン標識化糖鎖を溶解させるための水性溶媒は，好ましくは純水である。また，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに用いるカラムに充填されるべき樹脂の球状蛋白質に対する排除限界は，好ましくは１．５×１０３Ｄａを超えないものであり，より好ましくは６×１０２Ｄａ〜１．５×１０３Ｄａであり，更に好ましくは６．５×１０２Ｄａ〜７．５×１０２Ｄａであり，更により好ましくは約７×１０２Ｄａである。市販のＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ−１０（排除限界：７×１０２Ｄａ），ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ−１５（排除限界：１．５×１０３Ｄａ）等は，本発明において好適に使用できる。
本発明の方法で得られたアミノピリジン標識化糖鎖は，これを順相カラムクロマトグラフィーに付し，カラム通過後の溶液に，蛍光検出器で励起光を連続的に照射して，流出液から放射される蛍光の強度を測定することにより分析できる。このとき用いられる順相カラムクロマトグラフィーでカラムに充填されるべき担体は，分析対象の糖鎖の分子量に応じて適宜選択されるべきものであるが，アミノプロピル基を官能基として保持する担体が，この目的で好適に使用できる。
本発明において，糖蛋白質の糖鎖の還元末端をアミノピリジン標識する場合，糖蛋白質から糖鎖を予め切り出す必要がある。糖蛋白質からの糖鎖の切り出しは，酵素処理又は化学処理して行う。酵素処理は，Ｎ−グリコシダーゼ，グリコペプチダーゼＡ，Ｏ−グリコシダーゼ等を用いて行い，化学処理は，ヒドラジン分解等により行う。これらの処理により，糖蛋白質中のアスパラギン残基，セリン残基，スレオニン残基等に結合した糖鎖が切り出される。
本発明において，糖鎖が分析対象となる糖蛋白質は，特に限定はないが，好ましくはイズロン酸−２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ（グルコシルセラミダーゼ），ガルスルファーゼ，リソソーム酸性リパーゼ，酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ），血液凝固第ＶＩＩ因子，血液凝固第ＶＩＩＩ因子，血液凝固第ＩＸ因子等の血液凝固因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，及び抗体であり，特に，組換え体技術を用いて合成されたヒト等の哺乳動物の組換え糖蛋白質である。
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔ヒトイズロン酸−２−スルファターゼのグリコシダーゼ処理〕
組換え体ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｒｈｌ２Ｓ）の精製品を，公知の手法を用いて準備した（米国特許公報５７９８２３９）。ｒｈｌ２Ｓ溶液にＮ−グリコシダーゼＦ（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を加えて振り混ぜ，２〜８℃で３時間静置した。次いで反応液を９５℃で５分間加熱してグリコシダーゼを失活させてから減圧乾固した。
組換え体ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｒｈｌ２Ｓ）の精製品を，公知の手法を用いて準備した（米国特許公報５７９８２３９）。ｒｈｌ２Ｓ溶液にＮ−グリコシダーゼＦ（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を加えて振り混ぜ，２〜８℃で３時間静置した。次いで反応液を９５℃で５分間加熱してグリコシダーゼを失活させてから減圧乾固した。
〔糖鎖のアミノピリジン処理〕
上記の減圧乾固させた糖鎖に，２０μＬの２−アミノピリジン溶液（１５０ｍｇの２−アミノピリジンを５０μＬの酢酸に溶解したもの）を加えて振り混ぜ，８０℃で１時間反応させた。次いで，２０μＬのボラン−ジメチルアミン錯体溶液（２０ｍｇのボラン−ジメチルアミン錯体を１００μＬの酢酸に溶解したもの）を加えて振り混ぜ，８０℃で１時間反応させた。次いで，１００μＬのトルエンを加えて振り混ぜた後，遠心して，糖鎖を沈殿させるとともにトルエン層の上層を除去した。このトルエンによる抽出操作を，更に２回繰り返して行い，未反応の２−アミノピリジンを除去した。また，最後のトルエン抽出の際には，沈殿を残すようにして，可能な限りの溶液を除去した。ここで除去したトルエンを含む液は，有機溶媒廃棄用の容器に回収した。次いで，沈殿させた糖鎖を滅圧乾固させた後，５０μＬの水に溶解して糖鎖溶解液とし，これをゲルろ過カラムクロマトフィーに付して，アミノピリジン標識化糖鎖を含む画分を分取した。このときゲルろ過カラムクロマトフィーは，純水で平衡化させたＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ−１０（カラム径５ｍｍ，カラム長１５０ｍｍ，ＧＥヘルスケア）に糖鎖溶解液を付し，次いで，室温で８ｍＬ／分の流速で０．１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液を通して，蛍光検出器（励起波長３２０ｎｍ，蛍光波長４００ｎｍ）で蛍光強度をモニターしながら行った。このとき得られたクロマトグラムを図１に示す。図１において，ピークＡがアミノピリジン標識化糖鎖に由来するピークである。分取したアミノピリジン標識化糖鎖を含む画分を凍結乾燥した後，１ｍＬの水に溶かし，減圧乾固した。
上記の減圧乾固させた糖鎖に，２０μＬの２−アミノピリジン溶液（１５０ｍｇの２−アミノピリジンを５０μＬの酢酸に溶解したもの）を加えて振り混ぜ，８０℃で１時間反応させた。次いで，２０μＬのボラン−ジメチルアミン錯体溶液（２０ｍｇのボラン−ジメチルアミン錯体を１００μＬの酢酸に溶解したもの）を加えて振り混ぜ，８０℃で１時間反応させた。次いで，１００μＬのトルエンを加えて振り混ぜた後，遠心して，糖鎖を沈殿させるとともにトルエン層の上層を除去した。このトルエンによる抽出操作を，更に２回繰り返して行い，未反応の２−アミノピリジンを除去した。また，最後のトルエン抽出の際には，沈殿を残すようにして，可能な限りの溶液を除去した。ここで除去したトルエンを含む液は，有機溶媒廃棄用の容器に回収した。次いで，沈殿させた糖鎖を滅圧乾固させた後，５０μＬの水に溶解して糖鎖溶解液とし，これをゲルろ過カラムクロマトフィーに付して，アミノピリジン標識化糖鎖を含む画分を分取した。このときゲルろ過カラムクロマトフィーは，純水で平衡化させたＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ−１０（カラム径５ｍｍ，カラム長１５０ｍｍ，ＧＥヘルスケア）に糖鎖溶解液を付し，次いで，室温で８ｍＬ／分の流速で０．１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液を通して，蛍光検出器（励起波長３２０ｎｍ，蛍光波長４００ｎｍ）で蛍光強度をモニターしながら行った。このとき得られたクロマトグラムを図１に示す。図１において，ピークＡがアミノピリジン標識化糖鎖に由来するピークである。分取したアミノピリジン標識化糖鎖を含む画分を凍結乾燥した後，１ｍＬの水に溶かし，減圧乾固した。
〔順相クロマトグラフィーによるアミノピリジン標識された糖の分析〕
（１）装置
島津ＨＰＬＣシステムＬＣ−２０Ａ（島津製作所）に順相クロマトグラフィー用カラム（ＡｓａｈｉｐａｋＴＭ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ），官能基：アミノプロピル基，昭和電工）をセットした。カラムオーブンでカラムを５０℃に加熱するとともに，カラムの流出口の下流に蛍光検出器を設置し，カラム通過後の溶液に，励起光として波長３２０ｎｍの紫外線を照射し，波長４００ｎｍの蛍光を検出するようにした。
（２）移動相の調製
移動相として，０．１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液（溶液Ａ）と，０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液（溶液Ｂ）とを調製した。
（３）操作手順
上記の減圧乾固したアミノピリジン標識化糖鎖を溶液Ａに溶解し，試料溶液とした。還元糖分析システムのオートサンプラーに，溶液Ａと溶液Ｂをセットし，溶液Ａと溶液Ｂの体積比率が７０：３０である溶液でカラムを平衡化した後，試料溶液をカラムに負荷した。
（１）装置
島津ＨＰＬＣシステムＬＣ−２０Ａ（島津製作所）に順相クロマトグラフィー用カラム（ＡｓａｈｉｐａｋＴＭ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ），官能基：アミノプロピル基，昭和電工）をセットした。カラムオーブンでカラムを５０℃に加熱するとともに，カラムの流出口の下流に蛍光検出器を設置し，カラム通過後の溶液に，励起光として波長３２０ｎｍの紫外線を照射し，波長４００ｎｍの蛍光を検出するようにした。
（２）移動相の調製
移動相として，０．１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液（溶液Ａ）と，０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液（溶液Ｂ）とを調製した。
（３）操作手順
上記の減圧乾固したアミノピリジン標識化糖鎖を溶液Ａに溶解し，試料溶液とした。還元糖分析システムのオートサンプラーに，溶液Ａと溶液Ｂをセットし，溶液Ａと溶液Ｂの体積比率が７０：３０である溶液でカラムを平衡化した後，試料溶液をカラムに負荷した。
カラムに試料溶液を負荷した後，溶液Ａと溶液Ｂの体積比率が７０：３０の移動相を，０．６ｍＬ／分の流速で２分間カラムに流した後，同一流速で７８分かけて，移動相における溶液Ｂの体積比率を９５％にまで直線的に高め，次いで２５分間溶液Ｂの体積比率を９５％として同一流速で流し，更に，３５分間溶液Ａと溶液Ｂの体積比率を７０：３０にして同一流速で流した。カラム通過後の溶液に，励起光（波長３２０ｎｍ）を連続的に照射して該流出液から放射される蛍光（波長４００ｎｍ）の強度を連続的に測定した。
〔分析結果の評価〕
順相クロマトグラフィーによる分析の結果，アミノピリジン標識化糖鎖がピークＡ〜Ｅとして検出された（図２）。ピークＥは，アミノピリジン標識されたマンノース６リン酸を含む糖鎖に由来するものであった。
順相クロマトグラフィーによる分析の結果，アミノピリジン標識化糖鎖がピークＡ〜Ｅとして検出された（図２）。ピークＥは，アミノピリジン標識されたマンノース６リン酸を含む糖鎖に由来するものであった。
本発明によれば，多量のトルエンを気化させることなく，遺伝子組換え技術を用いて製造した糖蛋白質の糖鎖の還元末端を２−アミノピリジンで標識することができる。
Claims (6)
- 還元末端が２−アミノピリジンで標識された糖鎖を得るための方法であって，
還元末端を有する糖鎖と２−アミノピリジンとを含む溶液を加熱して，該還元末端と該２−アミノピリジンとを反応させることによりイミンを形成させた後，該溶液にボラン−ジメチルアミン錯体を添加して加熱し，該イミンを還元させることにより，還元末端が２−アミノピリジンで標識された標識化糖鎖を含む反応液を得るステップと，
該反応液にトルエンを添加し，該標識化糖鎖を沈殿させるとともに，未反応の２−アミノピリジンをトルエンとともに除去するステップと，
該沈殿を水性溶媒に溶解させて得られた溶液を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して，該標識化糖鎖を含有する画分を回収するステップとを，
この順で含んでなるものである方法。 - 該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて，カラムに充填される樹脂の排除限界が，１．５×１０３Ｄａを超えないものである請求項１に記載の方法。
- 該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて，カラムに充填される樹脂の排除限界が，６．５×１０２〜７．５×１０２Ｄａである請求項１に記載の方法。
- 該糖鎖が，糖蛋白質から切り出して得られるものである，請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
- 該糖蛋白質が，組換え糖蛋白質である，請求項４に記載の方法。
- 該糖蛋白質が，イズロン酸−２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，ガルスルファーゼ，リソソーム酸性リパーゼ，酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター，血液凝固第ＶＩＩ因子，血液凝固第ＶＩＩＩ因子，血液凝固第ＩＸ因子等の血液凝固因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，及び抗体からなる群から選択されるものである，請求項４又は５に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014212074A JP6169552B2 (ja) | 2013-10-01 | 2014-09-29 | ２−アミノピリジンによる糖鎖の標識法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013217811 | 2013-10-01 | ||
| JP2013217811 | 2013-10-01 | ||
| JP2014212074A JP6169552B2 (ja) | 2013-10-01 | 2014-09-29 | ２−アミノピリジンによる糖鎖の標識法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2015091953A JP2015091953A (ja) | 2015-05-14 |
| JP6169552B2 true JP6169552B2 (ja) | 2017-07-26 |
Family
ID=53195283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014212074A Active JP6169552B2 (ja) | 2013-10-01 | 2014-09-29 | ２−アミノピリジンによる糖鎖の標識法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6169552B2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10436790B2 (en) | 2011-09-28 | 2019-10-08 | Waters Technologies Corporation | Rapid fluorescence tagging of glycans and other biomolecules with enhanced MS signals |
| US11352325B2 (en) | 2011-09-28 | 2022-06-07 | Waters Technologies Corporation | Rapid fluorescence tagging of glycans and other biomolecules with enhanced MS signals |
| EP3974412A1 (en) | 2011-09-28 | 2022-03-30 | Waters Technologies Corporation | Rapid fluorescence tagging of glycans and other biomolecules with enhanced ms signals |
| CN107110785A (zh) | 2014-10-30 | 2017-08-29 | 沃特世科技公司 | 快速制备标记的葡糖基胺和分析生产所述标记的葡糖基胺的糖基化生物分子的方法 |
| JP6692811B2 (ja) * | 2014-11-13 | 2020-05-13 | ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン | 高速でラベル化されたｎ−グリカンに対する液体クロマトグラフィー較正方法 |
| US11035832B2 (en) | 2016-06-21 | 2021-06-15 | Waters Technologies Corporation | Methods of electrospray ionization of glycans modified with amphipathic, strongly basic moieties |
| WO2017222954A1 (en) | 2016-06-21 | 2017-12-28 | Waters Technologies Corporation | Fluorescence tagging of glycans and other biomolecules through reductive amination for enhanced ms signals |
| EP3479103B1 (en) | 2016-07-01 | 2022-04-20 | Waters Technologies Corporation | Methods for the rapid preparation of labeled glycosylamines from complex matrices using molecular weight cut off filtration and on-filter deglycosylation |
| CN110709700A (zh) | 2017-04-14 | 2020-01-17 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 评估细胞表面糖基化的方法 |
| EP3712609B1 (en) | 2017-11-15 | 2023-12-27 | JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. | Analysis method for glycan having acid group |
| CN108918749B (zh) * | 2018-07-17 | 2020-05-05 | 北京赛升药业股份有限公司 | 一种蛇毒纤溶酶的反相hplc检测方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08228795A (ja) * | 1994-12-27 | 1996-09-10 | Nakano Vinegar Co Ltd | 糖鎖分析用試料の調製方法及び該試料を用いた診断方法 |
| JPH10123096A (ja) * | 1996-10-22 | 1998-05-15 | Sumitomo Chem Co Ltd | シアロオリゴ糖の質量分析法 |
| JPH11127890A (ja) * | 1997-10-31 | 1999-05-18 | Kazuo Shimada | 糖蛋白質の生産方法 |
| JP4742191B2 (ja) * | 2001-06-14 | 2011-08-10 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 糖蛋白質およびその製造方法 |
| JP2005241389A (ja) * | 2004-02-25 | 2005-09-08 | Ochiyanomizu Jiyoshi Univ | 蛍光標識糖鎖の特異的固定化試薬および固定化方法 |
| JP3893470B2 (ja) * | 2005-03-10 | 2007-03-14 | 国立大学法人 香川大学 | 糖類の蛍光標識化方法、糖類の蛍光標識化装置 |
| JP2013100233A (ja) * | 2010-02-26 | 2013-05-23 | Osaka Prefectural Hospital Organization | 腫瘍マーカー、それに対する抗体、その検出キット及びその検出方法 |
| JP2013224885A (ja) * | 2012-04-23 | 2013-10-31 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | シアロ糖鎖を含む糖鎖試料を液体クロマトグラフィー質量分析を用いて分析する方法 |
-
2014
- 2014-09-29 JP JP2014212074A patent/JP6169552B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2015091953A (ja) | 2015-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6169552B2 (ja) | ２−アミノピリジンによる糖鎖の標識法 | |
| JP5688043B2 (ja) | 糖鎖誘導体の製造方法、構造解析方法、及び糖鎖誘導体 | |
| Volpi et al. | Analysis of glycosaminoglycan-derived, precolumn, 2-aminoacridone–labeled disaccharides with LC-fluorescence and LC-MS detection | |
| Wang et al. | Structural investigation of a uronic acid-containing polysaccharide from abalone by graded acid hydrolysis followed by PMP-HPLC–MSn and NMR analysis | |
| Yang et al. | Hyphenated techniques for the analysis of heparin and heparan sulfate | |
| JP5552421B2 (ja) | エキソグリコシダーゼを用いるｎ−グリカンの特性決定法 | |
| Hua et al. | Isomer-specific LC/MS and LC/MS/MS profiling of the mouse serum N-glycome revealing a number of novel sialylated N-glycans | |
| Volpi et al. | High-performance liquid chromatography-mass spectrometry for mapping and sequencing glycosaminoglycan-derived oligosaccharides | |
| Hecht et al. | Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, INLIGHT plasma N-glycans | |
| CN104198613B (zh) | 一种分析蛋白o-糖基化位点的方法 | |
| JPWO2009133696A1 (ja) | 糖鎖標識方法 | |
| Zhou et al. | Dual modifications strategy to quantify neutral and sialylated N-glycans simultaneously by MALDI-MS | |
| Yoshida et al. | Chemical Synthesis of Syndecan‐3 Glycopeptides Bearing Two Heparan Sulfate Glycan Chains | |
| Gill et al. | Mass spectrometric method for determining the uronic acid epimerization in heparan sulfate disaccharides generated using nitrous acid | |
| Zhang et al. | Preparation of complex glycans from natural sources for functional study | |
| CN1934135A (zh) | 使用hplc定量测定具体组成肝素或低分子量肝素的方法 | |
| Bavaro et al. | Chemoenzymatic synthesis of neoglycoproteins driven by the assessment of protein surface reactivity | |
| Zamfir | Applications of capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry in glycosaminoglycan analysis | |
| JP2009142238A (ja) | 細胞表面糖鎖の遊離方法及び検出方法 | |
| Yang et al. | Separation and preparation of N-glycans based on ammonia-catalyzed release method | |
| Kronewitter et al. | Polysialylated N-glycans identified in human serum through combined developments in sample preparation, separations, and electrospray ionization-mass spectrometry | |
| Wang et al. | Reductive chemical release of N-glycans as 1-amino-alditols and subsequent 9-fluorenylmethyloxycarbonyl labeling for MS and LC/MS analysis | |
| JP2009229426A (ja) | 糖鎖分析法 | |
| Xie et al. | Effects of chemical modification on the structure and biological activities of polysaccharides extracted from Inonotus obliquus by microwave | |
| CN110642963A (zh) | 一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161107 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170627 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170628 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6169552 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |