JP6038017B2 - 核酸を含む逆ミセル系及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、ステロール、アシルグリセロール、リン脂質又はスフィンゴ脂質及び核酸に基づく逆ミセル系に関する。本発明の逆ミセル系は、粘膜及び細胞膜を通過できる。従って、それは、核酸のターゲット部位へのベクトル化を可能にする。有利なことに、それは、医薬及び栄養の分野において有用である。

背景技術
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）及びアンチセンス（ＡＳ）戦略は、ｍＲＮＡターゲットの分解又は翻訳停止を可能にする核酸の使用によって、ターゲット遺伝子の発現をサイレンシングすることにある。新たなアンチセンス用途（エクソンスキッピング、選択的スプライシング校正）は、選択的スプライシング不履行の原因となる変異を隠すことによって、機能的タンパク質の合成を可能にしてきた。アプタマーは、ターゲットタンパク質と相互作用し、その合成をダウンレギュレーションできる核酸である。これらの核酸すべて、並びに、つい最近のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びＲＮＡａの発見は、遺伝性疾患、ガン、神経変性疾患、伝染性疾患及び炎症性疾患のような疾患の処置のための治療、又は、それらによって引き起こされる細胞増殖及び疾患を遮断することの見通しを大きく開いた。

しかしながら、これらの分子は体液中で不安定であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、それらは、弱い細胞内浸透及び低い生物学的利用率を示す。これらの大きな不利点は、治療におけるそれらの使用を制限してきた。その結果、前記核酸の臨床応用は、安定性及び細胞内浸透を増加させながら、タンパク質発現をノックダウンするそれらの能力を保持するための化学的改変を必要としている。核酸送達に基づいた治療の開発を妨げていた最大の障害を克服するために、研究グループは、それらの送達を改善するナノテクノロジー手法も適用している。生物学的利用率を改善するために、多くの研究者は、代替的な投与経路：眼、皮膚、口、筋肉内を使用することも試みている。今までのところ、それらの試みは、全く満足できるものではない。例えば、これらの試みのいくつか、より具体的には、リポソーム担体中の核酸を用いたアッセイは、免疫反応を刺激している。

以前、本発明者らは、植物抽出物から単離され、シトステロール及びアシルグリセロールからそれぞれ構成された２つの有機化合物から複合体が得られ、水溶性治療剤となり得ることを発見したが（W02006/048772）、これらの複合体は、前記治療剤の粘膜輸送ベクターとして特に効果的な薬剤である。以前記載したように、水溶性治療剤のこのようなベクトル化は、ミセルの非存在下におけるそれらの投与と比較して、投与量の大きな減少をもたらす。

前記複合体は、即時粘膜投与によって水溶性治療剤をベクトル化するのに効果的であることが示されている。しかしながら、治療剤を含むマイクロエマルションの安定性は、例えば、薬物及び／又は栄養化合物用の送達システムとしてのそれらの開発を可能にするには、常に満足できるものではない。このような開発は、長期間にわたって（例えば、数週間又は数ヶ月にわたって）室温で安定である製剤を必要とする。

本発明の目的は、先行技術の不利点を克服することである。安全かつ有効な核酸治療戦略、特に、有効な遺伝子発現モデュレーションに基づいた治療を達成できる新たなツールが明らかに必要である。より具体的には、例えば、粘膜投与され、活性型における薬物生物学的利用能を満足させ得る核酸、特にオリゴヌクレオチドを含む薬物送達システムを提供することが本発明の目的である。

驚くべきことに、特に、高投与量の核酸を含むマイクロエマルション製剤中の特定量のリン脂質又はスフィンゴ脂質の導入が、それらの安定性の大きな増加をトリガーした。

本発明は、多量の核酸をベクトル化できる新たなマイクロエマルション製剤、それらの調製過程、並びに、薬物及び／又は栄養化合物用の送達システムとしての使用を説明する。本明細書において、「多」量は、ヒトスケールで治療活性を得るのに十分だが、複合体の非存在下において送達される核酸の量よりも依然としてはるかに少ない量を意味する。

有利なことに、この製剤は、医薬及び栄養の分野におけるミセルの使用のための、ミセルを含む組成物のコントロール及び最適化を可能にする。

発明の概要
本発明は、核酸の放出用送達システム（好ましくは、粘膜的に適用される）、並びに、その送達システムを調製するための組成物及び方法に関する。安全かつコントロールされた方法でこの目的を達成するために設計された逆ミセル系が、本明細書において記載される。逆ミセル系は、粘膜を通じて吸収され、保護形態にある核酸を生物の任意の組織にベクトル化できる。

より具体的には、本発明は、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ又はタンパク質と相互作用でき、遺伝子発現をモデュレーションできる核酸、特にオリゴヌクレオチドを投薬するための逆ミセル輸送システムを提供する。より具体的には、本発明による逆ミセルは、粘膜上皮バリアを通過する核酸の吸収を促進し、核酸がターゲット細胞に取り込まれることを可能にする。本発明の逆ミセルは、より具体的には、遺伝子発現をモデュレーションできる少なくとも１つの核酸、特にオリゴヌクレオチド、ステロール、アシルグリセロール、リン脂質又はスフィンゴ脂質、アルコール及び水を含む。

逆ミセルは、ステロール、アシルグリセロール、リン脂質又はスフィンゴ脂質、アルコール及び水を少なくとも使用して、以下に記載される方法に従って調製され得る。

前記ミセルは、より具体的には、以下の方法：
（ａ）（ｉ）ステロール、好ましくはシトステロール又はコレステロール、（ｉｉ）アシルグリセロール、好ましくはジアシルグリセロール、（ｉｉｉ）リン脂質、好ましくはホスファチジルコリン又はスフィンゴ脂質、（ｉｖ）アルコール、（ｖ）水、好ましくは精製水及び（ｖｉ）遺伝子発現をモデュレーションできる少なくとも１つの核酸、特にオリゴヌクレオチド、を接触させること、
（ｂ）工程（ａ）において得られた混合物を、４０℃以下で、逆ミセルの形成を得るのに十分な時間撹拌すること
によって得られる。

当業者であれば誰でも、実験条件に応じて、撹拌のパラメーター（例えば、機械的撹拌の継続期間及び速度）を、容易に決定できる。実際、これらのパラメーターは、マイクロエマルションが得られるようなものである；速度は、視覚的に透明な製剤の形成が可能なように決定され、撹拌の継続期間は、視覚的に透明な製剤を得た後数分間に、撹拌が中止され得るようなものである。

本発明はさらに、本発明の逆ミセル及び薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は支持体を含む、医薬組成物に関する。

発明の詳細な説明
以下の説明は、ほんの一例としての好ましい実施態様であり、本発明を実施するために必要な特徴の組み合わせに制限はない。

逆ミセル
本発明による逆ミセル系は、油中における水のナノドロップレットの分散体を含むマイクロエマルションとして特徴付けられる。分散体は、水／油界面で最も合いそうな、２つの界面活性剤（アシルグリセロール、より好ましくはジアシルグリセロール、及び、リン脂質、より好ましくはホスファチジルコリン又はスフィンゴ脂質）及び補助界面活性剤（アルコール）により安定化される。逆ミセルは、水が内相を形成し、脂質の疎水性尾部が連続層を形成する系として定義され得る。油、界面活性剤、補助界面活性剤及び水層を含む逆ミセルは、油中水型マイクロエマルションとしても特徴付けられる。これらのマイクロエマルションは、熱力学的に安定であり、視覚的に透明である。

一般的には、本発明によるミセルの大きさは、非常に小さく、より具体的には、それは、１０nm未満である；より具体的には、それは、８nm未満、より好ましくは６nm未満である。その大きさは、添加される水及びリン脂質又はスフィンゴ脂質の量によって変わり得る。本発明は、より具体的には、約４nm、好ましくは３〜５nm、より好ましくは３．５〜５nm、特に３．７〜４．５nmの水性コアを有する逆ミセルに関する。

逆ミセル及びそれらの水性コアの大きさは、
− 小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）
− 中性子散乱
− 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
− 動的光散乱（ＤＬＳ）
を含む様々な方法によって特徴付けられ得る。

本発明による逆ミセル系における脂質成分（ステロール、アシルグリセロール及びリン脂質又はスフィンゴ脂質を含む）の比は、変わり得る。例えば、重量比ステロール／アシルグリセロールは、０．０１５〜０．０５、より具体的には０．０３〜０．０４の範囲であり得る。

重量比リン脂質又はスフィンゴ脂質／アシルグリセロールは、０．０５〜０．４０、特に０．０６〜０．２５の範囲であり得る。リン脂質又はスフィンゴ脂質の重量は、製剤化において使用されるリン脂質又はスフィンゴ脂質の混合物の総重量（例えば、レシチンの重量）にそれぞれ対応する。同様に、アシルグリセロールの重量は、アシルグリセロールを通常含む混合物、又は、アシルグリセロールと前記アシルグリセロール由来のグリセロール及び脂肪酸との混合物の総重量に対応する。

逆ミセル系の化合物は、適切な手段によって分析され得る。より具体的には、ステロールは、ガスクロマトグラフィー分析により、アシルグリセロールは、特に光散乱検出器を備えた、溶離液、例えば定組成アセトニトリルの存在下のシリカカラムでの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により同定され得る。ガスクロマトグラフィーは、ジアシルグリセロールを分析するのにも使用され得る。リン脂質及びスフィンゴ脂質は、ジオールカラムを備え光散乱検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析され得る。

逆ミセルは、動的な系である。ブラウン運動は絶え間ないミセルの衝突を引き起こし、それにより、ミセルの合体と水性コアの交換が生じる。ミセルの分離と再生が生じ、異なる溶液間での化学反応が生起する。ミセル間での交換速度は、特に、温度、界面活性剤の炭化水素鎖の長さ、及び水／界面活性剤比と共に、増大する。本発明の文脈内で、ミセルの水性コアは、調製されたミセル中で、遺伝子発現をモデュレーションできる１つ以上の核酸、特にオリゴヌクレオチドの分子が安定化されることを可能にする特定の大きさを有しなければならない。上述のように、水性コアの大きさは、好ましくは約４nm、より好ましくは３〜５nm、より具体的には３．５〜５nm、特に３．７〜４．５nmである。

逆ミセルは、例えば、スフィア、シリンダー又は分枝状のシリンダーなどの異なる構造機構として、本発明の系において存在し得る。

いかなる理論にも束縛されることなく、逆ミセル系においてリン脂質又はスフィンゴ脂質を含めることは、より大きな直径及び体積を有する安定なミセルの形成を可能にし、従って、多量の核酸のベクトル化を可能にするように思われる。ベクトル化核酸量のこの増加は、治療活性を得るのに十分な量のベクトル化をもたらす。逆ミセル系におけるリン脂質又はスフィンゴ脂質の取り込みは、マイクロエマルション（特に、多量の核酸を含むマイクロエマルション）のより高い安定性をさらにもたらす。

本発明の逆ミセル系は、粘膜を通過して、好ましくは口粘膜、鼻粘膜及び／又は直腸粘膜を通過して、より好ましくは口粘膜を通過して送達されるべき化合物の吸収を保証する。また、本発明の逆ミセルは、低変動の吸収で重要な生物学的利用率を提供する。

逆ミセルを調製するための方法
特定の実施態様では、本発明は、約４nm、好ましくは３〜５nm、より好ましくは３．５〜５nm、特に３．７〜４．５nmの水性コアを示し、遺伝子発現をモデュレーションできる少なくとも１つの核酸、特にオリゴヌクレオチド、ステロール、アシルグリセロール、リン脂質又はスフィンゴ脂質、アルコール及び水を含む、逆ミセルを調製するための方法であって、以下の工程：
（ａ）（ｉ）ステロール、（ｉｉ）アシルグリセロール、好ましくはジアシルグリセロール、（ｉｉｉ）リン脂質、好ましくはホスファチジルコリン又はスフィンゴ脂質、（ｉｖ）アルコール、（ｖ）水、好ましくは精製水及び（ｖｉ）遺伝子発現をモデュレーションできる少なくとも１つの核酸、特にオリゴヌクレオチド、を接触させること、
（ｂ）工程（ａ）において得られた混合物を、４０℃以下で、逆ミセルの形成を得るのに十分な時間撹拌すること
を含む、方法に関する。

次いで、得られ、回収された逆ミセルは、核酸用の送達システムとして特に有用である。プロセスの工程（ｂ）は、逆ミセルが得られることを可能にするので、特に重要であり、前記逆ミセルは、次いで、核酸をターゲット部位に送達するための輸送システムとして有用である。ターゲット部位は、例えば、特定の組織の細胞であり得る。

特定の実施態様では、最初に、核酸は、水（好ましくは、精製水）中で可溶化されて、水性混合物を形成する。次いで、前記水性混合物は、油性混合物に取り込まれる（工程（ａ））。油性混合物は、好ましくは、少なくとも１つのステロール、アシルグリセロール、リン脂質又はスフィンゴ脂質及びアルコールを含む。

工程（ａ）に関与する化合物は、以下により詳細に記載されるであろう。

工程（ａ）によって得られた混合物の撹拌は、４０℃以下、具体的には１５℃〜４０℃、又は、より好ましくは２５℃〜４０℃、又は、より具体的には３０℃〜３７℃の範囲の温度で実施される。十分な時間は、特に、使用される撹拌技術に応じて変わり得る。いずれにせよ、撹拌の時間は、開始混合物を視覚的に透明な逆ミセル溶液に変換するのに必要な時間である。

当業者であれば、本発明による組成物の有益な特性を保つために、本発明による組成物と一緒に使用され得る賦形剤又は成分を選択する方法を知っている。特に、グリセロールの存在は、大量に取り込まれる場合、逆ミセルの形成を防ぎ得るか、又は逆ミセル系を破壊し得る。より具体的には、わずか２．５％（グリセロールの重量／アシルグリセロールの重量によって表されるパーセント）しか、本発明の逆ミセルの調製に使用されない。

他の化合物が、工程（ａ）において導入され得る。例えば、着色剤及び／又は香味物質を挙げることができる。

有利な方法において、上記化合物又はそれらを含む市販の混合物は、ミセル系を調製するために導入される唯一の成分であり、その結果として、その唯一のものは、本発明のミセル系において存在する。

工程（ｂ）の撹拌は、例えば、機械的撹拌によって実施され得る。

一般的な装置は、その高速移動が、混合物内で粒子の相互浸透及び逆ミセルの形成を可能にする乱流及び渦を発生させるプロペラであり得る。

機械的撹拌速度は、好ましくは１００〜２０００r/分、より好ましくは３００〜７００r/分の範囲である。実施される容量、装置及び撹拌速度は、反応物質及びそれらの量に依存し、適合されるべきである。

温度は、より具体的には、１５℃〜４０℃、又は、２５℃〜４０℃、又は、さらにより具体的には３０℃〜３７℃の範囲である。

逆ミセル化合物
アシルグリセロール
本発明による逆ミセル系の調製に有用なアシルグリセロールは、動物及びより好ましくは植物の大部分から単離され得る。

アシルグリセロールは、モノ−、ジ−及びトリ−アシルグリセロールを含む。特定の実施態様では、本発明において優先的に使用されるアシルグリセロールは、以下の式（Ｉ）：

（式中、
− Ｒ_１は、１４〜２４個の炭素原子を有する、直鎖状若しくは分枝状の、飽和若しくは不飽和脂肪酸のアシル残基、水素原子、又はモノ−、ジ−若しくはトリ−ガラクトース若しくはグルコースであり；
− Ｒ_２は、２〜１８個の炭素原子を有する、直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和脂肪酸のアシル残基であり；
− Ｒ_３は、１４〜２４個の炭素原子を有する、直鎖状若しくは分枝状の、飽和若しくは不飽和脂肪酸のアシル残基、又は水素原子である）

特定の実施態様によれば、Ｒ_１又はＲ_３、好ましくはＲ_１及びＲ_３の１つだけ、特にＲ_１だけは、オレイン酸（Ｃ１８：１［シス］−９）のアシル残基を表す。

特定の態様によれば、Ｒ_２は１個の不飽和結合（例えば、エチレン性結合）を有し、有利には、１８個の炭素原子を有し、好ましくは、Ｒ２は、オレイン酸残基（オレオイル基）、二重結合（シス−６，７，９，１１及び１３）に関するその位置異性体の１つ又はそのイソ分枝異性体の１つである。

別の特定の態様によれば、Ｒ_１は、オレオイル基を表す。

別の特定の態様によれば、Ｒ_２は、アセチル基を表す。

別の特定の態様によれば、Ｒ_３は、水素原子である。

一般的に、オレイン酸を高濃度で含有する油が、本発明によるアシルグリセロールの有用な源として選択される。このような油は、通常、本発明による有用なアシルグリセロールを高い割合で含有している。

本発明の特定の態様によれば、好ましいジアシルグリセロールは、１，２−ジオレオイルグリセロール（又は、本明細書において、１，２−ジオレインとも命名される）及び１−オレオイル−２−アセチルグリセロールよりなる群の中で選択される。

それらの一定数、より具体的には、求められている用途において最も活性であることが見出されているものも、市販されている。これは、特に、１−オレオイル−２−アセチルグリセロール及び１，２−ジオレオイルグリセロールの場合である。グリセロールモノオレエート４０は、約３３％のジオレオイルグリセロール及び約１１％の１，２−ジオレインを含み、薬学的に許容されている（European Pharmacopeia (4^th Edition)、USP 25/NF20及びJapanese Standard of food Additives）。このような製造物は、例えば、PECEOL（登録商標）の名前でGattefosse社から市販されている。

アシルグリセロールは、好ましくは、総重量１００ｇの本発明による組成物又は逆ミセル系に対して、５０ｇ〜９０ｇの範囲の重量の量で、組成物若しくは逆ミセル系中に導入されるか、又は含められる。以下に特定される重量比により具体的に一致させるために、本明細書において詳述される量は、他の化合物に対して適合されるであろう。

ステロール
本発明による逆ミセル系の調製に有用なステロールは、好ましくは、コレステロール又は植物ステロール（野菜ステロール）などの天然のステロールである。シトステロール及びコレステロールが、本発明による逆ミセル系に有用な、好ましいステロールである。

シトステロール及びコレステロールは、市販されている。より具体的には、大豆から抽出された市販のシトステロールを使用され得る。このような製品では、シトステロールは、一般的に、製品の５０〜８０重量％を示し、一般的に、各々１５％程度の割合のカンペステロール及びシトスタノールとの混合物中に見出される。トール油と称される、種々の松から抽出された市販のシトステロールも、使用され得る。一般的に、シトスタノールとの混合物中のシトステロールを使用され得る。好ましくは、その混合物は、混合物の少なくとも５０重量％のシトステロールを含む。

上述のように、本発明による逆ミセル系における脂質成分（ステロール、アシルグリセロール及びリン脂質又はスフィンゴ脂質）の比は、変わり得る。好ましくは、重量比ステロール／アシルグリセロールは、０．０１５〜０．０５、より具体的には０．０３〜０．０４の範囲であり得る。本発明において、ステロールの重量は、製剤化において使用されるステロールの総重量（例えば、植物ステロールの重量）に一致する。

ステロールは、好ましくは、総重量１００ｇの本発明による組成物又は逆ミセル系に対して、０．８２５ｇ〜４．５ｇの範囲の重量の量で、組成物若しくは逆ミセル系中に導入されるか、又は含められる。上記及び／又は以下に特定される重量比により具体的に一致させるために、本明細書において詳述される量は、他の化合物に対して適合されるであろう。

リン脂質及びスフィンゴ脂質
リン脂質は、２つの脂肪酸とリン酸基とに結合したグリセロールで形成される。リン脂質の可変性は、グリセロールに結合している脂肪酸、及び、リン酸基に結合しやすい化学基によるものである。リン脂質は、スフィンゴ脂質と共に、生体膜の主な脂質成分である。

本発明において有用なリン脂質には、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール及びホスファチジルコリンが挙げられ得る。

具体的な実施態様では、リン脂質は、ホスファチジルコリンである。ホスファチジルコリンは、１，２−ジアシル−グリセロ−３−ホスホコリン又はＰｔｄＣｈｏとしても公知である。

ホスファチジルコリンは、コリン、リン酸基、グリセロール及び２つの脂肪酸から形成される。それは、実際には、脂肪酸組成が分子ごとに変わる分子の集団である。ホスファチジルコリンは、２０〜９８％の重量濃度でホスファチジルコリンを含む市販のレシチンから得られ得る。本発明による逆ミセルの調製に好ましく使用されるレシチンは、Epikuron 200（登録商標）であり、９０％超の濃度でホスファチジルコリンを含む。

スフィンゴ脂質は、脂肪族アミノアルコールスフィンゴシンに由来する脂質のクラスである。本発明において使用され得るスフィンゴ脂質には、アシルスフィンゴシン、スフィンゴミエリン、スフィンゴ糖脂質及びガングリオシドが挙げられ得る。

本発明の逆ミセル系は、リン脂質、スフィンゴ脂質、又は両種類の化合物の混合物、好ましくはリン脂質を含み得る。

具体的な実施態様によれば、本発明の逆ミセル系は、リン脂質を含む。

本発明による組成物若しくは逆ミセル系における重量比リン脂質及び／又はスフィンゴ脂質／アシルグリセロールは、０．０５〜０．４０、好ましくは０．０６〜０．２５である。

リン脂質又はスフィンゴ脂質は、好ましくは、総重量１００ｇの本発明による組成物又は逆ミセル系に対して、１ｇ〜３０ｇ、好ましくは５〜２０ｇの範囲の重量の量で、組成物若しくは逆ミセル系中に導入されるか、又は含められる。上記に特定される重量比により具体的に一致させるために、本明細書において詳述される量は、他の化合物に対して適合されるであろう。

アルコール
本発明による逆ミセル系の調製に有用なアルコールは、好ましくは、直鎖状又は分子状の、Ｃ２〜Ｃ６のモノアルコールである。アルコールの例は、エタノール、１−ブタノール、２−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、１−ペンタノール、１−プロパノール、２−プロパノール及びそれらの任意の混合物である。本発明の特定の実施態様では、アルコールは、エタノールである。

アルコールは、好ましくは、総重量１００ｇの本発明による組成物又は逆ミセル系に対して、５ｇ〜１２ｇの範囲の重量の量で、組成物若しくは逆ミセル系中に導入されるか、又は含められる。

水
本発明による逆ミセル系の調製に有用な水は、好ましくは、精製水、より好ましくはＲＮＡｓｅ又はＤＮＡｓｅフリーの水である。

水は、好ましくは、総体積１００mlの本発明による組成物又は逆ミセル系に対して、１ｇ〜１５ｇ、好ましくは５ｇ〜１５ｇの範囲の重量の量で、組成物若しくは逆ミセル系中に導入されるか、又は含められる。

当業者であれば、系におけるリン脂質又はスフィンゴ脂質の量を、所望量の水に適合させるであろう。例えば、水の量を増加させることは、系におけるリン脂質又はスフィンゴ脂質の量を増加させることを意味するはずである。

核酸
本発明において、「核酸」という用語は、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はタンパク質と相互作用でき、遺伝子発現をモデュレーションできる任意の核酸を意味する。好ましい核酸は、ターゲットタンパク質の発現をアップレギュレーション又はダウンレギュレーションできる。

「核酸」は、任意のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）を含む。この用語は、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えで製造されたＲＮＡ、アプタマー及び非標準ヌクレオチド（例えば、非天然に存在するヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチド）を含む核酸を含む。例えば、ギャップマー（gapmer）を挙げることができる。

「オリゴヌクレオチド」は、５個〜１００個のヌクレオチド、好ましくは１０個〜９０個のヌクレオチド、より好ましくは１３個〜８０個のヌクレオチド、より具体的には１３個〜２５個のヌクレオチドを含む核酸を意味する。

本明細書において使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「低分子干渉核酸」（ｓｉＮＡ）、「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」、「ｍｉＲＮＡ」、「マイクロＲＮＡ」、「ＲＮＡ活性化」（ＲＮＡａ）、「短ヘアピンＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）及び「アプタマー」という用語は、配列特異的な方法でターゲットタンパク質発現をアップレギュレーション又はダウンレギュレーション（例えば、遺伝子サイレンシング）することによって、遺伝子発現をモデュレーションできる任意の核酸分子を意味する。遺伝子発現をモデュレーションするための様々な核酸戦略を、以下に記載する。

１．ＲＮＡ干渉戦略
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内に存在する場合に、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）のものと同一又はほぼ同一の配列を有する内在性遺伝子の発現を阻害する過程を表す。阻害は、ターゲット遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特異的分解によって引き起こされる。より詳細には、ＲＮＡ干渉は、ｉｎ ｓｉｔｕ切断後の「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）の発現よって介在される、動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程を表す（Brummelkamp T.R. and al, 2002）。最初の基本的な過程は、ｄｓＲＮＡを含み、これは切断によってより短い単位（いわゆるｓｉＲＮＡ）（これが、相同的なターゲットメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の認識及びターゲティングされた切断を導く）にプロセシングされる。

従って、この方法は、古典的な遺伝子ノックアウト戦略で必要とされるもののように、時間のかかる遺伝子操作を必要とせず、従って、ヒト治療にも適用され得る、分子遺伝学における有益なツールとして出現した。

ＲＮＡｉの現在知られている機序は、以下に記載され得る：

ｄｓＲＮＡのｓｉＲＮＡ（これが、今度は、目的のターゲットｍＲＮＡの分解を誘導する）へのプロセシングは、２ステップＲＮＡ分解過程である。第一のステップは、ｄｓＲＮＡエンドヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼＩＩＩ様；ＲＮａｓｅ ＩＩＩ様）活性を含み、これはｄｓＲＮＡを、より小さなセンス及びアンチセンスＲＮＡ（これは、１９個〜２５個のヌクレオチド（ｎｔ）長の範囲であることが最も多い）に加工して、いわゆる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を生じさせる。このＲＮａｓｅ ＩＩＩ型タンパク質は、「ダイサー」と称される。第二のステップにおいて、生成されたアンチセンスｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される異なるリボヌクレアーゼ複合体と結合しそのガイドとして働き、これにより、ｓｉＲＮＡと相同的な一本鎖ターゲットｍＲＮＡとのアニーリング、及び、相同的な一本鎖ターゲットｍＲＮＡの切断が可能となる。ターゲットｍＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖及び目的のターゲットｍＲＮＡの相補的な二本鎖領域の真ん中で起こることが観察されている（Dykxhoorn D.M. and al, 2003）。

ｓｉＲＮＡ代替物は、ヘアピンｓｉＲＮＡをコードするプラスミドであり、これは、ｓｈＲＮＡ戦略（短ヘアピンＲＮＡ）と称される。細胞において、ヘアピンＲＮＡが作られ、ＤＩＣＥＲタンパク質と相互作用し、ＲＩＳＣ複合体に組み込まれるであろう機能的ｓｉＲＮＡを生じさせ、古典的なｓｉＲＮＡのように作用する（Wacheck V. and Zangemeister-Wittke U., 2006）。このようなプラスミドを用いたトランスフェクションは、ｓｈＲＮＡ及び内在性ｓｉＲＮＡ分子の大量のコピーを可能にする（McCaffrey A. P. and al, 2002）。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、転写後のレベルで遺伝子発現をコントロールする、２１個〜２５個のヌクレオチドの非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、１２５個のヌクレオチドのｍｉＲＮＡ前駆体において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩから合成される。ｍｉＲＮＡ前駆体は、酵素Ｄｒｏｓｈａによって核において切断され、不完全二本鎖ヘアピンＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡに基づいたヘアピンＲＮＡ）と称される前駆体を生じさせる。これらの不完全二本鎖ヘアピンＲＮＡは、エクスポーチン５タンパク質によって核から細胞質にエクスポートされ、ここで、それは、酵素ＤＩＣＥＲによって切断され、成熟ｍｉＲＮＡを生じさせる。ｍｉＲＮＡは、相同的な一本鎖ターゲットｍＲＮＡとの全体的又は部分的アニーリングを可能にするＲＩＳＣ複合体と結合する。ｍＲＮＡとの部分的アニーリングはタンパク質翻訳の抑制をもたらすが、全体的アニーリングは、一本鎖ｍＲＮＡの切断をもたらす（Dykxhoorn D.M. and al, 2003 for review）。

「アンチセンス鎖」は、ｓｉＲＮＡ分子のセンス領域に対する相補性を有するｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、ターゲット核酸配列と相同性を有する核酸配列を含む。

「センス鎖」は、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域に対する相補性を有するｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。

「モデュレート」及び「モデュレーション」は、遺伝子の発現、又は、１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子若しくは同等のＲＮＡ分子のレベル、又は、１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、アップレギュレーション又はダウンレギュレーションされることを意味し、それにより発現、レベル又は活性がモデュレーターの非存在下において観察されるものよりも大きく又は小さくなる。本発明の範囲内において、モデュレーションの好ましい形態は阻害であるが、「モデュレート」という語の使用はこの定義に限定されない。

「阻害」、「サイレンス」又は「ダウンレギュレーション」は、発現産物のレベル又は１つ以上の遺伝子産物をコードするＲＮＡ若しくは同等のＲＮＡのレベルが、本発明の核酸分子の非存在下において観察されるもの以下に減少することを意味する。一実施形態では、ＲＮＡ干渉を介在できる核酸分子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を用いた阻害は、好ましくは、ＲＮＡｉ応答を介在できない不活性又は弱力化分子の存在下において観察されるレベルを下回る。

「ターゲットタンパク質」は、その発現又は活性がモデュレーションされるべき任意のタンパク質を意味する。

「ターゲット核酸」又は「ターゲット遺伝子」は、その発現又は活性がモデュレーションされるべき任意の核酸配列を意味する。ターゲット核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。

遺伝子発現をモデュレーションできる核酸は、上記で定義された「低分子干渉核酸」（ｓｉＮＡ）、「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」、「ｍｉＲＮＡ」、「マイクロＲＮＡ」及び「短ヘアピンＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）を含むが、これらに限定されない。

２．アンチセンス戦略。
ａ．古典的なアンチセンス戦略。
アンチセンス戦略は、オリゴヌクレオチド化学的改変に基づく特別かつ合理的な戦術であり、その目的は、ターゲットＲＮＡ配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯＮ）を用いて、遺伝子発現を特異的に阻害し、タンパク質発現の阻害をもたらすことである。ＡＳＯＮは、１９７８年から、疾患に関連する遺伝子を特異的にサイレンシングできる新たなクラスの薬物として考えられている（Gallo M. and al, 2003, Chan J.H. and al, 2006）。

ＡＳＯＮは、１３個〜２５個、好ましくは１５個〜２１個の塩基の一本鎖デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチド（ＲＮＡ）である。ＡＳＯＮのターゲットｍＲＮＡ上でのハイブリダイゼーションは、立体遮断による翻訳停止、細胞内ＲＮａｓｅ Ｈ（これの役割は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を切断することである）の動員によるその破壊、又は、ｍＲＮＡ前駆体の不安定化（これは、スプライシング阻害をもたらす）をもたらす（Kurreck J.,2003 ; Chan J.H. and al, 2006）。

ｂ．アンチセンスオリゴヌクレオチドの新たな用途。
いくつかの最近の用途において、ＡＳＯＮは、遺伝子発現を阻害するのに使用されず、反対に、正常なタンパク質合成を修復するのに使用されている。選択的スプライシング校正及びエクソンスキッピングモデルにおいて、選択的スプライシングは、異常である。一般的には、イントロン（スプライシング校正）又はエクソン（エクソンスキッピング）ローカスに位置する異常変異は、スプライシング異常の起源であり、病徴の原因となる非機能的タンパク質をもたらす（Kang S.H. and al, 1998 ; Sazani P. and Kole R., 2003）。

ＡＳＯＮは、配列依存的方法で、変異ローカスにおいて特異的にハイブリダイゼーションし、変異を隠し、機能的タンパク質の発現を伴う正常な選択的スプライシングへと機構を修復できる。

これらの用途は、いくつかのガン、神経疾患（例えば、ハンチントン病）、加齢性黄斑疾患及び遺伝性疾患（例えば、βサラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ハッチンソン・ギルフォード早老症症候群（ＨＧＰＳ）又はＣＦＴＲ変異の嚢胞性線維症（ＣＦ）（Mercatante D.R. and al, 2001 ; Srebrow A and Kornblihtt A.R.. 2006 ; Brinkman B.M.,. 2004, and Venables J.P., 2006)）の処置に大きな関心を有する。

ｃ．アンチセンスオリゴヌクレオチドの化学的改変及び新たな作製。
ＲＮａｓｅ Ｈが、ＡＳＯＮのＲＮＡ鎖上でのハイブリダイゼーション中に核酸の二本鎖を分解できないように、化学的ＡＳＯＮ構造を改変する努力が報われた：リボースレベル（２’−フルオロ、２’−メチル、２’−メトキシ）、塩基レベル及び骨格レベル（リン酸ジエステル、ホスホロチオネート（phosphorithioate））における構造的改変。

ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の活性化因子ではなく、第二（２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル又はＭＯＥ）及び第三（ロック核酸又はＬＮＡ、ペプチド核酸又はＰＮＡ、ホスホアミデートモルホリノ又はＰＭＯ）世代の化学的改変構造を有するＡＳＯＮが好ましい（Altmann K.H. and al, 1996, Egholm M. and al, 1993 ; Singh S.K. and al, 1998, Summerton J. and Weller D., 1997）。

ギャップマーは、ホスホロチオネートＤＮＡ（５個〜１２個のヌクレオチド）の短いストレッチ（short strech）を有する化学的アンチセンスオリゴマー（ＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドの混合物）である。それらは、ターゲットＲＮＡ及びｍＲＮＡ分解のＲＮＡｓｅ Ｈ介在性切断を得るのに使用されている。高いＡＳＯ潜在性に加えて、それらは、ターゲット近接性及びヌクレアーゼ抵抗性を向上する（Kurreck J., 2003）。

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、ｍＲＮＡ（細胞質中の）又はｍＲＮＡ前駆体（細胞核中の）と特異的ハイブリダイゼーションできる一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。

アンチセンス機構を介在できる核酸は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、非改変オリゴヌクレオチド及び化学的に改変されたオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。

３．アプタマー。
アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は化学的に改変されたヌクレオチド（２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル又はホスホロチオネート）からなる２０個〜８０個のヌクレオチド核酸である（Chan J.H. and al, 2006）。アプタマーは、それらの３Ｄ構造のおかげで、ファンデルワールス結合、水素結合及び静電的結合を介して、高い親和性で様々な分子及びタンパク質に結合できる（Pendergrast P.S. and al, 2005）。

アプタマーの最も興味深い用途は、タンパク質活性を阻害することによる遺伝子発現のレギュレーションのように思われる。

高親和性アプタマーは、１９９０年に開発されたＳＥＬＥＸ技術（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）によって得られ得る。オリゴヌクレオチド（１０^１３〜１０^１５個の異なる配列）のプールがターゲットと混合され、ターゲットに結合したものだけが選択される。次いで、これらのアプタマーは、増幅され、以下のサイクルにおいて使用される。５回〜１５回の増幅ステップの後に、高親和性アプタマーは得られる（Rimmelle M., 2003; Chauveau F. and al, 2006）。この技術は、今や自動化されている。

アプタマーは、免疫原性がないため、自己免疫疾患の治療用途の良い候補であるのように思われる（White R.R. and al, 2000 ; Kim Y.M. and al, 2003 ; Drolet D.W. and al, 2000 and Rhodes A. and al, 2000）。

本発明による逆ミセル系に取り込まれたこのような薬剤は、粘膜上皮バリアを通過し、それによって、ターゲット部位においてその治療効果を示すことができる。

遺伝子発現をモデュレーションできる核酸は、逆ミセルの水性コアに存在する。

治療剤の安定性及び活性は、混合物中の水濃度によって、実質的にコントロールされ得る。

逆ミセル系に取り込まれた遺伝子発現をモデュレーションできる核酸の量は、親水性相（水性コア）におけるそれらの溶解度によって決定される。好ましくは、逆ミセル系に含まれる治療剤の量は、遺伝子発現をモデュレーションできる核酸の大きさに依存する。

本発明において、マイクロエマルションにおける核酸の重量濃度は、より具体的には、マイクロエマルションの０．９４＋／−０．０３の密度を用いて計算される。

密度は、一般的には、室温及び大気圧下で測定される。

逆ミセル系及びその使用
本発明の逆ミセルは、そこに含まれる核酸が投与され、特に、その安定性に影響を与えることなく、高度の保護を有する細胞に輸送されることを可能にする。

今日では、逆ミセル系は、マイクロ反応器として働くナノ材料の調製に使用され得ることが公知である。生体分子の活性及び安定性は、主に、逆ミセル系における水の濃度によってコントロールされ得る。

本発明の目的は、上に定義した逆ミセル及び少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は支持体を含む、医薬組成物に関する。

具体的な実施態様によれば、本発明による医薬組成物は、１００ｇの組成物に対して５〜２０ｇのリン脂質又はスフィンゴ脂質、及び、１００mlの組成物に対して５〜１５ｇの水を含む。

具体的な実施形態によれば、医薬組成物は、カプセル剤、カプレット剤、スプレー剤、溶液剤又は軟弾性ゼラチンカプセル剤の形態である。本発明のさらなる目的は、１つ以上の核酸の送達、より具体的には、経粘膜送達を目的とする医薬組成物を調製するための、上で定義された逆ミセルの使用に関する。医薬組成物は、より具体的には、遺伝性疾患、ガン、神経変性疾患、伝染性疾患及び／若しくは炎症性疾患、又は細胞増殖による疾患若しくは障害の症状を予防、処置及び／又は改善することを目的としている。

本発明の別の目的は、１つ以上の核酸を哺乳動物（特に、ヒト）に送達するための方法であって、上で定義された逆ミセル組成物をその哺乳動物に投与することを含む方法に関する。具体的な実施態様では、本発明は、１つ以上の核酸を経粘膜送達するための方法であって、上で定義された逆ミセル組成物を前記哺乳動物（特に、ヒト）に粘膜投与することを含む方法を提供する。

本発明は、遺伝性疾患、ガン、神経変性疾患、伝染性疾患及び／若しくは炎症性疾患、又は細胞増殖による疾患若しくは障害の症状の予防、処置及び／又は改善の方法であって、上で定義されかつ遺伝性疾患、ガン、神経変性疾患、伝染性疾患及び／若しくは炎症性疾患、又は細胞増殖による疾患の症状の予防、処置又は改善において有用な１つ以上の核酸を含む逆ミセル組成物の有効量を、それを必要とする前記ヒトに投与することを含む方法を提供する。具体的な実施態様では、本発明は、疾患又は障害に伴う１つ以上の症状の予防、処置、又は改善のための方法であって、上で定義されかつ前記疾患又は障害に伴う１つ以上の症状の予防、処置、又は改善において有用な１つ以上の核酸を含む逆ミセル組成物の有効量を、それを必要とする被験体に粘膜投与することを含む方法を提供する。

薬学的に許容しうる賦形剤、ビヒクル又は担体として、当業者に周知の任意の賦形剤、ビヒクル又は担体が使用され得る。当業者に周知の他の添加剤、例えば、安定剤、乾燥剤、結合剤又はｐＨ緩衝剤も使用され得る。本発明による好ましい賦形剤は、最終製造物の粘膜への付着を促進する。

本発明は、少なくとも１つの核酸の哺乳動物への送達のための上記医薬組成物の使用であって、前記送達が当該医薬組成物の粘膜投与を含む、使用にさらに関する。

具体的な実施形態では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの核酸の送達、より具体的には粘膜送達に使用される。

本発明に従って製剤化された逆ミセル系中の核酸は、好ましくは、血液脳関門を通過できる。従って、それらは、中枢神経系（ＣＮＳ）障害、特に遺伝性疾患、腫瘍性疾患、ウイルス性疾患及び／又はＣＮＳにおける変性疾患の処置において有用であり得る。

本発明の組成物は、様々な方法で、特に、粘膜組織吸収を介して、特に、舌下、鼻、膣又は消化吸収により、投与され得る。

「被験体」は、本発明の核酸が投与され得る生物を意味する。被験体は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物であり得る。好ましい被験体は、ヒト被験体である。

本明細書において使用される「粘膜」及び「粘膜の」という用語は、例えば、呼吸器官、消化組織又は生殖組織の粘膜組織を意味する。本明細書において使用される「経粘膜送達」、「経粘膜投与」及び類似の用語は、粘膜組織を通して組成物を投与することを意味する。「経粘膜送達」、「経粘膜投与」及び類似の用語は、気管支、歯肉、舌、鼻、口、膣、直腸、及び胃腸の粘膜組織を通して組成物を送達することを含むが、これらに限定されない。

本発明の好ましい実施態様では、本発明の逆ミセル組成物は、カプセル剤、カプレット剤、エアゾール剤、スプレー剤、溶液剤又は軟弾性ゼラチンカプセル剤として、粘膜投与される。本発明の組成物は、例えば、その内容物を口の中又は任意の粘膜組織上で放出するカプセル剤中に液体の形態で導入され得る。好ましくは、本発明の逆ミセル組成物は、疾患又は障害（例えば、遺伝性疾患、ガン、神経変性疾患、伝染性疾患及び炎症性疾患又は細胞増殖による疾患）を処置するために、哺乳動物、より好ましくはヒトに投与される。

以下の実施例は、本発明の操作を例示することを意図するものであるが、その範囲を限定することを意図するものではない。

逆ミセルの回折曲線（図１ａ）及び大きさ（図１ｂ）に対する、レシチン非存在下において取り込まれた水の割合の影響の評価。 逆ミセルの回折曲線（図１ａ）及び大きさ（図１ｂ）に対する、レシチン非存在下において取り込まれた水の割合の影響の評価。 逆ミセルの回折曲線（図２ａ）及び大きさ（図２ｂ）に対する、レシチン存在下において取り込まれた水の割合の影響の評価。 逆ミセルの回折曲線（図２ａ）及び大きさ（図２ｂ）に対する、レシチン存在下において取り込まれた水の割合の影響の評価。 逆ミセルの回折曲線に対する、取り込まれたＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ含有量の影響の評価。 ネイキッドＡｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡ（図４ａ）及び逆ミセル中に製剤化されたＡｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡ（図４ｂ）のｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布。 ネイキッドＡｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡ（図４ａ）及び逆ミセル中に製剤化されたＡｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡ（図４ｂ）のｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布。 肝臓ＧＡＰＤＨ遺伝子阻害のｉｎ ｖｉｖｏ評価。 筋肉ＭＡＦＢｘ遺伝子阻害のｉｎ ｖｉｖｏ評価。 肝臓ＰＣＳＫ９タンパク質阻害のｉｎ ｖｉｖｏ評価。 脳ＰｒＰ（Ｃ）タンパク質阻害のｉｎ ｖｉｖｏ評価。

実施例
実施例１：レシチン非存在下における逆ミセルの形成及び大きさに対する、水取り込みの影響の評価
本研究の目的は、Ｘ線回折法及び視覚測定によって、熱力学的に安定なマイクロエマルションの形成及びその中で分散された逆ミセルの大きさに対する、含水量の影響を評価することであった。

以下の手順に従って、異なるパーセンテージの水を有する逆ミセルの製剤１０個を調製した。

３７℃、３００r/分で１５分間磁気撹拌することによって、０．７ｇの植物ステロールを１．４ｇの無水エタノール中に溶解させた。グリセロールモノオレエートをそれに添加し、磁気撹拌を３７℃、５００r/分で４５分間実施した。精製水をこの油性混合物に添加し、３７℃、３００〜５００r/分で６０分間撹拌して、「空の」逆ミセルを形成させた。

異なる製剤を以下の表に要約する。

１％の増分で水の量を１％から１０％に増加させることによって、「空の」逆ミセルを調製した（水のパーセンテージは、水の重量／組成物の総体積、０．９４の密度によって表される）。これらの製造物すべてに関して、無水エタノール（５％）及び植物ステロール（２．５％）のパーセンテージ（重量／組成物の総重量）は、変化していなかった。

それらの透明性の視覚測定によって、熱力学的に安定なマイクロエマルションの形成を評価した。

格子定数は、Ｘ線回折によって得られ、それらは、本発明の逆ミセルの大きに対応していると考えられる。直径１．５mmのガラス毛管中にサンプルを導入し、送信設定を使用した。高フラックス（１０^８光子／秒間）及び定時的視準を与える多層集束「オスミウム」モノクロメーターを備えるカップ状の回転陽極Ｘ線源（４ｋＷで機能する）を使用した。「イメージプレート」２Ｄ検出器を使用した。波数ベクトルｑの関数として、回折強度を与える回折曲線を得た。空の毛管による拡散から来る曝露時間、送信及び強度バックグラウンドによって、回折強度を修正した。式：ｄ＝２π／□ｑｍａｘ（ｑｍａｘは、最大回折強度に対応する波数ベクトルである）を用いて、逆ミセルの大きさを計算した。

上記手順に従って調製した１０個のサンプルの回折曲線を図１ａに示すが、これは、水のパーセンテージが増加する場合に、取り込まれた水が１％〜６％の間で、ｑｍａｘ値が減少することを明確に実証している。図１ｂは、水のパーセンテージが増加する場合に、取り込まれた水が１％〜６％の間で、逆ミセルの大きさが３．１から３．７nmに増加することを示している。対照的に、取り込まれた水が７％から、逆ミセルの大きさは、増加が止まる。

さらに、視覚分析は、取り込まれた水が１〜５％まで、製造物が透明であることを示している。水が６％から、製造物は、ますます不透明になる。

これらの結果は、レシチンの非存在下で形成した製剤が、ある量の水（６％）を超えると、不安定であることを明確に示している。それらは、レシチンなしで製剤化したミセルが、製剤中の水の量を増加させたとしても、所定の大きさを上回ることができないことをさらに示している。

実施例２：レシチン存在下における逆ミセルの形成及び大きさに対する、水取り込みの影響の評価
本研究の目的は、Ｘ線回折法及び視覚測定によって、レシチンの増加割合の存在下における熱力学的に安定なマイクロエマルションの形成及びその中で分散された逆ミセルの大きさに対する、含水量の影響を評価することであった。

以下の手順に従って、異なるパーセンテージの水及びレシチンを有する逆ミセルの製剤３個を調製した。

室温、３００r/分で１０分間磁気撹拌することによって、市販のレシチンを８．５ｇの無水エタノール中に溶解させた。２．３ｇの植物ステロールを混合物に添加し、同じ条件で撹拌した。グリセロールモノオレエートをそれに添加し、磁気撹拌を３７℃、５００r/分で４５分間実施して、油性混合物を形成させた。精製水を油性混合物に添加し、３００〜５００r/分で３０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、「空の」逆ミセルを形成させた。

異なる製剤を以下の表に要約する。

水の量を４％（サンプル１１）から１２％（サンプル１３）に変化させ、レシチンの量を０％（サンプル１１）から１５％（サンプル１３）に変化させることによって、「空の」逆ミセルを調製した。レシチン含有量は、レシチンの重量／組成物の総重量から計算され、含水量は、水の重量／組成物の総体積（０．９４の密度）から計算される。これらのサンプルすべてに関して、植物ステロールのパーセンテージは、２．５％（植物ステロールの重量／組成物の総重量）であり、無水エタノールのパーセンテージは、９％（無水エタノールの重量／組成物の総重量）であった。

それらの透明性の視覚測定によって、熱力学的に安定なマイクロエマルションの形成を評価した。

実施例１に記載されるように、Ｘ線回折実験によって、これらの製剤の逆ミセルの大きさを評価した。

サンプル１１、１２及び１３の回折曲線を図２ａに示すが、これは、レシチンのパーセンテージが０から１５％に増加する場合に、回折強度が増加し、ｑｍａｘ値が減少することを明確に実証している。図２ｂは、レシチンのパーセンテージが０から１５％に増加する場合に、逆ミセルの大きさが、３．１から４．５nmに増加することを実証している。視覚分析は、これらの製剤が透明であることを示している。

従って、これらの実験は、１５％のレシチンの添加が、４．５nmの逆ミセルの大きさ及び高パーセンテージの水（１２％）を有する熱力学的に安定なマイクロエマルションの形成を可能にすることを示している。従って、レシチンの添加は、実施例１に記載されるレシチンの非存在下で製剤化された逆ミセルの欠点を解決する。

実施例３：逆ミセルの形成及び大きさに対する、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ取り込みの影響の評価
本研究の目的は、Ｘ線回折法及び視覚測定によって、レシチンの存在下における熱力学的に安定なマイクロエマルションの形成及びその中で分散された逆ミセルの大きさに対する、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ含有量の影響を評価することであった。

ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡは、２１個のヌクレオチドを含む二本鎖ｓｉＲＮＡであり、ＧＡＰＤＨ遺伝子の遺伝子サイレンシングを可能にするように設計されている。

以下の手順に従って、異なる濃度のＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを有する逆ミセルの製剤４個を調製した。

ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ溶液を、サンプル１３に従って調製した油性混合物に添加し、３００〜５００r/分で３０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを含む逆ミセルを形成させた。

異なる製剤を以下の表に要約する：

ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡの濃度を０（サンプル１３）から９５０μg/ml（サンプルＤ）に増加させることによって、逆ミセルを調製した。これらのサンプルすべてに関して、植物ステロールのパーセンテージは、２．５％（植物ステロールの重量／組成物の総重量）であり、無水エタノールのパーセンテージは、９％（無水エタノールの重量／組成物の総重量）であり、水のパーセンテージは、１２％（水の重量／組成物の総体積、０．９４の密度）であり、レシチンのパーセンテージは、１５％（レシチンの重量／組成物の総重量）であった。

それらの透明性の視覚測定によって、熱力学的に安定なマイクロエマルションの形成を評価した。

実施例１に記載されるように、Ｘ線回折実験によって、これらの製剤の逆ミセルの大きさを評価した。

図３は、サンプル１３、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの回折曲線を示す。ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ濃度の増加にもかかわらず、ｑｍａｘ値は、すべてのサンプルに関して同じである。これらのサンプルすべてに関して、逆ミセルの大きさは、４．５nmと計算される。視覚分析は、これらの製剤が透明であることを示している。

これらの実験は、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡの添加が、熱力学的に安定なマイクロエマルションの形成を妨げず、その中で分散された逆ミセルの大きさを変化させないことを示している。

実施例４：逆ミセル中に製剤化された蛍光Ａｌｅｘａ７００−サイクリンＢ１（ＣｌＢ１）ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布の評価
本研究の目的は、直腸経路によって送達した場合の、以下の手順（サンプルＥ）に従って逆ミセル中に製剤化したＡｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡの生体内分布を、静脈内経路によって送達した溶液中の同じ投与量の非製剤化前記ｓｉＲＮＡと比較して、動物イメージング技術によって評価することであった。

Ａｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡは、２１個のヌクレオチドを含む二本鎖ｓｉＲＮＡであり、蛍光を発するように設計されている。

サンプルＥ：室温、３００r/分で１０分間磁気撹拌することによって、１４．１ｇのレシチンを８．５ｇの無水エタノール中に溶解させた。２．３ｇの植物ステロールを混合物に添加し、同じ条件で撹拌した。５７．０ｇのグリセロールモノオレエートをそれに添加し、磁気撹拌を３７℃、５００r/分で４５分間実施した。１００μgのＡｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡを含む４８mgのｓｉＲＮＡ溶液を、３２８．７mgの油性混合物に添加し、７００r/分で４５分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、２５０μgＡｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡ/ml（０．９４の密度）を含む逆ミセルを形成させた。

投与された製造物：
−サンプルＥ：２５０μgＡｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡ/mlの上記手順に従って調製した逆ミセルを、２ml/kgで、直腸経路によって送達した

−非製剤化Ａｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡ：５０μgＡｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡ/mlのネイキッドｓｉＲＮＡ溶液を、１０ml/kgで、静脈内経路によって送達した

非製剤化ネイキッドＡｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡ又は前記ｓｉＲＮＡで製剤化した逆ミセルを、５００μg/kg（１０μg）で、麻酔をかけたヌードマウスに１回投与した。ネイキッドＡｌｅｘａ７００−ＣｌＢ１ ｓｉＲＮＡ溶液を、尾静脈に静脈内投与し、逆ミセル製剤化ｓｉＲＮＡを、ピペットを用いて、肛門括約筋のすぐ後ろの下部直腸にゆっくり投与した。

マウスを６６０nmでカメラの下に置き、０、１５分間、１時間、２時間、４時間、５時間及び２４時間の時点において側面及び腹部の写真を撮影して、蛍光強度生体内分布を可視化した。

結果を図４ａ及び４ｂに示す。図４ａは、静脈内注射後のネイキッドｓｉＲＮＡの急速な吸収を実証している。最大蛍光強度は、投与後１５分間に観察され、急速に減少している。

対照的に、図４ｂは、逆ミセル中に製剤化し、直腸経路によって投与したｓｉＲＮＡが、約４時間の時点において蛍光ピークを伴って動物の体全体に広く分布し、非常にゆっくり消失していることを示している。

上記実験は、逆ミセル中に製剤化したｓｉＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏ送達され得ること、並びに、逆ミセル製剤がｓｉＲＮＡの保護及び寿命を非常に増加させることを実証している。

実施例５：逆ミセル製剤中に製剤化されたＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡの、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現を阻害するｉｎ ｖｉｖｏ有効性の評価
本研究の目的は、直腸経路によってＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに送達した場合の、以下の手順（サンプルＦ及びＧ）に従って調製した逆ミセル中に製剤化したＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡの、肝臓ＧＡＰＤＨ遺伝子サイレンシング有効性を評価することであった。

ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡは、２１個のヌクレオチドを含む二本鎖ｓｉＲＮＡであり、ＧＡＰＤＨ遺伝子の遺伝子サイレンシングを可能にするように設計されている。

サンプルＦ：室温、３００r/分で１５分間磁気撹拌することによって、２．３ｇのコレステロールを８．５ｇの無水エタノール中に溶解させた。７９．２ｇのグリセロールモノオレエートをそれに添加し、磁気撹拌を３７℃、５００r/分で４５分間実施して、油性混合物を形成させた。３０１μgのＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを含む４０．０mgのｓｉＲＮＡ溶液を、９０４．０mgの油性混合物に添加し、３００〜５００r/分で３０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、３００μgＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ/ml（０．９４の密度）を含む逆ミセルを形成させた。

サンプルＧ：室温、３００r/分で１０分間磁気撹拌することによって、６．６ｇのレシチンを８．５ｇの無水エタノール中に溶解させた。２．３ｇのコレステロールを混合物に添加し、同じ条件で撹拌した。６７．７ｇのグリセロールモノオレエートをそれに添加し、磁気撹拌を３７℃、５００r/分で４５分間実施した。２８６μgのＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを含む４５．２mgのｓｉＲＮＡ溶液を、８５２．７mgの油性混合物に添加し、３００〜５００r/分で３０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、３００μgＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ/ml（０．９４の密度）を含む逆ミセルを形成させた。

サンプル１４：４０．５mgの精製水を、サンプルＦに従って調製した油性混合物９００．６mgに添加し、３００〜５００r/分で３０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、「空の」逆ミセルを形成させた。

投与された製造物：
−サンプルＦ：３００μgＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ/mlの上記手順に従って調製した逆ミセルを、１ml/kgで、直腸経路によって３日間送達した

−サンプルＧ：３００μgＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ/mlの上記手順に従って調製した逆ミセルを、１ml/kgで、直腸経路によって３日間送達した

−サンプル１４：上記手順に従って調製した「空の」逆ミセルを、１ml/kgで、直腸経路によって３日間送達した

以下の表に記載されるように、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを含む逆ミセルの製剤の両方を、６００μg/kg（３００μg/kgを１日に２回）で、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（グループ２及び３、１グループあたり３匹のマウス）に３日間送達した。これらの製造物を、ピペットを用いて、肛門括約筋のすぐ後ろの下部直腸にゆっくり送達した。未処置マウス又は「空の」逆ミセルで処置したマウスを、コントロールとして使用した（グループ１及び４）（サンプル１４）。

最後の投与後２４時間に、マウスを屠殺した。次いで、肝臓を回収し、凍結した。TRIzol（登録商標）／クロロホルム法によって総ＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ−ＰＣＲによって、標準遺伝子（ユビキチン）と比較してＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現を評価した。

結果を図５に示すが、これは、コレステロールを含む逆ミセル中に製剤化したＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（サンプルＦ）の、肝臓ＧＡＰＤＨ遺伝子発現を減少させるｉｎ ｖｉｖｏ有効性を実証している。サンプルＧにおけるレシチンの添加は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現を減少させる同様の有効性を示している。対照的に、「空の」逆ミセル（サンプル１４）は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現を減少させるのに効果がない。従って、このような量の核酸の送達に関して、本発明による逆ミセルは、レシチンを含まないものと同じくらい有効である。さらに、それらは、レシチンを含まない逆ミセルよりも、多量の核酸の送達を可能にする。

実施例６：逆ミセル中に製剤化されたユビキチンリガーゼアトロジン１／筋萎縮Ｆ−ｂｏｘ配列（ＭＡＦｂｘ） ｓｉＲＮＡの、ＭＡＦｂｘ遺伝子発現を阻害するｉｎ ｖｉｖｏ有効性の評価
本研究の目的は、ＭＡＦｂｘ過剰発現の誘導マウスモデルにおいて、以下の手順（サンプルＨ及びＩ）による逆ミセル中に製剤化したＭＡＦｂｘ ｓｉ１又はｓｉ２ ｓｉＲＮＡの、直腸経路によって送達した場合のＭＡＦｂｘ遺伝子サイレンシング有効性を、静脈内送達した同じ投与量の非製剤化ＭＡＦｂｘ ｓｉ１ ｓｉＲＮＡと比較して、評価することであった。

ＭＡＦｂｘ ｓｉ１及びｓｉ２ ｓｉＲＮＡは、それぞれ１９個及び２１個のヌクレオチドを含む二本鎖ｓｉＲＮＡであり、ＭＡＦｂｘ遺伝子の遺伝子サイレンシングを可能にするように設計されている。

サンプルＨ：室温、３００r/分で１０分間磁気撹拌することによって、１４．１ｇのレシチンを８．５ｇの無水エタノール中に溶解させた。２．３ｇの植物ステロールを混合物に添加し、同じ条件で撹拌した。５７．０ｇのグリセロールモノオレエートをそれに添加し、磁気撹拌を３７℃、５００r/分で４５分間実施した。３０３μgのＭＡＦｂｘ ｓ１ ｓｉＲＮＡを含む１１７．３mgのｓｉＲＮＡ溶液を、８３３．８mgの油性混合物に添加し、３００〜５００r/分で３０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、３００μgＭＡＦｂｘ ｓｉ１ ｓｉＲＮＡ/ml（０．９４の密度）を含む逆ミセルを形成させた。

サンプルＩ：室温、３００r/分で１５分間磁気撹拌することによって、２．３ｇの植物ステロールを８．５ｇの無水エタノール中に溶解させた。７９．２ｇのグリセロールモノオレエートをそれに添加し、磁気撹拌を３７℃、５００r/分で４５分間実施して、油性混合物を形成させた。３０２μgのＭＡＦｂｘ ｓｉ２ ｓｉＲＮＡを含む３９．５mgのｓｉＲＮＡ溶液を、９０５．４mgの油性混合物に添加し、３００〜５００r/分で３０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、３００μgＭＡＦｂｘ ｓｉ２ ｓｉＲＮＡ/ml（０．９４の密度）を含む逆ミセルを形成させた。

投与された製造物：
−サンプルＨ：３００μgＭＡＦｂｘ ｓｉ１ ｓｉＲＮＡ/mlの上記手順に従って調製した逆ミセルを、１ml/kgで、直腸経路によって１日目及び２日目に送達した

−サンプルＩ：３００μgＭＡＦｂｘ ｓｉ２ ｓｉＲＮＡ/mlの上記手順に従って調製した逆ミセルを、１ml/kgで、直腸経路によって１日目及び２日目に送達した

−非製剤化ＭＡＦｂｘ ｓｉ１ ｓｉＲＮＡ：３００μg/mlのネイキッドｓｉＲＮＡ溶液を、１ml/kgで、静脈内経路によって１日目に送達し、１５０μg/mlを、１ml/kgで、２日目に送達した。

以下の表に記載されるように、Ｂ６ＣＢＡ Ｆ１マウスを処置した。ＭＡＦｂｘ ｓｉ１又は２ ｓｉＲＮＡで製剤化した逆ミセル（サンプルＨ及びＩ）を、３００μg/kgで、直腸経路によって、１日１回、２日間送達した。これらの製造物を、ピペットを用いて、肛門括約筋のすぐ後ろの下部直腸にゆっくり送達した。この処置の後に、骨格筋萎縮症及びＭＡＦｂｘの過剰発現を誘導するために、２日間の食物飢餓を行った（グループ５及び７、１グループあたり８匹のマウス）。同じ処置（サンプルＨ及びＩ）を施したが、飢えていないマウスを、コントロールとして使用した（グループ４及び６、１グループあたり４匹のマウス）。別のグループのマウス８匹（グループ３）を、１日目に、尾静脈における静脈内経路によって、３００μg/kgで、非製剤化ネイキッドＭＡＦｂｘ ｓｉ１ ｓｉＲＮＡで処置し、２日目に、１５０μg/kgで処置し、その後に、２日間の食物飢餓を行った。食物飢餓を行った又は行わなかった未処置マウスを、コントロールとして使用した（グループ１及び２、１グループあたり８匹のマウス）。

５日目にすべてのマウスを屠殺し、前脛骨（ＴＡ）筋を回収し、凍結した。TRIzol（登録商標）／クロロホルム法によって総ＲＮＡを抽出し、mini Opticon Real Time PCR system（Biorad）を使用する定量ＲＴ−ＰＣＲによって、標準リボソーム遺伝子（ＲＰＳ９）と比較して、ＭＡＦｂｘ ｍＲＮＡ発現を評価した。

定量ＰＣＲの結果を図６に示すが、これは、ＭＡＦｂｘ ｓｉＲＮＡで製剤化した逆ミセルの、ＭＡＦｂｘ遺伝子過剰発現を減少させる有効性を明確に実証している。未処置動物と比較して、ＭＡＦｂｘ ｍＲＮＡレベルにおける約９０％の減少が、サンプルＨ及びＩで処置した動物において観察されている。従って、このような量の核酸の送達に関して、本発明による逆ミセルは、レシチンを含まないものと同じくらい有効である。さらに、それらは、レシチンを含まない逆ミセルよりも、多量の核酸の送達を可能にする。

実施例７：逆ミセル中に製剤化された、前駆タンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）をターゲティングするｓｉＲＮＡの、ＰＣＳＫ９タンパク質発現を阻害するｉｎ ｖｉｖｏ有効性の評価
本研究の目的は、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおいて、以下の手順（サンプルＪ）による逆ミセル中に製剤化したＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの、直腸経路によって送達した場合のＰＣＳＫ９タンパク質発現を減少させる有効性を、静脈内送達した同じ投与量の非製剤化ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡと比較して、評価することであった。

ＰＣＳＫ−９ ｓｉＲＮＡは、２１個のヌクレオチドを含む二本鎖ｓｉＲＮＡであり、ＰＣＳＫ９タンパク質発現の阻害を可能にするように設計されている。

サンプルＪ：室温、３００r/分で１０分間磁気撹拌することによって、１４．３ｇのレシチンを８．６ｇの無水エタノール中に溶解させた。２．４ｇの植物ステロールを混合物に添加し、同じ条件で撹拌した。５７．８ｇのグリセロールモノオレエートをそれに添加し、磁気撹拌を３７℃、５００r/分で６０分間実施した。５７９７μgのＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡを含む６９４．８mgのｓｉＲＮＡ溶液を、４８１９．４mgの油性混合物に添加し、３００〜５００r/分で３０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、１０００μgＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ/ml（０．９５の密度）を含む逆ミセルを形成させた。

サンプル１５：２．４ｇの精製水を、サンプルＪに従って調製した油性混合物１６．６ｇに添加し、３００〜５００r/分で３０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、「空の」逆ミセルを形成させた。

投与された製造物：
−サンプルＪ：１０００μgＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ/mlの上記手順に従って調製した逆ミセルを、１ml/kgで、直腸経路によって１０日間送達した

−サンプル１５：「空の」逆ミセルを、１ml/kgで、直腸経路によって１０日間送達した

−非製剤化ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ：１０００μgＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ/mlのネイキッドｓｉＲＮＡ溶液を、１ml/kgで、静脈内経路によって１０日間送達した

−緩衝食塩水を、１ml/kgで、静脈内経路によって１０日間送達した

以下の表に記載されるように、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（１グループあたり７又は８匹のマウス）を処置した。１０００μg/kgで送達するサンプルＪに製剤化したＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ（グループ１）、及び、コントロールとして使用する「空の」逆ミセル（サンプル１５）（グループ２）を、直腸経路によって、１日１回、１０日間投与した。これらの製造物を、ピペットを用いて、肛門括約筋のすぐ後ろの下部直腸にゆっくり送達した。非製剤化ネイキッドＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ（グループ３）又は緩衝食塩水（グループ４）で静脈内に１０日間処置した動物も、コントロールとして使用した。

１１日目に、すべてのマウスを屠殺した。肝臓を回収し、凍結した。製造業者の説明書に従って、ＥＬＩＳＡ法（R&D Systems）によって、ＰＣＳＫ９タンパク質発現を測定した。

結果を図７に示すが、これは、空の逆ミセル（サンプル１５）と比較した、ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ（サンプルＪ）で製剤化した逆ミセルによる処置の、肝臓におけるＰＣＳＫ９タンパク質発現を減少させる有効性を明確に実証している。さらに、本発明による逆ミセル中のＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの製剤は、ネイキッドＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡと比較して、肝臓におけるＰＣＳＫ９タンパク質発現を減少させる前記ｓｉＲＮＡのより良い有効性を提供する。

実施例８：逆ミセル中に製剤化された、ＰｒＰ（Ｃ）ｓｉＲＮＡの、ＰｒＰ（Ｃ）タンパク質発現を阻害するｉｎ ｖｉｖｏ有効性の評価
本研究の目的は、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの脳において、以下の手順（サンプルＫ）による逆ミセル中に製剤化した正常プリオンタンパク質ＰｒＰ（Ｃ）ｓｉＲＮＡの、直腸経路によって送達した場合のＰｒＰ（Ｃ）タンパク質発現を阻害する有効性を評価することであった。

ＰｒＰ（Ｃ）ｓｉＲＮＡは、２１個のヌクレオチドを含む二本鎖ｓｉＲＮＡであり、ＰｒＰ（Ｃ）タンパク質発現の阻害を可能にするように設計されている。

サンプルＫ：室温、３００r/分で１５分間磁気撹拌することによって、１４．１ｇのレシチンを８．５ｇの無水エタノール中に溶解させた。２．３ｇの植物ステロールを混合物に添加し、同じ条件で撹拌した。５７．１ｇのグリセロールモノオレエートをそれに添加し、磁気撹拌を３７℃、５００r/分で４５分間実施した。９３２μgのＰｒＰ（Ｃ）ｓｉＲＮＡを含む１８４．０mgのｓｉＲＮＡ溶液を、１２３３．６mgの油性混合物に添加し、３００〜５００r/分で６０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、６１８μgＰｒＰ（Ｃ）ｓｉＲＮＡ/ml（０．９４の密度）を含む逆ミセルを形成させた。

スクランブル（ＳＣ）ｓｉＲＮＡは、２１個のヌクレオチドを含む二本鎖ｓｉＲＮＡであり、ＰｒＰ（Ｃ）タンパク質発現のあらゆるモデュレーションを可能にしないように設計されている。

サンプルＬ：９３３μgのＳＣ ｓｉＲＮＡを含む１８４．２mgのｓｉＲＮＡ溶液を、サンプルＫに従って調製した油性混合物１２３３．８mgに添加し、３００〜５００r/分で６０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、６１８μgＳＣ ｓｉＲＮＡ/ml（０．９４の密度）を含む逆ミセルを形成させた。

投与された製造物：
−サンプルＫ：６１８μgＰｒＰ（Ｃ）ｓｉＲＮＡ/mlの上記手順に従って調製した逆ミセルを、１ml/kgで、直腸経路によって１２日間送達した

−サンプルＬ：６１８μgＳＣ ｓｉＲＮＡ/mlの上記手順に従って調製した逆ミセルを、１ml/kgで、直腸経路によって１２日間送達した

以下の表に記載されるように、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを処置した。逆ミセル中に製剤化したＰｒＰ（Ｃ）及びＳＣ ｓｉＲＮＡ（サンプルＫ及びＬ）を、６１８μg/kgで送達した（グループ２及び３、１グループあたり１０匹のマウス）。両製造物を、ピペットを用いて、肛門括約筋のすぐ後ろの下部直腸にゆっくりと、１日１回、１２日間（週末を除く）送達した。未処置動物も、コントロールとして使用した（グループ１、１グループあたり１０匹のマウス）。

１３日目に、すべてのマウスを屠殺した。脳を回収し、凍結した。製造業者の説明書に従って、ＥＬＩＳＡ法（SPI BIO）によって、ＰｒＰ（Ｃ）タンパク質レベルを測定した。

結果を図８に示すが、これは、逆ミセル中に製剤化したＰｒＰ（Ｃ）ｓｉＲＮＡ（サンプルＫ）の、血液脳関門を通過し、ＰｒＰ（Ｃ）の脳タンパク質発現を減少させる有効性を明確に実証している。対照的に、非特異的スクランブルｓｉＲＮＡで製剤化した逆ミセル（サンプルＬ）は、ＰｒＰ（Ｃ）の脳発現に対して効果がない。

実施例９：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた本発明による逆ミセルの形成
本研究の目的は、本発明による逆ミセル中に、化学的に改変したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯＮ）を製剤化することであった。

ＤＭＰＫ２４６７Ｕは、２０個のヌクレオチドを含むギャップマーＡＳＯＮである。

サンプルＭ：室温、３００r/分で１５分間磁気撹拌することによって、１４．３ｇのレシチンを８．６ｇの無水エタノール中に溶解させた。２．４ｇの植物ステロールを混合物に添加し、同じ条件で撹拌した。５７．８ｇのグリセロールモノオレエートをそれに添加し、磁気撹拌を３７℃、５００r/分で６０分間実施した。５９７３μgのＤＭＰＫ２４６７Ｕ ＡＳＯＮを含む７２４．６mgのＡＳＯＮ溶液を、４９８４．０mgの油性混合物に添加し、３００〜５００r/分で３０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、９９４μgＤＭＰＫ２４６７Ｕ ＡＳＯＮ/ml（０．９５の密度）を含む逆ミセルを形成させた。

ＤＭＰＫＧＤ６５は、２０個のヌクレオチドを含むギャップマーＡＳＯＮである。

サンプルＮ：５９３３μgのＤＭＰＫＧＤ６５ ＡＳＯＮを含む７１５．６mgのＡＳＯＮ溶液を、サンプルＭに従って調製した油性混合物４９８６．２mgに添加し、３００〜５００r/分で３０分間磁気撹拌することによって室温で撹拌して、９８８μgＤＭＰＫＧＤ６５ ＡＳＯＮ/ml（０．９５の密度）を含む逆ミセルを形成させた。

Claims (22)

1. 少なくとも１つの核酸、ステロール、アシルグリセロール、リン脂質又はスフィンゴ脂質、アルコール及び水を含む、逆ミセル系であって、重量比リン脂質又はスフィンゴ脂質／アシルグリセロールが０．０５〜０．４０である、逆ミセル系。
2. ミセルが３〜５nmの水性コアを示す、請求項１記載の逆ミセル系。
3. ミセルが３．５〜５nmの水性コアを示す、請求項２記載の逆ミセル系。
4. ミセルが３．７〜４．５nmの水性コアを示す、請求項３記載の逆ミセル系。
5. ミセルが４nmの水性コアを示す、請求項４記載の逆ミセル系。
6. 重量比ステロール／アシルグリセロールが、０．０１５〜０．０５の範囲である、請求項１〜５のいずれか一項記載の逆ミセル系。
7. 重量比ステロール／アシルグリセロールが、０．０３〜０．０４の範囲である、請求項６記載の逆ミセル系。
8. リン脂質がホスファチジルコリンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の逆ミセル系。
9. アシルグリセロールが以下の式（Ｉ）：
   
   （式中、
   −Ｒ_１は、１４〜２４個の炭素原子を有する、直鎖状若しくは分枝状の、飽和若しくは不飽和脂肪酸のアシル残基、水素原子、又はモノ−、ジ−若しくはトリ−ガラクトース若しくはグルコースであり；
   −Ｒ_２は、２〜１８個の炭素原子を有する、直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和脂肪酸のアシル残基であり；
   −Ｒ_３は、１４〜２４個の炭素原子を有する、直鎖状若しくは分枝状の、飽和若しくは不飽和脂肪酸のアシル残基、又は水素原子である）を表す、請求項１〜８のいずれか一項記載の逆ミセル系。
10. アシルグリセロールが、１，２−ジオレイン及び１−オレオイル−２−アセチルグリセロールからなる群の中で選択される、請求項１〜９のいずれか一項記載の逆ミセル系。
11. ステロールが、シトステロール又はコレステロールである、請求項１〜１０のいずれか一項記載の逆ミセル系。
12. 核酸が、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はタンパク質と相互作用でき、遺伝子発現をモデュレーションできるオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１１のいずれか一項記載の逆ミセル系。
13. 核酸が、ターゲットタンパク質の発現をアップレギュレーション又はダウンレギュレーションできるオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１２のいずれか一項記載の逆ミセル系。
14. （ａ）（ｉ）ステロール、（ｉｉ）アシルグリセロール、（ｉｉｉ）リン脂質又はスフィンゴ脂質、（ｉｖ）アルコール、（ｖ）水、及び（ｖｉ）少なくとも１つの核酸、を接触させること、
    （ｂ）工程（ａ）において得られた混合物を、４０℃以下で、逆ミセルの形成を得るのに十分な時間撹拌すること
    を含む、請求項１〜１３のいずれか一項記載の逆ミセル系を製造する方法。
15. 工程（ｂ）の撹拌することが、１５℃〜４０℃の温度範囲で実施される、請求項１４記載の方法。
16. 工程（ｂ）の撹拌することが、２５℃〜４０℃の温度範囲で実施される、請求項１５記載の方法。
17. 工程（ｂ）の撹拌することが、３０℃〜３７℃の温度範囲で実施される、請求項１６記載の方法。
18. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の逆ミセル系及び少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は支持体を含む、医薬組成物。
19. 少なくとも１つの核酸の哺乳動物への送達のための、請求項１８記載の医薬組成物であって、前記送達が当該医薬組成物の粘膜投与を含む、医薬組成物。
20. 遺伝性疾患、ガン、神経変性疾患、伝染性疾患及び／若しくは炎症性疾患、又は細胞増殖による疾患若しくは障害の症状の予防、処置及び／又は改善のための、請求項１８又は１９記載の医薬組成物。
21. 逆ミセル系の核酸が、血液脳関門を通過する、請求項１９又は２０記載の医薬組成物。
22. 疾患又は障害が、中枢神経系における遺伝性疾患、腫瘍性疾患、ウイルス性疾患及び変性疾患から選択される、請求項２１記載の医薬組成物。