JP6035578B2

JP6035578B2 - 乳酸菌、それを含む組成物及びそれらの使用

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Publication number: JP6035578B2
Application number: JP2015088066A
Authority: JP
Inventors: 英傑蔡; 偉賢劉; 堅甫廖; 智捷許
Original assignee: National Yang Ming Chiao Tung University NYCU
Current assignee: National Yang Ming Chiao Tung University NYCU
Priority date: 2014-04-23
Filing date: 2015-04-23
Publication date: 2016-11-30
Anticipated expiration: 2035-04-23
Also published as: CN105002109A; CN105002109B; EP2937424A1; PL2937424T3; ES2624673T3; JP2015213501A; EP2937424B1

Description

本発明は、乳酸菌、特に個体におけるストレス誘発失調または機能性胃腸障害を予防または治療するための新規乳酸菌株に関する。

機能性胃腸障害（ＦＧＩＤｓ）は消化器病学実務において最も頻繁に起きる問題である。機能性胃腸障害は胃腸（ＧＩ）管の機能異常により起こり、慢性的腹部症状の複合、たとえば腹痛と、下痢、便秘、鼓腸で定義される。ＲｏｍｅＩＩＩ診断基準（ＲｏｍｅＩＩＩｃｒｉｔｅｒｉａ）によれば、すでに２０種以上の機能性胃腸障害が確認されている。普通のＦＧＩＤｓは、機能性腹痛、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、便秘、機能性下痢と機能性消化不良を含むが、これらに限らない。
過敏性腸症候群は慢性的な機能性胃腸障害である。世界中で約４〜３０％の人間はＩＢＳに苦しむ。ＩＢＳは腹痛（慢性的疼痛）と排便習慣の変化との二つの主要症状が特徴である。前記主症状によれば、ＩＢＳは、下痢に伴うＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｄ）、便秘に伴うＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｃ）、混合形ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｍ）と分類不能型ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｕ）の四つのサブグループに分類することが可能である。ＩＢＳ患者の中には、約３０％の患者は胃腸炎の後にＩＢＳに苦しむ。また、それらは感染／炎症後ＩＢＳに属する。さらに、患者が健康管理を探し求めるようにモチベーションを持たせ、生活の品質を著しく低下させることの主な要因は、内臓過敏（ＶＨ）と関連する腹痛である。内臓過敏は、機能性胃腸障害を起こす主要メカニズムの一つだと考えられる。また、最近の研究は、内臓過敏はＩＢＳに対して高特異性であることを示す。
内臓過敏は、患者にセンセーションの強度増加と内臓痛に対する閾値の低下とで定義される。持続するＶＨは、ニューロン興奮性の増加に示されるニューロン感作性（ｎｅｕｒｏｎａｌｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）に関連する。神経伝達物質、たとえば、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）は、ニューロン感作性において重要な役割を果たす。セロトニンはモノアミンニューロン伝達物質である。従来の研究では、すでに覚醒ラットに５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ、セロトニンの前駆体）を皮下注射すると、ＶＨが誘発されたことを示している。セロトニンを合成と貯蔵する重要な場所は腸粘膜のクロム親和性細胞である。クロム親和性細胞から放出されたセロトニンは腸の分泌、運動性、及びセンセーションと関連する神経反射を活性化させる。臨床研究によると、ＩＢＳ患者は通常セロトニン代謝の異常が伴っている。さらに、セロトニン受容体拮抗薬は既に治療薬剤として広く使用されている。これは、ＩＢＳの病状はセロトニンと関連することを示している。
内臓過敏を示す直腸膨満試験の痛覚閾値の低下は、ＩＢＳ患者の顕著な特徴である。動物試験によると、結腸直腸の痛覚閾値はバロスタット膨張に反応する筋電図（ＥＭＧ）信号から監視でき、ＥＭＧ信号が高ければ高いほど、痛みの感受性が高いことを意味する。ＶＨに加えて、脊髄にＰ物質の表現の増加もすでにＩＢＳラットモデルの結腸直腸膨張時に内臓痛覚を示すバイオマーカーとして実証されている。
ＩＢＳ症状を改善する治療方法はさまざまあり、セロトニン受容体拮抗薬、抗うつ薬、運動促進薬、鎮痙薬とプロバイオティクスを含む。プロバイオティクス（有益菌）は生きている微生物であり、適切な量で投与したとき、宿主に健康利益を与える。薬理的な副作用がないので、プロバイオティクスはＩＢＳの治療にとって有望な方法だと思われる。一方、特定なプロバイオティクスは便秘症状に有利な効果を与えることもすでに記載されている。
便秘は、ワールドワイドの機能性胃腸障害であり、便の低頻度または通過困難と定義されている。便秘の原因は多くあり、化合物、食生活、腸内細菌の組成、妊娠、及び心理的ストレスを含む。多くの種類の下剤はすでに確認されているが、これらの薬の大部分は潜在的な不利な副作用があり、たとえば薬物の耐性、大腸メラノーゼ、または下剤性結腸を含む。便秘患者の腸内細菌は腸内毒素があり、プロバイオティクスの消費により改善できる。さらに、プロバイオティックバクテリア、特に乳酸桿菌とビフィズス菌は、結腸のｐＨを低下させることができ、乳酸、酢酸、及びその他のものを製造できる。低下したｐＨは大腸の蠕動運動を向上させる傾向があり、その結果、結腸の輸送時間を減少させ、便秘症状の治療にとって有利である。
プロバイオティクスは腸管内菌叢のバランスを維持すること、粘膜の障壁機能を強化させることと、免疫システムを調節することにより、宿主をより健康にし得る。数多い証拠は、プロバイオティクスは感染症、アレルギー、ガンと壊死性腸炎を含む疾患の治療法になることを示している。プロバイオティクスが機能性胃腸障害の治療に関する用途をさらに研究する価値がある。
それらのなかで、プロバイオティクスとして使用される最も重要な微生物種である乳酸菌（lactic acid bacteria）（本明細書では、これ以後LABと時々称される）は、宿主腸細菌叢を調節できるため、消化管（ｇｕｔ）の健康を予防または治療するための選択肢として認識されている。さらに、近年、LABが宿主の心理的ストレスに対する心理的及び生理的反応を変えることができることを明らかに示す証拠が増えている。

人類及び動物において、ストレスは気分障害及び神経化学変化を引き起こす原因のひとつである。齧歯類に急性ストレスとして強制水泳をさせた後、翌日の再試験の際は、不動状態がより多くなっている。研究によると、齧歯類が母性剥奪の早期生活ストレスに曝される場合、一般飼育のコントロール群より、成年期で胃腸炎、不安様（ａｎｘｉｅｔｙ−ｌｉｋｅ）と憂うつ様（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｌｉｋｅ）行動、視床下部‐下垂体‐副腎系機能障害、及び影響された神経伝達物質などの多重異常が発生する。ストレス誘発失調には、不安、憂うつ及び過敏性腸症候群が含まれるが、それらに限らない。
乳酸菌は宿主の腸‐脳軸への影響を有することが示されているため、従来の精神疾患用薬だけでなく、乳酸菌もストレス誘発失調を治療する代用品として使用できる。無菌マウスの活動力増加と不安減少が不足することは、正常菌群の脳部発育における重要な役割を強調することが開示されている。従来の研究には、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）が迷走神経により健康マウスにおける中枢神経系機能を変化させていることが開示され、また、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓ）は、強制水泳試験（ｆｏｒｃｅｄｓｗｉｍｍｉｎｇｔｅｓｔ、単にＦＳＴと称する）の行動欠陥を逆転させ、脳幹におけるアドレナリン濃度を還元することが開示されている。上記研究は、プロバイオティクスが精神失調の治療及び神経伝達物質として開発される得ることを支持している。
数多い研究により、生産及び製造方法並びにフードキャリアはプロバイオティック株の特性に影響を及ぼし得ること、および臨床的介入研究の結果に影響を与えることが示されている。ここで、発明者らは、精神障害及び機能性胃腸障害の予防または治療の可能性を示す乳酸菌株を同定した。

以下の参考文献及び本発明が引用するDSMZ番号およびATCC番号は、それぞれ引用により本明細書に組み込まれているものとする。

ＣｈｅｎＣＬ．（２０１３） "Ｖｉｓｃｅｒａｌｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｉｎｎｏｎ−ｅｒｏｓｉｖｅｒｅｆｌｕｘｄｉｓｅａｓｅ：ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃｏｖｅｒｗｈｅｌｍｉｎｇｉｎｅｓｏｐｈａｇｕｓ？" ＤｉｇＤｉｓＳｃｉ．Ａｕｇ；５８（８）：２１３１−２．ＣｏｌｌｉｎｓＳＭ．（２００７）． "Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇｓｙｍｐｔｏｍｓｉｎｔｏｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＧＩｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．" ＡｄｖＰｈｙｓｉｏｌＥｄｕｃ．Ｄｅｃ；３１（４）：３２９−３１．ＤｒｏｓｓｍａｎＤＡ．（２００６）． "ＴｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｄｉｓｏｒｄｅｒｓａｎｄｔｈｅＲｏｍｅＩＩＩｐｒｏｃｅｓｓ．" Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．Ａｐｒ；１３０（５）：１３７７−９０．ＫｅｏｈａｎｅＪ，ＱｕｉｇｌｅｙＥＭ．（２００６）． "Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｙｓｐｅｐｓｉａ：ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｖｉｓｃｅｒａｌｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｉｎｉｔｓｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．" ＷｏｒｌｄＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｍａｙ７；１２（１７）：２６７２−６．ＭｏｓｈｉｒｅｅＢ，ＺｈｏｕＱ，ＰｒｉｃｅＤＤ，ＶｅｒｎｅＧＮ．（２００６）． "Ｃｅｎｔｒａｌｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎｉｎｖｉｓｃｅｒａｌｐａｉｎｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｇｕｔ．" Ｊｕｌ；５５（７）：９０５−８．ＢｏｕｉｎＭ，ＰｌｏｕｒｄｅＶ，ＢｏｉｖｉｎＭ，ＲｉｂｅｒｄｙＭ，ＬｕｐｉｅｎＦ，ＬａｇａｎｉｅｒｅＭ，ＶｅｒｒｉｅｒＰ，ＰｏｉｔｒａｓＰ．Ｒｅｃｔａｌｄｉｓｔｅｎｔｉｏｎｔｅｓｔｉｎｇｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｉｒｒｉｔａｂｌｅｂｏｗｅｌｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｖａｌｕｅｓｏｆｐａｉｎｓｅｎｓｏｒｙｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ２００２；１２２：１７７１−１７７７．ＣｈｉｎＪＤｉｇＤｉｓ．２００６；７（４）：２１１−８．ＡｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｏｆｓｕｂｓｔａｎｃｅＰ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｎｅｕｒａｌｐａｔｈｗａｙｓｉｎａｒａｔｍｏｄｅｌｏｆｉｒｒｉｔａｂｌｅｂｏｗｅｌｓｙｎｄｒｏｍｅｗｉｔｈｒｅｃｔａｌｄｉｓｔｅｎｓｉｏｎ．ＮｅｒｉＦ，ＣａｖａｌｌａｒｉＧ，ＴｓｉｖｉａｎＭ，ＢｉａｎｃｈｉＥ，ＡｌｄｉｎｉＲ，ＣｅｖｅｎｉｎｉＭ，ＧｕｉｄｅｔｔｉＥ，ＰｉｒａｓＧＬ，ＰａｒｉａｌｉＭ，ＮａｒｄｏＢ．ＪＢｉｏｍｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２；２０１２：８９６１６２．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏｌｉｃｖｅｉｎｌｉｇａｔｕｒｅｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｌｏｐｅｒａｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ．ＦａｕｓｔａＳｅｒａｆｉｎｉ，ＦｒａｎｃｅｓｃａＴｕｒｒｏｎｉ，ＰａｔｒｉｃｉａＲｕａｓ−Ｍａｄｉｅｄｏ，ＧａｂｒｉｅｌｅＡｎｄｒｅａＬｕｇｌｉ，ＣｈｒｉｓｔｉａｎＭｉｌａｎｉ，ＳａｂｒｉｎａＤｕｒａｎｔｉ，ＮｉｃｏｌｅＺａｍｂｏｎｉ，ＦｒａｎｃｅｓｃａＢｏｔｔａｃｉｎｉ，ＤｏｕｗｅｖａｎＳｉｎｄｅｒｅｎ，ＡｂｅｌａｒｄｏＭａｒｇｏｌｌｅｓ，ＭａｒｃｏＶｅｎｔｕｒａ，ＫｅｆｉｒｆｅｒｍｅｎｔｅｄｍｉｌｋａｎｄｋｅｆｉｒａｎｐｒｏｍｏｔｅｇｒｏｗｔｈｏｆＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍＰＲＬ２０１０ａｎｄｍｏｄｕｌａｔｅｉｔｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，１７８，５０-５９．Ｃｈｅｎｇ，Ｆ．Ｃ．，Ｊ．Ｓ．Ｋｕｏ，Ｈ．Ｍ．Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｙ．Ｙａｎｇ，Ｔ．Ｆ．ＷｕａｎｄＴ．Ｈ．Ｔｓａｉ（２０００）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓｉｎｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａｃｅｌｌ（ＰＣ−１２）ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｂｙｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ−ｍｉｃｒｏｂｏｒｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ８７０（１−２）：４０５−４１１．Ｃｒｙａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ａ．Ｄａｌｖｉ，Ｓ．Ｈ．Ｊｉｎ，Ｂ．Ｒ．Ｈｉｒｓｃｈ，Ｉ．ＬｕｃｋｉａｎｄＳ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓ（２００１）．Ｕｓｅｏｆｄｏｐａｍｉｎｅ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅｉｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔｄｒｕｇｓ．ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ２９８（２）：６５１−６５７．Ｄｅｓｂｏｎｎｅｔ，Ｌ．，Ｌ．Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｇ．Ｃｌａｒｋｅ，Ｂ．Ｋｉｅｌｙ，Ｊ．Ｆ．ＣｒｙａｎａｎｄＴ．Ｇ．Ｄｉｎａｎ（２０１０）．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｐｒｏｂｉｏｔｉｃＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓｉｎｔｈｅｍａｔｅｒｎａｌｓｅｐａｒａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｏｆｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１７０（４）：１１７９−１１８８．Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ａ．ａｎｄＡ．Ｈｏｌｍｅｓ（２００７）．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｅｐｅａｔｅｄｍａｔｅｒｎａｌｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｎａｎｘｉｅｔｙ− ａｎｄｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｕｓｅｓｔｒａｉｎｓ．ＮｅｕｒｏｓｃｉＢｉｏｂｅｈａｖＲｅｖ３１（１）：３−１７．

本発明は、登録番号ＤＳＭ２８６３２でドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ−ＤＥＵＴＳＣＨＥＳＡＭＭＬＵＮＧＶＯＮＭＩＫＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＮＵＮＤＺＥＬＬＫＵＬＴＵＲＥＮ、単にＤＳＭＺと称する）に寄託しているラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＰＳ１２８）である単離乳酸菌を提供する。
本発明の一形態においては、ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８及び担体を含む組成物を提供する。
本発明の一態様においては、前記担体は生理学的に許容される賦形剤または希釈剤である。生理学的に許容される賦形剤または希釈剤の例としては、乳糖、澱粉、デキストリン、シクロデキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、プロピオン酸カルボキシル化スターチ、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、マルトデキストリン、およびステアリン酸マグネシウムを含むが、これらに限定されない。

本発明の一形態においては、有効量のラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８を個体に投与するステップを含む、個体のストレス誘発失調または精神障害を予防または治療するための方法を提供する。好ましくは、前記ストレス誘発失調または精神障害は、不安、憂うつ及び過敏性腸症候群からなる群から選ばれる。
さらに具体的な態様においては、ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８を投与した後、血清コルチコステロン濃度は個体において統計学的に有意に低下する。また、ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８を投与した後、神経伝達物質濃度は個体において統計学的に有意に上昇する。前記神経伝達物質はドーパミンであることが好ましい。
本発明の一形態においては、有効量のラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８を個体に投与することを含む、機能性胃腸障害を予防または治療するための方法を提供する。
本発明の別の形態においては、有効量のラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８を個体に投与することを含む、個体の内臓過敏を予防または治療するための方法を提供する。好ましくは、前記内臓過敏は機能性胃腸障害に関連する。
本発明の一態様においては、前記機能性胃腸障害は、機能性腹痛、過敏性腸症候群、便秘、機能性下痢及び機能性消化不良からなる群から選ばれる。好ましい態様においては、前記機能性胃腸障害は、機能性腹痛、過敏性腸症候群または便秘である。

本発明の別の形態においては、有効量のラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８を個体に投与する工程を含む、個体の機能性腹痛、過敏性腸症候群または便秘を予防または治療するための方法を提供する。
本発明のさらに具体的な実施例においては、ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８を投与した後、痛覚のバイオマーカーレベルは前記個体において統計学的に有意に低下する。好ましくは、前記バイオマーカーはＰ物質である。また、前記ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８投与した後、前記個体において筋電図信号が統計学的に有意に低下する。また、ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８を投与した後、筋電図信号は統計学的に有意に低下する。
好ましい実施例においては、前記単離乳酸菌を前記個体に経口投与する。

ラクトバチルス・プランタルム株のＥＲＩＣ−ＰＣＲプロフィールを示す筋電図信号図である。ＭはＤＮＡラダーを表し、ＤＳＭ２７４４５はラクトバチルス・プランタルム亜種を表し、ＡＴＣＣ１４９１７^Tはラクトバチルス・プランタルム亜種を表し、ＡＴＣＣ１７６３８^Tはラクトバチルス・プランタルム亜種アルゲントラテンシスを表する、ラクトバチルス・プランタルムのＰＣＲフィンガープリンティングプロフィールを示す。図２Ａと図２Ｂはラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８がマウスのオープンフィールド試験における全移動距離を増やし、マウスの強制水泳試験における憂うつ様行動を改善することを示す。＊はコントロール群と比較してｐ＜０．０５であることを表し、＄はストレス群と比較してｐ＜０．０５であることを表す。血清コルチコステロン濃度を示す。＊はコントロール群と比較してｐ＜０．０５であることを表し、＄はストレス群と比較してｐ＜０．０５であることを表す。図４Ａ〜４Ｃはラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８のマウス前頭葉前部皮質ドーパミンとセロトニン経路に対する影響を示す。＊はコントロール群と比較してｐ＜０．０５であることを表し、＄はストレス群と比較してｐ＜０．０５であることを表す。図５ＡはＰＳ１２８が５−ＨＴＰ誘発内臓過敏に対する効果を評価する実験的なタイムラインを表し、図５Ｂは内臓過敏試験の実験手順を表す。図６Ａ〜６ＣはＣＲＤ刺激に反応する筋電図（ＥＭＧ）信号を表す（ｎ＝８、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．０００１であり、ベースライン対５−ＨＴＰ）。図７はＬ６−Ｓ１脊髄中のＰ物質濃度のウエスタンブロット法による分析結果を表す。前記Ｌ６−Ｓ１脊髄はＰＳ１２８投与されたラットまたは投与のないラットから単離されたものである（ｎ＝３、＊＊＊はｐ＜０．０００１）。図８Ａと８Ｂは普通（Ａ）及び実験の便秘になった（Ｂ）マウスにおける糞の質量によって表されたＰＳ１２８の経口投与の効果を表す（ｎ＝６、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５）。

以下、特定かつ具体的な実施例をあげて本発明の実施形態を説明する。当業者は本願明細書の開示内容から、本発明の利点及び効果を簡単に理解することができる。本発明は、他の異なる実施形態により施行または適用でき、本願明細書中の各詳細内容は異なる観点と応用に基づいて、本発明の主旨を逸脱しない範囲内で修正または変更することができる。
多数の実施例によって本発明を説明する。以下の実施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない。

実施例１：ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８の単離と、ＥＲＩＣ−ＰＣＲによる新規な菌株の弁別
ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８（以下、単にＰＳ１２８と称する）は、台湾伝統のカラシナの発酵食品（中国表記「福菜」）から単離された。
ＥＲＩＣ−ＰＣＲを行い、さらに高い配列類似性を有する細菌亜種を識別した。
表１及び表２が示す条件でＰＳ１２８のＥＲＩＣ−ＰＣＲプロフィールを行った。その菌株から抽出したＤＮＡはテンプレートとして１６ＳｒＤＮＡの増幅を行った。得られた増幅産物を電気泳動して、図１に示すようにそのパターンを比較した。プライマーは、SEQ ID NO:1及びSEQ ID NO:2が示すプライマーを使用した。
ERIC1R: (5’- ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC -3’) SEQ ID NO: 1
ERIC2: (5’- AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG -3’) SEQ ID NO: 2

表１．ＰＣＲ反応溶液の組成（ＰＣＲ管あたり２５μｌ）

表２．ＰＣＲ条件

図１が示すように、Ｍ列はＤＮＡラダー（２５０〜１００００塩基対）を表し、ＤＳＭ２７４４５はラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムを表し、ＡＴＣＣ１４９１７^Tはラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムを表し、ＡＴＣＣ１７６３８^Tはラクトバチルス・プランタルム亜種アルゲントラテンシスを表する。

白い矢印が示すように、ＰＳ１２８のＤＳＭ２７４４５、ＡＴＣＣ１４９１７、またはＡＴＣＣ１７６３８におけるバンド位置は独特である。そのため、図１の結果は、ＰＳ１２８が、ＤＳＭ２７４４５、ＡＴＣＣ１４９１７^T、またはＡＴＣＣ１７６３８^T全部ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムに属するものであっても、これらは異なる菌種であることを示す。従って、この結果は、ＰＳ１２８はラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムの新たな菌株であることを示す。

ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８は、２０１４年３月３１日付でブダペスト条約に基づきドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，Ｄ−３８１２４Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託しており、国際寄託当局からＤＳＭＺの登録番号ＤＳＭ２８６３２を授けられた。また、この生物的材料は生死判別試験に合格した。

実施例２：分析プロフィール指数（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＰｒｏｆｉｌｅＩｎｄｅｘ、単にＡＰＩと称する）の判定
本発明はＡＰＩ５０ＣＨＬキット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）でＰＳ１２８の糖利用能を評価し、その結果を表３で示す。その発酵試験は、ＰＳ１２８がラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムと類似する生化学的特性を有することを示している。

表３．発酵試験結果

＋：陽性、−：陰性

実施例３：ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８による、ストレスを受けたマウスの行動、ストレスホルモン、及び神経伝達物質濃度の変化
（１）ＰＳ１２８の準備
ＰＳ１２８を培養液（１０％脱脂粉乳、１％酵母粉、０．１％ｔｗｅｅｎ８０、及び２％グルコース）に播種し、３７℃で１８時間培養した後、遠心分離して回収した。ＰＳ１２８は保護剤（脱脂粉乳１％、砂糖２％、オリゴフルクトース２％、マルトデキストリン３％、及びグリセロール２％）に埋め込んで凍結乾燥して最終濃度が１×１０¹¹コロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍａｔｉｏｎｕｎｉｔ、以下単にＣＦＵと称する）／ｇ粉末に調整し、使用するまで−２０℃冷蔵庫に貯蔵した。
（２）実験動物及び飼育
８週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌ雄マウスまたは定期的に妊娠するＣ５７ＢＬ／６Ｊｎａｒｌ雌マウスは、いずれも台湾国家実験動物センターから購入し、出産の約一週間前に、台湾国立陽明大学の病原体フリー動物センターの特定無菌室で、フィルターキャップ付き飼育ケージの中に、標準条件（温度２２℃、湿度５０〜６０％に保持し、１２時間の明暗周期）で飼育し、標準実験室食物（ＬａｂＤｉｅｔＡｕｔｏｃｌａｖａｂｌｅＲｏｄｅｎｔＤｉｅｔ５０１０，ＰＭＩＮｕｔｒｉｔｉｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ，ＵＳＡ）と水を無制限に提供した。全部の動物実験工程は台湾国立陽明大学動物管理委員会により審査され、許可された。

（３）早期生活ストレス
従来研究を修正し、低温環境下の母性剥奪を早期生活ストレス（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎａｎｄＨｏｌｍｅｓ２００７、Ｄｅｓｂｏｎｎｅｔｅｔａｌ．，２０１０）とした。即ち、新生仔の生後２〜１４日目、室温下（〜２２℃）で、毎日新生仔を親と兄弟から３時間（１１：００〜１４：００）分離させていた。それから２週間、毎週の床敷きの交換以外は邪魔しなかった。その後、ストレスを受けた幼若マウスを離乳させ、ケージあたり５〜６匹で無作為に割り当てた。雄の幼若マウスのみを実験に使用した（ストレス群は１２匹で、ストレス群に１０⁹のＰＳ１２８を与えた）。それら早期生活ストレスを受けていないマウスはコントロール群とした（コントロール群は１０匹）。
（４）実験設計及びサンプリング
離乳（生後２８日目）から８週齡までのマウスには、４週間連続で生理食塩水、またはＰＳ１２８（１０⁹ ＣＦＵ／匹／日）を投与した。これらのマウスに対し、照明期で最も軽微のストレスから最大ストレスへとオープンフィールド試験及び強制水泳試験などを含む一連の行動試験を行った。屠殺する当日、前記マウスから後眼窩採血して、ストレスの原因として頸椎脱臼の３０分間前に短い強制水泳を行わせ、これらはいずれも１１：００〜１４：００の間で行ったため、日周リズムへの影響は減少した。前記マウスの脳を速やかに取り出し、特定領域の前頭葉前部皮質を氷上で切片にし、液体窒素で冷凍して、または０．６％過塩素酸緩衝液に保存した後、使用するまで−８０℃に貯蔵していた。

（５）オープンフィールド試験（ｏｐｅｎｆｉｅｌｄｔｅｓｔ、ＯＦＴ）
オープンフィールド試験は、ラット／マウスの探索行動及び基本活動能力を測定する一般測定方法であり、さらに定性及び定量も同時にできる。
プレキシグラス壁を囲む二つの光束センサーリングを含む競技場（２５．４×２５．４×３８ｃｍ）を備えるオープンフィールド活動システム（ＴｒｕＳｃａｎａｃｔｉｖｉｔｙｓｙｓｔｅｍ，ＣｏｕｌｂｏｕｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＰＡ，ＵＳＡ）で、運動能力を監視して計算した。各マウスは同じコーナーから競技場に１０分間置いて、全移動距離などを含むいくつかの活動を測定した。毎回試験終了後、前記競技場は水及び７０％エタノールで洗浄し、前記マウスは元の飼育ケージに戻した。前記活動はＴｒｕＳｃａｎ２．２ソフトウェア（ＣｏｕｌｂｏｕｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で自動的に記録して定量した。

（６）強制水泳試験（ｆｏｒｃｅｄｓｗｉｍｍｉｎｇｔｅｓｔ、ＦＳＴ）
強制水泳は齧歯動物の行動試験であり、これらの憂うつ様状態を起こす或いは予防する抗憂うつ藥物、新規化合物の抗憂うつの治療効果、または実験操作を評価するためのものである。
強制水泳試験の評価方法は前記（Ｃｒｙａｎｅｔａｌ．，２００１）を修正したものである。即ち、不動程度（ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ）はビデオカメラで紀録し、マウスは透明なアクリルシリンダー（高さ３０ｃｍ×内径１０ｃｍ、深さ１５ｃｍの水を含み、水温は２３±１℃に調整する）中に放り込み、さらにビデオ追跡ソフトウェアＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ（ＮｏｌｄｕｓＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で、単回の６分間の強制水泳の内４分間（１〜５分）の不動程度を分析した。試験終了後、マウスはティッシュペーパーで乾燥させて元の飼育ケージに戻した。透明なアクリルシリンダー（高さ３０ｃｍ×内径１０ｃｍ）には深さ１５ｃｍの水を含み、水温は２３〜２５℃に調整し、単回の６分間試験に使用した。ビデオカメラでその行動を記録した。ビデオ追跡ソフトウェアＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ（ＮｏｌｄｕｓＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で分析した。１〜５分の不動時間はいずれも同じパラメータで計算して人的エラーを避ける。試験終了後、前記マウスはティッシュペーパーで乾燥させて元の飼育ケージに戻した。
図２Ａ及び２Ｂに示すように、オープンフィールド試験において、ストレスを受けたマウスはコントロール群と似ている全移動距離を有したが（図２Ａ）、強制水泳試験においては、より多くの不動時間を有している（図２Ｂ）。ストレスを受けるマウスにＰＳ１２８を投与すると、コントロール群マウスと同様な程度に、オープンフィールド試験における全移動距離が有意に上昇し、強制水泳試験における不動程度が有意に低下した（図２Ａ及び２Ｂ）。＊はコントロール群と比較してｐ＜０．０５であることを表し、＄はストレス群と比較してｐ＜０．０５であることを表す。

（７）血清コルチコステロンの測定
血漿コルチコステロン濃度は、視床下部‐下垂体‐副腎系活性化の指標であり、ストレスまたは恐怖下での体−脳相互作用の基本反応である。
犠牲にする前にマウスから採取した血液サンプルを４℃、３０００×ｇで１０分間遠心分離して血清を得た。血清を適宜に希釈して市販コルチコステロン酵素免疫測定キット（ＣＯＲＴＥＩＡｋｉｔ，Ｃａｙｍａｎ，ＵＳＡ）に加えて、そのキットが提供する標準品から内挿で濃度を算出した。
図３に示すように、血清濃度を測定することにより、本願発明者は、ストレスを受けるマウスにおいて、コルチコステロンは有意に上昇し、ＰＳ１２８（ストレス群には１０⁹を与える）を投与した後で逆転することを見出した。＊はコントロール群と比較してｐ＜０．０５であることを表し、＄はストレス群と比較してｐ＜０．０５であることを表す。

（８）HPLC-ECDによるモノアミンおよびその代謝物の定量
HPLC-ECDは、生物または環境サンプル、例えばカテコールアミン（ドーパミン、ノルアドレナリン、及びアドレナリン）、モノアミン（例えば、セロトニン、ドーパミン、ノルアドレナリン、及びアドレナリン）アセチルコリン、グルタミン酸、アルギニン、γ−アミノ酪酸、及び他の物質のルーチン測定に対して高性能を有する（Ｃｈｅｎｇｅｔａｌ．，２０００）。
測定しようとする神経伝達物質は、ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ、以下単にＤＡと称する）、ジヒドロキシフェニル酢酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ、以下単にＤＣと称する）、及びホモバニリン酸（ｈｏｍｏ−ｖａｎｉｌｌｉｃａｃｉｄ、以下単にＨＶＡと称する）を含む。前記高速液体クロマトグラフィー−電気化学検出器（HPLC-ECD）システムは前記（Ｃｈｅｎｇｅｔａｌ．２０００）のように、マイクロポンプ（ＣＭＡ−１００，ＣＭＡ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）、オンライン注射器（ＣＭＡ−１６０）、Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈ液体クロマトグラフィーポンプ（Ｍｉｃｒｏ−ｔｅｃｈＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、及びＢＡＳ−４Ｃ電気化学検出器（ＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＷｅｓｔＬａｆｅｙｅｔｔｅ，ＩＮ）を含む。逆相クロマトグラフィーカラム（ＫｉｎｅｔｅｘＣ１８、２．６μｍ、１００×内径２．１ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＵＳＡ）で分析した。室温下（２５℃）で、Ａｇ／ＡｇＣｌの参照電極に対し、グラッシーカーボン作用電極の電位を＋６５０ｍＶに設定した。０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ₂ＰＯ₄）、８％メタノール、０．７４ｍＭオクチル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）、０．０３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及び２ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）を含む移動相緩衝溶液をリン酸でｐＨ３．７４に調整した。マウス頸椎脱臼後に直ちに全脳を収集して、ドライアイスで冷凍した。前頭葉前部皮質を解剖して０．６％過塩素酸緩衝液に保存した。超音波で均質化し、かつ１２０００×ｇで１０分間遠心分離するまで−８０℃に貯蔵した。分析する前、上清を０．２２μｍＰＶＤＦ膜（４ｍｍシリンジフィルター、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）でろ過した。適宜に希釈した上清（２０μｌ）を、流速０．２ｍｌ／分間でクロマトグラフィー系に注入した。以下の標準品：ドーパミン、ジヒドロキシフェニル酢酸、及びホモバニリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から、範囲１〜１００ｎｇ／ｍｌで、内挿でモノアミンの濃度を算出した。
図４Ａ〜Ｃに示すように、早期生活ストレスプロトコルを適用することにより前頭葉前部皮質内の神経伝達物質が変化した。ドーパミン関連経路において、ドーパミン自体は低下し、かつその代謝物であるジヒドロキシフェニル酢酸はコントロール群と似ており（図４Ａ及びＢ）、同時に、もう一つの代謝物であるホモバニリン酸は有意に低下した（図４Ｃ）。ＰＳ１２８を投与することで、ストレスを受けたマウスのドーパミン、ジヒドロキシフェニル酢酸、及びホモバニリン酸濃度は有意に上昇した（図４Ａ〜Ｃ）。＊はコントロール群と比較してｐ＜０．０５であることを表し、＄はストレス群と比較してｐ＜０．０５であることを表す。

実施例４：ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８による、ラットにおける内臓過敏及びＰ物質濃度の変化
従来の研究では、覚醒ラットに５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）（セロトニン前駆体）を皮下注射すると、ＶＨを誘発したことが示されている。この研究では、５−ＨＴＰ誘発ＶＨモデルは、プロバイオティック株であるラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８のラットに対する改善効果を評価するのに使用されていた。

（１）ＰＳ１２８の準備
ＰＳ１２８を培養液（１０％脱脂粉乳、１％酵母粉、０．１％ｔｗｅｅｎ８０、及び２％グルコース）に播種し、３７℃で１８時間培養した後、遠心分離して回収した。ＰＳ１２８は保護剤（脱脂粉乳１％、砂糖２％、オリゴフルクトース２％、マルトデキストリン３％、及びグリセロール２％）に取り込んで凍結乾燥して最終濃度が１×１０¹¹コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｇ粉末になるように調整した。ＰＳ１２８粉末を−２０℃で貯蔵し、動物治療の前、食塩水に溶解して５×１０⁹ＣＦＵ／ｍＬとした。
（２）実験動物及び飼育
国家実験動物センター（ＮＬＡＣ、台北、台湾）から６〜８週齢のＳｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）雄ラット（２２０〜３３０ｇ）を購入した。これらのラットを恒温、恒湿、１２時間の明暗周期で飼育し、水と餌を無制限に提供した。全部の動物実験工程は台湾国立陽明大学動物管理委員会により審査され、許可された。
（３）実験手順
図５Ａを参照し、まず、電極植え込みのためにラットをイソフルランで麻酔した。電極植え込み手術の後、ラットを単独で飼育した。手術後約７〜１０日目、ベースラインと５−ＨＴＰ注射誘発の内臓過敏検知のため、ラットに結腸直腸膨張（ＣＲＤ）試験を行った。この試験は、細菌を投与していない覚醒雄ラットにおける５−ＨＴＰ−内臓過敏を検証するために設計された。１０日目、ＣＲＤ試験後の二週間にラットにＰＳ１２８（一日あたり約１０⁹ＣＦＵの０．２ｍＬ食塩水）または食塩水（一日あたり２００μｌ）を経口投与した。その後またＣＲＤ試験を行い、ＶＨにおけるＰＳ１２８の効果を測定した。ＣＲＤ手順と筋電図（ＥＭＧ）記録を同時に行った。ＥＭＧ曲線下面積（ＡＵＣ）はパラメーターとして計算した。脊髄におけるＰ物質のタンパク質濃度をウエスタンブロット法で検出するため、ラットをペントバルビタールナトリウム（６５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）で麻酔して生理食塩水を経心的に（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）灌流した。ラットの腹部感覚を担当するＬ６−Ｓ１脊髄を単離した。

（４）電極の埋め込み
ラットをイソフルランで麻酔した。少なくとも実験の７日前、テフロン（登録商標）被覆ステンレス鋼線（Ａ−Ｍｓｙｓｔｅｍｓｉｎｃ．）の電極をラットの腹部外斜筋に埋め込んだ。頸部の背に電極を露出させた。
（５）結腸直腸膨張（ＣＲＤ）試験
結腸直腸膨張（ＣＲＤ）は、内臓敏感度の評価に広く使用され、かつ再現できる方法である。筋電図信号の測定はＣＲＤにおける評価項目のひとつであり、かつ最も正確な定量試験項目である。
図５Ｂを参照し、ＣＲＤ試験は５−ＨＴＰ皮下注射（５ｍｇ／Ｋｇ）の前と後に行ない、５−ＨＴＰ誘発内臓過敏を測定した。
ＣＲＤ試験のためラットをプラスチックトンネル（直径６ｃｍ、長さ２５ｃｍ）内に置いた。試験に先立つ３日間、実験条件に慣らすためにラットを一日あたり３時間単独にトンネル置いて訓練した。結腸直腸膨張（ＣＲＤ）バルーンは直腸カテーテル（ＭｅｄｔｒｏｎｉｃＩｎｃ．）付着ラテックス手袋の指（長さ７ｃｍ）より構成される。バルーンを膨張して一晩放置することで、壁面の張力を平衡した。膨張装置を肛門管によって意識があるラットの直腸に完全に導入し、尾の基部に固定した。当該カテーテルをバロスタット（ＭｅｄｔｒｏｎｉｃＩｎｃ．）に接続し、バルーンを所望の圧力（２０、４０、または６０ｍｍＨｇ）になるように３０秒間の間隔を挟んで１０秒間膨張させて結腸を膨張させた。各シリーズの間に５分間の間隔をあけ、各実験プロトコルについて膨張を４回繰り返した。ＣＲＤの反応をＥＭＧ装置で記録した。ＥＭＧ信号分析は内臓運動反射（面積／秒間）としてＳｐｉｋｅ２（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＤｅｓｉｇｎＬｉｍｉｔｅｄ）で行われた。
図６Ａに示すように、内臓運動は生のＥＭＧ信号から算出され、各群において圧力依存の方式で徐々に増加する。ラットにおけるベースライン信号に対し、５−ＨＴＰ皮下注射により、ＣＲＤに反応するＥＭＧ信号が有意に増加している。
図６Ｂに示すように、二週間ＰＳ１２８投与のラットは５−ＨＴＰ誘発ＥＭＧ信号の上昇を抑制できるものの、５−ＨＴＰを注射した後、二週間食塩水を投与したら、ＥＭＧ信号は依然として有意に上昇した。
さらに、ＰＳ１２８の投与がＥＭＧ信号の上昇を抑制する効果を確認するために、我々は５−ＨＴＰ注射後１０日目と２４日目のＥＭＧ上昇の差を計算した。ＥＭＧ差の数式は次のように示す。
ＥＭＧ差＝（５−ＨＴＰ注射後の２４日目のＥＭＧ上昇の差）−（５−ＨＴＰ注射後の１０日目のＥＭＧ上昇の差）
図６Ｃに示すように、食塩水投与後、全部の膨張圧力刺激において、１０日目のＥＭＧ信号の上昇と比べて、２４日目のＥＭＧ信号の上昇がより大きい。それに対して、ＰＳ１２８群では、全部の膨張圧力刺激において、１０日目のＥＭＧ信号の上昇と比べて、２４日目のＥＭＧ信号の上昇が低い。これらのデータは、ＰＳ１２８が５−ＨＴＰ注射誘発ＶＨを改善する可能性を有することを示唆している。

（６）ウエスタンブロット法
ウエスタンブロット法でＰＳ１２８の痛覚関連の脊髄神経細胞ペプチドに対する効果を確認するため、市販のタンパク質抽出キット（ＥＣ２１Ｉｎｃ．）によりＬ６−Ｓ１脊髄組織の全部のタンパク質を抽出した。抽出物を１０％ポリアクリルアミドゲルで分別して電気泳動でフッ化ポリビニリデン膜（ＲｏｃｈｅＬｔｄ．）に移し、次に、ブロッキングバッファ（５％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴ）で１時間ブロッケージし、ブロッキングバッファの中の一次抗血清Ｐ物質（１：１０００、ＧｅｎｅＴｅｘｉｎｃ．）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで二回洗浄した後、膜をブロッキングバッファの中のヤギ抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｃ．）と一緒にインキュベートした。抗体−タンパク質複合体をイモビロン^TMウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅｉｎｃ．）で可視化してルミノ・イメージアナライザー（富士フイルムホールディングス株式会社）で検出した。
Ｐ物質はラット脊髄の痛覚のバイオマーカーである。これは、Ｐ物質の異常な発現レベルがＩＢＳの病因に関与することを示唆する。なお、Ｐ物質含有神経経路は胃腸機能調節の役割を果たす神経経路の一つであると考えられる。図７に示すように５−ＨＴＰを注射していないコントロールラットは基礎レベルの生成を有しているものの、食塩水を二週間経口投与したラットは、ＣＲＤ試験を経てから５−ＨＴＰを注射した後、Ｌ６−Ｓ１脊髄において高濃度のＰ物質の生成が発見された。二週間のＰＳ１２８投与は５−ＨＴＰ注射誘発Ｐ物質産生の上昇を抑制した。すなわち、ＰＳ１２８投与で、Ｐ物質のレベルはほぼ５−ＨＴＰを注射していないラットにおけるレベルにまで下がった。

実施例５：ＰＳ１２８の緩下効果
ロペラミドはμ−オピオイド受容体のアゴニストであり、腸筋神経叢（ｍｙｅｎｔｅｒｉｃｐｌｅｘｕｓ）におけるＧタンパク質によりアデニルシクラーゼを抑制する結果、内在性アセチルコリンの放出を抑制する。ロペラミドは、腸神経系に直接に作用して便秘を起こすと推定され、便秘モデルマウスに頻用されている。
さらに、正常及びロペラミド誘発便秘マウスの両方の排泄におけるＰＳ１２８の緩下効果が試験された。マウスにプラシーボ（０．２ｍＬ食塩水／マウス／日）またはＰＳ１２８（１０⁹ＣＦＵの０．２ｍＬ食塩水／マウス／日）を経口投与した。二週間後、３時間における各マウスの糞便の湿質量を測定した。実験の便秘マウスに、塩酸ロペラミド（５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与し、３０分間後、３時間における各実験便秘マウスの糞便の湿質量の測定を開始した。図８に示すように、ＰＳ１２８群の糞便の湿質量は、プラシーボ群と比べて、有意に増加しているため、ＰＳ１２８の緩下効果を示唆している。これらの結果は、ＰＳ１２８は便秘を軽減する可能性があると示唆している。

実施例６：統計的分析
各実験群の間の差異はＰｒｉｓｍｖｅｒｓｉｏｎ６（Ｐｒｉｓｍ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）で分析した。ここに示す全部のデータは平均値±標準偏差（ＳＤ）で示されている。図２、３、４、及び７の統計的分析は一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡ）で計算され、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後試験を行った。二標本ｔ−検定は、ＥＭＧ信号の差（図６）及びＰＳ１２８の緩下効果（図８）の分析に使用された。ｐ＜０．０５であれば、差異は統計的に有意と考えられる。各群の間の統計的有意差はｐ＜０．０５であれば、アスタリスク（＊）またはドル記号（＄）で示し、ｐ＜０．０１であれば、＊＊で示し、ｐ＜０．０００１であれば、＊＊＊で示す。
本発明は、潜在株であるラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８がストレスを受けるマウスに有益であることを見出し、乳酸桿菌株ＰＳ１２８を投与することにより、マウスの行動が改善されたと報告した。
なお、本発明は、ＰＳ１２８は内臓過敏及び便秘に有益であり、また、ＰＳ１２８は、５−ＨＴＰ注射後、ＥＭＧ信号の上昇を除去し、ラットの脊髄におけるＰ物質の生成の上昇を抑制することを見出した。
従って、本発明が提供する方法は、乳酸桿菌株ＰＳ１２８を投与することで、ストレス誘発失調または機能性胃腸障害を予防または治療することに有用なものである。
上記では本発明のいくつかの実施態様を詳細に述べてきたが、当業者は本発明の教示および利点を逸脱することなく示された特定の実施態様に種々の改変および変更を加えることができる。そのような改変および変更は特許請求の範囲に記載した本発明の主旨および範囲に含まれる。

Claims

登録番号ＤＳＭ２８６３２でドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）に寄託しているラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＳ１２８である単離乳酸菌。
請求項１に記載の単離乳酸菌と、担体とを含む組成物。
請求項１に記載の単離乳酸菌を含む、個体の不安、憂うつまたは過敏性腸症候群を予防または治療するための組成物。
血清コルチコステロン濃度が個体において統計学的に有意（ｐ値＜０．０５）に低下する、請求項３に記載の組成物。
神経伝達物質の濃度が個体において統計学的に有意（ｐ値＜０．０５）に上昇する、請求項３に記載の組成物。
神経伝達物質がドーパミンである請求項５に記載の組成物。
請求項１に記載の単離乳酸菌を含む、個体の機能性胃腸障害を予防または治療するための組成物。
請求項１に記載の単離乳酸菌を含む、個体の内臓過敏を予防または治療するための組成物。
内臓過敏が機能性胃腸障害に関連する、請求項８に記載の組成物。
機能性胃腸障害が機能性腹痛、過敏性腸症候群または便秘である、請求項７または９に記載の組成物。
請求項１に記載の単離乳酸菌を含む、個体の機能性腹痛、過敏性腸症候群または便秘を予防または治療するための組成物。
痛覚のバイオマーカーとしてのＰ物質のレベルが個体において統計学的に有意（ｐ値＜０．０５）に低下する、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
個体の腹部外斜筋の筋電図信号が統計学的に有意（ｐ値＜０．０５）に低下する、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
経口投与用である、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の組成物。