JP6030618B2 - 検体の検出 - Google Patents

Description

本発明は、検体に関するデータを得るために、機能向上された電気化学インピーダンス分光（ＥＩＳ）技法を使用して検体を検出するための方法に関する。この方法は、既知のＥＩＳアッセイ法よりも高速で行うことができ、したがって、結果取得時間（ＴＴＲ）を改良し、臨床環境でのそのようなアッセイの開発を促すことができるので有利である。

検体を検出するための方法は、生化学分析の分野でよく知られている。従来の方法では、通常は検体に蛍光標識を付け、蛍光標識は、検体を識別するために例えば蛍光検出によって検出することができる。

ここ数年、ＤＮＡ検出の分野において、ナノ粒子が標識として使用されている。これらの標識は、標識付けを可能にすると共に、結合に関係するいかなる系においても機能する可能性があり、したがって、生きた細胞系、ならびにタンパク質および核酸に有用となり得る。ナノ粒子は、コスト、使いやすさ、感度、および選択性を含めた、より従来の蛍光標識のいくつかの制限を克服することが判明している（Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ Ｗ， Ｔａｔｏｎ Ｔ Ａ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（２００３）Ｒ６３−Ｒ７３“Ｍｅｔａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｌａｂｅｌｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ，ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”）。ナノ粒子は、光学的検出、電気的検出、電気化学的検出、および重力測定による検出を含めたいくつかの異なるＤＮＡ検出法で使用されている（Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ Ｗ，Ｔａｔｏｎ Ｔ Ａ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（２００３）Ｒ６３−Ｒ７３“Ｍｅｔａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｌａｂｅｌｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ，ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”）。コロイド状の金タグの電気化学的ストリッピング検出に基づいた、ＤＮＡハイブリダイゼーションの検出における金ナノ粒子の使用は、成功例がある（Ｗａｎｇ Ｊ，Ｘｕ Ｄ，Ｋａｗｄｅ Ａ，Ｐｏｓｌｋｙ Ｒ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１），７３，５５７６−５５８１“Ｍｅｔａｌ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”）。また、量子ドットとも呼ばれる半導体ナノ結晶、および金ナノ粒子の使用も、ＤＮＡハイブリダイゼーション研究のための蛍光標識として良好に使用されている（Ｗｅｓｔ Ｊ，Ｈａｌａｓ Ｎ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００３，５：２８５−２９２“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｓｅｎｓｉｎｇ，Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”）。

従来の蛍光標識の代わりにＤＮＡ検出法においてナノ粒子を使用することによって見出される利点にも関わらず、依然として、検出法の感度、選択性、および特に速度を改良する必要がある。各検出法はある程度の感度および選択性を有するが、それらはそれぞれ様々な限界を有し、様々な不正確さを生み出し、何れも、特に短い結果取得時間（例えば約１０分）が望まれる臨床環境試験に関しては、望まれるほど速くはない。

そのような方法に加え、ＤＮＡを検出する際には、ナノ粒子標識付けが電気泳動と組み合わされている（国際公開第２００９／１１２５３７号パンフレット参照）。電気泳動は、電極表面上でのＤＮＡと相補的プローブとの結合を速めるために採用される。この方法は、既知のアッセイ法よりも向上された速度および感度をもたらすことができるので有利である。

また、これに加えて、臨床環境で、特にＤＮＡに関して安価であり単純な検出法がますます必要とされている。コストを低減し、方法を単純化し、検出の速度を改良するために、標識付けを完全になくすことが知られている。標識を使用しない検出法はこれらの利点を有するが、標識がもたらす検出の融通性および感度を実現するのは難しい。

従来、検体に関するデータを得るための電気化学インピーダンス分光（ＥＩＳ）技法は、標識を用いた技法と標識を用いない技法どちらも考察されている。以下の参考文献に、背景の詳細が記載されている。

バイオセンシングへのＥＩＳの適用の検討−Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｐｏｕｒｍａｎｄａ，Ｎ．，“Ｌａｂｅｌ−Ｆｒｅｅ Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ”，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，１９，２００７，１２３９−１２５７

バイオセンシングへのＥＩＳの適用の検討−Ｋａｔｚ，Ｅ．，Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．，“Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｔ Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｂｙ Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｒｏｕｔｅｓ ｔｏ Ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ，ＤＮＡ−Ｓｅｎｓｏｒｓ，ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ”，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ １５，２００３，９１３−９４７

ＫＣｌ溶液中での様々な寸法のナノスケール電極のインピーダンススペクトルの特徴付け−Ｌａｕｒｅｙｎ，Ｗ．，Ｖａｎ Ｇｅｒｗｅｎ，Ｐ．，Ｓｕｌｓ，Ｊ．，Ｊａｃｏｂｓ，Ｐ．，Ｍａｅｓ，Ｇ．，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，１３，２００１，２０４−２１１

酵素活性の検出のためのＡＣインピーダンスおよび分光分析−Ｌａｕｒｅｙｎ，Ｗ．，Ｖａｎ Ｇｅｒｗｅｎ，Ｐ．，Ｓｕｌｓ，Ｊ．，Ｊａｃｏｂｓ，Ｐ．，Ｍａｅｓ，Ｇ．，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，１３，２００１，２０４−２１１

一体型システム内でのＡＣインピーダンスおよびＩＤＥ−Ｚｏｕ，Ｚ．，Ｋａｉ，Ｊ．，Ｒｕｓｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｈａｎ，Ｊ．，Ａｈｎ，Ｃ．Ｈ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｎａｎｏ ｉｎｔｅｒ ｄｉｇｉｔａｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ ａｒｒａｙｓ ｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｅｎｓｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．”Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｓ．Ａ，１３６，２００７，５１８−５２６

“Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＮＡ／ＤＮＡ ｓｔｕｄｉｅｄ ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｍｐｅｄａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”Ｊ Ｌｉｕ，Ｓ．Ｔｉａｎ，Ｐ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００５，２９６９−２９７１

ここから分かるように、ＡＣインピーダンス測定（しばしば電気化学インピーダンス分光法またはＥＩＳとも呼ばれる）は、典型的には、２つの電極間に小さな正弦波振幅（約１０ｍＶ）のＡＣ電圧摂動を印加し、ＡＣ周波数の関数として電極間で得られる電流を測定することを含み、その測定から、周波数の関数としてインピーダンスを計算することができる。そのようなインピーダンススペクトルの変化は、特に櫛型電極（ＩＤＥ）、例えば櫛型マイクロ電極（ＩＭＥ）や櫛型ナノ電極（ＩＮＥ）を使用するときに、電極上での特定の表面フィルムにおけるプローブ−標的結合を、標識を用いずに高感度で測定するための方法を提供することが実証されている。しかし、これらの測定は、通常は、検体と電極または電極に取り付けられたプローブとの結合の平衡に依拠する。なぜなら、この平衡が、層内で結合されている標的の量を決定するからである。したがって、ＥＩＳ応答は平衡熱力学に従う。この処置は、測定前に完全なプローブ−標的の関連付けを保証するために、長時間（しばしば数時間）かかる、時として高温での平衡を必要とする。これは、高速の結果取得時間（ＴＴＲ）を妨げる。

これに加えて、ＩＤＥのインピーダンス応答が理論的に考察されている。分析は、典型的には、適切な電気的等価回路を使用して行われ、広い周波数範囲にわたる応答に適合し、等価電気回路素子（抵抗、コンデンサ、Ｗａｒｂｕｒｇ素子など）に関するパラメータを与え、そこから、電気化学的応答の変化を示唆する特徴的な物理パラメータ（例えば拡散係数、濃度、層厚さ）を抽出することができる。さらに、通常は、各周波数での逐次測定が採用される。これらの要因が長い分析および測定時間の原因となるので、これらの要因が合わさって、上で論じた比較的大きな結果取得時間を延ばす。

したがって、既知のＥＩＳ方法、特に標識を用いない方法は、典型的には遅く、本発明で必要とされる臨床環境での使用のための満足な結果取得時間を提供しない。

本発明の狙いは、上記の従来技術に関連付けられる問題を克服することである。特に、本発明の狙いは、良好な感度および選択性で検体を検出するための方法において、速度および結果取得時間も改良され、安価であり、簡単に実施できる方法を提供することである。

したがって、本発明は、検体を検出するための方法において、
ａ）検体に交流電圧を印加するステップであって、交流電圧が、電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）によって検体の有無を見分けるのに十分な複数の重畳された周波数を備えるステップと、
ｂ）ＥＩＳデータから検体の同定および／または量を決定するステップと
を含む方法を提供する。

本発明のこの第１の態様は、好ましくは、重畳され、ステップ（ａ）において印加される１組の周波数を決定するために、統計分析を利用する。このようにして周波数を決定するための統計的方法は、当技術分野でよく知られており、当業者は、本発明による方法で使用するために１組の周波数を決定するために任意の既知の方法を採用することができる。そのような方法は、例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏ．Ｐｔｅ．Ｌｔｄ．（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）によるＦ．Ｊａｍｅｓ編の“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｈｙｓｉｃｓ”（第２版）（２００６）ＩＳＢＮ ９８１−２５６７９５で見ることができる。

必要に応じて、１組の周波数を決定する他の方法を採用することもできる。例えば、特定のシステム（例えば特定の電極／溶液／検体の組合せ）に関して、その特定のシステムに関する標準として十分なものとなる１組の周波数を見出すために経験的な方法を事前に採用することができる。このとき、この標準は、方法が行われるたびに所要の周波数を計算することなく、そのシステムで採用することができる。採用できる実現可能な１組の周波数を生成し、ＴＴＲに悪影響を及ぼさないという前提の下で、リアルタイムで、または事前に任意の他の方法を採用することもできる。

１組の周波数を決定するために使用される方法には関係なく、その組は、ＥＩＳを使用して検体の有無を見分けるのに十分となるように必要な少なくとも最小数の周波数を含むべきである。当然、必要に応じて、その最小数に加えてさらなる周波数を採用することもできる。

この方法は、いくつかの実施形態では、１組の周波数に加えて、または１組の周波数の代わりに他のパラメータの決定を含み、これらのパラメータはそれ自体、１組の周波数を定義し、したがって検体の存在および／または量の検出を実現する助けとなる。各場合に、周波数および／またはパラメータは、データ分析による最速の結果取得時間の提供に鑑みて選択される。

典型的には、１組の周波数および／またはパラメータは、検体の有無を見分けるのに十分なものである。１組の周波数の仕様は特に限定されず、それらは、１組の特定の個々の周波数として定義することができ、ある範囲内の１組の周波数として定義することもでき、および／または単一の周波数およびそこからの間隔として定義することもでき、その間隔が、組に含まれるさらなる周波数を定義する。

重畳された周波数を使用するＥＩＳ測定の結果の分析は、好ましくは統計的であり、等価回路解析法を採用する必要はなく、このことが、典型的にはより高速の判別を可能にする。しかし、ＴＴＲに悪影響を及ぼさないという前提の下で、等価回路法および任意の他の方法も排除しない。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）解析を使用して、必要なＥＩＳデータを抽出することができ、この情報は、検体情報を提供するために採用される。そのようなＦＦＴ技法は当技術分野でよく知られており、当業者は、必要に応じて任意のそのような技法を本発明に採用することができる。

上述したように、好ましくは、検体の有無に関する情報をＥＩＳデータから得ることができ、より好ましくは、存在する検体の量を決定することもできる。

本発明は、ＥＩＳバイオセンシングおよび判別を、限られた周波数範囲にわたる少数の点（実施例１（下記参照）では１桁の周波数にわたって７点）を使用して実現することができることを裏付ける。これは、必要な周波数を含む多重波形（実施例１では多重正弦波）のＥＩＳ摂動と、必要な情報を抽出するために使用される高速フーリエ変換（ＦＦＴ）解析との同時適用を可能にする。そのような処置は、市販の機器を使用して数秒以内での測定および分析を可能にし、これは、高速でロバストな検出のための現実的な時間尺度でのＥＩＳ測定を可能にする。

本発明で任意の検体を検出することができ、検出法は、関連する検体のタイプに依存する。検体の中には、電極に直接結合することができるものがあり、また、電極の表面上でプローブまたは相補的分子に結合することができる検体（例えばＤＮＡ）もある。本発明で採用される１組の周波数は、対象の各特定のシステムに関して生じる結合のタイプ、およびシステム自体の物理的性質（電極タイプ、電極組成、電極寸法、検体組成、溶媒／液体媒体タイプ、電解液など）に依存する。上述したように、同様のシステムに関しては、標準的な周波数の組を採用することができ、新規のシステムまたは検体に関しては、リアルタイムの統計的計算を採用することができる。

本発明はさらに、検体を検出するための方法において、
ａ）検体に交流電圧を印加するステップと、
ｂ）検体にわたってＥＩＳ測定の変化の速度を求めるステップと、
ｃ）変化速度のデータから検体の同定および／または量を決定するステップと
を含む方法を提供する。

本発明のこの第２の態様では、ＥＩＳ測定が、電子移動抵抗Ｒ_ｅｔの測定であると特に好ましい。リアルタイムで行われる典型的なＥＩＳ測定に関して、プローブフィルム形成およびプローブ−標的ハイブリダイゼーションに対して特に感度が高い１つのパラメータは、系内に存在する酸化還元対（例えば［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３−／４−}）の電子移動抵抗Ｒ_ｅｔである。このパラメータは当技術分野でよく知られており、ＥＩＳスペクトルのナイキストプロットにおける半円形状の幅から計算することができる。

本発明のこの態様は、ＩＤＥ測定プロトコルを提供して、電極表面との検体結合、またはプローブ−検体ハイブリダイゼーションによる検体結合に関するＥＩＳ応答のインサイチュでの速度論的測定を可能にする。複数の重畳された周波数の採用と同様に、はるかに短いＥＩＳ測定時間になる。また、第１の態様と同様に、任意の検体を検出することができ、検出法の詳細は、対象の検体のタイプに依存する。検体の中には、電極に直接結合することができるものがあり、また、電極の表面上でプローブまたは相補的分子に結合することができる検体もある。Ｒ_ｅｔデータの正確な特性は、対象の各特定のシステムに関して考えられる結合のタイプに依存する。

上で示唆したように、本発明のこの態様では、酸化還元プローブの２つの酸化状態（例えばヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩およびヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩）が溶液中に存在することが好ましい。これは、外部基準電極を使用せずに２つのＩＤＥ間に電位を印加することができる方法および手段全体にわたって、ＩＤＥでのＤＣ電位が酸化還元プローブの還元電位によって一定に保たれることを保証する。これは、ＥＩＳ応答を測定するために、ＩＤＥでの２つの電極間に小さな振幅のＥＩＳ摂動電圧を簡単に印加できるようにする。そのような測定は、溶液にさらしたときに経時的にＥＩＳ応答を測定できるようにする。

上述したように、現在知られているＥＩＳプロトコルは、電極／検体結合（またはプローブが電極に取り付けられている場合には検体／プローブ結合）の平衡への接近を測定する。これは、平衡を示唆する一定値に対してＥＩＳ信号を変化（典型的には増加）させる。この場合、測定が溶液中で行われるので、平衡のための時間および平衡ＥＩＳ信号は、リアルタイムで決定され、最適な平衡測定をもたらす。しかし、結果取得時間は遅い。なぜなら、結果を求めることができるようにするには、事前に完全な平衡が必要とされるからであり、そのような平衡は、検体の結合および解放の速度によって制御される時間のかかるプロセスであることが多い。本発明の第２の態様では、上述したように、溶液中の検体の濃度を決定するために、ＥＩＳ信号の増加の速度を使用して分析する。例えば、電極／検体結合（またはプローブ／検体結合）が速度論的に測定される。これは、数分以下のはるかに高速のＴＴＲを用いて実現することができ、完全な平衡に達する必要はない。

本発明では、ＥＩＳデータは、好ましくは、複素インピーダンス（ｘ＋ｉｙ）から導出されたデータパラメータを備える。これらのパラメータは、当技術分野でよく知られており、以下のうちの１つまたは複数から選択することができる。
・実数成分（ｘ）
・虚数成分（ｙ）
・母数または絶対値［ｒ＝｜ｚ｜＝（ｘ^２＋ｙ^２）^１／２］
・角度［θ＝ｔａｎ−１（ｙ／ｘ）］
・基本成分１
・基本成分２

本明細書で採用する重畳された周波数の数は、所要の精度での検体の同定および／または量を与えるためにＥＩＳを使用する分析に適しているという前提の下で、特に限定されない。典型的には、重畳された周波数の最小数は２〜２０である。より好ましくは、重畳された周波数の最小数は、少なくとも３〜１０、すなわち少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０である。より好ましくは、重畳された周波数の数は、約７である。

本発明はさらに、検体を検出するための方法において、
ａ）検体に交流電圧を印加するステップと、
ｂ）検体にわたってＥＩＳ測定の変化の速度を求めるステップと、
ｃ）変化速度のデータから検体の同定および／または量を決定するステップと
を含む方法を提供する。

本発明では、採用されるＥＩＳ測定のタイプは特に限定されない。しかし、好ましくは、ＥＩＳ測定は、電子移動抵抗Ｒ_ｅｔの測定である。典型的には、ＥＩＳ測定は、ナイキストプロットにおける半円形状の幅を求めることから計算される測定である。一般に、この手法を使用してＲ_ｅｔを計算することができる。

上述したように、本発明は液体媒体中で行うことが好ましい。好ましくは、プロセスを補助するように液体媒体が選択される。酸性媒体が好ましく、液体媒体は、好ましくはＨ_２ＳＯ_４を含む。

添付図面を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。

マクロ金電極（小さなＺ値）および櫛型マイクロ（ＩＭＥ）電極からのＥＩＳデータの典型的なナイキストプロットを示す図である。 マクロ電極と櫛型電極の両方に関して、陽性対照試料と固定化プローブに関するデータについて、周波数に対する実数成分（ｘ）、虚数成分（ｙ）、母数（ｒ）、角度（θ）、基本成分１、および基本成分２のプロットを示す図である。 約２３秒の同時のＦＦＴ解析を用いた通常の単一正弦波の逐次ＥＩＳ測定における金タンパク質マクロ電極（６７００ｐＭ抗体）のＥＩＳ応答を示す図である（黒−２分間の記録時間；赤−９秒間の５個の多重正弦波のＥＩＳ測定；青−９秒毎の１５個の多重正弦波ＥＩＳ測定）。 ６９ｍｅｒＨＣＶ ＤＮＡプローブで修飾され、１ｍＭ ＭＣＨでブロッキングされた金電極（菱形）と、１μＭの相補的標的（ＩＴＩ０２５）とのハイブリダイゼーション（正方形）とのナイキストプロットの比較を示す図である。インピーダンス測定は、ＩＤＥ対の電極間の印加ｄｃ電位を０Ｖにして、１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^３−と１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^４−（およびプローブまたは標的）を含む２ｘＳＳＣ中で行った。 ６９ｍｅｒＨＣＶ ＤＮＡプローブで修飾され、１ｍＭ ＭＣＨでブロッキングされた金電極（菱形）、１μＭの非相補的標的（ＩＴＩ０１２）とのハイブリダイゼーション（正方形）、ならびに１ｎＭ（三角形）および５０ｎＭ（円形）の相補的標的（ＩＴＩ０２５）とのハイブリダイゼーションのナイキストプロットの比較を示す図である。インピーダンス測定は、ＩＤＥ対の電極間の印加ｄｃ電位を０Ｖにして、１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^３−と１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^４−（およびプローブまたは標的）を含む２ｘＳＳＣ中で行った。 プローブ（チオール化ＤＮＡ）層形成中（菱形）、ＭＣＨでのブロッキング後（正方形）、１μＭの相補的標的とのハイブリダイゼーション中（三角形）、およびハイブリダイゼーション後の洗浄中（円形）の、時間に対するＲ_ｅｔのＥＩＳ測定を示す図である。 相補的標的（５０ｎＭ）結合および２０ｎＭ ＱＤ培養のＥＩＳ測定後の蛍光測定を示す図である。ＰＭＴ設定は１８０である。

本発明の２つの態様の方法は、既知の方法に勝る以下のようないくつかの特定の利点を有する。臨床環境要件に適合された数秒から数分の高速の結果取得時間（ＴＴＲ）；様々なプローブ−標的システムに対する手法の広い適用可能性；データ収集を向上するための高速の多重正弦波ＥＩＳとの適合性；電子的制御および測定とのＥＩＳ検出の適合性；標識を用いない検出。

本発明による方法の２つの態様において検出対象となる検体は、特に限定されないが、好ましくは生体分子である。好ましくは、検体は、細胞、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片、アミノ酸、ＤＮＡ、およびＲＮＡから選択される。本発明の方法は、特にＤＮＡおよびＲＮＡ検出に有用である。

本発明の方法を使用して、単一の検体を検出することも、複数の異なる検体を同時に検出することもできる。

好ましくは、本発明の方法は、標識を用いない方法であり、すなわち検出を補助するために検体に標識付けする必要がない。しかし、状況によっては標識を採用することもできる。例えば、複数の異なる検体を同時に検出するためにこの方法が使用されるとき、異なる検体それぞれに、その検体に関係付けることができる１つまたは複数の異なる標識を付けることができる。あるいは、複数の検体を空間的分離によって検出することができ、例えば、１つの表面上にそれらの検体のための１組のプローブを配列することによって検出することができる。複数の異なる検体の検出は、多重化としても知られている。

本発明の電気化学的検出法では、検体は、溶液として、または液体媒体中の懸濁液として調べられる。液体媒体は、ＥＩＳを使用する分析に適しているという前提の下で、特に限定されない。好ましくは、液体媒体は、ＥＩＳ測定を容易にするために電解液を含む。電解液は、ＰＢＳなど不活性イオンを含む溶媒または緩衝液である。典型的には、次いで、酸化還元活性種が、はるかに低い濃度で添加される。電解液は、特に限定されず、当技術分野で知られている任意の電解液を含むことができる。しかし、Ｆｅ（ＩＩ）／Ｆｅ（ＩＩＩ）電解液系など、遷移金属の酸化還元系を含む電解液が好ましい。［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３−／４−}が特に好ましい。

異なる検体に標識付けするために複数の異なる標識が使用される場合、好ましくは、各標識は、電気化学的検出法に関して異なる酸化電位を有し、したがって得られるデータにおいて異なる信号ピークを生成する。例えば、異なる検体のための標識として金属ナノ粒子を使用するとき（下記参照）、各検体に対して、異なる酸化電位を有する異なる金属を使用することができる。

好ましい実施形態では、電極に印加される交流電位は、特に限定されず、採用される媒体に応じて決まる。したがって、実際には、ＥＩＳに関する上限の振幅は、溶媒の限界によって定められる（水の場合、約１〜２Ｖのｒｍｓ振幅を与えると、約２Ｖ）。したがって、水性媒体中では、電位は、＋１．０〜＋２．０Ｖ、好ましくは＋１．２Ｖ〜＋１．８Ｖにすることができる。系内で酸化還元種を使用するときには、酸化種と還元種の両方が存在し、これにより、典型的には２５０ｍＶ未満の振幅が使用される。より好ましい実施形態では、電極間に印加される交流電圧は、約１０ｍＶの二乗平均平方根（ｒｍｓ）振幅である。これは、例えば等価回路解析のために応答を線形化することができるようにする。より高い振幅の応答を使用することもできる（統計的方法を採用して特徴信号を抽出する場合、特徴信号は異なる／有利であることがある）。

好ましい実施形態では、電気的検出法はチップ上で行われる。光学的検出のために標識が使用される本発明の多重化実施形態では、検体が異なる標識を付けられているとき、光学的検出と電気的検出を１つのチップ上で同時に行うことができる。あるいは、検体が２つのアリコートに分離されており、別々に標識付けされている場合、１つのチップ上で光学的検出および電気的検出を行うために、標識付けした後にそれらを組み合わせることができ、または２つの別個のチップ上で別々に電気的検出を行うことができる。

本発明の一実施形態では、検体は核酸であり、標識付けステップは、標識付けされたプライマ、および標識付けされたヌクレオチドを用いたプライマ伸長を使用して行われる。標識付けされて伸長されたプライマは、光学的検出および電気的検出のためにプローブにハイブリダイゼーションすることができる。これは、電気的検出用の標識を検出用の電極に近接して位置決めするので、特に有利である。

ＥＩＳを使用して、存在する検体の量をボルタンメトリによって定量化することができる。定量データは、信号ピークから積分によって得ることができ、すなわち、生成された各信号ピークに関してグラフの下の面積を求めることによって得ることができる。

標識付けを採用する実施形態
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、特に多重化が望まれるときに標識が採用される。言及される標識は、特に限定されないが、好ましくは、ナノ粒子、単一分子、特定のヌクレオチドやアミノ酸など標的の固有成分、および化学発光酵素である。適切な化学発光酵素は、ＨＲＰおよびアルカリホスファターゼを含む。蛍光標識は、それらの標識の光学的検出が本発明の電気化学的方法と容易に組み合わされるので、特に好ましい。

好ましくは、標識はナノ粒子である。ナノ粒子は、電気的検出法で良く機能するので、本発明のこれらの実施形態で特に有利である。表面に対するナノ粒子の近接性は特に重要ではなく、このことが、アッセイをより融通性のあるものにする。好ましい実施形態では、ナノ粒子は、分子の集合体を含む。なぜなら、光学的検出法および電気的検出法において、分子の集合体は、単一分子が使用されるときよりも大きい信号を生み出すからである。

好ましくは、ナノ粒子は、金属、金属ナノシェル、金属二元化合物、および量子ドットから選択される。好ましい金属または他の元素の例は、金、銀、銅、カドミウム、セレン、パラジウム、および白金である。好ましい金属二元化合物および他の化合物の例としては、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＨｇＩ、ＺｎＴｅ、ＧａＡｓ、ＨｇＳ、ＣｄＡｓ、ＣｄＰ、ＺｎＰ、ＡｇＳ、ＩｎＰ、ＧａＰ、ＧａＩｎＰ、およびＩｎＧａＮが挙げられる。

金属ナノシェルは、薄い金属シェルによって取り囲まれたコアナノ粒子を備える球状ナノ粒子である。金属ナノシェルの例は、薄い金シェルによって取り囲まれた硫化金またはシリカのコアである。

量子ドットは、高い吸光性のルミネセンスナノ粒子である半導体ナノ結晶である（Ｗｅｓｔ Ｊ，Ｈａｌａｓ Ｎ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００３，５：２８５−２９２“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｓｅｎｓｉｎｇ，Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”）。量子ドットの例は、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＨｇＩ、ＺｎＴｅ、ＧａＡｓ、ＨｇＳ、ＣｄＡｓ、ＣｄＰ、ＺｎＰ、ＡｇＳ、ＩｎＰ、ＧａＰ、ＧａＩｎＰ、およびＩｎＧａＮナノ結晶である。

上記の標識の任意のものを抗体に取り付けることができる。

標識のサイズは、好ましくは直径２００ｎｍ未満、より好ましくは直径１００ｎｍ未満、さらに好ましくは直径２〜５０ｎｍ、さらに好ましくは直径５〜５０ｎｍ、さらに好ましくは直径１０〜３０ｎｍ、最も好ましくは１５〜２５ｎｍである。

本発明の方法が複数の検体を検出する目的のものであるとき、異なる検体がそれぞれ、その検体に関係付けることができる１つまたは複数の異なる標識を付けられる。本発明のこの態様では、標識は、それらの組成および／またはタイプにより異なることがある。例えば、標識がナノ粒子であるとき、標識は、異なる金属ナノ粒子でよい。ナノ粒子が金属ナノシェルであるとき、異なる標識を生成するためにコアおよびシェル層の寸法を変えることができる。代替または追加として、標識は、異なる物理的特性、例えばサイズ、形状、および表面粗さを有する。一実施形態では、標識は、同じ組成および／またはタイプ、ならびに異なる物理的特性を有することができる。

異なる検体のための異なる標識は、好ましくは、光学的検出法および電気的検出法において互いに区別可能である。例えば、標識は、異なる発光周波数、異なる散乱信号、および異なる酸化電位を有することがある。

多重化など、標識付けが採用される本発明の実施形態では、方法は、典型的には、標識付けされた検体を生成するために検体に１つまたは複数の標識を付けるさらなる初期ステップを含む。

検体に標識付けするための手段は特に限定されず、多くの適切な方法が当技術分野でよく知られている。例えば、検体がＤＮＡまたはＲＮＡであるとき、標識結合プライマ、ハイブリダイゼーション後の配位子もしくは反応部位への標識付け、または標識付けされていない標的と標識−オリゴヌクレオチドコンジュゲートプローブの「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションによって標識付けすることができる（Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ Ｗ，Ｔａｔｏｎ Ｔ Ａ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（２００３）Ｒ６３−Ｒ７３“Ｍｅｔａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｌａｂｅｌｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ，ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”）。

オリゴヌクレオチドをナノ粒子にコンジュゲートするための多くの異なる方法が当技術分野で知られており、例えば、チオール修飾およびジスルフィド修飾オリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子表面、スルフィドおよびトリスルフィド修飾コンジュゲート、オリゴチオールナノ粒子コンジュゲート、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅのホスフィン修飾ナノ粒子からのオリゴヌクレオチドコンジュゲートと自発的に結合する（Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ Ｗ，Ｔａｔｏｎ Ｔ Ａ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（２００３）Ｒ６３−Ｒ７３“Ｍｅｔａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｌａｂｅｌｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ，ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”の図２参照）。

一実施形態では、ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖は、どちらもビオチン標識されることがある。ビオチン標識された標的鎖は、オリゴヌクレオチドプローブでコーティングされた磁気ビーズにハイブリダイゼーションすることができる。このとき、ストレプトアビジンでコーティングされた金ナノ粒子が、捕獲された標的鎖に結合することができる（Ｗａｎｇ Ｊ，Ｘｕ Ｄ，Ｋａｗｄｅ Ａ，Ｐｏｓｌｋｙ Ｒ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１），７３，５５７６−５５８１“Ｍｅｔａｌ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”）。磁気ビーズは、ハイブリダイゼーションしていないＤＮＡの磁気的除去を可能にする。

本発明のＥＩＳ法は、多くの異なる特定の方法で採用することができる。しかし、それらは、インピーダンス測定プロテアーゼ活性検出など、プロテアーゼ検出に特に適している。図８は、この実施の様子を示す概略図である。プロテアーゼの活性を測定するために、その基質（特定のペプチド）が、ＡＣインピーダンス（Ａ）を測定するのに適した電極またはデバイス、例えば本発明の方法で使用されるデバイスに固定化される。系は、概略的なグラフに（Ａ）で示される初期インピーダンス挙動を示す。所望のプロテアーゼを含む試料を含む系の培養（Ｂ）は、固定化されたペプチドの短縮をもたらし、これは、インピーダンス信号の変化、例えば概略的なグラフに（Ｃ）で示されるＲ_ｅｔ値の減少をもたらす。このタイプの構成では、（メディエータ、例えばヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩／ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩を用いる、および用いない）ファラデーモードまたは非ファラデーモードでシステムを動作させることができることがある。

本発明のこの態様の利点は、プロテアーゼ活性を測定するために試験中に追加の試薬を加える必要がないことである。このシステムは、同じ試料および反応空間内で多くのプロテアーゼを測定することができるので、多重化できる可能性がある。また、このシステムは、速度論的なインピーダンス測定を多重化して行うことができるので、従来のシステムよりもはるかに高速となる可能性がある。

任意のプロテアーゼを検出することができ、プロテアーゼのタイプは特に限定されない。しかし、いくつかの実施形態では、創傷に関連付けられるプロテアーゼが採用される。典型的には、これらのプロテアーゼは、治癒していない創傷に存在するものである。特に興味深い２つのプロテアーゼは、ＭＭ８とＭＭ９である。

単に例として、本発明をさらに説明する。

実施例１−多重周波数解析のためのＥＩＳパラメータの考察
本発明の第１の態様の方法で使用するための最適なパラメータを得るために、任意のＥＩＳセットアップを採用することができる。しかし、典型的には、パラメータができるだけ最適に近くなることを保証するために、最終的な分析に関連する電極、電解液、液体媒体、検体（および使用される場合にはプローブ）が採用される。

この実施例では、Ａｂｔｅｃｈからの市販の金ＩＤＥ上でのプローブ−標的ハイブリダイゼーションを研究した。電気化学的洗浄サイクルを使用し、清浄な金電極の安定なサイクリックボルタモグラム（ＣＶ）特性が見られるまで、３０〜４０回の完全なサイクルにわたって、５０ｍＭの水性Ｈ_２ＳＯ_４溶液中のＡｇ／ＡｇＣｌを基準とした−０．６Ｖ〜＋１．６５Ｖの間の線形電位掃引を、５０ｍＶの掃引速度でＩＤＥ対の両方の電極に加えた。ＤＮＡ（６９−ｍｅｒ ＩＴＩ０２１）溶液を調製する前に、ジスルフィドで保護されたヌクレオチドの開裂後に、ＤＮＡプローブを、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（商標）Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ））に通すことによって５ｍＭのＴＣＥＰ溶液を用いて浄化した。

マクロ金電極と櫛型マイクロ（ＩＭＥ）電極の両方に関して、ＥＩＳに関する大きな周波数範囲のナイキストプロットをプロットした。これらを図１に示す。それぞれが、相補的標的結合に関する異なる信号を示す。

陽性対照試料（相補的標的が結合されているプローブ）と、陰性対照試料（プローブのみ、または非相補的標的を有するプローブ）との差を、複素インピーダンスから導出されるパラメータに関して比較した。複素インピーダンスは、ｘ＋ｉｙと書くことができ、ここでｉは（−１）^１／２である。これらは以下のものである。
・実数成分（ｘ）
・虚数成分（ｙ）
・母数または絶対値［ｒ＝｜ｚ｜＝（ｘ^２＋ｙ^２）^１／２］
・角度［θ＝ｔａｎ^−１（ｙ／ｘ）］
・基本成分１
・基本成分２

これらの量それぞれに関して、周波数の対数に対してプロットすることによって、これらの差を検査した（図２参照）。

図２は、大きな（マクロ）電極と小さな（櫛型マイクロ）電極との両方に関して、実数成分と母数が同様の情報を提供し、特に周波数範囲の下端で、陽性対照試料と固定化プローブからのＥＩＳ信号を最も良く判別することを示す。虚数成分は、周波数範囲の中央でＥＩＳ信号を最も良く判別する。

ＴＴＲを最適化するために、本発明は、すべての実験条件に関して異なるＥＩＳデータを最も良く判別する測定の最も有用な周波数範囲および最小数を選択する。等価回路など適合モデルを採用する必要はない。この実施例での統計分析は、陽性対照試料と固定化プローブのＥＩＳ信号間の倍率変化を使用して、マクロ金電極と櫛型マイクロ電極（ＩＭＥ）の両方に関して７点最適周波数範囲を決定した。

それらの結果を表１にまとめる。

両タイプの電極に関して、母数データおよび実数成分は、約１桁の周波数にわたり、ＥＩＳ測定に関する非常に似た最適周波数範囲を与えることに注目すべきである。両タイプの電極に関して、虚数成分は、やはり１桁の周波数にわたり、実数および母数データに関するものよりもわずかに高い周波数で最適な信号を与える。マクロからＩＭＥへの電極寸法の非常に大きな変化は、測定のための最適な周波数範囲にはほとんど影響がなく、応答が電極面積とはほぼ無関係であることに合致し、これはＥＩＳ測定を単純化する。倍率変化を使用した相補的ハイブリダイゼーションとモックハイブリダイゼーションの示差分析は、相補的ハイブリダイゼーションと固定化プローブの信号（表２）のものと同様の最適な周波数範囲を与え、同じ測定範囲を使用することができることを裏付けた。

これらのデータを高速で得ることができるようにするために、多重正弦波技法を採用して、必要な複数の周波数に同時にＦＦＴを適用して結果を分析し、これらのデータを抽出している。図３は、タンパク質マクロ電極実験システムについて、５個の多重正弦波（１桁の周波数にわたる）と１５個の多重正弦波（２桁の周波数にわたる）のＥＩＳ測定に関して、測定された応答に対する従来使用されている単一正弦波の逐次適用の方法でのＥＩＳナイキストプロットの比較を示す。実験データ収集、分析、および表示は、逐次適用に関して数分でＰＣ上で実現された。５個の正弦波に関しては約７秒、１５個の正弦波に関しては約２３秒であった。この多重正弦波実験に関する成分周波数は、統計分析によって決定される周波数範囲にわたるように選択されており、これは、図示されるＥＩＳナイキストプロットにおける電荷移動の半円形状にわたる。すべてのデータの非常に近い対応関係（典型的には０．０５％以内）は、多重正弦波ＥＩＳ手法が、測定の精度を損なわずに、数秒のＥＩＳ測定および分析（したがってＴＴＲ）に適合するより高速のＥＩＳパラメータをもたらすことを示す。

実施例２−ＥＩＳを使用するリアルタイム速度論測定の検査
この実施例では、Ａｂｔｅｃｈからの市販の金ＩＤＥ上でのプローブ−標的ハイブリダイゼーションの速度論を研究した。電気化学的洗浄サイクルを使用し、清浄な金電極の安定なサイクリックボルタモグラム（ＣＶ）特性が見られるまで、３０〜４０回の完全なサイクルにわたって、５０ｍＭの水性Ｈ_２ＳＯ_４溶液中のＡｇ／ＡｇＣｌに対する−０．６Ｖ〜＋１．６５Ｖの間の線形電位掃引を、５０ｍＶの掃引速度でＩＤＥ対の両方の電極に加えた。ＤＮＡ（６９−ｍｅｒ ＩＴＩ０２１）溶液を調製する前に、ジスルフィドで保護されたヌクレオチドの開裂後に、ＤＮＡプローブを、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（商標）Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ））に通すことによって５ｍＭのＴＣＥＰ溶液を用いて浄化した。

洗浄の直後に、チオール化ＤＮＡプローブ層を、室温で、２ｘＳＳＣ緩衝液およびそれぞれ１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^３−と［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^４−（１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３−／４−}）中の１０μＭのＤＮＡ溶液中に浸漬した。ＥＩＳ測定は、電極をＤＮＡ溶液中に浸漬した直後に開始し、３〜４時間続けた。前述したように、［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^３−と［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^４−が等濃度で存在することにより、各電極のＤＣ電位が［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３−／４−}の還元電位で一定に保たれることが保証されるので、これらの実験全体にわたって、ＤＣ電圧を０Ｖにして、ＩＤＥ対の電極間に１０ｍＶのＲＭＳ振幅の正弦電圧を印加した。次いで、修飾した表面を、数分間２ｘＳＳＣで洗浄し、室温で３０分間、水中のＭＣＨ１ｍＭでブロッキングした。２ｘＳＳＣ緩衝液での１０〜２０分間の洗浄後、電極ＥＩＳ信号を、１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＭ）_６］^{３−／４−}を含む２ｘＳＳＣ緩衝液中で再び測定し、ブロッキングステップ後の変化を調べた。次いで、電極を、１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３−／４−}を含む２ｘＳＳＣ中に溶解された標的（相補的または非相補的）ＤＮＡ中に浸漬して、再び０ＶのＤＣでＥＩＳ測定を行った。

図４は、１μＭの相補的標的（ＩＴＩ０２５）とのハイブリダイゼーションの前後での、これらの６９−ｍｅｒチオール化ＤＮＡ修飾プローブ電極の典型的なインピーダンスプロットを示す。高周波数の半円が、マクロ電極とＩＤＥ電極の両方に共通の特徴であり、電極表面でのプローブフィルム層を通る電荷移動に関する情報を与える。１μＭの相補的標的の追加後、予想通り、プローブ層内での相補的標的−プローブ結合により、この高周波数での半円の直径が増加し、その一方で、より低い周波数での拡散特徴は実質的に変化せず、これは、（予想通り）電極間での拡散に対する影響がほとんどないことを示す。

図５は、同様に調製されたＩＤＥの別の例を示す。この場合には、ブロッキング後に陰性対照を行った。すなわち、数時間にわたって、２ｘＳＳＣ中に１μＭの非相補的（ＩＴＩ０１２）標的と１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３−／４−}を含む溶液中でＥＩＳを監視した。予想通り、インピーダンス信号の変化は観察されず、非相補的標的−プローブ結合は示されなかった。この後、電極を２ｘＳＳＣ緩衝液中でリンスし、２ｘＳＳＣ中に１μＭの相補的標的ＤＮＡと１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３−／４−}を含む溶液中で応答を測定した。１時間後、応答が安定したとき、電極を５０ｎＭの標的溶液中に浸漬して、一晩測定した。プローブと１ｎＭ標的の相違は小さいが有意であり、５０ｎＭに関しては相違が明確に見られる。したがって、ＥＩＳは、平衡するまで待つ確立された方法を使用して相補的標的の結合を調べている。

次に、図６は、リアルタイムで行った典型的なＥＩＳ測定を示す。すなわち、プローブフィルム形成およびプローブ−標的ハイブリダイゼーションに対して感度が高いパラメータは、［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３−／４−}に関する電子移動抵抗Ｒ_ｅｔであり、これは、ＥＩＳスペクトルそれぞれのナイキストプロットにおける半円形状の幅を求めることから計算されている。これは、この図では時間の関数としてプロットされている（電子移送に対するＲ_ｅｔとして）。

これらのデータは、多くの情報を含み、プローブフィルムの確立（菱形）、ブロッキングおよび洗浄（正方形）、プローブ−標的ハイブリダイゼーションの速度論的推移（三角形）を示す。金電極がプローブフィルム溶液にさらされるとき（菱形）、Ｒ_ｅｔの値は、プローブフィルム形成により、最初の約１時間にわたって上昇し、次いで３〜４時間後に定常状態値に低下して、安定な表面フィルムを示す。プローブ溶液を除去して洗浄することによって、観察される値の変化がほとんどないので、この安定性が裏付けられる。［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３−／４−}を含む緩衝液（正方形）中で経時的に抵抗を測定するとき、残りの金表面をブロッキングするためにメルカプトヘキサノール（ＭＣＨ）を添加しても、抵抗の変化はほとんど生じず、これも安定なプローブフィルムを示す。安定なプローブフィルムを確立した後、次いで、速度論的技法を使用して、相補的標的およびヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩／ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩を含む溶液中でのプローブ−標的結合を監視する。プローブフィルムをこの溶液にさらすと（三角形）、相補的標的−プローブ結合によりＲ_ｅｔの即時の上昇が見られる。初期応答は即時であり、最初の時点がＲ_ｅｔの増加を示し、最初の１時間以内で値は２倍を超える。この方法は、数秒毎に、速度論的にＥＩＳ応答の測定を可能にする（多重正弦波ＩＤＦ参照）。プローブ−標的結合の増加の速度は、典型的には、標的濃度の１次である（標的濃度に確実に依存する）ことが予想される。したがって、このとき、ＥＩＳの上昇の速度の分析は、数秒から数分の時間尺度で標的濃度を与えることができる。この後、インピーダンスは、数時間にわたってよりゆっくりと増加し、平衡応答に向けて長時間かけて接近し、これは平衡測定のＴＴＲを制限すると考えられる。標的溶液を除去し、洗浄し、次いで［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３−／４−}を含む緩衝液中で応答を測定すると（円形）、Ｒ_ｅｔの遷移変化後、値は、前に観察された値に始めに戻り、これは、応答がプローブ−標的結合を示唆していることを示す。

プローブ層形成およびハイブリダイゼーションが金電極で行われたことを確認するために、アビジン標識付きの標的を使用し、このとき、ストレプトアビジン標識されたＱｄｏｔ（ＱＤ緩衝液中で２０ｎＭ）で培養した（室温で１時間）。

得られた蛍光画像（図７）から、予想通り、最高の蛍光強度の領域がＩＤＥの金フィンガ上にあることは明らかである。これは、ハイブリダイゼーション後に観察されたＲ_ｅｔの増加が、金ＩＤＥ表面上でのフィルムにおけるプローブ−標的ハイブリダイゼーションに起因するものであることを裏付ける。

Claims (26)

1. 検体を検出するための方法において、
   （ａ）前記検体に交流電圧を印加するステップであって、前記交流電圧は、ＥＩＳによって前記検体の存在を見分けるのに十分な複数の重畳された周波数を含む、ステップと、
   （ｂ）前記検体にわたってＥＩＳ測定結果の変化の速度を求めるステップと、
   （ｃ）変化速度のデータから前記検体の同定および／または量を決定するステップと、
   を含み、分析スピードが増すようにステップ（ｂ）がリアルタイムで実施され、
   前記ＥＩＳ測定が、電子移動抵抗Ｒ _ｅｔ の測定であり、
   前記変化速度のデータが、電極表面との検体結合またはプローブ−検体ハイブリダイゼーションに基づくものであることを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記ＥＩＳ測定が、ナイキストプロットにおける半円形状の幅を求めることから計算される測定であることを特徴とする方法。
3. 請求項１又は２に記載の方法において、ＥＩＳ測定を補助するために電解液がシステムに追加されることを特徴とする方法。
4. 請求項３に記載の方法において、前記電解液が遷移金属錯体であることを特徴とする方法。
5. 請求項４に記載の方法において、前記遷移金属錯体が、［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^３−／^４−系を含むことを特徴とする方法。
6. 請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、ＥＩＳ測定を補助するために液体媒体がシステムで採用されることを特徴とする方法。
7. 請求項６に記載の方法において、前記液体媒体がＨ_２ＳＯ_４を含むことを特徴とする方法。
8. 請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法において、前記方法が２つ以上の検体を分析する目的のものであり、さらに、標識によって互いに区別できるように標識付けされた検体を形成するために、各検体に１つまたは複数の標識を付けるステップを含むことを特徴とする方法。
9. 請求項８に記載の方法において、前記１つまたは複数の標識が、光学的検出および／または電気的検出に適していることを特徴とする方法。
10. 請求項９に記載の方法において、前記標識が、ナノ粒子、単一分子、化学発光酵素、および蛍光体から選択されることを特徴とする方法。
11. 請求項１０に記載の方法において、前記標識が、分子および／または原子の集合体を含むナノ粒子であることを特徴とする方法。
12. 請求項１１に記載の方法において、前記ナノ粒子が、金属、金属ナノシェル、金属二元化合物、および量子ドットから選択されることを特徴とする方法。
13. 請求項１１に記載の方法において、前記ナノ粒子が、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＨｇＩ、ＺｎＴｅ、ＧａＡｓ、ＨｇＳ、ＣｄＡｓ、ＣｄＰ、ＺｎＰ、ＡｇＳ、ＩｎＰ、ＧａＰ、ＧａＩｎＰ、およびＩｎＧａＮから選択される金属化合物を含むことを特徴とする方法。
14. 請求項１１に記載の方法において、前記ナノ粒子が、金、銀、銅、カドミウム、セレン、パラジウム、および白金から選択される金属を含むことを特徴とする方法。
15. 請求項１０乃至１４の何れか１項に記載の方法において、前記ナノ粒子が、直径１００ｎｍ未満であることを特徴とする方法。
16. 請求項９に記載の方法において、前記光学的検出法が、吸着された色素からの発光検出、吸光検出、光散乱検出、スペクトルシフト検出、表面プラズモン共鳴撮像、および表面増強ラマン散乱から選択されることを特徴とする方法。
17. 請求項９乃至１６の何れか１項に記載の方法において、前記光学的検出が発光検出であり、前記標識を活性化し、前記標識からの発光の周波数および強度を検出することができる光で、前記標識付けされた検体を照射するステップを含むことを特徴とする方法。
18. 請求項１７に記載の方法において、前記光がレーザ光であることを特徴とする方法。
19. 請求項１７または１８に記載の方法において、前記光が、赤外光、可視光、およびＵＶ光から選択されることを特徴とする方法。
20. 請求項１９に記載の方法において、前記光が白色光であることを特徴とする方法。
21. 請求項１乃至２０の何れか１項に記載の方法において、前記検体が、細胞、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片、アミノ酸、ＤＮＡ、およびＲＮＡから選択される１つまたは複数の化合物を含むことを特徴とする方法。
22. 請求項２１に記載の方法において、前記検体がプロテアーゼであることを特徴とする方法。
23. 請求項２２に記載の方法において、前記プロテアーゼが創傷治癒に関連付けられるプロテアーゼであることを特徴とする方法。
24. 請求項２３に記載の方法において、前記創傷治癒に関連付けられるプロテアーゼがＭＭ８またはＭＭ９であることを特徴とする方法。
25. 請求項２２に記載の方法において、前記検体が前記ＥＩＳによって検出されることを特徴とする方法。
26. 創傷治癒の検出のための請求項２２または２５に記載の方法。
    

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