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JP6018068B2 - 細胞の増殖抑制方法、ｎｅｋ１０バリアント遺伝子に対するｒｎａ干渉作用を有する核酸分子、及び抗癌剤 - Google Patents

細胞の増殖抑制方法、ｎｅｋ１０バリアント遺伝子に対するｒｎａ干渉作用を有する核酸分子、及び抗癌剤 Download PDF

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Description

本発明は、細胞の増殖抑制方法、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有する核酸分子、細胞内に当該核酸分子を発現させるための発現ベクター、当該核酸分子を含む、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子発現抑制用組成物、当該核酸分子を有効成分とする抗癌剤、及び抗癌剤のスクリーニング方法に関する。
癌は、近年の日本における第１位の死因であり、毎年３０、００００以上が癌により亡くなっている。癌の検出及び治療は進歩しているにもかかわらず、癌の死亡率は依然として高いままである。癌の化学療法として、近年、グリベック（登録商標）やハーセプチン（登録商標）等の分子標的抗癌剤が注目を集めているが、効果を示す患者が限定されるため、新たな分子標的抗癌剤の開発が望まれている。
１９７０年代初頭に、ＮＩＭＡ ｋｉｎａｓｅがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓから、また、ＮＩＭＡ ｋｉｎａｓｅのホモログであるＦｉｎ１が分裂酵母から発見された。ＮＩＭＡ ｋｉｎａｓｅはセリン／スレオニンキナーゼファミリーに属し、細胞周期のＭ期に重要であることが示された。すなわち、ＮＩＭＡ ｋｉｎａｓｅは、Ｍ期への進入、染色体の凝集、紡錘体の形成及び細胞質分裂の制御において中心的役割を有する分子であることが明らかとなった（例えば、非特許文献１参照）。
ヒトのＮＩＭＡ ｋｉｎａｓｅのホモログは、ＮＩＭＡ ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅｓ（ＮＥＫ）でありＮＥＫ１から１１まで存在し、ＮＥＫファミリーを形成する。これまでに、ＮＥＫファミリーは細胞周期及びシグナル伝達経路に重要な分子であることがわかっている。例えば、ＮＥＫファミリーのうちのＮＥＫ２、ＮＥＫ６、ＮＥＫ７、及びＮＥＫ９は、ＮＩＭＡ ｋｉｎａｓｅ及びＦｉｎ１と同様に、Ｍ期への進入、染色体の凝集、紡錘体の形成及び細胞質分裂の制御に関与すると報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
ＮＥＫ１０については、ＵＶ照射に対する応答におけるＧ２／Ｍ期チェックポイント制御に重要であるとの報告がある（例えば、非特許文献３参照）。また、ＮＥＫ１０遺伝子に存在するＳＮＰが乳癌の罹患率に関与することが報告されている（例えば、非特許文献４及び５参照）。但し、ＮＥＫ１０が細胞、特に癌細胞の増殖に関与しているかについては、不明であった。また、ＮＣＢＩのデータベースには、ヒトＮＥＫ１０バリアントと推測される分子（アクセッション番号：ＡＫ０９８８３２．１、以下、ヒトＮＥＫ１０バリアント）が登録されている。他のＮＥＫファミリー分子と同様にキナーゼドメインを有することから、ヒトＮＥＫ１０バリアントも細胞周期制御に関わっている可能性があるものの、生体内でどのような機能を持つかは不明であった。
Ｍ．Ｊ．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，ｖｏｌ．１３，ｐ．２２１〜２２８． Ｌ．Ｏ’Ｒｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， ２００７，ｖｏｌ．２，ｐ．２５〜３６． Ｌ．Ｓ．Ｍｏｎｉｚ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，ｖｏｌ．３１，ｐ．３０〜４２． Ｓ．Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ, ２００９， ｖｏｌ．４１， ｐ．５８５〜５９０. Ａ．Ｃ．Ａｎｔｏｎｉｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，ｖｏｌ．７０，ｐ．９７４２〜９７５４.
本発明は、細胞の増殖抑制方法、抗癌剤として有用な核酸分子、及び新たな抗癌剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明者は、ヒトＮＥＫ１０バリアントと相同性を有する分子がマウスにも存在し、ＮＥＫ１０バリアントが種を超えて保存されていることから、ＮＥＫ１０バリアントは細胞増殖や細胞周期制御に重要であると考え、生体内での機能が不明であったＮＥＫ１０バリアントについて鋭意研究を行った。その結果、本発明者は、細胞においてＮＥＫ１０バリアントの発現が抑制されると細胞増殖抑制が起こること、及びＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有する核酸（ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ）が細胞、特に癌細胞に対する細胞増殖抑制作用を有することを見出し、本願発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記の構成をとる。
（１） 細胞において、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を低下させる発現低下工程、又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性を低下させる活性低下工程を含む、細胞の増殖抑制方法。
（２） 前記発現低下工程が、ＲＮＡ干渉によりＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を抑制する核酸分子、前記核酸分子の前駆体、及び、前記核酸分子又は前記前駆体を発現し得る発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種を細胞に導入する工程である、前記（１）に記載の細胞の増殖抑制方法。
（３） 前記核酸分子が、配列番号２又は４で表される、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｍＲＮＡ中の塩基配列を標的とする、ＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡであり、
前記前駆体が、配列番号２又は４で表される、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｍＲＮＡ中の塩基配列を標的とするＲＮＡ干渉作用を有するｓｈＲＮＡである、前記（２）に記載の細胞の増殖抑制方法。
（４） 前記核酸分子が、
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号３で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号５で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列中の１５〜２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列中の１５〜２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｆ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、並びに、
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
からなる群より選択される、前記（２）又は（３）に記載の細胞の増殖抑制方法。
（５） 前記前駆体が、細胞内において、
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号３で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号５で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列中の１５〜２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列中の１５〜２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｆ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、又は
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
の何れかを産生する核酸分子である、
前記（２）〜（４）の何れか一つに記載の細胞の増殖抑制方法。
（６） 前記前駆体が、
（ｐ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号３で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ；あるいは
（ｑ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号５で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ；
であり、かつ
細胞内において、前記（ｐ）のｓｈＲＮＡ及び前記（ｑ）のｓｈＲＮＡから、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが産生される、前記（２）に記載の細胞の増殖抑制方法。
（７） 前記細胞が癌細胞である、前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の細胞の増殖抑制方法。
（８） （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号３で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号５で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列中の１５〜２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列中の１５〜２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｆ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、又は、
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
である、核酸分子。
（９） （ｐ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号３で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ；あるいは
（ｑ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号５で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ、
であり、細胞内において、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡを産生するための前駆体である、核酸分子。
（１０） 前記（８）又は（９）に記載の核酸分子を含み、当該核酸分子を発現させ得る、発現ベクター。
（１１） 前記（８）に記載の核酸分子、前記（９）に記載の核酸分子、及び前記（１０）に記載の発現ベクターからなる群より選択される１種以上を含む、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子発現抑制用組成物。
（１２） 前記（８）に記載の核酸分子、前記（９）に記載の核酸分子、及び前記（１０）に記載の発現ベクターからなる群より選択される１種以上を有効成分として含む、抗癌剤。
（１３） ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現に対する抑制効果又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性に対する抑制効果を指標とする、抗癌剤のスクリーニング方法。
（１４） ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現抑制効果、又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性に対する抑制効果についての候補物質の存在下及び非存在下で、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞をそれぞれ培養する工程；及び
当該細胞内のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現量、又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性量を測定し、当該候補物質存在下及び非存在下での発現量又は活性量を比較する工程；
を含む、前記（１３）に記載の抗癌剤のスクリーニング方法。
本発明の細胞の増殖抑制方法により、ＮＥＫ１０バリアント活性の低下という新規な経路に作用することによって、細胞の増殖を抑制することができる。また、本発明の核酸分子は、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有する物質であり、本発明の細胞の増殖抑制方法に好適に用いられる。すなわち、本発明の細胞の増殖抑制方法及び核酸分子は、癌の治療において極めて有用であり、従来の増殖抑制方法によっては効果が得られなかった癌患者に対しても抗腫瘍効果を示すことが期待できる。
また、本発明の抗癌剤のスクリーニング方法により、新たな抗癌剤の候補化合物を取得することができる。
実施例１において、コントロール ｓｉＲＮＡ処理時のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現を１００とした場合の、各ｓｉＲＮＡ処理群の相対的なＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現量を示した図である。 実施例１において、コントロール ｓｉＲＮＡ処理時の細胞増殖を１００とした場合の、各ｓｉＲＮＡ処理群の細胞増殖率を示した図である。
＜細胞の増殖抑制方法＞
本発明の細胞の増殖抑制方法は、細胞において、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を低下させる発現低下工程、及び/又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質（ＮＥＫ１０バリアント遺伝子がコードするタンパク質）の活性を低下させる活性低下工程を含むことを特徴とする。細胞内におけるＮＥＫ１０バリアントタンパク質の機能を抑制することにより、細胞の細胞増殖を抑制することができる。これは、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質が、細胞における細胞増殖に関与しているために生じる現象と考えられる。ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性を低下させる方法は、特に限定されるものではなく、細胞内における特定の遺伝子の発現又はタンパク質の活性を低下させる際に用いられる公知の手法のいずれを用いてもよい。
ＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性を低下させる方法としては、例えば、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質に対する抗体等の、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質に結合する物質を細胞内に導入し、当該物質を細胞内のＮＥＫ１０バリアントタンパク質と結合させることによってＮＥＫ１０バリアントタンパク質が他の生体分子と相互作用することを抑制する方法が挙げられる。ＮＥＫ１０バリアントタンパク質に結合する物質を細胞内へ導入する方法は特に限定されるものではなく、当該物質をインジェクション等により直接細胞内へ導入してもよく、当該物質を細胞表面上に接触させてエンドサイトーシス等により細胞内へ取り込ませてもよい。その他、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質はＮＥＫ１０タンパク質と同様にキナーゼ活性を持つことが、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質の構造から推測される。したがって、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性は、細胞内に、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質のキナーゼ活性部位を欠失又は置換したドミナントネガティブ体を発現させることによって抑制することも可能である。
一方、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を低下させる方法としては、ＲＮＡ干渉法によりＮＥＫ１０バリアント遺伝子をノックダウンする方法を挙げることができる。具体的には、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｍＲＮＡ（ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ）を標的とする、アンチセンス核酸、リボザイム核酸、又は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）等のＲＮＡ干渉を誘導する核酸分子を、細胞内へ導入し、当該細胞内のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡを分解させる。
一般的にＲＮＡ干渉とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の一部と相同な配列からなるセンスｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）及びこれと相補的な配列からなるアンチセンスｓｉＲＮＡから形成されたｄｓＲＮＡであるｓｉＲＮＡを細胞に投与することにより、細胞内でｓｉＲＮＡが、センスｓｉＲＮＡ及びアンチセンスｓｉＲＮＡに乖離し、標的遺伝子ｍＲＮＡとアンチセンスｓｉＲＮＡが二本鎖を形成し、その後、この形成されたｄｓＲＮＡがＤｉｃｅｒにより分解されることにより、標的遺伝子の発現が抑制される現象を言う。ＲＮＡ干渉法は、ｓｉＲＮＡを細胞内に導入するほか、細胞内へｓｉＲＮＡの前駆体となる比較的長鎖のｄｓＲＮＡ又はヘアピン型のｓｈＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ)を導入することや、ｓｉＲＮＡ又はその前駆体を発現するベクターを導入することによっても、ｓｉＲＮＡと同様に目的遺伝子の発現を抑制することも可能である。さらに、ｓｉＲＮＡにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて標的遺伝子の発現を抑制する方法も知られている（Ｐ．Ａｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，ｖｏｌ．４１８，ｐ３８−３９；Ｌ．Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２００２，ｖｏｌ．３２，ｐ１０７−１０８）。
［ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有する核酸分子］
本発明においては、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有する核酸分子（以下、「ＲＮＡｉ核酸分子」ということがある）を細胞へ導入することによって、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を低下させることが好ましい。ＲＮＡｉ核酸分子としては、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有する核酸分子であれば特に限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡであることが好ましい。
本発明においてＲＮＡｉ核酸分子として用いられるｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉作用を有する限り、そのどの領域に対してのｓｉＲＮＡであってもよい。ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの部分塩基配列に対してＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの塩基配列情報に基づき、当業者であれば、適宜設計して調製することが出来る。例えば、ヒトＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の標的とする塩基配列と、完全に相補的な塩基配列を有していることが好ましいが、ＲＮＡ干渉作用を有する限り、１又は数塩基のミスマッチがあってもよい。
本発明において用いられるｓｉＲＮＡの塩基対長は、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉作用を示すものであれば特に限定されるものではない。例えば、センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡが１５〜３０個の塩基対、好ましくは２１〜２３個の塩基対からなるｓｉＲＮＡが挙げられる。
また、本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉作用を有する限り、１又は数個の塩基が修飾されていてもよい。当該修飾としては、メチル化、イノシン化、ｄＵ化、蛍光基修飾、又はリン酸化等が挙げられる。ｓｉＲＮＡ中、修飾塩基は、センスＲＮＡ中にあってもよく、アンチセンスＲＮＡ中にあってもよく、両方に存在していてもよい。
本発明において用いられるｓｉＲＮＡの末端構造は、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現をＲＮＡ干渉効果により調節することが可能であれば、平滑末端と突出末端のいずれであってもよい。突出末端構造は、３’末端側が突出している構造だけではなく、上記ＲＮＡ干渉効果を示す限り５’末端側が突出している構造も含めることができる。また、突出する塩基数は、既に他の遺伝子に対しＲＮＡ干渉効果を示すことが報告されているｓｉＲＮＡの多くでは２〜３塩基であるが、本発明において用いられるｓｉＲＮＡでは、ＲＮＡ干渉効果を誘導することができる塩基数であればよく、例えば、突出する塩基数は、１〜８塩基、好ましくは２〜４塩基であってもよい。この突出している塩基については、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡと相補的（アンチセンス）又は同一（センス）配列である必要はない。
ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡとしては、例えば、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の配列番号２で表される塩基配列の全長若しくはその一部の連続する塩基配列、例えば１５〜２４個の連続する塩基配列、好ましくは１８〜２０個の連続する塩基配列を標的とする、ＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが挙げられる。また、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の配列番号４で表される塩基配列の全長若しくはその一部の連続する塩基配列、例えば１５〜２４個の連続する塩基配列、好ましくは１８〜２０個の連続する塩基配列を標的とするＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡも挙げられる。
ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の配列番号２で表される塩基配列の全長若しくはその部分塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡとしては、具体的には、配列番号２（５’−ＧＡＡＡＵＣＣＵＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＡＡＣＵＵＣＡ−３’）で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号３（５’−ＵＧＡＡＧＵＵＡＵＣＡＵＣＵＧＡＣＡＧＧＡＵＵＵＣ−３’）で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡや、配列番号２で表される塩基配列中の１５〜２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが挙げられる。また、配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡであってもよい。その他、これらのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡであってもよい。
ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の配列番号４で表される塩基配列の全長若しくはその部分塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡとしては、具体的には、配列番号４（５’−ＵＣＵＧＣＣＵＵＧＵＵＵＧＵＵＣＡＣＣＡＣＵＡＵＵ−３’）で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号５（５’−ＡＡＵＡＧＵＧＧＵＧＡＡＣＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＧＡ−３’）で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡや、配列番号４で表される塩基配列中の１５〜２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが挙げられる。また、配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡであってもよい。その他、これらのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡであってもよい。
［ＲＮＡｉ核酸分子の前駆体］
本発明の細胞の増殖抑制方法においては、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ核酸分子を直接細胞へ導入してもよく、ＲＮＡｉ核酸分子の前駆体を細胞へ導入し、当該細胞内において分解等の反応により当該前駆体からＲＮＡｉ核酸分子を産生させてもよい。ＲＮＡｉ核酸分子の前駆体としては、細胞内において最終的にｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ核酸分子を産生する前駆体であればよく、特に限定されない。ｓｉＲＮＡの前駆体としては、例えば、比較的長鎖のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを構成するセンスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡがスペーサーを介して連結されている一本鎖ＲＮＡが挙げられる。スペーサーの長さは特に限定されないが、例えば３〜２３塩基としてよい。また、センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを連結するスペーサーがループを形成して、その前後のＲＮＡ配列同士がアニールして２本鎖を形成するＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も好ましい。ｓｈＲＮＡ中のループ及びステムの長さは特に限定されないが、例えばステムは５〜２９塩基としてよい。また、５’末端及び／又は３’末端に数塩基のオーバーハングを有していてもよく、有していなくてもよい。これらの前駆体が、細胞内でＤｉｃｅｒ等により消化される結果、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ核酸分子が産生される。
本発明の細胞の増殖抑制方法において用いられる前駆体としては、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｍＲＮＡ中の配列番号２又は４で表される塩基配列を標的とする、ＲＮＡ干渉作用を有するｓｈＲＮＡが挙げられる。本発明において用いられる前駆体としては、細胞内において、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の配列番号２で表される塩基配列の全長若しくはその部分塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡ、又はＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の配列番号４で表される塩基配列の全長若しくはその部分塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡ、の何れかを産生し得るｓｈＲＮＡが好ましい。
配列番号２で表される塩基配列の全長若しくはその部分塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡを産生するための前駆体である核酸分子としては、例えば、配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号３で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ等であって、細胞内において当該ｓｈＲＮＡからＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが産生されるものが挙げられる。配列番号４で表される塩基配列の全長若しくはその部分塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡを産生するための前駆体である核酸分子としては、例えば、配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号５で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ等であって、細胞内において当該ｓｈＲＮＡからＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが産生されるものが挙げられる。
ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ核酸分子又はその前駆体である核酸分子は、例えば、化学的ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成系、ファージＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法、クローン化したｃＤＮＡを鋳型として転写し会合させた長いｄｓＲＮＡをＲＮａｓｅ III又はＤｉｃｅｒによって切断する方法等により、適宜調製することができる。また、修飾塩基を含むＲＮＡｉ核酸分子を用いる場合には、合成された核酸分子に対して修飾を施してもよく、修飾塩基を用いてＲＮＡｉ核酸分子を合成させてもよい。
［発現ベクター］
本発明の細胞の増殖抑制方法においては、ＲＮＡｉ核酸分子又はその前駆体である核酸分子を発現し得る発現ベクターを細胞に導入し、当該細胞内において、当該発現ベクターからＲＮＡｉ核酸分子等を産生させてもよい。ｓｉＲＮＡを発現し得るベクターとしては、例えば、ｓｉＲＮＡのセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡが別々に発現するように、それぞれ別々のプロモーターと連結した発現ベクター、選択的スプライシング等により１つのプロモーターからセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡが別個に転写されるようにした発現ベクター等が挙げられる。ｓｈＲＮＡを発現し得るベクターとしては、例えば、プロモーターの下流に、ｓｈＲＮＡを構成する一本鎖のＲＮＡを連結した発現ベクター等が挙げられる。
これらの発現ベクターは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、容易に作製することができる（Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，ｖｏｌ．２９６，ｐ．５５０〜５５３；Ｎ．Ｓ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００１，ｖｏｌ．１９，ｐ．５００〜５０５；Ｍ．Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｋ．Ｔａｉｒａ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００２，ｖｏｌ．１９，ｐ．４９７〜５００；Ｐ．Ｊ．Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，ｖｏｌ．９９，ｐ．１４４３〜１４４８；Ｃ．Ｐ．Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００２，ｖｏｌ．１９，ｐ．５０５〜５０８；Ｇ．Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，ｖｏｌ．９９，ｐ．５５１５〜５５２０；Ｇ．Ｍ．Ｂａｒｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，ｖｏｌ．９９，ｐ．１４９４３〜１４９４５；Ｐ．Ｊ．Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２００２，ｖｏｌ．１６，ｐ．９４８〜９５８）。より具体的には、目的のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって構築することが可能である。プロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター等を用いることができる。具体的には、例えばＵ６プロモーターやＨ１プロモーター等が利用できる。公知のベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター等のウイルスベクターや、プラスミド等の非ウイルスベクター等が利用できる。
［細胞への導入］
ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ核酸分子、その前駆体、又はこれらの発現ベクターを細胞へ導入する方法は、特に限定されるものではなく、核酸分子を細胞内へ導入する際に用いられる公知の手法のいずれを用いてもよい。例えば、ＲＮＡｉ核酸分子等をインジェクション等により直接細胞内へ導入してもよく、必要に応じて公知の遺伝子導入試薬等を使用してエンドサイトーシス等により細胞内へ取り込ませてもよい。また、細胞へ導入するＲＮＡｉ核酸分子等は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を組み合わせて導入してもよい。
本発明の細胞の増殖抑制方法において、増殖を抑制させる対象となる細胞は、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子が発現している細胞、すなわち、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡやその翻訳産物であるタンパク質を発現し得る細胞（以下、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞）である。ＮＥＫ１０バリアント発現細胞であれば特に限定されず、正常細胞であってもよく、癌細胞であってもよい。また、由来する組織等は特に限定されない。例えば、癌細胞の場合には、癌種も特に限定されない。また、ヒト由来の細胞であってもよく、ヒト以外の動物由来の細胞であってもよい。増殖を抑制させる対象となる細胞は、培養細胞や、生物個体から採取された細胞であってもよく、生物個体中の細胞であってもよい。
＜ＮＥＫ１０バリアント遺伝子発現抑制用組成物、抗癌剤＞
ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡの前駆体（中でも、ｓｈＲＮＡ）、前記ｓｉＲＮＡの発現ベクター、又は前記前駆体の発現ベクター等の核酸分子を細胞内へ導入すると、当該細胞内でＲＮＡ干渉がおこり、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現が低下する結果、当該細胞の細胞増殖が抑制される。つまり、これらの核酸分子は細胞増殖抑制剤の有効成分とし得るものであり、よって腫瘍等の細胞の過増殖等が問題となる疾患に対する医薬品として有用な物質である。そこで、これらの核酸分子は、そのまま、あるいは適宜薬理学的に許容される配合剤と混合して、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子発現抑制用組成物（本発明の組成物）又は抗癌剤（本発明の抗癌剤）として使用することができる。なお、本発明の組成物及び抗癌剤は、ｓｉＲＮＡ等の核酸分子を１種類のみ含有していてもよく、複数種類を組み合わせて含有していてもよい。
ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有する核酸分子を有効成分とする本発明の抗癌剤は、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子を発現する癌に対する治療において極めて有用であると考えられる。そして、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子は、乳癌のみならず、少なくとも肝癌、腎癌、前立腺癌、及び子宮癌で発現している。このため、本発明の抗癌剤は、多くの癌細胞において、細胞増殖作用を示し、高い抗腫瘍効果を発揮することが期待される。
本発明の組成物及び抗癌剤は、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子を発現する癌細胞に対して、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞死誘導作用等の抗癌作用や、抗癌剤等に対する感受性増強作用等を示す。また、本発明の組成物又は抗癌剤によるこれらの作用効果は、一過性であってもよく、恒常的に発揮されるものであってもよい。また、本発明の組成物又は抗癌剤の導入後、ある一定期間が経過した後に、最終的に効果が発現されるものであっても良い。
本発明の組成物及び抗癌剤に添加してもよい配合剤としては、担体、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、流動化剤、コーティング剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、矯味剤、着香剤、希釈剤、溶解補助剤等の製薬上許容し得る添加剤が挙げられる。又、本発明の組成物及び抗癌剤は、粉剤、顆粒剤、錠剤、カブレット剤、カプセル剤、注射剤、座剤、軟膏剤等の製剤形態で、経口又は非経口的（全身投与、局所投与等）に安全に投与される。本発明の組成物及び抗癌剤中の有効成分（ＲＮＡｉ核酸分子又はその前駆体である核酸分子）の含有量は、製剤により種々異なるが、通常０．１〜１００重量％であることが好ましい。投与量は、投与経路、患者の年齢、及び、予防又は治療すべき実際の症状等により異なるが、例えば成人に経口投与する場合、有効成分として１日０．０１ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０００ｍｇとすることができ、１日１回又は数回に分けて投与できる。
＜抗癌剤のスクリーニング方法＞
上述のように、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を低下させる等により、癌細胞内におけるＮＥＫ１０バリアントタンパク質の機能を抑制させることによって、癌細胞の細胞増殖が抑制され、抗腫瘍効果を示す。このため、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質、又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性を抑制する作用を有する物質は、癌治療薬の有効成分として有用である可能性が高い。したがって、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現に対する抑制効果又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性に対する抑制効果を指標とすることにより、新規抗癌剤のスクリーニングが可能である。
抗癌剤の候補物質としては、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物（低分子化合物や高分子化合物を含む）、無機化合物等を挙げることができる。本発明のスクリーニング方法は、これらの候補物質（以下、被験物質）を含む試料を対象として実施することができる。被験物質を含む試料には、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物、微生物培養上清及び菌体成分等が含まれる。
被験物質の中から、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現に対する抑制効果を指標として探索する場合には、具体的には、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞を、被験物質の存在下又は非存在下で培養し、両条件下でのＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の発現量を比較する。
スクリーニングに使用する細胞としては、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞であればよい。ヒトに有効な抗癌剤をスクリーニングする場合、ヒト由来のＮＥＫ１０バリアント発現細胞を用いることが好ましいが、ヒトＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡと相同性を示す塩基配列が存在する種由来の細胞であれば、ヒト以外の動物由来のＮＥＫ１０バリアント発現細胞であってもよい。例えば、マウスの転写産物中にもヒトＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡと相同性を示す塩基配列（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿００１１９５１１９．１）が存在することから、マウス由来のＮＥＫ１０バリアント発現細胞を用いてもよい。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。その他、定法に従って、ヒトＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入してＮＥＫ１０バリアントタンパク質を産生可能な状態に調製された形質転換細胞を、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞として使用することもできる。
上述のスクリーニング方法において、被験物質とＮＥＫ１０バリアント発現細胞との接触は、例えば、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞の培養液に被験物質を添加した状態で培養することにより行う。また、被験物質とＮＥＫ１０バリアント発現細胞との接触条件は、特に限定されないが、当該細胞が死滅せず、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ又は蛋白質が発現し得る培養条件（温度、ｐＨ、培地組成等）を選択することが好ましい。
候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＮＥＫ１０バリアント発現細胞とを接触させ、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＮＥＫ１０バリアント発現細胞を培養した場合に、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ又はタンパク質発現量が、同条件の被験物質非存在下のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ又はタンパク質発現量よりも小さい被験物質を選別する。
ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現量は、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ等を利用したノーザンブロット法やＤＮＡアレイを利用した測定方法、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の部分塩基配列をプライマーとしたＲＴ−ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法等により測定することができる。
ＮＥＫ１０バリアントタンパク質の発現量は、例えば、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質に対する抗体を利用した公知の方法により測定することができる。抗体を利用した測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ等が挙げられる。
ＮＥＫ１０バリアントはキナーゼ活性を持つことが構造から推定される。したがって、被験物質の中から、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質のキナーゼ活性に対する抑制効果を指標として、抗癌剤のスクリーニングを行うこともできる。具体的には、例えば、精製したＮＥＫ１０バリアントタンパク質又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質を発現する細胞の抽出液を用い、被験物質の存在下又は非存在下での、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質のキナーゼ活性を比較する。
キナーゼ活性測定に用いられるＮＥＫ１０バリアントタンパク質としては、遺伝子組換え技術により産生された組換えタンパク質を用いることができる。組換えタンパク質は、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｃＤＮＡと公知の発現系を用いて常法により製造することができる。発現系としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等を宿主細胞とする発現系、無細胞発現系等が挙げられる。例えば、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質を強制発現後の宿主細胞の抽出液をそのままキナーゼ活性測定に用いてもよく、当該抽出液から精製した組換えタンパク質を用いてもよい。また、元々ＮＥＫ１０バリアントタンパク質を発現している細胞の抽出液や、当該抽出液から精製されたＮＥＫ１０バリアントタンパク質も、キナーゼ活性測定に用いることができる。
キナーゼ活性測定に用いられる基質としては、キナーゼの基質として一般的に用いられる各種タンパク質を用いることができる。具体的には、ＭＢＰ（ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ヒストン等が挙げられる。基質とするタンパク質は、組換えタンパク質であってもよく、ペプチド合成等により人工的に合成されたものであってもよく、細胞内の内在性のタンパク質であってもよい。組換えタンパク質や元々細胞内に存在しているタンパク質を用いる場合、細胞の抽出液と当該抽出液から精製したタンパク質のいずれをキナーゼ活性測定に用いてもよい。
上述のスクリーニング方法において、被験物質とＮＥＫ１０バリアント発現細胞は、キナーゼ活性測定の測定環境下で接触させる。キナーゼ活性測定の温度、ｐＨ、塩濃度等の条件は、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質による基質となるタンパク質のリン酸化が起こる条件であればよく、特に限定されない。
候補物質の選別は、例えば上記条件の被験物質存在下で、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質による基質タンパク質のリン酸化量と、被験物質非存在下での基質タンパク質のリン酸化量とを比較することにより行うことができる。具体的には、被験物質存在下での基質タンパク質のリン酸化量が、同条件の被験物質非存在下での基質タンパク質のリン酸化量よりも小さい被験物質を選別する。
本発明の抗癌剤のスクリーニング方法により選抜された物質は、細胞においてＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を抑制しＮＥＫ１０バリアントタンパク質の産生を低下させるか、又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質のキナーゼ活性を低下させる作用を有するものであり、癌治療に有用であると考えられる。また、当該スクリーニング方法によって選別された被検物質の各種誘導体を製造し、これらに対してさらなるスクリーニングを行うことによって、効果や安全性に優れた誘導体を得ることも可能である。
以下、本発明を実施例等により具体的に説明するが、これは一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例等で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。
［参考例１］
本参考例は、各種癌細胞株において、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現を確認するために行った。すなわち、表１に記載の各種癌細胞株におけるＮＥＫ１０バリアントのｍＲＮＡの相対発現量を、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮによるリアルタイムＰＣＲにより測定した。
各癌細胞株よりＲＮＡｅａｓｙ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。４００ｎｇの精製したＲＮＡを用い、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用説明に従い使用し、ｃＤＮＡを調製した。すなわち、ＲＮＡを６５℃で５分間変性処理を行った後４℃で急冷し、その後５５℃で３０分間及び７５℃で１５分間反応させ、ｃＤＮＡを合成した。
得られたｃＤＮＡのうち１μＬを鋳型とし、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのプライマー、及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのプライマーを用い、ＢＲＩＬＩＡＮＴ ＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用い使用説明に従い使用し、リアルタイムＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨの増幅は、反応系のコントロールとして行った。すなわち、９５℃、１０分間の熱変性の後、１サイクルが９５℃、３０秒間、次いで５５℃、６０秒間、その後７２℃、６０秒間からなるサイクル反応を４０サイクル行うＰＣＲ反応を行った。リアルタイムＰＣＲ機は、ＭＸ３０００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いた。ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのプライマーとして、配列番号６：５’−ＧＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴＴＴＡＴＧＧ−３’の塩基配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号７：５’−ＣＴＡＣＴＣＡＡＡＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＡ−３’の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。また、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのプライマーとして、配列番号８：５’−ＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴ−３’の塩基配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号９：５’ −ＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＴＴＧＡＣＴＣＣＧＡＣ−３’の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。Ｃｔ値の判定は、ソフトウエアＭＸ Ｐｒｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いた。Ｃｔ値とは、ＰＣＲ反応により標的遺伝子の増幅が指数関数的におこる立ち上がりのサイクル数（Ｃｙｃｌｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｃｔ値）のことである。
下記の式（１）を用いて、得られたＣｔ値から、各種癌細胞株のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのΔＣｔ値（キャリブレータと比較した場合の相対的なＣｔ値）を求めた。
式（１）：
ΔＣｔ（ＮＥＫ１０遺伝子バリアント）値＝ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのＣｔ値−ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのＣｔ値
式（１）から得られた各種癌細胞株におけるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのΔＣｔ値を用いて、ＨｅＬａＳ３細胞におけるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現量を１００とした場合の、各種癌細胞株の相対的なＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現量を、式（２）により求めた。
式（２）：
各種癌細胞株のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの相対発現値＝（各種癌細胞株におけるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのΔＣｔ値／ＨｅＬａＳ３細胞におけるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのΔＣｔ値）×１００
前記式（２）を用いて得られた、ＨｅＬａＳ３細胞のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現量を１００とした場合の、各種癌細胞株におけるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの相対的な発現量を表１に示す。ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現は、乳癌細胞、肝癌、腎癌、前立腺癌及び子宮癌細胞で認められた。したがって、ＮＥＫ１０バリアントは乳癌細胞のみならず、乳癌以外の癌細胞でも重要な働きを担っていることが推測される。
Figure 0006018068
［実施例１］
本実施例は、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現を抑制し、かつ癌細胞の増殖を抑制することを確認するために行った。
＜ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現抑制作用の確認＞
配列番号２で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号３で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ（以下、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１）及び配列番号４で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ（以下、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２）について、細胞内に導入してｓｉＲＮＡ処理を行った後のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡをＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮによるリアルタイムＰＣＲにより測定し、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対するノックダウン効果を検討した。
実施例１でＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡを発現していることが確認された乳癌細胞株 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を用い、コントロールｓｉＲＮＡ、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１、又はＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２を細胞内に導入し、ｓｉＲＮＡ処理後のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡをＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮによるリアルタイムＰＣＲにより測定し、各ｓｉＲＮＡによるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのノックダウン効果を検討した。コントロールｓｉＲＮＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入し、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１及びＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社が合成したものを使用した。
１万個／ｗｅｌｌのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、２４時間後にｓｉＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い製造者の使用説明に従い使用し導入した。すなわち、１μＬのｓｉＲＮＡ（２０ｎＭ）を５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に溶解した溶液を、１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭに溶解し室温で５分間静置した溶液と混合し、さらに室温で２０分間静置した。静置後、上記混合液を細胞に添加し、３７℃で３時間培養した後、培地を交換し、さらに７２時間培養した。その後、培地を除去し、ＲＮＡｅａｓｙ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、各ｗｅｌｌ中の細胞からＲＮＡを精製した。
精製されたＲＮＡのうち５００ｎｇ用い、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、参考例１と同様にしてｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡのうち１μＬを鋳型とし、参考例１と同様にしてＣｔ値の測定を行った。使用した試薬、プライマー及び機器も参考例１と同様である。
実験はトリプリケイトで行い、Ｃｔ値のトリプリケイトの平均値を下記の式（３）に代入し、各ｓｉＲＮＡ処理群のΔＣｔ値を求めた。また、実験は３回繰り返した。
式（３）−１：
ΔＣｔ（ｃｏｎｔｒｏｌ）値＝コントロール ｓｉＲＮＡ処理群のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのＣｔ値−コントロール ｓｉＲＮＡ処理群のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのＣｔ値
式（３）−２：
ΔＣｔ（ｓａｍｐｌｅ）値＝ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ処理群のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのＣｔ値−ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ処理群のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのＣｔ値
前記式（３）で得られた各ｓｉＲＮＡ処理群のΔＣｔ値を用いて、下記式（４）により、各実験における各ｓｉＲＮＡ処理によるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現量を、１回目のコントロール ｓｉＲＮＡ処理群を１００とした場合の相対値として求めた。但し、式（４）中、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ量は、対コントロール ｓｉＲＮＡ処理群に対する％である。
式（４）：
ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ量＝２（ΔＣｔ（ｃｏｎｔｒｏｌ）値−ΔＣｔ（ｓａｍｐｌｅ）値）×１００
算出結果を図１に示す。図１中、縦軸はコントロールｓｉＲＮＡ処理時のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現を１００とした場合の、各ｓｉＲＮＡ処理群の相対的なＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現量を示す。横軸は各ｓｉＲＮＡ処理群を示す。
乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における、コントロール ｓｉＲＮＡ又はＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ処理によるＮＥＫ１０ ｍＲＮＡの対コントロール（％）は、コントロールｓｉＲＮＡ処理群が１０７±６．２、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１処理群が１１±０．５、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２処理群が８６±７．４であった。Ｄｕｎｎｅｔ検定によりコントロール ｓｉＲＮＡ処理群とＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ処理群とを検定した結果、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１処理群は、コントロール ｓｉＲＮＡ処理群と比較して有意（＊＊＊、ｐ＜０．００１）にＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡを抑制した。同様に、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２処理群も、コントロール ｓｉＲＮＡ処理群と比較して有意（＊＊、ｐ＜０．０１）にＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現を抑制した。すなわち、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１及びＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２はいずれも、乳癌細胞において、ＮＥＫ１０バリアントのｍＲＮＡ発現を抑制することが明らかとなった。
＜ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡの癌細胞の増殖抑制効果＞
ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１及びＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２が癌細胞に対する増殖抑制効果を有することを確認した。すなわち、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１及びＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２を細胞内に導入し、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子をノックダウンすることにより細胞増殖が抑制されるか、メチレンブルー法により検討した。
上記（ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現抑制作用の確認）と同様にして、各ｓｉＲＮＡをＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞へ導入し、導入後、７２時間培養した。培養後、培地を除去し、１０００μＬのメタノールを添加して室温で２分間放置し、細胞を固定した。メタノールを除去後、１０００μＬの染色液（０．０５％メチレンブルー溶液）を添加し、３０分間染色した。４ｍＬの蒸留水で３回洗浄した後、３％ＨＣｌ溶液を２ｍＬ添加し、メチレンブルーの６６０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて測定した。
実験はトリプリケイトで実施し、同様の実験を３回繰り返した。１回目の実験のコントロール ｓｉＲＮＡ処理群のトリプリケイトの平均値をコントロールとし、各実験のｓｉＲＮＡ処理群のトリプリケイトの平均値を用いて、下記式（５）により細胞増殖率（％）を算出した。
式（５）：
細胞増殖率（％）＝（各実験のコントロール ｓｉＲＮＡ処理群又はＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ処理群の６６０ｎｍの吸光度／１回目の実験のコントロール ｓｉＲＮＡ処理群の６６０ｎｍの吸光度）×１００
算出結果を図２に示す。図２中、縦軸はコントロールｓｉＲＮＡ処理時の細胞増殖を１００とした場合の、各ｓｉＲＮＡ処理群の細胞増殖率を示す。横軸は各ｓｉＲＮＡ処理群を示す。
各ｓｉＲＮＡ処理による乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞増殖率（％）は、コントロール ｓｉＲＮＡ処理群が８８±１８、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１処理群が３４±１４、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２処理群が５８±１７であった。Ｄｕｎｎｅｔ検定によりコントロール ｓｉＲＮＡ処理群とＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ処理群とを検定した結果、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１処理群は、コントロール ｓｉＲＮＡ処理群と比較して有意（＊、ｐ＜０．０５）にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖を抑制した。
また、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２処理群は、統計学的な有意性は確認できなかったものの、コントロール ｓｉＲＮＡ処理群よりも、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖が抑制されていた。すなわち、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１及びＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２は、効果の多少はあるがいずれも、乳癌細胞に対する増殖抑制効果を有することが明らかとなった。
また、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現抑制効果がより高いＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１のほうが、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２よりも細胞増殖抑制効果が高かった。これより、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現抑制効果が高いｓｉＲＮＡを用いることにより、より高い細胞増殖抑制効果が得られること、十分な細胞増殖抑制効果を得るためには、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現量を対コントロール（％）で８６以下とし得るｓｉＲＮＡを用いることが好ましいことが示唆された。また、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１とＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２は、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの異なる配列を標的としていることから、ＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃１とＮＥＫ１０ ｓｉＲＮＡ＃２を併用することにより、それぞれのｓｉＲＮＡを単独で使用した場合よりも高い細胞増殖抑制効果（抗腫瘍効果）が得られることが期待される。
本発明の細胞の増殖抑制方法及び核酸分子は、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子が発現している様々な細胞、特に癌細胞の増殖を抑制することができるため、癌の治療及び抗癌剤の製造等の分野で利用が可能である。

Claims (4)

  1. （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号３で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
    （ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号５で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
    である、核酸分子。
  2. 請求項１に記載の核酸分子を含み、当該核酸分子を発現させ得る、発現ベクター。
  3. 請求項１に記載の核酸分子、及び請求項２に記載の発現ベクターからなる群より選択される１種以上を含む、配列番号１で表されるＮＥＫ１０バリアント遺伝子発現抑制用組成物。
  4. 請求項１に記載の核酸分子、及び請求項２に記載の発現ベクターからなる群より選択される１種以上を有効成分として含む、抗癌剤。
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