JP6016326B2

JP6016326B2 - 乳酸菌のスクリーニング方法

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Publication number: JP6016326B2
Application number: JP2010274620A
Authority: JP
Inventors: 聖也牧野; 秀二池上; 伊藤　裕之; 裕之伊藤
Original assignee: Meiji Co Ltd
Current assignee: Meiji Co Ltd
Priority date: 2009-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2030-12-09
Also published as: JP2011139700A

Description

本発明は、乳酸菌のスクリーニング方法に関し、特に乳酸菌が産生する多糖体量等を測定することにより抗ウイルス活性を有する乳酸菌をスクリーニングする方法に関する。

現在、世界中で猛威を振るっている新型インフルエンザを始めとして、人類は常に新たなウイルスの脅威にさらされている。特に、季節性のものを含めたインフルエンザなどの呼吸器感染症は、日常的に罹患者が周囲に存在する様な状況であるため、高齢者など免疫力が低下している者にとっては罹患しやすい。また重篤に陥る可能性も高く、合併症を併発しての死亡率は非常に高くなっている。

現在、こうしたウイルス性の呼吸器感染症に対しては、ウイルス自体に作用し効果を示す抗ウイルス薬が用いられている。これらの抗ウイルス薬は、それぞれのウイルス性感染症に対して極めて有効なものであり、発病後早期に服用することで症状を速やかに緩和することができる。近年、ウイルス表面のノイラミニダーゼ蛋白質を阻害し、体内での増殖を防止するノイラミニダーゼ阻害薬が開発されている。その中でもＡ型及びＢ型インフルエンザに有効なものとして、カプセル内服薬として処方されるオセタミビル（商品名：タミフル；タミフルは登録商標である。）や粉末性吸入薬のザナミビル（商品名：リレンザ；リレンザは登録商標である。）といった薬剤が実用されている。しかし、これらはウイルスの増殖を抑制する薬剤であり、感染後早期に服用する必要がある（症状が出現して４８時間程度以内）。また一定期間一定量を継続して服用しなければならない。

またワクチン接種による予防も行われている。しかし、ワクチンは事前に対象となるウイルス種を特定して製造しなければならず、また大量生産には非常に時間がかかってしまう。またワクチン接種は、あくまで感染後の重症化リスクを下げる効果しかない。さらに抗体が定着するまで一定期間を必要とし、流行する前に予防接種をしなければならず、さらには接種したワクチンの種類と実際に感染したウイルスの種類が異なれば全く効果を発揮することができない。

このような状況の中、安全性が高いことはもちろん、予防的な摂取で効果を発揮し、しかも服用によってどのようなウイルスに対しても効果を発揮する抗ウイルス剤の開発が急務となっている。

一方、ウイルスの脅威に対処するためには、生体内へのウイルスの侵入及び増殖を最前線で防ぐ自然免疫を、普段から高めておくことも重要である。自然免疫において、白血球は特に重要な役割を果たす。白血球の中でもＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞ともいう。）は、ウイルス感染が小規模なうちに自発的に感染細胞を攻撃し、ウイルスの増殖及び感染の拡大を抑制する。

生体内ではウイルス感染を感知するとインターフェロン（以下、ＩＦＮ）などが、免疫細胞やウイルス感染細胞で産生される。このＩＦＮは自身に抗ウイルス活性と抗腫瘍活性があると共に、ＩＦＮ−γは自然免疫を高め、ＮＫ細胞活性化によっても、ウイルスの増殖を抑制し、感染の拡大を防ぐことが可能となる。ＮＫ細胞はワクチンのような特定のウイルスのみへの効果ではなく、広く様々なウイルス感染に対して効果があるために、このＩＦＮ―γの産生を誘導することで、全体としての免疫活性を高めることができるとも言える（免疫賦活効果）。

これまでに、免疫賦活効果を増強する物質が様々な方法で探索されている。例えば特許文献１には、ラクトコッカス属乳酸球菌を樹状細胞又は脾臓細胞と共培養して、ＩＬ−１８産生誘導能などにより選抜する方法が開示されている。
また特許文献２には、松茸の菌糸体より特定成分を陰イオン交換樹脂で吸着させ、そのなかでフェノール硫酸法による糖質含量と銅フェリン法による蛋白質含量とで細菌感染予防・治療剤を選択することが開示されている。

特開２００５−１５４３８７号公報特開２００４―２１０６９４号公報

上記のように、これまで様々な免疫賦活効果を増強する物質が探索されており、その中でもヨーグルトの発酵に用いられる乳酸菌などの食品微生物は様々な有用物質を産生しうることが知られている。これらの有用物質が免疫賦活効果の増強に有効であれば、日常生活において安全かつ簡便に摂取し、免疫力の増強が期待されると考えた。しかし十分な活性促進効果を得ることができる有効な乳酸菌を選抜しうる方法は見つかっていなかった。

そこで本発明の目的は、簡便な手法により免疫賦活効果の増強に有効な乳酸菌を選定しうるスクリーニング方法を提供することである。

上記従来の問題点に鑑み本発明者等は鋭意研究を進めたところ、乳酸菌の多糖体産生量をフェノール−硫酸法等の方法により測定して比較する方法に注目し、さらに、乳酸菌の多糖体産生量の測定値と該多糖体のＩＦＮ−γの産生誘導活性についての関連性を検討したところ、特定の基準によれば、免疫賦活効果の増強に有効な乳酸菌を選定できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、（Ａ）乳酸菌の複数の菌株の中から、フェノール−硫酸法による産生多糖体量の測定値が、培養物１ｋｇあたり、１１０〜１７０ｍｇの範囲内で適宜定めた基準値（例えば、１２０ｍｇ／ｋｇ）以上である乳酸菌の菌株を選抜する工程と、（Ｂ）工程（Ａ）で選抜された乳酸菌の菌株の中から、精製による産生多糖体量の測定値が、培養物１ｋｇあたり、１１０〜１７０ｍｇの範囲内で定めた基準値（例えば、１２０ｍｇ／ｋｇ）以上である乳酸菌の菌株を選抜する工程と、（Ｃ）工程（Ｂ）で選抜された乳酸菌の菌株の中から、これら菌株が産生する多糖体のＩＦＮ−γ産生誘導活性の測定値に基づいて、抗ウイルス活性の高い乳酸菌の菌株を選抜する工程と、を含むことを特徴とする乳酸菌のスクリーニング方法である。

前記スクリーニング方法においては、前記乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス）であることが好ましい。

本発明の乳酸菌のスクリーニング方法によれば、抗ウイルス活性の高い乳酸菌（以下、本発明の乳酸菌ともいう。）が提供される。

また、本発明の乳酸菌のスクリーニング方法によれば、例えば、有効量の乳酸菌からなる抗ウイルス剤（以下、本発明の抗ウイルス剤ともいう。）が提供される。

前記抗ウイルス剤においては、前記乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓであることが好ましい。

また、本発明の乳酸菌のスクリーニング方法によれば、例えば、有効量の乳酸菌を含む抗ウイルス用飲食品組成物（以下、本発明の飲食品組成物ともいう。）が提供される。

前記抗ウイルス用飲食品組成物においては、前記乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓであることが好ましい。また、抗ウイルス用飲食品組成物は発酵乳飲食品であることが好ましく、またヨーグルト、ヨーグルト飲料等のヨーグルト飲食品であることが特に好ましい。

本発明の乳酸菌のスクリーニング方法によって選抜した抗ウイルス活性の高い乳酸菌の菌株は、該乳酸菌を摂取した者の自然免疫を高めることができるので、ワクチンのようなウイルス特異性がなく、ウイルス感染前から可能な予防的効果を与えることができる。選抜された乳酸菌は、安全性が高く、予防的な摂取で効果を発揮し、服用によってどのようなウイルスに対しても効果を発揮する免疫賦活活性を提供できる。

実施例１の結果として、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスの多糖体産生量（フェノール−硫酸法による測定値）を示したグラフ図である。実施例２の結果として、実施例１における多糖体産生量（測定値）が多い上位１０株について、精製による多糖体産生量（測定値）を示したグラフ図である。実施例３の結果として、実施例２における多糖体産生量（測定値）が多い上位３株の多糖体によるＩＦＮ−γ産生誘導活性を示したグラフ図である。

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に述べる個々の形態には限定されない。

本発明で用いられるフェノール−硫酸法は一般的に知られている糖類の定量に用いられる方法が適用される。
本発明はこれには限定されないが、例えば、以下のような試薬を使用する。
・フェノール試薬（例えば５％（Ｗ／Ｖ））
・濃硫酸
・標準単糖水溶液（例えば、グルコースなどの水溶液）
測定方法としては例えば以下の手順が挙げられる。所定量の試料水溶液に所定量のフェノール試薬を加え攪拌する。これに所定量の濃硫酸を加え良く攪拌し、常温で冷却したのち分光光度計で４９０ｎｍの吸光度を測定する。同様の操作で標準単糖水溶液についても測定し、これを試料水溶液の結果と比較することで、含有する糖類を定量することが可能となる。

本発明では、スクリーニング対象となる乳酸菌を既知の方法により培養し、培養液より産生する糖類（特に多糖体）を既知の方法により分離し、この菌体外の多糖体（Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＥＰＳ）をフェノール−硫酸法により定量する。本発明においては、この定量値をフェノール−硫酸法による産生多糖体量の測定値とする。
また、培養液からの多糖体の分離方法としては、例えば、以下の工程ａ）〜ｄ）をこの順で行なう方法が挙げられる。
ａ)トリクロロ酢酸を用いて除タンパクし、
ｂ）エタノール沈殿法により多糖体を沈澱させ、
ｃ）得られた多糖体の水溶液に透析膜を用いて、水に対して透析を行い、
ｄ）高分子側の水溶液を得る。
但し、前記除タンパク、エタノール沈殿法、透析等の工程は、乳酸菌、培養液、培養条件等に応じて適宜条件を調整して行うことができる。また、使用する透析膜についても、分画分子量（ＭＷＣＯ）３５００〜５０００ダルトンを例示できるが、他の分画分子量を使用することもできる。

また、本発明では前記培養液から菌体外多糖体を精製したもの（以降、精製多糖体ともいう。）を秤量して、産生多糖量を測定する。本発明においては、この秤量値を精製による産生多糖体量の測定値とする。培養液から菌体外多糖類を精製する方法としては、例えば、以下の工程ａ）〜ｉ）をこの順で行なう方法が挙げられる。
ａ)トリクロロ酢酸を用いて除タンパクし、
ｂ）エタノール沈殿法により多糖体を沈澱させ、
ｃ）得られた多糖体の水溶液に透析膜を用いて、水に対して透析を行い、
ｄ）高分子側の水溶液に対して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＴｙｐｅＩＩ、ウシ膵臓由来、Enzyme Commission (EC) Number3.1.21.1、Cas番号9003-98-9）およびリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ、ウシ膵臓由来、Enzyme Commission (EC) Number3.1.27.5、Cas番号9001-99-4）を加えて、３７℃、６時間（ｈｒ）インキュベートすることで、核酸の消化を行い、
ｅ）さらにプロテイナーゼＫ（エンドペプチダーゼＫ、Tritirachium album由来、Commission (EC) Number 3.4.21.64、Cas番号39450-01-6）を加えて３７℃、１６ｈｒでインキュベートすることで、タンパク質の消化を行い、
ｆ）９０℃、１０分間（ｍｉｎ）で加熱することで、酵素を失活させ、
ｇ）エタノール沈殿法により多糖体を沈澱させ、
ｈ）得られた多糖体の水溶液を透析膜を用いて、水に対して透析を行い、高分子側の水溶液を得て、
i）高分子側の水溶液を乾燥して、これを秤量して、精製による産生多糖体量の測定値を得る。
但し、前記除タンパク、エタノール沈殿法、透析、核酸の消化、タンパク質の消化等の工程は、乳酸菌、培養液、培養条件等に応じて適宜条件を調整して行うことができる。また、使用する透析膜についても、分画分子量（ＭＷＣＯ）３５００〜５０００ダルトンを例示できるが、他の分画分子量を使用することもできる。また、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼおよびプロテイナーゼは、前記の例に限定されず、他のものを使用することもできる。

本発明では、フェノール−硫酸法による産生多糖体量の測定値が基準値（例えば、１２０ｍｇ／ｋｇ）以上である乳酸菌の中から、精製による産生多糖体量の測定値（例えば、基準値として１２０ｍｇ／ｋｇ以上）に基づいて、乳酸菌を選抜した後、該選抜された乳酸菌の中から、該多糖体のＩＦＮ−γ産生誘導活性の測定値の大きさに基づいて、抗ウイルス活性の高い乳酸菌を選抜する。
この場合、フェノール−硫酸法により定量された多糖体量が好ましくは１２０ｍｇ／ｋｇ以上、さらに好ましくは１７０ｍｇ／ｋｇ以上である乳酸菌を選抜する。なお、ここでの基準値は、１２０ｍｇ／ｋｇ及び１７０ｍｇ／ｋｇに限定されるものではなく、本発明では、１１０〜１７０ｍｇ／ｋｇの範囲内で適宜定めた値（例えば、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０または１７０ｍｇ／ｋｇ）を採用することができる。
また、前記精製により定量された多糖体量が好ましくは１２０ｍｇ／ｋｇ以上、さらに好ましくは１７０ｍｇ／ｋｇ以上である乳酸菌を選抜する。なお、ここでの基準値も、１２０ｍｇ／ｋｇ及び１７０ｍｇ／ｋｇに限定されるものではなく、本発明では、１１０〜１７０ｍｇ／ｋｇの範囲内で適宜定めた値（例えば、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０または１７０ｍｇ／ｋｇ）を採用することができる。
フェノール−硫酸法における基準値と、精製における基準値は、同じでもよいし、異なってもよい。例えば、フェノール−硫酸法における基準値が１２０ｍｇ／ｋｇである場合、精製における基準値は、１２０ｍｇ／ｋｇでもよいし、他の値（例えば、１４０ｍｇ／ｋｇ）でもよい。

さらに本発明においては、前記フェノール−硫酸法および精製によって測定された各多糖体量が所定量以上でありかつ該多糖体がＩＦＮ−γ産生誘導活性を有する乳酸菌が選抜される。
菌体外多糖体のＩＦＮ−γ産生誘導活性については、例えば以下の方法により測定することが可能である。
常法に従って、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの脾臓細胞を培地に懸濁し、これに菌体培養上清から得た多糖体を加える。この脾臓細胞を所定条件において培養し、培養上清を回収し、該培養上清中に含まれるＩＦＮ−γを所定のキット（例えば、商品名：ＢＤＯｐｔＥＩＡ^ＴＭＭｏｕｓｅＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡＳｅｔ（ＢＤＯｐｔＥＩＡは登録商標である。ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、カタログ番号５５５１３８））などにより測定することで前記多糖体に誘導されたＩＦＮ−γ産生量が得られる。これを対照と比較することでＩＦＮ−γ産生誘導活性が判る。本発明において、ＩＦＮ−γ産生誘導活性の測定対象として、菌体外多糖体を精製したもの、前記精製多糖体等を挙げることができる。

本発明に用いられる乳酸菌としては、多糖体を生産する乳酸菌であれば、種類を問わない。特に乳酸菌としては、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス、またはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）等が好ましく、この中から選抜を行った。本発明の方法により選抜された乳酸菌としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＯＬＬ１０７３Ｒ−１（寄託番号：ＦＥＲＭＰ−１７２２７、国際寄託番号：ＦＥＲＭＢＰ−１０７４１）（以下、１０７３Ｒ−１株ともいう。）が好ましく、特に抗ウイルス剤として用いることができることが判明した。
本発明者らは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＯＬＬ１０７３Ｒ−１を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。以下に、寄託を特定するための内容を記載する。
（１）寄託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
（２）連絡先：〒305-8566
茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６
（３）受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−１０７４１
（４）識別のための表示：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL 1073R-1
（５）原寄託日：平成１１年２月２２日
（６）ブタペスト条約に基づく寄託への移管日：平成１８年１１月２９日
また、菌株名にＪＣＭと記載された菌株は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室から入手した基準株を示す。

本発明の抗ウイルス剤に用いられる乳酸菌は、その培養物、その濃縮物、ペースト状に加工したペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、媒体に分散させた液状物、希釈剤で希釈した希釈物、乾燥物をミルなどで破砕した破砕物などの、処理工程を経た被処理物として用いることができる。前記処理工程は単独であっても複数を併用してもかまわない。

本発明の乳酸菌を有効成分とする抗ウイルス剤の投与量は、投与経路、ヒトを含む投与対象動物の年齢、体重、症状など、種々の要因を考慮して、適宜設定することができる。
本発明はこれに限定されないが、好ましくは、有効成分として少なくとも９×１０⁹ｃｆｕ／ｂｏｄｙ／ｄａｙを投与するのが適当である。しかしながら、長期間に亘って予防及び／または治療の目的で摂取する場合には、上記範囲よりも少量であってもよいし、また本有効成分は、通常のヨーグルト食品としての安全性について問題がないので、上記範囲よりも多量に投与してもさしつかえない。

また本発明の乳酸菌を有効成分とする抗ウイルス剤は、経口投与又は非経口投与（筋肉内、皮下、静脈内、坐薬、経皮等）のいずれでも投与できる。
本発明の乳酸菌を有効成分とする抗ウイルス剤の投与形態としては、治療目的や投与経路等に応じて剤型を選択することができ、例えば錠剤、被覆錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、浸剤、煎剤、チンキ剤等が挙げられる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に対して必要に応じて充填剤、増量剤、賦形剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤（以降、製剤の補助剤ともいう。）を用いて製剤化することができる。また、この医薬製剤中に着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させてもよい。

本発明の飲食品組成物は、抗ウイルス剤である乳酸菌を有効量含んでなる。飲食品組成物の形態としては、ヨーグルトの様な発酵乳、飲料等を始めとして保健機能食品や病者用食品にも適用することができる。保健機能食品制度は、内外の動向、従来からの特定保健用食品制度との整合性を踏まえて、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした食品を対象として設けられたもので、特定保健用食品（個別許可型）と栄養機能食品（規格基準型）の２種類の類型からなる。本発明の抗ウイルス剤である乳酸菌を含有する特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として直接摂取することにより、ウイルス感染に対する予防および／または治療が可能となる。

本発明の飲食品組成物の典型例としては、各種飲食品（例えば、牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、栄養食品、栄養補助食品等）に抗ウイルス剤である乳酸菌を添加したものが挙げられる。本有効成分をそのまま使用し、あるいは他の食品ないし食品成分と混合するなど、通常の食品組成物における常法にしたがって使用できる。また、その性状についても、通常用いられる飲食品の状態、例えば、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよい。

その他の成分についても特に限定されないが、本発明の抗ウイルス剤である乳酸菌を含有する飲食品組成物には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。
タンパク質またはその分解物としては、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α―カゼイン、β―カゼイン、κ−カゼイン、β―ラクトグロブリン、α―ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物；ホエイ、クリーム、非タンパク態窒素等の各種乳由来成分などが挙げられる。
糖質としては、例えば、糖類、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維、乳糖などが挙げられる。
脂質としては、例えば、バター、クリーム、リン脂質等の各種乳由来成分；ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。
ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられる。
ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラルなどが挙げられる。
有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。
これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができる。また、本発明の飲食品組成物の主成分は、合成品でもよいし、合成品を多く含むものでもよい。

本発明の抗ウイルス剤の主成分である乳酸菌の量は、その目的、用途に応じて任意に定めることができ、特に限定されないが、抗ウイルス剤または飲食品組成物の全体量に対して通常、１×１０⁸ｃｆｕ／ｇ以上が好ましい。

以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。なお、本明細書において％表示は明示しない場合には重量％を示す。

実施例１［フェノール−硫酸法による各種乳酸菌の産生多糖体量の測定］
以下の方法により、各種乳酸菌（１４０菌株）より産生される多糖体量を測定した。
まず、酵母エキスを添加していない１０w/v％脱脂粉乳培地を調製し、１５ｍｌコニカルチューブに４ｍｌずつ分注した。次に、各乳酸菌を２回賦活した後、分注した培地に対し１v/v％（４０μｌ）の量を接種し、３７℃、１８ｈｒ、好気条件下で静置培養した。培養終了後、培養液に１００w/v％トリクロロ酢酸（和光純薬社製）を４００μｌ（培養物の１０v/v％の量、培養物に添加した後のトリクロロ酢酸の最終濃度は約１０w/v％になる）で加え、粘性が無くなるまで攪拌し、除タンパクを行った。遠心分離（１２０００ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）により上清を得、これを新たな１５ｍｌコニカルチューブに全量を移した。回収した上清にＭｉｌｌｉＱ水を加え、コニカルチューブの目盛りで４ｍｌまでメスアップした。８ｍｌ（２倍量）の冷エタノールを徐々に加えて完全に混合し、その後４℃で一晩静置することで多糖体を沈澱させた。遠心により多糖体を沈澱として回収し、４ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水を加え、ｖｏｌｔｅｘにより完全に溶解させた。ディスポ９６穴透析器（商品名：９６−ｗｅｌｌＤｉｓｐｏＤＩＡＬＹＺＥＲ^ＴＭ（９６−ｗｅｌｌＤｉｓｐｏＤＩＡＬＹＺＥＲは、登録商標である。）、２５−３００μｌ／ｗｅｌｌ；ＭＷＣＯ５０００ダルトンの透析膜を使用、ＨＡＲＶＡＲＤ社製、型番７４−０９０２）にて、多糖体水溶液をＭｉｌｌｉＱ水に対して２日間透析を行った。透析終了後、高分子側の水溶液についてフェノール−硫酸法により多糖体濃度の測定を行い、培養物１ｋｇあたりの多糖体量（ｍｇ）を算出した。

図１に、得られた結果をフェノール−硫酸法による産生多糖体の測定値として示す。
フェノール−硫酸法による定量の結果、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＯＬＬ１０７３Ｒ−１（以下、１０７３Ｒ−１株ともいう。）は、２番目に多糖体産生量が多いことが明らかとなった。

実施例２［多糖体産生量上位１０菌株の培養物からの多糖体の精製］
実施例１の方法により産生多糖体量の測定値を得た、乳酸菌１４０株の中の産生量のうち上位１０株について、産生多糖体の免疫賦活活性について調べるために、以下の方法で多糖体を単離精製した。
まず各乳酸菌を２回賦活した後、それぞれ６００ｍｌの培地で培養を行った。培地は酵母エキスを含まない１０％脱脂粉乳培地を用い、３７℃、１８ｈｒ、好気条件下で静置培養した。培養終了後、培養液をそれぞれ５００ｇずつはかり取り、１００w/v％トリクロロ酢酸（和光純薬社製）を５０ｍｌ（培養液の１０v/w％の量、培養物に添加した後のトリクロロ酢酸の最終濃度は約１０w/w％になる）加え、粘性が無くなるまで攪拌し、除タンパクを行った。遠心分離（１２０００ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）により上清を回収し、これに２倍量の冷エタノールを加えて、４℃で一晩静置することで多糖体を沈澱させた。多糖体は遠心分離（１２０００ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）により沈澱として回収し、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて完全に溶解させた。
前記多糖体水溶液をＭＷＣＯ３５００ダルトンの透析チューブに入れ、ＭｉｌｌｉＱ水に対して３日間透析を行った。その後、高分子側の水溶液にＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液、ＭｇＣｌ₂水溶液および水を添加して、０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＭｇＣｌ₂の溶液とした。ここに最終濃度２μｇ／ｍｌでデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ、ＴｙｐｅＩＩ、ウシ膵臓由来、Enzyme Commission (EC) Number3.1.21.1、Cas番号9003-98-9、Ｓｉｇｍａ社製）、およびリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ、ウシ膵臓由来、Enzyme Commission (EC) Number3.1.27.5、Cas番号9001-99-4、Ｓｉｇｍａ社製）を加えて、３７℃、６ｈｒでインキュベートすることで、核酸の消化をおこなった。次いで、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌでプロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、別名エンドペプチダーゼＫ、Tritirachium album由来、Commission (EC) Number 3.4.21.64、Cas番号39450-01-6、Ｓｉｇｍａ社製）を加えて３７℃、１６ｈｒでインキュベートすることで、タンパク質の消化を行った。酵素処理終了後、９０℃、１０ｍｉｎで加熱することで、酵素を失活させた。
酵素処理後の多糖体水溶液に２倍量の冷エタノールを加え、４℃で一晩静置することで、再度多糖体を沈澱させた。多糖体は遠心分離（１２０００ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）により沈澱として回収し、ＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。この多糖体水溶液をＭＷＣＯ３５００ダルトンの透析膜を用いて、ＭｉｌｌｉＱ水に対して４日間透析を行った後、高分子側の水溶液について凍結乾燥を行い（以降、これを精製多糖体ともいう。）、これを秤量した。

得られた精製多糖体の量を図２に示す。
図２からも明らかなように、精製多糖体の量は１０７３Ｒ−１株が最も多く、以下、図２に「Ａ」として示す株１、及び、図２に「Ｇ」として示す株２の精製多糖体の量が多いことが判った。

実施例３［実施例２の精製多糖体の量が多い上位３菌株の各々が産生する精製多糖体の、マウスＣ３Ｈ／ＨｅＪの脾臓細胞に対するＩＦＮ−γ産生誘導活性の測定］
マウスＣ３Ｈ／ＨｅＪ（８週齢、オス、ＳＬＣ）５匹より脾臓細胞を調製し、１×１０⁷ｃｅｌｌ／ｍｌでＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。多糖体は凍結乾燥物を１ｍｇ／ｍｌでＲＰＭＩ１６４０培地に溶解し、０．４５μフィルターで滅菌した後、ＲＰＭＩ１６４０培地で各濃度に希釈を行った。９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製；型番３５９６）に脾臓細胞を５×１０⁵ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ（５０μｌ／ｗｅｌｌ）、多糖体溶液を１５０μｌ／ｗｅｌｌでアプライし、５％ＣＯ₂条件下で３７℃、７２ｈｒ培養を行った。このとき、多糖体の最終作用濃度は１０，５０，１００μｇ／ｍｌであった。
培養終了後、培養上清を回収した。培養上清中のＩＦＮ−γをマウスＩＦＮ−γ測定キット（商品名：ＢＤＯｐｔＥＩＡ^ＴＭＭｏｕｓｅＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡＳｅｔ、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、カタログ番号５５５１３８）を用いて、測定した。

なお、多糖体については、実施例２において得られた精製多糖体の量が多かった上位３株（図２における「Ａ」（図３中の株１）、「Ｇ」（図３中の株２）、及び、「１０７３Ｒ−１株」（図３中でも同じ名称））を用いて産生させたものである。
得られた結果を図３に示す。図３から明らかなように、１０７３Ｒ−１株が産生する多糖体に、高いＩＦＮ−γ産生誘導活性が認められた。

本発明の乳酸菌のスクリーニング方法によって、ＩＦＮ−γ産生誘導活性が高い菌株を選抜することで、自然免疫を高め、ワクチンのようなウイルス特異性がないウイルス感染前から可能な予防的効果を得ることができる乳酸菌を容易かつ迅速に見出すことができる。この選抜された乳酸菌は、予防的な摂取で効果を発揮し、服用によってどのようなウイルスに対しても効果を発揮して、免疫賦活活性を提供でき、産業上の利用価値が高い。

Claims

（Ａ）乳酸菌の複数の菌株の中から、フェノール−硫酸法による産生多糖体量の測定値が、培養物１ｋｇあたり、１１０〜１７０ｍｇの範囲内で適宜定めた基準値以上である乳酸菌の菌株を選抜する工程と、
（Ｂ）工程（Ａ）で選抜された乳酸菌の菌株の中から、精製による産生多糖体量の測定値が、培養物１ｋｇあたり、１１０〜１７０ｍｇの範囲内で定めた基準値以上である乳酸菌の菌株を選抜する工程と、
（Ｃ）工程（Ｂ）で選抜された乳酸菌の菌株の中から、これら菌株が産生する多糖体のＩＦＮ−γ産生誘導活性の測定値に基づいて、乳酸菌の菌株を選抜する工程と、
を含むことを特徴とする乳酸菌のスクリーニング方法。
精製による前記産生多糖体量の測定値が、以下の工程ａ）〜ｉ）をこの順で行なうことにより得られるものである、請求項１に記載の乳酸菌のスクリーニング方法。
ａ)トリクロロ酢酸を用いて除タンパクする工程
ｂ）エタノール沈殿法により多糖体を沈澱させる工程
ｃ）得られた多糖体の水溶液に透析膜を用いて、水に対して透析を行う工程
ｄ）高分子側の水溶液に対して、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼを加えて、核酸の消化を行う工程
ｅ）さらにプロテイナーゼを加えて、タンパク質の消化を行う工程
ｆ）酵素を失活させる工程
ｇ）エタノール沈殿法により多糖体を沈澱させる工程
ｈ）得られた多糖体の水溶液を透析膜を用いて、水に対して透析を行い、高分子側の水溶液を得る工程
ｉ）高分子側の水溶液を乾燥して、これを秤量する工程
工程（Ａ）及び工程（Ｂ）における前記産生多糖体量の各測定値の基準値が、１２０ｍｇ／ｋｇである、請求項１又は２に記載の乳酸菌のスクリーニング方法。
前記乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓである請求項１〜３のいずれか１項に記載の乳酸菌のスクリーニング方法。