JP6014731B2 - 褐藻類抽出物を有効成分とするｇａｂａａ−ベンゾジアゼピン受容体活性を有する睡眠誘導及び改善用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、褐藻類抽出物を有効成分として含むＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）受容体活性用組成物に関する。特に、本発明は、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体に親和力を有して、抗不安、抗痙攣、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善効果を有する組成物に関する。

現代社会において、多くの人は、ストレスと不安、焦燥のために、睡眠障害を経験している。統計によれば、成人の約１５％が不安症状による不眠症のために、薬物治療が必要であると知られており、不眠の原因としては、ストレス、緊張、恐怖など多様であり、治療薬物としては、ベンゾジアゼピン系の薬物とセロトニン効能薬などが使われているが、このような薬物は、長期間使ったとき、耐性及び依存性などの副作用が激しい問題点がある。

したがって、睡眠剤の長期服用者及び制限者の場合、これを代替しうる手段として天然補助剤の必要性が高くなっており、睡眠増進健康機能食品に対する需要が増大しつつある実情がある。

また、ＧＡＢＡ_Ａ受容体は、メンブレンイオンチャネルを形成するペンタメリックタンパク質であって、鎮静、睡眠、不安、筋肉緊張、痙攣、記憶喪失などの調節と密接な関連があり、これを通じてＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）が作用する。不安治療剤、鎮静剤または睡眠誘導剤としてベンゾジアゼピンを含んで多くの薬物が、この受容体に結合して薬理作用を行っており、ベンゾジアゼピン部位に薬物または補助剤が結合すれば、ＧＡＢＡに対するＧＡＢＡ_Ａ受容体親和度を増進させ、塩素イオンの細胞内流入を増加させて、抗不安、抗痙攣、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善効果を見せる。しかし、依然として薬物依存性を見せ、筋肉緩和及び健忘症などの深刻な問題を引き起こす。

したがって、ＧＡＢＡ_Ａ受容体のベンゾジアゼピンサイトに結合作用して、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体に親和力を有しながら、副作用の危険がなく、安全な天然物から得られた物質を利用した鎮静−睡眠効果の補助剤の開発が切実に要求されている実情がある。

ＧＡＢＡ_Ａ受容体のベンゾジアゼピン部位に作用して、ＧＡＢＡ_Ａ収容体がＧＡＢＡに反応して塩素イオンチャネルを活性化させ、塩素が細胞内に流入されて、細胞膜電位の過多分極を通じて神経細胞性（ｎｅｕｒｏｎａｌ）活動を遅らせる陸上のハブ及び植物抽出物についての研究があるが、海藻類である褐藻類抽出物または褐藻類に特異的に存在するフェノール性化合物であるフロログルシノールまたはフロロタンニンに対する報告は、世界的にその事例がなかった。

本発明が解決しようとする第１の課題は、ＧＡＢＡ_Ａ受容体のベンゾジアゼピンサイトに結合して親和力を有する、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体活性を有する睡眠誘導及び改善用組成物を提供するところにある。

本発明が解決しようとする第２の課題は、褐藻類抽出物を含む抗不安、抗痙攣、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善用組成物を提供するところにある。

本発明は、前記課題を果たすために、褐藻類抽出物を有効成分とするＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体活性を有する組成物を提供する。

本発明の一実施形態によれば、前記褐藻類は、ヘラヤハズ、カジメ、クロメ、ツルアラメ、アカモク、ハバノリ、ネバリモ、イワヒゲ、フクロノリ、ヤツマタモク、サナダグサ、アミジグサ、コンブ、ワカメ及びイシゲのうちから選択される何れか１つ以上の褐藻類であり得る。

本発明の一実施形態によれば、前記褐藻類は、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）またはクロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）であり得る。

本発明の一実施形態によれば、前記褐藻類抽出物は、褐藻類水抽出物、褐藻類エタノール抽出物、褐藻類メタノール抽出物、または水、エタノール及びメタノールのうちから選択される何れか２種以上の溶媒の混合溶媒による褐藻類抽出物であり得る。

本発明の一実施形態によれば、前記褐藻類水抽出物は、４０〜１００℃の水で２〜４８時間褐藻類を抽出して製造され、褐藻類エタノール抽出物は、褐藻類を３５〜７５％のエタノールで２０〜６０℃で２〜３６時間抽出して製造され、前記褐藻類メタノール抽出物は、褐藻類を３５〜８５％のメタノールで２０〜６０℃で２〜３６時間抽出して製造され得る。

本発明の一実施形態によれば、前記褐藻類水抽出物は、セルラーゼ、ビスコザイム、アルカラーゼ及びペクチンからなる群から選択される１種以上の酵素を添加した水で４０〜５５℃で２〜２４時間褐藻類を抽出して製造され得る。

本発明の褐藻類抽出物は、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体に親和力を有して、それを含む組成物は、抗不安、抗痙攣、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善に、特に、睡眠誘導及び改善に効果的であり、天然物から得られた物質を利用するため、副作用を誘発せず、安全性を確保し、薬学組成物や健康機能食品などの食品組成物としても非常に有用である。

カジメ水抽出物（ＥＣＫ−Ｗ）、カジメメタノール抽出物（ＥＣＫ−Ｍ）、カジメエタノール抽出物（ＥＣＫ−Ｅ）のそれぞれで、放射性標職されたＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピンリガンド［^３Ｈ］フルマゼニルの結合抑制効果を示すグラフである。 それぞれのサンプルをラットに経口投与し、４５分後、ｈｙｐｎｏｔｉｃ（４５ｍｇ／ｋｇ）濃度のペントバルビタールを腹腔注射で投与し、入眠潜時を示すグラフである。＊＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０１で有意差がある（Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ ｔｅｓｔ）。 それぞれのサンプルをラットに経口投与し、４５分後、ｈｙｐｎｏｔｉｃ（４５ｍｇ／ｋｇ）濃度のペントバルビタールを腹腔注射で投与し、睡眠時間を示すグラフである。＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０５で有意差があり、＊＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０１で有意差がある（Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ ｔｅｓｔ）。(ＣＯＮ：対照区（０．５％ ＣＭＣ−ｓａｌｉｎｅ １０ｍＬ／ｋｇ）を経口投与後、ペントバルビタール投与 ＤＺＰ：ジアゼパム２ｍｇ／ｋｇを経口投与後、ペントバルビタール投与 ＥＣＫ−Ｅ：カジメエタノール抽出物をそれぞれ１００、２５０、５００、１０００ｍｇ／ｋｇ投与後、ペントバルビタール投与 ＥＣＫ−Ｗ：カジメ水抽出物をそれぞれ１００、２５０、５００、１０００ｍｇ／ｋｇ投与後、ペントバルビタール投与） カジメエタノール抽出物から溶媒分画を製造する過程を示す概要図である。 カジメ抽出物分画の放射性標職されたＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピンリガンド［^３Ｈ］フルマゼニルの結合抑制効果を示すグラフである。 それぞれのカジメ抽出物分画をラットに経口投与し、４５分後、ｈｙｐｎｏｔｉｃ（４５ｍｇ／ｋｇ）濃度のペントバルビタールを腹腔注射で投与し、睡眠時間を示すグラフである。 カジメ抽出物分画の総フェノール含量（ＴＰＣ）と［^３Ｈ］フルマゼニルの結合に対するＩＣ_５０との相関関係を示すグラフである。 各カジメ抽出物分画の総フェノール含量（ＴＰＣ）と睡眠時間との相関関係を示すグラフである。 カジメ抽出物分画から分離されたフロロタンニン化合物であるフロログルシノール、エコール、エクストロノール、トリフロレトールＡ及びダイエコールの構造である。 フコジフロレトールＧ、６，６’−ビエコール、７−フロロエコール、６，８’−ビエコール、８，８’−ビエコールの構造である。 クロメメタノール抽出物、カジメメタノール抽出物、ヘラヤハズメタノール抽出物及びサナダグサメタノール抽出物の総フェノール含量（ＴＰＣ）と１０ｍｇ／ｍＬ濃度での［^３Ｈ］フルマゼニルの結合活性との相関関係を示すグラフである。 各褐藻類メタノール抽出物の総フェノール含量（ＴＰＣ）と睡眠時間との相関関係を示すグラフである。 フロログルシノール（ＰＧ）の濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 フロログルシノール（ＰＧ）の濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 フロログルシノールのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 フロログルシノールのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 エクストロノール（ＥＴＮ）の濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 エクストロノール（ＥＴＮ）の濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 エクストロノールのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 エクストロノールのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 トリフロレトールＡ（ＴＰＥ−Ａ）の濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 トリフロレトールＡ（ＴＰＥ−Ａ）の濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 トリフロレトールＡのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 トリフロレトールＡのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 フコジフロレトールＧ（ＦＤＥ−Ｇ）の濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 フコジフロレトールＧ（ＦＤＥ−Ｇ）の濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 フコジフロレトールＧのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 フコジフロレトールＧのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 エコールの濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 エコールの濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 エコールのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 エコールのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 ６，６’−ビエコールの濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 ６，６’−ビエコールの濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 ６，６’−ビエコールのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 ６，６’−ビエコールのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。 前記睡眠誘導効果の確認試験で陽性対照群として使われたジアゼパム（ＤＺＰ）とゾルピデム（ＺＰＤ）との有効濃度を確認するために、濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ確認したグラフである。 前記睡眠誘導効果の確認試験で陽性対照群として使われたジアゼパム（ＤＺＰ）とゾルピデム（ＺＰＤ）との有効濃度を確認するために、濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ確認したグラフである。 クロメメタノール抽出物（ＥＫＯ−Ｍ）の放射性標職されたＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピンリガンド［^３Ｈ］フルマゼニルの結合抑制効果を示すグラフである。 クロメメタノール抽出物（ＥＫＯ−Ｍ）をラットに経口投与し、４５分後、ｈｙｐｎｏｔｉｃ（４５ｍｇ／ｋｇ）濃度のペントバルビタールを腹腔注射で投与し、入眠潜時を示すグラフである。＊＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０１で有意差がある（Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ ｔｅｓｔ）。 クロメメタノール抽出物（ＥＫＯ−Ｍ）をラットに経口投与し、４５分後、ｈｙｐｎｏｔｉｃ（４５ｍｇ／ｋｇ）濃度のペントバルビタールを腹腔注射で投与し、睡眠時間を調査したグラフである。＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０５で有意差があり、＊＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０１で有意差がある（Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ ｔｅｓｔ）。（ＣＯＮ：対照区（０．５％ ＣＭＣ−ｓａｌｉｎｅ １０ｍＬ／ｋｇ）を経口投与後、ペントバルビタール投与 ＤＺＰ：ジアゼパム２ｍｇ／ｋｇを経口投与後、ペントバルビタール投与 ＥＣＫ−Ｍ：カジメメタノール抽出物をそれぞれ１０００ｍｇ／ｋｇ投与後、ペントバルビタール投与 ＥＫＯ−Ｍ：クロメメタノール抽出物を１０００ｍｇ／ｋｇ投与後、ペントバルビタール投与） カジメエタノール抽出物及び水抽出物とジアゼパムとの併用経口投与に対する睡眠誘導シナジー効果を調べるために、ＥＣＫ−Ｅは、１００ｍｇ／ｋｇ、ＥＣＫ−Ｗは、１００ｍｇ／ｋｇ、ジアゼパム（ＤＺＰ）は、０．５ｍｇ／ｋｇをペントバルビタール投与（ｈｙｐｎｏｔｉｃ ｄｏｓａｇｅ ４５ｍｇ／ｋｇ）４５分前に経口投与して測定した入眠潜時と睡眠時間とを示すグラフである。 カジメエタノール抽出物及び水抽出物とジアゼパムとの併用経口投与に対する睡眠誘導シナジー効果を調べるために、ＥＣＫ−Ｅは、１００ｍｇ／ｋｇ、ＥＣＫ−Ｗは、１００ｍｇ／ｋｇ、ジアゼパム（ＤＺＰ）は、０．５ｍｇ／ｋｇをペントバルビタール投与（ｈｙｐｎｏｔｉｃ ｄｏｓａｇｅ ４５ｍｇ／ｋｇ）４５分前に経口投与して測定した入眠潜時と睡眠時間とを示すグラフである。 フルマゼニル（ＦＬＵ）が、カジメエタノール抽出物、水抽出物、酢酸エチル分画の睡眠誘導効果に及ぼす影響に対して調べるために、ＥＣＫ−Ｅは、１０００ｍｇ／ｋｇ、ＥＣＫ−Ｗは、１０００ｍｇ／ｋｇ、ＥｔＡｃＯは、２００ｍｇ／ｋｇ、ジアゼパム（ＤＺＰ）は、０．５ｍｇ／ｋｇをペントバルビタール投与（ｈｙｐｎｏｔｉｃ ｄｏｓａｇｅ ４５ｍｇ／ｋｇ）４５分前に経口投与し、フルマゼニル（ＦＬＵ）は、８ｍｇ／ｋｇをＥＣＫ−Ｅ、ＥＣＫ−Ｗ、ＤＺＰ経口投与１０分前にあらかじめ腹腔注射して、入眠潜時と睡眠時間とに対して測定したグラフである。 フルマゼニル（ＦＬＵ）が、カジメエタノール抽出物、水抽出物、酢酸エチル分画の睡眠誘導効果に及ぼす影響に対して調べるために、ＥＣＫ−Ｅは、１０００ｍｇ／ｋｇ、ＥＣＫ−Ｗは、１０００ｍｇ／ｋｇ、ＥｔＡｃＯは、２００ｍｇ／ｋｇ、ジアゼパム（ＤＺＰ）は、０．５ｍｇ／ｋｇをペントバルビタール投与（ｈｙｐｎｏｔｉｃ ｄｏｓａｇｅ ４５ｍｇ／ｋｇ）４５分前に経口投与し、フルマゼニル（ＦＬＵ）は、８ｍｇ／ｋｇをＥＣＫ−Ｅ、ＥＣＫ−Ｗ、ＤＺＰ経口投与１０分前にあらかじめ腹腔注射して、入眠潜時と睡眠時間とに対して測定したグラフである。 カジメエタノール抽出物が、ラットの睡眠構造に及ぼす影響を調べるために、Ｃｏｎｔｒｏｌ群は、０．５％ ＣＭＣ−ｓａｌｉｎｅ溶液を、ＥＣＫ−Ｅは、５００ｍｇ／ｋｇをそれぞれ経口投与（ｐ．ｏ．）し、脳波を測定した後、分析したグラフである。 カジメエタノール抽出物が、ラットの睡眠構造に及ぼす影響を調べるために、Ｃｏｎｔｒｏｌ群は、０．５％ ＣＭＣ−ｓａｌｉｎｅ溶液を、ＥＣＫ−Ｅは、５００ｍｇ／ｋｇをそれぞれ経口投与（ｐ．ｏ．）し、脳波を測定した後、分析したグラフである。＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０５で有意差があること（Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ ｔｅｓｔ）を意味する。

以下、本発明を詳細に説明する。

ＧＡＢＡ_Ａ受容体は、抗不安、抗痙攣、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善効果と関連しており、ＧＡＢＡ_Ａ受容体に作用する薬物としては、作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）としては、ベンゾジアゼピン、ジアゼパム（ｄｉａｚｅｐａｍ、ＤＺＰ）、ゾルピデム（ｚｏｌｐｉｄｅｍ）などがあり、拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）としては、フルマゼニル（ｆｌｕｍａｚｅｎｉｌ、ＦＬＵ）がある。前述したように、ＧＡＢＡ_Ａ受容体に作用する薬物の場合、依存性及び副作用をもたらす問題点がある。

褐藻類抽出物は、緑藻類や紅藻類とは異なって、ＧＡＢＡ_Ａ−ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ（ベンゾジアゼピン）受容体に作用して、抗不安、抗痙攣、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善効果を有していることを確認した。前記睡眠改善は、入眠潜時（ｓｌｅｅｐ ｌａｔｅｎｃｙ）が減少し、睡眠時間（ｓｌｅｅｐ ｄｕｒａｔｉｏｎ）が増加する効果でありうるが、これに本発明の範囲が制限されるものではない。

前記褐藻類抽出物でＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体に作用して、抗不安、抗痙攣、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善効果を表わす有効成分は、褐藻類にのみ特異的に存在するポリフェノール化合物であるフロログルシノールまたはフロロタンニンであることを確認した。

前記フロロタンニンは、フロログルシノールのオリゴマーである。フロロタンニンは、例えば、エコール類、フコール類、フロレトール類、フハロール類及びエクストロノールのうちから選択されうる。前記エコール類は、エコール、ダイエコール、ビエコール、フロロエコール、フロエコール、フコフロエコール、フロロフコフロエコールなどがあり、フコール類は、２ないし１０個のフロログルシノールがアリール−アリール結合されたオリゴマーであり、フロレトール類は、２ないし１０個のフロログルシノールがアリール−エーテル結合されたオリゴマーであり、フハロール類は、３ないし１０個のフロログルシノールがパラまたはオルト位置でエーテル結合され、３番目の環ごとに水酸基をさらに含むオリゴマーである。ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体に作用して、抗不安、抗痙攣、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善効果に優れたフロロタンニンとしては、エクストロノール、トリフロレトールＡ、フコジフロレトールＧ、エコール及び５，６’−ビエコールがある。

本発明の組成物の有効成分であるフロログルシノールまたはフロロタンニンは、褐藻類から個別化合物に分離されたものを使うか、１つ以上のフロロタンニンが混合されている状態で抽出された抽出物、その抽出物を再び分画した濃縮物を使うことができ、または人工的に合成または半合成されたものを使うこともできる。

前記褐藻類は、例えば、ヘラヤハズ、カジメ、クロメ、ツルアラメ、アカモク、ハバノリ、ネバリモ、イワヒゲ、フクロノリ、ヤツマタモク、サナダグサ、アミジグサ、コンブ、ワカメ及びイシゲのうちから選択される何れか１つ以上の褐藻類であり、望ましくは、カジメまたはクロメであり、さらに望ましくは、カジメである。

前記褐藻類抽出物は、水、有機溶媒またはこれらの混合物を抽出溶媒として用いて抽出されたものであり得る。この際、使われる有機溶媒の種類や水と有機溶媒との混合比率は、特に制限されるものではない。

例えば、前記有機溶媒は、低級アルコール、ヘキサン、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、及びジエチルエーテルからなる群から選択された１つ以上の溶媒であり得る。前記低級アルコールは、炭素数１ないし６のアルコールであり得る。例えば、低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノール、ノルマルブタノール、１−ペンタノール、２−ブトキシエタノールまたはエチレングリコールなどを利用できる。有機溶媒は、それ以外にも、酢酸、ＤＭＦＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）などの極性溶媒、アセトニトリル、酢酸エチル、酢酸メチル、フルオロアルカン、ペンタン、２，２，４−トリメチルペンタン、デカン、シクロヘキサン、シクロペンタン、ジイソブチレン、１−ペンテン、１−クロロブタン、１−クロロペンタン、ｏ−キシレン、ジイソプロピルエーテル、２−クロロプロパン、トルエン、１−クロロプロパン、クロロベンゼン、ベンゼン、ジエチルエーテル、硫酸ジエチル、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、アニリン、ジエチルアミン、エーテル、四塩化炭素及びＴＨＦ（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）などの非極性溶媒を使うこともできる。

前記褐藻類抽出物は、褐藻類水抽出物、褐藻類エタノール抽出物、褐藻類メタノール抽出物、または水、エタノール及びメタノールのうちから選択される何れか２種以上の溶媒の混合溶媒による褐藻類抽出物であり得るが、これに本発明の範囲が制限されるものではない。

水抽出物の製造は、褐藻類を４０〜１００℃の水で２〜４８時間抽出して製造し、さらに望ましくは、水抽出による水溶性成分の抽出効率を増大させるために、セルラーゼ、ビスコザイム、アルカラーゼ及びペクチンからなる群から選択される１種以上の酵素を添加した水で４０〜５５℃で２〜２４時間抽出して製造することができる。

エタノール抽出物の製造は、褐藻類を３５〜７５％のエタノールで２０〜６０℃で２〜３６時間、望ましくは、４０〜５０℃で２．５〜６時間抽出して製造し、より望ましくは、７０％のエタノール水溶液で４５℃で３時間抽出して製造する。

メタノール抽出物の製造は、褐藻類を３５〜８５％のメタノールで２０〜６０℃で２〜３６時間抽出して製造し、望ましくは、２０〜３０℃で２２〜２６時間抽出して製造し、より望ましくは、８０％のメタノールで２５℃で２４時間抽出して製造する。

本発明の褐藻類抽出物のうちから、カジメ水抽出物は、前記ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体の結合測定でＩＣ_５０が１．０２〜１．０３μｍであり得る。また、カジメエタノール抽出物は、前記ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体の結合測定でＩＣ_５０が０．４５〜０．４６μｍであり得る。また、カジメメタノール抽出物は、前記ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体の結合測定でＩＣ_５０が１．２５〜１．２６μｍであり得る。また、クロメメタノール抽出物は、前記ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体の結合測定でＩＣ_５０が０．６２〜０．６３μｍであり得る。

本明細書で使われる用語‘抽出物’は、抽出物を追加的に分画（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）した分画物も含む。すなわち、褐藻類抽出物は、前述した抽出溶媒を用いて得たものだけではなく、これに錠剤過程を追加的に適用してフロロタンニンを濃縮させて得たものも含む。また、前記抽出物や分画物を一定の分子量カットオフ値を有する限外濾過膜を通過させて得た分画、多様なクロマトグラフィー（サイズ、電荷、疎水性または親和性による分離のために製作されたもの）による分離など、追加的に実施された多様な錠剤方法を通じて得られた分画も、本発明の褐藻類抽出物に含まれる。

本発明のフロログルシノール、フロロタンニンまたは褐藻類抽出物を有効成分とするＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体活性用組成物は、抗不安、抗痙攣、鎮静及び不眠症治療用薬学組成物であり得る。

前記抗不安、抗痙攣、鎮静及び不眠症治療用薬学組成物の薬学的投与形態は、これらの薬学的許容可能な塩の形態で使うことができ、単独で他の薬学的活性化合物と結合だけではなく、適当な集合の形態で使用できる。

また、本発明による抗不安、抗痙攣、鎮静及び不眠症治療用薬学組成物は、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、阻剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口剤剤型、外用剤、座剤及び滅菌注射溶液の形態で剤型化されて使うことができ、剤型化のために、薬学組成物の製造に通常使われる適切な担体、賦形剤または希釈剤を含みうる。

前記担体、または、賦形剤または希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、燐酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油などを含んだ多様な化合物あるいは混合物が挙げられる。

製剤化する場合には、普通使う充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使って製造することができる。

経口投与のための固型製剤は、前記抽出物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、ホウ酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて製造することができる。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使うことができる。

経口のための液状製剤としては、懸濁液、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使う単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含みうる。

非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水溶性剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性用剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使うことができる。座剤の基剤としては、ハードファット（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロールゼラチンなどを使うことができる。

本発明による抗不安、抗痙攣、鎮静及び不眠症治療用薬学組成物の望ましい投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択されうる。しかし、望ましい効果のためには、１日０．０００１ないし２，０００ｍｇ／ｋｇで、望ましくは、０．００１ないし２，０００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は、１日に１回投与することもでき、数回分けて投与することもできる。但し、前記投与量によって、本発明の範囲を限定するものではない。

本発明による抗不安、抗痙攣、鎮静及び不眠症治療用薬学組成物は、ラット、マウス、家畜、人間などの哺乳動物に多様な経路で投与することができる。投与のあらゆる方式は、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与することができる。

また、本発明は、フロログルシノール、フロロタンニンまたは褐藻類抽出物を有効成分とする抗不安、抗痙攣、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善用食品組成物であることを特徴とする。

本発明によるフロログルシノール、フロロタンニンまたは褐藻類抽出物を健康機能食品または一般食品の有効成分添加物として使う場合、本発明による抽出物をそのまま添加するか、他の食品または食品成分と共に使うことができ、通常の方法によって適切に使うことができる。有効成分の混合量は、予防、健康または治療などの各使用目的によって適するように決定することができる。

一般的に、食品または飲料の製造時に、本発明によるフロログルシノール、フロロタンニンまたは褐藻類抽出物は、原料に対して１５重量部以下、望ましくは、１０重量部以下の量で添加することができる。しかし、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下であり、また、本発明は、天然物からの抽出物を利用する点で安全性面で問題がないので、前記範囲以上の量でも使うことができる。

前記食品の種類には、特に制限はなく、前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含んだ酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常の意味での食品をいずれも含みうる。

本発明による健康機能食品のうち、飲料食品は、通常の飲料のようにさまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。前述した天然炭水化物は、葡萄糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールであり得る。甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使うことができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明による機能性食品１００ｍＬ当たり約０．０１〜０．０４ｇ、望ましくは、約０．０２〜０．０３ｇであり得る。

前記以外に、本発明による抗不安、抗痙攣、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善用食品組成物は、さまざまな営養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤を含有することができる。その他に、本発明の睡眠改善用組成物は、天然果汁、果汁飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立してまたは混合して使うことができる。このような添加剤の比率は、制限されるものではないが、本発明の組成物１００重量部に比べて、０．０１〜０．１重量部の範囲で選択されることが一般的である。

以下、望ましい実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲が、これに制限されるものではないということは当業者に自明である。

［実験例１：海藻類抽出物でのＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性の探索］
抗不安、抗痙攣、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善効果を有する海藻類を探索するために、５種の緑藻類、７種の紅藻類及び６種の褐藻類、総１８種の海藻類のメタノール抽出物を韓国の済州テクノパークの済州生物資源抽出物銀行で購入して、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合力を測定した。証拠見本（Ｖｏｕｃｈｅｒ ｓｐｅｃｉｍｅｎ）は、済州生物資源抽出物銀行に寄託した。

ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性の測定は、ＳＤ ラットの大脳皮質を摘出した後、即時３０ｍＭ トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．４、４℃で維持）２０ｍＬに入れてホモジナイズさせ、１０秒間超音波を処理した。引き続き２７，０００×ｇ及び４℃の条件で１５分間遠心分離した後、上澄み液を捨て、再びバッファー２０ｍＬを取って遠心分離し、この過程を３回繰り返した。脳組職内のＧＡＢＡを除去するために、３７℃の水槽で３０分間インキュベーションさせ、遠心分離した後、ペレットを収集して−８０℃で凍結保管して使った。凍結された膜組織を解凍させた後、２７，０００×ｇ及び４℃の条件で１０分間遠心分離した後、上澄み液を捨て、５０ｍＭ クエン酸トリスバッファー（結合バッファー、ｐＨ７．１、４℃で維持）２０ｍＬを入れて遠心分離した。この過程を３回繰り返した後、膜組織を結合バッファーに５００ｍＬ バッファー／オリジナル組織 ｇの濃度で懸濁させて、結合力評価試験に使った。９６−ウェルプレートに膜組織懸濁液１８０μｌ、それぞれの抽出物試料１０μｌ及び［^３Ｈ］フルマゼニル（１ｎＭ、終末濃度）（Ｒｏ １５−１７８８；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）１０μｌを入れ、氷浴で４０分間インキュベーションした。引き続きガラス繊維フィルタ（ＧＦ／Ｃ、Ｗｈａｔｍａｎ）を用いて収集した。サンプルの放射線は、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ液体シンチレーションアナライザ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）を通じて測定された。非特異的結合（ＮＳＢ）は、クロナゼパム（１ｕＭ、終末濃度）を用いて、その値を決定し、結合の置換（％）は、下記の式（１）のように計算した。
式（１）
結合の置換（％）＝［１−（（試料のＤＰＭ−ＮＳＢ ＤＰＭ）／（ＴＢ ＤＰＭ−ＮＳＢ ＤＰＭ））］×１００
（ＤＰＭ：１分当りの崩壊（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）、ＴＢ：全結合（ｔｏｔａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）、ＮＳＢ：非特異的結合）
抽出物の濃度をそれぞれ０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬに異ならせて、緑藻類メタノール抽出物のＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性の結果は、［表１］に表わし、紅藻類メタノール抽出物の結果は、［表２］に表わし、褐藻類メタノール抽出物の結果は、［表３］に表わした。

緑藻類でボタンアオサ（Ｕｌｖａ ｃｏｎｇｌｏｂａｔａ Ｋｊｅｌｌｍａｎ）と紅藻類でオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ Ｐａｐｅｎｆｕｓｓ）とが１０ｍｇ／ｍＬ濃度で８０％以上の［^３Ｈ］−フルマゼニルの結合を置換するＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性を表わしたが、残りのほとんどの緑藻類と紅藻類では、効果的なＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性を表わすことができなかった。しかし、褐藻類では、サナダグサ（Ｄｉｃｔｙｏｔａ ｃｏｒｉａｃｅａ）及びヤツマタモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ．Ａｇａｒｄｈ）を除いては、ほとんど結合活性を１０ｍｇ／ｍＬ濃度で５５％以上のＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性を表わし、特に、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ Ｋｊｅｌｌｍａｎ）は、９０％以上のＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性を表わした。

［実験例２：抽出溶媒によるカジメ抽出物のＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性］
実験例１で、９０％以上のＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性が最も優れたカジメ（ＥＣＫ）で抽出溶媒を異ならせた時、活性の差があるかを確認するために、抽出溶媒を異ならせたカジメ抽出物を製造した。

カジメエタノール抽出物は、７０％エタノールで５０℃で３時間抽出し、カジメ水抽出物は、酵素（ビスコザイム、アルカラーゼ、ペクチン）を添加して４５℃で３時間抽出し、カジメメタノール抽出物は、８０％メタノールで常温で２４時間抽出した。あらゆる抽出物は、抽出後、濾過及び濃縮過程を経た後、凍結乾燥して粉末化した。

図１は、カジメ水、エタノール、メタノール抽出物の放射性標職されたＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピンリガンド［^３Ｈ］フルマゼニルの結合置換効果を示すグラフである。これは、睡眠効果を表わす成分を探索するために、一般的に使われる方法で［^３Ｈ］フルマゼニルの置換効果が高いほど、その物質の結合活性が高いことを意味する。

カジメの３種の抽出物いずれもＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体に対する親和力が濃度依存的に高くなり、ＩＣ_５０値は、ＥＣＫ−Ｗ（水抽出物）＝１．０２６、ＥＣＫ−Ｍ（メタノール抽出物）＝１．２５６、ＥＣＫ−Ｅ（エタノール抽出物）＝０．４５６ｍｇ／ｍＬを表わした。

［実験例３：抽出溶媒及び濃度によるカジメ抽出物の睡眠誘導効果］
１）実験材料
ペントバルビタール（Ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ）は、翰林製薬会社から購入し、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体の拮抗剤であるジアゼパム（ＤＺＰ）は、よく知られた睡眠剤の１つであって、鎮静及び睡眠誘導効果の陽性対照群として使った。

実験動物として、重量１８〜２２ｇの雄ＩＣＲマウス（Ｋｏａｔｅｃｈ Ａｎｉｍａｌ社）を温度２４℃、湿度５５％、蛍光灯明暗１２時間サイクル（照明午前８時）の条件下で試料及び飮水は自在に摂取させ、新たな環境に適応させるために、実験前１週間飼育した。また、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合評価のためのメンブレン準備のために、重量２００〜２５０ｇのＳＤラットを使った。動物実験と関連したあらゆる手続きは、韓国食品研究員動物管理委員会（ＫＦＲＩ−ＩＡＣＵＣ、Ｋｏｒｅａ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の実験動物使用指針に基づいて行った。

２）実験方法
あらゆる実験は、午後１時から５時の間に進行し、マウスは、実験前２４時間前に節食させた。経口投与のために、カジメエタノール抽出物を０．５％ カルボキシメチルセルロース（０．５％、ＣＭＣ−食塩水（ｓａｌｉｎｅ） １０ｍＬ／ｋｇ）に希釈させ、陽性対照群であるジアゼパム（ＤＺＰ）は、やはり０．５％ ＣＭＣ−食塩水に希釈させた。カジメエタノール抽出物及び水抽出物（それぞれ１００、２５０、５００、１０００ｍｇ／ｋｇ）とジアゼパム（ＤＺＰ、２ｍｇ／ｋｇ）とをペントバルビタール投与４５分前に経口投与した。また、陰性対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ、ＣＯＮ）としては、別途の薬物を投与せず、０．５％ ＣＭＣ−食塩水１０ｍＬ／ｋｇを投与した。

それぞれマウスにペントバルビタール（サブ−ヒプノティック（ｓｕｂ−ｈｙｐｎｏｔｉｃ）用量３０ｍｇ／ｋｇ、ヒプノティック用量４５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔注射した後、入眠潜時と睡眠時間とを測定した。ペントバルビタールをマウスに腹腔内に注射した後から背中で底に寄り掛けながら、頭位反射を喪失するまでの経過時間を、すなわち、ペントバルビタール注射後、睡眠開始（ｓｌｅｅｐ ｏｎｓｅｔ）までの時間を入眠潜時と見なし、箱内のマウスのうちからペントバルビタール投与後に１分以上動きがない場合、眠ったと見なした。睡眠時間は、マウスが箱に移された後、動きがない時から自律行動を回復するまでの時間と見なした。ペントバルビタールのサブ−ヒプノティック用量の実験で、睡眠開始計算方法は、下記の式（２）の通りである。
式（２）
睡眠開始（％）＝（睡眠状態数／全体数）×１００

３）ヒプノティック濃度のペントバルビタールによって誘導されたラットでカジメエタノール及び水抽出物の睡眠誘導効果
カジメエタノール抽出物（ＥＣＫ−Ｅ）及び水抽出物（ＥＣＫ−Ｗ）を１００、２５０、５００、１，０００ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与（ｐ．ｏ．）した後、ペントバルビタール（４５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）による睡眠誘導効果に及ぼす影響を、下記の図２ａ及び図２ｂに表わした。各グラフは、平均値（ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ、ｎ＝１０）を表わす。

＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０５で、＊＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．００１で有意差があること（Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ ｔｅｓｔ）を意味し、＃は、ｐ＜０．０５で、＃＃は、ｐ＜０．０１で併用投与したグループと単一投与したグループとの間の有意差があるということを意味する。

カジメエタノール抽出物（ＥＣＫ−Ｅ）は、用量依存的に入眠潜時を減少させ、１００ｍｇ／ｋｇを除いた濃度で用量依存的に睡眠時間を増加させて、睡眠増進効果を表わした。カジメ水抽出物（ＥＣＫ−Ｗ）の場合は、低濃度では睡眠効果が表われなかったが、５００、１，０００ｍｇ／ｋｇの濃度で用量依存的に睡眠時間の有意な増加（ｐ＜０．０１）と入眠潜時の有意な減少（ｐ＜０．０１）とが表われた。特に、カジメ水抽出物（ＥＣＫ−Ｗ）１，０００ｍｇ／ｋｇの濃度では、カジメエタノール抽出物（ＥＣＫ−Ｅ）と陽性対照（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）であるＤＺＰよりも有意的に減少（ｐ＜０．０１）した入眠潜時を確認することができた。

４）Ｓｕｂ−ｈｙｐｎｏｔｉｃ濃度のペントバルビタールによって誘導されたラットでカジメエタノール及び水抽出物の睡眠誘導効果
カジメエタノール及び水抽出物が、サブ−ヒプノティック（ペントバルビタール３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔注射）濃度での入眠潜時と睡眠時間とを測定して、睡眠誘導効果に及ぼす影響を、下記の［表４］と［表５］とに表わした。実験の結果、カジメエタノール抽出物は、サブ−ヒプノティック濃度のペントバルビタールで対照グループは睡眠を誘導することができなかったが、ジアゼパム（２ｍｇ／ｋｇ、経口投与）は、睡眠開始が１００％で最も高く測定され、いずれもが睡眠状態に入った。カジメエタノール及び水抽出物では、濃度依存的に睡眠開始の入眠潜時の増加と睡眠時間の増加とが表われ、特に、１０００ｍｇ／ｋｇの濃度では、睡眠開始がそれぞれ９２％と９０％とで高く表われた。睡眠時間も、それぞれ３８．７±６．３分と３９．９３±４．７分とで有意な増加（ｐ＜０．０５）を表わした。

前記［表４］と［表５］は、ＣＯＮ（０．５％、ＣＭＣ−食塩水 １０ｍＬ／ｋｇ）、カジメエタノール抽出物（ＥＣＫ−Ｅ、それぞれ１００、２５０、５００、１０００ｍｇ／ｋｇ）、カジメ水抽出物（ＥＣＫ−Ｗ、それぞれ１００、２５０、５００、１０００ｍｇ／ｋｇ）とＤＺＰ（２ｍｇ／ｋｇ）とをペントバルビタール投与４５分前に経口投与した結果であって、
睡眠開始（％）＝（睡眠状態数／全体数）×１００
睡眠時間は、平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝１２）
＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０５で有意差があり、＊＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０１で有意差がある（Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ ｔｅｓｔ）。
ＣＯＮ：対照群（０．５％ ＣＭＣ−食塩水 １０ｍＬ／ｋｇ）を経口投与後、ペントバルビタール投与
ＤＺＰ：ジアゼパム２ｍｇ／ｋｇを経口投与後、ペントバルビタール投与
ＥＣＫ−Ｅ：カジメエタノール抽出物１００、２５０、５００、１０００ｍｇ／ｋｇを経口投与後、ペントバルビタール投与
ＥＣＫ−Ｗ：カジメ水抽出物１００、２５０、５００、１０００ｍｇ／ｋｇを経口投与後、ペントバルビタール投与

前記［表４］及び［表５］から見るように、カジメエタノール及び水抽出物は、濃度依存的に入眠潜時の増加と睡眠時間の増加とがあることを確認することができる。

［実験例４：カジメ抽出物分画のＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性及び睡眠誘導効果］
１）カジメ抽出物分画の製造
ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体に結合して、鎮静及び睡眠誘導などの活性を表わす有効成分を確認するために、図３に示すように、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、ｎ−ブタノール及び水分画を製造した。

２）ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性及び睡眠誘導効果の実験結果
ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピンリガンド［^３Ｈ］フルマゼニルの結合置換効果は、実験例１の方法で確認して、それぞれのカジメ抽出物分画の［^３Ｈ］フルマゼニルの結合置換効果を、図４ａに表わし、Ｈｙｐｎｏｔｉｃ濃度のペントバルビタールによって誘導されたラットでカジメ抽出物分画の睡眠誘導効果を、実験例３の方法で確認して、図４ｂに表わした。

酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）分画が最も低いＩＣ_５０値（０．０１８５ｍｇ／ｍＬ）を表わし、ｎ−ブタノール、ｎ−ヘキサン及び水分画は、ＩＣ_５０値がそれぞれ０．１０３３、０．１４０５及び０．９６０７を表わした（図４ａ）。

睡眠誘導効果と関連しても、前記［^３Ｈ］フルマゼニルの結合置換活性と類似した傾向を表わした。酢酸エチル分画は、１００及び２００ｍｇ／ｍＬいずれもで睡眠時間が著しく増加し、水分画は、２００ｍｇ／ｍＬでも、意味ある睡眠誘導活性を表わすことができなかった（図４ｂ）。

前記結果からカジメ抽出物の酢酸エチル分画にＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体に親和力を有して、抗不安、抗痙攣、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善効果を表わす有効成分含量が多いと判断された。

［実験例５：カジメ抽出物分画の総フェノール含量とＧＡＢＡＡ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性及び睡眠誘導効果との相関関係］
カジメ抽出物の酢酸エチル分画には、褐藻類特有のポリフェノールであるフロロタンニンが多数含まれているので、前記酢酸エチル分画のＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピンリガンド［^３Ｈ］フルマゼニルの結合置換効果及び睡眠誘導効果が、フロロタンニンによることである可能性を確認するために、前記それぞれのカジメ抽出物分画の総フェノール含量を分析し、総フェノール含量とＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性及び睡眠誘導効果との相関関係を分析した。

［表６］は、カジメ抽出物分画の総フェノール含量を表わしたものであって、酢酸エチル分画で総フェノール含量（ＴＰＣ）が最も高く、水分画で最も低いことを確認した。カジメエタノール抽出物（ＥＣＫ−Ｅ）の総フェノール含量は、１３８．５ｍｇ ＰＥＧ／ｇで酢酸エチル分画及びｎ−ブタノール分画がカジメエタノール抽出物に比べて、総フェノール含量が高かった。

前記各カジメ抽出物分画の総フェノール含量（ＴＰＣ）と［^３Ｈ］フルマゼニルの結合に対するＩＣ_５０との相関関係を、図５ａに表わし、各カジメ抽出物分画の総フェノール含量（ＴＰＣ）と睡眠時間との相関関係を、図５ｂに表わした。

前記図５ａ及び図５ｂによれば、各抽出物分画の結合活性と睡眠誘導効果は、総フェノール含量に比例することが分かった。結合活性の非線形回帰分析による係数（Ｒ^２）は、０．９５４４であり、睡眠時間と総フェノール含量との間にも、１００ｍｇ／ｋｇ濃度ではＲ^２が０．８３９６、２００ｍｇ／ｋｇ濃度ではＲ^２が０．９０５１であって、相関関係が高いということが分かった。

また、前記カジメ抽出物分画とカジメエタノール抽出物とに含まれたフロロタンニン化合物の種類及び含量（ｍｇ／ｇ）を分析して、［表７］に表わした。

前記各カジメ抽出物分画及びカジメエタノール抽出物から検出されたフロロタンニン化合物は、フロログルシノール、エコール、エクストロノール、トリフロレトールＡ及びダイエコールであった。各フロロタンニン化合物の構造は、図６に表わした。

結合活性と睡眠誘導効果とが高かった酢酸エチル分画とｎ−ブタノール分画とで総フロロタンニン化合物の含量が、３６７．４２ｍｇ／ｇ及び１７７．１１ｍｇ／ｇでｎ−ヘキサン分画及び水分画に比べて、著しく高かった。

また、それぞれの分画で総フロロタンニン化合物の含量と睡眠時間との相関関係は、１００ｍｇ／ｋｇ濃度ではＲ^２が０．９６８２、２００ｍｇ／ｋｇ濃度ではＲ^２が０．９４３４であって、非常に高いということを確認することができた。

［実験例６：フロロタンニン化合物のＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性］
前記各カジメ抽出物分画に存在するフロロタンニン化合物のＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピンリガンド［^３Ｈ］フルマゼニルの結合置換効果を表わすＩＣ_５０値と結合親和度（Ｋ_ｉ）を計算して、［表８］に表わした。結合親和度（Ｋ_ｉ）は、下記の式（３）のように計算した。
式（３）
Ｋ_ｉ＝（ＩＣ_５０）／（１＋（［Ｌ］／Ｋ_ｄ））
（［Ｌ］：使用された放射性リガント（［^３Ｈ］フルマゼニル）の濃度、Ｋ_ｄ：［^３Ｈ］フルマゼニルの競合リガント（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ）解離平衡定数。Ｋ_ｄ値は１．６ｎＭである。）

フロロタンニン化合物の結合親和度の相対的強度を確認するために、陽性対照区としてジアゼパム（ＤＺＰ）を使った。エコールとエクストロノールは、トリフロレトールＡやダイエコールに比べて、結合親和度が高く、フロロタンニンの基本骨格となるフロログルシノールの場合、１０００μＭで４２．２５％の阻害を表わして、結合親和度が異なるフロロタンニンに比べて、高くなかった。

［実験例７：褐藻類抽出物の総フェノール含量とＧＡＢＡＡ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性及び睡眠誘導効果との相関関係］
前記［表３］の褐藻類のうちからＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性が異なるサナダグサ、ヘラヤハズ（Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒｉｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ Ｏｋａｍｕｒａ）、カジメを選別し、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性が高かったカジメと同一属のクロメとを追加して、それぞれのメタノール抽出物の総フェノール含量を測定し、総フェノール含量とＧＡＢＡＡ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性及び睡眠誘導効果との相関関係を確認した。

［表９］は、４種の褐藻類メタノール抽出物の総フェノール含量を測定したものであって、カジメ抽出物分画の総フェノール含量を表わしたものであって、クロメは、カジメと総フェノール含量が類似し、ヘラヤハズ、サナダグサの順序で含量が低くなった。

前記クロメメタノール抽出物、カジメメタノール抽出物、ヘラヤハズメタノール抽出物及びサナダグサメタノール抽出物の総フェノール含量（ＴＰＣ）と１０ｍｇ／ｍＬ濃度での［３Ｈ］フルマゼニルの結合活性との相関関係を、図７ａに表わし、各褐藻類メタノール抽出物の総フェノール含量（ＴＰＣ）と睡眠時間との相関関係を、図７ｂに表わした。

前記図５ａ及び図５ｂで、カジメ抽出物分画の総フェノール含量によって結合活性と睡眠誘導効果が、総フェノール含量に比例すると同様に、図７ａ及び図７ｂでも、それぞれの褐藻類の総フェノール含量と結合活性や睡眠誘導効果が、比例関係にあることを確認することができた。

［実験例８：フロログルシノールまたはフロロタンニンの睡眠誘導効果及びフルマゼニルが睡眠誘導に及ぼす影響］
フロログルシノール（ｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌ、ＰＧ）及びフロロタンニンのうちからエクストロノール（ｅｃｋｓｔｏｌｏｎｏｌ、ＥＴＮ）、トリフロレトールＡ（ｔｒｉｐｈｌｏｒｅｔｈｏｌ Ａ、ＴＰＥ−Ａ）、フコジフロレトールＧ（ｆｕｃｏｄｉｐｈｌｏｒｅｔｈｏｌ Ｇ、ＦＤＥ−Ｇ）、エコール（ｅｃｋｏｌ）及び６，６’−ビエコール（６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌ）の濃度による睡眠誘導効果及びフルマゼニルが、睡眠誘導に及ぼす影響を確認した。

フロログルシノールまたはフロロタンニンの濃度による睡眠誘導効果を確認するために、実験例３の方法を利用するが、フロログルシノールまたはフロロタンニンを５、１０、２５、５０ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与（ｐ．ｏ．）した後、ペントバルビタール（４５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）による睡眠誘導効果を確認した。陰性対照群（ＣＯＮ）は０．５％、ＣＭＣ−ｓａｌｉｎｅ １０ｍＬ／ｋｇであり、陽性対照群としてジアゼパム（ＤＺＰ）２ｍｇ／ｋｇとゾルピデム（ＺＰＤ）１０ｍｇ／ｋｇとをペントバルビタール投与４５分前に経口投与して、入眠潜時と睡眠時間とを測定した。

フルマゼニルが、睡眠誘導効果に及ぼす影響に対して調べるために、フロログルシノールまたはフロロタンニンは、５０ｍｇ／ｋｇ、ＤＺＰは、２ｍｇ／ｋｇ、ＺＰＤは、１０ｍｇ／ｋｇをペントバルビタール投与（ｈｙｐｎｏｔｉｃ ｄｏｓａｇｅ ４５ｍｇ／ｋｇ）４５分前に経口投与し、ＦＬＵは、８ｍｇ／ｋｇを前記試料の経口投与１０分前にあらかじめ腹腔注射して、入眠潜時と睡眠時間とを測定した。

図８ａ及び図８ｂは、フロログルシノール（ＰＧ）の濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフであり、図８ｃ及び図８ｄは、フロログルシノールのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。

図９ａ及び図９ｂは、エクストロノール（ＥＴＮ）の濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフであり、図９ｃ及び図９ｄは、エクストロノールのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。

図１０ａ及び図１０ｂは、トリフロレトールＡ（ＴＰＥ−Ａ）の濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフであり、図１０ｃ及び図１０ｄは、トリフロレトールＡのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。

図１１ａ及び図１１ｂは、フコジフロレトールＧ（ＦＤＥ−Ｇ）の濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフであり、図１１ｃ及び図１１ｄは、フコジフロレトールＧのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。

図１２ａ及び図１２ｂは、エコールの濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフであり、図１２ｃ及び図１２ｄは、エコールのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。

図１３ａ及び図１３ｂは、６，６’−ビエコールの濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフであり、図１３ｃ及び図１３ｄは、６，６’−ビエコールのフルマゼニル投与の有無による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ示すグラフである。

図１４ａ及び図１４ｂは、前記睡眠誘導効果の確認試験で陽性対照群として使われたジアゼパム（ＤＺＰ）とゾルピデム（ＺＰＤ）との有効濃度を確認するために、濃度による入眠潜時及び睡眠時間をそれぞれ確認したグラフである。

前記結果によれば、本発明のフロログルシノール及びフロロタンニンは、５ないし２５ｍｇ／ｋｇの非常に低濃度で有意な入眠潜時の減少及び睡眠時間の増加の効果を表わした。

また、前記本発明のフロログルシノール及びフロロタンニンの睡眠効果は、ジアゼパムと同様に、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン拮抗剤であるフルマゼニルによって抑制された。

［実験例９：クロメ抽出物のＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性及び睡眠誘導効果］
カジメ抽出物と同様に、同じ属に属するクロメも、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性及び睡眠誘導効果を表わすかを確認した。

図１５ａは、クロメメタノール抽出物の放射性標職されたＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピンリガンド［^３Ｈ］フルマゼニルの結合抑制効果を示すグラフであって、クロメメタノール抽出物（ＥＫＯ−Ｍ）の場合、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体に対する親和力が濃度依存的に高くなり、ＩＣ_５０値は、０．６２６ｍｇ／ｍＬであった。

また、図１５ｂと図１５ｃは、カジメメタノール抽出物（ＥＣＫ−Ｍ）とクロメメタノール抽出物（ＥＫＯ−Ｍ）が、ｈｙｐｎｏｔｉｃ濃度のペントバルビタール（４５ｍｇ／ｋｇ、腹腔注射）での入眠潜時と睡眠時間とを測定して表わしたものであって、クロメメタノール抽出物は、睡眠時間において有意な効果があることを確認することができる。

［実験例１０：褐藻類抽出物とジアゼパムとの併用経口投与に対するペントバルビタール睡眠誘導シナジー効果］
カジメエタノール及び水抽出物とジアゼパムとの併用経口投与に対する睡眠誘導シナジー効果を調べるために、ペントバルビタールの睡眠誘導効果に影響を与えないほどの低濃度で、ＥＣＫ−Ｅは、１００ｍｇ／ｋｇ、ＥＣＫ−Ｗは、１００ｍｇ／ｋｇ、ＤＺＰは、０．５ｍｇ／ｋｇをペントバルビタール投与（ｈｙｐｎｏｔｉｃ ｄｏｓａｇｅ ４５ｍｇ／ｋｇ）４５分前に経口投与して、入眠潜時と睡眠時間とを測定したその結果を、図１６ａ及び図１６ｂに表わした。各グラフは、平均値（ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ、ｎ＝１０）を表わす。

＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０５で、＊＊＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．００１で有意差があること（Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ ｔｅｓｔ）を意味し、＃は、ｐ＜０．０５で、＃＃は、ｐ＜０．０１で併用投与したグループと単一投与したグループとの間の有意差があるということを意味する（対応のないスチューデントのｔ検定）。そして、ＮＳは、有意差がないということを意味する。

図１６ａ及び図１６ｂから見るように、本発明によるカジメエタノール及び水抽出物をＤＺＰと併用投与した時、睡眠時間において有意な効果があることを確認することができる。

［実験例１１：フルマゼニルが褐藻類抽出物の睡眠誘導効果に及ぼす影響］
ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン拮抗剤であるフルマゼニル（ＦＬＵ）が、実験例２の方法で製造されたカジメエタノール抽出物（ＥＣＫ−Ｅ）、カジメ水抽出物（ＥＣＫ−Ｗ）及び実験例４の方法で製造された酢酸エチル分画（ＥｔＯＡｃ）の睡眠誘導効果に及ぼす影響に対して調べるために、ＥＣＫ−Ｅは、１０００ｍｇ／ｋｇ、ＥＣＫ−Ｗは、１０００ｍｇ／ｋｇ、ＥｔＯＡｃは、２００ｍｇ／ｋｇ、ＤＺＰは、０．５ｍｇ／ｋｇをペントバルビタール投与（ｈｙｐｎｏｔｉｃ ｄｏｓａｇｅ ４５ｍｇ／ｋｇ）４５分前に経口投与し、ＦＬＵは、８ｍｇ／ｋｇをＥＣＫ−Ｅ、ＥＣＫ−Ｗ、ＥｔＯＡｃ、ＤＺＰ経口投与１０分前にあらかじめ腹腔注射して、入眠潜時と睡眠時間とを測定した。その結果を、下記の図１７ａ及び図１７ｂに表わした。各グラフは、平均値（ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ、ｎ＝１０）を表わす。

＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０５で、＊＊は、ｐ＜０．０１で、＊＊＊は、ｐ＜０．００１で有意差があること（Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ ｔｅｓｔ）を意味し、＃は、ｐ＜０．０５で、＃＃は、ｐ＜０．０１で、＃＃＃は、ｐ＜０．００１で、フルマゼニルを処理したグループと処理しないグループとの間の有意差があるということを意味する（対応のないスチューデントのｔ検定）。そして、ＮＳは、有意差がないということを意味する。

図１７ａ及び図１７ｂから見るように、代表的な睡眠剤の１つであるジアゼパムは、よく知られたＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピンの活性効能剤であって、ジアゼパムの睡眠効果は、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン拮抗剤であるフルマゼニルによって抑制された。

また、本発明によるカジメ水抽出物（ＥＣＫ−Ｗ）、エタノール抽出物（ＥＣＫ−Ｅ）及び酢酸エチル分画（ＥｔＯＡｃ）も、睡眠剤ジアゼパムと同様に、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン拮抗剤であるフルマゼニルによって、その効果が抑制された。

前記結果から、褐藻類抽出物は、既存の睡眠剤であるジアゼパムと同様に、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体に親和力を有し、効能剤の役割を行うことを確認することができる。そして、マウスを利用した動物実験でも、睡眠誘導効果を表わし、ジアゼパムと同様に、ＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン拮抗剤によって、その効果が減少することが分かる。

［実験例１２：褐藻類抽出物がラットの睡眠構造に及ぼす影響］
ＳＤ ラット（２００−２５０ｇ）を１週間適応させた後、脳波（Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒａｍ、ＥＥＧ）及び筋電図（Ｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｍ、ＥＭＧ）の測定のために、電極挿入手術を実施した。Ｒａｔをペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で痲酔させ、脳定位器（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）に頭部を固定させた。頭部皮下結合組織を切開した後、ＥＥＧ及びＥＭＧ測定のために、ステンレス鋼スクリューと銀電極ラインとを挿入した。引き続き歯科用セメントで固定させて縫合した。手術部位の消毒及び抗生剤投与を３日間実施して、手術による炎症を予防し、７日間回復期間を置いた。測定環境に適応させるために、測定４日前からｃｏｎｔｒｏｌ実験群に使う０．５％ ＣＭＣ−食塩水溶液を経口投与（ｐ．ｏ．）した後、記憶装置を連結して、本実験過程に順応するように誘導した。

ＥＥＧ及びＥＭＧは、ＰＡＬ−８２００ｓｅｒｉｅｓ（Ｐｉｎｎａｃｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を用いて、１０：００から１６：００まで６時間測定した。ＥＥＧ及びＥＭＧのｓａｍｐｌｉｎｇ ｒａｔｅは、２００Ｈｚに設定し（ｅｐｏｃｈ ｔｉｍｅ：１０秒）、ＥＥＧは、０．１−２５Ｈｚ、ＥＭＧは、１０−１００Ｈｚのフィルター領域を設定してデータを記録した。

睡眠構造分析は、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）アルゴリズムによって行われ、ＳｌｅｅｐＳｉｇｎプログラム（Ｖｅｒ．３．０，Ｋｉｓｓｅｉ Ｃｏｍｔｅｃ，Ｎａｇｏｎｏ，Ｊａｐａｎ）を利用した。

分析結果は、ｗａｋｅ、ＲＥＭ（レム睡眠、シータ帯域：６−１０Ｈｚ）、ＮＲＥＭ（ノンレム睡眠、デルタ帯域：０．６５−４Ｈｚ）に区分して表わした。入眠潜時は、１０秒エポック単位のＮＲＥＭ睡眠が１２回以上連続して表われるのにかかる時間として設定した。

図１８ａから見るように、本発明によるカジメエタノール抽出物５００ｍｇ／ｋｇを経口投与して睡眠構造を分析した結果、入眠潜時が４０．７分から３１．８分に約９分程度有意的に短縮された。

また、図１８ｂの睡眠構造で、ＮＲＥＭ睡眠時間が、４２．５％から５４．６％に約１２％増加しながら、睡眠増進に効果があった。

［実験例１３：フロロタンニン濃縮分画の抗痙攣効果］
実験例１で、９０％以上のＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体結合活性が最も優れたカジメ（ＥＣＫ）で酵素を利用した酵素抽出物を得て、その酵素抽出物でフロロタンニン濃縮分画を得て、酵素抽出物（ＥＣＥＥ）及びフロロタンニン濃縮分画（ＰＴＲＦ）の総フェノール含量及び抗痙攣効果を確認した。

１）酵素抽出物（ＥＣＥＥ）及びフロロタンニン濃縮分画（ＰＴＲＦ）の製造
１ｋｇの凍結乾燥カジメ粉末と蒸溜水１０Ｌとを混合した後、セルラーゼ（Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）１０ｍＬを添加し、５０℃で２４時間反応させ、１００℃で１０分間酵素を不活性化させた。３０００ｘｇで２０分間遠心分離して、加水分解されていない残渣を除去して得た濾液を得て、これを濃縮した後、凍結乾燥して酵素抽出物（ＥＣＥＥ）を得た。

前記酵素抽出物を凍結乾燥する前の濃縮物を７０％エタノールと混合した後、２４時間撹拌し、該撹拌した混合物を３５００ｘｇで２０分間遠心分離した後、ワットマン濾過紙Ｎｏ．１で残渣を除去して濾液を得て、これを濃縮した後、凍結乾燥してフロロタンニン濃縮分画（ＰＴＲＦ）を得た。

２）ピクロトキシン（ｐｉｃｒｏｔｏｘｉｎ）誘導発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）試験
実験動物は、実験例３のように準備し、ラットに対照群（ＣＯＮ、０．５％、ＣＭＣ−食塩水 １０ｍＬ／ｋｇ）、ＥＣＥＥ及びＤＺＰを経口投与し、経口投与４５分後、７ｍｇ／ｋｇのピクロトキシンを静脈注射して発作を誘導した。ピクロトキシンを投与したラットは、直ちに個別ケージに入れて９０分間観察して、痙攣の回数とピクロトキシン投与後から発作の発現までの発作潜在期間とを記録した。９０分間発作が発現されない場合、発作潜在期間は、０分と記録した。

３）実験の結果
［表１０］は、酵素抽出物（ＥＣＥＥ）及びフロロタンニン濃縮分画（ＰＴＲＦ）の総フェノール含量を表わしたものであり、残留物は、ＲＴＲＦを除いたＥＣＥＥ部分を意味する。フロロタンニン濃縮分画には、酵素抽出物に比べて、６倍以上多い総フェノール含量を表わした。

酵素抽出物（ＥＣＥＥ）の抗痙攣効果は、［表１１］に表わし、フロロタンニン濃縮分画（ＰＴＲＦ）の抗痙攣効果は、［表１２］に表わした。

＊＊は、対照区と比較して、ｐ＜０．０１で有意差がある（Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ ｔｅｓｔ）。

［表１１］で、対照群（ＣＯＮ）の最終死亡率は、８０％であり、陽性対照群として使われたジアゼパム（ＤＺＰ）は、発作潜在期間が著しく遅延された。酵素抽出物（ＥＣＥＥ）の場合にも、用量依存的に最終死亡率を低め、発作潜在期間を遅延させる効果を表わし、特に、１０００ｍｇ／ｋｇ容量で有意味な発作潜在期間の増加が表われた。

［表１２］で、フロロタンニン濃縮分画（ＰＴＲＦ）は、酵素抽出物（ＥＣＥＥ）と同様に、最終死亡率を低め、発作潜在期間を遅延させる効果を表わし、特に、ＥＣＥＥに比べて、１／４ないし１／１０程度の容量でも、ＥＣＥＥと同等のレベルの抗痙攣効果を表わした。

［実験例１４：統計分析］
５０％抑制濃度（ＩＣ_５０）値は、Ｐｒｉｓｍ５．０プログラムを用いてｏｎｅ−ｓｉｔｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを適用させて算出した。あらゆる実験の結果は、平均と標準誤差（ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ）とで表わし、各群と対照区との統計的な比較は、Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ ｔｅｓｔによる一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を通じて評価した。有意レベルの表示は、ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）レベルで有意性を見せる結果を別表で表示した。２つのグループ間のデータ比較は、対応のないスチューデントのｔ検定によって分析し、ｐ＜０．０５（＃）、ｐ＜０．０１（＃＃）、ｐ＜０．００１（＃＃＃）レベルで２つのグループ間に統計的に有意差があることを表示した。統計分析プログラムは、Ｐｒｉｓｍ５．０ソフトウェアを使って行った。

下記に、本発明のフロログルシノール、フロロタンニンまたは褐藻類抽出物を含有する組成物の製剤例を説明するが、本発明は、これを限定しようとすることではない、単に具体的に説明しようとすることである。

＜製剤例１．散剤の製造＞
実験例１で得たカジメエタノール抽出物粉末 ２０ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
前記の成分を混合し、気密布に充填して散剤を製造する。

＜製剤例２．錠剤の製造＞
実験例８のエコール １０ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって、打錠して錠剤を製造する。

＜製剤例３．カプセル剤の製造＞
実験例８のフロログルシノール １０ｍｇ
結晶性セルロース ３ｍｇ
ラクトース １４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ０．２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法によって、前記の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充電してカプセル剤を製造する。

＜製剤例４．注射剤の製造＞
実験例８のエクストロノール １０ｍｇ
マンニトール １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸溜水 ２９７４ｍｇ
Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１２Ｈ_２Ｏ ２６ｍｇ
通常の注射剤の製造方法によって、１アンプル当たり前記の成分含量で製造する。

＜製剤例５．液剤の製造＞
実験例１で得たカジメエタノール抽出物粉末 ２０ｍｇ
異性化糖 １０ｇ
マンニトール ５ｇ
精製水 適量
通常の液剤の製造方法によって、精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモン香を適量加えた後、前記の成分を混合した後、全体を精製水を加えて、全体１００に調節した後、褐色瓶に充填して滅菌させて、液剤を製造する。

＜製剤例６．健康機能食品の製造＞
実験例１で得たカジメエタノール抽出物粉末 １，０００ｍｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡアセテート ７０μｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２μｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０μｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０μｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
無機質混合物 適量
硫酸第一鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
第一燐酸カリウム １５ｍｇ
第二燐酸カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
前記のビタミン及びミネラル混合物の組成比は、比較的健康機能食品に適した成分を望ましい実施例で混合組成したが、その配合比を任意に変形実施しても良く、通常の健康機能食品の製造方法によって、前記の成分を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法によって、健康機能食品組成物の製造に使うことができる。

＜製剤例７．機能性飲料の製造＞
実験例１で得たカジメエタノール抽出物粉末 １，０００ｍｇ
クエン酸 １，０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
梅濃縮液 ２ｇ
タウリン １ｇ
精製水 全体９００ｍＬ
通常の健康飲料の製造方法によって、前記の成分を混合した後、約１時間８５℃で撹拌加熱した後、作られた溶液を濾過して、滅菌された２Ｌ容器に取得して密封滅菌した後、冷蔵保管した後、本発明の機能性飲料組成物の製造に使う。

前記組成比は、比較的嗜好飮料に適した成分を望ましい実施例で混合組成したが、需要階層、需要国家、使用用途など地域的、民族的嗜好度によって、その配合比を任意に変形実施しても良い。

Claims (4)

1. 褐藻類抽出物を有効成分とするＧＡＢＡ_Ａ−ベンゾジアゼピン受容体活性を有する睡眠誘導及び改善用組成物であって、
   前記褐藻類は、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）またはクロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）であることを特徴とする睡眠誘導及び改善用組成物。
2. 前記褐藻類抽出物は、褐藻類水抽出物、褐藻類エタノール抽出物、褐藻類メタノール抽出物、または水、エタノール及びメタノールのうちから選択される何れか２種以上の溶媒の混合溶媒による褐藻類抽出物であることを特徴とする請求項１に記載の睡眠誘導及び改善用組成物。
3. 褐藻類抽出物を有効成分とし、前記褐藻類がカジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）またはクロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）であり、前記褐藻類抽出物が、褐藻類水抽出物、褐藻類エタノール抽出物、褐藻類メタノール抽出物、または水、エタノール及びメタノールのうちから選択される何れか２種以上の溶媒の混合溶媒による褐藻類抽出物である、ＧＡＢＡ _Ａ −ベンゾジアゼピン受容体活性を有する睡眠誘導及び改善用組成物の製造方法であって、
   前記褐藻類水抽出物は、４０〜１００℃の水で２〜４８時間褐藻類を抽出して製造し、褐藻類エタノール抽出物は、褐藻類を３５〜７５％のエタノールで２０〜６０℃で２〜３６時間抽出して製造し、前記褐藻類メタノール抽出物は、褐藻類を３５〜８５％のメタノールで２０〜６０℃で２〜３６時間抽出して製造することを特徴とする睡眠誘導及び改善用組成物の製造方法。
4. 前記褐藻類水抽出物は、セルラーゼ、ビスコザイム、アルカラーゼ及びペクチンからなる群から選択される１種以上の酵素を添加した水で４０〜５５℃で２〜２４時間褐藻類を抽出して製造することを特徴とする請求項３に記載の睡眠誘導及び改善用組成物の製造方法。