JP6008345B2 - 免疫原性組成物 - Google Patents

Description

本発明は、両親媒性ポリマーからなるアジュバント微粒子に抗原が内包された抗原−アジュバント微粒子複合体を有効成分として含有する免疫原性組成物に関する。

抗原の免疫活性化能を向上させるために、アジュバントが抗原と共に用いられている。アジュバントとして高い効果が知られているのは完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）であるが、死菌およびオイルエマルジョンからなるＣＦＡは、投与部位に強い炎症反応および潰瘍性の腫張（肉芽腫）形成が生じるなど強い副作用があるため、安全上の懸念がありヒトに用いることは許可されていない。ヒトへの投与が許可されているアジュバントは限定されている。ヒトへの投与が許可されたアジュバントに水酸化アルミニウムアジュバントがあるが、このアジュバントは免疫活性化能力が十分とは言えず免疫を獲得させるために繰り返し投与が必要である。このためヒトに用いることのできる、効率的で強力なアジュバントを用いた免疫原性組成物の開発が待ち望まれている。

高い免疫活性化能を目指した新たなアジュバントの開発として、抗原を微粒子に内包する方法が試みられている。抗原を微粒子化して投与することで、抗原を単独で投与する場合と比較して抗体産生などの免疫反応が高まることが報告されているが、その効果は必ずしも高くなく、上述した水酸化アルミニウムアジュバントと同程度の効果が報告されているのみである。これは、これまで検討されてきた微粒子、例えば疎水性のポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体ポリマーからなる微粒子は、タンパクなどの親水性の抗原分子を効率よく構造を保持した状態で内包させることが困難であることが原因として考えられる（非特許文献１）。

近年、両親媒性ポリマーを利用した高分子量のタンパク質を高い効率で封入させうる新たな微粒子技術が報告されている（特許文献１、２）。この新しい微粒子については、薬物の徐放性能についての検討がなされているが、抗原を内包させた場合のアジュバント機能については全く検討がなされていない。さらに、抗原を含む微粒子がアジュバントとして機能するメカニズムは、抗原分子を徐放する機能と合わせて、抗原を含む微粒子が粒子ごと免疫細胞に取り込まれて細胞内で抗原を遊離するメカニズムが重要と考えられており、粒子からの薬物放出の機能とアジュバントとしての性能は一致しないと考えられているため、粒子の徐放性能からアジュバント機能を推測することは困難であり、既存の微粒子を用いた技術で、アルミニウムアジュバントをはるかにしのぐ性能を持つ効果的なアジュバントは、その開発が待望されているにもかかわらず、これまで実現されていなかった。

ＷＯ２００６／０９５６６８号 特開２００８−０８８１５８号公報

アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ、２００５年５７号、３９１−４１０ページ

本発明の目的は、少ない抗原量、少ない投与回数で高い免疫活性化能を有する免疫原性組成物を提供することにある。

上記課題を克服するために、本発明者らは、少量の抗原を用いて少ない投与回数で高い免疫活性化を起こすことのできる手段を検討した結果、アジュバント微粒子に抗原を内包させた抗原−アジュバント微粒子複合体が生体内で高い免疫活性化能を有することを見出した。すなわち、本発明は以下のような構成を有する。

（１）疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマーからなるアジュバント微粒子に抗原が内包された抗原−アジュバント微粒子複合体を有効成分として含有する、免疫原性組成物。

（２）抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子を有効成分として含有する、（１）に記載の免疫原性組成物。

（３）アジュバント微粒子が両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる親水性部分を内部に有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水部分の外層を有することを特徴とする、（１）または（２）に記載の免疫原性組成物。

（４）両親媒性ポリマーが多糖主鎖およびポリ（ヒドロキシ酸）グラフト鎖からなるグラフト型両親媒性ポリマーである、（１）〜（３）のいずれかに記載の免疫原性組成物。

（５）多糖がデキストランである、（１）〜（４）のいずれかに記載の免疫原性組成物。

（６）ポリ（ヒドロキシ酸）がポリ（乳酸−グリコール酸）である、（１）〜（５）のいずれかに記載の免疫原性組成物。

（７）表面改質剤がアジュバント微粒子のポリ（ヒドロキシ酸）に結合している、（１）〜（６）のいずれかに記載の免疫原性組成物。

（８）抗原−アジュバント微粒子複合体または抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子の平均粒径が０．１〜５０μｍである、（１）〜（７）のいずれかに記載の免疫原性組成物。

（９）さらに免疫活性化物質を含有する、（１）〜（８）のいずれかに記載の免疫原性組成物。

（１０）免疫活性化物質が核酸である、（９）に記載の免疫原性組成物。

（１１）免疫活性化物質がＣｐＧである、（９）または（１０）に記載の免疫原性組成物。

本発明により、従来よりも生体内で強力な免疫活性化が可能となる免疫原性組成物が提供される。

ＯＶＡ含有免疫原性組成物の免疫評価１。 ＣＥＡ含有免疫原性組成物の免疫評価（全ＩｇＧ）。 ＣＥＡ含有免疫原性組成物の免疫評価（ＩｇＧ２ａ）。 ＯＶＡ含有免疫原性組成物の免疫評価２。 ＯＶＡ含有免疫原性組成物の免疫評価３。 ＨＣＶ構成タンパク含有免疫原性組成物の免疫評価。 ＣＥＡ含有免疫原性組成物の免疫評価２。 ＣＥＡ含有免疫原性組成物の免疫評価３。 ＯＶＡ含有免疫原性組成物の免疫評価４。 ＣＥＡ含有免疫原性組成物の免疫評価４。 ＣＥＡ含有免疫原性組成物の免疫評価（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比率）。

本発明は疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）である両親媒性ポリマーからなるアジュバント微粒子に抗原が内包された抗原−アジュバント微粒子複合体を含有する免疫原性組成物に関する。

まず、アジュバント微粒子を構成する両親媒性ポリマーについて説明する。両親媒性とは、親水性と疎水性の両方の性質を有しているということで、親水性とは、任意の部位の水への溶解度が、他の部位より高いとき、該部位を親水性であると言う。親水部位は、水に可溶であることが望ましいが、難溶であっても他の部位と比較して、水への溶解度が高ければ良い。また、疎水性とは、任意の部位の水への溶解度が、他の部位より低いとき、該セグメントを疎水性であるという。疎水性部位は、水に不溶であることが望ましいが、可溶であっても他の部位と比較して、水への溶解度が低ければ良い。

両親媒性ポリマーとは分子全体として上述の両親媒性を有するポリマーである。ポリマーとは両親媒性ポリマーの親水性セグメントまたは疎水性セグメント、またはその両方が最小単位（モノマー）の繰り返し構造で構成された分子構造であることを示す。本発明における両親媒性ポリマーは親水性セグメントと疎水性セグメントを有した構造であればよく、親水性セグメントと疎水性セグメントがつながった直鎖状のブロックポリマーであっても良いし、親水性セグメントまたは疎水性セグメント、またはその両方が複数個存在する分岐を持った分岐ポリマー、親水性セグメントに複数の疎水性セグメントがグラフトされている、または疎水性セグメントに複数の親水性セグメントがグラフトされているグラフトポリマーでも良い。好ましくは親水性セグメントが１つのポリマーであり、最も好ましくは親水性セグメント、疎水性セグメントを１つずつ有する直鎖状のブロックポリマーまたは親水性セグメント主鎖に複数の疎水性セグメントがグラフトされているグラフトポリマーである。

免疫原性組成物を構成する両親媒性ポリマーは、アジュバント微粒子としての性質を有する限りは親水部分または疎水部分、またはその両方が異なる構成ポリマーからなる複数種類の両親媒性ポリマー、構成ポリマーは同じでも複数種類の連結様式を持つ両親媒性ポリマーの集合であっても良いが、安定した性能を果たさせ、生産性を高めるためには、少ない種類の両親媒性ポリマーの集合であることが望ましく、好ましくは主として２種類以下の両親媒性ポリマーの集合、より望ましくは主として単一種類の両親媒性ポリマーより構成されていることである。

本発明においては、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であることを特徴としている。ポリ（ヒドロキシ酸）であれば特に限定されないが、生体投与時に著しく有害な影響を与えない生体適合性ポリマーであることが好ましい。ここで言う生体適合性とはラットに該ポリマーを経口投与する場合のＬＤ５０が２，０００ｍｇ／ｋｇ以上のものを指す。また、複数種類のヒドロキシ酸の共重合体であってもよいが、好ましくは２種類以下のヒドロキシ酸の重合体である。好ましいポリ（ヒドロキシ酸）の具体例としては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（２−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（２−ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（２−ヒドロキシカプロン酸）、ポリ（２−ヒドロキシカプリン酸）、ポリ（リンゴ酸）またはこれらの高分子化合物の誘導体ならびに共重合体が挙げられるが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸またはポリ（乳酸−グリコール酸）の共重合体がより好ましい。また、ポリ（ヒドロキシ酸）がポリ（乳酸−グリコール酸）である場合、ポリ（乳酸−グリコール酸）の組成比（乳酸／グリコール酸）（モル／モル％）は、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、１００／０〜３０／７０のものが好ましく、６０／４０〜４０／６０のものがより好ましい。

両親媒性ポリマーの親水性セグメントについては特に限定されないが、疎水性セグメントと同様に生体適合性ポリマーであることが好ましい。また、両親媒性ポリマーからなるアジュバント微粒子に持続的なアジュバント能を付与するためには哺乳類または鳥類の生体内もしくは細胞内で分解されにくい難分解性ポリマーであることが好ましい。生体適合性分子であって難分解性ポリマーの具体例としてはポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸または難分解性の多糖（例えば、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストラン）が挙げられ、親水性セグメントがポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサンまたはポリアミノ酸である場合、両親媒性ポリマーは親水性セグメントおよび疎水性セグメントを１つずつ有する直鎖状のブロックポリマーであることが好ましく、親水性セグメントが多糖である場合、両親媒性ポリマーは親水性セグメント主鎖に複数の疎水性セグメントがグラフトされているグラフトポリマーであることが好ましい。また、両親媒性ポリマーの親水性セグメントとしては、ポリエチレングリコールまたは難分解性の多糖であることが好ましく、多糖としてはデキストランがより好ましい。

前記ポリ（ヒドロキシ酸）の疎水性セグメントと親水性セグメントからなる両親媒性ポリマーは、ポリマー全体として水非混和性の性質であることが、免疫原性組成物の抗原内包性および生体投与時の持続性が向上するため、好ましい。

両親媒性ポリマーにおける親水性セグメントの平均分子量は特に限定されないが、親水性セグメントと疎水性セグメントが直鎖状に結合したブロックポリマーの場合、好ましくは１，０００〜５０，０００であり、より好ましくは２，０００〜１５，０００である。ここで、用語「ブロック」とは、ポリマー分子の一部分で，少なくとも５個以上のモノマー単位からなり，その部分に隣接する他の部分と化学構造上あるいは立体配置上異なるものを言い、少なくとも２以上のブロックが線状に連結してできたポリマーをブロックポリマーと言う。ブロックポリマーを構成する各ブロック自体が、２種類以上のモノマー単位からなる、ランダム、交互、グラジエントポリマーであっても良い。本発明においては、親水性セグメントを形成するポリマーとポリヒドロキシ酸がそれぞれ１つずつ連結したブロックポリマーであることが好ましい。

また、親水性セグメント主鎖に疎水性セグメントがグラフトされているグラフトポリマーの場合、親水性セグメントの平均分子量は好ましくは１，０００〜１００，０００であり、より好ましくは２，０００〜５０，０００、さらに好ましくは１０，０００〜４０，０００である。また、グラフト鎖の数は、好ましくは２から５０である。グラフト鎖数は^１Ｈ−ＮＭＲ測定によって得られる親水性セグメント主鎖と疎水性セグメント主鎖の比率および疎水性セグメントの平均分子量と、使用した親水性セグメント主鎖の平均分子量から求めることができる。

疎水性セグメントと親水性セグメントの好ましい平均分子量比は両親媒性ポリマーによって異なるが、疎水性セグメントと親水性セグメントが直鎖状につながったブロックポリマーの場合、親水性セグメントと疎水性セグメントの平均分子量比は１：１以上が好ましく、１：２以上がより好ましく、１：４以上がさらに好ましく、特に好ましいのは１：４以上１：２５以下である。

親水性セグメント主鎖に複数の疎水性セグメントグラフト鎖が結合したグラフトポリマーの場合、親水性セグメント主鎖部と疎水性セグメントグラフト鎖全体の平均分子量比が１：３以上でかつ、各グラフト鎖の平均分子量が２，５００〜４０，０００であることが好ましく、より好ましくは全体の平均分子量比が１：５以上で、各グラフト鎖の平均分子量が５，０００〜４０，０００である。

なお、前述の平均分子量とは特に断りがない限り数平均分子量を言う。数平均分子量とは、分子の大きさの重み付けを考慮しない方法で算出した平均分子量であり、両親媒性ポリマーおよび両親媒性ポリマーの親水性セグメントを構成するポリマーの数平均分子量はゲルパーミションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレンやプルラン換算の分子量として求めることができる。また、ポリ（ヒドロキシ酸）の平均分子量は核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定により、末端残基のピーク積分値と末端残基以外のピーク積分値の比から求めることができる。

本発明で使用される両親媒性ポリマーは既知の方法で合成すれば良く、親水性セグメントとなるポリマーにポリ（ヒドロキシ酸）ポリマーを加えて縮合反応を行い製造する方法、親水性セグメントとなるポリマーにヒドロキシ酸活性化モノマーを加えて重合反応を行い製造する方法や、また逆にポリ（ヒドロキシ酸）重合体である疎水性セグメントに親水性セグメントを構成するモノマーを加えて重合反応を行う方法が例として挙げられる。

例えば、ポリエチレングリコールおよびポリ（ヒドロキシ酸）からなる両親媒性ポリマーであれば、すず触媒存在下、ポリエチレングリコールにヒドロキシ酸活性化モノマーを加えて重合反応を行い、ポリ（ヒドロキシ酸）を導入することで両親媒性ブロックポリマーを製造する方法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，７１，ｐ．２０３−２１１（２００１年）］により製造することができる。

また例えば、多糖およびポリ（ヒドロキシ酸）グラフト鎖からなるグラフト型両親媒性ポリマーであれば、以下の（１）、（２）または（３）のようにして製造することができる。
（１）すず触媒存在下、多糖にヒドロキシ酸活性化モノマーを加えて重合反応を行い、ポリ（ヒドロキシ酸）を導入することでグラフト型両親媒性ポリマーを製造する方法［Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３１，ｐ．１０３２−１０３９（１９９８年）］
（２）水酸基の大部分が置換基で保護された多糖の一部未保護の水酸基を塩基で活性化後、ヒドロキシ酸活性化モノマーを加えてポリ（ヒドロキシ酸）からなるグラフト鎖を導入し、最後に保護基を取り除くことにより、グラフト型両親媒性ポリマーを製造する方法［Ｐｏｌｙｍｅｒ，４４，ｐ．３９２７−３９３３，（２００３年）］
（３）多糖に対して、ポリ（ヒドロキシ酸）の共重合体を脱水剤および／または官能基の活性化剤を用いて縮合反応させることにより、グラフト型両親媒性ポリマーを製造する方法［Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３３，ｐ．３６８０−３６８５（２０００年）］。

次に、アジュバント微粒子について説明する。アジュバント微粒子とは、アジュバント能を有する微粒子のことであり、アジュバント能とは抗原を生体内に投与した場合の免疫応答を、抗原単独を投与した時に比べて高く引き起こすことのできるものを示す。また、本発明においては、アジュバント微粒子は両親媒性ポリマーからなる微粒子であることを特徴とし、さらに、アジュバント微粒子は抗原を内包することで抗原−アジュバント微粒子複合体を形成し、該複合体が本発明の免疫原性組成物の有効成分となることを特徴としている。

アジュバント微粒子の構造としては特に限定されないが、両親媒性ポリマーの親水性セグメントをアジュバント微粒子の内側に有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントの外層を有した構造をとる場合、内包される抗原が安定に保持されるため、好ましい。該構造のアジュバント微粒子を製造する方法としては限定されないが、例を挙げると（ａ）水系溶媒Ａと両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒Ｂを混合することにより、逆相エマルジョンを形成する工程および（ｂ）逆相エマルジョンから溶媒を除去してアジュバント微粒子を得る工程を含む方法によって製造できる。その際、水系溶媒Ａに抗原を含有させることで抗原が内包された抗原−アジュバント微粒子複合体を構成することができる。以下、工程（ａ）および（ｂ）について説明する。

工程（ａ）における水系溶媒Ａには、水あるいは水溶性成分を含有する水溶液を使用する。該水溶性成分として、例えば、無機塩類、糖類、有機塩類、アミノ酸などが挙げられる。

また、工程（ａ）における水非混和性有機溶媒Ｂは、該両親媒性ポリマーのポリ（ヒドロキシ酸）が可溶で且つ、親水性セグメントを構成するポリマーが難溶または不溶であることが好ましく、さらに凍結乾燥により揮散除去できることが好ましい。該水非混和性有機溶媒Ｂの水への溶解度は、好ましくは３０ｇ（水非混和性有機溶媒Ｂ）／１００ｍｌ（水）以下である。水非混和性有機溶媒Ｂの具体例としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチル、塩化メチレン、クロロフォルムが挙げられる。

水非混和性有機溶媒Ｂに対する水系溶媒Ａの比は、１，０００：１〜１：１、好ましくは１００：１〜１：１である。該水非混和性有機溶媒Ｂ中の両親媒性ポリマーの濃度は、水非混和性有機溶媒Ｂ、両親媒性ポリマーの種類によって異なるが、０．０１〜９０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．１〜５０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは、１〜２０％（ｗ／ｗ）である。

工程（ａ）における、水系溶媒Ａ、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒Ｂにより、逆相エマルジョンを形成する工程において、製剤学的目的に応じて、２種以上の両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒Ｂにより、逆相エマルジョンを形成しても良い。

工程（ａ）においては、逆相エマルジョンの形成を補助し、均一かつ微小な逆相エマルジョンを形成する目的のために、共剤を添加することができる。共剤としては、炭素数３から６のアルキルアルコール、炭素数３から６のアルキルアミン、炭素数３から６のアルキルカルボン酸から選ばれる化合物が好ましい。これら共剤のアルキル鎖の構造は、特に限定されず、直鎖構造でも分岐構造でも良く、飽和アルキルでも、不飽和アルキルでも良い。本発明において、共剤としては、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｉｓｏ−プロパノール、ペンタノールが特に好ましい。

工程（ｂ）において、逆相エマルジョンから溶媒を除去する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、加熱、減圧乾燥、透析、凍結乾燥、遠心操作、濾過、再沈殿および、それらの組み合わせが挙げられる。前記逆相エマルジョンから溶媒を除去する方法の中でも、凍結乾燥は逆相エマルジョン中の粒子の合一などによる構造変化が少なく、好ましい。凍結乾燥の条件、装置としては、凍結過程と減圧下での乾燥工程を含むものであり、凍結乾燥の常法である予備凍結、減圧・低温下での一次乾燥、減圧下での二次乾燥を経る工程が特に好ましい。例えば抗原−アジュバント微粒子複合体の水非混和性溶媒分散体を得る場合は、逆相エマルジョンを構成する水系溶媒Ａと水非混和性有機溶媒Ｂの融点以下に冷却・凍結し、次いで減圧乾燥することにより、凍結乾燥したアジュバント微粒子が得られる。予備凍結の温度としては、溶媒組成から適宜実験的に決定すれば良いが、−２０℃以下が好ましい。また、乾燥過程における減圧度も、溶媒組成から適宜実験的に決定すれば良いが、３，０００Ｐａ以下が好ましく、５００Ｐａ以下が乾燥時間の短縮のためにより好ましい。凍結乾燥には、コールドトラップを備え真空ポンプと接続可能なラボ用凍結乾燥機や医薬品の製造などに用いられる棚式真空凍結乾燥機を使用することが好ましく、液体窒素、冷媒などによる予備凍結の後、冷却下または室温で真空ポンプなどの減圧装置で減圧乾燥を行えば良い。

アジュバント微粒子に内包される抗原の種類は特に限定されるものでは無く、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、脂質、炭水化物、核酸、多糖類およびこれらを含むウイルス、菌体、アレルギー原因物質、組織、細胞、などであればよい。具体例を挙げると花粉由来抗原、Ａ型肝炎ウイルス由来抗原、Ｂ型肝炎ウイルス由来抗原、Ｃ型肝炎ウイルス由来抗原、Ｄ型肝炎ウイルス由来抗原、Ｅ型肝炎ウイルス由来抗原、Ｆ型肝炎ウイルス由来抗原、ＨＩＶウイルス由来抗原、インフルエンザウイルス由来抗原、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）由来抗原、炭疽菌由来抗原、クラジミア由来抗原、肺炎球菌由来抗原、日本脳炎ウイルス由来抗原、麻疹ウイルス由来抗原、風疹ウイルス由来抗原、破傷風菌由来抗原、水痘ウイルス由来抗原、ＳＡＲＳウイルス由来抗原、ＥＢウイルス由来抗原、パピローマウイルス由来抗原、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）菌由来抗原、狂犬病ウイルス由来抗原、ウエストナイルウイルス由来抗原、ハンタウイルス由来抗原、連鎖球菌由来抗原、ブドウ球菌由来抗原、百日咳（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）菌由来抗原、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来抗原、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）由来抗原、ポリオウイルス由来抗原、各種人畜共通感染症由来抗原、癌抗原、各種食物アレルギー由来抗原などである。

内包される抗原は単一である必要は無い。これは本発明の応用を考えた場合に、単独のタンパクやペプチドではなく、癌細胞や、細菌、ウイルスなど複数の構成物より構成されたものに対する免疫応答を起こすことがあり、この場合は免疫応答を起こしうる複数種類のタンパク質などや、種類の特定できない混合物でも良い。また積極的に複数種類の抗原に対する免疫応答をおこすことを目的とし、複数種類の抗原を含有させることも本発明の免疫原性組成物の利用形態の１つである。好ましくは３種類以下、より好ましくは単一種類である抗原がアジュバント微粒子に内包される。

本発明における抗原−アジュバント微粒子複合体は、アジュバント微粒子を構成するポリマーの種類および調製方法により含有する抗原の保持性を変化しうる。本発明における抗原−アジュバント微粒子複合体が免疫原性をもたらすメカニズムとしては、アジュバント微粒子から放出された抗原が免疫担当細胞に認識される過程や、アジュバント微粒子ごと免疫担当細胞に認識される過程など複数の過程が考えられ、それらの過程の相乗効果によっても高い効果が得られる。

抗原−アジュバント微粒子複合体が免疫担当細胞に抗原を認識させる過程は、その過程ごとに惹起される免疫反応の種類も異なり、生じさせたい免疫反応の種類や投与部位によって好ましい過程を選択すればよい。すなわち、抗原は抗原−アジュバント微粒子複合体から必ずしも放出される必要は無く、目的とする最良の免疫原性を有する形態は抗原と活性化させたい免疫反応の種類により最適化されることが好ましい使用方法である。しかし抗原が著しく速く抗原−アジュバント微粒子複合体から放出される場合は本発明の良好な性質である長期間の持続的な免疫活性化作用が得られないため、抗原−アジュバント微粒子複合体における抗原の１０％以上が生体内に投与１週間後も複合体として保持されていることが好ましく、より好ましくは投与１週間後に５０％以上が内包されていることである。これらの放出挙動は実施例にも示すように生体内環境を模したｉｎ ｖｉｔｒｏ評価により確認できる。

また、抗原−アジュバント微粒子複合体は、該複合体が会合した粒子状態にあっても本発明の免疫原性組成物の有効成分として良好に効果を果たす、ここで言う会合とは、２以上の粒子が粒子間力もしくは他物質を介して結合し，集合体を形成することである。粒子間力は特に限定されないが、疎水性相互作用、水素結合、ファン・デル・ワールス力が挙げられる。会合は、微粒子同士が接している状態に限定されず、微粒子間に微粒子と親和性を有する物質が存在していても良く、マトリックスに微粒子が分散していても良い。微粒子に親和性を有する物質、マトリックスとしてはポリマーが好ましく、疎水性部分がポリ（ヒドロキシ酸）である両親媒性ポリマーであり、アジュバント微粒子と同じ構成成分であるポリマーがより好ましく、具体例として多糖主鎖およびポリ（ヒドロキシ酸）グラフト鎖からなる両親媒性ポリマー、ポリエチレングリコールとポリ（ヒドロキシ酸）からなるブロックポリマーまたはポリ（ヒドロキシ酸）が挙げられる。

抗原−アジュバント微粒子複合体の会合は、使用時に再分離する状態であっても良いし、再分離しない状態であってもよい。なお、抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子の形態が、該複合体が会合したことが分からない状態であっても、その製造工程に該複合体を会合させる工程を含む場合、該複合体が会合した粒子であると考える。

抗原−アジュバント微粒子複合体を会合させる工程は特に制限されるものでは無いが、具体例として抗原−アジュバント微粒子複合体または該複合体分散液を、表面改質剤を含む液相Ｃに導入し分散媒を除去することにより会合させる工程が挙げられ、以下、該工程について説明する。

抗原−アジュバント微粒子複合体を分散媒に分散させ、該複合体分散液を調製する場合、分散媒としては特に限定されるものではないが、アジュバント微粒子が内部に両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる親水性部分を有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水部分を外層に有する場合は、その構造を保護する目的で、両親媒性ポリマーのポリ（ヒドロキシ酸）が可溶で且つ、親水性セグメントを構成するポリマーを実質的に溶解しない溶媒であることが好ましく、その場合、水非混和性有機溶媒でも水混和性有機溶媒であっても良い。両親媒性ポリマーのポリ（ヒドロキシ酸）が可溶で且つ、親水性セグメントを構成するポリマーを実質的に溶解しない溶媒の具体例としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチル、塩化メチレン、クロロフォルム、ジオキサン、トルエン、キシレンなどが挙げられる。

液相Ｃとしては、表面改質剤を可溶で且つ、分散媒よりも高い沸点を有することが好ましく、水系溶媒、水非混和性有機溶媒、水混和性有機溶媒のいずれであっても良い。ここでいう水系溶媒としては、水あるいは水溶性成分を含有する水溶液が好ましく、該水溶性成分として、例えば、無機塩類、糖類、有機塩類、アミノ酸などが挙げられる。水非混和性有機溶媒としては、例えば、シリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油、流動パラフィン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、グリセロール、オレイン酸などが挙げられる。水混和性有機溶媒としては、例えば、グリセリン、アセトン、エタノール、酢酸、ジプロピレングリコール、トリエタノールアミン、トリエチレングリコールなどが挙げられる。中でも本発明においては、液相Ｃは水系溶媒または水混和性有機溶媒であることが好ましい。液相Ｃが水系溶媒で、かつ、分散媒が水非混和性有機溶媒の場合には、得られる抗原−アジュバント微粒子複合体懸濁液は、いわゆるソリッド・イン・オイル・イン・ウォーター（Ｓ／Ｏ／Ｗ）型エマルジョンとなり、液相Ｃが水非混和性有機溶媒または水混和性有機溶媒でかつ分散媒と混和しない場合には、ソリッド・イン・オイル・イン・オイル（Ｓ／Ｏ１／Ｏ２）型エマルジョンとなる。

表面改質剤としては、Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンの水−油界面あるいはＳ／Ｏ１／Ｏ２型エマルジョンの油−油界面を安定化するものであることが好ましく、また、抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子のコロイド安定性を向上させる性質を有する化合物であることが好ましい。ここでコロイド安定性を向上させるとは、抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子の溶媒中における凝集を防ぐことまたは遅延させることを言う。また表面改質剤は、１種でも複数の混合物でも良い。

本発明で使用される表面改質剤は、親水性ポリマーまたは両親媒性化合物であることが好ましい。

表面改質剤である親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖類多糖類もしくはいずれかの類縁体であることが好ましい。該親水性ポリマーの類縁体としては、親水性ポリマーを長鎖アルキルなどの疎水基を部分的に修飾するなどした界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

表面改質剤であるポリエチレングリコール類縁体としては、ＢＡＳＦ社から市販される“Ｐｌｕｒｏｎｉｃ”（ＢＡＳＦ社の登録商標）もしくはその同等品が好ましい。

表面改質剤であるポリアミノ酸としては、ポリアスパラギン酸もしくはポリグルタミン酸またはこれらの類縁体が好ましく、ポリアスパラギン酸もしくはポリグルタミン酸の一部に長鎖アルキル基を導入した類縁体はより好ましい。

表面改質剤であるペプチドとしては、塩基性ペプチドが挙げられ、表面改質剤のタンパク質としては、ゼラチン、カゼインまたはアルブミンが粒子の分散性向上のために好ましい。その他、タンパク質としては、抗体も好ましい１例として挙げられる。

表面改質剤である糖類としては、単糖類、オリゴ糖類、多糖類が好ましい。多糖類としては、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストランが好ましく、特にコレステロール化プルランは、粒子の分散性向上のために好ましく、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストランのいずれかの類縁体が好ましい。

表面改質剤としてのこれらのペプチド、タンパク質または糖類は、長鎖アルキルなどの疎水基を部分的に修飾するなどした類縁体や前述の親水性ポリマーや両親媒性化合物を修飾した類縁体が特に好ましい。

表面改質剤である両親媒性化合物としては、脂質または界面活性剤が挙げられる。界面活性剤としては、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール共重合体、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンジ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンジ脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン性活性剤や、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ステアリル硫酸ナトリウムなどのアルキル硫酸塩またはレシチンが好ましい。

抗原−アジュバント微粒子複合体を分散させる分散媒に対する液相Ｃの容積比は、１，０００：１〜１：１，０００、好ましくは１００：１〜１：１００である。なお、この容積比に応じて得られる抗原−アジュバント微粒子複合体の会合数は変化し、液相Ｃの比率が高いほど多くの抗原−アジュバント微粒子複合体が会合した粒子の水分散体が得られ、また、少ない場合は会合数が少なくなり、溶液比１：４よりも液相Ｃの比率が小さい場合には、大部分が抗原−アジュバント微粒子複合体１つから構成される粒子の水分散体となるため、抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子を製造する一連の過程において、液相Ｃの容積比を調整することによって、抗原−アジュバント微粒子複合体と該複合体が会合してなる粒子を作り分けることができる。

抗原−アジュバント微粒子複合体を含む分散媒を液相Ｃに混和させる場合には必要であれば、例えば、マグネティックスターラーなどの撹拌装置、タービン型攪拌機、ホモジナイザー、多孔質膜を装備した膜乳化装置などを使用しても良い。

液相Ｃには、表面改質剤に加え、製剤学的な目的に応じて、各種添加物、例えば、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖などを含有しても良い。また、抗原−アジュバント微粒子複合体を分散させる分散媒には、該複合体の分解もしくは崩壊による内包された抗原の放出速度の制御を目的に、分散媒に可溶な各種添加剤、例えば酸性化合物、塩基性化合物、両親媒性ポリマーまたは生分解性ポリマーなどを含有しても良い。

その他、より微細な抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子を製造する目的で、形成されるソリッド・イン・オイル・イン・ウォーター（Ｓ／Ｏ／Ｗ）型エマルジョンまたはソリッド・イン・オイル・イン・オイル（Ｓ／Ｏ１／Ｏ２）型エマルジョンの乳化操作を行っても良い。乳化方法は、安定なエマルジョンを調製できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、撹拌による方法、高圧ホモジナイザー、高速ホモミキサーなどを用いる方法などが挙げられる。

抗原−アジュバント微粒子複合体を一旦分散媒に分散させて、得られた分散液を、表面改質剤を含む液相Ｃに添加した場合には、分散媒を除去することで、所望のアジュバント微粒子が会合してなる粒子の懸濁液が得られる。分散媒を除去する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、液中乾燥、透析、凍結乾燥、遠心操作、濾過、再沈殿が挙げられ、液中乾燥、凍結乾燥が特に好ましい。液相Ｃとして水系溶媒を用いた場合には、本工程により、抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子の水系分散体が得られる。

なお、表面改質剤が抗原−アジュバント微粒子複合体または抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子に結合しているものについても好ましい態様のひとつである。ここでいう結合とは非共有結合であっても共有結合であっても良い。非共有結合は、好ましくは疎水的な相互作用であるが、静電相互作用、水素結合、フアン・デル・ワールスカでも良く、それらが複合した結合でも良い。非共有結合においては、両親媒性ポリマーを含む微粒子のポリ（ヒドロキシ酸）と表面改質剤の疎水部分とが、疎水的な相互作用により結合していることが好ましく、この場合、抗原−アジュバント微粒子複合体の分散媒が水、緩衝液、生理食塩水、表面改質剤水溶液または親水性溶媒である微粒子分散体であることが好ましい。

前述により得られる、抗原−アジュバント微粒子複合体または該複合体が会合してなる粒子の平均粒径は、０．１〜５０μｍであることが好ましく、０．１〜１０μｍであることがより好ましい。特に、抗原−アジュバント微粒子複合体の平均粒径は、好ましくは０．１〜１μｍ、より好ましくは０．１〜０．５μｍであり、抗原−アジュバント微粒子複合体の平均粒径は、好ましくは０．１〜５０μｍ、より好ましくは０．１〜１０μｍ、さらに好ましくは１〜１０μｍである。抗原−アジュバント微粒子複合体または該複合体が会合してなる粒子の平均粒径は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：例えば株式会社日立製作所製 Ｓ−４８００）による画像解析法を用いて直接平均粒径を測定することができる。

本発明における免疫原性組成物とは、生体内で免疫応答を起こしうる組成物であり、前記抗原−アジュバント微粒子複合体を免疫原性物質として含んでいる。免疫原性組成物が生じさせる免疫応答の種類は限定されない。生じさせる免疫応答の種類としてはＴｈ１型免疫応答やＴｈ２型免疫応答があり、抗原や投与部位、投与方法の種類によってどちらかの免疫応答に優位に生じることが知られるが、本発明はＴｈ１型、Ｔｈ２型両方のタイプの免疫応答を生じさせうる。Ｔｈ１型の免疫反応は、実施例で示すように小粒径の本発明の抗原−アジュバント微粒子複合体または該複合体が会合してなる粒子により効果的に生じさせることができる。Ｔｈ１型の免疫応答とＴｈ２免疫応答の度合いに関しては既知の様々な方法で評価できる。例を挙げるとマウスの場合はＩｇＧ２ａ抗体の産生量がＴｈ１型免疫応答の指標として知られる。またＴｈ２型免疫応答の指標としてはＩｇＧ１抗体、総ＩｇＧ抗体量が指標として知られる。

また本発明の免疫原性組成物は、抗原−アジュバント微粒子複合体または該複合体が会合してなる粒子を有効成分として含有することからアジュバント能を有するが、さらに免疫活性化物質を含むことで高い免疫活性化活性を実現することができる。これらの免疫活性化物質はアジュバント微粒子の外であっても内包されていても良いが、アジュバント微粒子に内包されていることが好ましい。免疫活性化物質として例をあげると、オイル類、アルミニウム塩、カルシウム塩、ゲル性高分子、免疫活性化サイトカイン、ＴＬＲ受容体リガンドなど免疫活性化物質として機能しうるものであれば限定されないが、免疫活性化サイトカインまたはＴＬＲ受容体リガンドが好ましい。

免疫活性化サイトカインとしては、インターロイキン１２、インターフェロンα、インターロイキン１８、ＴＮＦα、インターロイキン６、ＮＯ、インターフェロンγ、インターフェロンβがあげられる。

ＴＬＲ受容体リガンドとしては、リポタンパク質、ｐｏｌｙＩ：Ｃ、ｐｏｌｙＩ：ＣＬＣなどの２本鎖ＲＮＡ、フラジェリン、１本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ、プロフィリン、ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＴＤＭであり、好ましくは２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧなどの核酸であり、より好ましくはＣｐＧである。ここでＣｐＧとはウイルス、細菌などに存在する非メチル化ＣｐＧ（シトシン−グアニン）モチーフＤＮＡを示す（特表２００１−５０３２５４号公報参照）。ＣｐＧモチーフには様々な有効配列が報告されているが、配列の種類は免疫活性化能をもつ限りは制限されず、塩基アナログを使用したものでも、各種修飾体でも良い。

本発明の免疫原性組成物を医薬品組成物やワクチンとして用いる場合、両親媒性ポリマー、親水性活性物質、表面改質剤、分散媒の他に製剤学的に有用な各種添加剤を含有していても良く、添加できる添加物として好ましくは、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖である。

本発明の免疫原性組成物を用いて、免疫応答を起こす方法については限定されず、免疫原性組成物を生体に投与しても良いし、生体外に摘出した免疫担当細胞に接触させても良い。免疫原性組成物を生体に投与する方法としては限定されないが、例を挙げると、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経鼻投与、経肺投与、経口投与、経皮投与、舌下投与、腟内投与、腹腔内投与、リンパ節投与などであり、好ましくは皮内投与または皮下投与である。

本発明の免疫原性組成物を用いて免疫応答を起こす場合の使用容量については目的とする免疫反応を生じさせるのに必要な抗原量は抗原の種類や投与方法、投与回数によって適宜設定されるが、例えばヒトに対して本発明の免疫原性組成物を皮下投与して免疫応答を誘導する場合、免疫原性組成物に含有する抗原量として１回あたり０．０１〜１，０００μｇが投与される。また、投与回数についても使用用量と同様に適宜設定されるが、本発明の免疫原性組成物は持続的に免疫応答を生じさせる作用を有しているため、１〜１０回の投与により免疫応答を誘導することが可能である。

投与する生体はヒトであってもヒト以外の動物であってもよいが、好ましくはヒトあるいは家畜、愛玩動物または実験動物として飼育されているブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ウマ、ロバ、ヤギまたはラクダ、イヌ、ネコ、フェレット、ウサギ、サル、ラット、マウス、モルモットである。

以下に実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されない。

実施例１ デキストラン−ポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）の合成
（１−１）ＴＭＳ−デキストランの合成
デキストラン（ナカライテスク株式会社、ナカライ規格特級適合品、数平均分子量１３，０００、５．０ｇ）をホルムアミド（１００ｍｌ）に加え、８０℃に加熱した。この溶液に１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン（１００ｍｌ）を２０分掛けて滴下した。滴下終了後、８０℃で２時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を室温に戻し、分液漏斗で２層を分離した。上の層を減圧下濃縮した後、メタノール（３００ｍｌ）を加え、得られた固体をろ過、乾燥し、ＴＭＳ−デキストラン（化合物（１））（１１．４ｇ）を白色固体として得た。

同様の方法を用いて、デキストラン（シグマ社製、平均分子量１,５００以下）を用いて化合物（２）および（３）を、デキストラン（ＳＥＲＶＡ社製、平均分子量５，０００）を用いて化合物（４）および（５）を、デキストラン（化合物（１）調製時と同じもの）を用いて化合物（６）を、デキストラン（ナカライテスク社製、平均分子量４０，０００）を用いて化合物（７）、（８）および（９）を調製した。

（１−２）デキストラン−ＰＬＧＡ（化合物（１２）〜（２３））の合成
化合物（１）（０．５ｇ）とｔｅｒｔ−ブトキシカリウム（３５ｍｇ）を加熱減圧下２時間乾燥後、テトラヒドロフラン（１０ｍｌ）を加え、１．５時間室温で攪拌した。この溶液に（ＤＬ）−ラクチド（０．５６ｇ）とグリコリド（０．４５ｇ）のテトラヒドロフラン（１５ｍｌ）溶液を滴下し、５分間攪拌後、酢酸を２滴加えて反応を停止させた。反応終了後、溶媒を減圧下濃縮し、クロロフォルム−メタノール系およびクロロフォルム−ジエチルエーテル系で再沈殿精製を行うことによって得られる白色固体をクロロフォルム（９ｍｌ）に溶解した。この溶液にトリフルオロ酢酸（１．０ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下留去後、残渣をクロロフォルム（１０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却したジエチルエーテルに滴下することにより得られた生成物をろ過することによりデキストラン−ＰＬＧＡを白色固体として得た（化合物（１２））。同様な方法で、（ＤＬ）−ラクチド（０．７８ｇ）とグリコリド（０．６３ｇ）の仕込量で化合物（１３）を、同様な方法で、（ＤＬ）−ラクチド（１．１２ｇ）とグリコリド（０．９ｇ）の仕込量で化合物（１４）を、同様な方法で（ＤＬ）−ラクチド（１．６７ｇ）とグリコリド（１．３５ｇ）の仕込量で化合物（１５）を合成した。

また、化合物（２）を用いて（ＤＬ）−ラクチド（０．５６ｇ）とグリコリド（０．４５ｇ）の仕込量で化合物（１６）を、化合物（３）を用いて（ＤＬ）−ラクチド（０．６７ｇ）とグリコリド（０．５４ｇ）の仕込量で化合物（１７）を、化合物（４）を用いて（ＤＬ）−ラクチド（０．７８ｇ）とグリコリド（０．６３ｇ）の仕込量で化合物（１８）を、化合物（５）を用いて（ＤＬ）−ラクチド（０．８９ｇ）とグリコリド（０．７２ｇ）の仕込量で化合物（１９）を、化合物（６）を用いて（ＤＬ）−ラクチド（０．７８ｇ）とグリコリド（０．６３ｇ）の仕込量で化合物（２０）を、化合物（７）を用いて（ＤＬ）−ラクチド（０．７８ｇ）とグリコリド（０．６３ｇ）の仕込量で化合物（２１）を、化合物（８）を用いて（ＤＬ）−ラクチド（１．１２ｇ）とグリコリド（０．９ｇ）の仕込量で化合物（２２）を、化合物（９）を用いて（ＤＬ）−ラクチド（１．１２ｇ）とグリコリド（０．９ｇ）の仕込量で化合物（２３）を合成した。

化合物（１２）〜（１５）のポリマーの重量平均分子量、数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム：東ソ−株式会社製 ＴＳＫ−ｇｅｌ α−５０００×２、ＤＭＦ系溶媒、検出器：ＲＩ、標準品：プルラン）によって決定した。また、化合物（１２）〜（２３）のグラフト鎖の数平均分子量、グラフト鎖数は^１Ｈ−ＮＭＲ測定により決定した（表１）。

実施例２ ＰＥＧ−ＰＬＧＡの合成（化合物（１０）、（１１））
ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（日本油脂株式会社製 ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＨ−２０Ｈ、数平均分子量５，１２８、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０２）、（ＤＬ）−ラクチドとグリコリドを表２の仕込量で混合し、１４０℃に加熱した。２０分攪拌後、オクチル酸すず（ＩＩ）（ポリエチレングリコールモノメチルエーテルに対して０．０５重量％）を加え、１８０℃で３時間攪拌した。反応液を室温に戻した後、クロロフォルム（約１００ｍｇ／ｍｌ濃度になるよう）に溶解し、０℃に冷却したジエチルエーテルで再沈殿精製し、得られた固体を濾別、減圧乾燥することでＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーを白色、または薄茶色の固体として得た。本ポリマーの数平均分子量は^１Ｈ−ＮＭＲから求めた（表２）。

実施例３ Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡポリマーを用いた抗原−アジュバント微粒子複合体の調製（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１）〜（２８））
実施例１のデキストラン-ポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（化合物（１２）〜（２３））５ｍｇを炭酸ジメチル１００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にｔｅｒｔ−ブタノール２０μｌを添加後、表３の内包抗原（（ＯＶＡ（卵白アルブミン）（シグマ社）またはＣＥＡ（癌胎児性抗原）（コスモバイオ社））および免疫活性化物質（ＣｐＧ）を表記の濃度で５０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。ＣｐＧとしては５’−ｇｇｇｇｇｇｇＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡｇＧ−３’（配列中の小文字は、ホスホロチオエート修飾塩基を表わす）（シグマジェノシス社に委託合成）を用いた。

該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を表３に記す量の分散溶媒に分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８含有水溶液２ｍｌに滴下し、表３に記載の攪拌方法にて撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、抗原−アジュバント微粒子複合体分散液とした。該分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、抗原−アジュバント微粒子複合体（平均粒径０．４μｍ）および抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子（平均粒径５〜４０μｍ）乾燥粉末を得た。得られた粒子の平均粒径を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：株式会社日立製作所製Ｓ−４８００）により観察することで算出した結果を表３に示す。

実施例４ ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーを用いた抗原−アジュバント微粒子複合体の調製（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子（１）〜（４））
実施例２で作製したＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（化合物（１０）、（１１））５ｍｇを炭酸ジメチル１００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にｔｅｒｔ−ブタノールを２０μｌ添加後、表４に示す抗原含有溶液５０μｌを加え、攪拌することで逆相エマルジョン溶液を製造した。該逆相エマルジョン溶液を、液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を表４に示す量の酢酸エチルに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８含有水溶液２ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、抗原−アジュバント微粒子複合体分散液とした。該分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで抗原−アジュバント微粒子複合体乾燥粉末を得た。抗原−アジュバント微粒子複合体の平均粒径を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：株式会社日立製作所製 Ｓ−４８００）により観察することで算出した結果を表４に示す。

比較例１ 抗原を含有したＰＬＧＡホモポリマー粒子（ＰＬＧＡ粒子（１）、（２））の作製
抗原を含有したＰＬＧＡ粒子に関しては既知の技術（インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマスティックス、２００７年、３３４号、１３７-１４８ページ）を用いて調製した。ＰＬＧＡ（ＳＩＧＭＡ社製、平均分子量４０，０００−７５，０００）２００ｍｇを塩化メチレン １５ｍｌに溶解させ１３．３ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡ溶液を調製した。５ｍｇ／ｍｌのＯＶＡ水溶液１００μｌを該ポリマー溶液２ｍｌに１９，０００ｒｐｍ（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ社製ホモジナイザー）で攪拌した状態で添加し、さらに５分間同様に攪拌することでＷ／Ｏ溶液を製造した。該Ｗ／Ｏ溶液を１％ポリビニルアルコール水溶液２０ｍＬに１９，０００ｒｐｍで攪拌した状態で添加し、さらに５分間同様に攪拌することでＷ／Ｏ／Ｗ溶液を製造した。該Ｗ／Ｏ／Ｗ溶液を２００ｒｐｍで１２時間攪拌した後に、液体窒素で予備凍結し、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて１２時間凍結乾燥することで、抗原を含有したＰＬＧＡ粒子を得た。得られた粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：株式会社日立製作所製 Ｓ−４８００）により観察することで平均粒径を算出したところ、２μｍであった。また、同様の方法でＣＥＡ水溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を用いてＰＬＧＡ粒子（２）を作製し、同様にＳＥＭにて平均粒径を算出したところ、２μｍであった。

実施例５ ＣＥＡ−アジュバント微粒子複合体またはその会合粒子における抗原内包率と抗原保持性の測定
＜方法＞
実施例３および４の方法で作成したＣＥＡ−アジュバント微粒子複合体またはその会合粒子（以下、ＣＥＡ内包粒子という。）２０ｍｇを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに秤量し、１ｍｌの緩衝液Ａ（０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８および０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）に溶解して１８，０００×ｇ、１０分間の遠心により粒子（沈殿）と上清を分離した。上清を別のチューブに回収した後、粒子を１ｍｌの緩衝液に再けん濁し、上記条件での遠心による粒子と上清の分離を再度行った。この洗浄操作をもう一度繰り返し（計３回遠心）、各遠心で回収した上清中のＣＥＡ濃度はＥＬＩＳＡキット（Ｈｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製 ＴＭ−２０１）を用いて測定した。

粒子作製時の仕込みのＣＥＡ量（ＣＥＡ内包粒子重量２０ｍｇあたり）から３回の遠心上清中のＣＥＡ量合計を差し引くことで、以下の式により内包率を計算した。

抗原の放出性の測定は３回洗浄を行った粒子を１．２ｍｌの緩衝液Ａにけん濁分散させた。この溶液から一部（４０μ１）を別のチューブに移し、１８, ０００×ｇで１０分間の遠心により粒子を沈殿させ、上清３０μｌを別のチューブに回収した（０時間サンプル）。残りの粒子けん濁液は、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で、３７℃インキュベーター内でローテーターを用いて６ｒｐｍの速度でゆっくりと転倒混和させた。この溶液から経時的に少量（４０μｌ）を分取して、上記と同様に遠心による上清分離を行った。各時点で回収した上清サンプル中のＣＥＡ濃度を上記のＥＬＩＳＡ法で測定し、放出量（％）を以下の式により計算した。

＜結果＞
ＣＥＡ内包粒子の抗原内包率は表５のようになり、いずれのＣＥＡ内包粒子も高い効率で抗原が内包されていることが示された。抗原の保持性は疎水グラフト鎖の短いＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（７）で低く、１週間の間に内包する抗原の６７．３％が放出された。一方、疎水グラフト鎖が長くなるにつれ、抗原の保持性は上昇し、疎水グラフト鎖の長いＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子では1週間後も仕込抗原の９０％程度が含有されたままであった。ＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子も１週間で４％程度の抗原が放出されるに留まり、高い抗原保持性を示した。

実施例６ ＯＶＡ含有免疫原性組成物のマウス皮下投与（１）
＜方法＞
実施例３および４で作製したＯＶＡ−アジュバント微粒子複合体会合粒子（以下、ＯＶＡ内包会合粒子）またはＯＶＡ−アジュバント微粒子複合体（以下、ＯＶＡ内包粒子）のうち、疎水鎖の長さの異なるＯＶＡ内包会合粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２）（３）（４））、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（３）と粒径の異なるＯＶＡ内包会合粒子およびＯＶＡ内包粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（５）（６））、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子（３）それぞれ４０ｍｇ（抗原仕込み量５０μｇ）を３ｍｌのリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）にけん濁分散させ８０×ｇ、５分間の遠心により粒子を沈殿させ、上清を別チューブに移した。上清は再度８０×ｇ、５分間の遠心を行って残存している粒子を沈殿させ、上清は除去した。１回目の遠心沈殿と２回目の遠心沈殿をあわせて１ｍｌのＰＢＳに再分散し、同様の遠心洗浄操作を３回繰り返すことにより、粒子に内包されていない抗原を除去した。最後に沈殿を１５０μｌのＰＢＳに再分散して、投与溶液とした。本溶液を、９週令の雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（日本ＳＬＣ社）の背部皮下に単回注射投与した。比較例としては比較例１で製造したＰＬＧＡ粒子または抗原溶液（５０μｌ）のみ、さらに参考例として抗原溶液５０μｌとアジュバントとして“Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ”（サーモ・サイエンティフィック社製、以下、Ａｌｕｍとも言う。）５０μｌを混合した溶液をそれぞれ単回注射投与した。それぞれの条件ごとに４匹のマウスに投与し図１では抗体価の平均値を示した。

投与したマウスは自由に給餌、給水可能な環境で飼育し、経時的に尾静脈より採血を行った。採取した血液は、終濃度３．３ＩＵ／ｍｌのヘパリンを添加して５，０００ｒｐｍで５分間遠心して血漿を回収し、血漿中のＯＶＡに対する抗体価を測定した。

抗体価は、以下の方法で測定を行った。９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製 ＭａｘｉＳｏｒｐ）に、１μｇ／ｍｌのＯＶＡを含むＰＢＳ溶液１００μｌを入れ、４℃で１晩静置した。溶液を捨て、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ４００μｌを入れて室温で２時間ブロッキングを行った。ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）４００μｌで１回洗浄後、希釈液（０．２５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で１，０００倍から１００，０００倍に希釈した血漿サンプル１００μｌを入れ、室温で４０分間振とう反応を行った。ウェルを洗浄液で３回洗浄後、ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社）（希釈液で１０，０００倍希釈）１００μｌを入れ、室温で２０分間振とう反応を行った。ウェルを洗浄液で３回洗浄後、発色液（０．００６％過酸化水素、０．２ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンジジンを含む０．１Ｍ酢酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５））を１００μｌ入れ、室温で１０分間振とう反応を行った。１Ｎ硫酸１００μｌを加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準サンプルとして、段階希釈した抗ＯＶＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｈｏｐ社製 ＨＹＢ ０９４−０５）を同時に測定し、これを検量線として、各サンプル中の抗体量を重量濃度（ｎｇ／ｍｌ）に換算した。

＜結果＞
血漿中の抗ＯＶＡ抗体価の平均値の経時変化を図１に示す。Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡを用いたＯＶＡ内包粒子またはＯＶＡ内包会合粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２）（３）（４）（５）（６））、ＰＥＧ−ＰＬＧＡを用いたＯＶＡ内包会合粒子（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子（３））は６週間以上にわたり持続的な抗体価上昇効果を示し、比較例であるＰＬＧＡ粒子や抗原のみの投与、参考例である抗原＋Ａｌｕｍの投与を大きく上回った。なお、粒子径の小さいＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（６）が最も高い抗体価上昇効果を持つ傾向を示した。

実施例７ ＣＥＡ含有免疫原性組成物のマウス皮下投与
＜方法＞
実施例３および４の方法で作成したＣＥＡ―アジュバント微粒子複合体（以下、ＣＥＡ内包粒子）またはその会合粒子（以下、ＣＥＡ内包会合粒子）について、実施例６と同様の方法にて評価を行った。１匹あたりの投与量は１ｍｇ（抗原５μｇ）とし、それを単回注射投与した。ＣＥＡ内包粒子およびＣＥＡ内包会合粒子としては疎水グラフト鎖の長さの異なるＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（８）（９）（１０）、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（９）と同じ化合物（４）を用いて調製した粒子径の異なるＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１１）（１２）、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（９）に抗原と共にＣｐＧ２５μｇを共に含有させたＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１３）、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子（４）を評価した。また、比較例としては抗原５μｇを含む水溶液５０μｌ、参考例としては抗原５μｇを含む水溶液５０μｌおよびＡｌｕｍ５０μｌを混合して単回注射投与した。それぞれの条件ごとに４匹のマウスに投与し、図２および図３では各群の平均値を示した。

ＣＥＡに対する抗体価は、以下の方法で測定を行った。９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製 ＭａｘｉＳｏｒｐ）に、１μｇ／ｍｌのＣＥＡタンパクを含むＰＢＳ溶液１００μｌを入れ、４℃で１晩静置した。溶液を捨て、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ４００μｌを入れて室温で２時間ブロッキングを行った。ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）４００μｌで１回洗浄後、希釈液（０．２５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で１,０００倍から１００,０００倍に希釈した血漿サンプル１００μｌを入れ、室温で４０分間振とう反応を行った。ウェルを洗浄液で３回洗浄後、ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社）（希釈液で１０，０００倍希釈）１００μｌを入れ、室温で２０分間振とう反応を行った。ウェルを洗浄液で３回洗浄後、発色液（０．００６％過酸化水素、０．２ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンジジンを含む０．１Ｍ酢酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５））を１００μｌ入れ、室温で１０分間振とう反応を行った。１Ｎ硫酸１００μｌを加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準サンプルとして、段階希釈した抗ＣＥＡモノクローナル抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ社製 ＭＡ１−５３０８）を同時に測定し、これを検量線として、各サンプル中の抗体量を重量濃度（ｎｇ／ｍｌ）に換算した。ＩｇＧ２ａ抗体価の測定はＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体の代わりにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製 Ａ９０−１０７Ｐ）を用いて、抗体価の上昇した１匹のマウスの血漿サンプルを基準サンプルとして用い、これを段階希釈したサンプルを標準として検量線を作成し、６４,０００倍希釈サンプルに相当する抗体価を１Ｕとして表した。

＜結果＞
Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡを用いたＣＥＡ内包粒子またはＣＥＡ内包会合粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（８）（９）（１０）（１１）（１２）、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子（４））はおよそ６週間にわたり持続的な抗体価上昇を示し、これらの中で粒子径の小さな粒子であるＣＥＡ内包粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１２））が最も高い抗体価上昇効果を示した。また、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（９）に抗原と共にＣｐＧを含有させたＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１３）はＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（９）と比較し高い抗体価上昇効果を示した（図２）。

抗ＩｇＧ２ａ抗体価はＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（８）（９）（１０）（１１）（１２）およびＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子（４）で持続的な上昇が確認された。Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（９）に抗原と共にＣｐＧを含有させたＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１３）はＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（９）と比較し高い抗体価上昇効果を示した。一方、参考例である抗原とＡｌｕｍを混合して投与した場合は抗体価の持続的な上昇は見られるものの、その他のＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子と比較するとその効果は弱かった。本発明の免疫原性組成物はマウスＩｇＧ２ａ価上昇が指標として知られる細胞性免疫も持続的に長期間にわたり活性化していることが確認された（図３）。

実施例８ ＯＶＡ含有免疫原性組成物のマウス皮下投与（２）
＜方法＞
実施例１の化合物（４）と同様の方法で調製したＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡポリマーを用い、実施例３のＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（３）と同様の方法で調製した粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（Ａ））を実施例６に記載の方法を用いて評価を行った。1匹あたりの投与量は１６ｍｇ（内包ＯＶＡ量２０μｇ）とし、それを単回注射投与した。また参考例として、２０μｇのＯＶＡ抗原を含む水溶液５０μｌとＡｌｕｍ５０μｌを混合した溶液を１回、または１週間おきに３回注射投与した。それぞれの条件ごとに２匹のマウスに投与し、図４では抗体価の平均値を４５０ｎｍの吸光度測定値の数値として表記した。

＜結果＞
血漿中の抗ＯＶＡ抗体の経時変化を図４に示す。Ａｌｕｍと抗原の混合溶液を１回のみ投与した参考例では抗体価の上昇はほとんど見られなかった。Ａｌｕｍと抗原を３回投与した参考例では３回目の投与から急激な抗体価の上昇が見られたが、上昇は一過性で３５日以降上昇は見られなかった。本発明の免疫原性組成物（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（Ａ））を単回注射投与したマウスでは投与２週間目から持続的な上昇が見られ、５６日後まで持続的な抗体価上昇が確認された。

実施例９ ＯＶＡ含有免疫原性組成物のマウス皮下投与（３）
＜方法＞
評価は実施例６と同様の方法にて行った。投与量はいずれも１匹あたりＯＶＡ内包会合粒子１０ｍｇ（抗原仕込み量１２．５μｇ）とし、実施例１の化合物（４）と同様の手法で調製したＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡポリマーを用い、実施例３のＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（３）と同様の方法で調製した粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（Ｂ））および、実施例１の化合物（４）と同様の手法で調製したＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡポリマーを用い、実施例３のＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（３）の調製時にＯＶＡと共に１匹あたりの投与量が６．２５μｇになるようにＣｐＧを含有させた粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（Ｃ））、およびＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子（１）および（２）を単回注射投与した。比較例としては抗原１２．５μｇ、参考例としては抗原１２．５μｇとＣｐＧ６．２５μｇを混合して単回注射投与した。抗体価は投与から４週目より１週間おきに採血を行い、実施例６と同様の方法で測定した。各条件につき２匹のマウスに投与し図５では抗体価の平均値を示した。

＜結果＞
ＯＶＡ内包会合粒子（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子（１）（２）、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（Ｂ）（Ｃ））はいずれも投与後６週間以上にわたり投与動物の抗体価を上昇させた。Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子はＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子よりも高い免疫活性化能を示した。また、ＣｐＧを内包したＯＶＡ内包粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（Ｃ））は、ＣｐＧを含まないＯＶＡ内包粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（Ｂ））よりも高い抗体価上昇効果を示した。

実施例１０ ＨＣＶ構成タンパク質含有免疫原性組成物のマウス皮下投与
＜方法＞
実施例１の化合物（４）と同様の手法で調製したＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡポリマーを用い、実施例３のＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（３）と同様の調製方法を用いて、ＨＣＶ構成タンパク質を含有させたＨＣＶ構成タンパク質−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（Ｄ）（以下、ＨＣＶ−Ｅ２内包会合粒子）を調製し実施例６と同様の方法で単回注射投与した。ＨＣＶ構成タンパク質としては特願２００８−２５４３３８に記載された方法に従って調製したＪ６ＣＦ株由来のＥ２タンパク質とヒトＩｇＧのＦｃタンパク質からなるキメラタンパク質を用いた。１匹あたりの投与量は８０ｍｇ（抗原１．５μｇ）とした。またＣｐＧ２５μｇとＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（Ｄ）を混合したもの、ＣｐＧ２５μｇとＡｌｕｍ５０μｌをＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（Ｄ）と混合したものをそれぞれ単回注射投与した。比較例としては抗原のみ１．５μｇ、参考例として抗原１．５μｇおよびＣｐＧ２５μｇを含む水溶液１００μｌ、抗原１．５μｇおよびＡｌｕｍ５０μｌを含む水溶液１００μｌ、あるいは抗原１．５μｇ、Ａｌｕｍ５０μｌおよびＣｐＧ２５μｇを含む水溶液１００μｌをそれぞれ単回注射投与した。それぞれの条件ごとに２匹のマウスに投与した。

ＨＣＶ構成タンパク質に対する抗体価は、以下の方法で測定を行った。９６穴マイクロプレート(Ｎｕｎｃ社製 ＭａｘｉＳｏｒｐ)に、０．５μｇ／ｍｌのＨＣＶ構成タンパク質を含むＰＢＳ溶液１００μｌを入れ、４℃で１晩静置した。溶液を捨て、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ４００μｌを入れて室温で２時間ブロッキングを行った。ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）４００μｌで１回洗浄後、希釈液（０．２５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で１，０００倍から１００，０００倍に希釈した血漿サンプル１００μｌを入れ、室温で４０分間振とう反応を行った。ウェルを洗浄液で３回洗浄後、ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社）（希釈液で１０，０００倍希釈）１００μｌを入れ、室温で２０分間振とう反応を行った。ウェルを洗浄液で３回洗浄後、発色液（０．００６％過酸化水素、０．２ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンジジンを含む０．１Ｍ酢酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５））を１００μｌ入れ、室温で１０分間振とう反応を行った。１Ｎ硫酸１００μｌを加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。図６では抗体価の平均値を４５０ｎｍの吸光度測定値の数値として表記した。

＜結果＞
ＨＣＶ−Ｅ２内包会合粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（Ｄ））は７週間にわたり持続的な抗体価上昇効果を示した。またＨＣＶ−Ｅ２内包会合粒子にＣｐＧを混合した場合、およびＨＣＶ−Ｅ２内包会合粒子にＣｐＧおよびＡｌｕｍを混合した場合は、ＨＣＶ−Ｅ２内包会合粒子単独を投与した場合に比べ高い抗体価上昇効果を示した。抗原のみを投与した比較例では、ほとんど抗体価上昇が観察されなかった。抗原およびＡｌｕｍ、抗原およびＣｐＧ、あるいは抗原、ＣｐＧおよびＡｌｕｍをそれぞれ混合して投与した参考例では抗原単独に比べ抗体価上昇効果は上昇したが、ＨＣＶ−Ｅ２内包会合粒子を投与した場合と比較し遙かに劣る抗体価上昇効果しか示さなかった。

実施例１１ ＣＥＡ含有免疫原性組成物のマウス皮下投与（２）
＜方法＞
実施例３および４の方法で作成したＣＥＡ―アジュバント微粒子複合体会合粒子（以下、ＣＥＡ内包会合粒子）について、実施例７と同様の方法にて評価を行った。１匹あたりの投与量は４００μｇ（抗原１μｇ）とし、それを０週目と４週目に投与した。ＣＥＡ内包会合粒子としてはデキストラン分子量１，５００を親水鎖とするＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１４）（１５）、デキストラン分子量５，０００を親水鎖とするＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１６）（１７）、デキストラン分子量１７５，０００を親水鎖とするＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１８）、デキストラン分子量４０，０００を親水鎖とするＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１９）を評価した。それぞれの条件ごとに５匹のマウスに投与し、図７では各群の平均値を示した。ＣＥＡに対する抗体価は、実施例７と同様の方法で測定した。

＜結果＞
Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡを用いたＣＥＡ内包会合粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１４）（１５）（１６）（１７）（１８）（１９））は持続的な抗体価上昇を示した。これらの中でデキストラン分子量１７５，０００および分子量４０，０００から構成されるＣＥＡ内包会合粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１８）（１９）は、デキストラン親水鎖の分子量１，５００および分子量５，０００から構成されるＣＥＡ内包会合粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（１４）（１５）（１６）（１７）と比較し高い抗体価上昇効果を示した（図７）。

実施例１２ ＣＥＡ含有免疫原性組成物のマウス皮下投与（３）
＜方法＞
実施例３および４の方法で作成したＣＥＡ−アジュバント微粒子複合体会合粒子（以下、ＣＥＡ内包会合粒子）について、実施例７と同様の方法にて評価を行った。１匹あたりの投与量は４００μｇ（抗原１μｇ）とし、それを０週目と４週目に投与した。ＣＥＡ内包会合粒子としては同一のポリマーを用い、異なる粒径に調製した粒子３種類の粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２０）（粒径０．４μｍ）、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２１）（粒径５μｍ）、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（粒径４０μｍ）を評価した。それぞれの条件ごとに５匹のマウスに投与し、図８では各群の平均値を示した。ＣＥＡに対する抗体価は、実施例７と同様の方法で測定した。

＜結果＞
Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡを用いたＣＥＡ内包粒子およびＣＥＡ内包会合粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２０）（２１）（２２））は持続的な抗体価上昇を示した。これらの中で、平均粒径０．４μｍのＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２０）が最も高い抗体価上昇効果を示し、次に平均粒径５μｍのＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２１）、そして、平均粒径４０μｍのＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２２）は最も低い抗体価上昇効果を示した（図８）。

実施例１３ ＯＶＡ含有免疫原性組成物のマウス皮下投与（４）
＜方法＞
評価は実施例９と同様の方法にて行った。投与量はいずれも１回投与あたりの抗原量を２０μｇとし、０週目、２週目、４週目に３回の抗原投与を行った。評価はＯＶＡ２０μｇと抗原を含まないＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２４）（ポリマー量１６ｍｇ分）を混合して投与した場合、ＯＶＡ２０μｇを含むＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２３）（ポリマー量１６ｍｇ分）を投与した場合、ＯＶＡ２０μｇとＡｌｕｍ５０μｌを混合して投与した場合、ＯＶＡ２０μｇと抗原を含まないＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２４）を別の場所に投与した場合を比較した。血中の抗体価は実施例９と同様の方法で測定した。各条件につき２匹のマウスに投与し図９では抗体価の平均値を示した。

＜結果＞
いずれの粒子も抗体価上昇効果を示した。ＯＶＡと抗原を含まない粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２４））を混合して投与した場合、およびＯＶＡとＤｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２４）を別々の場所に投与した場合に比べ、ＯＶＡ内包会合粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２３））が高い抗体価上昇効果を示した。

実施例１４ ＣＥＡ含有免疫原性組成物のマウス皮下投与（４）
＜方法＞
評価は実施例７と同様の方法にて行った。ＣＥＡとＡｌｕｍを混合して投与した場合のみ、０週目、２週目、４週目に合わせて３回の投与を行い、その他のＣＥＡ内包粒子および、ＣＥＡ内包会合粒子は０週目に単回投与を行った。評価は同一のポリマーを用いて調製した粒径の異なる粒子、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２５）（粒径０．４μｍ、ポリマー含有量４ｍｇ、抗原投与量１０μｇ）、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２６）（粒径５μｍ、ポリマー含有量４ｍｇ、抗原投与量１０μｇ）、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２７）（粒径４０μｍ、ポリマー含有量４ｍｇ、抗原投与量１０μｇ）、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２８）（粒径０．４μｍ、ポリマー含有量４ｍｇ、抗原投与量１μｇ）を比較した。また、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２５）に関しては投与量を１０分の１（ポリマー含有量４００μｇ、抗原投与量１μｇ）、１００分の１（ポリマー含有量４０μｇ、抗原投与量０．１μｇ）に減らして投与した場合との比較を行った。比較例としては、ＣＥＡを内包させて調製したＰＬＧＡ粒子（２）を評価した。それぞれの項目ごとに６匹のマウスに投与を行い血中の抗体価およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａは実施例７と同様の方法で測定を行い、図１０、図１１ではその平均値を示した。

＜結果＞
平均粒径０．４μｍおよび平均粒径５μｍのＣＥＡ内包粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２５）（２６））は、平均粒径４０μｍのＣＥＡ内包粒子（Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２７））と比較し高い抗体価上昇効果を示した。Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２５）が高い抗体価上昇効果を示したのに対し、その投与量を１０分の１，１００分の１と減らすことで、抗体価上昇効果は低下し、投与量を１００分の１とした粒子では低い抗体価上昇効果しか持たなかった。抗原投与量１μｇとした、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２５）１０分の１量投与、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２８）のの比較では、投与ポリマー量が多い方が高い抗体価誘導効果を示した（図１０）。

また、６週間目の血液に関して実施例７と同様の方法でＩｇＧ２ａ抗体価を測定し、ＩｇＧ２ａ抗体価測定と同様の方法でＩｇＧ１抗体をもちいて、ＩｇＧ１抗体価を測定し、その比を計測したところ、Ａｌｕｍと抗原を混合して投与した場合は低いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１値を示すのに対し、Ｄｅｘ−ｇ−ＰＬＧＡ粒子（２５）（２６）（２７）は高いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１値を示し、粒径が小さくなるほどＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１値が高くなる傾向が見られた（図１１）。

本発明の免疫原性組成物は、感染症や癌などの治療および／または予防のためのワクチンとして利用することができる。

Claims (11)

1. 疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマーからなるアジュバント微粒子に抗原が内包された抗原−アジュバント微粒子複合体を有効成分として含有する、免疫原性増強用組成物。
2. 抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子を有効成分として含有する、請求項１に記載の免疫原性増強用組成物。
3. アジュバント微粒子が両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる親水性部分を内部に有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水部分の外層を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の免疫原性増強用組成物。
4. 両親媒性ポリマーが多糖主鎖およびポリ（ヒドロキシ酸）グラフト鎖からなるグラフト型両親媒性ポリマーである、請求項１〜３のいずれかに記載の免疫原性増強用組成物。
5. 多糖がデキストランである、請求項１〜４のいずれかに記載の免疫原性増強用組成物。
6. ポリ（ヒドロキシ酸）がポリ（乳酸−グリコール酸）である、請求項１〜５のいずれかに記載の免疫原性増強用組成物。
7. 表面改質剤がアジュバント微粒子のポリ（ヒドロキシ酸）に結合している、請求項１〜６のいずれかに記載の免疫原性増強用組成物。
8. 抗原−アジュバント微粒子複合体または抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子の平均粒径が０．１〜５０μｍである、請求項１〜７のいずれかに記載の免疫原性増強用組成物。
9. さらに免疫活性化物質を有効成分として含有する、請求項１〜８のいずれかに記載の免疫原性増強用組成物。
10. 免疫活性化物質が核酸である、請求項９に記載の免疫原性増強用組成物。
11. 免疫活性化物質がＣｐＧである、請求項９または１０に記載の免疫原性増強用組成物。

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