JP6007791B2 - 糖液の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法に関する。

糖を原料とした化学品の発酵生産プロセスは、種々の工業原料生産に利用されている。この発酵原料となる糖として、現在、さとうきび、澱粉、テンサイなどの食用原料に由来するものが工業的に使用されているが、今後の世界人口の増加による食用原料価格の高騰、あるいは食用と競合するという倫理的な側面から、再生可能な非食用資源、すなわちセルロース含有バイオマスより効率的に糖液を製造するプロセス、あるいは得られた糖液を発酵原料として、効率的に工業原料に変換するプロセスの構築が今後の課題となっている。

バイオマスから糖を得る従来技術としては、濃硫酸を用いて、バイオマス中のセルロースやヘミセルロースをグルコース、キシロースに代表される単糖まで加水分解する方法（特許文献１、２）や、バイオマスの反応性を向上させる前処理を施した後に、酵素反応により加水分解する方法が一般的に知られている（特許文献３、４）。その場合、セルロース含有バイオマスの加水分解においてセルロースあるいはヘミセルロース成分などの分解と同時に、生成したグルコース、キシロースとした糖の分解物反応も進み、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールなどのフラン化合物、あるいはギ酸、酢酸など有機酸といった副産物も生成するという課題があった。これらの化合物は、微生物を利用した発酵工程で阻害的に作用し、微生物の増殖阻害を引き起こし、発酵産物の収率を低下させるため、発酵阻害物質と呼ばれ、セルロース含有バイオマス由来の糖液を発酵原料として利用する際に大きな課題であった。このような発酵阻害物質を糖液製造過程で除去する方法として、発酵阻害物質をナノ濾過膜や逆浸透膜で除去する方法が知られている（特許文献５）。

特表平１１−５０６９３４号公報 特開２００５−２２９８２１号公報 特開２００１−９５５９４号公報 特許第３０４１３８０号公報 ＷＯ２０１０／０６７７８５号

本発明者は前述のとおりセルロース含有バイオマス由来の糖液に含まれる発酵阻害物質をナノ濾過膜や逆浸透膜で除去した際、発酵阻害物質が全量除去されない場合があることを見出し、その原因としてナノ濾過膜や逆浸透膜では除去しづらい未同定の発酵阻害物質がセルロース含有バイオマス由来の糖液に含まれうることによるものであると推定した。本発明ではセルロース含有バイオマス由来の糖液から従来の方法では除去困難であった発酵阻害物質を除去して発酵阻害物質量が極めて少ない糖液を製造する方法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を鋭意検討した結果、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する工程で生じる発酵阻害物質としてクマル酸、フェルラ酸、コニフェリルアルデヒド、２，３−ジヒドロベンゾフランといったと単糖と同等の分子量、または分子量の大きい物質が含まれることを新たに同定するとともに、それらを限外濾過膜によって効率的に除去できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の［１］から［６］で構成される。
［１］セルロース含有バイオマスを原料として糖液を製造する方法であって、
工程（１）：セルロース含有バイオマスを加水分解し、糖水溶液を製造する工程、
工程（２）：工程（１）で得られた糖水溶液を分画分子量６００〜２，０００の限外濾過膜を通じて濾過して、透過側に発酵阻害物質を除去し非透過側から糖液を回収する工程、を含むことを特徴とする、糖液の製造方法。
２］前記発酵阻害物質がクマル酸、フェルラ酸および２，３−ジヒドロベンゾフランからなる群から選択される一種または２種以上を含むことを特徴とする、［１］記載の糖液の製造方法。
［３］前記工程（２）において、糖水溶液をｐＨ５以下に調整して濾過することを特徴とする、［１］または［２］記載の糖液の製造方法。
［４］前記工程（２）で使用する限外濾過膜の機能層の材質がポリエーテルスルホンであることを特徴とする、［１］から［３］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［５］工程（２）で得られた糖液および／または発酵阻害物質を含む透過液をナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過して、非透過側から濃縮糖液を回収する工程を含むことを特徴とする、［１］から［４］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［６］［１］から［５］のいずれかに記載の糖液の製造方法によって得られた糖液を発酵原料として使用することを特徴とする、化学品の製造方法。

本発明によって、グルコース、キシロースなどの糖を含有する糖液を高純度・高収率で製造することができる。その結果、本発明で得られた精製糖液を発酵原料として使用することで、種々の化学品の発酵生産の効率を向上させることができる。

[図４]図４はセルロース含有バイオマスの希硫酸により得られる硫酸水溶液を限外濾過
膜して得た透過液を膜濃縮することによってキシロース消費速度を指標とした発酵性が向上した結果である。

［工程（１）］
本発明におけるセルロース含有バイオマスとは、セルロースを５重量％以上含む生物由来の資源を言う。具体的には、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、稲わら、麦わらなどの草本系バイオマス、樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。これらのセルロース含有バイオマスは、芳香族高分子であるリグニン及びセルロース・ヘミセルロースを含有していることから、リグノセルロースとも呼ばれる。セルロース含有バイオマスに含まれる多糖成分であるセルロースやヘミセルロースを加水分解することにより、化学品を製造するための発酵原料として利用可能な単糖を含む糖液、具体的にはキシロースおよびグルコースを主成分とする糖液を得ることができる。

セルロース含有バイオマスの加水分解処理は、具体的には、化学的処理方法として、高温高圧の希硫酸、亜硫酸塩等で処理する酸処理、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ性水溶液で処理するアルカリ処理、液体アンモニア又はアンモニアガス又はアンモニア水溶液で処理するアンモニア処理、加圧熱水で処理する水熱処理が挙げられる。また、これらの加水分解処理に加えて糖化酵素による加水分解処理をしてもよい。

酸処理は、一般に、リグニンを溶解させ、さらにまず結晶性の低いヘミセルロース成分から加水分解が起き、次いで結晶性の高いセルロース成分が分解されるという特徴を有するので、ヘミセルロース由来のキシロースを多く含有する液を得ることが可能である。また、処理回数は特に限定されないが、２段階以上の酸処理工程を設定することで、ヘミセルロース、セルロースに適した加水分解条件を選択的に設定することができ、分解効率及び糖収率を向上させることが可能になる。酸処理において用いる酸は、加水分解を起こすものであれば特に限定はされないが、経済性の観点から硫酸が望ましい。酸の濃度は、好ましくは０．１〜１００重量％であり、より好ましくは０．５〜１５重量％である。反応温度は１００〜３００℃の範囲で、反応時間は１秒〜６０分の範囲で設定することができる。酸処理後の液成分には加水分解で得られたヘミセルロース由来の成分を主成分とする単糖およびそのオリゴ糖が多量に含まれている。特に５０％以上、より好ましくは８０％以上の濃硫酸で作用させれば、ヘミセルロース・セルロースがともに加水分解され一段で加水分解処理することも可能である。また、酸処理後に糖化酵素によりさらに加水分解する場合、酸処理後に得られる固形分と液成分とを分けてそれぞれ行っても良いし、固形分と液成分とが混合したまま行っても良い。なお、酸処理によって得られる固形分および液成分には用いた酸が含まれているので、糖化酵素による加水分解反応を行うためにはあらかじめ酸処理物を中和することが好ましい。

アルカリ処理は、アルカリ水溶液、具体的には水酸化物塩（但し、水酸化アンモニウムを除く）の水溶液でセルロース含有バイオマスを反応させる処理方法である。アルカリ処理により、主にセルロース・ヘミセルロースの糖化酵素による反応を阻害するリグニンを除去することができる。使用する水酸化物塩としては、水酸化ナトリウム又は水酸化カルシウムが好ましい。アルカリ水溶液の濃度は、０．１〜６０重量％の範囲が好ましく、これをセルロース含有バイオマスに添加し、通常１００〜２００℃、好ましくは１１０〜１８０℃の温度範囲で処理する。処理回数は特に限定されず、１回又は複数回行ってもよい。２回以上行う場合は、各回の処理を異なる条件で実施してもよい。なお、アルカリ処理によって得られた前処理物はアルカリを含むため、さらに糖化酵素による加水分解を行う場合はあらかじめ中和することが好ましい。

アンモニア処理は、アンモニア水溶液又は１００％アンモニア（液体又は気体）をセルロース由来バイオマスと反応させる処理方法であり、例えば、特開２００８−１６１１２５又は特開２００８−５３５６６４に記載の方法を用いることができる。アンモニア処理では、アンモニアがセルロース成分と反応することにより、セルロースの結晶性が崩れることにより、糖化酵素との反応効率が大幅に向上すると言われている。通常、セルロース含有バイオマスに対して０．１〜１５重量％の範囲の濃度となるようにセルロース含有バイオマスにアンモニアを添加し、４〜２００℃、好ましくは６０〜１５０℃で処理する。処理回数は特に限定されず、１回又は複数回行ってもよい。なお、アンモニア処理によって得られた前処理物をさらに糖化酵素による加水分解反応を行う場合は、あらかじめアンモニアの中和又はアンモニアの除去を行うことが好ましい。

水熱処理は、セルロース含有バイオマスを１００〜４００℃の加圧熱水で、１秒〜６０分処理する方法である。通常、処理後の２５℃の常温で水に不溶であるセルロース含有バイオマスが、セルロース含有バイオマスと水の合計総重量に対して０．１〜５０重量％の濃度になるように行われる。圧力は処理温度に依存されるため特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０ＭＰａである。なお、水熱処理では加圧熱水の温度により熱水への溶出成分が異なる。一般に、加圧熱水の温度を上昇させていくと、セルロース含有バイオマスからは最初にタンニン、リグニンの第１グループが流出し、次に１４０〜１５０℃以上でヘミセルロースの第２グループが流出し、更に約２３０℃を越えるとセルロースの第３グループが流出する。また、流出と同時にヘミセルロース、セルロースの加水分解反応が起こることもある。加圧熱水の温度による流出成分の違いを利用して、セルロース、ヘミセルロースに対する糖化酵素の反応効率を向上させるために処理温度を変えて多段階の処理をしてもよい。ここで、水熱処理によって得られる画分のうち、加圧熱水へ溶出した成分を含む水溶物を熱水可溶分、熱水可溶分を除いたものを熱水不溶分という。

熱水不溶分は、多くのリグニンとヘミセルロース成分が溶出された結果得られる、主に二糖以上のセルロース（Ｃ６）成分を含んだ固形分である。主成分のセルロースにほか、ヘミセルロース成分、リグニン成分が含まれることもある。これらの含有比率は、水熱処理の加圧熱水の温度や処理バイオマスの種類によって変化する。熱水不溶分の含水率は１０％から９０％、より好ましくは２０％から８０％である。

熱水可溶分は液体状態又はスラリー状態である加圧熱水に溶出したヘミセルロース、リグニン、タンニン、一部のセルロース成分を含む水溶物であり、液体状態又はスラリー状態である。熱水可溶分には加水分解した多糖、オリゴ糖、単糖を多く含んでいる。これらをそのまま、または糖化酵素によりさらに加水分解して糖水溶液として利用することが可能である。

また、前記加水分解処理方法の前に、カッターミルや、ハンマーミルなどを用いて機械的に繊維を切断する粉砕処理、ボールミル、ジェットミルなどを利用した微粉砕処理、グラインダーを利用した湿式処理、メカノケミカル処理、水蒸気によって短時間蒸煮し、瞬時に圧力を開放して体積膨張により粉砕する蒸煮爆砕処理などの前処理を実施してもよい。粉砕されることによってセルロース・ヘミセルロースの露出面積が増えて糖化酵素による加水分解反応の効率が高まるからである。

糖化酵素は、セルロースまたはヘミセルロース分解活性を有する酵素であれば特に制限はないが、トリコデルマ属に属する糸状菌が産生する糖化酵素が好適である。トリコデルマ属糸状菌は細胞外に多種の糖化酵素に分泌する微生物であり、好ましくは、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の糖化酵素である。また、セルロースまたはヘミセルロース分解活性を有する酵素の他に、セルロース又はヘミセルロースの分解を補助する酵素を含んだものも好適である。セルロース又はヘミセルロースの分解を補助する酵素としては、セルビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、バイオマス膨潤酵素などを例示することができる。糖化酵素を使用した加水分解反応は、ｐＨが３〜７の付近で行うことが好ましく、より好ましくはｐＨ５付近である。反応温度は、４０〜７０℃であることが好ましい。また酵素による加水分解終了時に固液分離を行い、未分解の固形分を除去することが好ましい。固形分除去の方法としては、遠心分離法、膜分離法などがあるが特に限定されない。またこうした固液分離を複数種組み合わせて使用してもよい。

工程（１）で得られる糖水溶液は、工程（２）における限外濾過膜の目詰まりやファウリングを防ぐために、工程（２）に供する前に固形分やオリゴ糖、多糖、タンニン、糖化酵素、バイオマス由来のタンパク質成分などの水溶性高分子を除去しておくことが好ましい。これらの成分の除去方法には特に制限はないが、好ましい除去方法として、糖水溶液を精密濾過膜および／または分画分子量が２，０００よりも大きい限外濾過膜に通じて濾過して、非透過側に固形分や水溶性高分子を濾別する方法が挙げられる。濾過の方法としては、圧濾過、真空濾過、遠心濾過などがあるが特に限定されるものではない。また濾過操作として、定圧濾過、定流量濾過、非定圧非定流量濾過に大別されるが特に限定されない。また濾過操作としては、固形分を効率的に除去するために、精密濾過膜あるいは分画分子量が２，０００よりも大きい限外濾過膜を２回以上使用する多段的な濾過でもよい。

精密濾過膜とは、平均細孔径が０．０１μｍ〜５ｍｍである膜のことであり、マイクロフィルトレーション膜、ＭＦ膜などと略称されるものであって、糖水溶液に含まれる固形分を除去する際に好ましく用いられる。ここで使用される精密濾過膜は無機膜でも有機膜であっても良く、セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、塩素化ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリ４フッ化エチレン等の有機材料、あるいはステンレス等の金属、あるいはセラミック等無機材料が挙げられる。

限外濾過膜とは、後述の工程（２）において詳述されるものであって、分画分子量が２，０００より大きい限外濾過膜を使用することによって、糖水溶液に含まれる水溶性高分子、特に糖化酵素を除去する際に好ましく用いられる。

［工程（２）］
工程（１）においてセルロース含有バイオマスを加水分解した場合、糖の他に発酵阻害物質が生成することが知られている。発酵阻害物質とは、セルロース含有バイオマスの加水分解で生成する化合物であって、糖液を原料とする化学品を製造するための発酵工程において、化学品の生産量、蓄積量、あるいは生産速度の低下現象を引き起こす作用を有する物質のことを指す。発酵阻害物質による発酵阻害の程度は、糖水溶液中に存在する発酵阻害物質の種類、およびこれらの量により微生物の受ける阻害の程度も異なり、また使用する微生物種、あるいはその生産物である化学品の種類によってもその阻害の程度は異なっているため、本発明においては特段限定されるものではない。

これまでに、酢酸、ギ酸などの有機酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）などのフラン系化合物、バニリン、４−ヒドロキシ安息香酸などのフェノール系化合物が発酵阻害物質として知られていたが、本発明者は、これまで知られていた発酵阻害物質の他に、クマル酸、フェルラ酸、２，３−ジヒドロベンゾフランなどが発酵阻害物質となることを見出した。そして工程（２）では、工程（１）で得られた糖水溶液を特定の分画分子量の限外濾過膜に通じて濾過することによって、透過側に発酵阻害物質を除去し、非透過側から糖液を回収することを特徴とする。

本明細書にいう限外濾過膜とは、分画分子量が６００〜２００，０００となる分離膜のことであり、ウルトラフィルトレーション膜、ＵＦ膜などと略称されるものである。また、分画分子量とは、日本膜学会編 膜学実験シリーズ 第ＩＩＩ巻 人工膜編 編集委員／木村尚史・中尾真一・大矢晴彦・仲川勤（共立出版、１９９３年）９２頁に、『溶質の分子量を横軸に、阻止率を縦軸にとってデータをプロットしたものを分画分子量曲線とよんでいる。そして阻止率が９０％となる分子量を膜の分画分子量とよんでいる。』とあるように、限外濾過膜の膜性能を表す指標として当業者には周知のものである。なお、分離膜の技術分野では、分画分子量が６００〜１，０００の範囲の分離膜はナノ濾過膜と限外濾過膜の境界領域であると認識されているため、文献によっては、分画分子量６００〜１，０００の範囲にある分離膜をナノ濾過膜と呼ぶ場合もあれば、限外濾過膜と呼ぶ場合もある。本明細書では、分画分子量が６００〜２００，０００の範囲にある分離膜を限外濾過膜と呼び、分画分子量が６００未満のものでかつ、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜に当てはまるものをナノ濾過膜と呼ぶこととする。

本発明では、分画分子量６００〜２，０００の限外濾過膜を使用することを特徴とする。分画分子量が２，０００より大きい限外濾過膜では糖の大部分と発酵阻害物質がともに透過側に抜けてしまい、また、分画分子量が６００未満の膜であると新たに同定した発酵阻害物質であるクマル酸、フェルラ酸、２，３−ジヒドロベンゾフランの透過側への除去性能が落ちるため、好ましくない。

限外濾過膜の材質は、特に限定されるものではないが、セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、スルホン化ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、塩素化ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリ４フッ化エチレン等の有機材料、ステンレス等の金属、又はセラミック等無機材料が挙げられる。中でも疎水性物質の除去性から有機性の膜が好ましい。中でもポリエーテルスルホンが好ましい。ポリエーテルスルホンの膜が所望の糖と発酵阻害物質との分離性能が良いことが判明したからである。さらに好ましくはスルホン化ポリエーテルスルホンである。糖の阻止率がスルホン化されていない場合に比べて高まるからである。

使用する限外濾過膜の形態は特に限定されるものではなく、スパイラル型、中空糸型、チューブラー型、平膜型のいずれであってもよい。

本発明で使用される限外濾過膜の具体例としては、ＤＥＳＡＬ社のＧ−５タイプ、ＧＨタイプ、ＧＫタイプ、Ｓｙｎｄｅｒ社のＳＰＥ１、ＫＯＣＨ社製のＰＭ１０００、ＰＭ２０００、ＭＰＳ−３６、ＳＲ２、アルファラバル製ＧＲ９５Ｐｐ、ＥＴＮＡ０１ＰＰ、日東電工株式会社製のＮＴＲ−７４５０（分画分子量６００〜８００、ＷａｔｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ ３７（２００３） ８６４−８７２参照。）、ＮＴＲ−７４１０（分画分子量１，０００〜２，０００、衛生工学シンポジウム論文集，５：２４６−２５１（１９９７）参照。）などが挙げられる。

前記限外濾過膜の濾過処理における濾過圧は糖水溶液の濃度にも依存するが、０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲であることが好ましい。濾過圧が０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるおそれがある。また、０．５ＭＰａ以上６ＭＰａ以下であれば膜透過流束が高いことから、糖溶液を効率的に透過させることができるため、より好ましい。

前記限外濾過膜の濾過処理における膜透過流束は０．２ｍ／Ｄ以上４．０ｍ／Ｄ以下が好ましい。０．２ｍ／Ｄ以下であると、限外濾過膜での濃縮が行えず２．０ｍ／Ｄ以下であると、膜のファウリングが顕著になるからである。また、０．５ｍ／Ｄ以上２．０ｍ／Ｄ以上であれば、限外濾過膜による濾過が行いやすくなるため、より好ましい。

前記限外濾過膜の濾過処理における糖水溶液のｐＨは特に限定はされないが、発酵阻害物質の透過性の観点からｐＨ５以下が好ましく、ｐＨ４以下がより好ましい。なお、ｐＨが１以下であるとｐＨ調整時の酸が大量に必要になるため、経済性の見地からｐＨの下限値を１とすることが好ましい。糖水溶液のｐＨ調整は、特に発酵阻害物質としてクマル酸やフェルラ酸といった芳香族化合物でかつカルボン酸基を有する物質が含まれる場合に効果が顕著である。

前記限外濾過膜の濾過処理の非透過側から回収される糖液は、後述の発酵工程の原料としてそのまま用いてもよく、また、該糖液をさらにＷＯ２０１０／０６７７８５号に記載されるナノ濾過膜および／または逆浸透膜による濾過処理に供して非透過側に糖を濃縮した後、該濃縮糖液を後述の発酵工程の原料として用いてもよい。

また、前記限外濾過膜の濾過処理では糖が透過側に一部損失する場合があるが、その場合、透過側から回収される発酵阻害物質を含む透過液をＷＯ２０１０／０６７７８５号に記載されるナノ濾過膜および／または逆浸透膜による濾過処理に供することによって、非透過側から濃縮糖液を回収することできる。本工程によって得られた濃縮糖液についても、後述の発酵工程の原料として用いられる。なお、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜による濾過処理によって得られた濃縮糖液についても、あらかじめ分画分子量が６００〜２，０００の限外濾過膜で濾過処理した場合は、濾過処理していない場合や分画分子量が２，０００を上回る限外濾過膜で濾過処理した場合に比べて後述の発酵工程での発酵性能が向上する傾向が確認されている。これは、セルロース含有バイオマス由来の糖水溶液には分子量２，０００近傍の未知の発酵阻害物質が微量含まれ、それがナノ濾過膜や逆浸透膜によって濃縮されるためであると考えられる。

［発酵工程］
工程（２）で得られた糖液は化学品を代謝産物として製造しうる微生物あるいは培養細胞の生育のための炭素源であるグルコースおよび／またはキシロースを含んでおり、一方で、クマル酸、フェルラ酸、２，３−ジヒドロベンゾフランなどの発酵阻害物質の含量が極めて少ないために、化学品を製造するための発酵原料、特に炭素源として有効に使用することが可能である。発酵工程は、ＷＯ２０１０／０６７７８５号に記載される発酵工程に準じて実施することができる。

発酵工程により得られる化学品としては、上記微生物や培養細胞が培養液中に生産する物質であれば制限はなく、具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、ブタノール、１，３−プロパンジオール、２，３−ブタンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、核酸であれば、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、またカダベリンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。

（参考例１）単糖濃度の測定方法
各実施例、比較例において得られた糖液に含まれる単糖濃度（グルコース濃度、キシロース濃度）は、以下に示す条件でＨＰＬＣにより分析し、標品との比較により定量した。
カラム：Ｌｕｎａ ＮＨ_２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：超純水：アセトニトリル＝２５：７５（流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：３０℃。

（参考例２）発酵阻害物質の濃度の測定方法
糖液に含まれる発酵阻害物質のうち、フラン系発酵阻害物質（ＨＭＦ、フルフラール）及びフェノール系発酵阻害物質（クマル酸、フェルラ酸、２，３−ジヒドロベンゾフラン）の濃度は、以下に示す条件でＨＰＬＣにより分析し、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ＨｉｄｒｏＲＰ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：アセトニトリル−０．１重量％Ｈ_３ＰＯ_４（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：ＵＶ（２８３ｎｍ）
温度：４０℃。

糖液に含まれる発酵阻害物質のうち、有機酸（酢酸、ギ酸）は、以下に示す条件でＨＰＬＣにより分析し、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−ＨとＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＣＲ１０１Ｈ（株式会社島津製作所製）の直列
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。

（参考例３）セルロース含有バイオマスの希硫酸処理・酵素処理による加水分解工程
セルロース含有バイオマスとして、稲藁を使用した。前記セルロース含有バイオマスを硫酸１％水溶液に浸し、１５０℃で３０分オートクレーブ処理（日東高圧製）した。処理後、固液分離を行い、硫酸水溶液と硫酸処理セルロースに分離した。次に硫酸処理セルロースと固形分濃度が１０重量％となるように希硫酸処理液と攪拌混合した後、水酸化ナトリウムによって、ｐＨを５付近に調整した。この混合液に、糖化酵素としてトリコデルマ・リーセイ由来の糖化酵素である“アクセルレースデュエット”（ダニスコ・ジャパン株式会社製）を添加し、５０℃で１日間攪拌混同しながら、加水分解反応を行った。その後、遠心分離（３０００Ｇ）を行い、未分解セルロースあるいはリグニンを分離除去し、希硫酸処理糖水溶液を得た。さらに希硫酸処理糖水溶液に含まれる発酵阻害物質および単糖の組成はそれぞれ表１〜３の通りであった。

（参考例４）セルロース含有バイオマスの蒸煮爆砕処理・酵素処理による加水分解工程
セルロース含有バイオマスとして、稲藁を使用した。前記セルロース含有バイオマス１００ｇを２Ｌ蒸煮爆砕試験機（日本電熱株式会社製）に投入して蒸気を投入し、２．５ＭＰａで２．５分間保持して容器内を一気に大気開放し、爆砕処理を行いサンプルを回収した。この時の容器内の温度は２２５℃であった。この時の処理物の含水率は８４．４％であった。固形分濃度が１０重量％となるように水を加えｐＨを１規定の水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを５．０に調整し、糖化酵素として“アクセルレースデュエット”を添加して５０℃に保持し攪拌し１日反応させた。得られた糖水溶液の組成を表４〜６に示す。

（参考例５）セルロース含有バイオマスのアンモニア処理・酵素処理による加水分解工程
セルロース含有バイオマスとして、稲藁を使用した。前記セルロース含有バイオマスを小型反応器（耐圧硝子工業製、ＴＶＳ−Ｎ２ ３０ｍｌ）に投入し、液体窒素で冷却した。この反応器に濃度１００％のアンモニアガスを流入し、試料を完全に１００％の液体アンモニアに浸漬させた。リアクターの蓋を閉め、室温で１５分ほど放置した。次いで、１５０℃のオイルバス中にて１時間処理した。処理後、反応器をオイルバスから取り出し、ドラフト中で直ちに前記アンモニアガスをリーク後、さらに真空ポンプで反応器内を１０Ｐａまで真空引きし前記セルロース含有バイオマスを乾燥させた。この処理セルロース含有バイオマスと固形分濃度が１５重量％となるように純水を攪拌混合した後、硫酸によって、ｐＨを５付近に調整した。この混合液に、糖化酵素として“アクセルレースデュエット”を添加し、５０℃で３日間攪拌混同しながら、加水分解反応を行った。その後、遠心分離（３０００Ｇ）を行い、未分解セルロースあるいはリグニンを分離除去した糖水溶液を得た。さらに糖水溶液に含まれる発酵阻害物質および単糖の組成は表７〜９の通りであった。

（参考例６）セルロース含有バイオマスの水熱処理・酵素処理による加水分解工程
セルロース含有バイオマスとして、稲藁を使用した。前記セルロース含有バイオマスを水に浸し、撹拌しながら１８０℃で２０分間オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製）した。その際の圧力は１０ＭＰａであった。処理後は溶液成分と処理バイオマス成分に遠心分離（３０００Ｇ）を用いて固液分離した。溶液成分のｐＨは４．０であった。次に溶液成分を水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．０に調整し、糖化酵素として“アクセルレースデュエット”を添加し、５０℃で１日間攪拌混同しながら、加水分解反応を行って水熱処理液を得た。さらに水熱処理液に含まれる発酵阻害物質および単糖の組成は表１０〜１２の通りであった。

（参考例７）発酵の評価方法
酵母株（ピキア・スティピティス、ＮＢＲＣ１６８７）を用いて発酵試験を行った。グルコース濃度が２５ｇ／Ｌになるよう希釈した後、表１３の組成になるように添加物を加えて培地を調製し、フィルター滅菌（ミリポア、ステリカップ０．２２μｍ）したものを発酵に用いた。培養条件は、植菌量は０．５％で、２８℃条件下で１５０ｒｐｍでフラスコを振って７２時間培養した。発酵阻害性は酵母株のグルコースの消費速度で評価した。酵母株のグルコースの消費速度の評価方法としては、培養開始から１６、２４、４０、４８、６４、７２時間の時点で培地成分をクリーンベンチ内で滅菌状態で取り出し、その培地を遠心分離した後、フィルターをかけて参考例１記載のＨＰＬＣ分析によりグルコース濃度の定量を行った。

（実施例１）
参考例３記載の希硫酸処理糖水溶液を孔径０．０８μｍの精密ろ過膜を用いて濾過を行い、精密ろ過膜の透過液について限外濾過膜による濾過処理を行った。使用した限外濾過膜は、“ＮＴＲ−７４５０”（日東電工株式会社製、材質：スルホン化ポリエーテルスルホン、分画分子量：６００〜８００）、“ＮＴＲ−７４１０”（日東電工株式会社製、材質：スルホン化ポリエーテルスルホン、分画分子量：１，０００）、“ＳＰＥ１”（Ｓｙｎｄｅｒ製、材質：ポリエーテルスルホン、分画分子量：１，０００）、ＧＥオスモニクス製のＧＨシリーズ（材質：ポリエチレングリコール、分画分子量：１，０００）、 “ＧＲ９５Ｐｐ”（アルファラバル製、材質：ポリエーテルスルホン、分画分子量：２，０００）、ＧＥ製のＧＫシリーズ（材質：ポリエチレングリコール、材質：２，０００）を使用した。それぞれの膜について希硫酸糖化液の精密ろ過膜の透過液を１．５Ｌそれぞれ用意し、平膜濾過ユニット“ＳＥＰＡ−ＩＩ”（ＧＥオスモニクス製）を用いて、膜面線速度２０ｃｍ／秒、濾加圧３ＭＰａの条件下で非透過側から回収される液量が０．５Ｌになるまで濾過処理を行った。結果を表１４に示す。その結果、限外濾過膜処理で単糖は濃縮されるが、低分子性のギ酸、酢酸、ＨＭＦ、フルフラールが濃縮されないだけでなく、クマル酸、フェルラ酸、２，３−ジヒドロベンゾフランもほぼ濃縮されないことが判明した。また、限外濾過膜の非透過液側から回収される糖液の中からいくつかピックアップし（Ａ〜Ｃ）、参考例７の条件で発酵試験を行った。結果を図１に示す。

（比較例１）
実施例１と同様の濾過処理を実施例１よりも分画分子量の高い限外濾過膜である“ＳＰＥ３”（Ｓｙｎｄｅｒ製、材質：ポリエーテルスルホン、分画分子量：３，０００）、ナノ濾過膜である“ＵＴＣ−６０”（東レ株式会社製、材質：ピペラジンポリアミド）、ＨＬシリーズ（ＧＥオスモニクス製、材質：複合膜）、ＤＫシリーズ（ＧＥオスモニクス製、材質：複合膜）を用いて濾過試験を行った。結果を表１４に示す。分画分子量３，０００の限外濾過膜を用いた場合、極端に単糖の濃縮率が悪化することが判明した。また、ナノ濾過膜について濃縮を行ったところ、濃縮液の濃度に若干の差異はあるがクマル酸、フェルラ酸、２，３−ジヒドロベンゾフランは濃縮され、発酵試験（Ｄ）においても実施例１の限外濾過膜を用いた場合（Ａ〜Ｃ）と比べてグルコース消費速度が遅かった。

（実施例２）
参考例４記載の蒸煮爆砕処理糖水溶液の精密ろ過膜の透過液について実施例１と同様の濾過処理を実施した。結果を表１５に示す。さらに参考例７の方法で行った発酵結果（Ｅ〜Ｇ）を図２に示す。

（比較例２）
比較例１と同じ膜を使用して蒸煮爆砕処理糖化液の精密ろ過膜の透過液について濾過処理を行った。液組成の結果を表１５に、発酵試験の結果を図２に記載する。実施例１と比較例１の比較結果と同様、分画分子量３，０００の限外濾過膜を用いた場合、極端に単糖の濃縮率が悪化し、また、ナノ濾過膜を用いた場合、濃縮液の濃度に若干の差異はあるがクマル酸、フェルラ酸、２，３−ジヒドロベンゾフランは濃縮され、発酵試験（Ｈ）においても実施例２の限外濾過膜を用いた場合と比べてグルコース消費速度が遅かった。

（実施例３）
参考例５記載のアンモニア処理糖水溶液の精密ろ過膜の透過液について実施例１と同様の濃縮試験を実施した。結果を表１６に示す。

（比較例３）
比較例１と同じ膜を使用してアンモニア処理糖水溶液の精密ろ過膜の透過液の濾過処理を行った。液組成の結果を表１６に記載する。実施例１と比較例１の比較結果と同様、分画分子量３，０００の限外濾過膜を用いた場合、極端に単糖の濃縮率が悪化し、また、ナノ濾過膜を用いた場合、濃縮液の濃度に若干の差異はあるがクマル酸、フェルラ酸、２，３−ジヒドロベンゾフランは濃縮された。

（実施例４）
参考例６で調製した水熱処理糖水溶液を限外濾過膜“ＮＴＲ−７４５０”または“ＮＴＲ−７４１０”で濾過処理する前に、第二の限外濾過膜として、分画分子量：１０，０００の限外濾過膜（アプライドメンブレイン製、材質：ポリエーテルスルホン）を用いて濾過処理する場合としない場合を比較した。結果を表１７に示す。第二の限外濾過膜処理を実施した場合、“ＮＴＲ−７４５０”または“ＮＴＲ−７４１０”で限外濾過膜処理する際の膜透過流束（処理時間中で平均化した）が大幅に増加し、さらに非透過側の単糖の濃縮倍率が改善することが判明した。

（実施例５）
参考例６で調製した水熱処理糖水溶液の精密ろ過膜透過液１．５Ｌを限外濾過膜“ＮＴＲ−７４１０”（日東電工株式会社製、材質：スルホン化ポリエーテルスルホン、分画分子量：１，０００）にて実施例１と同様に濾過処理した際の非透過側の濃縮液（０．５Ｌ）および透過側の濾液（１．０Ｌ）の発酵阻害物質と単糖の組成を表１８に示す。そして、この濾液をナノ濾過膜“ＵＴＣ−６０”（東レ株式会社製、材質：ピペラジンポリアミド）で濾過処理して非透過側の濃縮液（０．３３Ｌ）の発酵阻害物質と単糖の組成を表１９に示す。この濃縮液を、表２０の組成になるよう、試薬を添加して調製し、参考例７と同等の発酵試験を行い、キシロース消費速度を測定した結果を図３に示す（図３のＪ参照。）。

（比較例４）
参考例６で調製した水熱処理糖水溶液の精密ろ過膜透過液１．５Ｌをナノ濾過膜“ＵＴＣ−６０”で濾過処理した非透過側の濃縮液０．７５Ｌの発酵阻害物質と単糖の組成を表１９に示す。これを実施例５と同様に表２０の組成になるよう試薬を添加して調製し、発酵試験に供した結果（キシロース消費速度）を図３に示す（図３のＪ参照。）。

実施例５で得られる糖液はクマル酸、フェルラ酸、２，３−ジヒドロベンゾフランの濃度が少し濃いが、キシロース消費速度において比較例４よりも発酵性が良いことが判明した。これは、糖水溶液中には分画分子量が６００〜２，０００の限外濾過膜を透過しない未同定の発酵阻害物質が存在するためであると推定された。また、実施例５により、分画分子量が６００〜２，０００の限外濾過膜の非透過側の糖液だけでなく、透過側の濾液をナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過して非透過側から得られる第二の濃縮糖液も発酵性の良い糖液であることが判明した。

（参考例８）糖水溶液ｐＨによる発酵阻害物質除去性能の評価
参考例６記載の水熱処理液のｐＨを調整して、糖水溶液中の発酵阻害物質の限外濾過膜による透過率を比較・検討した。発酵阻害物質の透過率とは、各成分の濾液側の濃度を膜処理時の非透過側の濃度で割った値に１００をかけた値を割合（％）として示した。水熱処理液に希硫酸または水酸化ナトリウムを添加した後、沈殿が発生するため遠心処理さらに精密ろ過膜処理を行った後、平膜濾過ユニット“ＳＥＰＡ−ＩＩ”（ＧＥオスモニクス製）に限外濾過膜“ＮＴＲ−７４１０”（日東電工株式会社製、材質：スルホン化ポリエーテルスルホン、分画分子量：１，０００）をセットし、膜面線速度２０ｃｍ／秒、濾加圧２ＭＰａの条件下で濾過処理した。なお、濾液側の濃度は安定するのに時間がかかるため、２０分間濾液の液を原水側に戻し、２０分経過後の安定した濾液をサンプリングし、透過率を求めた結果、表２１のように、ｐＨを５以下に調整することによって、クマル酸、フェルラ酸の芳香族とカルボン酸の両方を有する発酵阻害物の除去性能が大幅に向上することを見出した。

（実施例６）
参考例３で得られた硫酸水溶液をｐＨ４．０になるようアンモニアで中和し精密ろ過膜処理した透過液１．５Ｌを限外濾過膜“ＮＴＲ−７４５０”（日東電工株式会社製、材質：スルホン化ポリエーテルスルホン、分画分子量：６００〜８００）にて実施例１と同様に濾過処理した際の非透過側の濃縮液（０．５Ｌ）および透過側の濾液（１．０Ｌ）の発酵阻害物質と単糖の組成を表２２に示す。そして、この濾液をナノ濾過膜“ＵＴＣ−６０”（東レ株式会社製、材質：ピペラジンポリアミド）で濾過処理して非透過側の濃縮液（０．３３Ｌ）の発酵阻害物質と単糖の組成を表２３に示す。この濃縮液を、表２４の組成になるようになるよう、試薬を添加して調製し、参考例７と同等の発酵試験を行い、キシロース消費速度を測定した結果を図４に示す（図４のＬ参照。）。

（比較例５）
参考例３で得られた硫酸水溶液をｐＨ４．０になるようアンモニアで中和し精密ろ過膜処理した透過液１．５Ｌをナノ濾過膜“ＵＴＣ−６０”で濾過処理した非透過側の濃縮液０．７５Ｌの発酵阻害物質と単糖の組成を表２２に示す。これを実施例６と同様に表２４の組成になるよう試薬を添加して調製し、発酵試験に供した結果（キシロース消費速度）を図４に示す（図４のＫ参照。）。

実施例６で得られる糖液はクマル酸、フェルラ酸、２，３−ジヒドロベンゾフランの濃度が少し濃いが、キシロース消費速度において比較例５よりも発酵性が良いことが判明した。これは、糖水溶液中には分画分子量が６００〜２，０００の限外濾過膜を透過しない未同定の発酵阻害物質が存在するためであると推定された。また、実施例６により、分画分子量が６００〜２，０００の限外濾過膜の非透過側の糖液だけでなく、透過側の濾液をナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過して非透過側から得られる第二の濃縮糖液も発酵性の良い糖液であることが判明した。

本発明によって、セルロース含有バイオマスに由来する糖水溶液から発酵阻害物質を効率的に除去することが可能であり、一方でグルコース、キシロースなどの単糖を含む精製糖液を高純度・高収率で製造することができるため、該精製糖液を発酵原料とした場合、種々の化学品の発酵生産の効率を向上させることができる。

Ａ 希硫酸処理糖水溶液を限外濾過膜“ＮＴＲ−７４５０”で濾過処理して得られた糖液
Ｂ 希硫酸処理糖水溶液を限外濾過膜“ＳＰＥ１”で濾過処理して得られた糖液
Ｃ 希硫酸処理糖水溶液を限外濾過膜“ＧＲ９５Ｐｐ”で濾過処理して得られた糖液
Ｄ 希硫酸処理糖水溶液をナノ濾過膜“ＵＴＣ−６０”で濾過処理して得られた糖液
Ｅ 蒸煮爆砕処理糖水溶液を限外濾過膜“ＮＴＲ−７４５０”で濾過処理して得られた糖液
Ｆ 蒸煮爆砕処理糖水溶液を限外濾過膜“ＳＰＥ１”で濾過処理して得られた糖液
Ｇ 蒸煮爆砕処理糖水溶液を限外濾過膜“ＧＲ９５Ｐｐ”で濾過処理して得られた糖液
Ｈ 蒸煮爆砕処理糖水溶液をナノ濾過膜“ＵＴＣ−６０”で濾過処理して得られた糖液
Ｉ 水熱処理糖水溶液をナノ濾過膜“ＵＴＣ−６０”で濾過処理して得られた濃縮糖液
Ｊ 水熱処理糖水溶液を限外濾過膜“ＮＴＲ−７４１０”で濾過処理して得られた透過液をナノ濾過膜“ＵＴＣ−６０”で濾過処理して得られた濃縮糖液
Ｋ 硫酸水溶液をナノ濾過膜“ＵＴＣ−６０”で濾過処理して得られた濃縮糖液
Ｌ 硫酸水溶液を限外濾過膜“ＮＴＲ−７４５０”で濾過処理して得られた透過液をナノ濾過膜“ＵＴＣ−６０”で濾過処理して得られた濃縮糖液

Claims (6)

1. セルロース含有バイオマスを原料として糖液を製造する方法であって、
   工程（１）：セルロース含有バイオマスを加水分解し、糖水溶液を製造する工程、
   工程（２）：工程（１）で得られた糖水溶液を分画分子量６００〜２，０００の限外濾過膜を通じて濾過して、透過側に発酵阻害物質を除去し非透過側から糖液を回収する工程、
   を含むことを特徴とする、糖液の製造方法。
2. 前記発酵阻害物質がクマル酸、フェルラ酸および２，３−ジヒドロベンゾフランからなる群から選択される一種または２種以上を含むことを特徴とする、請求項１記載の糖液の製造方法。
3. 前記工程（２）において、糖水溶液をｐＨ５以下に調整して濾過することを特徴とする、請求項１または２記載の糖液の製造方法。
4. 前記工程（２）で使用する限外濾過膜の機能層の材質がポリエーテルスルホンであることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の糖液の製造方法。
5. 工程（２）で得られた糖液および／または発酵阻害物質を含む透過液をナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過して、非透過側から濃縮糖液を回収する工程を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の糖液の製造方法。
6. 請求項１から５のいずれかに記載の糖液の製造方法によって得られた糖液を発酵原料として使用することを特徴とする、化学品の製造方法。

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