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JP6007420B2 - 親和性成熟に基づく抗体最適化方法 - Google Patents

親和性成熟に基づく抗体最適化方法 Download PDF

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JP6007420B2 JP2012537994A JP2012537994A JP6007420B2 JP 6007420 B2 JP6007420 B2 JP 6007420B2 JP 2012537994 A JP2012537994 A JP 2012537994A JP 2012537994 A JP2012537994 A JP 2012537994A JP 6007420 B2 JP6007420 B2 JP 6007420B2
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Description

関連出願
２００９年１１月４日出願の「親和性成熟に基づく抗体最適化方法」の名称の米国特許仮出願第６１／２８０、６１８号、および２０１２年５月１３日出願の「親和性成熟に基づく抗体最適化、抗体変換方法および抗体」の名称の米国特許仮出願第６１／３９５、６７０号の優先権の利益を主張する。認められる場合は、上述の出願内容は、参照によってその全体が組み込まれる。
本出願は、また、２００９年１１月４日出願の「コンビナトリアル抗体ライブラリーおよびその使用」の名称の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６３２９９号に関連し、この特許は、２００８年１１月７日出願の米国特許仮出願第６１／１９８、７６４号、および２００９年３月２５日出願の米国特許仮出願第６１／２１１、２０４号（それぞれの名称：「コンビナトリアル抗体ライブラリーおよびその使用」）の優先権を主張している。さらに、この出願は、「抗ＤＬＬ４抗体およびその使用」の名称の国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３３０３号に関連し、この特許もまた、米国特許仮出願第６１／１９８、７６４号および６１／２１１、２０４号のそれぞれの優先権を主張している。
上記出願のそれぞれの内容は参照によってその全体が組み込まれる。
コンパクトディスクで提供される配列リストの参照による組み込み
電子バージョンの配列リストが添付されており、その内容は、参照によってその全体が組み込まれる。電子ファイルは２．６６メガバイトのサイズで、ファイル名は７０２ｓｅｑＰＣ１．ｔｘｔである。
発明の分野
本明細書では、抗体の構造／親和性または活性の関連性に基づいて、抗体またはその一部の活性を進展させる親和性成熟の合理的方法が提供される。得られた親和性成熟抗体は、標的抗原に対し改善された、または最適化された結合親和性を示す。
背景
多くの治療および診断用モノクローナル抗体（ＭＡｂ）が臨床現場で使用され、ヒト疾患、例えば、癌および自己免疫疾患、の治療および診断が行われている。例えば、代表的治療用抗体には、リツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、アバスチン（ベバシズマブ）およびレミケード（インフリキシマブ）が挙げられる。抗体治療薬を設計する場合には、抗体、例えば、標的の機能活性を調節する抗体、および／または、例えば、より高い特異性および／または、親和性を有するように改良された抗体および／または、特定の細胞または組織環境中で生体利用可能性がより高い、またはより安定な、またはより可溶性の大きい抗体、を作り出すことが望ましい。抗体の結合親和性の最適化および改良方法ならびに所望の親和性を有する抗体を選択する方法の提供も本明細書の目的に含まれる。
要約
本明細書では、構造／活性関連性（ＳＡＲ）に基づく抗体またはその断片の親和性成熟方法が提供される。この方法は、親和性成熟前の出発抗体に比べて、標的抗原に対する活性（例えば、結合特異性または親和性）が高められ、改良された最適化抗体をもたらす。
本明細書では、標的抗原に対する１次抗体またはその一部の親和性成熟方法を提供する。この方法では、関連抗体またはその一部が、対応する型の１次抗体よりも標的抗原に対する活性の低下を示すことが特定され、この関連抗体またはその一部は、関連可変重鎖または関連可変軽鎖を含み、１）対応する関連抗体の可変重鎖または可変軽鎖が、１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖に対し少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を示すが、１００％の配列同一性を示さない抗体であるか；または２）関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同等であり、および／または少なくとも１つの関連抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子のＶκおよびＪκまたは少なくとも１つのＶλおよびＪλ生殖系列セグメントが、１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶκおよびＪκまたはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントに同等である抗体かのいずれかである。さらに、この方法では、１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列が、対応する関連抗体の可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と比較される。比較後、１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖内の標的領域が特定され、それにより、標的領域が、関連抗体の同じ領域に比べて、少なくとも１つのアミノ酸差異を示す１次抗体中の領域であることが特定される。標的領域の特定後、それぞれ可変重鎖および可変軽鎖を含む複数の改変抗体またはその一部が産生され、単一アミノ酸残基の置換を、例えば、各複数抗体の標的領域が１次抗体と比較して別のアミノ酸への置換を含むように行い、標的領域中の少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖が改変される。得られた複数の変異抗体は、標的抗原に対する活性により選別される。改変抗体は、１次抗体に比べ標的抗原に対する活性増加を示す。この方法の一例では、１次抗体の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を作ることにより複数の改変抗体が産生され、核酸分子が、標的領域中に未改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、複数のそれぞれの核酸分子が、標的領域中で単一アミノ酸残基の置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする。
本明細書で提供される方法では、１次抗体の標的領域は、対応する関連抗体中の領域に比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸差異を示す。さらに、この方法では、１次抗体は、１、２、３、４、または５つの関連抗体と比較できる。本明細書の方法では、標的領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４から選択される。例えば、標的領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３である。
本明細書で提供される方法では、評価される活性は、結合、シグナル伝達、分化、遺伝子発現の変化、細胞増殖、アポトーシス、走化性、細胞障害性、癌細胞浸潤、内皮細胞増殖または管形成であってもよい。一例では、活性は、結合であり、結合は、イムノアッセイ、全細胞パニングまたは表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により評価される。例えば、結合は、イムノアッセイにより、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または電気化学発光測定法により評価可能である。特に、結合は、電気化学発光測定、例えば、メソ・スケール・ディスカバリーで評価される。
本明細書の方法では、抗体がＦａｂ型の場合は、親和性成熟１次抗体は、正確にまたは約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍまたは１０−８Ｍ未満の結合親和性で、標的抗原に対し結合を行う。
一例では、本明細書で提供される親和性成熟方法は、関連抗体またはその一部との比較を含み、対応する１次抗体型に比較して８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または５％未満の活性を示す。例えば、関連抗体は、陰性対照に比較して、標的抗原に対し同じまたは類似のレベルの活性を示してもよい。別の例では、関連抗体は、１次抗体の結合親和性未満の結合親和性を示し、この場合の結合親和性は、そのＦａｂ型で正確にまたは約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍまたは１０−８Ｍ未満である。
本明細書で提供される方法の一例では、標的領域は、１次抗体の可変重鎖内で特定され、この方法はそこから行われる。本明細書で提供される方法の別の例では、標的領域は、１次抗体の可変軽鎖内で特定され、この方法はそこから行われる。本明細書の方法のさらなる例では、標的領域は、１次抗体の可変重鎖内で特定され、この方法のステップはそこから行われる；また、別々に、独立に標的領域が１次抗体の可変軽鎖内で特定され、この方法はそこから行われる。
本明細書の方法の一態様では、対応する関連可変重鎖を含む関連抗体は、対応する関連可変軽鎖を含む関連抗体とは異なる。本明細書の方法の別の態様では、対応する関連可変重鎖を含む関連抗体は、対応する関連可変軽鎖を含む関連抗体と同じである。
本明細書の方法の一例では、１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖は、関連抗体の対応する関連可変重鎖または可変軽鎖と、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示す。特に、１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖は、関連抗体の対応する関連可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも９５％の配列同一性を示す。
別の例では、関連抗体は、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、１つの関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子のＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同等であり；および／または１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶκおよびＪκまたは少なくとも１つのＶλおよびＪλ生殖系列セグメントが、関連抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶκおよびＪκまたはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントと同等である関連可変重鎖または可変軽鎖を含む抗体である。例えば、関連抗体は、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同じ遺伝子ファミリー由来であり；および／または少なくとも１つのＶκおよびＪκまたは１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶλおよびＪλ生殖系列セグメントが、関連抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶκおよびＪκまたはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントと同じ遺伝子ファミリー由来である関連可変重鎖または可変軽鎖を含む抗体である。このような例では、１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖は、対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示す。
本明細書の方法では、１次抗体は、コンビナトリアル抗体ライブラリーの選別により特定され、コンビナトリアル抗体ライブラリーは、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨヒト生殖系列セグメントまたはそのインフレームの一部を組み合わせ、ＶＨ鎖またはその一部をコードする核酸分子の配列を生成し；さらにＶκおよびＪκヒト生殖系列セグメントまたはそのインフレームの一部、もしくはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントまたはその一部を組み合わせ、ＶＬ鎖またはその一部をコードする核酸分子の配列を生成することにより作られる。組み合わせのステップでは、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、Ｊκ、ＶλまたはＪλのそれぞれの部分は、抗原結合部位を形成するのに充分なＶＨもしくはＶＬまたはその一部を含む抗体またはその一部を作るのに充分である。組み合わせのステップは、複数の異なる核酸分子の配列を生成するために複数回繰り返される。核酸分子が合成され、２つのライブラリーが作られる。第一のライブラリーは、ＶＨ鎖またはその一部をコードする核酸分子を含み；さらに第２のライブラリーは、ＶＬ鎖またはその一部をコードする核酸分子を含む。第１および第２ライブラリー由来の核酸分子が細胞に導入され、これを複数回繰り返し、細胞ライブラリーを産生し、この中の各細胞は、細胞ライブラリー由来の他のあらゆる細胞とのＶＨおよびＶＬの異なる組み合わせをコードする核酸分子を含む。最後に、コンビナトリアルライブラリーを生成する方法で、細胞が成長し、各細胞中で抗体またはその一部が発現し、それにより複数の抗体またはその一部を産生し、ライブラリー中の各抗体またはその一部が、ライブラリー中の全ての他の抗体またはその一部との種々の組み合わせの抗原結合部位を形成するのに充分なＶＨもしくはＶＬ鎖またはその一部を含む。１次抗体を特定するために、ライブラリーは、選別されるライブラリー中の抗体またはその一部を標的タンパク質と接触させ、抗体またはその一部と標的タンパク質の結合、および／または抗体またはその一部が標的タンパク質の機能活性を調節するかどうかを評価することにより選別され；さらに標的タンパク質に対する活性を示す抗体またはその一部を特定する。ここで特定された抗体またはその一部が１次抗体である。同様に、関連抗体もまた、このようなコンビナトリアル抗体ライブラリーを標的抗原に対し選別し、１次抗体に比べて標的抗原に対し低い活性を示す関連抗体を特定する。
選別されたコンビナトリアルライブラリーは、アドレス指定できるライブラリーであってもよい。アドレス指定できるライブラリーでは、合成核酸配列は、別々にアドレス指定され、それによって第１のアドレス指定核酸ライブラリーおよび第２のアドレス指定核酸ライブラリーを生成する。また、細胞も、各位置が、アドレス指定細胞ライブラリー中のあらゆる他の細胞とは異なるＶＨおよびＶＬの組み合わせをコードする核酸分子を含む細胞を含有するようにアドレス指定される。最終的に、複数の抗体またはその一部が、アドレス指定され、ライブラリー中の各位置の抗体またはその一部が同じ抗体であり、また、それぞれの位置および他のあらゆる位置の抗体またはその一部とは異なり；さらに抗体またはその一部の同一性は、そのアドレスにより知ることができる。アドレス指定できるライブラリーは、空間アレイで配列可能で、アレイの各個別位置は、異なる抗体メンバーに対応する。空間アレイは、マルチウェルプレートであってもよい。別の例では、アドレス指定できるライブラリー中の抗体は、フィルター、チップ、スライド、ビーズまたはセルロースの固体支持体に付着させることが可能で、異なる抗体メンバーがそれらの表面に固定化される。
本明細書の親和性成熟方法では、標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸または小分子である。標的抗原は、ウイルス、細菌、腫瘍もしくは他の細胞表面上に発現していてもよく、あるいは組換え型タンパク質またはペプチドであってもよい。一例では、標的抗原は、治療介入の標的であるたんぱく質である。例えば、標的抗原は、細胞増殖および分化、細胞遊走、アポトーシスまたは血管新生に関与する。代表的な標的抗原には、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞増殖因子受容体１、２、および３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体；ＨＧＦＲとしても知られる）、ＤＬＬ４、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体）、ＫＩＴ（ｃ−Ｋｉｔ受容体）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４（繊維芽細胞増殖因子受容体１、２、および４）、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ；マクロファージ刺激１受容体としても知られる）、ＴＥＫ（内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ）、ＴＩＥ（内皮細胞に存在する受容体型チロシンキナーゼ）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１（エリトロポイエチン産生肝細胞受容体Ａ１、Ａ２およびＢ１）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＮＯＴＣＨ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ、ＥＰＯ−Ｒ．、カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５２、ＣＤ４４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、リンホトキシン（ＬＴ）、ＩｇＥ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦならびにＥＰＯ、が挙げられる（これらに限定されない）。
本明細書で提供される親和性成熟方法では、サブセットの標的領域のアミノ酸残基がアミノ酸置換により改変される。一連では、標的領域の１次抗体および関連抗体の間の異なるアミノ酸残基のみがアミノ酸置換により改変される。別の例では、標的領域の１次抗体および関連抗体の間の同じアミノ酸残基のみがアミノ酸置換により改変される。本明細書で提供される方法の一例では、標的領域中の全てのアミノ酸残基がアミノ酸置換により改変される。改変されるアミノ酸に対して、アミノ酸置換は、他の全ての１９個のアミノ酸への置換であってもよく、あるいは制限されたそのサブセットへの置換であってもよい。
本明細書で提供される方法では、その抗体は、ＰＣＲ変異誘発、カセット変異導入、部位特異的変異誘発、ランダム点変異誘発、ウラシル含有テンプレートを使った変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを使った変異誘発、ポイントミスマッチ修復（ｐｏｉｎｔ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ）、修復欠損宿主株を使った変異誘発、制限選択（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）および制限精製（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、ならびに二重鎖切断修復によって変異導入される。抗体は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＮ、ＮＮＹまたはＮＮＲ変異誘発により変異導入してもよい。
本方法の一態様では、標的領域の系統的変異導入を行い、変異導入すべきアミノ酸残基をさらに解明する。このような方法では、可変重鎖および可変軽鎖またはその一部を含む複数の改変抗体を産生することにより、１次抗体に対して系統的変異導入を行う。この場合、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖が、標的領域内の単一アミノ酸残基の別のアミノ酸残基での置換により改変されており、それにより、複数の抗体のそれぞれが１次抗体と比較して、標的領域内のアミノ酸置換を含む。複数の改変抗体のそれぞれは、標的抗原に対する活性により選別される。２次抗体は、アミノ酸置換を含まない１次抗体に比較して、標的抗原に対して活性保持または活性増加を示す改変抗体の中から選択され、この結果、本明細書で上述の親和性成熟法において、２次抗体が１次抗体の代わりに使用される。このような例では、標的領域含有１次抗体の改変型可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を作ることにより、複数の改変抗体を産生可能である。この場合、核酸分子は、中性アミノ酸をコードしない未改変可変重鎖または可変軽鎖の対応するコドンに比べて、標的領域のアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、各複数の核酸分子が標的領域内の単一アミノ酸残基の中性アミノ酸残基への置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする。
さらに、標的領域で系統的変異導入が行われる方法では、対応する型の１次抗体の活性の少なくともまたは約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％もしくはそれ以上の活性を示す２次抗体が選択される。活性保持または活性増加を示す抗体の選択後、アミノ酸置換を含まない１次抗体に比べて、スキャンされた酸を含む２次抗体中で改変されているアミノ酸残基位置を特定できる。
本明細書の系統的変異導入を用いる親和性成熟法の例では、スキャンアミノ酸は、アラニン、トレオニン、プロリンまたはグリシンであってもよい。例えば、スキャンアミノ酸は、アラニンである。また、スキャンアミノ酸は、非天然のアミノ酸であってもよい。
さらに、本明細書の方法の系統的変異導入を行う場合、標的領域のアミノ酸残基サブセットが、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される。一例では、１次抗体および関連抗体の間で、標的領域内の異なるアミノ酸残基のみが、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される。別の例では、１次抗体および関連抗体の間で、標的領域内の同じアミノ酸残基のみが、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される。さらなる例では、標的領域の全アミノ酸が、中性アミノ酸へのアミノ酸置換により改変される。
本明細書の親和性成熟法では、選択改変抗体は、１次抗体に比較して、２倍、５倍、１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、１００００倍またはそれを超える標的抗原に対する活性の改善を示す。例えば、改変抗体は、１次抗体の結合親和性より大きな結合親和性を示し、正確にまたは約１ｘ１０−９Ｍ、２ｘ１０−９Ｍ、３ｘ１０−９Ｍ、４ｘ１０−９Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、６ｘ１０−９Ｍ、７ｘ１０−９Ｍ、８ｘ１０−９Ｍ、９ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、２ｘ１０−１０Ｍ、３ｘ１０−１０Ｍ、４ｘ１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、６ｘ１０−１０Ｍ、７ｘ１０−１０Ｍ、８ｘ１０−１０Ｍ、９ｘ１０−１０Ｍもしくはそれ未満の結合親和性である。
本明細書の方法では、アミノ酸置換を含まない１次抗体に比べて改変抗体中で変えられたアミノ酸改変を特定可能である。さらに、本明細書で提供される親和性成熟法は、改変抗体が選択され、その後に続くその抗体の親和性成熟のための最初の抗体として使用される場合は、反復繰り返し可能である。さらに、本明細書の方法では、選択改変抗体の標的領域内の１つまたは複数の可変重鎖または１つまたは複数の可変軽鎖中の１つまたは複数のアミノ酸置換が組み合わされてさらなる改変抗体を生成し、それにより、さらなる改変抗体が標的抗原に対する活性で選別され、１次抗体および選択改変抗体に比べて標的抗原に対する活性増加を示すさらなる改変抗体が特定される。
本明細書の親和性成熟法では、この方法を、１次抗体の可変重鎖に対して実行し、それぞれの標的領域にアミノ酸置換を含む１次改変抗体が選択できる。次に、独立に、別々に、この方法を１次抗体の可変軽鎖に対し実行し、それぞれの標的領域にアミノ酸置換を含む２次改変抗体が選択できる。１次改変抗体の可変重鎖が２次改変抗体の可変軽鎖と組み合わされて、それぞれの可変重鎖および可変軽鎖の標的領域のアミノ酸置換を含む複数の異なる３次改変抗体を生成できる。このような３次抗体は、標的抗原に対する活性により選別可能で、１次および２次改変抗体に比べ標的抗原に対し活性増加を示すさらなる改変抗体が選択可能である。
さらに、いずれかの本明細書の方法で、抗体の他の領域を最適化可能である。例えば、改変抗体を選択後、１次改変抗体の可変重鎖または可変軽鎖内の別の異なる領域を、さらなる変異誘発のために選択可能である。このような例では、改変型の１次改変抗体の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生可能であり、この場合、核酸分子は、選択領域中に１次改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、各複数の核酸分子が、選択領域中で単一アミノ酸残基の置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする。次に、複数のそれぞれ可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含むさらなる改変抗体が産生され、この場合、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖が改変され、それにより、それぞれの複数の抗体の選択領域が、１次改変抗体に比較して異なるアミノ酸へのアミノ酸置換を含む。さらなる改変抗体が標的抗原に対する活性により選別され、１次改変抗体に比べ、標的抗原に対する活性増加を示すさらなる改変抗体が選択される。このような例では、改変される異なる領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４であってもよい。
いずれかの本明細書の親和性成熟法において、いずれの抗体も、抗体またはその一部を含んでもよい。このような抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、ｓｃＦｖ断片、ならびにｓｃＦａｂ断片であってもよい。
本明細書では、系統的変異導入に基づく親和性成熟の方法が提供される。この方法では、改変型の１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することにより１次抗体の系統的変異導入を行い、この場合、核酸分子は、他のアミノ酸をコードしない未改変可変重鎖または可変軽鎖の対応するコドンに比べ、別のアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、各複数の核酸分子が単一アミノ酸残基の別のアミノ酸への置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖がコードされて、コード化可変重鎖または軽鎖の全長にわたる全位置が置換され、またはコード化可変重鎖または可変軽鎖の選択領域の全位置が置換され、それにより、各置換が同じアミノ酸残基に対して行われる。次に、それぞれ可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数の改変抗体が産生され、それにより、それぞれの複数の抗体が、１次抗体に比べ、アミノ酸位置の別のアミノ酸による置換を含む。複数の改変抗体が標的抗原の活性に対し選別される。２次抗体は、アミノ酸置換を含まない１次抗体に比べ、標的抗原に対して活性保持または活性増加を示す改変抗体から選択される。改変型の２次抗体の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することにより２次抗体のさらなる変異誘発を行う。ここで、核酸分子は、スキャンアミノ酸位置に、２次抗体のスキャンアミノ酸とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、各複数の核酸分子は、スキャンアミノ酸位置で単一アミノ酸残基により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする。可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数のさらなる改変抗体が産生され、それにより、スキャンアミノ酸位置が、２次抗体に比べ異なるアミノ酸への置換を含む。さらなる改変抗体が標的抗原に対する活性により選別される。さらなる改変抗体の中から、１次抗体または２次抗体に比較して、標的抗原に対し活性増加を示す３次抗体が選択される。
本明細書で提供されるスキャンニング親和性成熟方法（ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）の一例では、可変重鎖または可変軽鎖をコードする領域の全ての位置が置換される。選択領域は、選択された可変重鎖または可変軽鎖中の相補性決定領域：ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３であってもよい。
本明細書の方法では、１次抗体に比べ、結合維持または結合強化を示すスキャンニング変異を含む２次抗体が選択される。一般的に、選択された２次抗体は、対応する型の１次抗体の活性の少なくともまたは約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％またはそれを超える活性を示す。
本明細書で提供される親和性成熟方法では、アミノ酸置換を含まない１次抗体に比べて、スキャンアミノ酸を含むように改変されている２次抗体のアミノ酸残基位置を特定できる。
本明細書で提供されるスキャンニング親和性成熟法では、スキャンニングアミノ酸残基は、アラニン、トレオニン、プロリンおよびグリシンであってもよい。例えば、アミノ酸はアラニンである。他の例では、スキャンニングアミノ酸は非天然アミノ酸である。本明細書の方法では、それぞれの複数の核酸分子は、単一のアミノ酸残基の同じスキャンアミノ酸への置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする。この方法では、スキャンアミノ酸位置は、全ての他のアミノ酸残基への、または制限されたそのサブセットへのアミノ酸置換により改変される。
本明細書で提供されるスキャンニング親和性成熟法では、２次抗体が選択されるとすぐに、さらなる抗体の改変が実行される。この方法では、改変は、１次抗体のその位置のスキャンアミノ酸または元のアミノ酸へのアミノ酸置換は含まない。２次抗体のさらなる改変は、ＰＣＲ変異誘発、カセット変異導入、部位特異的変異誘発、ランダム点変異誘発、ウラシル含有テンプレートを使った変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、ホスホロチオエート修正ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを使った変異誘発、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使った変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、ならびに二重鎖切断修復による方法で導入することができる。一例では、さらなる変異は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＮ、ＮＮＹまたはＮＮＲ変異誘発により形成する。
本明細書で提供されるスキャンニング親和性成熟法では、評価される活性は、結合、シグナル伝達、分化、遺伝子発現の変化、細胞増殖、アポトーシス、走化性、細胞障害性、癌細胞浸潤、内皮細胞増殖および管形成である。例えば、活性が結合である場合、結合は、イムノアッセイ、全細胞パニングおよび表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により評価される。イムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または電気化学発光測定法であってもよい。例えば、電気化学発光測定法は、メソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）であってもよい。
本明細書で提供されるスキャンニング親和性成熟法では、標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸または小分子である。標的抗原は、ウイルス、細菌、腫瘍または他の細胞の表面に発現していてもよく、または、組換え型タンパク質もしくはペプチドである。標的抗原は、治療介入のための標的タンパク質であってもよい。例えば、標的抗原は、細胞増殖および分化、細胞遊走、アポトーシスまたは血管新生に関与する。代表的標的抗原には、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞増殖因子受容体１、２、および３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体；ＨＧＦＲとしても知られる）、ＤＬＬ４、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体）、ＫＩＴ（ｃ−ｋｉｔ用受容体）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４（繊維芽細胞増殖因子受容体１、２、および４）、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ；マクロファージ刺激１受容体としても知られる）、ＴＥＫ（内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ）、ＴＩＥ（内皮細胞に存在する受容体型チロシンキナーゼ）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１（エリトロポイエチン産生肝細胞受容体Ａ１、Ａ２およびＢ１）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＮＯＴＣＨ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ、ＥＰＯ−Ｒ．、カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５２、ＣＤ４４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、リンホトキシン（ＬＴ）、ＩｇＥ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦならびにＥＰＯ、が挙げられる。
本明細書のスキャンニング方法では、３次抗体は、１次抗体または２次抗体に比較して、２倍、５倍、１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、１００００倍またはそれを超える標的抗原に対する活性を示す。例えば、抗体がＦａｂ型である場合、１次抗体は、正確にまたは約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、もしくは、それ未満の結合親和性で標的抗原に結合する。さらに最適化された抗体、例えば、選択された３次抗体、は１次抗体に比べ改善された結合親和性を有するように最適化されている。例えば、３次抗体は、１次抗体の結合親和性より大きな結合親和性を示し、正確にまたは約１ｘ１０−９Ｍ、２ｘ１０−９Ｍ、３ｘ１０−９Ｍ、４ｘ１０−９Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、６ｘ１０−９Ｍ、７ｘ１０−９Ｍ、８ｘ１０−９Ｍ、９ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、２ｘ１０−１０Ｍ、３ｘ１０−１０Ｍ、４ｘ１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、６ｘ１０−１０Ｍ、７ｘ１０−１０Ｍ、８ｘ１０−１０Ｍ、９ｘ１０−１０Ｍもしくはそれ未満の結合親和性である。
本方法の一態様では、系統的変異導入を１次抗体の可変重鎖内で行い、そこから本方法を進める。別の態様では、系統的変異導入を１次抗体の可変軽鎖内で行い、そこから本方法のステップを進める。さらなる本方法の態様では、系統的変異導入を１次抗体の可変重鎖内で行い、そこから本方法のステップを進め；さらに別々に、独立に系統的変異導入を１次抗体の可変軽鎖内で行い、行い、そこから本方法のステップを進める。
本明細書の方法では、さらなる最適化を成し遂げることができる。その方法には、アミノ酸置換を含まない１次抗体に比べ、３次抗体中で変えられているアミノ酸改変の特定を含んでもよい。組み合わせ変異体を生成させることも可能である。また、本明細書の方法では、反復繰り返しする方法が提供され、この場合、その中で特定された３次抗体が選択されて、その後に続くそれの成熟用の１次抗体として使用され、それにより、改変されたアミノ酸残基はそれ以降のこの方法の繰り返しではさらに改変されない。別の最適化例では、選択３次抗体の１つまたは複数の可変重鎖または１つまたは複数の可変軽鎖中の１つまたは複数のアミノ酸置換が組み合わされて、さらなる改変抗体を生成し、それにより、さらなる改変抗体が標的抗原の活性に対し選別され、１次抗体、２次抗体および選択３次抗体に比較して、標的抗原に対する活性増加を示すさらなる改変抗体を特定する。例えば、この方法のステップを、１次抗体の可変重鎖に対して行い、対応する１次抗体の可変重鎖に比較して可変重鎖中のアミノ酸置換をそれぞれ含む３次抗体を選択可能である。独立に、別々に、この方法のステップを１次抗体の可変軽鎖に対して行い、対応する１次抗体の可変軽鎖に比較して可変軽鎖のアミノ酸置換をそれぞれ含む別の３次抗体が選択される。３次抗体の可変重鎖が別の３次抗体の可変軽鎖と組み合わされて、１次抗体の可変重鎖および可変軽鎖に比較して、可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸置換をそれぞれ含む異なる複数のさらなる改変抗体を生成可能である。さらなる改変抗体は、標的抗原に対する活性（例えば、結合）により選別可能であり；１次抗体、２次抗体、および３次抗体に比較して、標的抗原に対する活性増加を示す４次抗体が選択される。
別の例では、３次抗体の選択後、３次抗体の可変重鎖または可変軽鎖内の別の異なる領域がさらなる変異誘発のために選択される。このような方法では、３次抗体の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子が産生され、この場合、核酸分子が、選択領域中に、１次改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、各複数の核酸分子が単一のアミノ酸残基の置換により選択領域中で改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする。次に、可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部をそれぞれ含む複数のさらなる改変抗体が産生され、それにより、それぞれの複数の抗体中の選択領域が、３次抗体に比較してアミノ酸の異なるアミノ酸への置換を含む。さらなる改変抗体が標的抗原に対する活性（例えば、結合）により選別されて、３次抗体に比較して、標的抗原に対する活性増加を示すさらなる改変抗体が選択される。このような例では、さらなる変異誘発の対象となる異なる領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４、であってよい。
本明細書のいずれかの方法で、抗体は、可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む抗体またはその断片であってもよい。例えば、抗体は、完全長抗体またはその断片：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、ｓｃＦｖ断片、およびｓｃＦａｂ断片、であってもよい。
また、本明細書では、抗体変換の方法が提供され、それにより、既知の活性を有する１次または参照抗体の変異誘発の後に、同じ標的抗原に対する１次または参照抗体の活性に比較して、変えられているか、または変換されている活性を示す抗体が選択される。この方法の一例では、抗体の活性がアンタゴニストから活性化因子に変換される。この方法では、アンタゴニスト抗体である１次抗体またはその断片が選択され、それにより、抗体は、その標的抗原に関連する機能活性を阻害する。抗原に結合するのに充分な可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部をそれぞれ含む複数の改変抗体が産生され、この場合、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖が改変され、１次抗体に比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。例えば、アミノ酸改変は、少なくとも単一のアミノ酸残基の置換であり、それにより、複数の抗体のそれぞれが、１次抗体に比較して異なるアミノ酸へのアミノ酸の置換を含む。この方法の一例では、改変型の１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を生成することにより複数の改変抗体が産生され、この場合、核酸分子は、未改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードする少なくとも１つのコドンを含み、これにより、複数の核酸分子のそれぞれが単一アミノ酸残基の置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする。変異誘発の後で、複数の改変抗体が標的抗原に対する活性によりそれぞれ選別される。１次抗体の存在下の活性に比較して、標的抗原に関連する機能活性の増加を生じ、それにより、１次抗体を活性化因子に変換する抗体が選択または特定される。
アンタゴニスト抗体を活性化因子に変換する方法の一部の例では、機能活性により抗体を選別する前に、複数の抗体を、標的抗原に対する結合親和性によりそれぞれ評価する。対応する型の１次抗体よりも大きな標的抗原に対する結合親和性を示す抗体が特定または選択される。次に、そのサブセットの抗体が機能活性によりさらに選別され、変換された活性化因子活性を有するものが特定または選択される。
抗体変換方法の別の例では、抗体の活性が活性化因子からアンタゴニストに変換される。この方法では、活性化因子抗体である１次抗体またはその断片が選択され、それにより、抗体は標的抗原に関連する機能活性を増加させる。抗原に結合するのに充分な可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部をそれぞれ含む複数の改変抗体が産生され、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖が改変され、これにより、１次抗体に比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。例えば、アミノ酸改変は、少なくとも単一のアミノ酸残基を置換して、これにより、１次抗体に比較して、複数の抗体のそれぞれがアミノ酸の異なるアミノ酸への置換を含む。この方法の一例では、改変型の１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を生成することにより、複数の改変抗体が産生され、この場合、核酸分子は、未改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードする少なくとも１つのコドンを含み、これにより、複数の核酸分子のそれぞれが単一アミノ酸残基の置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする。変異誘発後に、複数の改変抗体が、標的抗原に対する活性によりそれぞれ選別される。１次抗体の存在下の活性に比較して、標的抗原に関連する機能活性を減少させる抗体が選択または特定され、それにより、１次抗体がアンタゴニストへ変換される。
活性化因子抗体をアンタゴニストに変換する方法の一部の例では、抗体が機能活性により選別される前に、複数の抗体が標的抗原に対する結合親和性により、それぞれ評価される。対応する型の１次抗体よりも低い標的抗原に対する結合親和性を示す抗体が特定または選択される。次に、そのサブセットの抗体が機能活性に対しさらに選別されて、変換されたアンタゴニスト活性を有するものが特定または選択される。
上記変換方法のそれぞれで、標的抗原は、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞増殖因子受容体１、２、および３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−ｂ３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体；ＨＧＦＲとしても知られる）、ＤＬＬ４、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体）、ＫＩＴ（ｃ−ｋｉｔ用受容体）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４（繊維芽細胞増殖因子受容体１、２、および４）、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ；マクロファージ刺激１受容体としても知られる）、ＴＥＫ（内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ）、ＴＩＥ（内皮細胞に存在する受容体型チロシンキナーゼ）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１（エリトロポイエチン産生肝細胞受容体Ａ１、Ａ２およびＢ１）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＮＯＴＣＨ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−ＲまたはＥＰＯ−Ｒ、である。
本明細書では、ＤＬＬ４に対し結合親和性を有する抗ＤＬＬ４抗体多量体が提供される。これは、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により単量体Ｉｇ断片として測定して１０−８Ｍ以下の結合親和性を有し、ＤＬＬ４活性の活性化因子である。例えば、結合親和性は、１０−６Ｍ〜１０−８Ｍである。抗体多量体は、例えば、完全長抗体、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖダイマーであってもよい。一部の例では、その抗体多量体は、完全長抗体で、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡおよびＩｇＭの定常領域由来の定常領域を含む。例えば、定常領域は、ＩｇＧ１定常領域、またはその改変型である。
一例では、抗体多量体は、配列番号２９０８に設定された重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、配列番号２９０９に設定された重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、配列番号２９１０に設定された重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）、配列番号２９１１に設定された軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号２９１２に設定された軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、および配列番号２９１３に設定された軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み；または配列番号２９０８〜２９１３のいずれかに対し少なくとも７０％配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、その結果、抗体はＤＬＬ４に結合し、ＤＬＬ４活性の活性化因子である。例えば、抗体多量体は、配列番号８８に設定された可変領域を有する重鎖および配列番号１０７に設定された可変領域を有する軽鎖を含む。
別の例では、抗体多量体は、配列番号２９１４に設定された重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、配列番号２９１５に設定された重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、配列番号２９１６に設定された重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）、配列番号２９１７に設定された軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、配列番号２９１８に設定された軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、および配列番号２９１９に設定された軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含み；または配列番号２９１４〜２９１９のいずれかの配列に対し少なくとも７０％配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、その結果、抗体はＤＬＬ４に結合し、ＤＬＬ４活性の活性化因子である。例えば、抗体多量体は、配列番号８９に設定された可変領域を有する重鎖および配列番号１０８に設定された可変領域を有する軽鎖を含む。
本明細書で提供される抗体多量体の例では、重鎖は、ＩｇＧ１定常領域（例えば、配列番号２９２２に設定された）、軽鎖定常領域、ラムダまたはカッパ（例えば、配列番号２９２３または２９２４に設定された）を含んでもよい。
本明細書では、本明細書で提供されるいずれかの抗体多量体を患者に投与し、それにより、ＤＬＬ４受容体の活性が高められることにより血管新生疾患または状態に関連する異常血管新生を治療する方法が提供される。例えば、ＤＬＬ４受容体は、Ｎｏｔｃｈ−１またはＮｏｔｃｈ−４である。血管新生疾患または状態は、癌、糖尿病性網膜症および他の糖尿病合併症、炎症性疾患、子宮内膜症ならびに加齢黄斑変性であってもよい。
は、構造親和性／活性関連性（ＳＡＲ）に基づく親和性成熟の方法を説明するフローチャートである。 は、「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１およびＬ６＿ＩＧＫＪ１＊０１のアミノ酸配列比較である。図２Ａは、「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の可変重鎖（配列番号８８および１０７）と「ｎｏｎ−Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−１３＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の可変重鎖（配列番号９３および１０７）の配列比較を示す。図２Ｂは、「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の可変軽鎖（配列番号８８および１０７）と「ｎｏｎ−Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ａ２７＿ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号８および１１０）、ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ２５＿ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号８８および１２０）およびＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ２＿ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号８８および１１２）の可変軽鎖の配列比較を示す。変異領域は、灰色で強調表示している。「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１のアミノ酸配列は、太字で示している。 は、「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１の可変重鎖のアミノ酸配列比較である。図３は、「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１の可変重鎖（配列番号８９および１０８）と「ｎｏｎ−Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ６−２５＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１の可変重鎖（配列番号１０６および１０８）の配列比較を示す。変異領域は、灰色で強調表示している。「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１のアミノ酸配列は太字で示している。 は、生殖系列交換可変重鎖のアミノ酸配列比較である。図４Ａは、「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の可変重鎖（配列番号８８および１０７）とＪセグメント生殖系列で交換したＦａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ２＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号５８５および１０７）、ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号５８６および１０７）およびＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ５＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号５８７および１０７）の可変重鎖の配列比較を示す。図４Ｂは、「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１の可変重鎖（配列番号８９および１０８）とＪセグメント生殖系列で交換したＦａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１（配列番号５８８および１０８）、ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ３＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ４＊０１（配列番号５８９および１０８）およびＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ５＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ４＊０１（配列番号５９０および１０８）の可変重鎖の配列比較を示す。図４Ｃは、「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１の可変重鎖（配列番号８９および１０８）とＤセグメント生殖系列で交換したＦａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１２＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１（配列番号５９１および１０８）およびＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−２４＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１（配列番号５９２および１０８）の可変重鎖の配列比較を示す。変異領域は、灰色で強調表示している。「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１のアミノ酸配列は、太字で示している。 は、「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−２１＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１の可変重鎖のアミノ酸配列比較である。図５は、「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−２１＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１の可変重鎖（配列番号１７２９および５９４）と関連する「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−２＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１（配列番号１７２３および５９４）、ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１（配列番号１７２５および５９４）およびＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−１５＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１（配列番号１７２７および５９４）の可変重鎖の配列比較を示す。変異領域は、灰色で強調表示している。「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−２１＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１のアミノ酸配列は、太字で示している。
詳細な説明
アウトライン
Ａ．定義
Ｂ．方法の概説
１．抗体ポリペプチド
ａ．抗体構造および機能
ｂ．抗体配列および特異性
２．抗体を特定する方法
３．抗体最適化の既存方法
Ｃ．抗体親和性成熟法
１．構造および活性の比較
ａ．親和性成熟用の次抗体の選択
ｉ．免疫化およびハイブリドーマ選別
ｉｉ．「Ｈｉｔ」の特定のための選別アッセイ
１）ディスプレイライブラリー
２）ファージディスプレイライブラリー
３）アドレス指定可能なライブラリー
ｂ．関連抗体の特定
ｃ．１次抗体および関連抗体のアミノ酸配列の比較
ｄ．特定された領域の変異誘発
２．系統的変異導入によるＳＡＲ
３．さらなる最適化
ａ．相補性決定領域
ｂ．フレームワーク領域
ｃ．生殖系列スワッピング
Ｄ．抗体変換方法
１．出発または参照抗体の選択
２．変異誘発
３．変換された抗体の選択
ａ．結合
ｂ．機能活性
Ｅ．アッセイ
１．結合アッセイ
２．機能活性
ａ．分化
ｂ．遺伝子発現の変化
ｃ．細胞障害性アッセイ
３．インビボアッセイ
Ｆ．抗体産生方法
１．ベクター
２．細胞および発現系
ａ．原核生物発現
ｂ．酵母
ｃ．昆虫
ｄ．哺乳動物細胞
ｅ．植物
３．精製
Ｇ．抗ＤＬＬ４活性化因子／モジュレーター抗体およびその使用
１．ＤＬＬ４
ａ．構造
ｂ．発現
ｃ．機能
２．活性化因子／モジュレーター抗ＤＬＬ４多量体抗体
代表的抗体
３．改変
ａ．免疫原性を減らす改変
ｂ．グリコシル化
ｃ．Ｆｃ改変
ｄ．ペグ化
４．組成物、製剤、投与および製品／キット
ａ．組成物および製剤
ｂ．製品およびキット
５．治療および使用方法
併用療法
Ｈ．実施例
Ａ．定義
特に断らなければ、本明細書で使われる全ての技術および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の全開示を通して参照される全ての特許、特許出願、公開出願、および出版物、ジェンバンク配列、データベース、ウエブサイト、および他の公表された物質は、特に他に断らない限り、参照によってその全体が組み込まれる。本明細書の用語に対し複数の定義が存在する場合は、本節の定義が優先される。ＵＲＬまたは他のこのような識別子またはアドレスに対し参照がなされている場合は、このような識別子は、変わる可能性があり、特にインターネット情報は絶えず入れ替わっているが、同等の情報をインターネット上でサーチすることにより見つけることができることは理解されよう。それに対する参照は、このような情報の利用可能性および公開流布の証拠となるものである。
本明細書で使用される抗体は、天然由来の、または一部もしくは全部が合成、例えば、組換えにより産生された、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンの一部を指し、抗原結合部位を形成するのに充分な免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリンのいずれかの部分を含む。従って、抗体またはその一部は、免疫グロブリン抗原結合部位に対し相同または実質的に相同である結合ドメインを有するいずれかのタンパク質を含む。例えば、抗体は、２つの重鎖（ＨおよびＨ’と記される）および２つの軽鎖（ＬおよびＬ’と記される）を含む抗体を指し、この場合、各重鎖は、完全長免疫グロブリン重鎖または抗原結合部位（例えば、重鎖には、ＶＨ、鎖ＶＨ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３鎖が含まれるが、これに限定されない）を形成するのに充分なその一部であってもよく、また、各軽鎖は、完全長軽鎖または抗原結合部位（例えば、軽鎖には、ＶＬ鎖およびＶＬ−ＣＬ鎖が含まれるが、これに限定されない）を形成するのに充分なその一部であってもよい。各重鎖（ＨおよびＨ’）は１つの軽鎖（それぞれ、ＬおよびＬ’）と対を作る。通常、抗体は、最小限で、可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）の全てまたは少なくとも一部を含む。また、抗体は、定常領域の全てまたは一部を含んでもよい。
本明細書の目的に対して、用語の抗体は、例えば、これに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片ならびにｓｃＦｖ断片を含む完全長抗体およびその一部を含む。他の既知の断片には、これに限定されないが、ｓｃＦａｂ断片（Ｈｕｓｔ ｅｔ ａｌ．、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）、７：１４）が含まれる。抗体は、免疫グロブリンクラスのいずれかのメンバーを含み、これには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥがある。
本明細書で使用される、完全長抗体は、２つの完全長重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３またはＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）および２つの完全長軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）およびヒンジ部を有する抗体であり、例えば、抗体分泌Ｂ細胞により産生されたヒト抗体、および合成的に産生された同じドメインを有する抗体がこの例である。
本明細書で使用される、抗体の「その一部」または「その断片」として参照される抗体断片または抗体の一部は、完全長抗体のいずれかの一部を指し、完全長の長さより短いが、抗原結合部位（例えば、１つまたは複数のＣＤＲ）を形成するのに充分な少なくとも一部の抗体の可変領域を含み、従って、完全長抗体の結合特異性および／または活性を保持する；抗体断片は、完全長抗体の酵素処理により産生された抗体誘導体、ならびに合成的に、例えば、組換えにより産生された誘導体を含む。抗体断片の例には、これに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、が含まれる（例えば、分子生物学における方法、Ｖｏｌ２０７：癌治療方法およびプロトコルのための組換え型抗体、（２００３）；Ｃｈａｐｔｅｒ１；ｐ３−２５、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、を参照）。断片には、例えば、ジスルフィド架橋および／またはペプチドリンカーによって一緒に結合した複数の鎖を含んでもよい。抗体断片は、通常、少なくとも約５０アミノ酸、典型的には、少なくとも２００アミノ酸を含む。
従って、「抗原結合部位を形成するのに充分な抗体またはその一部」への参照は、抗体またはその一部が、全６ＣＤＲを含む対応する完全長抗体の少なくとも一部の結合特異性を保持するのに充分な少なくとも１または２、典型的には３、４、５または全６ＣＤＲのＶＨおよびＶＬを含むことを意味する。通常、充分な抗原結合部位には、少なくとも重鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）が必要である。典型的には、さらに軽鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）が必要である。本明細書記載のように、当業者は、ｋａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａナンバリングに基づいてＣＤＲを理解し、特定することができる（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）免疫学的関連タンパク質の配列、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、を参照）。例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくと、ＣＤＲ−ＬＩは、残基Ｌ２４〜Ｌ３４に相当する；ＣＤＲ−Ｌ２は、残基Ｌ５０〜Ｌ５６に相当する；ＣＤＲ−Ｌ３は、残基Ｌ８９〜Ｌ９７に相当する；ＣＤＲ−Ｈ１は、残基Ｈ３１〜Ｈ３５、３５ａまたは３５ｂに相当する（長さに応じて）；ＣＤＲ−Ｈ２は、残基Ｈ５０〜Ｈ６５に相当する；ならびにＣＤＲ−Ｈ３は、残基Ｈ９５〜Ｈ１０２に相当する。
本明細書で使われる「抗原結合部位」は、１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ；高頻度可変性領域とも呼ばれる）によって形成されるインターフェイスを指す。各抗原結合部位は、重鎖可変領域由来の３つのＣＤＲおよび軽鎖可変領域由来の３つのＣＤＲを含む。抗体分子は、通常、２つの抗原結合部位を有し、それぞれは重鎖可変領域の一部および軽鎖可変領域の一部を含む。抗原結合部位は、ＣＤＲに加えて、可変領域ドメインの他の部分を含むことができる。
本明細書で使われるＦｖ抗体断片は、非共有結合の相互作用により結合した１つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）および１つの可変軽鎖（ＶＬ）ドメインからなる。
本明細書で使われるｄｓＦｖは、操作されたＶＨ−ＶＬ対を安定化させる分子間ジスルフィド結合を有するＦｖを指す。
本明細書で使われるＦｄ断片は、抗体重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および１つの定常領域ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体の断片である。
本明細書で使われる「Ｆａｂ断片」は、完全長免疫グロブリンをパパインで消化して生じた完全長抗体の一部を含む抗体断片、または合成、例えば、組換えにより産生された同じ構造を有する断片である。Ｆａｂ断片は、軽鎖（ＶＬおよびＣＬ部分を含む）および重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および１つの重鎖（ＣＨ１）の定常領域ドメイン部分を含む別の鎖を含む；これは、組換えにより産生可能である。
本明細書で使われるＦ（ａｂ’）２断片は、免疫グロブリンのｐＨ４．０〜４．５でのペプシン消化から生じた抗体断片、または合成的に、例えば、組換えにより、産生された同じ構造を有する抗体である。Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つのＦａｂ断片を含むが、各重鎖部分がシステイン残基を含む、２つの断片を結合するジスルフィド結合を形成する少数の追加のアミノ酸を含む場合には、それは組換えにより産生可能である。
Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片の半分（１つの重鎖と１つの軽鎖）を含む断片である。
本明細書で使われる、Ｆｄ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片の１つの重鎖部分を含む抗体の断片である。
本明細書で使われる、Ｆｖ’断片は、抗体分子のＶＨおよびＶＬドメインのみを含む断片である。
本明細書で使われるｓｃＦｖ断片は、ポリペプチドリンカーにより任意の順に共有結合された可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を含む抗体断片を指す。リンカーは、２つの可変ドメインが実質的な干渉なしに架橋されるような長さである。代表的リンカーは、一部のＧｌｕまたはＬｙｓ残基を全体に散在させて溶解度を高めた（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基である。
本明細書で使われるディアボディは、二量体ｓｃＦｖである；ディアボディは、典型的には、ｓｃＦｖより短いペプチドリンカーを有し、優先的に二量体化する。
本明細書で使われるｈｓＦｖは、Ｆａｂ断片に通常存在する定常ドメインが、ヘテロ二量体コイルドコイルドメインにより置換されている抗体断片を指す（例えば、Ａｒｎｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．７：３１２：２２１−２２８、参照）。
本明細書で使われる「抗体多量体」は、少なくとも２つ以上の抗原結合部位を含む抗体を指す。抗体多量体には、二量体、三量体、四量体、五量体、およびさらに高い重合度のオリゴマーが含まれる。多量体としての抗体の形成は、当業者の知識に基づいて行うことができる。例えば、多量体型は、少なくとも２つのポリペプチドまたは共有結合の相互反応を調節または促進する多量体化ドメインを介して形成される抗体オリゴマーを含む。
本明細書で使われる多量体化ドメインは、ポリペプチド分子と、１つまたは複数の別のポリペプチド分子との安定な相互作用を促進するアミノ酸配列を指す。この別のポリペプチド分子は相補的な多量体化ドメインをそれぞれ含み、このドメインは最初のドメインと安定な多量体を形成するために、同じ多量体化ドメインであっても、異なるドメインであってもよい。通常、ポリペプチドは、直接または間接的に多量体化ドメインに結合している。代表的多量体化ドメインには、免疫グロブリン配列またはその一部、ロイシンジッパー疎水性の領域、親水性の領域、および適合性タンパク質−タンパク質相互作用ドメインが含まれる。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域またはドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプを含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭならびにその改変型由来の、定常ドメインまたはその一部であってもよい。
本明細書で使われる「単一特異性」は、２つ以上の抗原結合部位を含み、各抗原結合部位が免疫特異的に同じエピトープに結合する抗体である。
本明細書で使われる「多選択性」抗体は、２つ以上の抗原結合部位を含み、少なくとも２つの抗原結合部位が免疫特異的に異なるエピトープに結合する抗体である。
本明細書で使われる「二重特異性」抗体は、２つ以上の抗原結合部位を含み、２つの異なるエピトープに免疫特異的に結合可能な多選択性抗体である。「三重特異性」抗体は、３つ以上の抗原結合部位を含み、３つの異なるエピトープに免疫特異的に結合可能な多選択性抗体であり、「四重特異性」抗体は、４つ以上の抗原結合部位を含み、４つの異なるエピトープに免疫特異的に結合可能な多選択性抗体である、等々。
本明細書で使われる「単量体Ｉｇ断片」への参照は、１つの抗原結合部位のみを含む抗体の一部を指す。例えば、単量体Ｉｇ断片には、例えば、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖが含まれる。
本明細書で使われるポリペプチドドメインは、構造的におよび／または機能的に区別可能なまたは限定可能なポリペプチドの一部（３つ以上、通常、５または７または７超のアミノ酸の配列）である。代表的ポリペプチドドメインは、１つまたは複数の構造的モチーフ（例えば、ループ領域で連結されたアルファらせんおよび／またはベータ鎖の組み合わせ）から構成されるポリペプチド内の独立に折り畳まれた構造を形成するポリペプチドおよび／または特定の機能活性、例えば、酵素活性または抗原結合により識別されるポリペプチドの一部である。ポリペプチドは、１つの、典型的には２つ以上の、異なるドメインを持つことができる。例えば、ポリペプチドは、１つまたは複数の構造的ドメインおよび１つまたは複数の機能的ドメインを持つことができる。単一ポリペプチドドメインは、構造および機能に基づいて区別可能である。ドメインは、近接するアミノ酸の直鎖状配列を包含可能である。あるいは、ドメインは、複数の非近接アミノ酸部分を含んでもよく、これはポリペプチドのアミノ酸の直鎖状配列に沿って非近接である。通常、ポリペプチドは、複数のドメインを含む。例えば、抗体分子の各重鎖および各軽鎖は、複数の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含み、それぞれ、約１１０アミノ酸の長さである。
本明細書で使われるＩｇドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドと呼ばれる構造により区別できると当業者が認識しているドメインであり、この構造は、２つのベータプリーツシートを含み、それぞれがループで連結された逆平行アミノ酸ベータ鎖を含む。Ｉｇフォールド中の２つのベータシートは、疎水性の相互作用により一緒にサンドイッチされ、鎖内ジスルフィド結合により保持されている。抗体鎖内のそれぞれの免疫グロブリンドメインは、機能に基づいてさらに区別できる。例えば、軽鎖は、１つの可変領域ドメイン（ＶＬ）および１つの定常領域ドメイン（ＣＬ）を含み、他方、重鎖は、１つの可変領域ドメイン（ＶＨ）および３つまたは４つの定常領域ドメイン（ＣＨ）を含む。各ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨドメインは、免疫グロブリンドメインの例である。
本明細書で使われる抗体に関連する「可変ドメイン」は、異なる抗体間で変化するアミノ酸配列を含む抗体の重鎖または軽鎖の特異的Ｉｇドメインである。各軽鎖および各重鎖は、１つの可変領域ドメイン（ＶＬ、および、ＶＨ）を有する。可変ドメインは、抗原特異性を提供し、従って、抗原認識に関与する。各可変領域は、ＣＤＲを含み、これは抗原結合部位ドメインおよびフレームワーク領域（ＦＲ）の一部である。
本明細書で使われる可変重鎖（ＶＨ）または可変軽鎖（ＶＬ）鎖（ＶＨドメインまたはＶＬドメインとも呼ばれる）への参照は、抗体の可変ドメインを構成するポリペプチド鎖を指す。
本明細書で使われる抗体の「領域」は、特定の機能または構造に関連する抗体のドメインまたはドメインの一部を指す。抗体では、抗体の領域には、相補性決定領域、フレームワーク領域、および／または定常領域が含まれる。一般的に、本明細書の目的に対して、抗体の領域は、可変軽鎖もしくは可変重鎖の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、もしくはＣＤＲＨ３）、または可変軽鎖または可変重鎖のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２もしくはＦＲ３である。
本明細書で使われる「高頻度可変性領域」、「ＨＶ」、「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」ならびに「抗体ＣＤＲ」は、同義に使用され、一緒に抗体の抗原結合部位を形成する各可変領域内の複数の部分の１つを指す。各可変領域ドメインは、３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と名付けられている。この３つのＣＤＲは、直鎖状アミノ酸配列に沿って非近接であるが、折り畳みポリペプチド中では近接している。ＣＤＲは、可変ドメインのベータシートの平行鎖を連結するループ内に位置する。
本明細書で使われるフレームワーク領域（ＦＲ）は、ベータシート内に位置する抗体可変領域ドメイン内の領域であり；ＦＲ領域は、そのアミノ酸配列に関して、高頻度可変性領域に比較して保存的である。
本明細書で使われる定常領域ドメインは、比較的に、可変領域ドメインより抗体中で保存的であるアミノ酸配列を含む、抗体重鎖または軽鎖中のドメインである。各軽鎖は、単一軽鎖定常領域（ＣＬ）ドメインを有し、各重鎖は、１つまたは複数の重鎖定常領域（ＣＨ）ドメインを含み、これにはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４が含まれる。完全長ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧアイソタイプは、ＣＨ１、ＣＨ２ＣＨ３およびヒンジ部を含み、一方、ＩｇＥおよびＩｇＭは、ＣＨ１、ＣＨ２ＣＨ３およびＣＨ４を含む。ＣＨ１およびＣＬドメインは、抗体分子のＦａｂアームを伸張し、これにより、抗原との相互作用および抗体アームの回転に寄与する。抗体定常領域は、エフェクター機能、例えば、これに限定されないが、抗体が、例えば、種々の細胞、生体分子および組織との相互作用を介して、特異的に結合している抗原、病原体および毒素のクリアランス、を提供できる。
本明細書で使われるヒト化抗体は、アミノ酸の「ヒト」配列を含むように改変され、それにより、ヒトへの投与が免疫応答を誘発しない抗体を指す。このような抗体を調製する方法は既知である。例えば、非可変領域のアミノ酸組成がヒト抗体に基づくことが可能な抗体。コンピュータプログラムが、このような領域を特定するように設計されている。
本明細書で使われる「抗体変換」は、標的抗原または基質に対する抗体またはその断片の機能的活性が、通常、１つまたは複数のアミノ酸残基の変異により変えられて、出発または参照抗体の逆の機能活性を有するようにするプロセスを指す。例えば、出発または参照抗体が標的抗原に対しアンタゴニスト活性を示す場合は、抗体変換により抗体がアゴニストまたは活性化因子／モジュレーター活性に変えられる。別の例では、出発または参照抗体が標的抗原に対し活性化因子／モジュレーター活性を示す場合は、抗体変換により、抗体はアンタゴニスト活性に変えられる。
本明細書で使われる「親和性成熟」は、通常、１つまたは複数のアミノ酸残基の変異により、参照抗体（本明細書では、テンプレートまたは親抗体とも呼ばれる）から、対応する型の参照抗体の同じ標的抗原に対する活性より、標的抗原に対する活性増加を示すように抗体を進化させるプロセスを指す。従って、進化した抗体は、参照またはテンプレート抗体に比べて、最適化されている。
本明細書で使われる親和性成熟抗体への参照は、参照抗体に比べて、標的抗原に対する活性増加を有する抗体を指す。例えば、親和性成熟抗体は、参照または親抗体に比べて、標的抗原に対する強化された結合を示す。通常、親和性成熟抗体は、参照抗体と同じエピトープに結合する。
本明細書で使われる最適化抗体は、参照抗体に比べて、標的タンパク質または抗原に対し活性増加、例えば、標的タンパク質に対する結合親和性の改善および／または機能活性の改善、を示す抗体、またはその一部を指す。通常、抗体は、１つまたは複数のアミノ酸改変を含まない親抗体に比較して、１つまたは複数のアミノ酸改変（アミノ酸欠失、置換または挿入）に基づいて最適化される。一般的に、活性、例えば、結合親和性は、親抗体（例えば、改変を含まない生殖系列抗体Ｈｉｔ）の活性に比べて、１．５倍〜１０００倍、通常は少なくとも２倍〜１００倍、例えば、正確にまたは約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍または１０００倍超、の値だけ増加する。
本明細書で使われる「構造親和性／活性関係性」（ＳＡＲ）は、構造（例えば、配列）および分子の機能間の関係性を指し、それにより、抗体の活性をその配列に関係づけることができる。従って、ＳＡＲの知識により、抗体の活性に寄与する特定のアミノ酸残基を含む配列の領域が明らかにされる。ＳＡＲを測定する方法は、本明細書で記載される。
本明細書で使われる標的タンパク質または標的抗原に対する活性は、結合特異性または結合親和性および／または標的タンパク質の機能活性の調節、または標的タンパク質に対する抗体またはその一部の活性を反映した他の測定値、を指す。抗体の活性は、結合または親和性に基づくアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、電気化学発光測定法（例えば、メソ・スケール・ディスカバリー）、もしくは表面プラズモン共鳴法、または本明細書記載の細胞ベースアッセイを使って測定できる。
本明細書で使われる「機能活性」は、完全長（完全）タンパク質に付随するポリペプチド（例えば、標的タンパク質）またはその一部の活性を指す。機能活性には、これに限定されないが、生物活性、触媒または酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体に対し結合する能力、またはポリペプチドと抗ポリペプチド抗体に対する結合に関し競合する能力）、免疫原性、多量体形成能力、ポリペプチドならびにシグナル伝達および下流エフェクター機能のために、受容体またはリガンドに特異的に結合する能力、が挙げられる。本明細書の目的のためには、抗体またはその一部によるポリペプチドの機能活性の調節（すなわち、活性化または抑制）は、本明細書では、ポリペプチドの機能活性が、抗体またはその一部が存在しない場合に比べ、抗体の存在下、変更または部分的に変更されることを意味する。
本明細書で使われる結合活性は、１つまたは複数の結合相手に、それが結合するか否か、およびどのように結合するかに関連した、分子、例えば、ポリペプチド、の特性を指す。結合活性には、結合相手に結合する能力、結合相手に結合する親和性（例えば、高親和性）、結合相手に結合する結合力、結合相手と結合する強度および結合相手と結合するための特異性、が含まれる。
本明細書で使われる「親和性」または「結合親和性」は、標的タンパク質または抗原上のエピトープに抗体分子またはその一部が結合する強度を指す。親和性は、平衡結合定数（ＫＡ）または平衡解離定数（ＫＤ）で測定されることが多い。低親和性抗体−抗原相互作用は弱く、分子は急速に分離する傾向があり、一方、高親和性抗体−抗原結合は強く、分子は、結合状態で長時間の間残る。一般的に、標的タンパク質に対する抗体の親和性は、平衡結合定数（ＫＡ）で、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、約１０８Ｍ−１以上、または約１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１もしくは１０１２Ｍ−１である。また、抗体は、平衡解離定数（ＫＤ）１０−４Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−７Ｍ、または１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍもしくは１０−１２Ｍまたは、さらに低い解離定数が特徴であってもよい。低い解離定数は、抗体がより高い結合親和性を特徴とすることを意味していることは理解されよう。通常、ｎＭまたはｎＭ以下の解離定数を有する抗体は、高親和性抗体と見なされる。このような親和性は、従来技術、例えば、平衡透析；ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置を使い、メーカーにより概説されている一般的手法を使って；放射線標識標的抗原を使ったラジオイムノアッセイ；または当業者には既知の他の方法を使って容易に測定可能である。親和性データを、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ、５１：６６０（１９４９）、の方法を使って解析できる。
本明細書で使われる抗体またはその抗原結合断片に関する「特異的に結合する」または「免疫特異的に結合する」は、本明細書では同意義に使用され、抗体および抗原（例えば、ヒトＤＬＬ４）の抗体結合部位間の非共有相互作用により１つまたは複数の同族の抗原と非共有結合を形成する抗体または抗原結合断片の能力を指す。通常、抗原に対し免疫特異的に結合（または特異的に結合する）抗体は、正確にまたは約１×１０７Ｍ−１または１ｘ１０８Ｍ−１もしくはそれ超の親和定数Ｋａ（または１ｘ１０−７Ｍまたは１×１０‑８Ｍもしくはそれ未満の解離定数（Ｋｄ））の値で抗原に結合する抗体である。親和定数は、抗体反応の標準的動力学的方法、例えば、イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）（Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１：５４；Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ（１９９８）Ａｎａｌｙｓｔ．１２３：１５９９）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）または当技術分野で既知の他の動力学的相互作用アッセイで測定可能である（例えば、Ｐａｕｌ、ｅｄ．、免疫学の基礎、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐａｇｅｓ ３３２−３３６（１９８９）を参照；また、代表的ＳＰＲおよびＩＴＣ法による抗ＲＳＶ抗体の結合親和性を計算法の説明は、米国特許第７、２２９、６１９号を参照）。結合速度のリアルタイム検出およびモニタリング用設備と方法は既知で、市販されている（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ ２０００、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２７：３３５）。
本明細書で提供されるポリペプチドまたは抗体に関連して、本明細書で使われる用語の「選択的に結合する（ｂｉｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」または「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｉｎｄｓ）」は、ポリペプチドまたは抗体が、実質的に別のエピトープに結合することなく、選択されたエピトープと結合することを意味する。通常、選択されたエピトープに選択的に結合する抗体またはその断片は、例えば、正確にまたは約１×１０７Ｍ−１または１ｘ１０８Ｍ−１もしくはそれ超の親和定数Ｋａで特異的にエピトープに結合する。
本明細書で使われる「エピトープ」は、抗体により認識される抗原またはタンパク質の表面上の局部的領域を指す。ペプチドエピトープには、連続的エピトープまたは不連続的エピトープが含まれる。エピトープは、通常、直鎖アミノ酸配列とは対照的に、タンパク質の３次元構造により決定される。
２つ以上の抗体への参照に伴い、本明細書で使われる「同じエピトープに結合する」は、抗体が抗原との結合で競合し、同じか、重なり合う、または包含するアミノ酸の連続または不連続セグメントに結合することを意味する。当業者なら、語句の「同じエピトープに結合する」が、抗体が正確に同じアミノ酸に結合することを必ずしも意味しないことがわかるであろう。抗体が結合する正確なアミノ酸は、異なっていてもよい。例えば、１次抗体は、２次抗体に結合されたアミノ酸のセグメントにより完全に包含されるアミノ酸のセグメントに結合可能である。別の例では、１次抗体は、１つまたは複数の２次抗体により結合されたセグメントと大きくオーバーラップする１つまたは複数のアミノ酸のセグメントと結合する。本明細書の目的に対して、このような抗体は、「同じエピトープに結合する」と見なされる。
抗体競合アッセイを使用して、抗体が、別の抗体と「同じエピトープに結合する」か否かを測定できる。このようなアッセイは、この分野でよく知られている。通常、２次抗体が過剰で、かつ、１次抗体が全部位を飽和させている条件下で、２次抗体によるエピトープとの相互作用が既知である抗体の７０％以上、例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の競合は、抗体が「同じエピトープに結合する」指標となる。２つの抗体間の競合レベルを評価するために、例えば、ラジオイムノアッセイまたは他の抗体に対する標識を使ったアッセイを使用可能である。例えば、ＤＬＬ４抗原を、標識化合物（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、ビオチン、またはルビジウム）と結合した飽和量の１次抗ＤＬＬ４抗体またはその抗原結合断片と共に、同量の非標識２次抗ＤＬＬ４抗体の存在下、インキュベートしてもよい。次に、非標識ブロッキング抗体の存在下で抗原に結合している標識抗体の量を評価し、非標識ブロッキング抗体の存在しない条件下の結合と比較する。ブロッキング抗体の存在しない条件と比較して、非標識ブロッキング抗体の存在下における結合シグナルのパーセンテージ変化により競合を測定する。従って、ブロッキング抗体の存在しない条件下の結合に比較して、ブロッキング抗体の存在下の標識抗体の７０％の結合の抑制がある場合、７０％の２つの抗体の間に競合がある。従って、７０％以上、例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の１次および２次抗体の間の競合に対する参照は、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上（１次抗体の存在しない条件下の２次抗体による抗原の結合に比較して）、抗原に対する２次抗体の結合（または逆も同様）を１次抗体が阻害することを意味する。従って、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の１次抗体の抗原に対する結合の２次抗体による抑制は、２つの抗体が同じエピトープに結合することを示す。
本明細書で使われる用語の「表面プラズモン共鳴」は、例えば、ＢｉａＣｏｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使って、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによりリアルタイム相互作用の分析を可能とする光学的現象を指す。
本明細書で使われる「二重特異性」抗体は、２つ以上の抗原結合部位を含む多選択性抗体で、２つの異なるエピトープに免疫特異的に結合することができる。「三重特異性」抗体は、３つ以上の抗原結合部位を含む多選択性抗体で、３つの異なるエピトープに免疫特異的に結合することができ、「四重特異性」抗体は、４つ以上の抗原結合部位を含む多選択性抗体で、４つの異なるエピトープに免疫特異的に結合できる、等々。
本明細書で使われる「エピトープマッピング」は、抗体−抗原認識の分子決定要因を特定するプロセスである。
本明細書で使われる「標的タンパク質」または「標的抗原」は、抗体またはその一部により特異的に認識される、および／またはその活性が抗体またはその一部により調節される候補タンパク質またはペプチドを指す。標的タンパク質には、抗体認識のためのエピトープを含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。標的タンパク質には、発現または活性によって疾患または障害の病因に関与するタンパク質が含まれる。代表的標的タンパク質は、本明細書で記載される。
本明細書で使われる「Ｈｉｔ」は、標的抗原に対する活性を有するとして、産生された、特定された、認識された、または選択された抗体またはその一部を指す。例えば、「Ｈｉｔ」は、選別アッセイで特定できる。通常、「Ｈｉｔ」は、標的抗原に対するその結合活性または親和性に基づいて特定される。本明細書の目的に対しては、「Ｈｉｔ」は、通常、少なくとも正確にまたは約１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、またはそれ以下である標的抗原に対する結合親和性を有する抗体またはその一部であると認識されている。本明細書の目的としては、Ｈｉｔは、通常、本明細書の親和性成熟法を使ってさらに最適化される１次抗体または参照もしくは親抗体である。従って、用語の「Ｈｉｔ」、１次抗体、参照抗体または親抗体は、本明細書では、同義で使用される。
本明細書で使われる「改変抗体」は、親または参照抗体に比べ１つまたは複数のアミノ酸改変を含む抗体またはその一部を指す。アミノ酸改変には、アミノ酸欠失、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（もしくは置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ））、または追加、が含まれる。改変抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超えるアミノ酸改変を含むことができる。通常、アミノ酸改変は、アミノ酸置換である。一般的には、アミノ酸改変は、抗体の領域または標的領域に存在するが、抗体またはその一部の他の領域に存在してもよい。
本明細書で使われる「関連抗体」は、対応する型の参照抗体（例えば、Ｈｉｔ抗体または１次抗体）に対し、構造的および機能的な類似性を示すが、参照抗体と同じ活性または構造（例えば、配列）を示さない抗体である。例えば、関連抗体は、配列の類似性を示すが、参照抗体と同じではなく、また、標的タンパク質または抗原に対して、参照抗体の活性より活性の低下または少ない活性、例えば、結合親和性の低下、を示す抗体である。本明細書の目的に対しては、１）その抗体が、参照抗体に対する配列の類似性を示し、対応する１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖に対し少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を示す可変重鎖および／または可変軽鎖を含み、関連抗体（可変重鎖および可変軽鎖）は、参照抗体に対する１００％の配列同一性を示さず；さらに２）その抗体が、対応する型の参照抗体に比較して活性の低下を示す場合、抗体は、関連抗体である。配列類似性または配列同一性に関する別の例では、１）その抗体が、参照抗体に対して配列類似性を示し、関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同一であり、および／または少なくとも１つのＶκおよびＪκまたは少なくとも１つの可変軽鎖をコードする核酸分子のＶλおよびＪλ生殖系列セグメントが、１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶκおよびＪκまたはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントと同一であり；さらに２）その抗体が対応する型の参照抗体に比較して活性低下を示す場合、抗体は関連抗体である。
本明細書で使われる標的抗原に対する「活性低下」または「低い活性」は、抗体、またはその一部が、同じ標的抗原に対する参照抗体ほど高くないか、または同じ程度の標的抗原に対する活性（例えば、結合または他の機能活性）を示すことを意味する。参照抗体に対する活性の比較では、活性は、同じまたは類似の条件下で活性を評価するのと同じアッセイを使って対応する型の抗体と比較されることが理解されよう。従って、２つ以上の抗体の間またはその内の必要な活性レベルは、類似のパラメータまたは条件の下で比較される。本明細書の目的に対しては、標的抗原に対する「活性低下」または「低い活性」を有する抗体は、通常、参照抗体に比べ、標的抗原に対し８０％以下の活性、例えば、参照抗体の５％〜８０％の活性、例えば、正確にまたは約８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％もしくはそれ未満の標的抗原に対する活性を示す。
本明細書で使われる「関連可変重鎖」または「関連可変軽鎖」は、対応する参照抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖と配列同一性を示すが、対応する参照抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖と同じではない（例えば、１００％配列同一性を示さない）ものである。通常、関連可変重鎖または可変軽鎖は、対応する参照抗体の鎖と少なくとも６０％配列同一性、通常、少なくとも７５％配列同一性を示すものである。例えば、関連可変重鎖または可変軽鎖は、対応する参照抗体の鎖と６０％〜９９％配列同一性、例えば、正確にまたは約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すものである。例えば、関連抗体には、関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同じであり、および／または可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶκおよびＪκまたは少なくとも１つのＶλおよびＪλ生殖系列セグメントが、１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶκおよびＪκまたはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントと同一である抗体が含まれる。通常、抗体の関連可変重鎖および／または可変軽鎖は、対応する参照抗体の可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性を示す。
本明細書で使われる抗体の型は、抗体の特定の構造を指す。本明細書の抗体には、完全長抗体およびその一部、例えば、Ｆａｂ断片または他の抗体断片が含まれる。従って、Ｆａｂは特定の型の抗体である。
本明細書で使われる抗体の「対応する型」に対する参照は、２つの抗体の特性または活性を比較する場合、特性を同じ型の抗体を使って比較することを意味する。例えば、抗体が、対応する型の１次抗体の活性に比べて低い活性であると述べられている場合、特定の型、例えば、抗体のＦａｂ、が１次抗体のＦａｂの型に比べて、低い活性を有することを意味する。
本明細書で使われる「配列多様性」または「配列類似性」は、核酸配列の類似性の表現を指し、配列アラインメント、多様性スコア、および／または配列クラスタリングを使って求められる。いずれかの２つの配列に関し、配列を並べて配置し、配列の長さ方向に沿った全ての位置のヌクレオチド内の差異を分析することにより配列比較可能である。ＮＣＢＩが開発したツールのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を使って、コンピュータにより核酸および／またはタンパク質配列の比較を行い、配列アラインメントを評価することができる。配列アラインメントのためにＢＬＡＳＴを使用することは、当業者にはよく知られている。Ｂｌａｓｔの探索アルゴリズムは、２つの配列を比較し、各マッチ（Ｂｌａｓｔスコア）の統計的有意性を計算するものである。相互に最も類似している配列は、高いＢｌａｓｔスコアを有し、一方、最も違いの多い配列は、低いＢｌａｓｔスコアを有することになる。
本明細書で使われるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）により開発された探索アルゴリズムで、タンパク質またはＤＮＡデータベースを、例えば、配列同一性に基づいて、別々に探索する。例えば、ｂａｓｔｎは、ヌクレオチド配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）に対してヌクレオチド問い合わせ配列を比較するプログラムである。ＢｌａｓｔＰは、タンパク質配列データベースに対してアミノ酸問い合わせ配列を比較するプログラムである。
本明細書で使われる「標的領域」は、関連抗体または抗体の対応する領域に比べて、少なくとも１つのアミノ酸差異を示す抗体（例えば、Ｈｉｔ抗体）またはその一部の可変重鎖または可変軽鎖の領域を指す。従って、標的領域には、関連抗体の対応する領域に比べて、少なくとも１つのアミノ酸差異を含む抗体の可変重鎖または可変軽鎖の１つまたは複数のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４が含まれる。通常、標的領域は、抗体の構造／活性関連性（ＳＡＲ）に関連する抗体の領域である。従って、本明細書の方法を実施する目的のためには、標的領域は、さらなる変異誘発の標的となる領域である。本明細書に記載のように、このような領域を特定し、アミノ酸の差異が存在するかどうかを判定することは、当業者のレベル内で可能なことである。当業者なら、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａナンバリング（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）免疫学的関連タンパク質の配列、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、を参照）に基づいて、抗体中の領域、例えば、ＣＤＲまたはＦＲ、を知り、特定できる。
本明細書で使われる「飽和変異誘発」は、タンパク質配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を全てのまたはサブセットの使われていないアミノ酸残基に置換することにより、または多くのアミノ酸残基（タンパク質の全長内もしくは全体にわたり、またはタンパク質の領域内もしくは全体にわたり）のそれぞれを全てのまたはサブセットの使われていないアミノ酸残基に置換させることにより、系統的に複数の変異体を生成するプロセスを指す。飽和変異誘発は、全体でも部分的であってもよい。
本明細書で使われる「完全飽和変異誘発（ｆｕｌｌ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」は、タンパク質配列中のアミノ酸残基を他の１９天然アミノ酸で置換することにより複数の変異体を系統的に生成するプロセスを指す。タンパク質配列中の単一アミノ酸残基は、変異誘発の対象でありうる。あるいは、タンパク質またはタンパク質配列の領域（例えば、標的領域）の完全長配列全体にわたる全ての、またはサブセットのアミノ酸残基を完全飽和変異誘発に供することができる。
本明細書で使われる「部分的飽和変異誘発」は、タンパク質配列中のアミノ酸残基をサブセットの他の１９の天然のアミノ酸に置き換えることにより、複数の変異体配列を系統的に生成するプロセスを指す。タンパク質配列中の単一のアミノ酸残基は、変異誘発の対象になりうる。あるいは、タンパク質またはタンパク質配列の領域（例えば、標的領域）の完全長配列全体にわたる全ての、またはサブセットのアミノ酸残基を部分的飽和変異誘発に供することができる。
本明細書で使われる「系統的変異導入」は、タンパク質またはタンパク質の領域（例えば、標的領域）の全ての、またはサブセットのアミノ酸残基を、各残基が同じ残基で置換可能な間は、選択されたアミノ酸、通常、アラニン、グリシンまたはセリンで、系統的に置換するプロセスを指す。通常は、置換アミノ酸はアラニンである。
本明細書で使われる「Ｕｐ ｍｕｔａｎｔ」である抗体、または「活性保持または活性増加を示す」抗体への参照は、スキャンアミノ酸の変異を含まない親抗体に比較して、スキャンアミノ酸に単一アミノ酸変異を含む場合に、活性が維持されるか、または高められる系統的変異導入をされた抗体を指す。標的抗原に対し活性を保持している抗体は、結合の少しの増加または減少を示しうるが、通常は、スキャン変異を含まない１次抗体と同じ結合を示す。例えば、少なくとも７５％の結合活性、例えば、７５％〜１２０％の結合、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％または１１５％の結合を示す。標的抗原に対し活性増加を示す抗体は、通常、変異を含まない１次抗体に比べて、１１５％を超える活性、例えば、１１５％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％またはそれを超える活性を示す。
本方法のステップの実行に関して本明細書で使われる「反復性の（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ）」は、前の繰り返し時に比べ、改変された「Ｈｉｔ」の活性が最適化されている、または改善されていることが特定されるまで、複数回、例えば、２、３、４、５またはそれを超える回数、この方法が繰り返されることを意味している。
本明細書で使われる抗体またはその一部に関連する「中間体」は、参照抗体、テンプレートまたは親抗体から、例えば、親和性成熟のプロセスにより、誘導されたか、または進化した抗体で、しかし、それ自体さらに進化を受ける抗体を指す。例えば、改変Ｈｉｔが本明細書の親和性成熟法により選択されるとすぐ、それ自体、さらに抗体を進化させる、または最適化するために、テンプレートとして使用できる。従って、改変Ｈｉｔは、さらなる改変Ｈｉｔを特定するか、または選択するための中間体抗体である。
本明細書で使われる「抗体ライブラリー」は、例えば、２以上、通常は、５以上、さらに通常は、１０以上、例えば、正確にまたは約１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、１０４ 、１０５、１０６ 、１０７ 、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４もしくはそれ以上のこのような分子の抗体メンバーまたはその一部の収集を指す。一部の実施例では、収集のメンバーは、収集内のメンバーが、標的またはテンプレート抗体に比較して多様化されているために、相互に類似している。しかし、抗体ライブラリーは、任意の抗体メンバー、またはその一部の収集を包含する。従って、テンプレートメンバーに比較して、収集内の各メンバーが多様化される必要はない。通常、収集は、異なるメンバー（すなわち、配列に基づいて）を含むが、一部の抗体収集では、いくつかの同じメンバーを含むこともありうる。通常は、収集は、少なくとも１０４または約１０４ 、１０５または約１０５、１０６または約１０６、少なくとも１０８または約１０８、少なくとも１０９または約１０９、少なくとも１０１０または約１０１０、またはそれ以上異なる抗体メンバーを含む。従って、収集は、通常、少なくとも１０４または約１０４ 、１０５または約１０５、１０６または約１０６、少なくとも１０８または約１０８、少なくとも１０９または約１０９、少なくとも１０１０または約１０１０、少なくとも１０１１または約１０１１、少なくとも１０１２または約１０１２、少なくとも１０１３または約１０１３、少なくとも１０１４または約１０１４、またはそれ以上の多様性を有する。従って、１０７の多様性を有する抗体ライブラリーは、１０７の異なるメンバーを含むことを意味する。
収集またはライブラリーのメンバーに関して本明細書で使われる「多様性」は、収集中のユニークなメンバーの数を指す。従って、多様性は、類似のポリペプチドメンバーの収集の中の異なるアミノ酸配列または核酸配列それぞれの数を指す。例えば、１０４の多様性を有するポリヌクレオチドの収集は、類似のポリヌクレオチドメンバーの中で、１０４異なる核酸配列を含む。一例では、提供されるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの収集は、少なくとも正確にまたは約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０もしくはそれ超の多様性を有する。
本明細書で使われる「多様性比率」は、ライブラリー中の、ライブラリーの全体メンバーの数に対する、異なるメンバーの数の比率を指す。従って、別のライブラリーより大きな多様性比率を有するライブラリーは、全体メンバーに対するより多くの異なるメンバーを含み、それにより、全体メンバーに対するより多くの多様性を有する。提供されるライブラリーは、高い多様性比率、例えば、１に近い多様性比率、例えば、正確にまたは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５．０．９６、０．９７、０．９８、または０．９９の多様性比率を有するライブラリーを含む。
本明細書で使われる「コンビナトリアルライブラリー」は、ビルディングブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）の組み合わせに基づく、置き替え可能な化学的「ビルディングブロック」の異なる組み合わせを反応させ、化合物の収集を生成することにより形成される化合物の収集を指す。抗体コンビナトリアルライブラリーに対しては、ビルディングブロックは、成分Ｖ、ＤおよびＪ領域（またはその改変型）で、これらから抗体が生成される。目的本明細書の目的に対しては、用語「ライブラリー」または「収集」は、同義に使用される。
本明細書で使われるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、抗体（またはその一部、例えば、Ｆａｂ）の収集で、ここでは、抗体は、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、特にヒトＶ、ＤおよびＪ生殖系列セグメントの組み合わせにより作られる核酸分子にコードされている。本明細書のコンビナトリアルライブラリーは、通常、少なくとも５０の異なる抗体（または抗体の一部もしくは断片）メンバー、通常、少なくともまたは約５０〜１０１０以上の異なるメンバー、一般的には、少なくともまたは約１０２〜１０６以上の異なるメンバー、例えば、少なくともまたは約５０、１００、５００、１０３、１ｘ１０３、２ｘ１０３、３ｘ１０３、４ｘ１０３、５ｘ１０３、６ｘ１０３、７ｘ１０３、８ｘ１０３、９ｘ１０３、１ｘ１０４、２ｘ１０４、３ｘ１０４、４ｘ１０４、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４、１ｘ１０５、２ｘ１０５、３ｘ１０５、４ｘ１０５、５ｘ１０５、６ｘ１０５、７ｘ１０５、８ｘ１０５、９ｘ１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、またはそれ以上の異なるメンバーを含む。得られた抗体またはその一部のライブラリーまたは収集は、標的タンパク質に対する結合または機能活性の調節により選別できる。
本明細書で使われるヒトコンビナトリアル抗体ライブラリーは、抗体またはその一部の収集で、各メンバーは、抗原結合部位を形成するのに充分なＶＬおよびＶＨ鎖またはその一部を含み、これらは、米国特許仮出願第６１／１９８、７６４号および６１／２１１、２０４号に記載のようにして製造されたヒト生殖系列セグメントを含む核酸にコードされている。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書で使われるライブラリー中の座位（ｌｏｃｕｓ）は、ライブラリーの１つまたは複数のメンバーを含みうる部位または位置を指す。位置は、物理的な位置である必要はない。例えば、収集が固体支持体上のアレイとして提供される場合は、支持体はアレイのメンバーを提示できる、または提示する座位を含む。
本明細書で使われるアドレスは、収集中の各座位を示すユニークな識別子を指し、それにより、アドレス指定されたメンバー（例えば、抗体）が特定できる。アドレス指定された成分は、その座位または部位により特定可能な成分である。アドレス指定は、表面の位置、例えば、マイクロプレートのウエルの位置にも適用可能である。例えば、マイクロウエルプレート中のタンパク質のアドレス：Ｆ９は、タンパク質がマイクロウエルプレートのＦ行、９列の位置にあることを意味する。また、アドレス指定は、他の識別子、例えば、バーコードもしくは他の記号体系をコードしたタグ、化学的タグ、電子的なＲＦ等のタグ、色分けされたタグまたは他のこのような識別子により行うこともできる。
本明細書で使われるアレイは、３つ以上のメンバーを含む要素、例えば、抗体、の収集を指す。
本明細書で使われる「空間アレイ」は、メンバーがアレイ中の分離された、または別々の空間を占めるアレイである。従って、空間アレイは、アドレス指定できるアレイのタイプである。空間アレイの例には、プレートの各ウエルがアレイ中のアドレスであるマイクロタイタープレートが含まれる。空間アレイには、複数の異なる分子、例えば、ポリペプチド、が保持、提示、配置、位置付け、または支持されている任意の配置が含まれる。アレイには、マイクロタイタープレート、例えば、４８ウエル、９６ウエル、１４４ウエル、１９２ウエル、２４０ウエル、２８８ウエル、３３６ウエル、３８４ウエル、４３２ウエル、４８０ウエル、５７６ウエル、６７２ウエル、７６８ウエル、８６４ウエル、９６０ウエル、１０５６ウエル、１１５２ウエル、１２４８ウエル、１３４４ウエル、１４４０ウエル、もしくは１５３６ウエルプレート、チューブ、スライド、チップ、フラスコ、または任意の他の適切な実験器具、が含まれる。さらに、アレイは、複数のサブアレイを含んでもよい。複数のサブアレイは、２つ以上の配列を使用してポリペプチドを配置するアレイを包含する。例えば、複数の９６ウエルプレートは、複数のサブアレイおよび単一のアレイを構成することができる。
本明細書で使われる、アドレス指定できるライブラリーは、収集の各メンバーがそのアドレスにより特定可能な分子、例えば、核酸分子または抗体等のタンパク質試薬の収集である。
本明細書で使われる、アドレス指定できるアレイは、アレイのメンバーがそれらのアドレス、マイクロタイタープレートのウエルもしくは固相支持体、等の空間アレイ中の位置、または特定可能なもしくは検出可能な標識、例えば、色、蛍光、電子シグナル（例えば、ＲＦ、マイクロ波もしくは対象分子の相互作用を実質的に変えない他の周波数）、バーコードもしくは他の記号体系、化学的もしくは他のこのような標識、により特定可能なアレイである。従って、一般的に、アレイメンバーは、固相の表面上の特定可能な座位に配置され、または直接的もしくは間接的に特定可能な標識に結合させるか、またはそうでなければ会合させて、例えば、マイクロスフェアまたは他の粒子状支持体（本明細書では、ビーズと呼ぶ）に付着させ、溶液中に懸濁または表面上に展開させて、配置される。
本明細書で使われる「アドレス指定できる抗体ライブラリー」または「アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリー」は、メンバー抗体が特定可能であり、空間アレイもしくは固体支持体の位置、または化学的もしくはＲＦタグ、等の同じ識別子の全抗体が同じ抗原に結合し、さらに、通常、アミノ酸配列が実質的に同じである抗体の収集を指す。本明細書の目的に対しては、「アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリー配列」への参照は、アレイ中で抗体メンバーがアドレス指定されることを意味する。
本明細書で使われる支持体（マトリックス支持体、マトリックス、不溶性の支持体または固体支持体、とも呼ばれる）は、任意の固体または半固体または不溶性支持体を指し、これに、対象分子、通常は、生物学的分子、有機分子または生体分子特異的リガンドが結合または接触する。このような材料には、化学的および生物学的分子合成および分析のための親和性マトリックスまたは支持体として使用される任意の材料が含まれ、例えば、これに限定されないが、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デキストラン、キチン、サンド、軽石、アガロース、多糖類、デンドリマー、バッキーボール、ポリアクリルアミド、シリコン、ゴム、および固相合成、親和性分離および精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイならびに他のこのような用途に使われる他の材料、が含まれる。本明細書のマトリックスは、粒子状であっても、連続表面の形、例えば、マイクロタイターディッシュもしくはウエル、ガラススライド、シリコンチップ、ニトロセルロースシート、ナイロンメッシュ、または他のこのような材料であってもよい。微粒子の場合は、通常、粒子は、少なくとも１つの次元は５〜１０ｍｍの範囲以下である。このような粒子、本明細書ではまとめて「ビーズ」と呼ぶ、は、必須ではないが、球状であることが多い。しかし、このような参照は、マトリックスの形状を制約するものではなく、ランダムな形状、針状、線維状、および細長い形状を含むどのような形でもよい。液体相中で使用可能な、凡そ球状の「ビーズ」、特に、マイクロスフェアも、また、意図されている。「ビーズ」は、追加の成分、例えば、磁石利用分離のための磁性または常磁性粒子（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を参照）を、その追加の成分が本明細書の方法と分析を妨害しない限り、含んでもよい。
本明細書で使われるマトリックスまたは支持体粒子は、離散性の粒子の形であるマトリックス材料を指す。粒子は、任意の形と次元を有するが、通常、少なくとも１つの次元は、１００ｍｍ未満、５０ｍｍ未満、１０ｍｍ未満、１ｍｍ未満、１００μｍ未満、５０μｍ未満であり、また、通常、大きさは、１００ｍｍ３未満、５０ｍｍ３未満、１０ｍｍ３未満、および１ｍｍ３未満、１００μｍ３未満、および立方ミクロンのオーダーであってもよい。このような粒子をまとめて「ビーズ」と呼ぶ。
本明細書で使われる生殖系列遺伝子セグメントは、免疫グロブリン重鎖または軽鎖（カッパ鎖およびラムダ鎖）をコードする生殖系列由来の免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）および連結（Ｊ）または定常（Ｃ）遺伝子を指す。生殖系列には、複数のＶ、Ｄ、ＪおよびＣ遺伝子セグメントがあるが、遺伝子再構成では、再構成された各機能的遺伝子中にそれぞれただ１つのセグメントを生ずる。例えば、機能的に再構成された重鎖は、１つのＶ、１つのＤおよび１つのＪを含み、機能的に再構成された軽鎖遺伝子は、１つのＶおよび１つのＪを含む。従って、これらの遺伝子セグメントは、生殖細胞に運ばれるが、しかしそれらが機能的遺伝子に再構成されるまで、転写もされず、重鎖と軽鎖に翻訳もされ得ない。骨髄中でのＢ細胞分化の間に、これらの遺伝子セグメントは、１０１０を超える特異性を生成することが可能なダイナミック遺伝系により、ランダムにシャッフルされる。
本明細書の目的に対しては、重鎖生殖系列セグメントは、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨとして設計され、その編集により、ＶＨ鎖をコードする核酸を生ずる。軽鎖生殖系列セグメントは、カッパおよびラムダ軽鎖（ＶκおよびＪκ；ＶλおよびＪλ）を含むＶＬまたはＪＬとして設計され、その編集により、ＶＬ鎖をコードする核酸を生ずる。軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖であるが、ＶκおよびＪλの編集によるカッパ／ラムダの組み合わせは含まないことは理解されよう。
本明細書の可変生殖系列セグメントへの参照は、Ｖ、ＤおよびＪグループ、サブグループ、遺伝子またはその対立遺伝子を指す。遺伝子セグメント配列は、既知のデータベース（例えば、米国・国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ）、ＫａｂａｔデータベースおよびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ’ｓ ＶＢａｓｅデータベース（Ｌｅｆｒａｎｃ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１：３０７−３１０；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、抗体エンジニアリング用バイオインフォマティクスツール（治療抗体ハンドブック中の）、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ（２００７）、ｐｐ．１０４−１０７）からアクセス可能である。
本明細書で使われる、生殖系列セグメントに関連する「グループ」は、免疫グロブリン由来のコアコード領域、すなわち、重鎖または軽鎖をコードする可変（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子、連結（Ｊ）遺伝子または定常（Ｃ）遺伝子、を指す。代表的な生殖系列セグメントグループには、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、Ｊκ、ＶλおよびＪλが含まれる。
本明細書で使われる生殖系列セグメントに関連する「サブグループ」は、ヌクレオチド配列類似性または同一性により定まる一連の配列を指す。一般的には、サブグループは、所与の種における同じグループ［Ｖ、Ｄ、ＪまたはＣ］に属する一連の遺伝子で、ヌクレオチドレベルで少なくとも７５％の同一性を共有する。サブグループは、ＩＭＧＴ命名法（ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ；例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００８）バイオインフォマティクス・ブリーフィング、９：２６３−２７５、参照）に基づいて分類される。通常、サブグループは、多重遺伝子ファミリーを表す。
本明細書で使われる遺伝子の対立遺伝子は、参照遺伝子配列に比較して、コード領域中の１つまたは複数のヌクレオチドの差異（例えば、置換、挿入または欠失）による配列多型性を有する生殖系列配列を指す。従って、同じサブグループに属するＩＧ配列は、それらのコード配列が高度に類似しているが、それにも関わらず、高い多形性を示しうる。サブグループ対立遺伝子は、ＩＭＧＴ命名法に基づいて分類され、アステリスク（＊）とそれに続く２つの図番号が付加される。
本明細書で使われる生殖系列セグメントに関連する「ファミリー」は、アミノ酸配列類似性または同一性により定まる一連の生殖系列セグメント配列を指す。通常、生殖系列ファミリーには、遺伝子の全対立遺伝子が含まれる。
本明細書で使われる生殖系列セグメントのヌクレオチドに関連する反転配列は、遺伝子セグメントが、ヌクレオチドの参照配列の逆相補配列であるヌクレオチドの配列を有することを意味する。
本明細書で使われる「編集（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）」、「編集する（ｃｏｍｐｉｌｅ）」、「組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｅ）」、「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」、「再構成する（ｒｅａｒｒａｎｇｅ）」、「再構成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）」、または他の類似の用語またはその文法的変化は、生殖系列セグメントが整えられ、または組み立てられて遺伝子を表す核酸配列になるプロセスを指す。例えば、コンビナトリアル法では、可変重鎖生殖系列セグメントは、ＶＨセグメントがＤＨセグメントに対し５’となり、またＤＨセグメントがＪＨセグメントに対し５’となるように組み立てられ、その結果、ＶＨ鎖をコードする核酸配列が得られる。可変軽鎖生殖系列セグメントは、ＶＬセグメントがＪＬセグメントに対し５’となるように組み立てられ、それにより、ＶＬ鎖をコードする核酸配列が得られる。１つまたは複数の定常遺伝子セグメントも、また、ＶＨまたはＶＬ鎖をコードする核酸の３’末端上に組み立てることができる。
本明細書で使われる生殖系列セグメントに関連する「結合された（ｌｉｎｋｅｄ）」、または「結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」または他のその文法的変化は、生殖系列セグメントの連結を指す。結合は、直接的でも間接的でもよい。生殖系列セグメントは、セグメント間に追加のヌクレオチドなしに直接結合可能であり、または追加のヌクレオチドを加えて、全体セグメントをインフレームにする、もしくはヌクレオチドを欠失させ、生じたセグメントをインフレームにすることが可能である。コンビナトリアル抗体ライブラリーを生成する方法では、生じた核酸分子がインフレームであり、機能的かつ増殖性抗体をコードするように、リンカーヌクレオチドの選択がなされることを理解されたい。
本明細書で使われる、ヒト生殖系列セグメントの結合に関連する「インフレーム」または「結合されたインフレーム」は、生じた核酸分子を５’開始コドン（ＡＴＧ）を有するインフレームにし、それにより、「増殖性」または機能的完全長ポリペプチドを産生するために、連結された接合部のヌクレオチド生殖系列セグメント内に挿入および／または欠失があることを意味する。生殖系列セグメントに対し挿入する、または欠失させるヌクレオチドの選択、特に、可変ＶＤ、ＤＪおよびＶＪセグメントを連結する接合部での選択は、本明細書の方法で提供されたＶ（Ｄ）Ｊ接合部生成のための規則に従っている（詳細は米国特許仮出願第６１／１９８、７６４号および同６１／２１１、２０４号に記載されている）。例えば、生殖系列セグメントは、ＶＨセグメントがＤＨセグメントに対し５’となり、ＤＨセグメントがＪＨセグメントに対し５’となるように、組み立てられる。ＶＨおよびＤＨの連結の接合部、ならびにＤＨおよびＪＨセグメントの連結の接合部で、生じた連結したＶＤＪセグメントを含む核酸分子が５’開始コドン（ＡＴＧ）を有するインフレームとなるように、ヌクレオチドを個々のＶＨ、ＤＨまたはＪＨセグメントに対し挿入する、または欠失させることができる。
本明細書で使われる抗体またはその一部をコードする核酸に関連する「機能的抗体」または「増殖性抗体」は、コンビナトリアル法により産生された核酸分子によりコードされている抗体またはその一部、例えば、Ｆａｂ、を指す。機能性または増殖性抗体では、Ｖ（Ｄ）Ｊ生殖系列セグメントは、コードされた抗体またはその一部が切断されないように、および／またはアミノ酸配列が読み枠から外れないように、編集される（すなわち、再構成される）。これは、タンパク質翻訳機械にタンパク質構築を時期尚早に停止させる内部停止コドンを核酸分子が含まないことを意味する。
本明細書で使われる、対応する残基に関連する対応、例えば、「に対応するアミノ酸残基」は、関連配列（例えば、対立遺伝子変異体、同じファミリーの遺伝子、種の変異体）の２つのポリペプチドの内または間で比較した、残基を指す。当業者なら、ポリペプチドの間、または内で対応する残基を容易に特定することができる。例えば、２つの配列を比較することにより、当業者なら、保存された、および等価なアミノ酸をガイドとして使用して、対応する残基を特定できる。当業者なら、マニュアルで配列を整列比較することができ、または多数の入手可能なプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）のいずれかを使用することができる。従って、相互に対応するアミノ酸残基または位置は、配列および／または特定の参照ポリペプチドとの構造的配列比較に基づき、相互に対応することがわかった残基である。
本明細書で使われる「選別」は、抗体またはその一部の活性または特性の測定に基づき、複数の抗体、例えば、抗体および／またはその一部の収集またはライブラリーからの、抗体またはその一部の特定または選択を指す。選別は、例えば、抗体の標的タンパク質に対する直接結合（例えば、結合親和性）を評価するアッセイ、または標的タンパク質の活性調節を評価する機能的アッセイ、を含む種々の方法のいずれかにより行うことができる。
本明細書で使われる用語の評価（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）は、抗体またはその一部の標的タンパク質に対する結合、および／または標的タンパク質の抗体またはその一部による活性の調節、および、また、指数、比率、パーセンテージ、目視のまたは他の結合または活性のレベルを示す値、の取得のために、絶対値取得という意味での定量的および定性的測定を含むことが意図されている。評価は、直接的でも間接的でもよい。例えば、結合は、検出可能な標識による抗体またはその一部の直接標識化により、および／またはそれ自体を標識した二次抗体を使うことにより、測定可能である。さらに、機能的活性は、当業者に既知の種々のアッセイ、例えば、増殖、細胞障害性および本明細書記載の他の方法のいずれかを使って、抗体またはその一部の存在と非存在の対比下で標的タンパク質の活性を比較することにより、測定可能である。
本明細書で使われる、抗体またはその一部の標的タンパク質機能活性の効果に関連する「調節する」または「調節」および他のそれの種々の文法的変化型は、活性増加、例えば、誘導または活性の増強、ならびに標的タンパク質の１つまたは複数の活性の抑制を指す。従って、調節には、活性の増加（すなわち、上方制御またはアゴニスト活性）、活性の減少（すなわち、下方制御または抑制）またはいずれかの他の活性の変化（例えば、周期性、頻度、持続期間、動力学または他のパラメータの変化）が含まれうる。調節は、状況依存的である可能性があり、通常、調節は設計された状態、例えば、野生型タンパク質、恒常的状態のタンパク質、または設計された細胞型または状態で発現したたんぱく質、と比較される。標的タンパク質の機能活性は、抗体またはその一部が存在しない条件下の標的タンパク質の活性に比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％超だけ抗体またはその一部により調節されうる。
本明細書で使われるＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ４（ＤＬＬ４）は、Ｎｏｔｃｈ受容体１および４用のリガンドであるタンパク質を指す。ＤＬＬ４には、下記のいずれかのＤＬＬ４ポリペプチドが含まれる（これに限定されない）：組換えで産生したポリペプチド、合成で産生したポリペプチド、ネイティブＤＬＬ４ポリペプチド、および内皮細胞を含む細胞または組織から抽出したＤＬＬ４ポリペプチド。また、ＤＬＬ４には、ヒトおよび非ヒト起原の動物（これに限定されない）を含む、異なる種由来の関連ポリペプチドが含まれる。ヒトＤＬＬ４には、ＤＬＬ４、対立遺伝子変異体アイソフォーム、核酸由来合成分子、ヒト組織および細胞から単離されたタンパク質、およびその改変型が含まれる。代表的ＤＬＬ４ヒトには、配列番号２９０４で設定されるアミノ酸配列を有し、配列番号２９０５で設定されるヌクレオチドの配列によりコードされたＤＬＬ４が含まれる。本明細書の目的のためには、ＤＬＬ４への参照は、別に定めがなければ、通常は、ヒトＤＬＬ４への参照である。
本明細書で使われる「活性化因子」、例えば、「アゴニスト」または「活性化因子／モジュレーター」は、シグナル伝達活性または他の受容体の機能活性を、増強するか、誘導するか、そうでなければ高めることにより調節する抗体またはその一部を指す。活性化因子、例えば、アゴニストまたは活性化因子／モジュレーターは、単独で使用した場合、シグナル伝達または他の機能活性を調節または高めることができるか、またはリガンド単独の場合に比べ、天然の受容体のリガンド、もしくは他の受容体刺激物質の存在下で、シグナル伝達または他の機能活性を変えて、受容体によりシグナル伝達を強化することができる。活性化因子には、アゴニストまたは活性化因子／モジュレーターが含まれる。
本明細書で使われる「アゴニスト」は、内在性リガンドの活性を模倣し、内在性リガンドに置き換わることができる抗体またはその一部を指す。
本明細書で使われる「モジュレーター／活性化因子」は、標的基質のアロステリック部位に結合し、そのリガンドによる受容体の活性化を変える、例えば、高める抗体またはその一部を指す。
本明細書で使われる「アロステリック部位」は、リガンド／受容体相互作用を付与する部位ではないが、抗体またはその一部によって結合された場合、標的基質の活性を変える標的基質上の部位である。
本明細書で使われる「アンタゴニスト」は、シグナル伝達活性または他の受容体の機能活性を遮断または低減することによってシグナル伝達または他の受容体の機能活性を調節する抗体またはその一部を指す。
本明細書で使われるオフレート（ｋｏｆｆ）は、その抗原から抗体が解離する速度である。
本明細書で使われるオンレート（ｋｏｎ）は、抗体が抗原に結合する速度である。
本明細書で使われる「半減期」（ｔ１／２）または「解離半減期」は、最初に存在するタンパク質−リガンドまたは基質−抗体複合体の半分が解離する時間を指す。これは、Ｌｎ（２）／ｋｏｆｆとして表される。
本明細書で使われる「抗原結合部位を形成するのに充分な抗体またはその一部」への参照は、抗体またはその一部が全６ＣＤＲを含む対応する完全長抗体の少なくとも一部の結合特異性を保持するのに充分な、ＶＨおよびＶＬの少なくとも１または２、通常は３、４、５または全６のＣＤＲを含むことを意味する。通常、充分な抗原結合部位には、少なくとも重鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）が必要である。通常は、さらに軽鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）が必要である。本明細書記載のように、当業者なら、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａナンバリングに基づいてＣＤＲを理解し、特定することができる（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）免疫学的関連タンパク質の配列、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、を参照）。例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくと、ＣＤＲ−ＬＩは、残基Ｌ２４〜Ｌ３４に相当する；ＣＤＲ−Ｌ２は、残基Ｌ５０〜Ｌ５６に相当する；ＣＤＲ−Ｌ３は、残基Ｌ８９〜Ｌ９７に相当する；ＣＤＲ−Ｈ１は、残基Ｈ３１〜Ｈ３５、３５ａまたは３５ｂに相当する（長さに応じて）；ＣＤＲ−Ｈ２は、残基Ｈ５０〜Ｈ６５に相当する；ならびにＣＤＲ−Ｈ３は、残基Ｈ９５〜Ｈ１０２に相当する。
本明細書で使われる標識は、分子に直接的または間接的に付着または結合または会合させることが可能な、検出可能マーカーである。検出方法は、当技術分野で既知のいずれの方法でもよい。
本明細書で使われるヒトタンパク質は、ヒトゲノム中に存在する核酸分子、例えば、ＤＮＡによってコードされるたんぱく質で、全対立遺伝子変異体およびその保存された変種を含む。改変がヒトタンパク質の野生型または主要な配列に基づく場合は、タンパク質改変変異体は、ヒトタンパク質である。
本明細書で使われる「天然アミノ酸」は、ポリペプチドで発生する２０のＬ−アミノ酸を指す。残基は、ヒト中で、その同族のｍＲＮＡコドンを使った負荷ｔＲＮＡ分子の特異的認識によりタンパク質に組み込まれる天然に存在する２０のα−アミノ酸である。
本明細書で使われる非天然アミノ酸は、遺伝的にコードされないアミノ酸を指す。例えば、非天然アミノ酸は、天然アミノ酸に類似の構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に改変されている有機化合物である。非天然アミノ酸は、従って、例えば、２０天然アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体で、アミノ酸のＤ−イソステレオマーを含む（これに限定されない）。代表的非天然アミノ酸は、当業者に既知である。
本明細書で使われる核酸には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびその混合物を含むＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似体が含まれる。核酸は、単鎖でも二重鎖でもよい。任意選択で検出可能標識、例えば、蛍光または放射標識等で標識付けした、プローブまたはプライマーを参照する場合、単鎖分子が意図されている。このような分子は、通常、ライブラリーの探査または初回刺激に対して、その標的が統計的にユニークであるか、または小コピー数であるような長さ（典型的には、５未満、一般的には、３未満）である。一般的には、プローブまたはプライマーは、対象遺伝子に対し配列相補的なまたは同等な少なくとも１４、１６または３０の近接ヌクレオチドを含む。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００またはそれ以上の核酸長さであってもよい。
本明細書で使われるペプチドは、２〜４０アミノ酸長さのポリペプチドを指す。
本明細書で使われている、本明細書で提供される種々のアミノ酸配列中で現れるアミノ酸は、既知の３文字または１文字省略（表１）に従って特定される。種々の核酸断片中に現れるヌクレオチドは、当技術分野で日常的に使われる標準的な単一文字名称で示される。
本明細書で使われる「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸を含む。本明細書の目的に対しては、アミノ酸には、２０の天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体（すなわち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸）が含まれる。
本明細書で使われる「アミノ酸残基」は、そのペプチド結合位置でポリペプチドの化学的消化（加水分解）により形成されたアミノ酸を指す。本明細書記載のアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体であると想定されている。「Ｄ」と指定されている異性体の残基は、ポリペプチドの所望の機能特性が保持されている限り、いずれかのＬ−アミノ酸残基で置換可能である。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４３：３５５７−３５５９（１９６８）に記載され、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２、で採用された、標準的ポリペプチド命名法に従った、アミノ酸残基の省略を表１に示す。
Figure 0006007420
本明細書で式により表現される全アミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への通常の方向の、左から右への配列であることに注意しなければならない。さらに、語句の「アミノ酸残基」は、対応表（表１）に挙げられたアミノ酸ならびに改変された、および他とは異なるアミノ酸、例えば、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２（参照により本明細書に組み込まれる）で参照されているものを含むように広義に定義されている。さらに、アミノ酸残基配列の先頭または末端にあるダッシュは、アミノ末端基、例えば、ＮＨ２への、またはカルボキシル末端基、例えば、ＣＯＯＨへの１つまたは複数のアミノ酸残基の追加配列に対するペプチド結合を示すことに注意すべきである。任意の保護基、アミノ酸および他の化合物に対する省略は、特に指示がなければ、それらの通常の使用法、認められている略号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法に関する委員会（（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：１７２６、参照）に従う。各天然Ｌ−アミノ酸は、標準的な３文字コード（もしくは１文字文字コード）または接頭辞「Ｌ−」と共に標準的な３文字コード（もしくは１文字コード）によって特定される。接頭辞「Ｄ−」は、アミノ酸の立体異性体がＤであることを示す。
本明細書で使われる等速性混合物は、アミノ酸のモル比が、報告されている反応速度に基づいて調製されている混合物である（例えば、Ｏｓｔｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．、（１９９４）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３４：１６８１、参照）。
本明細書で使われる改変は、ポリペプチドのアミノ酸配列の改変への、または核酸分子中のヌクレオチド配列の改変への参照であり、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入、および置換をそれぞれ含む。ポリペプチドの改変方法は、当業者には日常的作業であり、例えば、組換えＤＮＡ法を使って行われる。
本明細書で使われる適切なアミノ酸の保存的置換は、当業者には既知で、通常、生成した分子の生物活性を変えることなく実行できる。当業者には、一般的に、ポリペプチドの非必須領域での単一アミノ酸置換は、生物活性を実質的に変えないことがわかっている（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．遺伝子の分子生物学、第４版、１９８７、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．ｃｏ．、ｐ．２２４、参照）。このような置換は、以下の表２で定められている内容に従って行うことができる。
Figure 0006007420
 他の置換も許容でき、経験的に、または既知の保存的置換に従って決定できる。
本明細書で使われるＤＮＡ構築物は、単鎖または二重鎖の、天然には無い方式で組み合わされ、並置されたＤＮＡのセグメントを含む直鎖または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、ヒト操作の結果として存在し、クローンおよび他の操作された分子のコピーを含む。
本明細書で使われるＤＮＡセグメントは、特定の属性を有するより大きなＤＮＡ分子の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、より長いＤＮＡ分子、例えば、プラスミドまたはプラスミド断片の一部であり、これは、５’から３’方向へ読み取られた場合、特定のポリペプチドのアミノ酸配列をコードしている。
本明細書で使われる用語の「核酸」は、単鎖および／または二重鎖ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、およびリボ核酸（ＲＮＡ）ならびにＲＮＡまたはＤＮＡの類似体または誘導体を指す。また、用語の「核酸」には、核酸の類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ、および他のこのような類似体および誘導体またはこれらの組み合わせが含まれる。核酸は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を指すこともできる。また、この用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体、単鎖（センスまたはアンチセンス）および二重鎖ポリヌクレオチドから作られたＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、変異体および類似体を含む。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジン、が含まれる。ＲＮＡに対しては、ウラシル塩基はウリジンである。
本明細書で使われる「コードする核酸分子」は、特異的タンパク質またはペプチドの発現を指示する核酸分子を指す。核酸配列には、ＲＮＡ中へ転写されるＤＮＡ鎖配列およびタンパク質またはペプチド中へ転写されるＲＮＡ配列の両方が含まれる。核酸分子には、完全長成熟ポリペプチド、例えば、前駆体配列の欠けた完全長ポリペプチド由来の完全長核酸配列ならびに非完全長配列の両方が含まれる。本明細書の目的のためには、核酸配列は、また、ネイティブ配列の縮重コドンまたは特異的宿主でのコドン選択を提供するために導入可能な配列も含む。
本明細書で使われる用語の「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２つの結合ヌクレオチド、またはヌクレオチド誘導体を含むオリゴマーまたはポリマーを指し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびＤＮＡまたはＲＮＡ誘導体を含む。これらには、例えば、ヌクレオチド類似体またはリン酸ジエステル結合以外の「バックボーン」結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホルアミダート結合、ホホロチオアート結合、チオエステル結合、またはペプチド結合（ペプチド核酸）が含まれる。また、用語の「オリゴヌクレオチド」は、本明細書では、基本的に「ポリヌクレオチド」の同義語として使用されるが、当業者は、オリゴヌクレオチド、例えば、ＰＣＲプライマー、は通常、約５０から１００ヌクレオチドの長さ未満であることを認識している。
ポリヌクレオチドには、例えば、ポリヌクレオチドの大量分化を可能とする大量改変ヌクレオチド；ポリヌクレオチドの検出を可能とする検出可能標識、例えば、蛍光、放射性、ルミネセンスもしくは化学発光標識を含むヌクレオチド；またはポリヌクレオチドの固体支持体への固定化を促進する反応性基、例えば、ビオチンもしくはチオール基を含むヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体が含まれうる。また、ポリヌクレオチドには、選択的に開裂する、例えば、科学的に、酵素的に、または光分解的に開裂する１つまたは複数のバックボーン結合が含まれる。例えば、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド、続いて、１つまたは複数のリボヌクレオチド、さらにこれに続く、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド、を含むことが可能で、このような配列はリボヌクレオチド配列の位置で塩基加水分解により切断可能である。また、ポリヌクレオチドは、例えば、キメラオリゴヌクレオチドプライマー等の、相対的に開裂に対し耐性のある１つまたは複数の結合を含んでもよく、これはペプチド核酸結合により連結されたヌクレオチドおよび３’末端位置の少なくとも１つのヌクレオチドを含むことが可能で、リン酸ジエステル結合または他の適切な結合により結合されており、ポリメラーゼにより延長できる。ペプチド核酸配列は、よく知られた方法を使って調製可能である（例えば、Ｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２７９２−２７９９（１９９７）、参照）。
本明細書で使われる２つのタンパク質または核酸の間の「類似性」は、タンパク質のアミノ酸配列または核酸のヌクレオチド配列の間の関連性を指す。類似性は、残基の配列およびその中に含まれる残基の同一性および／または相同性の程度に基づいて考えることができる。タンパク質または核酸の間の類似性の程度を評価する方法は、当業者には既知である。例えば、配列類似性を評価する方法の１つの方法では、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列が、配列間で最大レベルの同一性が得られるように整列される。「同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列が不変である程度を指す。アミノ酸配列の整列化では（ヌクレオチド配列ではある程度）、アミノ酸（またはヌクレオチド）における保存の差異および／または高頻度置換を考慮に入れることもできる。保存の差異は、関連残基の物理化学的特性の保存の差異である。整列化は全体的（配列の全長にわたる、全残基を含む比較配列の整列化）であっても、局部的（最も類似性の高い領域または複数領域のみを含む配列の一部の整列化）であってもよい。
「同一性」それ自体は、当該分野で承認されている意味を有し、報告された技術を使って計算可能である（例えば、コンピュータによる分子生物学、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．、ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；配列データのコンピュータ分析、パートＩ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、ａｎｄＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；分子生物学における配列解析、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；および、配列解析プライマー、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１、を参照）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定する多くの方法が存在するが、用語の「同一性」は、当業者にはよく知られている（Ｃａｒｉｌｌｏ、Ｈ．＆ Ｌｉｐｔｏｎ、Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））。
本明細書で使われる相同（核酸および／またはアミノ酸配列に関して）は、約２５％より大きいか、または等しい配列相同性、典型的には、２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％より大きいか、または等しい配列相同性を意味する。必要に応じ、正確なパーセンテージを特定できる。本明細書の目的のためには、用語の「相同性」および「同一性」は、特に別に指示がなければ、同義に使用されることが多い。一般的には、パーセンテージ相同性または同一性の測定のために、最高順位のマッチが得られるように配列を整列させる（例えば、コンピュータによる分子生物学、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．、ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；配列データのコンピュータ分析、パートＩ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；分子生物学における配列解析、ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；および配列解析プライマー、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ４ ８：１０７３、参照）。配列相同性により、保存的アミノ酸の数が標準的整列化アルゴリズムプログラムにより求められ、このプログラムは、それぞれのサプライヤーにより確立された規定値のギャップペナルティを用いて使用可能である。大体の場合、相同核酸分子を対象核酸の全長に沿って、通常、中等度の厳密性または高い厳密性でハイブリダイズする。また、ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの代わりに縮重コドンを含む核酸分子も意図されている。
いずれかの２つの分子が、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の「同一性」または「相同」のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するかどうかは、既知のコンピュータアルゴリズム、例えば、「ＦＡＳＴＡ」プログラム、により、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４、の記載にあるように、規定値のパラメータを用いて決定可能である（他のプログラムには、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ １２（Ｉ）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．、ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３（１９９０））；巨大コンピュータへのガイド、Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４、およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３、が含まれる）。例えば、全米バイオテクノロジー情報センター・データベースのＢＬＡＳＴ関数は、同一性の測定に使用可能である。他の市販または公的に入手可能なプログラムには、ＤＮＡＳｔａｒ「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）が含まれる。タンパク質および／または核酸分子のパーセント相同性または同一性は、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラムを使って配列情報を比較することにより測定できる（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎによる改訂版（（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、参照）。簡単に述べると、ＧＡＰプログラムは、類似の整列化記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として類似性を求め、２つの配列の短い方の全記号数で除算する。ギャッププログラム用の規定値のパラメータには、次の項目が含まれる：（１）ＳｃｈｗａｒｔｚとＤａｙｈｏｆｆ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ、ｅｄｓ．、ＡＴＬＡＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＤ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ｐｐ．３５３‑３５８（１９７９））により記載されているように、単項比較マトリックス（同一性に対し１の値、非同一性に対し０の値を持たせる）およびＧｒｉｂｓｋｏｖの加重比較マトリックス（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５）；（２）各ギャップに対し３．０のペナルティ、および、それぞれのギャップ中の各記号に対し０．１０の追加のペナルティ；さらに（３）末端ギャップに対してはペナルティ無し。
従って、本明細書で使用される用語の「同一性」または「相同性」は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間での比較を意味する。本明細書で使われる用語の少なくとも「に対し９０％の同一性」は、参照核酸またはポリペプチドのアミノ酸配列に比べて９０〜９９．９９パーセントの同一性を指す。９０％以上のレベルの同一性は、例として、１００アミノ酸長さの試験および参照ポリペプチドが比較されることを仮定した場合、試験ポリペプチド中のアミノ酸の内の、わずかに１０％（すなわち、１００の内の１０）が、参照ポリペプチドの配列とは異なるという事実を示している。試験および参照ポリヌクレオチドの間で、類似の比較が可能である。このような差異は、ポリペプチド全長にわたりランダムに分布した点変異として表すことができ、または、それらは１つまたは複数の可変長さの部位中で、最大許容可能差異、例えば、１０／１００アミノ酸差異（約９０％同一性）まで、クラスター形成されうる。差異は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。約８５〜９０％を超える相同性または同一性のレベルで、結果は、プログラムおよびギャップパラメータセットとは無関係であるべきである；このような高いレベルの同一性は、ソフトウェアに頼ることなく、マニュアル配列比較により、容易に評価可能なことも多い。
本明細書で使われる整列化配列は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列中で対応する位置を整列させるために、相同性（類似性および／または同一性）を使用することを指す。通常、５０％以上同一性により関連付けられている２つ以上の配列が整列化させられる。整列化配列セットは、対応する位置で整列し、ＲＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ配列と整列させたＥＳＴおよび他のｃＤＮＡ由来の整列化配列を含むことができる２つ以上の配列を指す。
本明細書で使われる「プライマー」は、適切な条件下（例えば４つの異なるヌクレオシド三リン酸塩および重合試薬、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在下）、適切な緩衝液中の適切な温度で、テンプレート誘導ＤＮＡ合成の開始点として作用可能な核酸分子を指す。特定の核酸分子が、「プローブ」および「プライマー」として役立つことは好ましいでことあろう。しかし、プライマーは、延長用の３’ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、ＲＮＡ ＰＣＲ、ＬＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、パンハンドルＰＣＲ、キャプチャーＰＣＲ、発現ＰＣＲ、３’および５’ＲＡＣＥ、インサイチューＰＣＲ、連結反応仲介ＰＣＲおよび他の増幅プロトコルを含む種々の方法で使用可能である。
本明細書で使われる「プライマー対」は、増幅（例えば、ＰＣＲにより）される配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増幅される配列の３’末端の相補配列とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含む一連のプライマーを指す。
本明細書で使われる「特異的にハイブリダイズする」は、相補的な塩基対形成による、標的核酸分子に対する核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）のアニーリングを指す。当業者なら、特異的ハイブリダイゼーションを起こさせるインビトロおよびインビボパラメータ、例えば、特定の分子の長さおよび組成をよく知っている。特に、インビトロハイブリダイゼーションに関するパラメータには、アニーリングおよび洗浄温度、緩衝液組成ならびに塩濃度が、さらに含まれる。非特異的に結合した核酸分子を高い厳密性で除く代表的洗浄条件は、０．１ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃であり、中程度の厳密性の場合は、０．２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃である。等価な厳密性条件は、当技術分野で既知である。当業者なら、これらのパラメータを容易に調節し、特定の用途に適した、標的核酸分子に対する核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを成し遂げることができる。
本明細書で使われる、実質的に生成物に対し同じ、は充分に類似しており、対象特性が充分に未変化で、そのため、実質的に同じ生成物が、その生成物の代わりに使用できることを意味する。
本明細書で使われるように、用語「実質的に同じ」または「類似の」は、関連分野の専門家により理解されるように、文脈により変化することもまた、理解されよう。
本明細書で使われる、対立遺伝子変異体または対立遺伝子変異は、同じ染色体座位を占める２つ以上の代替形の遺伝子のいずれかを指す。対立遺伝子変異は、変異により自然に発生し、集団内の表現型多型を生じうる。遺伝子変異は、サイレント（コード化ポリペプチド中の無変化）であっても、変異アミノ酸配列を有するコード化ポリペプチドであってもよい。用語の「対立遺伝子変異体」は、また、本明細書で遺伝子対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すためにも使用される。通常、参照型の遺伝子は、種の集団または単一参照メンバー由来の野生型および／または優勢型のポリペプチドをコードする。通常、種の間、または種内の変異体を含む対立遺伝子変異体は、典型的には、同じ種由来の野生型および／または優勢型と少なくとも８０％、９０％またはそれを超えるアミノ酸同一性を有するが、同一性の程度は、遺伝子、および比較が種内または種間であるかどうかに依存する。通常、種間対立遺伝子変異体は、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のポリペプチドの野生型および／または優勢型との同一性を含む、少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のポリペプチドの野生型および／または優勢型との同一性を有する。本明細書の対立遺伝子変異体への参照は、通常、同じ種のメンバー中のタンパク質の変異を指す。
本明細書で使われるように、本明細書中で「対立遺伝子変異体」と同義に使われる「対立遺伝子」は、遺伝子またはその一部の代替形を指す。対立遺伝子は、相同染色体上の同じ座位または位置を占める。対象が２つの同じ遺伝子の対立遺伝子を有する場合、対象は、その遺伝子または対立遺伝子に対しホモ接合であると呼ばれる。対象が異なる遺伝子の対立遺伝子を有する場合対象は、その遺伝子に対しヘテロ接合であると呼ばれる。特異的遺伝子の対立遺伝子は、単一ヌクレオチドまたはいくつかのヌクレオチド中で相互に異なっていてもよく、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含むことができる。遺伝子の対立遺伝子は、また、変異を含む遺伝子の形であってもよい。
本明細書で使われる種変異体は、例えば、マウスとヒト、等の異なる哺乳類種を含む、異なる種の中でのポリペプチドの変異体を指す。
本明細書で使われるスプライス変異体は、１つまたは複数のタイプのｍＲＮＡを生ずるゲノムＤＮＡの１次転写物のディファレンシャルプロセッシングにより産生された変異体を指す。
本明細書で使われる用語のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の一部を意味する。プロモーター配列は、いつもではないが、通常は、遺伝子の５’非コード領域に存在する。
本明細書で使われる、単離もしくは精製ポリペプチドまたはタンパク質もしくは生物学的に活性なその一部は、細胞性材料または他のそのタンパク質が得られた細胞もしくは組織由来の混入タンパク質が実質的に無い、または化学前駆物質もしくは他の科学的に合成された場合の化学物質が実質的に無いことを意味する。このような純度を評価するのに当業者により使われる標準的な分析方法、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動法および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定して、容易に検出可能な不純物がない様に見える場合に、または、それ以上の精製によって物質の物理的および化学的特性、例えば、酵素的および生物活性の変化が検出できない程度に充分純粋な場合に、調製物は実質的に何も含まないと判定できる。実質的に、化学的に純粋な化合物を製造する化合物の精製方法は、当業者には既知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であってもよい。このような場合には、さらなる精製を行えば、化合物の特異的活性が高まることになろう。
用語の細胞性物質が実質的に無い、は、タンパク質が、それが単離された、または組換えで産生された細胞の細胞性成分から分離されているタンパク質の調製を含む。一実施形態では、用語の細胞性物質が実質的に無い、には、約３０％（乾燥重量で）未満の非プロテアーゼタンパク質（本明細書では、混入タンパク質とも呼ばれている）、通常、約２０％未満の非プロテアーゼタンパク質または１０％の非プロテアーゼタンパク質または約５％未満の非プロテアーゼタンパク質、を有するプロテアーゼタンパク質の調製が含まれる。プロテアーゼタンパク質または活性なその一部が組換えにより産生される場合、また、それは、実質的に培地が無く、すなわち、培地はプロテアーゼタンパク質調製物の容量の約またはちょうど２０％、１０％もしくは５％未満である。
本明細書で使われる用語の化学前駆物質または他の化学物質が実質的に無い、は、タンパク質が、タンパク質の合成に関与する化学前駆物質または他の化学物質から分離されているプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。この用語は、約３０％（乾燥重量で）２０％、１０％、５％またはそれより少ない値未満の化学前駆物質または非プロテアーゼ化学物質または成分を有するプロテアーゼタンパク質調製物を含む。
本明細書で使われる、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子、または合成ペプチド、に関連する「合成」は、組換え法および／または化学合成法により産生される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
本明細書で使われる、組換えＤＮＡ法を使った組換え型による産生法、は、クローンＤＮＡによりコードされたタンパク質を発現するためのよく知られた分子生物学の方法の使用を意味する。
本明細書で使われるベクター（またはプラスミド）は、発現またはその複製を目的として、異種の核酸を細胞中に導入するために使われる個別要素を指す。ベクターは、通常、エピソームとして残るが、遺伝子またはその一部をゲノムの染色体へ統合させるように設計可能である。また、人工染色体、例えば、酵母人工染色体および哺乳類人工染色体であるベクターも意図されている。このようなビークルの選択と使用は当業者にはよく知られている。
明細書で使われる発現ベクターには、調節配列、例えば、プロモーター領域、と作動可能なように連結されたＤＮＡを発現することができるベクターを含み、この調節配列は、このようなＤＮＡ断片を発現させることが可能である。このような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含むことができ、また任意選択で、１つまたは複数の複製起点、１つまたは複数の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、等を含むことができる。発現ベクターは、通常、プラスミドまたはウイルスＤＮＡ由来であり、両方の要素を含んでもよい。従って、発現ベクターは、適切な宿主細胞中への導入に際し、クローンＤＮＡの発現がもたらされる組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例えば、プラスミド、ファージ、組換え型ウイルスまたは他のベクターを指す。適切な発現ベクターは、当業者にはよく知られており、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能な、エピソームとして残るか、または宿主細胞ゲノム中へ統合されるベクターが含まれる。
本明細書で使われるベクターには、また、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」が含まれる。ウイルス性ベクターは外因性の遺伝子を細胞内へ運ぶ（ビークルまたはシャトルとして）ために、作動可能なように外因性の遺伝子に連結された、操作されたウイルスである。
ＤＮＡセグメントを参照する場合に本明細書で使われる、作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｏｒ ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）は、意図された目的に呼応して機能する、例えば、プロモーター中で転写を開始し、コードセグメントを通してターミネーターまで進める、ようにそのセグメントが配置される、ことを意味する。
本明細書で使われる生物試料は、生きている、またはウイルス性ソースから入手したいずれかの試料を指し、核酸またはタンパク質または他の高分子が得られる任意の対象の細胞型または組織を含む。生物試料には、これに限定されないが、体液、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、関節液、尿および汗；動物および植物由来の組織および器官試料が含まれる。また、土壌および水試料ならびに他の環境的試料、ウイルス、細菌、真菌、藻類、原虫類およびその成分、が含まれる。従って、食品および環境の細菌性およびウイルス性およびその他の汚染が評価可能である。本明細書の方法は、生物試料を使って実行され、一部の実施形態では、例えば、プロファイリングを目的としても、任意の試料の試験に使用可能である。
本明細書で使われる高分子は、数百〜数百万の分子量の任意の分子を指す。高分子には、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、および通常は、生物学的有機体により合成されるが、合成により、または組換え型分子生物的方法を使って調製することができる他の分子、が含まれる。
本明細書で使われる組成物は、任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉体、ペースト、水性、非水性またはこれらのいずれかの組み合わせ、であってよい。
本明細書で使われる、組み合わせ、は、２つ以上の要素の間、またはその内の任意の結びつきを指す。組み合わせは、２つ以上の離れた要素、例えば、２つの組成物または２つの収集であってもよく、それらの混合物、例えば、２つ以上の要素の単一混合物、またはそれらの任意の変形、であってもよい。
本明細書で使われる、キットは、パッケージ化された組み合わせを指し、任意選択で、インストラクションおよび／または使用する試薬を含む。
本明細書で使われる薬効または治療効果は、疾患または障害の治療またはその症状の改善を意図した試薬の投与に際し、観察される効果を指す。
本明細書で使われる「疾患または障害」は、感染、後天性条件、遺伝的条件（これらに限定されない）を含む原因または条件により生じた生物体の病理学的状態および特定可能な症状を特徴とする状態を指す。本明細書の対象の疾患および障害は、標的タンパク質が病因学または病理学における役割を果たすものを含む特異的標的タンパク質を伴うものである。代表的標的タンパク質および関連疾患と障害は、本明細書の他の場所に記載されている。
本明細書で使われる血管新生疾患（または血管新生関連疾患）は、血管新生のバランスが変えられているか、またはそのタイミングが変えられている疾患である。血管新生疾患には、血管新生の変化、例えば、望ましくない血管新生、が発生している疾患が含まれる。このような疾患には、これに限定されないが、癌を含む細胞増殖性疾患、糖尿病性網膜症および他の糖尿病合併症、炎症性疾患、子宮内膜症、加齢黄斑変性および他の当技術分野で既知の、または本明細書の別のところで述べられている疾患を含む過剰血管新生が疾患プロセスの一部である疾患が含まれる。
本明細書で使われる、何らかの疾患または状態の患者の「治療」は、患者の症状が、部分的にもしくは全く軽減された、または治療後変化しないままであることを意味する。従って、治療は予防、治療および／または治癒を包含する。予防は、潜在的な疾患および／または疾患の症状の悪化または進行の予防を指す。また、治療は、改変インターフェロンおよび本明細書で提供される組成物のいずれかの医薬品の使用を包含する。
本明細書で使われる治療薬、治療法、放射線防護剤、または化学療法剤は、当業者には既知の、ワクチン剤を含む通常の薬剤および薬物療法、を意味する。放射線療法剤は当技術分野でよく知られている。
本明細書で使われる治療は、状態、障害もしくは疾患または他の徴候の症状が、回復するか、またはそうでなければ有益な方向に変化するいずれかの方法を意味する。
本明細書で使われる治療効果は、患者の治療から得られた効果を意味する。この効果は、疾患もしくは状態の症状を、変える、通常は、改善するか、または回復する、または状態を治癒する。治療有効量は、患者に対する投与後、治療効果を生ずる組成物、分子または化合物の量を指す。
本明細書で使われる用語「患者」は、人類等の哺乳動物を含む動物を指す。
本明細書で使われる患者は、ヒトの患者を指す。
本明細書で使われる、治療、例えば、医薬組成物または他の治療薬の投与、による特定の疾患または障害の症状の改善は、永久的であれ一時的であれ、継続的であれ一過性であれ、組成物または治療薬の投与に起因するか、または関連する症状の低減を指す。
本明細書で使われる、予防または予防法は、疾患または状態を進展させるリスクを減少させる方法を指す。
本明細書で使われる、有効量は、疾患または障害の症状の予防、治療、改善、抑止または部分的抑止に必要な治療薬の量である。
本明細書で使われる、投与は、抗体またはその一部を、その標的タンパク質と接触させるいずれかの方法を指す。投与は、インビボまたはエクスビボまたはインビトロで行うことができる。例えば、エクスビボ投与に対しては、体液、例えば、血液、が患者から取り出し、体外で抗体またはその一部と接触させる。インビボ投与に対しては、抗体またはその一部が体内に、例えば、局部的、局所的、全身性および／または他の導入経路により体内に導入可能である。インビトロ投与は、細胞培養法、等の方法を包含する。
本明細書で使われる、単位投与剤形は、ヒトおよび動物に適切な物理的に離散性の単位を指し、当技術分野で既知のように、個別にパッケージされている。
本明細書で使われる、単回投与製剤は、直接投与用の製剤を指す。
本明細書で使われる「製品」は、作られて販売される生成物である。本出願全体を通して使われる用語は、パッケージング製品に含まれる、まとめられた生殖系列抗体またはそれから得られた抗体を包含することが意図されている。
本明細書で使われる、流体は、流れることができる任意の組成物を指す。従って、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性の混合物、ゲル、ローション、クリームの形の組成物およびその他のこのような組成物を含む。
本明細書で使われる動物には、任意の動物、例えば、これに限定されないが、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長類；げっ歯類、例えば、マウスおよびラット；家禽、例えば、ニワトリ；反芻動物、例えば、ヤギ、雄ウシ、シカ、ヒツジ；哺乳動物、例えば、ブタおよび他の動物、が含まれる。非ヒト動物では、ヒトが意図された動物として除外される。本明細書で提供される生殖系列セグメントおよび得られた抗体は、動物、植物、原核生物および真菌、のいずれかのソース由来である。大抵の生殖系列セグメントおよび得られた抗体は、哺乳類由来を含む動物由来である。
本明細書で使われる対照は、試験パラメータで処理されていないことを除き、または、それが血漿試料の場合は、それは対象の疾患に罹患していない正常なボランティア由来でありうることを除き、実質的に試験試料と同等な試料を指す。また、対照は、内部対照であってもよい。
本明細書で使われる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、複数の参照物を含む。従って、例えば、「細胞外のドメイン（ａｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）」を含む化合物への参照は、１つまたは複数の細胞外のドメインを含む化合物を包含する。
本明細書で使われる範囲と量は、「約」特定の値または範囲として表現している。また、約は、正確な量を含む。従って、「ａｂｏｕｔ ５ ｂａｓｅｓ」は、「約５塩基（ａｂｏｕｔ ５ ｂａｓｅｓ）」および「５塩基（５ ｂａｓｅｓ）」も意味する。
本明細書で使われる「任意選択の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意選択で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、それに続いて記載されたイベントまたは状況が発生しているか、または発生していないこと、および、その記載は、前記イベントまたは状況が発生する場合、およびそれが発生しない場合を含むことを意味する。例えば、「任意選択で置換される基」では、基は未置換であるか、または置換されていることを意味する。
本明細書で使われる任意の保護基、アミノ酸および他の化合物に対する省略は、別に定めが無ければ、それらの通常の使用法、認められている省略、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法に関する委員会（（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：１７２６、参照）に従う。
Ｂ．方法の概要
本明細書で、所望の親和性および活性を持つ抗体の選択方法が提供される。この方法には、親和性成熟および抗体変換法が含まれる。この方法は、抗体を操作するために使用し、それにより、アンタゴニスト抗体、部分アンタゴニスト抗体、アゴニスト抗体および／または活性化因子／モジュラー抗体としての抗体を特定または選択することができる。特定の経路を「調節する」能力は、完全にそれを阻害するのとは対照的に、タンパク質治療薬としての利点となると思われる。例えば、薬理学的に、高親和性相互作用による経路を「オン」または「オフ」する能力は、「可変抵抗器」ベースの治療薬による経路の調節よりも、望ましくないであろう。他の例では、高親和性を有する抗体は望ましい。
本方法の実施により生成した親和性に基づくまたは活性に基づく抗体は、１つまたは複数の標的タンパク質に対する特異性を理由に、例えば、種々のインビトロおよびインビボでの適用を含む所望のいずれかの用途または目的のために使用可能である。その多様性、特異性およびエフェクター機能のために、抗体は、タンパク質ベース治療薬に対する魅力的な候補である。従って、本明細書で提供される、所望の親和性、特異性および／または活性を有する抗体を生成する方法は、それらの治療抗体としての使用を可能にする。例えば、抗体は、抗体が調節可能な特定の標的タンパク質の発現または活性化に関連する疾患または障害の治療のための治療方法およびその他の用途に使うことができる。
１．抗体ポリペプチド
本明細書で提供される方法では、変異誘発は、通常、抗体の可変領域上で行われる。従って、本明細書で提供される方法を使って、親和性変換または親和性成熟用に選択された親抗体は、抗体が充分な抗体結合部位を含む限りにおいて、通常は最小限度で、全てのまたは一部の可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）鎖を含む。しかし、本方法の実施により使用される、または得られるいずれかの抗体は、全てのまたは一部の定常重鎖（例えば、１つまたは複数のＣＨドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４および／または定常軽鎖（ＣＬ））を含むように作製可能であることは、理解されよう。従って、本明細書の親和性変換または親和性成熟に供された抗体は、完全長抗体を含み、また、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ならびにｓｃＦａｂ断片を含む断片またはその一部を含む。例えば、本明細書の親和性変換抗体または親和性成熟抗体は、Ｆａｂを含む。
当業者なら抗体の構造、配列および機能を理解できる。抗体の構造、配列および機能の一般的説明を以下に提供する。
ａ．抗体構造および機能
抗体は、膜結合型かつ分泌型としてＢ細胞により天然に産生される。また、天然に産生される抗体に加えて、抗体には、合成的に、すなわち、組換えで産生された抗体、例えば、抗体断片、も含まれる。抗体は、抗原エピトープを特異的に認識し、同族相互作用により結合する。同族の抗原に対する抗体結合により複数のエフェクター機能を開始でき、これにより、毒素、病原体および他の感染性病原体の中和とクリアランスが起こる。抗体特異性の多様性は、Ｂ細胞成長の間の組換えイベントにより自然に生ずる。これらのイベントにより、抗体分子の可変領域をコードする複数の抗体Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの様々な組み合わせが定常領域遺伝子と結合され、多数の多様な抗体を有する天然の抗体レパートリーを生成する。ヒト抗体レパートリーは、１０１０を超える異なる抗原特異性を含み、従って、理論的には、どのような外部抗原も特異的に認識可能である。
完全長抗体は、４つのポリペプチド鎖、２つの等価な重（Ｈ）鎖（通常、それぞれ、約４４０アミノ酸を含む）および２つの等価な軽（Ｌ）鎖（それぞれ、約２２０アミノ酸を含む）を含む。軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの異なる形で存在する。各鎖は、可変（Ｖ）および定常（Ｃ）領域ドメイを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインとして組織化された一連のドメインにまとめられる。軽鎖は、Ｃ領域（ＣＬ）および可変領域（ＶＬ）に対応する２つのドメインを有する。重鎖は、４つのドメインの可変領域（ＶＨ）およびＣ領域中に３つまたは４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）、および一部のケースではヒンジ部を有する。４つの鎖（２つの重鎖と２つの軽鎖）は、共有結合（ジスルフィド）および非共有結合により一緒に保持されている。
抗体には、完全長抗体、およびその断片、すなわちＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、が含まれる。断片には、単鎖型および二量体型のものが含まれる。ＶＨおよびＶＬドメインのみを含むＦｖ断片は、全抗原結合部位を持つ最小の免疫グロブリン断片である（例えば、「分子生物学における方法」、Ｖｏｌ ２０７：「癌治療法およびプロトコルのための組換え型抗体（２００３）」；１章；ｐ３−２５、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、参照）。Ｆｖの安定化は、ＶＨおよびＶＬ鎖の直接結合、例えば、ペプチド結合（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を生成するための）、ジスルフィド架橋またはｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ変異により成し遂げられている。対照的に、Ｆａｂ断片は、可変鎖を一緒に保持しているＣＨ１およびＣＬドメインの存在により安定である。ＶＨドメインのみを含むＦｄ抗体は、完全な抗原結合部位が欠けており、また不溶性でありうる。
折り畳み抗体ポリペプチドでは、結合特異性は、抗原結合部位ドメインにより付与され、これは、一部の重鎖および／または軽鎖可変領域ドメインを含む。抗体分子上の他のドメインは、イベント、例えば、他の細胞、ポリペプチドおよび生体分子とのシグナル伝達および相互作用、に寄与することにより、エフェクター機能の役割を果たす。これらのエフェクター機能は、抗体により認識される感染性病原体の中和および／またはクリアランスを引き起こす。
ｂ．抗体配列および特異性
重鎖および軽鎖の可変領域は、非コード領域またはイントロンで分離された複数の生殖系列遺伝子セグメントによりコードされており、異なる染色体上に存在することが多い。Ｂ細胞分化の間に、生殖系列ＤＮＡは、再構成され、それにより、重鎖座位の１つのＤＨおよび１つのＪＨ遺伝子セグメントが組み換えられ、続いて、ＶＨ遺伝子セグメントの結合によりＶＨ鎖をコードする再構成ＶＤＪ遺伝子が形成される。再構成は、対立遺伝子排除のプロセスにより、単一重鎖対立遺伝子上でのみ起こる。対立遺伝子排除は、インフレームまたはＶＤＪセグメントの「増殖性」組換えにより調節されており、これは、ＶＤＪ組換え可変重鎖の約１／３で発生する。このような増殖性組換えイベントが細胞中で最初に起こる場合には、これにより、プレＢ細胞の表面上に発現したμ重鎖が産生され、さらなる重鎖組換えの停止シグナルを送り、それにより対立遺伝子重鎖座位の発現を防止する。表面に発現したμ重鎖は、また、再構成のためのカッパ（κ）座位を活性化する作用も行う。κ組換えが両座位で非生産的である場合、ラムダ（λ）座位は、再構成のための活性化のみが行われる。軽鎖再構成イベントは、ＶＬおよびＪＬセグメントのみ組み換えられることを除いて、重鎖に類似である。それぞれの１次転写の前に、対応する定常鎖遺伝子が追加される。その後の転写およびＲＮＡスプライシングによりｍＲＮＡが得られ、インタクト軽鎖または重鎖に翻訳される。
抗体の可変領域は、抗原結合およびそれぞれの生殖系列Ｖ、ＤおよびＪセグメントの組換えイベントによる特異性を付与し、それにより得られた可変領域ドメインをコードする組換え核酸配列は抗体の中で異なり、特定の抗体に抗原特異性を付与する。しかし、変化は、（Ｈ）鎖および（Ｌ）鎖可変領域のＮ末端ドメイン内に存在する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に限られる。ＣＤＲは、より保存的な、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる領域と共に散在する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、正確に定義されている（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）免疫学的関連タンパク質の配列、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、参照）。各ＶＨおよびＶＬは、通常、アミノ末端からカルボキシ末端へ、次の順に配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。ＶＬおよびＶＨドメイン内の配列変異性は、通常、ＣＤＲに限定され、これは、抗原結合部位を形成する領域である。例えば、重鎖に関して、通常は、ＶＨ遺伝子は、Ｎ末端の３つのフレームワーク領域、最初の２つの全ＣＤＲおよび３つめのＣＲＤの最初の部分をコードする；ＤＨ遺伝子は、３つめのＣＤＲの中央部をコードし、ＪＨ遺伝子は、３つめのＣＤＲの最後の部分および４つめのフレームワーク領域をコードする。軽鎖に関しては、ＶＬ遺伝子は、最初のＣＤＲおよび２つめのＣＤＲをコードする。３つめのＣＤＲ（ＣＤＲＬ３）は、ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントの結合により形成される。従って、ＣＤＲ１および２は、生殖系列Ｖ遺伝子セグメント配列により独占的にコードされる。ＶＨおよびＶＬ鎖ＣＤＲ３は、抗原結合部位の中心部を形成し、一方、ＣＤＲ１および２は、境界の外側を形成する；ＦＲは、ＨおよびＬのＣＤＲの方向を定めることにより足場を支える。概して、抗原結合部位は、通常、少なくとも４つのＣＤＲが抗原のエピトープと接触し、重鎖および軽鎖両方のＣＤＲ３が最も可変であり、抗原結合に対する最多数の特異性に寄与することが必要である（例えば、Ｊａｎｉｓ Ｋｕｂｙ、免疫学、第３版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９８、ｐｐ．１１５−１１８、参照）。Ｄ遺伝子セグメントの全てを含むＣＤＲＨ３は、Ａｂ結合部位の最も多様な成分であり、典型的には、Ａｂの特異性を決定する上で重要な役割を果たす。配列変動に加えて、重鎖および軽鎖の間のＣＤＲの長さの変動がある。
他方、定常領域は、抗体中でより保存的な配列によりコードされる。これらのドメインは、機能的特性、例えば、感染性病原体のクリアランスを起こすために免疫系および血清タンパク質の細胞と相互作用する能力、を抗体に付与する。異なるクラスの抗体、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＡ、は異なる定常領域を有し、異なるエフェクター機能を提供させる。
これらのＶ、Ｄ、およびＪの天然の組換えイベントは、高親和性および特異性の両方を有する、ほぼ２ｘ１０７の異なる抗体を提供できる。追加の多様性は、連結セグメント中へのヌクレオチド挿入および欠失により、また、可変領域の体細胞超変異によっても導入される。結果は、個体中に異なる抗原特異性を有する約１０１０抗体が存在するということになる。
２．抗体を特定する方法
標的タンパク質または抗原に対する結合特異性および／または活性を有する抗体を、当業者に既知の任意の方法により特定可能である。例えば、抗体は、標的抗原に対して従来の免疫化方法により産生され、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞が生成しうる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５；Ｇｏｄｉｎｇ、「モノクローナル抗体：原理と実践」、ｐｐ．５９−１０３（Ｍａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９８４）１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．、「モノクローナル抗体産生技術と応用」、ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７、を参照）。別の方法では、標的抗原に特異的な抗体は、抗体ライブラリーの所望の結合および活性による選別により特定される。抗体ライブラリーは、「ワンポット」ライブラリーとして提供可能であり、これには、抗体メンバーの多様な集団が、例えば、ディスプレイライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーとして含まれる。このようなライブラリーでは、ライブラリーの各メンバーの特定は、所望の結合活性を有する陽性クローンのシーケンシングの前には、通常は、未知である。
他の例では、抗体ライブラリーは、米国特許仮出願第６１／１９８、７６４号および同６１／２１１、２０４号、および国際公開第２０１００５４００７号（参照によって本明細書に組み込まれる）、に記載のアドレス指定可能なコンビナトリアル抗体ライブラリーを含む。アドレス指定できるライブラリーでは、各ＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖をコードする核酸分子は、それぞれ、アドレス指定できるフォーマットで標準的ＤＮＡ合成技術を使って合成され、それにより、各座位の各ＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖の核酸配列の同一性を知ることができる。ＶＨ鎖およびＶＬ鎖は、次に、同様にアドレス指定できるフォーマットで対形成され、ライブラリー各メンバーの同一性を、その座位または「アドレス」に基づいて知ることができる。アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、標的タンパク質に対する結合または活性で選別され、標的タンパク質に結合する、および／または標的タンパク質の活性を調節する抗体またはその一部を特定できる。これらのライブラリーが配列しているという事実のおかげで、選別の間に、収集内のそれぞれのメンバーの同一性を知ることができ、それにより、「Ｈｉｔ」抗体の手軽な比較を可能とする。
３．既存の抗体最適化方法
通常、上記方法のいずれかで生成された、および／または、特定された抗体は、中等度の親和性（例えば、約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）である。本明細書で考察のように、抗体発見およびエンジニアリングの既存の方法は、高親和性アンタゴニスト抗体を要求する。従って、さらなる抗体の最適化に向け、結合親和性を最適化し、改善する親和性成熟方法が採用される。親和性成熟抗体は、一般的に、活性、例えば、抗原結合親和性、の改善を生ずる１つまたは複数のアミノ酸変化を含む抗体である。抗体の親和性成熟の既知の方法には、例えば、前に特定した抗体をテンプレートとして使い、以下の方法を使って変異をインビトロでランダムに導入して、抗体ライブラリーを生成および選別することが含まれる。エラープローンＰＣＲ（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）１９（２１）：６０５２；および米国特許公開第２００４／０１１０２９４号）；１つまたは複数のＣＤＲまたはＦＲをランダム変異導入（例えば、国際公開第９６／０７７５４号；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１：３８０９−３８１３；Ｃｕｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：１１２９−１１３４；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９−８９６；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４：３３１０−３３１９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９５：６０３７−６０４２；ＭｃＣａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３６：４３３−４４５、参照）；オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（１９９８）１６０：２３５３−２３５９）；コドンカセット変異導入（Ｋｅｇｌｅｒ−Ｅｂｏ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（１９９４）２２（９）：１５９３−１５９９）；２ステップＰＣＲおよびオーバーラップＰＣＲを含む縮重プライマーＰＣＲ（米国特許第５、５４５、１４２、６、２４８、５１６号、および同７、１８９、８４１号；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８８）；１６（１５）：７３５１−７３６７；およびＤｕｂｒｅｕｉｌ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００５）２８０（２６）：２４８８０−２４８８７）；未免疫ドナーから入手した天然Ｖドメイン変異体レパートリーを有するファージディスプレイにより選択し、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３（１９９２）に記載のように数ラウンドの鎖の再シャッフルによるより高い親和性で選別した組換えＶＨまたはＶＬドメインによるドメインシャッフリング。
抗体を最適化するための利用可能なそれぞれの手法は、制約がある。第１に、これらの手法は、低親和性の抗体が、アゴニスト、部分アゴニスト／アンタゴニストまたは活性化因子／モジュレーターとして作用する候補治療薬であることを認めない。例えば、アンタゴニスト抗体を生成するために、高親和性抗体を生成することが所望の場合、ここでも既存の親和性成熟手法は制約がある。例えば、多くの利用可能な手法は、不要な変異（例えば、望ましくない位置の変異）の導入および／または特定の変異体に対する偏った導入のリスクがある。変異体の全ての可能な組み合わせを生成することができないために、ライブラリーサイズおよび完全性の制約が存在する。さらに、大量の低親和性変異体が、少ない高親和性変異体を排除しないように、競合を避けなくてはならない。さらに、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のＶＨおよびＶＬドメインシャッフリング、またはランダム変異誘発によって多くの親和性成熟抗体が産生される。これらの方法は、しかし、評価される巨大な数のクローンのために、いくつかのタイプのディスプレイ選択が必要である。非常に強い抗体−抗原相互作用を破るための溶出条件が、通常、非常に過酷で（例えば、低ｐＨ、高塩）ファージ粒子を変性させて非感染性にしてしまうために、結局のところ、非常に高親和性抗体はパニングによる単離が困難である。
本明細書で、これらの制約の一部または全部を克服する方法が提供される。
Ｃ．抗体の親和性成熟方法
本明細書で、標的抗原に対するその活性を親和性成熟される抗体の構造／活性関連性（ＳＡＲ）に基づいて改善する合理的な抗体の親和性成熟方法が提供される。ＳＡＲは、抗体の活性（例えば、標的抗原に対する結合）にとって重要な、抗体中の１つまたは複数の領域または特定のアミノ酸残基を特定するために使用できる。例えば、この方法では、親和性成熟する「Ｈｉｔ」または親抗体の構造の知識（例えば、配列）が、標的抗原に対する活性（例えば、結合）と関連付けられる。このような知識は、標的抗原に対する活性に関与する領域および／またはアミノ酸残基を明らかにするために使用することができる。領域またはアミノ酸残基は、さらなる変異誘発のために標的にされる。従って、ＳＡＲ情報は、変異させるべき抗体ポリペプチドの合理的な領域の特定を提供することにより、さらなる最適化のためのガイダンスを提供する。得られた変異抗体は選別され、出発または参照抗体に比べて、最適化された抗体を特定することができる。
本明細書で提供される方法では、「Ｈｉｔ」または親抗体の親和性成熟は、その構造−親和性／活性−関連性に基づいている。従って、この方法は、ＳＡＲに誘導されて活性を調節する領域と残基を特定する、遙かに小さなライブラリーを有する合理的な標的変異誘発手法である。
抗体のＳＡＲは、様々な手法により決定できる。例えば、標的抗原に対する所望の活性を有する抗体の配列を、同じ標的抗原に対し低下した活性を有する関連抗体と比較して、抗体間で異なるアミノ酸残基を特定することにより、ＳＡＲを決定することができる。アミノ酸差異を示す抗体の領域は、抗体の活性に重要な構造であることが特定され、さらなる変異誘発の標的とされる。
特に、ＳＡＲは、米国特許仮出願第６１／１９８、７６４号および米国特許仮出願第６１／２１１、２０４号；および国際公開第２０１００５４００７号に記載のように、空間的にアドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーを使って素早く解明できる。空間的にアドレス指定可能なフォーマットでは、アドレス指定されたメンバーの配列は、演繹的に既知であるため、活性および結合親和性は、選別アッセイと同時に、構造（例えば、配列）と関連付けることができる。空間的にアドレス指定可能なフォーマットでは、その配列の同一性は演繹的に既知であるため、近くの非「Ｈｉｔ」抗体に対する「Ｈｉｔ」抗体の結合親和性を配列空間で比較可能である。配列比較は、「Ｈｉｔ」および同じアッセイでより低い活性または非活性の関連抗体の間で行うことができる。このような比較により、ＳＡＲを明らかにし、抗体の活性に関与する重要な領域またはアミノ酸残基を特定することができる。例えば、このような比較は、標的への結合のために重要なＣＤＲおよび潜在的に重要なＣＤＲ内の残基のＳＡＲを明らかにすることができる。また、ＳＡＲは、抗体の領域または抗体の活性に寄与するその中のアミノ酸残基を特定する他の方法を使って決定可能である。例えば、変異誘発法、例えば、系統的変異導入法、をＳＡＲの決定に使用可能である。
本明細書記載の合理的な手法は、小分子医薬品化学で使われる手法を模倣して、予備的なｈｉｔの最適化を支援するＳＡＲの特定を促進する。これは、親和性成熟の既存の方法よりも利点がある。現在、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングまたはＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発により、多くのインビトロ親和性成熟抗体が作られている。多くのこれらの方法は、しかし、評価される巨大な数のクローンのために、いくつかのタイプのディスプレイ選択が必要である。本明細書の方法では、さらに合理的な、標的変異誘発法を採用し、ＳＡＲに誘導されて遙かに小さいライブラリーを使って系統的変異導入を行い、親和性を調節する領域と残基を特定する。活性なｈｉｔをライブラリー中に存在する、より低い活性の、または不活性の関連する抗体と比較することができるため、真のＳＡＲを特定できる。さらに、本明細書の方法は、ライブラリーサイズの指数関数的拡大を避けるために、同時発生の変異生成を避けるように行うことができる。例えば、所与のＣＤＲまたは標的領域に対して、１つの最良の置換が変異位置のそれぞれで特定され、活性のさらなる改良を得るために、新規抗体中で変異を組み合わせることができる。一例では、結合親和性が増加する。親和性の増加は、Ｋｄの減少として測定され、結合速度（ｋｏｎ）の増加、解離速度（ｋｏｆｆ）の減少、または両方により達成できる。
本方法の一態様では、「Ｈｉｔ」抗体中で変異誘発する残基は、「Ｈｉｔ」抗体の可変重鎖または軽鎖のアミノ酸配列と、親和性成熟されるＨｉｔ抗体に比較して標的抗原に対し低下した活性を示す関連抗体のそれぞれの可変重鎖または軽鎖とを比較することにより特定できる。一部の例では、関連抗体は、Ｈｉｔ抗体に比べ標的抗原に対して顕著に低い活性、例えば、８０％未満の活性、通常、５０％未満の活性、例えば、５％〜５０％の活性、例えば、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％またはそれ以下の活性、を示す非Ｈｉｔ抗体である。例えば、非Ｈｉｔ抗体は、標的抗原に対して検出可能な活性を示さない、または無視できる程度の活性のみを示す抗体でありうる。本方法を実施するに際し、活性の寄与領域の合理的な分析を行うために、「Ｈｉｔ」および関連抗体の間の関連性の一定の要件レベルが要求される。「Ｈｉｔ」抗体および関連抗体の間の、この構造−親和性／活性関連性分析により、活性に重要な抗体ポリペプチドの標的領域が明らかにされる。
本明細書で提供される方法の別の態様では、系統的変異導入法は、抗体の構造／活性関連性に関するより明確な情報を明らかにするために使用可能である。このような方法では、さらなる変異導入のための残基を特定するために、通常、系統的変異導入法が採用される。従って、系統的変異導入法はＳＡＲを決定する手段として採用可能である。あるいは、系統的変異導入法は、上述の比較方法と組み合わせて使うことも可能である。このような例では、標的領域活性に関与する標的領域が特定されるとすぐに、系統的変異導入法を使用して、変異誘発のためのアミノ酸残基を合理的に選択するために、それぞれのアミノ酸残基の活性における役割をさらに明らかにする。下記で詳細に考察するように、本明細書の系統的変異導入法では、抗体の活性に悪影響を与えない（例えば、標的抗原に対する活性を保持する、または、高める）スキャン変異体残基のみが、スキャン残基それぞれを他のアミノ酸へさらに変異導入することによりさらに変異誘発を受ける。
ＳＡＲが決定されるとすぐに、活性に重要な残基含有標的領域が抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖中で明らかにされる。可変重鎖または軽鎖に対する標的領域が特定されるとすぐに、領域内のアミノ酸残基の変異誘発法が採用され、標的抗原に対する活性により変異体が選別される。本明細書の方法では、例えば、ＤＮＡ合成または組換ＤＮＡ技術により変異誘発された抗体がそれぞれ生成され、発現し、標的抗原に対する活性によりアッセイされる。例えば、カセット変異導入、同時変異を使って、それぞれの抗体に変異導入することにより、ライブラリーの指数関数的拡大を避けることができる。さらに、不必要な変異を避けることができる。他の例では、所望に応じ、他の変異誘発手法、例えば、種々のドーピング方法、および選別およびシーケンシングにより特定された変異体の同一性を使って、変異を起こすことができる。親和性成熟は、参照Ｈｉｔ抗体の可変重鎖および可変軽鎖に対し別々にかつ独立に行うことができる。次に、得られた親和性成熟可変重鎖および軽鎖は、抗体のさらなる最適化のために対形成を行うことができる。
本明細書で提供される親和性成熟方法では、結合親和性のさらなる最適化を繰り返し行うことができる。例えば、さらなる最適化を、変異誘発および抗体ポリペプチドの追加の領域の選別の繰り返しにより行うことができる。方法の各ステップで、親和性成熟抗体の、標的抗原に対する活性（例えば、結合）の試験を行うことができる。親抗体またはいずれかのその中間体抗体に比べて標的抗原に対し改善された活性を有する抗体が特定される。また、標的抗原に対する活性を改善するための抗体領域中の最良置換が特定されるとすぐに、それらは組み合わされて新しい抗体を生成し、さらに改善して、抗体活性を最適化することができる。このような組み合わせ変異体は、追加の改善を提供できる。従って、本明細書の親和性成熟法により、抗体結合親和性の合理的な最適化が可能となる。
１．構造と活性の比較
Ｈｉｔ抗体のＳＡＲに基づいた、その構造と活性の関連抗体の比較による親和性成熟の方法が本明細書で提供される。この方法を実行するに際し、「Ｈｉｔ」抗体の重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列が、「Ｈｉｔ」抗体に比べて標的抗原に対する低減した、またはより少ない活性を示す関連抗体の対応する配列と比較される。以下で考察するように、本明細書の方法を実施する目的に対し、比較する場合（例えば、配列アラインメントにより）、「Ｈｉｔ」および関連抗体の間のアミノ酸差異を示す１次配列の領域を制限するために、関連抗体は「Ｈｉｔ」抗体の配列に充分に関連付けられる。従って、この方法は、標的抗原に対する活性に関与する「Ｈｉｔ」抗体の領域の特定を可能にする。例えば、「Ｈｉｔ」の一次配列（例えば、可変重鎖および／または可変軽鎖）および関連抗体の配列比較により、「Ｈｉｔ」および関連抗体の間にアミノ酸差異が存在する１つまたは複数の領域を特定することができる。領域は、１つまたは複数のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３であっても、および／または抗体（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４）のフレームワーク領域内のアミノ酸残基であってもよい。関連抗体の対応する領域に比べて少なくとも１つのアミノ酸差異を示す抗体の領域は、さらなる変異誘発の標的となる標的領域である。
この方法では、他のいずれかのアミノ酸またはアミノ酸のサブセットへの変異誘発が、特定された標的領域内のアミノ酸残基上で行われる。例えば、「Ｈｉｔ」抗体の重鎖および／または軽鎖中の選択領域の一部のまたは全部のアミノ酸残基が変異している。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超えるアミノ酸残基が変異している。変異誘発目的で選択された各アミノ酸残基は、全１９の他のアミノ酸残基、または制限されたそのサブセット、に変異可能である。得られた変異抗体は、出発「Ｈｉｔ」抗体に比べて、標的抗原に対する活性により選別される。以下で考察されるように、一部の例では、それぞれのアミノ酸残基の変異誘発に先立ち、標的領域内の全または選択されたアミノ酸残基の系統的変異導入法を使用して、変異誘発のための特定の残基を特定することができる。特定残基のサブセットは、次に、変異誘発に供されて、標的抗原に対する活性を改善または最適化する。
通常、この方法は、抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖に対し行われる。通常、親和性成熟は、「Ｈｉｔ」抗体の重鎖および／または軽鎖の内の１つまたは両方に対し相互に独立に、別々に行われる。重鎖および軽鎖は、独立に、例えば、任意の順で連続して親和性成熟される。あるいは、重鎖および軽鎖は、同時並行で親和性成熟を受ける。可変重鎖および／または可変軽鎖をコードする変異体ＤＮＡ分子が設計され、変異誘発により産生され、クローン化される。一部の例では、改変可変重鎖および軽鎖が合成により、または他の組換え法により産生されうる。重鎖および軽鎖の様々な組み合わせが対形成され、変異抗体のライブラリーが生成されうる。得られた抗体またはその断片は、標的抗原に対する活性により試験される。出発「Ｈｉｔ」抗体に比較して、最適化されたまたは改善された結合親和性を示す抗体が選択される。
標的抗原に対する活性をさらに最適化するために、繰り返して選別を行うことができる。例えば、可変重鎖または軽鎖内で標的抗原に対する活性を高める変異は、組み合わせることが可能で、それにより、出発「Ｈｉｔ」抗体および／または中間体の単一変異抗体に比べて改善された活性を有する抗体を作り出すことができる。また、親和性成熟軽鎖を有する親和性成熟重鎖の対形成により、本方法の実施により産生された生成抗体の活性をさらに最適化および改善することができる。さらに、１つまたは複数の追加の可変重鎖または軽鎖の領域中のアミノ酸残基の変異誘発、例えば、系統的変異導入または完全もしくは部分飽和変異誘発を行い、標的抗原に対する活性をさらに最適化するさらなる変異を特定することができる。
この方法のいずれのステップにおいても、親和性成熟抗体は、さらに活性に関し評価されうる。いずれの活性も、本明細書のセクションＥのいずれかの例で示すように、評価可能である。一例では、結合が評価される。当業者に既知のいずれの方法も、抗体の結合または結合親和性の測定に使用可能である。一例では、結合親和性は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を使って測定される。別の例では、結合親和性は、ＥＬＩＳＡを使って、用量反応により測定される。得られた抗体は、また、本明細書の別のところで考察されているように、機能活性の試験が可能である。
得られた親和性成熟抗体は、親「Ｈｉｔ」抗体に比較して改善された、および／または最適化された標的抗原に対する活性、を有するように選択される。本方法を実施することにより、標的抗原に対する抗体の活性が、少なくとも１．５倍、通常、少なくとも２倍、例えば、少なくとも２倍〜１００００倍、例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、１００００倍またはそれ超だけ改善されうる。例えば、本方法の実施により生成された親和性成熟抗体は、例えば、正確にまたは約１１ｘ１０−９Ｍ〜１ｘ１０−１１Ｍ、通常は、５ｘ１０−９Ｍ〜５ｘ１０−１０Ｍ、例えば、正確にまたは約１ｘ１０−９Ｍ、２ｘ１０−９Ｍ、３ｘ１０−９Ｍ、４ｘ１０−９Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、６ｘ１０−９Ｍ、７ｘ１０−９Ｍ、８ｘ１０−９Ｍ、９ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、２ｘ１０−１０Ｍ、３ｘ１０−１０Ｍ、４ｘ１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、６ｘ１０−１０Ｍ、７ｘ１０−１０Ｍ、８ｘ１０−１０Ｍ、９ｘ１０−１０Ｍまたはそれ未満の標的抗原に対する改善された結合親和性を有しうる。
この方法のステップの要約が図１で説明されている。本方法の各ステップの詳細説明は、以下で提供される。本明細書で提供される親和性成熟方法のステップは、抗体の可変重鎖に対しても、または可変軽鎖配列に対しても同様に行えることは理解されよう。従って、本明細書の目的のために、以下の説明は、特に明確な別段の記載が無ければ、重鎖および軽鎖配列の片方または両方に対する本方法の実施に適用できる。本明細書の別のところで考察されているように、通常、親和性成熟は、抗体の重鎖および／または軽鎖の片方または両方に対し、相互に独立に行われる。所望なら、親和性成熟重鎖は、親和性成熟軽鎖と対形成し、抗体の活性をさらに最適化または改善することができる。
ａ．親和性成熟のための１次抗体の選択
親和性成熟を行うために選択された抗体は、当技術分野で既知の、または標的抗原または抗原に対する活性を有すると特定されたいずれかの抗体である。例えば、抗体は、「Ｈｉｔ」抗体、例えば、選別アッセイで特定された抗体であってもよい。通常、抗体は、標的抗原に対する活性を示すが、親和性が充分高くはないために治療薬としての使用には理想的ではない、または活性の改善が可能もしくは望ましい抗体である。例えば、親和性成熟のために選択される抗体は、典型的には、正確にまたは約１０−５Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば、正確にまたは約１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、またはそれ以下、の標的抗原に対する結合親和性を有する。一般的に、親和性成熟のために選択される抗体は、標的抗原に特異的に結合する。標的抗原に対する抗体の活性を評価するアッセイは、当技術分野で既知である。代表的アッセイは、セクションＥで提供される。
従って、１次抗体は、標的抗原に対して活性を有することがわかっている抗体である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸または小分子（例えば、神経伝達物質）であってもよい。抗体は、ウイルス、細菌性、腫瘍または他の細胞の表面に発現した抗原に対して活性を示すことも、または、精製抗原に対する活性（例えば、結合）を示すことも可能である。通常、標的抗原は、精製タンパク質またはペプチドで、例えば、組換え型タンパク質を含む。
一般的に、標的抗原は、治療介入の標的であるタンパク質である。代表的標的抗原には、これに限定されないが、細胞増殖および分化、細胞遊走、アポトーシスおよび血管新生に関与する標的が含まれる。このような標的には、これに限定されないが、増殖因子、サイトカイン、リンパ球性抗原、他の細胞性活性化因子およびその受容体が含まれる。このような標的の代表例には、膜結合受容体、例えば、以下を含む細胞表面受容体が挙げられる（これらに限定されない）：ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞増殖因子受容体１、２、および３）、ａ上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−ｂ３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体としても知られる；ＨＧＦＲ）、ＤＬＬ４、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体）、ＫＩＴ（ｃ−ｋｉｔ用受容体）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４（繊維芽細胞増殖因子受容体１、２、および４）、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒｄ’ｏｒｉｇｉｎｅｎａｎｔａｉｓ；マクロファージ刺激１受容体としても知られる）、ＴＥＫ（内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ）、ＴＩＥ（内皮細胞に存在する受容体型チロシンキナーゼ）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１（エリトロポイエチン産生肝細胞受容体Ａ１、Ａ２およびＢ１）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＮＯＴＣＨ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−ＲならびにＥＰＯ−Ｒ、が含まれる。他の標的には、膜結合型タンパク質、例えば、カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５２またはＣＤ４４から選択されるものが含まれる。本明細書の選別方法の標的になりうる代表的リガンドには、これに限定されないが、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、リンホトキシン（ＬＴ）、ＩｇＥ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＥＰＯが含まれる。一部の例では、「Ｈｉｔ」抗体は、１つまたは複数の抗原と結合可能である。例えば、実施例１で例示したように、１つの標的抗原のみ、例えば、ＤＬＬ４に対し結合する、または２つ以上の異なる標的抗原、例えば、Ｐ−カドヘリンおよびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）に結合する「Ｈｉｔ」抗体が特定された。
本明細書で提供される方法の実施では、通常、抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖のみが親和性成熟される。従って、選択された抗体は、通常、抗原結合部位を形成するのに充分な可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む。しかし、抗体は、また、定常重鎖（例えば、１つまたは複数のＣＨドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）、および／または定常軽鎖（ＣＬ）の全てまたは一部を含むことができることは理解されよう。従って、抗体は、完全長抗体、および、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ならびにｓｃＦａｂ断片、を含む断片またはその一部も含むことができる。例えば、本明細書の実施例に例示されている親和性成熟抗体はＦａｂである。本明細書で提供されるように、抗体が親和性成熟されるとすぐに、得られた抗体は、完全長抗体またはその断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ならびにｓｃＦａｂ断片、として産生可能であることは理解されよう。さらに、いずれかのアイソタイプの定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ定常領域を含む完全または部分的抗体断片の生成に使用可能である。このような定常領域は、いずれかのヒトまたは動物種から入手可能である。活性と結合親和性は、抗体の構造に応じて異なりうることは理解されよう。例えば、通常、二価の抗体、例えば、二価のＦ（ａｂ’）２断片または完全長ＩｇＧは、一価のＦａｂ抗体よりも良好な結合親和性を有する。結果として、Ｆａｂが特定の標的に対し特定の結合親和性を有する場合、結合親和性が二価の完全長ＩｇＧに対してはさらに大きいということは除外して考えるべきである。従って、１次抗体および親和性成熟抗体の間の結合親和性の比較は、通常、例えば、ＦａｂとＦａｂを比較する、等の、同じ構造を有する抗体の間でなされる。
親和性成熟用の抗体には、当業者に既知の既存抗体を含んでもよい。別の例では、抗体は、所望の標的に応じて経験的に生成、または特定される。例えば、抗体は、従来の免疫化およびハイブリドーマ選別法を使って産生することができる。別の例では、抗体は、当業者に既知の種々の選別方法のいずれかを使って特定される。
ｉ．免疫化およびハイブリドーマ選別
標的抗原に特異的抗体は、最初、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５、に記載されたハイブリドーマ法を使ってまたは組換えＤＮＡ法（米国特許第４、８１６、５６７号）により産生可能である。
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えば、ハムスター、に免疫して免疫化に使われるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘発する。標的抗原に対する抗体を、タンパク質抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内の（ｉｐ）注射により動物中に産生することができる。２週間後、動物に追加免疫を行う。７〜１４日後、動物から採血し、血清を用いて標的抗原に特異的な抗体力価のアッセイを行う。動物は、力価がプラトーになるまで追加免役される。
あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化できる。次に、リンパ球をポリエチレングリコール等の適切な融合剤を使ってミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、「モノクローナル抗体：原理と実践」、ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。
調製されたハイブリドーマ細胞を播種し、非融合の親ミエローマ細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含む適切な培地中で成長させる。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合には、ハイブリドーマ用の培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、この物質は、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を防ぐ。
ミエローマ細胞は、効率的に融合するものを含み、選択された抗体産生細胞により抗体の安定な高レベル産生を支援し、また、培地、例えば、ＨＡＴ培地に敏感である。ミエローマ細胞株の中には、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ、から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、ＵＳＡ、から入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞、由来のものがある。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１；およびＢｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．、「モノクローナル抗体産生技術および応用」、ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７））。
ハイブリドーマ細胞が成長している培地を使って、標的抗原に対して誘導されたモノクローナル抗体の産生のアッセイを行う。ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、当業者には既知のいずれかの方法（例えば、セクションＥ．１に記載のように）、例えば、免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、等のインビトロ結合アッセイにより、測定可能である。結合親和性は、また、例えば、スキャチャード解析を使って測定可能である。
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後で、クローンを限界希釈法でサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ、「モノクローナル抗体：原理と実践」、ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。この目的のための適切な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地がある。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物中で腹水腫瘍としてインビボで増殖できる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製法、例えば、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、または親和性クロマトグラフィーにより、培地、腹水体液、または血清から適切に分離される。
ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に分離可能で、従来の方法を使って配列決定できる。例えば、シーケンシングは、重鎖および軽鎖をコードするハイブリドーマ由来対象領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使って行うことができる。単離されるとすぐ、ＤＮＡは発現ベクター中に挿入することができ、次に、他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、サルのコス細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞中に形質移入し、組換え型宿主細胞中で所望のモノクローナル抗体の合成を行う。
ｉｉ．「Ｈｉｔ」の特定のための選別アッセイ
方法本明細書の方法により親和性成熟した抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使って合成抗体クローンを所望の１つまたは複数の活性により選別することにより特定可能である。所望の活性を有する抗体は、「Ｈｉｔ」として選別できる。このような「Ｈｉｔ」抗体は、親和性成熟してさらに活性を最適化できる。
１）ディスプレイライブラリー
典型的な選別方法は、高スループット選別の抗体ライブラリーである。例えば、抗体ライブラリーは、ライブラリーの個々の分子（表現型）およびそれらをコードする遺伝子情報（遺伝子型）の間の物理的リンクがある様に、ディスプレイ技術を使って選別される。これらの方法には、これに限定されないが、細菌性ディスプレイ、酵母ディスプレイおよび哺乳類ディスプレイを含む細胞ディスプレイ；ファージディスプレイ（Ｓｍｉｔｈ、Ｇ．Ｐ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７）、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイならびにＤＮＡディスプレイ、が含まれる。ディスプレイ技術を使って、個々の抗体のそれぞれの同一性を選別の前に知ることができるが、表現型−遺伝子型リンクは、選択抗体を容易に特定できるようにする。本明細書の方法を実施する前に、「Ｈｉｔ」抗体の配列が決定される。
通常、ライブラリーでは、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒトまたは動物から採取した免疫細胞から入手される。抗原特異的抗体の方に偏ったライブラリーを望む場合は、対象を標的抗原で免疫して、抗体応答を生成させ、脾臓細胞および／または循環Ｂ細胞または他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をライブラリー構築用に回収する。抗原特異的抗体反応性細胞集団のさらなる濃縮は、抗原特異的膜結合抗体を発現しているＢ細胞を単離する適切な選別方法、例えば、抗原親和性クロマトグラフィーによる細胞分離、または蛍光色素標識抗原への吸着とそれに続く蛍光標識細胞分取（ＦＡＣｓ）を使って行うことができる。
あるいは、脾臓細胞および／またはＢ細胞または未免疫ドナー由来の他のＰＢＬの使用により、より良好な発現量の可能な抗体レパートリーが提供され、また、標的抗原が非抗原性である任意の動物（ヒトまたは非ヒト）種を使った抗体ライブラリーの構築が可能となる。インビトロ抗体遺伝子構築を組み込んだライブラリーのために、対象から幹細胞を採取し、未再構成抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。対象免疫細胞は、種々の動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、およびトリ種から入手できる。
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨおよびＶＬセグメントを含む）をコードする核酸は、対象細胞から回収し、増殖可能である。再構成されたＶＨおよびＶＬ遺伝子ライブラリーの場合には、所望のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをリンパ球から単離し、次いで、再構成ＶＨＶＬ遺伝子の５’および３’末端に適合するプライマーでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得られ（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６：３８３３−３８３７）、それにより発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作ることができる。Ｖ遺伝子は、成熟Ｖ−ドメインをコードするエキソンの５’末端の逆方向プライマー（ｂａｃｋｐｒｉｍｅｒ）、およびＪ−セグメント内の順方向プライマーを使って相補ＤＮＡおよびゲノムＤＮＡから増幅できる（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４−５４６）。しかし、相補ＤＮＡから増幅するためには、逆方向プライマーは、また、リーダーエキソン中をベースにしてもよく（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：８８−８９）、また、順方向プライマーは、定常領域内をベースにしてもよい（Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６：５７２８−５７３２）。相補性を最大化するために、縮重をプライマー中に組み込むこともできる（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）またはＳａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９））。ライブラリー多様性は、免疫細胞核酸試料中に存在する全ての利用可能なＶＨおよびＶＬ再構成を増幅するために、例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７、またはＯｒｕｍ ｅｔ ａｌ．、（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：４４９１−４４９８、に記載の方法により、各Ｖ−遺伝子ファミリーを標的にしたＰＣＲプライマーを使って最大化可能である。増幅ＤＮＡの発現ベクター中へのクローニングのために、ＰＣＲプライマー内の１つの末端にタグとして導入する（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９））か、またはタグを付けたプライマーでＰＣＲ増幅することにより（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８）、希な制限酵素部位を導入することができる。
合成的に再構成されたＶ遺伝子の抗体ライブラリー、レパートリー作製の別の例では、Ｖ遺伝子セグメントからインビトロで得ることができる。大抵のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、クローン化され、配列決定されており（例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７７６−７９８、参照）、マップ化されている（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、３：９８８−９４、参照）。これらのセグメントは、多様配列および長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーを使って多様なＶＨ遺伝子レパートリーを生成するために使用可能である（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１−３８８）。また、長い単一長さのＨ３ループに焦点を絞った全ての配列多様性を有するＶＨレパートリーも作製可能である（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４４５７−４４６１）。ヒトＶκおよびＶλセグメントは、クローン化され、配列決定されており（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：１４５６−１４６１、参照）、合成軽鎖レパートリーを作るために使用可能である。ＶＨおよびＶＬ群ならびにＬ３およびＨ３長さの範囲をベースにした合成Ｖ遺伝子レパートリーは、多くの構造的多様性の抗体をコードする。ＤＮＡをコードするＶ−遺伝子の増幅の後で、生殖系列Ｖ−遺伝子セグメントが、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１−３８８、の方法に従って、インビトロで再構成できる。
抗体断片レパートリーは、ＶＨおよびＶＬ遺伝子レパートリーをいくつかの方法で一緒に組み合わせることにより構築可能である。各レパートリーは、異なるベクター中で作製でき、ベクターは、インビトロで（例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅ ｅｔ ａｌ．、（１９９３）Ｇｅｎｅ、１２８：１１９−１２６、参照）、またはインビボでコンビナトリアル感染、例えば、ｌｏｘ Ｐシステムを使って（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．、（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：２２６５−２２６６）、組換え可能である。インビボ組換え手法は、Ｆａｂ断片の二重鎖の性質を利用して大腸菌形質転換効率から来るライブラリーサイズの制限を克服する。あるいは、レパートリーは、同じベクター中へ順次クローン化でき（例えば、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７９７８−７９８２、参照）、または、ＰＣＲにより一緒に構築し、次いで、クローン化できる（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８、参照）。また、ＰＣＲによる構築により、ＶＨおよびＶＬ ＤＮＡを柔軟なペプチドスペーサーをコードするＤＮＡと連結し、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成できる。別の技術では、「細胞中ＰＣＲ構築」を使って、リンパ球内のＶＨおよびＶＬ遺伝子をＰＣＲで結合し、次に連結遺伝子のレパートリーをクローン化できる（例えば、Ｅｍｂｌｅｔｏｎ（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：３８３１−３８３７、参照）。
通常のディスプレイライブラリーでは、ＶＨおよびＶＬ鎖のレパートリーは、ライブラリーの各メンバーの配列がわからない形でワンポットライブラリーとして構築される。従って、本明細書の方法を実施するために必要な何らかのＳＡＲ関連性の知識を得るために、「Ｈｉｔ」抗体の特定後、シーケンシングが必要である。従って上述のように、ハイブリドーマ生成抗体に対し、ディスプレイライブラリーから特定されたＤＮＡコード抗体クローンが容易に単離でき、従来の方法で配列決定できる。例えば、シーケンシングは、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡテンプレート、例えば、ファージＤＮＡテンプレート、由来の対象領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使って行うことができる。
選別に使用可能な代表的なこのような抗体ライブラリーは、下記のいずれかに記載されている：欧州特許出願第０３６８６８４号および同８９３１１７３１号；国際公開第９２／００１０４７号、同０２／３８７５６号、同９７／０８３２０号、同２００５／０２３９９３号、同０７／１３７６１６号および同２００７／０５４８１６号；米国特許第６、５９３、０８１号および同６、９８９、２５０号；米国特許公開第２００２／０１０２６１３号、同２００３／１５３０３８号、同２００３／００２２２４０号、同２００５／０１１９４５５号、同２００５／００７９５７４号および同２００６／０２３４３０２号；ならびにＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：３８３３−３８３７；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４−５４６；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：１０１３４−１０１３７；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２２２：５８１−５９１；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２２７：３８１−３８８；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ、１３：６９２−６９８；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：４４５７−４４６１；Ａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：４６５１−１６５９；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ、１３：３２４５−３２６０；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ（２００４）ＰＮＡＳ、１０１：１２４６７−１２４７２；Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５７：６０７−６２０；Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６；Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７６：１１８２−１２００；Ｍｏｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１３：１１１７−１１２９；およびＢｅｈａｒ、Ｉ．（２００７）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．、７：７６３−７７９。
２）ファージディスプレイライブラリー
例えば、天然、または合成抗体は、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片を提示するファージを含む選別ファージライブラリーによって選択される。可変ドメインは、短い柔軟なペプチドを介してＶＨおよびＶＬが共有結合している単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、または、それぞれ定常ドメインに融合し、非共有結合で相互作用する（Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３−４５５）Ｆａｂ断片として、ファージ上で機能的に提示されうる。このようなファージライブラリーは親和性クロマトグラフィーにより所望の抗原に対して選別される。所望の抗原に対し結合可能なＦｖ断片を発現しているクローンは、抗原に結合し、その結果、ライブラリー中の非結合クローンから分離される。結合クローンは、次に、抗原から溶出され、抗原結合／溶出の追加のサイクルによりさらに濃縮できる。どのような抗体も、対象ファージクローンの選別のための適切な抗原選別方法を設計し、続いて、対象ファージクローンおよび適切な定常領域（Ｆｃ）配列由来のＦｖ配列を使って完全長抗体クローンを構築することにより得ることができる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）免疫学的関連タンパク質の配列、第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１）、ｖｏｌｓ．１−３）。
ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローン化でき、ファージライブラリー中でランダムに組換え可能で、その後、抗原結合クローンを対象に検索できる（Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３−４５５（１９９４））。免疫化ソース由来のライブラリーは、ハイブリドーマ構築を要せずに、免疫原に対し高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリーは、クローン化して、何ら免疫化をせずに、広い範囲の非自己および自己抗原に対しヒト抗体の単一ソースを提供できる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３））。また、最終的に、ナイーブライブラリーは、幹細胞由来の未再構成Ｖ−遺伝子セグメントのクローン化、およびランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使って高可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成することにより合成的に作ることができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１−３８８（１９９２））。
ＶＨおよびＶＬレパートリーは、別々にクローンされ、１つはファージミド中に、また、もう一方はファージベクター中に挿入される。次に、各細胞が異なる組み合わせを含み、さらに、ライブラリーサイズが存在する細胞の数（約１０１２クローン）のみにより制限されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染により２つのライブラリーを組み合わせる。両ベクターは、インビボ組換えシグナルを含み、これにより、ＶＨおよびＶＬ遺伝子が単一レプリコン上で組み換えられ、ファージヴィリオン中に一緒にパッケージされる。ライブラリーは、良好な親和性（約１０−８ＭのＫｄ−１）を有する大量の多様な抗体を提供できる。
繊維状ファージが、コートタンパク質、例えば、少数のコートタンパク質ｐＩＩＩに融合することにより抗体断片を提示するために使用される。抗体断片は、ＶＨおよびＶＬドメインが同じポリペプチド鎖上で柔軟なポリペプチドスペーサーにより連結された、単鎖Ｆｖ断片として（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７（１９９１））、または、１つの鎖がｐＩＩＩに融合し、もう一方の鎖が細菌性宿主細胞ペリプラズム中に分泌され、そこで野性型コートタンパク質の一部を置換することによりファージ表面上に提示されるＦａｂコートタンパク質構造の構築がなされるＦａｂ断片として（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：４１３３−４１３７（１９９１））提示される。
３）アドレス指定可能なライブラリー
標的タンパク質に対する所望の特異性および／または活性を有する抗体またはその断片を特定する別の方法には、米国特許仮出願第６１／１９８、７６４号および同６１／２１１、２０４号、ならびに国際公開第２０１００５４００７号に記載のアドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーが含まれる（これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる）。これらには、例えば、空間的にアドレス指定されるコンビナトリアル抗体ライブラリーが含まれる。ディスプレイライブラリーに比べて、アドレス指定できるコンビナトリアルライブラリーの利点は、各座位が、アドレスにより同一性がわかっている異なるライブラリーメンバーを表すことである。このようなライブラリーでは、ライブラリーの各個別メンバーは、別々に生成され、次に、各メンバーの配列が知られる。ライブラリーのメンバーの提示は、結合に対してのみではなく、機能に対しても各メンバーの選択を可能にする任意の所望のフォーマットで達成できる。「Ｈｉｔ」は、配列から判断できるものを含め、選別の結果と同時に素早く特定できる。特定された「Ｈｉｔ」の配列は、演繹的に既知であるので、特定された抗体に関する構造的情報を得るのにシーケンシングの必要はない。従って、「Ｈｉｔ」抗体の親和性成熟は、選別および「Ｈｉｔ」抗体の特定後、直ちに行うことができる。
アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、組換えヒト生殖系列セグメントからなる可変重鎖および可変軽鎖を有する抗体を含む。ライブラリー中の抗体組み合わせ多様性は、可変重鎖を構成する個別のＶ、ＤおよびＪセグメントの組換え、および可変軽鎖を構成する個別Ｖ（ＶκまたはＶλ）およびＪ（ＪκまたはＪλ）セグメントの組換えから生ずる。さらなる組み合わせ多様性は、異なる可変重鎖および可変軽鎖の対形成から得られる。
各ＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖をコードする核酸分子は、標準的ＤＮＡ合成技術を使って、アドレス指定できるフォーマットで別々に合成され、それにより、各ＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖の座位における核酸配列の同一性は既知である。ＶＨ鎖およびＶＬ鎖は、こちらもアドレス指定できるフォーマットで対形成され、それにより、ライブラリー各メンバーの同一性は座位または「アドレス」に基づいて既知である。アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、標的タンパク質に対する結合または活性により選別でき、標的タンパク質に結合する、および／または標的タンパク質の活性を調節する抗体またはその一部を特定できる。これらのライブラリーが配列されているという事実のために、収集中の各個別メンバーの同一性を選別の間に知ることができ、それにより、「Ｈｉｔ」および関連「非Ｈｉｔ」抗体の比較を容易にする。
米国仮出願特許第６１／１９８、７６４号、および６１／２１１、２０４号、ならびに国際公開第２０１００５４００７号（参照によって本明細書に組み込まれる）には、抗体メンバーの組み合わせ生成の理由により、各抗体の同一性が選別時点で既知であるコンビナトリアル抗体ライブラリーを生成する方法が提供されている。アドレス指定可能なコンビナトリアルライブラリーでは、ライブラリーの可変重鎖（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）メンバーは、既知の生殖系列抗体配列またはその改変配列から、組換えでまたは合成的にＤＮＡ合成により生成される。ライブラリー中の抗体組み合わせ多様性は、可変重鎖を構成する個別のＶ、ＤおよびＪセグメントの組換え、および可変軽鎖を構成する個別のＶ（ＶκまたはＶλ）およびＪ（ＪκまたはＪλ）セグメントから生成する。さらなる組み合わせ多様性は、異なる可変重鎖および可変軽鎖の対形成から得られる。
ライブラリー中の抗体の各ＶＬ鎖は、ＶκおよびＪκヒト生殖系列セグメントもしくはその縮重コドン、またはＶλおよびＪλヒト生殖系列セグメントもしくはその縮重コドンを含む核酸分子によりコードされ、それにより、セグメントがインフレームで連結される。生殖系列セグメントは、ＶＬセグメントがＪＬセグメントの５’となるように連結される。ライブラリー中の抗体の各ＶＨ鎖は、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントを含む核酸分子によりコードされ、それにより、セグメントは、インフレームで連結される。生殖系列セグメントは、ＶＨセグメントがＤＨセグメントの５’であり、これがＪＨセグメントの５’となるように、連結される。
各遺伝子セグメントがインフレームとなり、得られた組換え核酸分子が機能的ＶＨまたはＶＬポリペプチドをコードするように、組換えが行われる。例えば、組換えＤセグメントは、組換え完全長核酸がインフレームであり、５’開始コドン（ＡＴＧ）を有し、それにより、完全長ポリペプチドの発現を可能とするように連結される。Ｖ（Ｄ）Ｊのどのような組み合わせも作ることができ、従って、接合部がインフレームの編集されたＶ（Ｄ）Ｊ配列を生成するために改変され、一方、各セグメントの読み枠は保存される。接合部改変の選択は、連結されるＶ（Ｄ）Ｊの組み合わせ、および各遺伝子セグメントの適切な読み枠に依存する。一部の例では、ＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖をコードする核酸分子は、さらに改変され、停止コドンおよび／または制限酵素部位を除去し、それにより、生じたコード化ポリペプチドはインフレームであり、機能的となる。
可変重鎖または可変軽鎖をコードする核酸が、以下のように産生される。最初のステップで、それぞれの生殖系列セグメント（重鎖に対するＶＨ、ＤＨおよびＪＨまたは軽鎖に対するＶκおよびＪκ、またはＶλおよびＪλ）が組み換えのために選択される。生殖系列セグメントは、ヒト生殖系列セグメントもしくは、その縮重配列でも、あるいは、改変されていてもよい。例えば、可変重鎖のＤＨセグメントは、任意の読み枠に翻訳されてもよく、あるいは、ＤＨセグメントは、ＤＨ生殖系列セグメントの逆相補配列であってもよい。選択されるとすぐ、生殖系列セグメントは、組換え完全長核酸が５’開始コドン（ＡＴＧ）を有するインフレームとなるように連結され、それにより、完全長ポリペプチドの発現を可能とする。任意のＶ（Ｄ）Ｊの組み合わせが可能であり、従って、編集されたインフレームのＶ（Ｄ）Ｊ配列を生成するために接合部が改変され、一方、各セグメントの読み枠は保存される。Ｖセグメントは、常に読み枠１である。Ｊセグメントの読み枠は、適切なアミノ酸がコードされるように選択される。Ｄセグメントは、どのような読み枠でも可能だが、通常、読み枠は、生じたアミノ酸の疎水性が優るように選択される。必要に応じ、各セグメントが所望の読み枠に入るように、遺伝子セグメントの間の接合部で核酸の改変がなされる。例えば、Ｖ−Ｄ接合部では、１つまたは複数のヌクレオチドがＤの５’末端から欠失、１つまたは複数のヌクレオチドがＶの３’末端から欠失、または１つまたは複数のヌクレオチドがＶとＤに間に挿入されうる（例えば、ヌクレオチドは、Ｖの３’末端に追加できる）。接合部が形成されるとすぐに、配列は改変され、いずれの停止コドンもヌクレオチドに置換されることにより、例えば、停止コドンＴＡＡがコドンＴＡＴにより置換され；停止コドンＴＡＧがコドンＴＡＴにより置換され、さらに停止コドンＴＧＡがコドンＴＣＡにより置換されることにより除去される。最終的に、核酸は、さらに改変され、例えば、不必要な制限酵素部位、スプライシングドナーもしくは受容体部位、または効率的翻訳に潜在的に有害な他のヌクレオチド配列を除去できる。核酸配列の改変には、ヌクレオチドの交換もしくは置換、挿入、または欠失、またはそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。
各ＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖をコードする核酸分子を標準的ＤＮＡ合成技術を使ってアドレス指定できるフォーマットで別々に合成し、それにより、各ＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖の各座位の核酸配列の同一性を知ることができる。
次に、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖が同様にアドレス指定できるフォーマットで対形成され、それにより、ライブラリーの各メンバーの同一性を座位または「アドレス］に基づいて知ることができる。例えば、生成するライブラリーのメンバーは、組換え可変領域遺伝子をコードする核酸分子の同時発現により一緒に産生され、それにより、発現する場合、コンビナトリアル抗体メンバーは、ＶＨおよびＶＬ鎖またはその一部を最低限含むように生成される。この方法の一部の例では、ＶＨおよびＶＬ鎖をコードする核酸分子は、単一核酸分子として発現することができ、それにより、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、リンカーによって連結される。この方法の別の例では、ＶＨおよびＶＬ鎖をコードする核酸分子は、一緒の発現のために、別々に提供できる。従って、組換え核酸分子からの発現に際し、各異なるライブラリーのメンバーは、生殖系列にコードされた抗体を表し、それにより、多様性は、Ｖ（Ｄ）Ｊセグメントの組み合わせ多様性および重鎖および軽鎖の対形成多様性により達成される。
アドレス指定できるコンビナトリアル生殖系列抗体ライブラリー内の抗体は、生じた抗体が抗原結合部位を形成するのに充分であるという前提の下、全てまたは一部の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含む。通常、アドレス指定できるコンビナトリアル生殖系列抗体は、Ｆａｂである。可変重鎖および軽鎖をコードする代表的核酸は、下表３で示されている。抗体のライブラリーは、ＶＨ鎖をコードする核酸分子およびＶＬ鎖コードする核酸分子の同時発現により産生され、複数の異なるメンバーを含むコンビナトリアルライブラリーを生成することができる。代表的対形成核酸ライブラリーを、下表４に示すが、ここで、各行は、ライブラリーの異なる座位を表す。アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、選別されて任意の標的抗原に対する「Ｈｉｔ」抗体を特定することができる。各「Ｈｉｔ」または「非Ｈｉｔ」の配列構造による同一性は、結合結果と同時に直ちにわかるので、標的抗原に結合しない関連非Ｈｉｔ抗体もまた、容易に特定可能である。
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通常、アドレス指定できるコンビナトリアル生殖系列ライブラリーは、マルチウェルプレート、例えば、９６ウエルプレート、中で空間的に配列されており、プレートの各ウエルは、他の全てのウエル中の抗体とは異なる１つの抗体に対応する。抗体は、プレートのウエル表面に固定でき、または溶液として存在できる。あるいは、抗体は、固体支持体、例えば、例えば、フィルター、チップ、スライド、ビーズまたはセルロースに付着される。抗体は、また、着色、発色性、発光、化学、蛍光または電子標識で、識別可能なように標識できる。アドレス指定できるコンビナトリアル生殖系列抗体ライブラリーは、標的タンパク質に対する結合または活性により選別し、標的タンパク質に結合する、および／または標的タンパク質の活性を調節する抗体またはその一部を特定できる。これらのライブラリーが配列されているという事実のおかげで、収集中のそれぞれ個別のメンバーの同一性を選別の間に知ることができ、それにより「Ｈｉｔ」抗体の特定が容易にできる。結合または機能活性による選別は、当業者に既知のいずれの方法、例えば、セクションＥ．１に記載のいずれの方法であってもよい。
例えば、実施例に記載のように、アドレス指定できる抗体ライブラリーから、ＭＳＤ電気化学発光結合アッセイまたはＥＬＩＳＡを使って標的抗原に対して「Ｈｉｔ」抗体を選別できることが実証される。ライブラリーはアドレス指定できるために、特定された「Ｈｉｔ」の配列は、直ちに知ることができる。以下でさらに考察されるように、類似のアッセイにより関連抗体を特定できることが実証される。
ｂ．関連抗体の特定
本明細書で提供される方法では、標的抗原に対し１次抗体より低減したまたは少ない活性を有する関連抗体との比較により、本明細書の親和性成熟に使われるＳＡＲ情報が得られる。この方法では、親和性成熟される抗体の変異誘発対象の残基が、１次抗体（例えば、「Ｈｉｔ」）の可変重鎖または軽鎖と、関連抗体の可変重鎖または軽鎖の対応するアミノ酸配列とのアミノ酸配列の比較により特定される。本明細書の方法を実施する目的に対し、関連抗体は、抗体（重鎖および軽鎖）の全体配列にわたって「Ｈｉｔ」抗体に対する配列類似性または同一性を有するが、それ自体、「Ｈｉｔ」抗体に対し配列は全く同じではない。さらに、関連抗体は、標的抗原に対し１次抗体より少ない活性（例えば、結合または結合親和性）を示す。
本明細書の方法では、１次抗体が上述の本明細書の親和性成熟のために選択されるとすぐに、１つまたは複数の関連抗体が選択される。１次抗体および関連抗体が同じライブラリーから特定される必要もなく、または、同じ選別方法を使って特定される必要もない。関連抗体が標的抗原に対し１次抗体より活性が低く、関連抗体が親和性成熟されている抗体に対し配列の類似性を示すことが、必要なことの全てである。便宜上、関連抗体は、通常、１次抗体の特定に使用されたのと同じ選別方法およびアッセイシステムを使って特定される。従って、上述のセクションＣ．１に記載のいずれかの抗体ライブラリーを含むいずれの抗体生成方法も関連抗体の特定に使用可能である。代表的抗体ライブラリーは、上述および本明細書の実施例のアドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーである。前に記載のように、アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、標的抗原に対する結合に関するライブラリー全メンバーの構造−活性関連性についての即時知識取得の利点を有する。従って、「Ｈｉｔ」抗体の場合と同様に、関連抗体の配列および活性を、直ちに知ることができる。従って、標的抗原に対する選別アッセイの完了時に、「Ｈｉｔ」および関連抗体の間の配列類似性の評価を、ほぼ即座に確定可能である。
通常、関連抗体は、１次抗体に比較して、標的抗原に対し１次抗体の８０％未満の活性、通常、５％〜８０％の活性、さらに特に５％〜５０％の活性、例えば、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％またはそれ未満の活性を示す抗体である。例えば、関連抗体は、「Ｈｉｔ」抗体が結合する標的抗体に対し結合しないか、または無視できる程度にしか結合しない抗体であってもよい（例えば、結合レベルは、アッセイに使われる陰性対照の結合と同じまたは類似の程度である）。従って、関連抗体は、選択された１次抗体が特異的に結合する標的抗原に対し特異的に結合しないために、最初に特定可能である。例えば、関連抗体は、１０−４Ｍまたはそれ超、例えば、１０−４Ｍ、１０−３Ｍ、１０−２Ｍ、またはそれ超の結合親和性を示してもよい。１次抗体の活性（例えば、結合および／または結合親和性）の関連抗体との比較では、同じ標的抗原が使用され、活性は、同じまたは類似のアッセイにより評価される。さらに、抗体の構造も同じである（例えば、完全長抗体またはその断片、例えば、Ｆａｂ）場合のような、対応する型の抗体が比較される。
その全体配列（重鎖および軽鎖）にわたり、またはその可変重鎖または可変軽鎖の全域で１次抗体に配列類似性または同一性を示すため、本方法実施をするために選択された関連抗体は１次抗体に関連している。例えば、関連抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列は、１次抗体のアミノ酸配列に少なくとも５０％同一、通常少なくとも７５％同等の配列、例えば、１次抗体に対し、正確にまたは約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一のアミノ酸配列、典型的には、少なくとも正確にまたは約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％配列類似性である。関連抗体は、可変重鎖および軽鎖の両方で１次抗体と同じではないが、１次抗体の可変重鎖または軽鎖の一方と同じで、もう一方の鎖で１００％未満の配列類似性であってもよい。従って、本方法の実施のために、本方法で使われる関連抗体の可変部分は、特定された「Ｈｉｔ」抗体に対し同一性が１００％未満であることは理解されよう。例えば、多くのケースで、関連抗体は、１次抗体の可変軽鎖配列に対し１００％の配列同一性を示すが、１次抗体の可変重鎖配列に対しては、１００％未満の配列類似性を示し、それでも必要な配列類似性を示す抗体である可能性がある。このケースでは、関連抗体の可変重鎖配列のみが本明細書記載の方法の実施に使われる。本明細書の他のところで記載されているように、当業者に既知の配列類似性を測定するいずれの方法も使用可能であり、これに限定されないが、マニュアルによる方法または利用可能なプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴの使用が含まれる。
例えば、関連抗体は、１次抗体の可変重鎖と同じ可変重鎖、および１次抗体に対し配列類似性を示す可変軽鎖を含んでもよい。別の例では、関連抗体の可変重鎖も可変軽鎖も１次抗体のアミノ酸配列と同じではないが、両方とも１次抗体に対する配列類似性を示す。従って、一部の例では、１次抗体の可変重鎖の親和性成熟法で使われる関連抗体は、１次抗体の可変軽鎖の親和性成熟法で使われる関連抗体とは異なる。従って、本明細書の方法の実施のために、１つまたは複数の関連抗体が選択されうる。例えば、実施例で示したように、可変軽鎖の親和性成熟のために３つの関連抗体が選択さる。いずれかの例では、１次抗体の対応する重鎖または軽鎖に対し配列類似性を示す関連抗体の可変鎖（重鎖または軽鎖）が、異なる１次抗体中の１つまたは複数の領域を特定する方法に使用され、従って、１次抗体および関連抗体の異なる結合能力の原因である。このような１つまたは複数の領域は、以下でさらに説明されるように、本明細書の方法における親和性成熟および変異誘発のための標的となる。
通常、１次抗体および関連抗体の可変重鎖および／または軽鎖は、同じまたは関連する抗体可変領域生殖系列セグメント、例えば、同じ遺伝子ファミリー、由来である。例えば、関連抗体は、１つまたは複数の可変重鎖ＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ生殖系列セグメントまたは可変軽鎖ＶκおよびＪκもしくはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントを含む核酸配列によりコードされる。この生殖系列セグメントは、１次抗体をコードする核酸配列に含まれるセグメントと同じではなく、このセグメントと同じ遺伝子ファミリーに属する。通常、関連抗体は、生殖系列セグメントの１、２、３、４、または５つが異なるまたは関連していることを除いて、１次抗体をコードする核酸配列と同じ生殖系列セグメントを含む核酸配列によりコードされる。例えば、関連抗体は、同じ可変重鎖ＶＨおよびＤＨ生殖系列セグメントまたは同じ可変軽鎖ＶκもしくはＶλ生殖系列セグメントを含むが異なるまたは関連するＪＨおよびＪκもしくはＪλ生殖系列セグメントを含むＶＨまたはＶＬ鎖をコードする核酸配列によってコードされる。実施例に例示されるように、選択された「Ｈｉｔ」の可変重鎖配列をコードする核酸配列と比較して、同じ可変重鎖ＶＨおよびＪＨ生殖系列セグメント（すなわちＶＨ５−５１およびＩＧＨＪ４＊０１）を含むが、異なるＤＨ生殖系列セグメント（すなわち、ＩＧＨＤ６−２５＊０１対ＩＧＨＤ５−５１＊０１＞３）を有する核酸配列によりコードされているので、関連抗体の可変重鎖が、本明細書の方法の実施のために選択された。関連抗体の可変重鎖の配列は、１次抗体に対し９８％の配列類似性を示す。別の例では、選択された１次抗体の可変重鎖配列をコードする核酸配列に比べて、同じＶＨ生殖系列セグメント（すなわち、ＶＨ１−４６）を含むが、異なるＪＨ生殖系列セグメント（すなわち、ＩＧＨＪ１＊０１対ＩＧＨＪ４＊０１）、および関連ＤＨ生殖系列セグメント（すなわち、同じ遺伝子ファミリーＩＧＨＤ６を共有するＩＧＨＤ６−６＊０１対ＩＧＨＤ６−１３＊０１）を含む核酸配列によりコードされているので、関連抗体の可変重鎖が本明細書の方法の実施のために、選択された。関連抗体の可変重鎖の配列は、１次抗体に対し９５％配列の類似性を示す。
当業者は、抗体の生殖系列セグメント配列を知っており、精通していて、抗体重鎖または軽鎖をコードする生殖系列セグメント配列を特定することができる。代表的抗体生殖系列ソースには、これに限定されないが、米国・国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベース、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ）、ＫａｂａｔデータベースおよびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ’ｓ ＶＢａｓｅデータベースが含まれる（Ｌｅｆｒａｎｃ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１：３０７−３１０；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、抗体エンジニアリング用バイオインフォマティクスツール（治療抗体ハンドブック）、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ（２００７）、ｐｐ．１０４−１０７）。また、生殖系列セグメントは、非ヒトに関しても既知である。例えば、代表的マウス生殖系列データベースは、ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＡＢＧデータベースである。生殖系列セグメント配列は、種々の命名法により知られ、例えば、ＩＭＧＴ遺伝子名およびヒト遺伝子解析機構（ＨＵＧＯ）命名委員会により承認された定義がある（Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．−Ｐ．Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ、１８：１００−１１６（２００１）、Ｚａｃｈａｕ、Ｈ．Ｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、４：４９−５４（１９９６）、Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．−Ｐ．Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ、１８：１６１−１７４（２０００）、Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、７：２５０−２６１（１９９７）、Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．−Ｐ．Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ、１８：２４２−２５４（２００１））。どの所望の命名規則も抗体生殖系列セグメントを特定するのに使用可能である。当業者なら、いずれかの所望の命名規則を用いて核酸配列を特定することができる。例えば、ＩＭＧＴ命名法では、最初の３つの文字は、座位（ＩＧＨ、ＩＧＫまたはＩＧＬ）を示し、４番目の文字は、遺伝子を（例えば、Ｖ遺伝子をＶで、Ｄ遺伝子をＤで、Ｊ遺伝子をＪで）表し、５番目の位置は、サブグループの数を示し、ハイフンに続いて、遺伝子分類番号を示す。対立遺伝子に対しては、ＩＭＧＴ名は、アステリスクの後に２つの図番号を入れる。米国特許仮出願第６１／１９８、７６４号および同６１／２１１、２０４号には、代表的ヒト重鎖および軽鎖（カッパおよびラムダ）生殖系列セグメント配列が説明されている。
ｃ．１次抗体および関連抗体のアミノ酸配列の比較
１次抗体が選択され、関連抗体または抗体が関連可変重鎖および／または可変軽鎖を有することが特定されるとすぐに、抗体の配列比較が行われる。親または１次抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖と関連抗体のアミノ酸配列の比較により、１次抗体および関連抗体の間の異なる領域の特定が可能となる。このような１つまたは複数の領域が、親和性成熟および変異誘発の標的となる。
この方法では、親１次抗体のＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖のアミノ酸配列が、少なくとも１つの関連抗体のそれぞれのＶＨ鎖またはＶＬ鎖に整列され、１次抗体および関連抗体間で異なる、または変わっているポリペプチドの領域を特定する。抗体のアミノ酸配列は、当技術分野で通常知られているいずれかの方法で整列させることができる。この方法には、マニュアル配列比較、コンピュータ支援配列アラインメント、およびこれらの組み合わせ、が含まれる。配列アラインメントを行う多くのアルゴリズム（通常、コンピュータで実行される）が広く利用可能である、または専門家により作製可能である。これらの方法には、例えば、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））の局地的相同性アルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））の相同性配列比較アルゴリズム；ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８））の類似性探索方法；および／またはこれらのアルゴリズムの計算機実装による方法（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ７．０、（遺伝学コンピュータグループ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）が含まれる。
例えば、アルゴリズムを使って配列同一性（および配列類似性）分析を行うためのソフトウェアが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、に記載されている。このソフトウェアは、公的に、例えば、国立バイオテクノロジー情報センターのｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ経由で、入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合、ある正の値の閾値Ｔに一致するか、またはこれを満たす問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを特定することにより、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる。これらの最初の近傍ワードヒットは、これらを含むさらに長いＨＳＰを見付けるための探索開始用シードとして役立つ。次に、累積的配列比較スコアが増加している間は、ワードヒットを各配列に沿って両方向に延長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列に対しては、パラメータＭ（マッチ残基対に対するリワードスコア（ｒｅｗａｒｄ ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基に対するペナルティスコア（ｐｅｎａｌｔｙ ｓｃｏｒｅ）；常に＜０）を使って計算される。アミノ酸配列に対しては、スコアリング行列を使って、累積スコアを計算する。ワードヒットの各方向への延長は、次の場合に停止される：累積配列比較スコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下する場合；１つまたは複数の負のスコアリング残基配列比較値の蓄積により、累積スコアがゼロ以下になる場合；またはどちらかの配列の末端に至った場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、配列比較の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワード長（Ｗ）：１１、期待数（Ｅ）：１０、カットオフ値：１００、Ｍ＝５、Ｎ＝-４、および両鎖の比較、を規定値としてとして使用する。アミノ酸配列に対しては、ＢＬＡＳＴＰ（ＢＬＡＳＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラムは、ワード長（Ｗ）：３、期待数（Ｅ）：１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５、参照）を規定値として使用する。
さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７、参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより得られる１つの類似性の尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間にマッチングが偶然に発生する確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において、最小和確率が約０．１未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満でさえある場合は、核酸は、参照配列に類似である（また、従ってこの文脈では、相同である）と見なされる。
複数のＤＮＡ、またはアミノ酸の配列アラインメントに適したアルゴリズムのさらなる例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．、（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）。ＣＬＵＳＴＡＬＷは、配列グループ間の複数の対での比較を行い、それらを集めて相同性に基づく複数の配列比較を構築する。ギャップ開口およびギャップ延長ペナルティは、例えば、それぞれ、１０と０．０５であってもよい。アミノ酸配列比較に対しては、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムがタンパク質重み行列として使用可能である。例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９、を参照。
抗体のアミノ酸配列を配列比較することにより、当業者なら、１次抗体および関連抗体のアミノ酸配列間の異なる領域を特定することができる。抗体間で異なる領域は、ＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖のどの部分でも発生する可能性がある。通常、異なるまたは変化している領域は、ＣＤＲまたはフレームワーク（ＦＲ）領域、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４、および特に、ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ３で、発生する。当業者は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａナンバリングに基づいてＣＤＲおよびＦＲを認識し、特定することができる（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）免疫学的関連タンパク質の配列、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、を参照）。例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくと、ＣＤＲ−ＬＩは、残基Ｌ２４〜Ｌ３４に相当する；ＣＤＲ−Ｌ２は、残基Ｌ５０〜Ｌ５６に相当する；ＣＤＲ−Ｌ３は、残基Ｌ８９〜Ｌ９７に相当する；ＣＤＲ−Ｈ１は、残基Ｈ３１〜Ｈ３５、３５ａまたは３５ｂに相当する（長さに応じて）；ＣＤＲ−Ｈ２は、残基Ｈ５０〜Ｈ６５に相当する；ならびにＣＤＲ−Ｈ３は、残基Ｈ９５〜Ｈ１０２に相当する。例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくと、ＦＲ−Ｌ１は、残基Ｌ１〜Ｌ２３に相当する；ＦＲ−Ｌ２は、残基Ｌ３５〜Ｌ４９に相当する；ＦＲ−Ｌ３は、残基Ｌ５７〜Ｌ８８に相当する；ＦＲ−Ｌ４は、残基Ｌ９８〜Ｌ１０９に相当する；ＦＲ−Ｈ１は、残基Ｈ１〜Ｈ３０に相当する；ＦＲ−Ｈ２は、残基Ｈ３６〜Ｈ４９に相当する；ＦＲ−Ｈ３は、残基Ｈ６６〜Ｈ９４に相当する；およびＦＲ−Ｈ４は、残基Ｈ１０３〜Ｈ１１３に相当する。
１次抗体と関連抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖アミノ酸配列の対応するアミノ酸位置で少なくとも１つの酸の差異または変化を含むため、異なる領域は標的領域として特定される。変異位置には、関連抗体ポリペプチドに比較して、１次抗体ポリペプチドのアミノ酸欠失、追加または置換が含まれる。本明細書の目的のために、特定された領域は、少なくとも１つの１次抗体の可変鎖の領域中に、関連抗体に比較して、１つまたは複数の、通常は２つ以上の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異アミノ酸位置を含む。一部の例では、１つまたは複数の領域、例えば、１、２、３、４またはそれ以上の領域が、１次抗体と関連抗体の間で、少なくとも１つの変異アミノ酸位置を含むことが特定できる。いずれか１つまたは複数の領域が変異誘発による親和性成熟の標的となりうる。通常、ＣＤＲが変異誘発の標的とされる。
ｄ．特定された領域の変異導入
本方法では、特定された標的領域内の標的残基の変異誘発が行われる。例えば、１次抗体の重鎖および／または軽鎖中の選択された標的領域の一部の、または全部のアミノ酸残基が変異導入される。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれ以上のアミノ酸残基が変異導入される。変異誘発のために選択された各標的アミノ酸残基が、全１９の他のアミノ酸残基に、または制限されたそのサブセットに変異されうる。
一例では、特定された標的領域、例えば、ＣＤＲ３、中の全アミノ酸残基が変異誘発の対象である。別の例では、選択された標的領域中のアミノ酸残基のサブセットが変異誘発の対象である。例えば、１次抗体と関連抗体の間で異なっている位置のアミノ酸残基のみが変異誘発の対象である。別の例では、１次抗体と関連抗体の間で同じである位置のアミノ酸残基のみが変異誘発の対象である。さらなる例では、系統的変異導入を、任意選択で行い、標的抗原に対する結合を強める残基を特定する。このような例では、以下で考察するように、「ＵＰ」変異として特定された残基のみがさらなる飽和変異誘発の対象となる。
例えば、通常、ＣＤＲは３〜２５のアミノ酸残基を含むことができる。ＣＤＲ内の全部またはサブセットのアミノ酸が、変異誘発の標的とされうる、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のアミノ酸残基が変異誘発の標的とされうる。一部の例では、ＣＤＲ内の全アミノ酸が変異誘発のために選択される。他の例では、ＣＤＲ内のサブセットのアミノ酸のみが変異誘発のために選択される。一部の例では、ＣＤＲ内の１つのアミノ酸残基のみが変異誘発のために選択される。別の例では、２つ以上のアミノ酸が変異誘発のために選択される。
さらなる変異誘発のために選択されたアミノ酸残基は、当業者に既知の任意の方法で改変することができる。アミノ酸残基は、合理的に改変でき、またはランダム変異誘発により改変できる。これは、コードしているＤＮＡを改変することによって達成できる。当業者なら変異誘発方法をよく知っている。変異誘発方法には、これに限定されないが、部位媒介変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、カセット変異導入、部位特異的変異誘発、ランダム点変異誘発、ウラシル含有テンプレートを使った変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを使った変異誘発、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使った変異誘発、制限選択と制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、二重鎖切断修復、および他の多くの当業者に既知の方法、が含まれる。例えば、Ａｒｎｏｌｄ（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４５０−４５５；Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２４０−２４５；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔｌｅ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、（１９８５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：４４３１−４４４３；Ｃａｒｔｅｒ（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；Ｃａｒｔｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３；Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．、（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：５１１５；Ｆｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９；Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．、（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８７）「オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発の効率」（核酸と分子生物学）（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｆ．ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｙ、Ｄ．Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４、３６７−３８２；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、（１９８４）Ｃｅｌｌ３８：８７９−８８７；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７２０７；Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、（１９９７）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８；Ｌｏｒｉｍｅｒ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３、３０６７−８；Ｍａｎｄｅｃｋｉ（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７１７７−７１８１；Ｎａｋａｍａｙｅ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８；Ｎａｍｂｉａｒ ｅｔ ａｌ．、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９−１３０１；Ｓａｋａｍａｒ ａｎｄ Ｋｈｏｒａｎａ（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２；Ｓａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２；Ｓａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４；Ｓｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：４５６−４６０；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０、３８９−９１；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．、（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．、（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７；Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．、（１９８６）Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ３１７：４１５−４２３；Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００；およびＺｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０、を参照。一部の例では、アミノ酸残基はＮＮＫ変異誘発により改変される。別の例では、アミノ酸残基は、カセット変異導入により改変される。
一部の例では、選択標的アミノ酸残基は、各変異誘発が１つの標的位置のみでの単一アミノ酸残基の置換により行われるように、また、生じたそれぞれの個別変異体がそれぞれの単一変異誘発反応の単一の生成物であるように、個々に変異誘発されうる。単一アミノ酸置換変異誘発反応は、選択領域中のそれぞれの標的位置で選択されたアミノ酸のそれぞれに対し繰り返すことができる。従って、複数の変異タンパク質分子が産生され、それにより各変異タンパク質は、１つの標的位置のみに単一アミノ酸置換を含む。変異誘発は、アドレス指定できるアレイ中でも実行でき、それにより、各変異タンパク質の同一性が解る。例えば、部位特異的変異誘発方法は、個別に変異タンパク質を生成するのに使用可能である。
他の例では、可変重鎖または軽鎖中の異的標的位置にランダムアミノ酸を有する変異誘発された抗体を生成できる。通常、選択された標的アミノ酸残基は同時に変異誘発可能で、すなわち、１つまたは複数のアミノ酸残基が一緒に変異誘発される。例えば、標的アミノ酸が、２０アミノ酸の全部（またはグループ）により置換されるように、ランダム変異誘発法を使用可能である。異なるアミノ酸位置での単一または複数の置換が同じ分子に、同時に生成される。この手法では、アミノ酸位置もアミノ酸タイプも制約されない；また、あらゆる可能な変異が生成し、試験される。複数の置換が同時に同じ分子上でランダムに発生することもありうる。得られた変異分子の収集は、下記に記載のように、活性により評価可能で、結合を示す分子が特定され、配列決定される。
ランダム変異誘発法では、配列中に無作為化を導入するための任意の既知の方法が利用可能であることが意図されている。例えば、エラープローンＰＣＲによれば、対象ポリペプチドをコードする核酸配列中にランダム変異を導入することができる（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、（１９９２）２２６（３）：８８９−９６、参照）。簡単に述べれば、当業者なら成し遂げることができるように、ＰＣＲを複製の正確さを甘くした条件で行い、その結果、配列中にランダム変異を導入する。
１つまたは複数の標的アミノ酸位置に無作為化を導入する代表的な方法は、デオキシリボヌクレオチド「ドーピング戦略（ｄｏｐｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ）」の使用で、これは、全２０アミノ酸の導入をカバーする一方で、コード化停止コドンの数を最小化する。例えば、ＮＮＫ変異誘発を採用でき、ここでＮは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ（名目上、等モル）、およびＫはＧまたはＴ（名目上、等モル）でありうる。他の例では、ＮＮＳ変異誘発を採用可能で、ここで、ＳはＧまたはＣでありうる。従って、ＮＮＫまたはＮＮＳは、（ｉ）全アミノ酸をコード、（ｉｉ）１つの停止コドンのみをコード、および（ｉｉｉ）コドンの偏りの範囲を６：１から３：１に減らす。ＮＮＫモチーフから生じる３２の可能なコドンがある：各１２のアミノ酸に対し１つのコドン、各５のアミノ酸に対し２つのコドン、各３のアミノ酸に対し３つのコドン、そして３つの停止コドンの内の１つのコドンのみ。他の選択対象には、これに限定されないが：全ての可能なアミノ酸および全ストップコドンを提供可能なＮＮＮ；全ストップコドンを除き、それでも２０アミノ酸の内の１４をカバーするＮＮＹ；さらに２０アミノ酸の内の１４をカバーするＮＮＲ、が挙げられる。コドン中の３番目のヌクレオチド位置は、既知の縮重混合物のいずれかを使ってカスタム設計可能である。しかし、ＮＮＫ、ＮＮＮ、ＮＮＹ、ＮＮＲ、ＮＮＳのグループは、大抵の頻繁に使われるドーピング戦略および本明細書で使われるものをカバーしている。
変異誘発されたタンパク質は、発現し、標的抗原に対する活性により評価される。例えば、さらに本明細書で以下のセクションＥ．１で記載のような、活性を評価するための当業者に既知のいずれの方法も使用可能である。例えば、代表的結合アッセイには、これに限定されないが、イムノアッセイ、例えば、以下に示す技術を使った競合的および非競合的アッセイシステムが含まれる：ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、メソ・スケール・ディスカバリー電気化学発光測定法（ＭＳＤ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、免疫沈降アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定分析、蛍光イムノアッセイ、およびタンパク質Ａイムノアッセイ。このようなアッセイは、日常的に使われ、当技術分野でよく知られている（例えば、、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ、１９９４、「分子生物学における最新プロトコル）、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、を参照。これらの文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、本明細書で提供された方法では、標的抗原に対する抗体の結合は、ＥＣＬ結合アッセイを使って測定される。別の例では、結合はＥＬＩＳＡにより測定される。
親１次抗体に比べて、標的抗原に対する改善されたまたは強化された結合を示す変異抗体が特定される。特定された変異抗体の可変重鎖または軽鎖中のアミノ酸変異が特定できる。以下で考察するように、特定された変異抗体に対しさらなる変異誘発および繰り返しの選別を行い、標的抗原に対する活性をさらに最適化できる。例えば、標的抗原に対し改善された結合を示すとして特定された親１次抗体の全ての変異抗体の変異を測定可能である。全てのまたはサブセットの特定されたアミノ酸変異を組み合わせて組み合わせ変異抗体を生成できる。
２．系統的変異導入によるＳＡＲ
系統的変異導入は、タンパク質残基の機能的役割を測定するための、簡便な、広く使われている技術である。系統的変異導入は、本明細書の親和性成熟の方法に使用し、１次抗体のＳＡＲを測定することが可能である。系統的変異導入は、関連抗体と比較しないで１次抗体に対して行うことができる。他の例では、系統的変異導入は、任意選択で、変異導入するアミノ酸残基をさらに合理的に特定するために、上記標的領域の変異誘発の前に行われる。
本明細書の系統的変異導入方法では、抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖の完全長全体の全ての残基がスキャンニングアミノ酸により置換される。あるいは、可変重鎖または可変軽鎖の領域の全ての残基がスキャンニングアミノ酸により置換される。例えば、少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３）がスキャンニングのために選択される。スキャンニングアミノ酸は、任意のアミノ酸でよいが、通常は、アラニン、トレオニン、プロリンまたはグリシンである。アミノ酸置換は、通常、部位特異的変異誘発により行われる。アラニンは、［ベータ］炭素の先の側鎖を削除し、それでも、主鎖高次構造を変えず（グリシンまたはプロリンと同様に）、また、極度の静電的または立体効果を与えないために、通常、アラニンは好まれる置換残基である。一般的に、変異誘発のために選択された全アミノ酸残基が、スキャンされた（例えば、変異された）同じアミノ酸残基である。他のスキャンニングアミノ酸残基を使う必要が生じることがよくある。例えば、標的アミノ酸残基がすでにアラニンである場合は、別のアミノ酸残基、例えば、トレオニン、プロリンまたはグリシンが使用可能である。
系統的変異導入を行う場合は、完全長ポリペプチド全域または選択領域中の全またはサブセットのアミノ酸が系統的変異導入の標的であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸残基が系統的変異導入を受ける。関連抗体との比較に加えて、系統的変異導入が行われる例では、標的領域中の全アミノ酸残基または標的領域中のサブセットのアミノ酸残基がスキャンされうる。一例では、１次抗体と関連抗体の間で異なるアミノ酸残基のみが、系統的変異導入の標的とされる。一般的に、標的領域中の全アミノ酸残基が系統的変異導入を受ける。上述および以下のセクションＥで記載のように、変異誘発されたタンパク質は、発現し、標的抗原に対する活性により評価される。
スキャンニング後、スキャンされた（例えば、変異された）抗体は、活性により選別して、さらなる変異のためにアミノ酸残基を特定する。通常、大抵の先行技術の系統的変異導入方法は、対象タンパク質の活性をノックダウンするか、または低減するスキャン位置の特定を含むか、または位置の特定に限定されている。論拠は、これらの残基は、いずれにしろ活性に対し重大であるということである。しかし、本明細書の方法の実施の目的のために、スキャンニング後のさらなる変異誘発のために、「Ｕｐ」変異体である残基が選択される。これらは、親抗体に比較してスキャンアミノ酸を含むように変異を受けた場合、活性の保持または増加を示す抗体である。さらに、接触ＣＤＲ中のスキャン置換による残基のみが選択される。従って、本明細書の代表的実施形態では、接触ＣＤＲ中のスキャン置換による残基、および活性に影響しない、または改善しない残基のみが選択され、それぞれに、他のアミノ酸への変異をさらに受ける。
この手法の利点は、本明細書の親和性成熟のために選択された抗体は、通常、マイクロモルまたは高ナノモルレベルの親和性を示すことである。このような親和性は、抗体が標的抗原に対し低い相互作用を示すことを意味する。このことは、その機能活性に対しすでに高度に進化している通常の手法で親和性成熟された多くのタンパク質とは対照的である。従って、標的抗原に対し弱い活性を示す、親和性成熟のために選択された抗体に対して、弱い相互作用を改善するか、または最適化するさらなる機会が生ずる。従って、本明細書の方法を実施するに際し、抗体の活性の増加または保持を生ずるスキャン残基が、さらなる変異誘発のために選択される。これは、新しい相互作用を起こさせ、例えば、親和性成熟の前には存在しなかった新しい接触残基をつくりだす。
従って、本明細書の系統的変異導入方法では、選択アミノ酸が系統的変異導入を受け、「Ｕｐ」変異体（すなわち、活性の保持または増加を示す変異体）であるアミノ酸残基が特定される。さらなる変異誘発が、親抗体に比較して標的抗原に対する活性の保持または増加を示すスキャンアミノ酸位置のみで行われる。標的抗原に対し活性を維持する抗体は、結合の幾分の増加または減少を示しうるが、通常は、スキャン変異を含まない１次抗体と同じ結合を示し、例えば、少なくとも７５％の結合活性、例えば、７５％〜１２０％の結合、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％または１１５％の結合、を示す。標的抗原に対し活性増加を示す抗体は、通常は、１１５％を超える活性、例えば、変異を含まない１次抗体よりも１１５％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％またはそれ以上超の活性を示す。従って、系統的変異導入は、標的領域中のさらに変異誘発される標的アミノ酸残基のサブセットを制限するために採用可能である。上記セクションＣ．４で記載のように、特定されるとすぐに、変異誘発が、全またはサブセットのアミノ酸残基上で行われる。上述および以下のセクションＥで記載のように、さらに変異誘発された抗体は、発現し、標的抗原に対する活性により評価される。１次抗体に比較して活性の改善または最適化を示す抗体が選択される。
３．さらなる最適化
本明細書で提供される親和性成熟方法は、さらなる抗体の最適化のために繰り返し行うことができる。追加して、または、代わりに、可変重鎖または軽鎖内で標的抗原に対し活性の改善または最適化を生ずる全てのまたはサブセットのアミノ酸改変が選択され、組み合わされ、活性によりさらに評価されうる。これらの中間抗体もまた、本明細書の親和性成熟方法を使った、さらなる変異誘発のためのテンプレートとして使用可能である。一部の例では、１つまたは複数のアミノ酸改変を組み込んだ可変重鎖または軽鎖は、さらなる活性のための変異誘発と最適化用のテンプレートとして使用可能である。さらに、さらなる抗体の領域が変異誘発可能である。
本方法は、１次抗体と関連抗体のアミノ酸配列比較に基づく変異誘発の対象として最初に選択されなかった可変重鎖または軽鎖の領域の最適化を提供する。さらなる変異誘発のために選択される追加の領域は、可変重鎖または軽鎖のいずれの部分でもありうる。例えば、追加の領域には、ＣＤＲまたはフレームワーク領域を含むこともできる。通常、ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３が、選択され、標的とされる。いずれか１つまたは複数の領域が変異誘発による親和性成熟のために標的化可能である。下記の実施例９と１２で例示するように、追加の変異誘発のためにＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２が選択される。
可変重鎖または軽鎖の追加の領域は、同時に、さらなる変異誘発を受けることができ、あるいは、繰り返し変異誘発を受けることができる。例えば、抗体の活性を最適化する本明細書のさらなる変異誘発による１つの領域の変異が最初に特定され、第２の領域の最適化がそれに続く。変異誘発するための選択された標的領域内のアミノ酸残基の選択は、この方法を実施する人が決定することができる。一部の例では、その領域中の全てのアミノ酸が変異誘発の標的となる。他の例では、その領域中のアミノ酸のサブセットのみが変異誘発の標的となる。さらなる例では、系統的変異導入を行い、標的抗原に対する活性を高める、または保持する残基が特定される。このような例では、結合親和性を高める、または影響を与えない残基のみがさらに変異誘発され、標的抗原に対する結合親和性を高める変異が特定される。通常、変異誘発は、重鎖および／または軽鎖の片方または両方に対し、他とは独立的に行われる。さらなる変異誘発のために選択されているアミノ酸残基は、当業者には既知のいずれの方法によっても改変可能である。変異誘発されたタンパク質は、発現し、標的抗原に対する結合により評価される。代表的結合アッセイは、下記のセクションＥ．１で記載される。
上記セクションＣ．４およびＣ．５に記載のように、さらなる変異誘発のために選択された領域中のアミノ酸残基は、当業者に既知のいずれかの方法により改変可能である。一部の例では、選択アミノ酸は、さらなる変異誘発のための「Ｕｐ」変異を特定するために、系統的変異導入を受ける。他の例では、選択アミノ酸は、ランダムに変異誘発され、例えば、アミノ酸残基が飽和変異誘発および／またはカセット変異導入により改変される。セクションＦおよびＥで記載のように、変異誘発されたタンパク質は発現し、標的抗原に対する活性により評価される。標的抗原に対する活性を増加させるアミノ酸変異を含む抗体が特定される。
また、組み合わせ変異体も産生できる。本明細書で提供される方法では、標的抗原に対する抗体の活性増加を生ずるアミノ酸変異が組み合わされて、複数のアミノ酸改変を有する可変重鎖または軽鎖を生成する。通常、組み合わせ変異体は、可変重鎖および／または軽鎖当たり、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異を有する。一部の例では、組み合わせ変異体は、２つのアミノ酸改変を含む。他の例では、組み合わせ変異体は、３つ以上のアミノ酸改変を含む。下記実施例９で例示するように、４アミノ酸変異を含む可変重鎖が産生される。
さらに、可変重鎖または軽鎖内に複数のアミノ酸改変を含む中間抗体が、この方法のいずれかのステップで生成しうる。中間抗体の可変重鎖および／または軽鎖、すなわち、複数の前に特定されたアミノ酸改変を含むものは、さらなる変異誘発と親和性成熟のための「テンプレート」として使用可能である。
さらに、本明細書の方法は、いずれかの改変軽鎖を有するいずれかの改変重鎖の対形成を提供し、それにより重鎖および軽鎖の両方が変異を含む中間体または親和性成熟抗体を生成する。変異重鎖および軽鎖は、この方法の任意のステップで対形成し、発現し、標的抗原に対する結合により評価されうる。従って、さらなる抗体の最適化が達成できる。
本明細書の方法のさらなる最適化のいずれのステップでも、セクションＥに記載のように、親和性成熟抗体は、活性によりさらに評価可能である。
ａ．相補性決定領域
一部の例では、領域がさらなる変異誘発のために選択される。通常、領域はＣＤＲ、例えば、可変重鎖または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３である。可変重鎖または軽鎖ＣＤＲ内のアミノ酸残基は、当業者により特定可能である。ＣＤＲは、次に示すものを含む、いずれの標準的定義によっても特定される：Ｋａｂａｔ（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）免疫学的関連タンパク質の配列、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、参照）；Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ、（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６（４）：９０１−１７；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．、（１９９７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２７３（４）：９２７−４８、参照）；Ａｂｍ（例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：９２６８−９２７２、参照）；または結晶構造データに基づく接触残基（例えば、ＭａｃＣａｌｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２、７３２−７４５、参照）。Ｋａｂａｔナンバリングに基づき定義された、重鎖および軽鎖ＣＤＲ内に含有されたアミノ酸は、上記セクションＣ．３に記載されている。
通常、ＣＤＲは３〜２５残基を含み、その全てまたは一部は、さらなる変異誘発のために標的化可能である。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸残基を変異誘発のための標的とすることができる。実施例９に例示したように、選択されたＣＤＲＨ１残基のみが変異誘発され、一方、実施例１０では、ＣＤＲＬ２内の全残基が変異誘発される。
上記セクションＣ．４および下記セクションＥ．とＦ．で記載のように、選択されたアミノ酸は変異誘発を受け、抗体は発現して、標的抗原に対する活性によりアッセイされる。
ｂ．フレームワーク領域
一部の例では、さらなる変異誘発のために選択された領域は、フレームワーク領域の一部、例えば、可変重鎖または軽鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４、である。ＣＤＲの場合のように、フレームワーク領域が、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ａｂｍまたは接触残基のナンバリングに従って、いずれかの標準的な定義により特定される。重鎖および軽鎖可変領域内のフレームワーク領域を構成するアミノ酸は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づいて、上記セクションＣ．３に記載されている。典型的には、フレームワーク領域は、１１〜３２のアミノ酸を含む。全てのまたは一部のフレームワーク領域は、変異誘発の標的化が可能で、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２アミノ酸が完全または部分飽和変異誘発を受けることができる。フレームワーク領域の選択された領域は、１つまたは複数のアミノ酸残基を含みうる。一部の例では、１つのアミノ酸残基のみが変異誘発される。他の例では、２つ以上のアミノ酸残基が変異誘発される。選択されたアミノ酸残基は、別々に変異誘発可能であり、あるいは、選択されたアミノ酸残基は、同時に、すなわち、１つまたは複数のアミノ酸残基が一緒に変異誘発されうる。例えば、二重変異体が生じ、標的抗原に対する結合能力によりアッセイされる。
上記セクションＣ．４および下記セクションＥ．とＦに記載のように、選択されたアミノ酸は、変異誘発を受け、抗体は発現して、標的抗原に対する活性によりアッセイされる。
ｃ．生殖系列スワッピング
一部の例では、さらなる変異誘発のために選択される領域は、生殖系列セグメント、すなわち、可変重鎖Ｖ、ＤもしくはＪセグメント、または可変カッパもしくはラムダ軽鎖ＶもしくはＪセグメント、例えば、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、Ｖλ、Ｊκ、およびＪλである。可変重鎖では、生殖系列セグメントＶＨはＣＤＲ１およびＣＤＲ２内のアミノ酸を含み、一方、生殖系列セグメントＤＨおよびＪＨはＣＤＲ３内のアミノ酸残基を含む。可変軽鎖では、Ｖ生殖系列セグメント（例えば、ＶκまたはＶλ）はＣＤＲ１、ＣＤＲ２内およびＣＤＲ３の５’末端のアミノ酸残基を含み、一方、Ｊ生殖系列セグメント（例えば、ＶλおよびＪκ）はＣＤＲ３の３’末端のアミノ酸残基を含む。生殖系列セグメントが変異誘発の標的とされる場合は、アミノ酸改変は、全体生殖系列セグメントを同じタイプの別の生殖系列セグメントでスワッピング、または置換することにより、可変重鎖または軽鎖中に導入される。例えば、ＪＨ生殖系列セグメント、例えば、ＩＧＨＪ１＊０１は、異なるＪＨ生殖系列セグメント、例えば、ＩＧＨＪ２＊０１で、または任意の他のＧＨＪ生殖系列セグメントで置換される。実施例１３Ａおよび図４Ａで例示されているように、ＩＧＨＪ１＊０１のスワッピングにより、重鎖ＣＤＲ３内の６アミノ酸残基およびフレームワーク領域４内の７番目の残基の同時変異が可能となる。１つの生殖系列セグメント、例えば、ＪＨがスワッピングされ、あるいは、２つの生殖系列セグメント、例えば、ＤＨとＪＨの両方が、１つの可変重鎖内でスワッピングされうる。
生殖系列セグメントは、重鎖および軽鎖両方のＣＤＲ３をコードするために、通常、ＤまたはＪ生殖系列セグメントが変異誘発のために選択される。さらに特異的となるように、生殖系列セグメントＤＨ、ＪＨ、Ｊκ、および／またはＪλが選択される。実施例１３Ｂに例示するように、ＤＨおよびＪＨセグメント両方のスワッピングは、重鎖ＣＤＲ３のほぼ完全なスキャンをもたらす。図４Ｂに示すように、生殖系列セグメントＪＨは、３つの異なるＪＨセグメントでスワッピングされてＣＤＲＨ３の３’末端の６アミノ酸を変異させ、また、図４Ｃに示すように、ＣＤＲＨ３の中央部の５アミノ酸が改変される。
セクションＥ．とＦで記載のように、生殖系列で抗体は、発現し、標的抗原に対する活性によりアッセイされる。本明細書の本セクションで記載のように、標的抗原に対する活性を高めた、スワッピングされた生殖系列セグメントを含む抗体は、さらなる改変のための中間抗体として使用可能である。
Ｄ．抗体の変換方法
抗体の変換方法が本明細書で提供される。この方法は、親和性が変動しても、標的抗原に対する特異性を維持している抗体は、同じ標的抗原に対して、アゴニストまたは活性化因子−モジュレーター活性からアンタゴニスト活性までの範囲の活性を示すことが可能であるという解明に基づいている。本明細書で記載のように、抗体の薬理的活性は、それらの親和性に依存し、質的に異なる活性（活性化と抑制）が、同じエピトープであるが本質的に異なる親和性を有するエピトープを認識する抗体で発生する。機能の活性化は、受容体クラスタリングによるシグナル伝達の増強、および低親和性変異体の急速なオン／オフ速度に起因することは、本明細書で意図されている。対照的に、高親和性結合体はそのリガンドにしがみつき、放さず、その結果、シグナル伝達を妨げる。従って、抗体は、同じ標的抗原の低親和性アゴニストもしくは活性化因子−モジュレーターとして、または高親和性アンタゴニストとして、治療効果を示すことが可能である。
複数の作用機序が、通常、いくつかのクラスの小分子薬剤で認められるという事実にも拘わらず、臨床用途におけるほぼ全ての抗体は、高親和性アンタゴニストである。例えば、小分子薬剤は、アンタゴニスト、アゴニスト、部分アゴニストまたはアンタゴニストおよびモジュレーターとしての作用を含め、いくつかの作用機序を有する。対照的に、大抵の抗体治療薬は、アンタゴニストとして作用する。ハイブリドーマおよびディスプレイベースシステムの発見された選択機序は、親和性および優勢エピトープ結合を進行させる。従って、抗体エンジニアリングの大抵の方法は、親和性に基づく偏りを示す。これが、大抵の既存のディスプレイベースライブラリーが、高親和性結合剤を素早く特定する能力に基づいて抗体を選択する理由である。例えば、大抵の方法は、標的親和性に基づく競合的選択に依存する。従って、大抵の既存の方法、例えば、競合的親和性選別に依存する伝統的ディスプレイベースの方法は、それらが高親和性と相容れないといる理由だけで、潜在的治療薬を見逃す可能性がある。
従って、抗体の変換方法が本明細書で提供され、それにより、抗体が、アンタゴニストから部分アゴニスト、アンタゴニストもしくは活性化因子−モジュレーター、またはアゴニストもしくは活性化因子−モジュレーターからアンタゴニスト、もしくは部分アンタゴニストに変換されうる。この方法は、拮抗作用、部分拮抗作用または活性化調節からのある範囲の活性を得るために、同じ標的抗原に対する抗体の結合親和性を調節または変更することにより抗体を変換することに基づいている。この方法は、出発抗体の変異誘発手法と、生じた活性の結合親和性および機能活性の評価に対する評価項目の分析とを組み合わせる。ランダムまたは合理的な変異誘発戦略を採用することにより、広い測定範囲の親和性により選別し、アンタゴニスト、部分アンタゴニストまたは活性化因子／モジュレーター活性を有する抗体を特定することができるライブラリーを生成可能である。一部の例では、ライブラリーは、ライブラリーの各メンバーの同一性がわかるようにアレイフォーマットになっている。別の例では、セクションＣに記載の親和性成熟方法と類似の構造／活性関連性（ＳＡＲ）変異誘発戦略が採用可能である。
１．出発または参照抗体の選定
この方法では、変換されるべき出発または参照抗体、もしくはその一部が選択される。選択される抗体は、１）特定の標的抗原に対して既知の活性を示す（例えば、アンタゴニストまたはアゴニスト）、および２）抗体の活性が逆の場合、または部分的に逆転した場合、潜在的な治療効果が存在すると思われるものである。例えば、アンタゴニストまたは部分アンタゴニスト活性を示す抗体は、選ばれることが可能で、それにより、同じ標的抗原に対し逆アゴニスト、部分アゴニストまたは活性化因子−モジュレーター活性を示す抗体も、望ましい。別の例では、標的抗原に対し、アゴニスト、部分アゴニストまたは活性化因子−モジュレーター活性を示す抗体は、選択され、その結果、同じ標的抗原に対し、逆アンタゴニストまたは部分アンタゴニスト活性を示す抗体も、望ましい。
１次または出発抗体は、標的抗原に対し活性を有していることがわかっている、またはそのように特定された抗体である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸または小分子（例えば、神経伝達物質）であってもよい。抗体は、ウイルス、細菌性、腫瘍または他の細胞の表面上に発現している抗原に対し活性を示す、または、精製抗原に対し活性（例えば、結合）を示すことができる。一般的に、標的抗原は、治療介入の標的となるタンパク質である。代表的標的抗原には、これに限定されないが、細胞増殖および分化、細胞遊走、アポトーシスならびに血管新生に関与する標的が含まれる。このような標的には、これに限定されないが、増殖因子、サイトカイン、リンパ球性抗原、他の細胞性活性化因子およびそれらの受容体が含まれる。代表的なこのような標的には、膜結合受容体、例えば、細胞表面受容体が含まれ、これには次のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞増殖因子受容体１、２、および３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−ｂ３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体；ＨＧＦＲとしても知られる）、ＤＬＬ４、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体）、ＫＩＴ（ｃ−ｋｉｔの受容体）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４（繊維芽細胞増殖因子受容体１、２、および４）、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ；マクロファージ刺激１受容体としても知られる）、ＴＥＫ（内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ）、ＴＩＥ（内皮細胞に存在する受容体型チロシンキナーゼ）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１（エリトロポイエチン産生肝細胞受容体Ａ１、Ａ２およびＢ１）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＮＯＴＣＨ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−ＲならびにＥＰＯ−Ｒ。他の標的には、膜結合型のタンパク質、例えば、カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５２またはＣＤ４４から選択されるたんぱく質が含まれる。標的となりうる代表的リガンドには、これに限定されないが、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、リンホトキシン（ＬＴ）、ＩｇＥ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＥＰＯが含まれる。
標的抗原に対し活性を有する１次または出発抗体は、標的抗原または抗原に対する特定の活性を有することが当技術分野で既知であるか、またはそのように特定されている。例えば、免疫化およびハイブリドーマ選別法、ディスプレイライブラリー選別法（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）、またはアドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーを含む（これに限定されない）特定の標的抗原に対し抗体を特定または選択するいずれかの方法が、出発抗体の選択または選出に使用可能である。例えば、特定の活性または親和性を有する抗体を特定する方法が本明細書のセクションＢ．２に記載されている。さらに、本明細書の親和性成熟方法に関してセクションＣ．１、特にセクションＣ．１のｉおよびｉｉに記載されている１次または出発抗体を選択または選出する方法の説明もまた、１次抗体の選択または選出に使用でき、本明細書の抗体変換方法で変換できることは理解されよう。さらに、親和性成熟され、通常、アンタゴニスト活性を示すいずれの抗体も、出発または１次抗体として選択できる。本明細書の別のところで考察したように、親和性成熟法は、当技術分野では既知である（例えば、セクションＢ．３参照）。また、セクションＣで記載された親和性成熟法は、後で本明細書の変換方法に使用可能な抗体、通常、高親和性を有する抗体を特定するのに使用可能である。
１次または出発抗体の活性が未知である場合は、測定することができる。結合親和性および／または機能活性（例えば、アゴニスト、アンタゴニストまたは活性化因子−モジュレーターとして）が測定可能である。代表的アッセイは、本明細書のセクションＥおよび実施例に記載されている。特定のアッセイの選定は、標的抗原および／またはその活性に対する要求に依存する。例えば、ＤＬＬ４は、Ｎｏｔｃｈ１受容体を活性化する細胞表面リガンドで、細胞表面上に発現する。従って、通常、細胞ベースアッセイを採用して活性を評価する。代表的細胞ベースアッセイは、本明細書および実施例に記載のレポーターアッセイである。本明細書の記載に基づいて、各抗体に対して特定のアッセイを決め、最適化することは当業者のレベルの範囲内で可能なことである。
２．変異誘発
１次または出発抗体が選択されるとすぐに、可変重鎖および／または可変軽鎖中のアミノ酸残基が変異誘発を受ける。一般的に、１つまたは複数のＣＤＲ中のアミノ酸残基が変異を受け、例えば、抗体のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２および／またはＣＤＲＨ３中の残基が変異を受ける。例えば、通常、ＣＤＲは３〜２５アミノ酸残基を含むことができる。ＣＤＲ内の全ての、またはサブセットのアミノ酸が変異誘発の標的となり得、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸残基が変異誘発のための標的となりうる。
さらなる変異誘発のために選択されたアミノ酸残基は、当業者に既知のいずれの方法でも改変可能である。アミノ酸残基は、合理的に、またはランダム変異誘発によって改変可能である。これは、コードしているＤＮＡを改変することにより達成可能である。当業者なら変異誘発方法をよく知っている。例えば、セクションＣ．１．ｄで記載のいずれかの変異誘発方法が使用可能である。一例では、１次または出発抗体中の結合に関与する残基が既知である場合は、これらの残基は、種々の変異誘発戦略のいずれかにより合理的に標的とされうる。別の例では、ランダム変異誘発法が採用可能である。代表的なこのような変異誘発戦略では、当技術分野で既知の方法を使って配列が無作為化されるが、この方法には、これに限定されないが、エラープローンＰＣＲまたはドーピング戦略が含まれる。変異誘発されたタンパク質は、セクションＦに記載のように発現する。本明細書中で以下に記載のように、変換を目的として、変異抗体のライブラリーまたは収集を作成し、選別することができる。一部の例では、ライブラリーはアドレス指定できるライブラリーである。
３．変換抗体に対する選択
変異誘発されたタンパク質は発現し、標的抗原に対する結合親和性および／または標的抗原に対する機能活性の調節に与える効果により評価される。出発または１次抗体に比較して逆転した結合親和性および活性（例えば、より高いまたはより低い；アンタゴニスト対アゴニスト／活性化因子−モジュレーター）を有する変換抗体が選択される。
ａ．結合
変換抗体の選択の第１ステップでは、結合親和性が評価される。活性を評価する当業者に既知のいずれの方法、例えば、本明細書の以下のセクションＥ．１でさらに記載されるような方法、でも使用可能である。例えば、代表的結合アッセイには、これに限定されないが、例えば、下記の技術を使った、競合的および非競合的アッセイシステム、等のイムノアッセイが含まれる：ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、メソ・スケール・ディスカバリー電気化学発光測定法（ＭＳＤ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、免疫沈降アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定分析、蛍光イムノアッセイ、およびタンパク質Ａイムノアッセイ。このようなアッセイは、日常的に使用され、当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ、１９９４、「分子生物学における最新プロトコル」、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋを参照のこと。本文献は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、本明細書で提供される方法では、標的抗原に対する抗体の結合はＥＣＬ結合アッセイを使って測定される。別の例では、結合はＥＬＩＳＡにより測定される。本明細書の別のところで考察されているように、１次抗体と変異抗体の間の結合親和性の比較は、通常、同じ構造を有する抗体間で行われ、例えば、ＩｇＧのＦａｂは、ＩｇＧのＦａｂと比較される。
例えば、アンタゴニスト抗体が１次または出発抗体として選択される場合は、アゴニスト、部分アゴニストまたは活性化因子−モジュレーターが結合親和性に対する最初の抗体試験により選択される。１次または出発抗体より結合親和性の減少（例えば、より高い結合親和性）を示す抗体が選択される。例えば、２倍〜５０００倍、例えば、１０倍〜５０００倍、例えば、１００倍〜１０００倍減少した結合親和性を示す抗体が選択される。例えば、１次または出発抗体の結合親和性が１０−９Ｍである場合、１０−７Ｍの結合親和性を示す抗体は、１０００倍の結合親和性の減少を示すことになる。
別の例では、アゴニスト、部分アゴニスト、または活性化因子−モジュラー抗体が１次または出発抗体として選択される場合、アンタゴニストまたは部分アンタゴニスト抗体が結合親和性に対する最初の抗体試験により選択される。１次または出発抗体より強化された、または増加した結合親和性（例えば、より低い結合親和性）を示す抗体が選択される。例えば、１０倍〜１０、０００倍、例えば、１００倍〜５０００倍、例えば、約５００倍〜２５００倍、強化された、または増加した結合親和性を示す抗体が選択される。例えば、１次または出発抗体が１０−７Ｍである場合、１０−９Ｍの結合親和性を示す抗体は、１０００倍増加または強化された結合親和性を示すものとして選択される。
ｂ．機能活性
結合親和性に基づき最初に選択された変異抗体は、次に、機能活性の逆調節により選択される。機能活性を評価するアッセイは当業者にはよく知られ、特定の標的タンパク質に応じて経験的に判断されている。通常、このアッセイは、細胞ベースアッセイである。代表的細胞株を含む代表的アッセイは、本明細書のセクションＥに記載されている。アッセイされる細胞は、特定の標的対象タンパク質を発現している。タンパク質を発現していない対照細胞もまた、特異性評価に使用可能である。採用されるアッセイは、容易に判断可能な定量的活性評価を提供する出力を与えることができるものである。例えば、代表的機能アッセイには、レポーターアッセイが含まれ、それにより、例えば、外因的に付加されたリガンドによる細胞表面受容体の活性化時に、測定可能なレポーターシグナルが誘導される。細胞表面受容体またはリガンドに対するアンタゴニストまたは部分アンタゴニスト抗体の存在下では、測定された出力が抗体の阻害効果に呼応して減少する。対照的に、アゴニスト、部分アゴニストまたは活性化因子−モジュレーターの存在下では、測定された出力は、抗体の活性化効果に呼応して増加する。
例えば、出発または１次抗体が標的タンパク質アンタゴニストの場合は、上記ａ）において、最初に低下した結合親和性（例えば、より高い結合親和性）を有するとして選択された１次抗体の変異抗体が、同じ標的タンパク質に対し、アゴニスト、部分アゴニストおよび／または活性化因子−モジュレーターとしてさらに活性の試験をされる。変換されたとして選択された抗体は、標的タンパク質の機能活性化を示すものである。従って、同じ活性化条件の抗体が存在しない条件下で示される活性に比べて、抗体の存在により標的タンパク質の活性増加、または標的タンパク質の評価項目の活性増加を生ずる。例えば、標的タンパク質がリガンドの存在下で正常に活性化する場合、設定された測定活性が得られ；アゴニスト、部分アゴニストまたは活性化因子−モジュラー抗体が追加されて存在する場合は、測定活性は増加する。別の例では、標的タンパク質が受容体を正常に活性化するリガンドである場合、リガンド−受容体相互作用は設定された測定活性が得られる；リガンドに追加した抗体が存在する場合、測定活性は増加する。例えば、標的タンパク質の活性は、同じ活性化条件と抗体が存在しない条件下での標的タンパク質の活性に比べ、１．２〜２倍、２倍〜１０００倍増加し、例えば、５倍〜５００倍、例えば、１０倍〜２００倍増加し、例えば、１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍またはそれ以上増加する。
別の例では、出発または１次抗体が標的タンパク質のアゴニスト、部分アゴニストまたは活性化因子−モジュレーターの場合、上記ａ）において、最初増加または強化された結合親和性を有する（例えば、より低い結合親和性）として選択された１次抗体の変異抗体が、同じ標的タンパク質に対するアンタゴニストまたは部分アンタゴニストとしての活性によりさらに試験される。変換されているとして選択された抗体は、標的タンパク質に阻害活性を示すものである。従って、抗体の存在が、同じ活性化条件の抗体が存在しない条件下で示される活性に比べ、標的タンパク質の活性の低減、または標的タンパク質の評価項目の活性の低減をもたらす。例えば、標的タンパク質がリガンドの存在下で正常に活性化する場合、設定した測定活性が得られ；アンタゴニストまたは部分アンタゴニスト抗体が追加されて存在する場合、測定活性は減少する。別の例では、標的タンパク質が正常に受容体を活性化するリガンドである場合、リガンド−受容体相互作用により、設定された測定活性が得られ；リガンドに追加されて抗体が存在する場合は、測定活性が増加する。例えば、標的タンパク質の活性は、同じ活性化条件と抗体が存在しない条件下での標的タンパク質の活性化に比べ、１．２〜２倍、２倍〜１０００倍減少し、例えば、５倍〜５００倍、例えば、１０倍〜２００倍減少し、例えば、１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍またはそれ以上減少する。
本明細書の抗体変換方法の一部の例では、増加または減少した結合親和性に基づいた最初の抗体選択ステップを行わない。従って、本明細書の抗体変換方法は、本明細書に記載のように、１次または出発抗体を直接選択することにより行い、本明細書記載のように変異誘発して、１次または出発抗体の逆の機能活性により変異抗体の収集を直接試験する。逆の活性を示す変換された抗体が選択される。
本明細書で提供される方法の実施に際し、通常、抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖のみが変異誘発を受ける。選択された最終的抗体は、通常、少なくとも抗原結合部位を形成するのに充分な可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む。しかし、抗体は、また、全てまたは一部の定常重鎖（例えば、１つまたは複数のＣＨドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）、および／または定常軽鎖（ＣＬ）を含んでもよいことは理解されよう。従って、抗体は、完全長抗体を含むことができ、また、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ならびにｓｃＦａｂ断片、を含む断片またはその一部、を含むことができる。また、本明細書で提供されるように、抗体が変換されるとすぐに、生じた抗体は、完全長抗体またはその断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ならびにｓｃＦａｂ断片、として産生されうることは理解されよう。さらに、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域は、完全または部分抗体断片の生成に使用可能である。このような定常領域は、いずれかのヒトまたは動物種から入手可能である。例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト、としての活性は実質的に変化するとは予測されないにしても、活性および結合親和性は、抗体の構造によって異なる可能性があることは理解されよう。例えば、一般的に二価の抗体、例えば、二価のＦ（ａｂ’）２断片または完全長ＩｇＧは、一価Ｆａｂ抗体よりも大きい結合親和性を有する。その結果、Ｆａｂが、特定の標的に対し特定の結合親和性を有する場合は、二価の完全長ＩｇＧがさらに大きな結合親和性を有するということは除外して考えるべきである。
生成した変換抗体は、治療薬の候補である。代表的実施方法は、本明細書の実施例で記載される。例えば、実施例１９では、ＤＬＬ４に対し低親和性を有する、２つの異なる抗ＤＬＬ４生殖系列抗体が、アゴニスト活性を示したことが示されている。本明細書記載の親和性成熟法による抗体のそれぞれの変異誘発により、同じ標的抗原に対しより高い親和性を有するアンタゴニスト抗体への変換がもたらされる。
Ｅ．アッセイ
本明細書の方法で産生された抗体は、標的抗原に対する活性により評価することができる。改善された結合親和性を有するか、または標的の活性を変更または調節（増加または低減）する抗体が選別され、変異または改変抗体が特定される。通常、本明細書の方法には、標的抗原に対する結合により抗体を選別し試験することが含まれる。また、他の活性は、細胞障害性、細胞分化または増殖、細胞遊走、アポトーシス、血管新生および遺伝子発現変化、を含む評価項目（これらに限定されない）に対してアッセイすることができる。
１．結合アッセイ
本明細書で提供される抗体は、当業者に既知のいずれかの方法により、選択標的に結合する能力によって選別できる。代表的標的抗原は、セクションＣ．１に記載されている。結合アッセイは、溶液中、懸濁液中または固体支持体上で行うことができる。例えば、標的抗原を、固体支持体（例えば、炭素もしくはプラスチック表面またはチップ）に固定し、抗体を接触させることができる。非結合抗体または標的タンパク質を洗い流し、次に、結合複合体を検出できる。結合アッセイは、非イオン性洗剤（例えば、０．１％トリトンＸ−１００またはツイーン２０）および／またはブロッキングタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはゼラチン）と一緒に高イオン強度緩衝液（例えば、０．３〜０．４Ｍ ＮａＣｌ）を使う、等の非特異的結合を減らす条件下で行うことができる。また、陰性対照も、バックグラウンド結合の基準としてこのようなアッセイ中に含めることもできる。結合親和性は、スキャチャード解析（Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０））、ＢＩＡＣｏｒｅまたは当業者に既知の他の方法を使って測定可能である。
代表的結合アッセイには、これに限定されないが、例えば、次の技術を使った競合的および非競合的アッセイシステム等のイムノアッセイが含まれる：ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、メソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、免疫沈降アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定分析、蛍光イムノアッセイ、およびタンパク質Ａイムノアッセイ。このようなアッセイは日常的に使用され、当技術分野ではよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ、１９９４、「分子生物学における最新プロトコル」、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、を参照。本文献は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。他のアッセイ形式には、リポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）があり、これは、特異的分子（例えば、抗体）に結合し、カプセル化試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを使う。放出された化学物質は、次に、標準的な方法により検出される（Ｍｏｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．、（１９８６）Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１、参照）。
通常、結合は、標的または必要に応じ直接ライブラリー中の抗体メンバーに結合させた検出可能成分または標識（例えば、酵素、放射性核種、蛍光プローブ、電気化学発光標識、または色染料）を使って検出される。あるいは、結合は、それ自体に標識した、またはそれ自体検出可能である追加の３番目の試薬によって検出可能である。例えば、標的タンパク質に結合した抗体の検出は、サンドイッチ法フォーマットの標識捕獲分子を使って達成できる。免疫グロブリン定常領域に特異的に結合できる他のタンパク質、例えば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇもまた、標識試薬として使用可能である。これらのタンパク質は、種々の種由来の免疫グロブリン定常領域に対し強力な非免疫原性反応性を示す（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌ ｅｔ ａｌ．、（１９７３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１４０１−１４０６；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．、（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９−２５４２、参照）。検出試薬は、ストレプトアビジン等の別の分子が特異的に結合可能な検出可能成分、例えば、ビオチン、で修飾可能である。種々の検出可能成分が当業者にはよく知られている。
アッセイに使われる抗体の特異的結合を著しく妨害しない限りは、アッセイに使われる標識または検出可能基の選択は、重大ではない。通常、選択は、必要な感度、化合物との結合の容易さ、安定性要件、利用可能な装置、および廃棄規定に依存する。当業者は、標識をよく知っており、採用されるアッセイに適し、それと相性がよい検出可能標識を選定できる。
検出可能基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の材料であってよい。このような検出可能標識はイムノアッセイの分野で充分に開発されてきており、一般的に、このような方法に使われる大抵の標識が本明細書に適用可能である。従って、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。有用な標識には、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソチオシアナート、Ｔｅｘａｓｒｅｄ、ローダミン、等）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼおよびＥＬＩＳＡでよく使われる他のもの）、化学発光標識（ルシフェリンおよび２、３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノール）、ならびに比色標識、例えば、コロイド状金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、等）が挙げられる。使用可能な種々の標識化またはシグナル生成システムの概説に関しては、例えば、米国特許第４、３９１、９０４号を参照のこと。
標識を検出する手段は当業者によく知られている。従って、例えば、標識が放射性の標識である場合には、検出手段には、オートラジオグラフィーの場合のようにシンチレーションカウンターまたは写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合には、蛍光色素を適切な波長の光で励起して、生じた蛍光を検出することができる。蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管、等の電子的検出器を使って、目視により検出出来る。同様に、酵素標識は、酵素に対する適切な基質を提供し、得られた反応生成物を検出することができる。最後に、単純な比色標識は、単純に標識に関連した色を観察することにより検出出来る。
一部のアッセイ形式では、標識した成分の使用を要しない。例えば、凝集アッセイは、標的抗体の存在を検出するのに使用できる。この場合、抗原コート粒子が標的抗体を含む試料により凝集させられる。この形式では、どの成分も標識する必要がなく、標的抗体の存在が単純な目視検査で検出される。
あるいは、本明細書で提供される抗体は、サブトラクティブパニング（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｐａｎｎｉｎｇ）を行う場合と行わない場合の全細胞パニングを使って、細胞に結合する能力により選別できる。選別は、生きた細胞に対して、またはインタクトの緩く固定した標的細胞に対して行うことができる。全細胞パニングの方法は、以前記載している（例えば、Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０６：７３−８５、を参照。本文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。他の適用可能選別技術には、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣｓ）がある。
高スループット選別のために、アッセイを多重化可能である。従って、多くの異なる標的タンパク質に対する抗体の結合親和性が同時に測定可能である。一例では、異なる標的タンパク質が異なる検出可能成分で別々に標識可能である。例えば、異なる抗原を色分けしたビーズに結合させることができる（Ｓｃｈｗｅｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔ．、６：１２５−１３２）。別の例では、プレートの座位中の１００タンパク質までの吸収によりアッセイを多重化するマルチスポットプレートを使うことができる（例えば、メソ・スケール・ディスカバリー；ＭＳＤ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから入手したマルチアレイまたはマルチスポットプレートを使って）。このような例では、抗体は、マルチスポットプレートの各ウエルに異なる抗体を添加することにより選別可能である。このアッセイは、多くの標的タンパク質に対して数千の抗体を一度に選別することを容易に可能にする。
本明細書の選別方法では、通常、標的抗原に対して特異的に結合し、１次抗体に比べ増加した結合親和性を有する抗体が特定される。Ｋｄの減少として測定される親和性の増加は、会合速度（ｋｏｎ）の増加、もしくは解離速度ｋｏｆｆの減少、または両方により達成できる。例えば、抗体の結合親和性は、標的タンパク質に対する高親和性を有する抗体を特定、または選択するために測定される。例えば、本方法の実施により生成した親和性成熟抗体は、１ｘ１０−９Ｍ未満、通常１ｘ１０−９Ｍ〜１ｘ１０−１１Ｍ、例えば、正確にまたは約１ｘ１０−９Ｍ、２ｘ１０−９Ｍ、３ｘ１０−９Ｍ、４ｘ１０−９Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、６ｘ１０−９Ｍ、７ｘ１０−９Ｍ、８ｘ１０−９Ｍ、９ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、２ｘ１０−１０Ｍ、３ｘ１０−１０Ｍ、４ｘ１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、６ｘ１０−１０Ｍ、７ｘ１０−１０Ｍ、８ｘ１０−１０Ｍ、９ｘ１０−１０Ｍまたはそれ未満の標的抗原に対する結合親和性を有することができる。
当業者に既知のいずれの方法も、抗体の結合親和性を測定するために使用可能である。例えば、抗体の結合特性は、飽和結合アッセイ、例えば、飽和ＥＬＩＳＡ、を行うことにより評価でき、それにより、抗体量の増加に伴う標的タンパク質に対する結合が評価される。このような実験では、結合が用量依存性および／または飽和性であるかどうかを評価できる。さらに、結合親和性は、５０％結合シグナルから外挿できる。通常、見かけの結合親和性は、結合定数（Ｋａ）または解離定数（Ｋｄ）として測定され、スキャチャード解析を使って決定される（Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）。例えば、標的タンパク質に対する結合親和性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡ、等により非標識タンパク質を漸増濃度で添加する、競合結合アッセイで評価可能である。結合親和性は、また、ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析を使って分析可能である。これは、表面に固定化した標的タンパク質を含むチップからの抗体メンバーの結合および解離を解析することを含む。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアは、相互作用モデルにデータをフィッティングさせることにより、ＫａとＫｄの値を生成する。結合親和性の全アッセイは、粗い近似を提供してはくれるが、抗体の結合親和性は、採用アッセイおよび条件によって変化しうることは理解されよう。種々の条件下で種々のアッセイを行うことにより、抗体の結合親和性を推定することが可能となる。
さらに、結合親和性は、抗体の構造により異なる可能性がある。例えば、通常、二価の抗体、例えば、二価のＦ（ａｂ’）２断片または完全長ＩｇＧは、一価Ｆａｂ抗体よりも良好な結合親和性を有する。従って、Ｆａｂが特定の標的に対し、特定の結合親和性を有する場合、結合親和性は二価の完全長ＩｇＧに対してはさらに大きいということは除外して考えるべきであることは理解されよう。
２．機能活性
本明細書の方法により生成された抗体は、当業者に既知の任意の方法で、標的の機能活性を調節する能力により選別することができる。アッセイは、細胞表面受容体を結合および／または調節することができる抗体を特定するように設計できる。このような抗体は、受容体結合の正常な効果を模倣するアゴニスト、または受容体結合の正常な効果を阻害するアンタゴニストでありうる。特に関心のあるのは、受容体に結合し、細胞内シグナル伝達を調節する試薬の特定である。
一部の例では、このようなアッセイは、細胞ベースアッセイアッセイである。通常、アッセイは、対象標的を発現することが知られている細胞株を使って行われる。このような細胞は当業者には既知である。例えば、ＡＴＣＣカタログ（ａｔｃｃ．ｏｒｇ）を調べ、細胞株を特定することができる。また、特定の細胞型が必要なら、このような細胞の入手手段、および／またはそれらのすぐ利用可能なソースは、当業者には既知である。科学文献の分析により、任意の所望の標的を発現している細胞の適切な選択を容易に明らかにすることができる。表５は、本明細書で提供された抗体ライブラリーに対し本明細書の機能活性で選別可能な対象標的を発現している代表的細胞株のリストである。
Figure 0006007420
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さらに、対象標的を発現している発現ベクターの一時的または安定なトランスフェクションにより対象標的を発現している細胞株を生成できる。トランスフェクションおよび発現の方法は当業者には既知である（例えば、ＫａｕｆｍａｎＲ．Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：５３７−５６６；Ｋａｕｆｍａｎｅｔａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：５３７−５６６、参照）。さらに、いずれかの１次細胞または細胞株を特定の標的（例えば、細胞表面マーカー）の発現により評価可能である。細胞表面マーカーは蛍光標識抗体およびＦＡＣＳを使ってアッセイできる。適切な細胞株には、Ａ５４９（肺）、ＨｅＬａ、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＪＡＢ、Ｃｏｌｏ２０５、Ｈ１２９９、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ３、ＨＵＭＥＣ、ＨＵＶＥＣ、およびＰｒＥＣが挙げられる。
本明細書に記載のように、いずれかの適切な機能的効果が測定可能である。例えば、細胞形態（例えば、細胞容量、核容量、細胞周囲長、および核周囲長）、リガンド結合、基質結合、ヌクレアーゼ活性、アポトーシス、走化性または細胞遊走、細胞表面マーカー発現、細胞増殖、ＧＦＰ陽性および色素希釈アッセイ（例えば、細胞膜に結合する染料を用いたｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒアッセイ）、ＤＮＡ合成アッセイ（例えば、３Ｈ−チミジンおよび蛍光ＤＮＡ結合染料、例えば、ＢｒｄＵまたはＨｏｅｃｈｓｔ染料を使ってＦＡＣＳ分析で）およびｎｕｃｌｅａｒ ｆｏｃｉアッセイ、は全て、細胞ベースシステムを使って潜在的モジュレーターを特定するために適切なアッセイである。他の測定可能な機能活性には、これに限定されないが、リガンド結合、基質結合、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性、既知のおよび性質不明の遺伝子マーカーへの転写変化（例えば、ノーザンブロット）、細胞代謝の変化、細胞増殖関連の変化、細胞表面マーカー発現、ＤＮＡ合成、マーカーおよび色素希釈アッセイ（例えば、ＧＦＰおよびｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒアッセイ）、接触阻害、ヌードマウス中の腫瘍増殖、等がある。
例えば、本明細書で提供される方法により生成された抗体は、標的タンパク質を発現することがわかっている細胞の１つまたは複数の表現型の調節により評価可能である。表現型のアッセイ、キットおよび使用される試薬は当業者にはよく知られており、本明細書で抗体ライブラリーを選別するために使用される。いくつかの市販品ベンダーのいずれかから入手可能な代表的な表現型のアッセイには、細胞生存率、細胞障害性、増殖または細胞生存（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）、酵素アッセイ（Ｐａｎｖｅｒａ、ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を含むタンパク質ベースアッセイ、細胞調節、シグナル伝達、炎症、酸化プロセスおよびアポトーシス（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ Ｉｎｃ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．）、トリグリセリド蓄積（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、血管新生アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイならびに代謝アッセイ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａｌｉｆ．；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、を測定するものが含まれる。
特定の表現型のアッセイに適切であると判断された細胞（すなわち、Ａ５４９、ＨｅＬａ、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＪＡＢ、Ｃｏｌｏ２０５、Ｈ１２９９、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ３、ＨＵＭＥＣ、ＨＵＶＥＣ、およびＰｒＥＣおよび対象標的を発現するとわかっているいずれかの他の細胞）が、抗体ならびに対照化合物と一緒に処理される。必要に応じ、受容体標的に対するリガンドが含まれ、それにより受容体が活性化される。治療期間の終わりに、処理された細胞および未処理細胞が、特異的な１つまたは複数の方法によりアッセイされ、表現型の結果および評価項目が測定される。
表現型評価項目には、時間または治療用量に対する細胞形態の変化、ならびに細胞成分、例えば、タンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖類または金属のレベルの変化が含まれる。ｐＨ、細胞周期のステージ、細胞による生物指標の摂取量または排出量、を含む細胞状態の測定値、もまた対象となる評価項目である。
標的タンパク質に対する抗体の直接効果を評価するために、アッセイを行うことができる。例えば、標的タンパク質が細胞表面受容体である場合、標的タンパク質が直接に、例えば、刺激により、受容体の活性または機能を調節するかどうかを評価するために抗体を添加することができる。このような場合には、抗体はアゴニスト抗体と見なされる。別の例では、標的タンパク質が細胞表面受容体の場合には、受容体の活性が、リガンドまたは他の刺激試薬の存在下、かつ抗体の存在下または非存在下、で刺激され、抗体が抗体の作用を調節するかどうか（例えば、阻害するかどうか）を判定する。例えば、抗体は、受容体と相互作用してリガンドの能力をブロックすることにより作用すること、および／または、さもなければ、負の刺激シグナルを誘導することができる。このような場合は、抗体は、受容体のアンタゴニストと見なされる。従って、本明細書の機能活性による選別方法は、アゴニストおよびアンタゴニスト抗体の特定を可能にする。
ａ．分化
細胞分化は、物理的、化学的または表現型変化の検出を可能とするいずれかのアッセイを使って解析可能である。種々のアッセイが、外部刺激に応答した細胞増殖および活性化を定量的に測定するのに使用される。細胞増殖アッセイは、細胞分化時に新しく合成された細胞のＤＮＡ中に試薬を組み込む事により細胞増殖を定量的に測定するために使用される。このような試薬には、これに限定されないが、３Ｈ−チミジン、５−ブロモ−２′−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）および蛍光Ｈｏｅｃｈｓｔ染料、が含まれる。細胞生存率アッセイは、生きている細胞は染料を排除するという事実に基づいて、細胞を染料で染色し、どのくらいの細胞が染料を取り込んだかを測定することにより試料中の健康な細胞の数を測定するのに使用される。このような染料には、これに限定されないが、３−（４、５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、２、３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド分子内塩（ＸＴＴ）、および４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１、３−ベンゼンジスルホナート（ＷＳＴ−１）、が挙げられる。試薬の取り込みは、分光光度計を使って比色測定で、またはシンチレーションカウンターで照射を測定して求められる。これらの方法の詳細は当業者にはよく知られている。
蛍光染料は、種々の細胞ベースアッセイで、生きている細胞および主要な機能活性の検出によく使用される。細胞代謝に依存しない、いくつかの非放射性、蛍光ベースアッセイがある。蛍光染料が核酸に結合し、その後、蛍光を定量的または定性的に測定できる。このような染料には、これに限定されないが、プロピジウムヨウ化物およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２、がある。次いで、蛍光に基づいて細胞数が定量できる。ＤＮＡ含量も画像処理装置に付属する利用可能なツールを使って定量化可能である。これらの方法の詳細は当業者にはよく知られている。
マトリゲルまたは一部の他の細胞外の基質成分中への侵襲の程度を、異常細胞増殖および腫瘍増殖を阻害することができる抗体を特定するアッセイとして使用できる。腫瘍細胞は、悪性度と、マトリゲルまたは一部の他の細胞外の基質成分中への侵襲性の間の良い相関を示す。このアッセイでは、通常、腫瘍原性細胞が宿主細胞として使用される。従って、抗体は、潜在的モジュレーターの導入前後の宿主細胞間の侵襲性レベルの変化を測定することにより特定可能である。
簡単に述べれば、宿主細胞侵襲レベルは、マトリゲルまたは一部の他の細胞外の基質成分でコートしたフィルターを使って測定することができる。ゲル中、またはフィルターの遠位側への浸透は、細胞の数と移動距離により、または細胞を１２５Ｉで前標識し、フィルターの遠位側またはディッシュの底の放射能をカウントすることにより組織学的に分類され、侵襲力としてランク付けされる（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、「基本技術マニュアル：動物細胞の培養」、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、参照。本文献は、参照によって本明細書に組み込まれる］）。
ｂ．遺伝子発現の変化
抗体による標的に対する結合および／または調節の検出は、生物学的応答、例えば、Ｃａ２＋イオン流束、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、ＰＩＰ３またはレポーター遺伝子の転写を測定することにより検出できる。治療後の細胞の遺伝子型の分析（レポーター遺伝子アッセイを使った１つまたは複数の細胞遺伝子の発現測定）もまた、抗体の有効性または効力の指標として使われる。特徴遺伝子、またはシグナル伝達経路に関連すると疑われる遺伝子が、処理後または未処理の両細胞中で測定される。
レポーター遺伝子の活性化を測定するアッセイを行うことができる。適切なレポーター遺伝子には、例えば、トランスフェクション、電気穿孔、リポフェクションおよびウイルス感染、等の当業者にはよく知られた標準的な方法のいずれかにより細胞中に導入される内在性遺伝子ならびに外因性の遺伝子が含まれる。例えば、組換え型受容体を発現している細胞に、応答配列に機能的に連結されたレポーター遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリフォスファターゼ）を形質移入できる。次に、細胞を抗体とインキュベートし、レポーター遺伝子の発現が、組換え型受容体を発現しないが他の点では基本的に同じである対照細胞中での発現と比較される。受容体発現細胞中のレポーター遺伝子発現の統計的に有意な変化により、試験化合物が受容体と相互作用していることが示される。さらに、対象タンパク質は、２次レポーター、例えば、赤色または緑色蛍光タンパク質への付着を介した間接的レポーターとして使用可能である（例えば、Ｍｉｓｔｉｌｉ ＆ Ｓｐｅｃｔｏｒ、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：９６１−９６４、参照）。
レポーター構築物は、通常、細胞中に形質移入される。潜在的モジュレーターで処理後、レポーター遺伝子の転写、翻訳、または活性の量が当業者に既知の標準的な方法により測定される。ルシフェラーゼを使ったレポーター遺伝子アッセイを使用して、直接的、またはサイクリンＤプロモーターの誘導によるＳＴＡＴ５活性の測定に関し、実施例１２で例示されている。
ｃ．細胞障害活性
抗体は、アポトーシスまたはプログラム細胞死を直接誘導し、または増殖因子受容体を遮断することにより間接的にアポトーシスを誘導し、それにより増殖を効率的に抑止する能力により選別可能である。また、抗体は補体に結合し、補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）として知られる、直接的細胞毒性の原因となる。従って、補体依存性細胞障害を評価するアッセイを行うことができる。
アポトーシスを評価する種々のアッセイは当業者には既知である。例えば、アポトーシスアッセイには、アポトーシスに関与する酵素であるカスパーゼの活性の試験をするアッセイが含まれる。カスパーゼアッセイは、酵素前駆体の活性酵素およびタンパク分解活性へのプロセッシングの測定に基づいている。多くの市販キットおよび試薬がカスパーゼ機能に基づくアポトーシス評価に利用可能であり、これに限定されないが、ＰｈｉＰｈｉＬｕｘ（ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｉｎ、Ｉｎｃ．）、Ｃａｓｐａｓｅ ３ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ ｓｃｉｅｎｃｅ）、ホモジニアスカスパーゼアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ａｐｏ−ＯＮＥ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｃａｓｐａｓｅ−３／７ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＣａｓｐＡＣＥ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｏｒ Ｆｌｕｏｒｍｅｔｒｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＥｎｚＣｈｅｋ Ｃａｓｐａｓｅ−３ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｉｍａｇ−ｉＴ ＬＩＶＥ ｇｒｅｅｎ Ｃａｓｐａｓｅ−３ ａｎｄ ７ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｃｔｉｖｅ Ｃａｓｐａｓｅ−３ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｃａｓｐａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）およびＣａｓＰＡＳＥ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ）、が含まれる。
アポトーシスのためのアッセイには、ヌクレアーゼの活性化およびその後のＤＮＡ開裂による１８０〜２００塩基対増加を測定するＴＵＮＥＬおよびＤＮＡ断片化アッセイが含まれる。このようなアッセイおよびキットは、市販品として入手可能であり、これには限定されないが、アポトティックＤＮＡラダーキット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、細胞ＤＮＡフラグメンテーションＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤｅａｄＥｎｄ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｉｒｃ ｏｒ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＰＯ−ＢｒｄＵ ＴＵＮＥＬアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＴＵＮＥＬ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｕｐｓｔａｔｅ）が含まれる。
アポトーシスを評価する他のアッセイには、例えば、膜の完全性の減少を評価する細胞透過性アッセイが含まれる。例えば、抗体が細胞死を誘導することが可能かどうかを判定するために、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）、トリパンブルー、または７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）の取り込みで評価した膜の完全性の減少を、未処理細胞に比較して評価できる。さらに、市販キット、例えば、ＡＰＯＰｅｒｃｅｎｔａｇｅ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ Ａｓｓａｙｓ）を使ってアポトーシスを測定できる。また、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ａｓｓａｙも採用可能である。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖは、結合ｔｏホスファチジルセリンに結合するが、これは．通常、細胞質膜の内表面上に認められる。アポトーシスの間に、ホスファチジルセリンが外表面に移動し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖにより検出できる。例えば、蛍光標識Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを使った標準的結合アッセイを使うことができる（例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ３５０複合体）。アポトーシスは、また、他のアポトーシスマーカーの存在を評価することにより、タンパク質開裂を評価することにより、および／またはミトコンドリアおよびＡＴＰ／ＡＤＰアッセイにより、測定可能である。このようなアッセイは、日常的に使用され、当業者には既知である。
例えば、アポトーシス分析は、細胞株、例えば、ＲＫＯもしくはＨＣＴ１１６、または対象標的タンパク質を発現している他の細胞を使って、機能的抗体を特定するアッセイとして使用可能である。この細胞は、マーカー遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質、またはｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ染料をコードした遺伝子、を含む構築物を同時形質移入できる。アポトーシス性変化は、当技術分野で既知の方法、例えば、螢光顕微鏡を使ったＤＡＰＩ染色およびＴＵＮＥＬアッセイ、を使って測定できる。ＴＵＮＥＬアッセイに関しては、市販の利用可能なキット（例えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ＦｒａｇＥＬ ＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＱＩＡ３９およびテトラメチル−ローダミン−５−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１５３４３７８））が使用可能である。抗体と接触した細胞は、例えば、対照に比べアポトーシスの増加を示す。
インビトロの細胞死は、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存細胞障害（ＣＤＣ）により誘導された細胞死を区別して測定可能である。従って、加熱不活性化した血清（すなわち、補体の非存在の）を使い、免疫エフェクター細胞の非存在下、細胞死のためのアッセイを行うことができる。
３．インビボアッセイ
親和性成熟抗体または変換抗体が本明細書の方法で生成されるとすぐ、標的の異常活性に関連したインビボアッセイにより評価可能である。一般的に、この方法は、対象に、通常は、疾患または状態のために非ヒト動物モデルに、抗体を投与すること、およびモデル動物の疾患または状態に対する抗体の効果を判断することを含む。インビボアッセイには、対照が含まれるが、適切な対照には抗体を含まない試料が含まれる。通常、異なる抗体濃度の複数のアッセイ混合物が同時に行われ、様々な濃度に対する反応の差が得られる。通常は、これらの濃度の１つが陰性対照、すなわち、ゼロ濃度の、または検出レベル以下の対照として使える。
非ヒト動物モデルには、疾患の進行に与える効果をモニターするために、抗体の投与の前に、疾患および／または表現型誘導物質を含む注射により、疾患を有するように誘導されたモデルが含まれる。遺伝的モデルもまた、有用である。過剰発現、過小発現または１つまたは複数の遺伝子のノックアウトにより疾患または状態を模倣する動物、例えば、マウスを生成できる。このような動物は、当技術分野でよく知られた遺伝子導入動物産生技術により、または天然もしくは誘導変異株を使って、生成可能である。当業者なら特定の標的に関連した種々の動物モデルをよく知っている。
このような動物モデル系には、これに限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ならびに非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジーおよびサル、が含まれる。当技術分野でよく知られたいずれの動物系も使用可能である。いくつかの手順の態様が変化する可能性がある；前記態様には、これに限定されないが、抗体（例えば、予防薬および／または治療薬）投与の時間的計画、このような抗体を別々に投与するのか、または混合物として投与するのかということ、および抗体の投与頻度が挙げられる。
組換え型（遺伝子導入）動物モデルは、遺伝子導入動物を産生する標準的な方法を使って、本明細書で特定された遺伝子のコード部分を対象動物のゲノム中に導入することにより操作可能である。遺伝子導入操作の標的として使用できる動物には、これに制限されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタならびに非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジーおよびサルが含まれる。このような動物中に導入遺伝子を導入する当技術分野で既知の技術には、前核マイクロインジェクション（米国特許第４、８７３、１９１号）；レトロウイルス媒介遺伝子の生殖細胞系列への移入（例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５）；胚性幹細胞標的遺伝子（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１）；胚の電気穿孔（Ｌｏ、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４）；精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７３）、が含まれる。概説としては、例えば、米国特許第４、７３６、８６６号を参照のこと。
動物モデルは、本明細書で提供される抗体、組成物、または併用療法の有効性の評価に使用可能である。肺癌の動物モデルの例には、これに限定されないが、肺癌動物モデル（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、（１９９４）Ｉｎ Ｖｉｖｏ ８（５）：７５５−６９）および破壊されたｐ５３機能を有する遺伝子導入マウスモデル（例えば、Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．、（１９９８）Ｊ Ｌａ Ｓｔａｔｅ Ｍｅｄ Ｓｏｃ １５０（４）：１７９−８５、参照）、が含まれる。乳癌の動物モデルの例には、これに限定されないが、サイクリンＤ１を過剰発現している遺伝子導入マウス（例えば、Ｈｏｓｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．、（２００１）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ １０（５）：４７１−８）が含まれる。結腸癌の動物モデルの例には、これに限定されないが、ＴＣＲｂおよびｐ５３ダブルノックアウトマウス（例えば、Ｋａｄｏ ｅｔ ａｌ．、（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１（６）：２３９５−８）が含まれる。膵臓癌の動物モデルの例には、これに限定されないが、Ｐａｎｃ０２マウス膵臓腺癌の転移性モデル（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、（２００１）Ｉｎｔ Ｊ Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌ ２９（１）：３７−４６、参照）および皮下膵腫瘍のｎｕ−ｎｕマウス（例えば、Ｇｈａｎｅｈ ｅｔ ａｌ．、（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８（３）：１９９−２０８、参照）が含まれる。非ホジキンリンパ腫の動物モデルの例には、これに限定されないが、重症複合免疫不全（「ＳＣＩＤ」）マウス（例えば、Ｂｒｙａｎｔ ｅｔ ａｌ．、（２０００）Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ８０（４）：５５３−７３、参照）およびＩｇＨｍｕ−ＨＯＸ１１遺伝子導入マウス（例えば、Ｈｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５（２３）：１３８５３−８、参照）が含まれる。食道癌の動物モデルの例には、これに限定されないが、ヒトパピローマウイルス型１６Ｅ７癌遺伝子のための遺伝子導入マウス（例えば、Ｈｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、（１９９６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０（３）：１８７３−８１、参照）が含まれる。結腸直腸癌の動物モデルの例には、これに限定されないが、Ａｐｃマウスモデル（例えば、Ｆｏｄｄｅ ＆ Ｓｍｉｔｓ、（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７（８）：３６９−７３およびＫｕｒａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．、（２０００）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９（５０）：５７５５−６３、参照）が含まれる。
関節炎の動物モデルには、これに限定されないが、関節リウマチラット（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、（１９５６）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、９１：９５−１０１、参照）およびマウスおよびラット中のコラーゲン誘導関節炎（例えば、免疫学における最新プロトコル、Ｅｄｓ．Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｏｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、１９９４、参照）が含まれる。喘息の動物モデルの例には、これに限定されないが、肺過敏症のマウスモデル（例えば、Ｒｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２３５１−２３６３ ａｎｄ Ｓｈｉ、ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：１９７−２０６、参照）が含まれる。同種拒絶反応動物モデルには、これに限定されないが、ラット同種間心臓移植モデル（例えば、Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５８：２３−２７およびＴｉｎｕｂｕ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４３３０−４３３８、参照）およびラット異種心臓同種移植片拒絶（Ｊａｅ−ＨｙｕｃｋＳｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（１６）：１０６１７−１０６２２）が含まれる。鋼色マウスがヒト再生不良性貧血のモデルとして使用される（例えば、Ｊｏｎｅｓ、（１９８３）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１１：５７１−５８０、参照）。貧血の動物モデルの例には、これに限定されないが、溶血性貧血モルモット（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：５７５、参照）が含まれる。好中球減少症の動物モデルの例には、これに限定されないが、好中球減少症中球減少性ＣＤラット（例えば、Ｎｏｈｙｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９：２５９−２６６、参照）が含まれる。
Ｆ．抗体の産生方法
本明細書で提供される方法により生成した核酸分子と抗体は、当業者に既知のいずれの方法でも作成可能である。このような方法は、日常的な作業であり、当業者にはよく知られている。これらには、遺伝子合成、ＰＣＲ、連結反応、クローニング、トランスフェクションおよび精製技術を含む日常的に使われる分子生物学技術が含まれる。このような方法の説明が下記に提供される。
例えば、核酸配列は、本明細書の上記で考察したような遺伝子合成技術を使って構築可能である。遺伝子合成または日常的分子生物学技術は、また、ヌクレオチドの挿入、欠失、追加または置換を行うために使用できる。例えば、追加のヌクレオチド配列を核酸配列に連結可能である。一例では、リンカー配列が付加され、それにより、配列が合成遺伝子をベクター、例えば、タンパク質発現ベクターまたは抗体定常領域をコードするＤＮＡ配列の増幅のために設計されたベクター、中に挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。さらに、機能性ＤＮＡ配列を特定する追加のヌクレオチド配列が核酸分子をコードする組換え生殖系列に機能的に連結されうる。このような配列の例には、これに限定されないが、細胞内のタンパク質発現を促進するように設計されたプロモーター配列、およびタンパク質分泌を促進するように設計されたリーダーペプチド配列、が含まれる。さらなるヌクレオチド配列、例えば、タンパク質結合領域を特定する配列も、結合した核酸配列に結合可能である。このような領域には、これに限定されないが、組換え抗体またはその断片を特異的標的細胞中に取り込みを促進するか、またはそうでなければ、合成遺伝子の薬物動態を高める配列、が含まれる。
核酸配列は、本明細書記載のように、例えば、変異誘発により、さらに操作し、変異体抗体を生成することが可能である。変異誘発は、遺伝子合成により全体的に行うことができる。例えば、変異抗体をコードするために、核酸分子をマニュアルで、またはコンピュータシミュレーションにより合成のための設計ができる。遺伝子合成方法を使う利点は、本明細書で前に考察したように、生じた核酸分子がインフレームであり、「増殖性」であるように変異をさせることができることである。他の合成方法は、遺伝子合成の間に無作為化が達成できる場合に登場する。例えば、オリゴヌクレオチドの合成で、ノンネイティブのホスホラミダイトを「ドープ」して、ランダム変異誘発の標的とされる遺伝子部位の無作為化が生じるプロトコルが開発されている（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｈｏｏｖｅｒ（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９：５８１２−９）。この方法は、位置選択を制御し、一方でランダム置換比率を保持することを可能にする。あるいは、変異誘発を他の分子生物学技術を使って行うことができる。通常、部位特異的変異誘発戦略が採用できる。
変異抗体を作るために使用される他の最新の方法には、これに限定されないが、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（Ｃａｌｄｗｅｌｌ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ（１９９２）；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９：３５７６−８０）；最適化されるべき特異的領域が合成的に変異誘発されたオリゴヌクレオチドで置換されるカセット変異導入（Ｓｔｅｍｍｅｒ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３：２１４−２０）；Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９：７８１１−７８１５；Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ、４４：１７７−８３；Ｈｅｒｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、８７：６９６−７００）；変異頻度を増やすための主細胞の変異誘発株の使用（Ｇｒｅｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７：１８９−９５）；ＤＮＡシャフリング（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ、３９１：２８８−２９１；米国特許第６、１７７、２６３号；同５、９６５、４０８号；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：１２０５−１２０９）；および他のランダム変異誘発方法、が挙げられる。
本明細書で提供される抗体は、完全長抗体、または、Ｆａｂ、Ｆａｂヒンジ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｃＦｖタンデム断片ならびにｓｃＦｖヒンジおよびｓｃＦｖヒンジ（ΔＥ）断片を含む（これに限定されない）完全長より短い抗体として生成または発現可能である。様々な技術が抗体断片の産生のために開発されてきた。従来から、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク分解性消化経由で生成された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４：１０７−１１７；Ｂｒｅｎｎａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１、参照）。また、断片は、組換え型宿主細胞により直接的に産生することも可能である。Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌等の宿主細胞中で発現し、そこから分泌され、その結果、これらの大量の断片を容易に産生することを可能にしている。また、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成できる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３−１６７）。別の手法により、Ｆ（ａｂ’）２断片は組換え型宿主細胞培養から直接単離可能である。他の例では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である（例えば、国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５、５７１、８９４号および同５、５８７、４５８号参照）。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域を欠いているインタクト結合部位を有する唯一の種である；従って、それらは、インビボでの使用の間の低減した非特異的結合に適している。ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端でエフェクタータンパク質の融合体を得るようにｓＦｖ融合タンパク質を構築可能である。抗体断片は、また、直鎖抗体であってもよい（例えば、米国特許第５、６４１、８７０号、参照）。このような直鎖抗体断片は、単一特異性でも、または二重特異性でもよい。抗体断片または抗体多量体の産生のための他の技術も当業者に既知である。
例えば、発現時に、抗体重鎖および軽鎖がジスルフィド結合で対形成し、完全長抗体またはその断片を形成する。例えば、完全長Ｉｇの発現のために、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３をコードする配列を第１の発現ベクターに挿入し、ＶＬ−ＣＬドメインをコードする配列を第２の発現ベクターに挿入することができる。ＶＬ−ＣＬドメインをコードする第２の発現ベクターとの同時発現により、完全長抗体が発現する。別の例では、Ｆａｂを生成するために、ＶＨ−ＣＨ１をコードする配列を第１の発現ベクターに挿入し、ＶＬ−ＣＬドメインをコードする配列を第２の発現ベクターに挿入できる。重鎖が軽鎖と対形成し、Ｆａｂモノマーが生成する。この例では、本明細書の別のところで記載しているように、代表的ベクターはプラスミドＡ、Ｃ、ＤおよびＥを含む。種々のＩｇＧサブタイプのＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３の配列は、当業者には既知である（例えば、米国特許公開第２００８０２４８０２８号参照；また配列番号２９２２も参照）。同様に、ＣＬ、ラムダまたはカッパ、の配列もまた、既知である（例えば、米国特許公開第２００８０２４８０２８号参照；また、配列番号２９２３〜２９２４も参照）。
１．ベクター
可変重鎖または可変軽鎖をコードする核酸の発現のためのベクターが本明細書で提供されている。通常、原核細胞または真核細胞の形質転換の前に、抗体ポリペプチドをコードする核酸が中間体ベクター中に挿入される。ベクターの選択は所望の用途による。例えば、核酸の挿入後、ベクターは、通常は、宿主細胞を形質転換するために、例えば、その複製および／または発現のために抗体遺伝子を増幅するために使われる。このような例では、高レベル発現に適したベクターが使われる。別の例では、細胞表面上に発現したポリペプチドのディスプレイに適合するベクターが選定される。
抗体ポリペプチドをコードする核酸は、通常、原核細胞または真核細胞の形質転換の前にベクター中に挿入される。ベクターの選択は所望の用途に依存する。例えば、核酸の挿入後、ベクターは、通常は、宿主細胞を形質転換するために、例えば、その複製および／または発現のために抗体遺伝子を増幅するために使われる。このような例では、高レベル発現に適したベクターが使われる。発現は、当業者に既知のいずれの細胞発現系でも可能である。代表的発現用細胞には、これに限定されないが、２９３ＦＳ細胞、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞またはＣＨＯ細胞、が含まれる。他の発現ベクターおよび宿主細胞は、下記に記載する。
一般的に、抗体の重鎖をコードする核酸がベクター中に挿入され、また、抗体の軽鎖をコードする核酸がベクター中に挿入される。遺伝子を、その二重発現のために単一ベクターに、または別々のベクターに、挿入できる。必要に応じ、ベクターはまた、追加の定常領域またはヒンジ部をコードするさらなる配列を含み、他の抗体形態を生成することもできる。
多くの発現ベクターが利用可能で、抗体またはその一部の発現のために、当業者に既知である。発現ベクターの選択は宿主発現系の選択に影響される。このような選択は、当業者の技量の範囲内で充分処理できることである。一般的に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび任意選択のエンハンサー、翻訳シグナル、および転写と翻訳の終止シグナル、を含んでもよい。安定な形質転換のために使われる発現ベクターは、通常、形質転換細胞の選択と維持を可能にする選択可能マーカーを有する。一部の例では、複製起点は、細胞中のベクターのコピー数を増幅するために使用可能である。また、ベクターは、通常、連結された核酸分子に機能的に連結された追加のヌクレオチド配列を含むこともできる（例えば、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ）。本明細書の目的のために、ベクターは、通常、定常領域をコードする配列を含む。従って、組換え抗体またはその一部もまた、タンパク質融合体として発現可能である。例えば、融合体を生成させ、ポリペプチドに対し追加の機能を加えることも可能である。融合タンパク質の例には、これに限定されないが、シグナル配列の融合体、エピトープタグ、例えば、局在化用の、例えば、ｈｉｓ６タグまたはｍｙｃタグ、または精製用タグ、例えば、ＧＳＴ融合体、およびタンパク質分泌および／または膜結合指示用配列、が含まれる。
例えば、タンパク質の発現は、当技術分野で既知のいずれかのプロモーター／エンハンサーにより制御可能である。適切な細菌性プロモーターは当技術分野でよく知られ、本明細書で下記に記載されている。他の哺乳動物細胞、酵母細胞および昆虫細胞用の適切なプロモーターは、当技術分野でよく知られており、一部は以下に例示されている。異種の核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。使用されるプロモーターには、これに限定されないが、ＳＶ４０早期プロモーターを含む真核生物発現ベクター（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列中に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２（１９８２））；原核生物発現ベクター、例えば、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５５４３）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５（１９８３））；また、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７９−９４（１９８０）中の「組換え型細菌由来有用なタンパク質」を参照）；ノパリン合成酵素プロモーター含有植物発現ベクター（Ｈｅｒｒａｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９−２１３（１９８４））またはカリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：２８７１（１９８１））、および光合成酵素リブロース二リン酸脱炭酸酵素のプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１１５−１２０（１９８４））；酵母および他の真菌由来のプロモーター配列、例えば、Ｇａｌ４プロモーター、アルコール脱水素酵素プロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、および組織特異性を示し、遺伝子導入動物で使用された次の動物転写制御領域：膵腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６（１９８４）；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５（１９８７））；膵臓ベータ細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２（１９８５））、リンパ球系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８（１９８４）；Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４（１９８７））、精巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞中で活性なマウス房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５（１９８６））、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６（１９８７））、肝臓中で活性なアルファフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８（１９８５）；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８１９８７））、肝臓で活性なアルファ１抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１（１９８７））、骨髄性細胞中有で活性なベータグロビン遺伝子制御領域（Ｍａｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０（１９８５）；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４（１９８６））、脳のオリゴデンドロサイト細胞中で活発なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２（１９８７））、骨格筋中で活発なミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓｈａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６（１９８５））、および視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞で活性な性腺刺激性放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８（１９８６））、が含まれる。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、通常、宿主細胞で抗体、またはその一部の発現に必要な全ての追加の配列を含む転写ユニットまたは発現カセットを含む。典型的な発現カセットには、生殖系列抗体鎖および転写物の効率的なポリアデニル化に必要なシグナルをコードする核酸配列に機能的に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位ならびに翻訳終結部位が含まれる。カセットの追加の配列には、エンハンサーを含んでもよい。さらに、カセットは、通常、効率的な終結を提供するための構造遺伝子の下流の転写終止領域を含む。終止領域は、同じ遺伝子からプロモーター配列として得るか、または異なる遺伝子から得ることができる。
一部の発現系は、遺伝子増幅を提供するマーカー、例えば、チミジンキナーゼおよびジヒドロ葉酸還元酵素を有する。あるいは、ポリへドロンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指揮下で昆虫細胞のバキュロウイルスベクターを使う、等の遺伝子増幅を伴わない、生殖系列抗体鎖をコードする核酸配列を有する高収率発現系もまた適切である。
代表的発現ベクターには、任意の哺乳類発現ベクター、例えば、ｐＣＭＶが含まれる。細菌発現に対しては、このようなベクターには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびに融合体ベクター、例えば、ＭＢＰ、ＧＳＴおよびＬａｃＺ、が含まれる。代表的なこのようなベクターは細菌発現ベクター、例えば、本明細書記載のプラスミドＡ、プラスミドＣ、プラスミドＤおよびプラスミドＥ、である。他の真核生物ベクター、例えば、真核生物ウイルス由来の調節配列を含むいずれかは、真核生物発現ベクターとして使用可能である。これらには、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒウイルス由来のベクターが含まれる。他の代表的真核生物ベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴ０１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＣＥ、およびＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリへドロンプロモーター、または真核生物の発現に有効であることがわかっている他のプロモーター、の指揮下でタンパク質の発現を可能とするいずれかのベクター、が含まれる。
抗体の可変領域をコードする核酸配列に機能的に連結された抗体の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供可能である。ベクターは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４および／またはＣＬの１つまたは全てのための配列を含むことができる。通常、Ｆａｂの発現等のために、ベクターは、ＣＨ１またはＣＬのための配列を含む。一例では、抗体の重鎖をコードする核酸は、第１の発現ベクター中に連結され、抗体の軽鎖をコードする核酸は、第２の発現ベクター中に連結される。発現ベクターは同じであっても異なっていてもよいが、通常は、それらは、同程度のタンパク質（重鎖および軽鎖）の発現を可能にするのに充分な適合性がある。第１と第２の発現ベクターは、通常、宿主細胞に１：１の比率で同時形質移入される。代表的なベクターには、これに限定されないが、ｐg１ＨＣおよびｐkＬＣ、が含まれる（Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３２９：１１２−２４）。他の発現ベクターには、軽鎖発現ベクターｐＡＧ４６２２および重鎖発現ベクターｐＡＨ４６０４、が含まれる（Ｃｏｌｏｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５２：８９−１０４）。ｐＡＧ４６２２ベクターは、ヒトκ軽鎖のＣ領域ドメインをコードするゲノム配列およびｇｐｔ選択可能マーカーを含む。ｐＡＨ４６０４ベクターは、ｈｉｓＤ選択可能マーカーおよびヒト重鎖γ１Ｃ−領域ドメインをコードする配列を含む。別の例では、重鎖および軽鎖は、重鎖および軽鎖両方用の発現カセットを有する単一ベクターに挿入することができる。他の代表的発現ベクターには、本明細書の別のところで記載のプラスミドＡ、Ｃ、ＤおよびＥが含まれる。
本明細書の目的のために、抗体の組換え可変領域をコードする核酸配列に機能的に連結された抗体の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。ベクターは、ＣＨ１、ＣＨ２、ヒンジ、ＣＨ３またはＣＨ４および／またはＣＬの１つまたは全てのための配列を含むことができる。通常、例えば、Ｆａｂの発現のために、ベクターは、ＣＨ１（配列番号２９２２のアミノ酸１〜１０３）またはＣＬ（カッパ軽鎖に関しては、配列番号２９２３参照；ラムダ軽鎖に関しては、配列番号２９２４参照）のための配列を含む。定常領域またはヒンジ部の配列は、当業者には既知である（例えば、米国特許公開第２００８０２４８０２８号、およびＣＨ１（配列番号２９２２）のアミノ酸１〜１０３、ＩｇＧ１ヒンジ部（配列番号２９２２のアミノ酸１０４〜１１９）、ＩｇＧ１ＣＨ２（配列番号２９２２のアミノ酸１２０−２２３）、ＩｇＧ１ＣＨ３（配列番号２９２２のアミノ酸２２４〜３３０）、ＣＬカッパ（配列番号２９２３）およびＣＬラムダ（配列番号２９２４）を含む配列番号２９２２−２９２４参照。重鎖定常領域遺伝子（例えば、ＣＨ１）を含む代表的なこのようなベクターは、本明細書記載のプラスミドＡおよびＤである。軽鎖定常領域遺伝子を含む代表的なこのようなベクターは、本明細書記載のプラスミドＣおよびＥである。
大腸菌細胞の形質転換のための代表的プラスミドベクターには、例えば、本明細書に記載のＣｏｌＥ１複製ベクターが含まれる。これら全てのベクターに共通のいくつかの特徴には、（ａ）ｐＢＡＤ誘導性プロモーター；（ｂ）ｐＢＡＤプロモーターを制御するＡｒａＣ遺伝子；（ｃ）効率的翻訳のための合成リボソーム結合部位（ＲＢＳ）；（ｄ）多コピー発現を可能とするＣｏｌＥ１複製起点；（ｅ）発現したタンパク質をペリプラズムへ移動させるＳＴＩＩリーダー配列；（ｆ）ｆ１複製起点；および（ｇ）抗生物質耐性を付与する遺伝子、が含まれる。このようなプラスミドには、プラスミドＡ（配列番号８４）、プラスミドＣ（配列番号８６）、プラスミドＤ（配列番号８５）およびプラスミドＥ（配列番号８７）が含まれる。プラスミドＡおよびプラスミドＤは、それらが重鎖可変領域のために挿入された遺伝子に機能的に連結された重鎖定常領域（ＣＨ１）のための遺伝子を含むので、重鎖抗体遺伝子の発現に利用される。ベクターは、ＮｈｅＩおよびＮｃｏＩ制限酵素部位を含み、本明細書に記載の組換え抗体遺伝子のクローニングを可能とする。両ベクターは、ｐＵＣ複製起点、ＣｏｌＥ１タイプ複製起点、およびカナマイシン耐性を付与するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。プラスミドＡは、タンパク質精製用の（Ｈｉｓ）６タグおよびＦｌａｇタグを含む。プラスミドＤは、（Ｈｉｓ）６タグおよびＦｌａｇタグの両方を含み、得られたタンパク質のｓｏｒｔａｓｅを使った共有結合を可能とする追加のＬＰＥＴＧタグを含む。プラスミドＣおよびプラスミドＥは、それらが軽鎖可変領域のために挿入された遺伝子に機能的に連結された軽鎖定常領域（ＣＬ）のための遺伝子を含むので、軽鎖抗体遺伝子の発現に利用される。プラスミドＣは、カッパ軽鎖に対し特異的であり、ＢｓｅＷＩおよびＮｃｏＩ制限酵素部位を含み、本明細書に記載の組換え抗体遺伝子のクローニングを可能とする。プラスミドＥは、ラムダ軽鎖に特異的であり、ＡｃｒＩＩおよびＮｃｏＩ制限酵素部位を含み、本明細書に記載の組換え抗体遺伝子のクローニングを可能とする。両ベクターは、３．３複製起点、ＣｏｌＥ１タイプ複製起点、およびクロラムフェニコール耐性を付与する遺伝子を含む。上述のベクターは、軽鎖ベクターおよび重鎖ベクターが同時形質転換される二重ベクター系で利用されるように設計される。従って、それらは、異なっているが適合性がよい、利用される２つのＣｏｌＥ１複製起点、１つは重鎖用、もう一つは軽鎖用、を含む。これにより、ベクターが同時形質転換され、発現する場合に抗体の両鎖の効率的な発現が可能となる。
ＤＮＡ断片をベクター中へ挿入する当業者に既知のいずれの方法も、抗体鎖をコードする核酸を含む発現ベクターを構築するのに使用可能である。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術ならびにインビボ組換え（遺伝的組換え）を含むことができる。クローニングベクターへの挿入は、例えば、ＤＮＡ断片を相補的な付着末端を有するクローニングベクター中へ連結することにより達成できる。クローニングベクターＤＮＡを分解するのに使われる相補的な制限酵素部位が無ければ、ＤＮＡ分子の末端は酵素的に修飾されうる。あるいは、いずれかの所望の部位をヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することにより産生可能である；これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成核酸を含んでもよい。
２．細胞および発現系
また、ベクター含有細胞も提供される。通常、異種のＤＮＡを発現するように操作でき、分泌経路を有するいずれの細胞型も安定である。発現宿主には、原核生物および真核生物、例えば、細菌性細胞（例えば、大腸菌）、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞を含む動物細胞が含まれる。発現宿主は、タンパク質産生レベルならびに発現タンパク質上に存在する翻訳後修飾物の型が異なる可能性がある。さらに、発現宿主の選択は、ベクターの選択ならびに使われる転写および翻訳配列に関連することが多い。例えば、発現宿主の選択は、必ずではないが、使用される前駆体配列の選択に依存することが多い。例えば、多くの異種のシグナル配列は、同じ種の宿主細胞中でのみ発現できる（すなわち、昆虫細胞シグナル配列は昆虫細胞中で最適に発現する）。対照的に、他のシグナル配列、例えば、酵母、昆虫、または哺乳類宿主細胞中でうまく作用するヒト血清アルブミン（ｈＨＳＡ）シグナル配列、ならびに昆虫および哺乳動物細胞中で機能的であることが示された組織プラスミノーゲンアクチベータープレプロ配列（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．、（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１５：３３７）は、異種の宿主中で使用可能である。発現宿主の選択は、これらおよび他の因子、例えば、調節および安全性の考慮、生産コストならびに精製の必要性と方法に基づいて行うことができる。従って、ベクター系は、使われる宿主細胞と適合性がなければならない。
真核生物宿主中での発現には、酵母、例えば、出芽酵母およびピキアパストリス、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ細胞および鱗翅目の昆虫の細胞、植物および植物細胞、例えば、タバコ、トウモロコシ、コメ、藻類、およびアオウキクサ属中の発現を含むことができる。また、発現用の真核細胞には、哺乳動物細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞が含まれる。また、真核生物発現宿主には、例えば、血清、ミルクおよび卵中の産物を含む遺伝子導入動物中の産物が含まれる。
組換え型分子は、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔およびソノポレーションにより宿主細胞中に導入可能であり、それにより、多くの遺伝子配列の複製が生成される。通常、標準的トランスフェクション方法が、大量の抗体鎖を発現する細菌、哺乳類、酵母、または昆虫細胞株を産生するために使用され、次いで、標準的な方法を使って精製される（例えば、Ｃｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１７６１９−１７６２２；「酵素学における方法」、ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、ｅｄ．）、１９９０中の「タンパク質精製ガイド」、参照）。真核生物および原核細胞の形質転換は、標準的な方法に従って行われる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９７７）Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ ａｎｄ Ｃｕｒｔｉｓｓ（１９８３）「酵素学における方法」、１０１、３４７−３６２、参照）。例えば、外部ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するためのいずれかのよく知られた方法を使用可能である。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、遺伝子銃、リポソーム、微量注入、血漿ベクター、ウイルスベクターおよびクローン化ゲノムＤＮＡ、相補ＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外部遺伝物質を宿主細胞中に導入する他のよく知られたいずれかの方法の使用が含まれる。通常、本明細書の目的のために、宿主細胞は、少なくともＶＨ鎖をコードする第１のベクターおよび少なくともＶＬ鎖をコードする第２のベクターを形質移入される。従って、使用される特定の遺伝子工学的手法により、少なくとも両遺伝子が生殖系列、またはその改変型の抗体ポリペプチドを発現可能な宿主細胞中へ成功裏に導入されることのみが必要である。
単離された組換え可変領域遺伝子、相補ＤＮＡ、または合成ＤＮＡ配列を組み込んだ宿主細胞の組換えＤＮＡ分子による形質転換により、遺伝子の複数の転写物の生成が可能となる。従って、遺伝子は、形質転換体を繁殖させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、さらに必要に応じ、単離組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することにより、大量に得ることができる。通常、発現ベクターが細胞中に導入された後に、生殖系列鎖の発現に適した条件下で形質移入細胞を培養し、下記で示されている標準的精製技術を使って、培養物から回収される。
抗体およびその一部は、当技術分野でタンパク質産生のために既知のいずれかの高スループット手法を使って産生可能である。これらの手法には、インビトロおよびインビボ方法、例えば、抗体またはその一部をコードする核酸分子の宿主細胞または宿主動物中への導入、および抗体をコードする核酸分子からのインビトロ発現を含む。原核生物、特に大腸菌は、大量の抗体またはその一部の産生のためのシステムを提供し、タンパク質の高スループット発現および精製を適用する場合、特に望ましい。大腸菌の形質転換は当業者によく知られた単純かつ迅速な技術である。高スループット発現用大腸菌宿主株には、これに限定されないが、ＢＬ２１（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＬＭＧ１９４（ＡＴＣＣ）がある。代表的なこのような大腸菌宿主株は、ＢＬ２１である。高スループット発現用ベクターには、これに限定されないが、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣベクターが含まれる。代表的なこのようなベクターは、本明細書に記載のベクターで、プラスミドＡ、プラスミドＣ、プラスミドＤおよびプラスミドＥが含まれる。発現と精製の自動化により、高スループット発現を促進可能である。例えば、細胞培養を自動化採取、溶解および精製ユニットと組み合わせた完全自動化システムであるＰｉｃｃｏｌｏ（登録商標）システム（Ｗｏｌｌｅｒｔｏｎｅｔａｌ．（２００６）ＪＡＬＡ、１１：２９１−３０３）、または他の類似のロボットシステムが採用できる。
ａ．原核生物発現
原核生物、特に、大腸菌は、大量の抗体またはその一部を産生するためのシステムを提供する。大腸菌の形質転換は、当業者によく知られた単純かつ迅速な技術である。大腸菌用発現ベクターは、高レベルのタンパク質の発現の誘導および宿主細胞に対し何らかの毒性を示すたんぱく質の発現のために有用な誘導性プロモーターを含むことが可能である。誘導性プロモーターの例には、ラックプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６ＲＮＡプロモーターならびに温度調節λＰＬプロモーター、が含まれる。
抗体またはその一部は、大腸菌の細胞質環境中で発現可能である。細胞質は、還元環境であり、一部の分子にとって、これにより、不溶性の封入体の形成が起こりうる。還元試薬、例えば、ジチオトレイトールおよびβ−メルカプトエタノールおよび変性剤（例えば、グアニジン−ＨＣｌおよび尿素）をタンパク質の可溶化のために使用できる。代表的代替手法は、細菌細胞周辺腔中での抗体またはその断片の発現であり、これにより、酸化環境、ならびにシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼが提供され、可溶性タンパク質の産生につながる。通常、リーダー配列が、発現のためにタンパク質に融合され、これがタンパク質をペリプラズムに移動させる。その後、リーダーは、ペリプラズム内のシグナルペプチダーゼにより除去される。発現したタンパク質をペリプラズムに移動させる３つの主要経路がある。すなわち、Ｓｅｃ経路、ＳＲＰ経路およびＴＡＴ経路である。ペリプラズム標的リーダー配列の例には、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のｐｅｌＢリーダー、ＳｔＩＩリーダー配列、およびＤｓｂＡリーダー配列が含まれる。代表的リーダー配列は、ＤｓｂＡリーダー配列である。いくつかの例では、ペリプラズム発現は、発現したタンパク質の培地中への漏出を可能とする。タンパク質の分泌は、培養上清からの迅速かつ単純な精製を可能とする。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解によりペリプラズムから得ることができる。細胞質発現と同様に、一部の例では、タンパク質が不溶性になり、変性および還元試薬が可溶化およびリフォールディングを促進するため使用できる。誘導と増殖温度も影響発現レベルおよび溶解度に影響しうる。通常、２５℃〜３７℃の温度が使われる。変異もまた、発現したタンパク質の溶解度を高めるために使用可能である。通常、細菌は、グリコシル化されたタンパク質を産生する。従って、タンパク質が機能のためにグリコシル化が必要な場合、グリコシル化は、宿主細胞からの精製後、インビトロで追加可能である。
ｂ．酵母
酵母、例えば、出芽酵母、分裂酵母、アルカン資化酵母、クルイベロミセス・ラクチス、およびピキアパストリスが組換え抗体またはその一部のための有用な発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターにより、または相同組換えによる安定な染色体の統合により形質転換可能である。通常、遺伝子発現を調節するために、誘導性プロモーターが使用される。このようなプロモーターの例には、ＡＯＸ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ５ならびにメタロチオネインプロモーター、例えば、ＣＵＰ１が含まれる。発現ベクターには、選択可能マーカー、例えば、形質転換ＤＮＡの選択および維持のためのＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、およびＵＲＡ３、が含まれることが多い。酵母中で発現したタンパク質は可溶性であることが多い。Ｂｉｐ等のシャペロニンとタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの同時発現により、発現レベルと溶解度が改善する。さらに、酵母中で発現したタンパク質は、分泌シグナルペプチド融合体、例えば、サッカロミセス・セレビジエ由来の酵母接合タイプアルファ因子分泌シグナル、および酵母細胞表面タンパク質との融合体、例えば、接着受容体またはアークスラ・アデニニボランスグルコアミラーゼと結合したＡｇａ２ｐ、を使って分泌を誘導されうる。例えば、Ｋｅｘ−２プロテアーゼのためのプロテアーゼ開裂部位を、操作して、それらが分泌経路から出る際に融合配列を発現したポリペプチドから除去できる。酵母は、また、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフの位置でグリコシル化可能である。
ｃ．昆虫
昆虫細胞、特に、バキュロウイルス発現を使う場合の昆虫細胞は、抗体またはその一部の発現に有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物により使われる大抵の翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは、宿主範囲が限られており、このために安全性が改善され、真核生物発現に対する制御事項が減る。通常、発現ベクターは高レベル発現用プロモーター、例えば、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターおよびｐ１０プロモーターを使用する。通常使われるバキュロウイルス系には、バキュロウイルス、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）、およびカイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）および昆虫細胞株、例えば、ヨトウガ由来Ｓｆ９およびイラクサギンウワバ由来ＴＮ、が含まれる。高レベル発現のために、発現される分子のヌクレオチド配列が、ウイルスのポリへドリン開始コドンのすぐ下流に融合される。ヒト抗体を発現可能なバキュロウイルス組換えを行うために、二重発現導入ベクター、例えば、ｐＡｃＵＷ５１（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）が利用される。哺乳類動物の分泌シグナルは、昆虫細胞中で正しく処理され、発現したタンパク質を培地中へ分泌させるのに使用可能である。
別の昆虫細胞発現系は、安定に形質転換された細胞を使うことである。細胞株、例えば、ヨトウガの細胞由来のＳｆ９およびイラクサギンウワバの細胞由来のＴＮが発現に使用可能である。バキュロウイルス最初期の遺伝子プロモーターＩＥ１が安定したレベルの発現を誘導するために使用可能である。典型的発現ベクターには、ｐＩＥ１−３およびｐＩ３１−４導入ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）が含まれる。発現ベクターは、通常、選択可能マーカー、例えば、ネオマイシンおよびヒグロマイシンを使って維持される。
ｄ．哺乳動物細胞
哺乳類発現系は、抗体またはその一部を発現するのに使用可能である。発現構築物は、アデノウイルス等のウイルス感染により、または、リポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、等の直接移入により、ならびに電気穿孔および微量注入等の物理的手段により、哺乳動物細胞中に移入可能である。哺乳動物細胞用の発現ベクターは、通常、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）およびポリアデニル化配列、を含む。このようなベクターは、高レベル発現用転写プロモーター−エンハンサー、例えば、ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の末端反復配列、を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞型中で活性である。組織および細胞型プロモーターおよびエンハンサー領域もまた、発現のために使用できる。代表的プロモーター／エンハンサー領域には、これに限定されないが、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス房腫瘍ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ１抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御、等の遺伝子由来の領域が含まれる。選択可能マーカーが発現構築物を含む細胞の選択と維持に使用可能である。選択可能マーカー遺伝子の例には、これに限定されないが、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素およびチミジンキナーゼ、が含まれる。抗体は、通常、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）系またはグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）系、を使って産生される。ＧＳ系は、共発現ベクター、例えば、ｐＥＥ１２／ｐＥＥ６、を使って重鎖と軽鎖の両方を発現する。細胞表面シグナル伝達分子、例えば、ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γを有する融合体は、細胞表面にある活性状態のタンパク質の発現を指示することができる。
多くの細胞株が、マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞を含む哺乳類発現のために利用可能である。代表的細胞株には、これに限定されないが、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌性）および他のミエローマ細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８、およびＨＫＢ細胞、が含まれる。また、細胞培地からの分泌タンパク質の精製を促進する無血清培地に適合された細胞株も利用可能である。このような例の１つに、無血清ＥＢＮＡ−１細胞株がある（Ｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．、（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：３３２−４２）。
ｅ．植物
遺伝子導入植物細胞および植物は、タンパク質、例えば、本明細書に記載のいずれかの抗体またはその一部を発現するのに使用可能である。発現構築物は、通常、直接ＤＮＡ移入、例えば、微粒子銃およびＰＥＧ媒介プロトプラストへの移入、およびアグロバクテリウム媒介形質転換によって植物に導入される。発現ベクターには、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終止配列および翻訳調節配列を含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、双子葉植物宿主、例えば、シロイヌナズナおよびタバコ、と単子葉植物宿主、例えば、トウモロコシおよびコメ、の間で異なる。発現に使用される植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーターおよびトウモロコシユビキチン−１（ｕｂｉ−１）プロモーターが含まれる。選択可能マーカー、例えば、ヒグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼが、形質転換細胞の選択と維持を促進するために使用されることが多い。形質転換細胞は、細胞、凝集物（カルス組織）として培養物中で維持でき、または全植物に再生することができる。遺伝子導入植物細胞には、また、ロテアーゼまたは改変ロテアーゼを産生するように操作された藻類を含むこともできる（例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ １００：４３８−４４２、参照）。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するため、これは、これらの宿主中で産生されたタンパク質の選択に影響する可能性がある。
３．精製
抗体およびその一部は、当業者に既知のいずれかの方法により精製される。本明細書の方法で精製される、または使われる抗体は、当技術分野で既知の標準的タンパク質精製技術を使って実質的な純度に精製できる。これらの技術には、これに限定されないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿法、キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはカラムクロマトグラフィー、が含まれる。例えば、抗体は、カラムクロマトグラフィーで精製できる。抗体を精製する代表的な方法は、カラムクロマトグラフィーを使うことによる方法で、固体支持体カラム材料が連鎖球菌由来の細胞表面結合タンパク質であるタンパク質Ｇに連結され、これが結合免疫グロブリンと高親和性で結合する。抗体は、６０％、７０％、８０％の純度に精製可能で、典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の純度に精製できる。純度は標準的な方法、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により評価可能である。
抗体またはその一部の宿主細胞からの精製方法は、選択された宿主細胞および発現系に依存する。分泌分子に対しては、タンパク質は、通常、細胞除去後、培地から精製される。細胞内の発現に対しては、細胞を溶解し、タンパク質は抽出物から精製される。遺伝子導入生物、例えば、遺伝子導入植物および動物が発現に使用される場合には、組織または器官は、溶解細胞抽出物を作る出発材料として使用することができる。さらに、遺伝子導入動物産生には、ミルクまたは卵中でのポリペプチドの産生を含むことができ、集めて、さらなる必要に応じ、タンパク質を抽出し、当技術分野で標準的な方法を使ってさらに精製できる。
抗体が形質転換細菌により大量に発現する場合、発現は恒常的でありうるが、通常、プロモーター誘導後、ポリペプチドが不溶性凝集物を形成する可能性がある。当業者に既知のポリペプチド封入体の精製に適したいくつかのプロトコルが存在する。多くの変形が当業者には明らかであろう。
例えば、１つの方法では、細胞懸濁液が、通常、遠心分離され、封入体含有ペレットが緩衝液中で再懸濁される。この緩衝液は、封入体を溶解しないで洗浄するもので、例えば、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２％トリトン−Ｘ１００、の非イオン性洗剤である。洗浄ステップを繰り返し、細胞性壊死組織片を可能な限り除去することが必要となろう。残りの封入体ペレットは適切な緩衝液（例えば、２０ｍＭ ナトリウムリン酸塩、ｐＨ６．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で再懸濁できる。他の適切な緩衝液は当業者には自明である。
あるいは、抗体は、細菌ペリプラズムから生成できる。ポリペプチドが細菌のペリプラズムへ搬出される場合は、細菌のペリプラズム画分は当業者に既知の他の方法に加えて冷浸透圧ショックで単離できる。例えば、ペリプラズムから組換え型ポリペプチドを単離する１つの方法では、細菌性細胞を遠心分離し、ペレットを形成する。このペレットを２０％ショ糖含有緩衝液に再懸濁する。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、ペレットを氷冷した５ｍＭ ＭｇＳＯ４に再懸濁し、氷浴中で約１０分間保持する。細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカンテーションし、保存する。上清中に存在する組換え型ポリペプチドを当業者よく知られた標準的分離技術により宿主タンパク質から分離できる。これらの方法には、これに限定されないが、次の工程を含む：溶解度分画、サイズ差次的濾過、およびカラムクロマトグラフィー。
Ｇ．抗ＤＬＬ４活性化因子／モジュラー抗体およびその使用
ヒトデルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）に特異的に結合し、ＤＬＬ４活性の活性化因子／モジュレーターである抗ＤＬＬ４多量体抗体が、本明細書で提供される。従って、多量体抗体は、血管新生阻害治療薬として使用し、過剰または異常血管新生を特徴とする疾患または障害、例えば、癌または黄斑変性を治療することができる。
１．ＤＬＬ４
ａ．構造
ＤＬＬ４（配列番号２９０４に設定；また、ヌクレオチド配列（配列番号２９０５に設定）によりコードされる）は、Ｎｏｔｃｈ膜貫通受容体に対する膜貫通タンパク質リガンドである。細胞外の領域は、８ＥＧＦ様反復、ならびに全Ｎｏｔｃｈリガンドの間で保存され、受容体結合に必要なＤＳＬドメインを含む。また、タンパク質は、膜貫通領域、およびどのような触媒的モチーフも存在しない細胞質側末端を含む。ヒトＤＬＬ４は６８５アミノ酸タンパク質で、配列番号２９０４に設定のアミノ酸に対応する次のドメインを含む：シグナルペプチド（アミノ酸１〜２５）；ＭＮＮＬ（アミノ酸２６〜９２）；ＤＳＬ（アミノ酸１５５〜２１７）；ＥＧＦ様１（ＥＧＦ１；アミノ酸２２１〜２５１）；ＥＧＦ様２（ＥＧＦ２；アミノ酸２５２〜２８２）；ＥＧＦ様３（ＥＧＦ３；アミノ酸２８４〜３２２）；ＥＧＦ様４（ＥＧＦ４；アミノ酸３２４〜３６０）；ＥＧＦ様５（ＥＧＦ５；アミノ酸３６６〜４００）；ＥＧＦ様６（ＥＧＦ６；アミノ酸４０２〜４３８）；ＥＧＦ様７（ＥＧＦ７；アミノ酸４４０〜４７６）；ＥＧＦ様８（ＥＧＦ８；アミノ酸４８０〜５１８）；膜貫通（アミノ酸５２９〜５５１）；および細胞質ドメイン（アミノ酸５５３〜６８５）。
ｂ．発現
ＤＬＬ４は種々の組織で広範に発現しているが、その発現は、主に脈管構造に局在化している。それは正常な血管成長に必要であり、腫瘍血管上に発現する。それは腫瘍血管新生中の血管中で発現上昇しており、発現はＶＥＧＦシグナル伝達に依存している。また、ＤＬＬ４は、炎症促進性刺激、例えば、リポ多糖類、インターロイキン−１β、Ｔｏｌｌ様受容体４リガンドおよび他の炎症促進性の刺激に曝された活性化マクロファージ上に発現し、Ｎｏｔｃｈ経路を介したそのシグナル伝達はマクロファージ活性化を特徴とする炎症性状態である種の役割を果たす（Ｆｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１１５：２９４８−２９５６）。
ｃ．機能
ＤＬＬ４はＮｏｔｃｈ受容体に結合する。進化的に保存されたＮｏｔｃｈ経路は、多くの発生過程ならびに出生後の自己更新器官系の主要な制御因子である。無脊椎動物から哺乳動物まで、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、無数の細胞の運命の決定を通して細胞を誘導し、増殖、分化およびアポトーシスに影響を与える（Ｍｉｅｌｅ ａｎｄ Ｏｓｂｏｒｎｅ（１９９９）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１８１：３９３−４０９）。Ｎｏｔｃｈファミリーは、ＤＳＬ遺伝子ファミリーのリガンドに結合した膜により活性化される、構造的に保存された細胞表面受容体で構成されている（ショウジョウバエ由来のＤｅｌｔａとＳｅｒｒａｔｅおよび線虫由来のＬａｇ−２から名付けられた）。哺乳動物は、４つの受容体（Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３およびＮｏｔｃｈ４）および５つのリガンド（Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、およびＤＬＬ４）を有する。隣接細胞上のリガンドにより活性化されると、Ｎｏｔｃｈ受容体は、連続的タンパク分解性切断；すなわち、ＡＤＡＭプロテアーゼに媒介された細胞外開裂およびガンマセクレターゼにより媒介された膜貫通ドメイン内開裂、を受ける。これはＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）の放出につながり、これが核内に移動し、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＢＰ−Ｊｋ（ＣＳＬｆｏｒＣＢＦ１／Ｓｕ（Ｈ）／Ｌａｇ−１由来名称のＣＳＬとしても知られる）および他の転写補助因子と転写複合体を形成する。Ｎｏｔｃｈ活性化の主要標的遺伝子には、ＨＥＳ（Ｈａｉｒｙ／Ｅｎｈａｎｃｅ ｏｆ Ｓｐｌｉｔ）遺伝子ファミリーおよびＨＥＳ関連遺伝子（Ｈｅｙ、ＣＨＦ、ＨＲＴ、ＨＥＳＲ）が含まれ、組織および細胞タイプ特異的な方式で、下流の転写エフェクターを順々に調節する（Ｉｓｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９４：２３７−２５５；Ｌｉ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、８：１−３）。
Ｎｏｔｃｈ受容体によるシグナル伝達は、これに限定されないが、以下に示す造血幹細胞通常の保守および白血病性形質転換を含む様々な細胞プロセスに関係する（ＨＳＣｓ；Ｋｏｐｐｅｒ ＆ Ｈａｊｄｕ（２００４）Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．、１０：６９−７３）：通常の保守ならびに脳癌の場合を含む神経幹細胞の維持（Ｋｏｐｐｅｒ ＆ Ｈａｊｄｕ（２００４）Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．、１０：６９−７３；Ｐｕｒｏｗ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：２３５３−６３；Ｈａｌｌａｈａｎ ｅｔ ａｌ．、（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：７７９４−８００）；リンパ芽球白血病／リンパ腫の場合を含む多くのヒト癌の発生（Ｅｌｌｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ、６６：６４９−６１；Ｒｏｂｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ、８７：４８３−９２；Ｐｅａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２２８３−９１；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９８：３７９３−９；Ｂｅｌｌａｖｉａ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ．１９：３３３７−４８；Ｐｅａｒ ＆ Ａｓｔｅｒ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１１：４１６−３３）；乳癌（Ｇａｌｌａｈａｎ ＆ Ｃａｌｌａｈａｎ（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６１：６６−７４；Ｂｒｅｎｎａｎ ＆ Ｂｒｏｗｎ（２００３）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５：６９；Ｐｏｌｉｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．、１４：３４１−７；Ｗｅｉｊｚｅｎｅｔａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、８：９７９−８６；Ｐａｒｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、１４：７７９−８６）；子宮頸癌（Ｚａｇｏｕｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＰＮＡＳ、９２：６４１４−８）；腎細胞癌（Ｒａｅ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８８：７２６−３２）；頭頸部扁平上皮癌（Ｌｅｅｔｈａｎａｋｕｌ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９：３２２０−４）；子宮内膜癌（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、１７：１１３１−９）；および神経芽細胞腫（ｖａｎＬｉｍｐｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｅｄ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｏｎｃｏｌ．、３５：５５４−８）。また、Ｎｏｔｃｈ経路は、増殖、遊走、平滑筋分化、血管新生および動静脈分化を含む血管成長の多くの局面に関与する（Ｉｓｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２３：５４３）。
ＮｏｔｃｈリガンドＤＬＬ４は、Ｎｏｔｃｈ−１（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ４６５３１；配列番号２９０６）およびＮｏｔｃｈ−４受容体（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ９９４６６；配列番号２９０７）と相互作用し、主に脈管構造中に発現する。ＤＬＬ４の過剰発現の効果を評価する調査により、ＤＬＬ４が、血管新生、内皮細胞増殖、遊走および血管分岐の負の制御因子であることが明らかにされた（例えば、Ｔｒｉｎｄａｄｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ １：１１２、参照）。ＤＬＬ４の抗血管新生活性に対する１つの説明は、これがＶＥＧＦ応答性遺伝子であり、血管新生促進因子であるＶＥＧＦシグナル伝達の負の制御因子として作用するということである。従って、ＤＬＬ４活性化をターゲティングすることにより、ＤＬＬ４の抗血管新生活性が促進される。
対照的に、ＤＬＬ４の遮断は、非生産的血管新生に関連している。ＤＬＬ４は、血管の新芽形成と分岐を特徴とする血管新生を増加させるが、また、血管機能の低下にも関連し、それにより、腫瘍成長の低下も生ずる（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ、４４４：１０８３；Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ、４４４：１０３２）。従って、ＤＬＬ４の機能は、腫瘍血管密集状態とは切り離された腫瘍成長に起因する無秩序な血管新生と関連している。従って、ＤＬＬ４シグナル伝達の遮断は、増殖性血管新生を混乱させ、腫瘍成長を効率的に低下させる。従って、また、ＤＬＬ４抑制のターゲッティングは、血管新生が進行している腫瘍を治療するために使用できる（例えば、国際公開第２００９／０８５２０９号、参照）。
２．活性化因子／モジュレーター抗ＤＬＬ４多量体抗体
本明細書で、ＤＬＬ４活性の活性化因子／モジュレーターである抗体またはその抗体断片が提供される。この抗体は、ＤＬＬ４の活性を活性化するか、または増加させ、それにより、抗血管新生剤として作用する。例えば、本明細書で提供される抗体多量体は、抗体多量体のない場合の活性化に比べ、ＤＬＬ４媒介受容体活性化、例えば、ＤＬＬ４−媒介Ｎｏｔｃｈ−１またはＮｏｔｃｈ−４シグナル伝達の活性化の活性を増加させる。ＤＬＬ４媒介活性は、抗体多量体が存在しない場合の活性化に比べ、抗体多量体の存在下で、少なくとも１．１倍、例えば、正確にまたは約１．２倍〜５倍の間、例えば、１．１倍、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５倍またはそれ超増加する。従って、抗体は、血管新生疾患または障害を治療するために使用可能である。一部の例では、本明細書で提供される抗体はアゴニストである。他の例では、本明細書で提供される抗体は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化することによるＤＬＬ４の活性化因子／モジュレーターである。
本明細書で提供される抗体多量体は、ＤＬＬ４との結合に対し、速いオン／オフ速度を示す。特に、抗体は高ｋｏｆｆを示す。例えば、単量体Ｉｇ断片として評価される場合、本明細書で提供される抗体は、正確にまたは約１ｓ−１〜５ｘ１０−２ｓ−１、例えば、０．５ｓ−１〜０．０１ｓ−１、例えば、正確にまたは約０．１ｓ−１のｋｏｆｆを有する。例えば、抗体多量体が特異的にＤＬＬ４に結合している限り、本明細書で提供される抗体のｋｏｆｆは、Ｆａｂ型で評価した場合、正確にまたは約５ｘ１０−２ｓ−１、４ｘ１０−２ｓ−１、３ｘ１０−２ｓ−１、２ｘ１０−２ｓ−１、１ｘ１０−２ｓ−１、０．０２ｓ−１、０．０３ｓ−１、０．０４ｓ−１、０．０５ｓ−１、０．０６ｓ−１、０．０７ｓ−１、０．０８ｓ−１、０．０９ｓ−１、０．１ｓ−１、０．２ｓ−１、０．３ｓ−１、０．４ｓ−１、０．５ｓ−１、０．６ｓ−１、０．７ｓ−１、０．８ｓ−１、０．９ｓ−１、１ｓ−１またはそれより大きい。一部の例では、本明細書で提供される抗体は、単量体Ｉｇ断片として評価した場合、０．５ｓ〜１５０ｓ、例えば、１ｓ〜１００ｓ、５ｓ〜５０ｓまたは５ｓ〜１０ｓの解離半減期（ｔ１／２）を示す。例えば、本明細書で提供される抗体のｔ１／２は、単量体Ｉｇ断片として評価した場合、正確にまたは約１ｓ、２ｓ、３ｓ、４ｓ、５ｓ、６ｓ、７ｓ、８ｓ、９ｓ、１０ｓ、２０ｓ、３０ｓ、４０ｓ、５０ｓ、６０ｓ、７０ｓ、８０ｓ、９０ｓ、１００ｓ、１１０ｓ、１２０ｓ、１３０ｓ、１４０ｓまたは１５０ｓである。抗体の動力学的速度定数を測定する方法は当業者には既知である。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）装置を使った表面プラズモン共鳴法を使うことができる（ＢｉａＣｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。Ｂｉａｃｏｒｅの機器使用および他の機器使用提供サービスが利用可能である（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｔｏｏｌｓ；Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、ＵＴ；ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）。
通常、本明細書で提供される抗体多量体は、一般的に低い結合親和性に示す。例えば、単量体Ｉｇ断片として評価した場合、本明細書で提供される抗体は、１０−８Ｍまたはそれ未満の結合親和性を示す。例えば、結合親和性は、１０−６Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば、４ｘ１０−６Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば、１ｘ１０−７Ｍ〜１０−８Ｍである。例えば、本明細書で提供される抗体の結合親和性は、単量体Ｉｇ断片として、正確にまたは約１ｘ１０−６Ｍ、２ｘ１０−６Ｍ、３ｘ１０−６Ｍ、４ｘ１０−６Ｍ、５ｘ１０−６Ｍ、６ｘ１０−６Ｍ、７ｘ１０−６Ｍ、８ｘ１０−６Ｍ、９ｘ１０−６Ｍ、１ｘ１０−７Ｍ、２ｘ１０−７Ｍ、３ｘ１０−７Ｍ、４ｘ１０−７Ｍ、５ｘ１０−７Ｍ、６ｘ１０−７Ｍ、７ｘ１０−７Ｍ、８ｘ１０−７Ｍ、９ｘ１０−７Ｍまたは１ｘ１０−８Ｍである。結合親和性の評価方法は当業者に既知であり、本明細書のセクションＥで記載されている。
本明細書で提供される抗体は、多量体であり、それにより、少なくとも２つの抗原結合部位を含む。通常、本明細書で提供される抗体は、少なくとも２つの可変重鎖、または抗原に結合するのに充分なその一部；および２つの可変軽鎖、または多量体化ドメインにより結合される抗原に結合するのに充分なその一部、を含む。多量体は、単量体免疫グロブリン分子の二量体、三量体、またはさらに高い次数の多量体であってもよい。多量体には、二価の、三価の、四価の、五価、六価、七価、またはさらに大きな結合価（すなわち、２、３、４、５、６、７またはそれ超の抗原結合部位を含む）のものが含まれる。例えば、全免疫グロブリン分子またはＦ（ａｂ’）２断片の二量体は四価であり、一方、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子の二量体は二価である。
多量体中の個別の抗体は、同じまたは異なる結合特異性を持つことができる。通常、多量体は、単一特異性であり、ＤＬＬ４上の同じエピトープに免疫特異的に結合する２つ以上の抗原結合ドメインを含む。一部の例では、２つ以上の異なるエピトープに免疫特異的に結合する２つ以上の抗原結合ドメインを含む多選択性の抗体多量体を生成することができる。エピトープはＤＬＬ４エピトープであってもよい。一部の例では、抗体多量体は、ＤＬＬ４中のエピトープに結合し、また、別の異なる標的抗原中のエピトープにも結合する。
抗体多量体を操作する技術は当技術分野で既知であり、これには、例えば、共有結合、非共有結合、または化学結合を介して２つ以上の可変重鎖および可変軽鎖の結合が含まれる。抗体の多量体化は、抗体の自然凝集または当技術分野で既知の化学的または組換え連結技術により行うことができる。従って、２つの抗体ポリペプチド鎖または抗原結合断片間の多量体化は、自発的であるか、または２つ以上のポリペプチドの強制的結合により生成させることができる。一例では、抗体多量体は、異なるポリペプチド鎖上のシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合により生成させることができる。別の例では、抗体多量体は、共有結合または非共有結合的相互作用を介してポリペプチドを連結することにより生成させることができる。一部の例では、多量体は、ペプチド、例えば、多量体化を促進する特性を有するペプチドリンカー（スペーサー）、またはペプチドから生成することができる。一部の例では、抗体多量体は、例えば、ヘテロ二機能性リンカーを使って、化学結合により形成できる。
例えば、抗体多量体には、ＶＬ−ＣＬ含有軽鎖およびＶＨ−ＣＨ１−ヒンジおよび重鎖の結合が可能とするのに充分なＣＨ２−ＣＨ３（または、ＩｇＥもしくはＩｇＭクラスの場合ＣＨ４）の一部を含有する重鎖を含む抗体が含まれる。精製時には、このような抗体（例えば、完全長ＩｇＧ１）自然に抗体ホモダイマー含有凝集物、および他のより高次の抗体多量体を形成する。代表的な定常領域は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ由来の免疫グロブリン分子の定常領域部分、を含むことができる。抗体領域の配列は既知で、組換えによる抗体多量体を生成するために使用可能である（例えば、米国特許公開第２００８０２４８０２８号、参照）。例えば、軽鎖アミノ酸配列は、ＣＬドメイン、カッパ（配列番号２９２３に設定）またはラムダ（配列番号２９２４）を含むことができる。重鎖アミノ酸配列は、ＩｇＧ１（配列番号２９２２）、ＩｇＧ２（配列番号２９３７）、ＩｇＧ３（配列番号２９２５）、ＩｇＡ（配列番号２９２６もしくは２９２７）またはＩｇＭ（配列番号２９２８もしくは２９２９）サブクラス由来の１つまたは複数のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４を含むことができる。特に、本明細書で提供される抗体多量体は、ＶＬ−ＣＬ含有軽鎖、およびＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３含有重鎖を含む完全長抗体である。例えば、このような抗体多量体では、生じる抗体分子は、重鎖が軽鎖にジスルフィド結合により結合し、２つの重鎖がジスルフィド結合により相互に結合した少なくとも４つの鎖の分子である。また、重鎖の結合は、重鎖の、ヒンジ部として知られる柔軟な領域により媒介される。
あるいは、抗体ホモダイマーは、当技術分野で既知の化学結合技術により形成可能である。例えば、ＳＭＣＣ［スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート］およびＳＡＴＡ［Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオ−アセタート］（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から入手可能）を含むヘテロ二機能性架橋剤（これに限定されない）が、抗体多量体形成のために使用可能である。抗体ホモダイマー形成用の代表的プロトコルが、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ（１９９７）９４：７５０９−７５１４、に記載されている。抗体ホモダイマーは、ペプシン消化によりＦａｂ’２ホモダイマーに変換可能である。抗体ホモダイマー形成の別の手法は、Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｋｏｈｌｅｒ、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）２５：３９６−４０４、に記載の自己親和性（ａｕｔｏｐｈｉｌｉｃ）Ｔ１５ペプチドの使用によるものである。
また、ＳｃＦｖ二量体は、当技術分野で既知の組換え型技術により形成可能である。例えば、このような抗体多量体は、２つのドメイン間で同じ鎖上で対形成を可能とするには短すぎるペプチドリンカーにより連結された同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）上の可変軽鎖に連結された可変重鎖を含む。このことが、別の鎖の相補的なドメインとの対形成を起こさせ、２つの機能性抗原結合部位を有する二量体分子の構築を促進する。ｓｃＦｖ二量体の構成の例が、Ｇｏｅｌｅｔａｌ．、（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：６９６４−６９７１、に記載されている。
あるいは、抗体は、組換ＤＮＡ技術により多量体化することができる。ＩｇＭおよびＩｇＡは、成熟Ｊ鎖ポリペプチド（例えば、配列番号２９３０）との相互作用により自然に抗体多量体を形成する。非ＩｇＡまたは非ＩｇＭ分子、例えば、ＩｇＧ分子は、ＩｇＡまたはＩｇＭのＪ鎖相互作用ドメインを含むように操作でき、それにより、非ＩｇＡまたは非ＩｇＭ分子のさらに高次の多量体を形成する能力が付与される。（例えば、Ｃｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕ ｅｔ ａｌ．、（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０１：２１−３１．およびＦｒｉｇｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ．、（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１２３：１４８３−９４、参照）。ＩｇＡ二量体は、粘膜裏打ち器官の管腔中に自然に分泌される。この分泌は、Ｊ鎖と上皮細胞上の重合体ＩｇＡ受容体（ｐＩｇＲ）との相互作用により媒介される。ＩｇＡ型の抗体（またはＪ鎖相互作用ドメインを含むように操作された抗体のＩｇＡ型）の分泌が望ましくない場合は、ｐＩｇＲとうまく相互作用しない変異Ｊ鎖と結合した抗体分子を発現することにより、この分泌を大きく減らすことができる（例えば、配列番号２９３１〜２９３３；Ｊｏｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）１６７：５１８５−５１９２）。配列番号２９３１は、成熟型のヒトＪ鎖（配列番号２９３０）に比べ、Ｃ１３４Ｓ変異を有する変異型のヒト成熟Ｊ鎖である。配列番号２９３２は、成熟型のヒトＪ鎖（配列番号２９３０）に比べて、アミノ酸１１３〜１３７が欠失した変異型のヒト成熟Ｊ鎖である。配列番号２９３３は、成熟型のヒトＪ鎖（配列番号２９３０）に比べて、Ｃ１０９ＳおよびＣ１３４Ｓ変異を有する変異型のヒト成熟Ｊ鎖を示す。これらの変異Ｊ鎖の１つを有する抗体の発現は、上皮細胞上の高分子ＩｇＡ受容体に結合する能力を低下させ、それにより、上皮細胞を通過する抗体、およびその生成分泌物の粘膜裏打ち器官の管腔中への輸送を減らすことになる。
抗体多量体は、当技術分野で既知のいずれかの適切な方法を使って精製可能であり、これには、サイズ排除クロマトグラフィーが含まれる（これに限定されない）。抗体精製の代表的方法は、本明細書の別のところに記載されている。
代表的抗体
本明細書で提供される代表的抗体多量体は、ＳＹＹＭＨ（配列番号２９２０）のアミノ酸配列、例えば、ＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（配列番号２９０８）を有するＣＤＲＨ１（ｋａｂａｔナンバリングよるアミノ酸位置２６〜３５に対応）、ＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２９０９）のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２（ｋａｂａｔナンバリングによるアミノ酸位置５０〜６５に対応）およびＥＥＹＳＳＳＳＡＥＹＦＱＨ（配列番号２９１０）のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３（アミノ酸位置９５〜１０２に対応）を含有する可変重鎖を含み；さらにＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号２９１１）のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１（ｋａｂａｔナンバリングによるアミノ酸位置２４〜３３または３４に対応）、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号２９１２）のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２（ｋａｂａｔナンバリングによるアミノ酸位置５０〜５６に対応）、およびＱＱＲＳＮＷＰＰＷＴ（配列番号２９１３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３（ｋａｂａｔナンバリングによるアミノ酸位置８９〜９７に対応）を含有する可変軽鎖を含む。また、それぞれ配列番号２９０８〜２９１０のいずれかに少なくとも７０％同じであるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む可変重鎖、ならびにそれぞれ、配列番号２９１１〜２９１３のいずれかに少なくとも７０％同じであるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む可変軽鎖を有し、それにより抗体多量体がＤＬＬ４に結合し、ＤＬＬ４の活性化因子である抗体多量体が提供される。例えば、配列同一性は、正確にまたは約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、またはそれ超であってもよい。例えば、抗体多量体は、少なくとも配列番号８８に設定された可変重鎖および配列番号１０７に設定された可変軽鎖、または、それぞれ、配列番号８８および／または１０７に少なくとも６０％同じである可変重鎖または可変軽鎖を含む抗体である。抗体は、本明細書の上記に記載のように多量体化可能である。例えば、配列番号８８で設定された可変重鎖領域、および配列番号２９２２で設定されたＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖、ならびに配列番号１０７で設定された可変軽鎖および配列番号２９２３または２９２４で設定されたカッパまたはラムダＣＬ鎖を含む軽鎖を有する抗体多量体が本明細書で提供される。
別の例では、本明細書で提供される代表的抗体多量体は、ＳＹＷＩＧ（配列番号２９２１）のアミノ酸配列、例えば、ＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧ（配列番号２９１４）を有するＣＤＲＨ１（ｋａｂａｔナンバリングによるアミノ酸位置２６〜３５に対応）、ＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２９１５）のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２（ｋａｂａｔナンバリングによるアミノ酸位置５０〜６５に対応）、およびＲＧＹＳＹＧＹＤＹＦＤＹ（配列番号２９１６）のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３（アミノ酸位置９５〜１０２に対応）を含有する可変重鎖；ＧＬＳＳＧＳＶＳＴＳＹＹＰＳ（配列番号２９１７）のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１（ｋａｂａｔナンバリングによるアミノ酸位置２４〜３３または３４に対応）、ＳＴＮＴＲＳＳ（配列番号２９１８）のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２（ｋａｂａｔナンバリングによるアミノ酸位置５０〜５６）、およびＶＬＹＭＧＳＧＩＳＹＶ（配列番号２９１９）のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３（ｋａｂａｔナンバリングによるアミノ酸位置８９〜９７に対応）を含有する軽鎖、を含む。また、それぞれ配列番号２９１４〜２９１６のいずれかに少なくとも７０％同じであるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む可変重鎖、ならびにそれぞれ配列番号２９１７〜２９１９のいずれかに少なくとも７０％同じであるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む可変軽鎖を有し、それにより、抗体多量体がＤＬＬ４に系都合し、ＤＬＬ４の活性化因子である抗体多量体が提供される。例えば、配列同一性は、正確にまたは約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、またはそれ超であってもよい。例えば、抗体多量体は、少なくとも配列番号８９で設定された可変重鎖および配列番号１０８で設定された可変軽鎖、または配列番号８９および／または１０８にそれぞれ少なくとも６０％同じである可変重鎖もしくは可変軽鎖を含む抗体である。抗体は、本明細書の上記に記載のように、多量体化可能である。例えば、配列番号８９で設定された可変重鎖領域、および配列番号２９２２で設定されたＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖、ならびに、配列番号１０８で設定された可変軽鎖および配列番号２９２３または２９２４で設定されたカッパまたはラムダＣＬ鎖を含む軽鎖を有する抗体多量体が本明細書で提供される。
一部の例では、抗体が配列番号８８で設定された可変重を含む重鎖および配列番号１０７で設定された可変軽鎖を含む軽鎖を有する抗体ではない；または配列番号８９で設定された可変重鎖を含む重鎖および配列番号１０８で設定された可変軽鎖を含む軽鎖を有する抗体ではない、という条件で、本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体多量体は、ＤＬＬ４活性の活性化因子／モジュレーターを含む。
３．改変
本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体多量体は、抗体がＤＬＬ４に対する結合を維持し、ＤＬＬ４活性の活性化因子である限り、さらに改変可能である。本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体多量体の改変により、１つまたは複数の抗体の特性を改善することができる。改善できる特性には、これに限定されないが、抗体の免疫原性の低減；抗体の半減期の改善、例えば、蛋白質分解に対する感受性の低減および／または酸化に対する感受性の低減；抗体の結合特性の変更または改善；および／または抗体のエフェクター機能の調節、が含まれる。代表的改変には、抗体の一次配列の改変、および／または抗体の翻訳後修飾の変更がある。代表的翻訳後修飾には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、保護基／遮断基による誘導体化、タンパク分解性開裂、および細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合が含まれる。他の代表的改変には、１つまたは複数の抗体特性の変更または改善のための抗体への１つまたは複数の異種のペプチドの連結が含まれる。
通常、改変は、抗体またはその抗原結合断片の免疫原性の増加を生じない、または抗体のＤＬＬ４に対する結合または活性化因子としての活性に顕著な負の影響を与えない。改変抗体のＤＬＬ４に対する結合を評価する方法は、本明細書で提供され、また、当技術分野で既知である。例えば、改変抗体のＤＬＬ４に対する結合を、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ結合アッセイにより試験できる（これに限定されない）。また、抗体活性の活性化を評価する方法は、当業者には既知であり、また、本明細書の別のところで、例えば、実施例中で、記載されている。例えば、活性は、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性をレポーターアッセイを使って測定可能である。
本明細書で産生された抗ＤＬＬ４抗体の改変には、その抗体が由来している親抗体に比べて、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または追加を含むことができる。ポリペプチド、例えば、抗体、の改変の方法は、当技術分野で既知であり、本明細書で提供されるいずれの抗体または抗原結合断片の改変にも採用可能である。当業者に既知の標準的な方法が、本明細書で提供される抗体または抗原結合断片をコードするヌクレオチド分子中に変異を導入し、１つまたは複数のアミノ酸置換を有するポリペプチドを産生するために使用可能である。変異導入のための代表的技術には、これに限定されないが、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発がある。
抗体は、Ｎ末端またはＣ末端で異種のポリペプチドに組換操作による融合、または異種のポリペプチドまたは他の組成物への共有結合および非有結合を含む化学的結合が可能である。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカーペプチド経由で行ってもよい。一部の例では、リンカーペプチドは、精製後、プロテアーゼ開裂部位を特異的に認識するプロテアーゼによる開裂によって精製ペプチドの取り出しを可能にするプロテアーゼ開裂部位を含む。
例えば、本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体は、精製を促進するための異種ペプチドの連結により改変できる。通常、このようなペプチドは、抗体のＣ末端またはＮ末端でペプチドに融合した抗体を含む融合タンパク質として発現する。精製によく使われる代表的ペプチドには、これに限定されないが、ヘキサヒスチジンペプチド、赤血球凝集素（ＨＡ）ペプチド、およびｆｌａｇタグペプチド、が含まれる（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７：７６７；Ｗｉｔｚｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２３：２、２９１−８、参照）。
別の例では、本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体は、共有結合の任意のタイプの分子、例えば、診断または治療分子、により改変されうる。代表的診断および治療成分には、これに限定されないが、薬剤、放射性ヌクレオチド、毒素、蛍光分子、が含まれる（例えば、国際公開第９２／０８４９５号；同９１／１４４３８号；同８９／１２６２４号；米国特許第５、３１４、９９５号；および欧州特許第３９６、３８７号、参照）。診断ポリペプチドまたは診断成分は、例えば、インビボまたはインビトロ検出のための標識として、使用可能である。さらなる例では、本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体多量体は、他の分子または成分、例えば、半減期、安定性、免疫原性を増加させるか、またはインビボで抗体のターゲッティングに影響を与えるか、もしくは変えるもののいずれかに連結することにより改変できる。
代表的改変は、本明細書で下記に記載される。特定の抗体の用途に応じて、本明細書で提供される抗体のいずれかを改変することは、当業者のレベルの範囲内で対処できることである。
ａ．免疫原性を減らすための改変
一部の例では、本明細書で提供される抗体は、患者、例えば、ヒト患者の免疫原性を減らすために改変可能である。例えば、患者の免疫系に曝した場合、抗体中の１つまたは複数のアミノ酸が改変されて、ヒトＴ細胞に対する潜在的エピトープを変え、抗体の免疫原性を除去するか、または減らすことができる。代表的改変は、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失および挿入を含み、これにより、抗体の免疫原性を除去または低減する。通常、このような改変は、それぞれの抗原に対する結合特異性を変えない。抗体の免疫原性の減少により、１つまたは複数の抗体特性、例えば、抗体治療の効力の改善および／またはインビボ抗体半減期を増加させることができる。
ｂ．グリコシル化
本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体は、Ｎ結合型またはＯ結合型グリコシル化により改変可能である。Ｎ結合型グリコシル化には、トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン内のアスパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の連結が含まれる。ここで、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である。Ｏ結合型グリコシル化には、糖類の１つ、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのヒドロキシルアミノ酸への結合が含まれ、最もよく使われるのはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用可能である。抗ＤＬＬ４抗体は、さらに改変により、１つまたは複数の上記のトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変えることにより追加のグリコシル化部位を組み込むことができる（Ｎ結合型グリコシル化部位に対し）。また、元の抗体の配列に対し、１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を追加または置換することにより改変を行うことができる（Ｏ結合型グリコシル化部位に対し）。抗体がＦｃ領域を含む場合は、それに連結された炭水化物は変えることができる（例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号、同２００５／０１２３５４６号および同２００４／００９３６２１号；国際公開第２００３／０１１８７８号、同１９９７／３００８７号、同１９９８／５８９６４号、同１９９９／２２７６４号；および米国特許第６、６０２、６８４号、参照）。
例えば、Ｆｃ領域に結合した炭水化物構造でフコースが欠けているようなグリコシル化の変化が抗体のＦｃ領域で起こる。このような変異体は、ＡＤＣＣ機能を改善する。任意選択で、Ｆｃ領域は、１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４（Ｅｕ残基ナンバリング）での置換をさらに含み、それにより、ＡＤＣＣをさらに改善する（例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許公開第２００４／００９３６２１号；米国特許公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第／０５３７４２；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、参照）。脱フコシル化抗体を産生する細胞株の例には、タンパク質フコシル化欠損Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ、Ｌ；および国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．（特に、実施例１１））、ならびにノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１、６−フコシル基転移酵素遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４））が含まれる。
ｃ．Ｆｃ改変
本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体多量体は、野性型または改変Ｆｃ領域を含むことができる。本明細書で提供される抗体は、改変Ｆｃ領域を含むよう操作できる。一部の例では、Ｆｃ領域は、Ｆｃポリペプチドの１つまたは複数の特性を変えるように改変可能である。例えば、Ｆｃ領域は、野性型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能に比べて、エフェクター機能を変える（すなわち、高めるまたは低下させる）ように改変可能である。従って、改変Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する親和性を高める、または低下させる、または無くする（これに限定されない）ことを含めて、変えられた親和性を持たせることができる。受容体に対するＦｃ領域の親和性を変えることにより、Ｆｃドメインにより誘導されるエフェクター機能を調節することができる。
一例では、特定のＦｃγＲｓに対する結合を最適化し、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）をよりうまく媒介するために改変されているＦｃ領域が使用される。このような改変Ｆｃ領域は、１つまたは複数のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔナンバリング体系による：Ｋａｂａｔ、ｅｔａｌ．（１９９１）免疫学的関連タンパク質の配列、米国保健福祉省）での改変を含むことができる。これらの残基には、これに限定されないが、アミノ酸の位置２４９、２５２、２５９、２６２、２６８、２７１、２７３、２７７、２８０、２８１、２８５、２８７、２９６、３００、３１７、３２３、３４３、３４５、３４６、３４９、３５１、３５２、３５３、および４２４、が含まれる。例えば、配列番号２９２２に設定された代表的Ｆｃ配列のいずれか１つまたは複数のＧ１１９Ｓ、Ｇ１１９Ａ、Ｓ１２２Ｄ、Ｓ１２２Ｅ、Ｓ１２２Ｎ、Ｓ１２２Ｑ、Ｓ１２２Ｔ、Ｋ１２９Ｈ、Ｋ１２９Ｙ、Ｄ１３２Ｙ、Ｒ１３８Ｙ、Ｅ１４１Ｙ、Ｔ１４３Ｈ、Ｖ１４７Ｉ、Ｓ１５０Ｅ、Ｈ１５１Ｄ、Ｅ１５５Ｙ、Ｅ１５５Ｉ、Ｅ１５５Ｈ、Ｋ１５７Ｅ、Ｇ１６４Ｄ、Ｅ１６６Ｌ、Ｅ１６６Ｈ、Ｓ１８１Ａ、Ｓ１８１Ｄ、Ｓ１８７Ｔ、Ｓ２０７Ｇ、Ｓ２０７Ｉ、Ｋ２０９Ｔ、Ｋ２０９Ｅ、Ｋ２０９Ｄ、Ａ２１０Ｄ、Ａ２１３Ｙ、Ａ２１３Ｌ、Ａ２１３Ｉ、Ｉ２１５Ｄ、Ｉ２１５Ｅ、Ｉ２１５Ｎ、Ｉ２１５Ｑ、Ｅ２１６Ｙ、Ｅ２１６Ａ、Ｋ２１７Ｔ、Ｋ２１７Ｆ、Ｋ２１７Ａ、およびＰ２７９Ｌ、またはその組み合わせに対応するＦｃ領域の改変を行うことができる。これらの変異を含む改変Ｆｃは、ＦｃＲに対する強化された結合、例えば、受容体ＦｃγＩＩＩａを活性化する結合、および／または阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂに対する低下した結合を有しうる（例えば、米国特許公開第２００６／００２４２９８号参照）。ＦｃＲに対する結合を強化するように改変されたＦｃ領域は、患者中の真菌細胞の破壊を促進するのにさらに有効になりうる。
一部の例では、本明細書で提供される抗体または抗原結合断片がさらに改変され、抗体とＦｃＲｎ受容体の相互作用を改善し、インビボ半減期および抗体の薬物動態を増加させることができる（例えば、米国特許第７、２１７、７９７号；ならびに米国特許公開第２００６／０１９８８４０号および同２００８／０２８７６５７号、参照）。ＦｃＲｎは、新生児のＦｃＲで、これとの結合により、エンドサイトーシスによって取り込まれた抗体がエンドソームからリサイクルにより血流に戻される。大きなサイズの完全長分子による腎臓濾過の妨害と相まって、このプロセスにより、１〜３週間の範囲の好ましい抗体血清半減期が生ずる。また、ＦｃＲｎへのＦｃの結合は、抗体輸送でも一定の役割を果たす。
Ｆｃ領域の代表的改変には、これに限定されないが、米国特許第７、２１７、７９７号；米国特許公開第２００６／０１９８８４０号、同２００６／００２４２９８号および同２００８／０２８７６５７号；ならびに国際公開第２００５／０６３８１６号、に記載のＦｃの変異、例えば、１つまたは複数のＦｃ重鎖定常領域のＣＨ２ドメイン中のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔナンバリング、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１））２５１〜２５６、２８５〜９０、３０８〜３１４、および／またはＣＨ３ドメイン中のアミノ酸残基３８５〜３８９、および４２８〜４３６の変異が含まれ、これらの改変により、未改変抗体に比べ、Ｆｃ受容体結合親和性および／または血清半減期が変化する。一部の例では、Ｆｃ領域が、１つまたは複数のＦｃ重鎖定常領域のＣＨ２ドメイン中のアミノ酸位置２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２６３、３０８、３０９、３１１、３１２および３１４および／またはＣＨ３ドメイン中のアミノ酸位置３８５、３８６、３８７、３８９、４２８、４３３、４３４、４３６、および４５９で改変される。このような改変は、配列番号２９２２に設定された代表的Ｆｃ配列中のＣＨ２ドメイン中のアミノ酸Ｇｌｙ１２０、Ｐｒｏ１２１、Ｓｅｒ１２２、Ｐｈｅ１２４Ｌｅｕ１２５、Ｐｈｅ１２６、Ｔｈｒ１３３、Ｐｒｏ１７４、Ａｒｇ１７５、Ｇｌｕ１７７、Ｇｌｎ１７８、およびＡｓｎ１８０ならびにＣＨ３ドメイン中のアミノ酸Ｇｌｎ２４５、Ｖａｌ２４６、Ｓｅｒ２４７、Ｔｈｒ２４９、Ｓｅｒ２８３、Ｇｌｙ２８５、Ｓｅｒ２８６、Ｐｈｅ２８８、およびＭｅｔ３１１に対応する。一部の例では、改変は、１つまたは複数の表面露出残基で行われ、改変は、置換される残基に類似の電荷、極性または疎水性を有する残基による置換である。
特定の例では、Ｆｃ重鎖定常領域が１つまたは複数のアミノ酸位置２５１、２５２、２５４、２５５、および２５６（Ｋａｂａｔナンバリング）で改変される。この場合、位置２５１がＬｅｕまたはＡｒｇで置換され、位置２５２がＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＴｈｒで置換され、位置２５４がＴｈｒまたはＳｅｒで置換され、位置２５５がＬｅｕ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＡｒｇで置換され、および／または位置２５６がＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＴｈｒで置換される。一部の例では、Ｆｃ重鎖定常領域が１つまたは複数のアミノ酸位置３０８、３０９、３１１、３１２、および３１４（Ｋａｂａｔナンバリング）で改変される。この場合、位置３０８がＴｈｒまたはＩｌｅで置換され、位置３０９がＰｒｏで置換され、位置３１１がセリンまたはＧｌｕで置換され、位置３１２がＡｓｐで置換され、および／または位置３１４がＬｅｕで置換される。一部の例では、Ｆｃ重鎖定常領域が１つまたは複数のアミノ酸位置４２８、４３３、４３４、および４３６（Ｋａｂａｔナンバリング）で改変される。この場合、位置４２８がＭｅｔ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＳｅｒで置換され、位置４３３がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、またはＨｉｓで置換され、位置４３４がＰｈｅ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓで置換され、および／または位置４３６がＨｉｓ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、またはＴｈｒで置換される。一部の例では、Ｆｃ重鎖定常領域が１つまたは複数のアミノ酸位置２６３および４５９（Ｋａｂａｔナンバリング）で改変される。この場合、位置２６３がＧｌｎまたはＧｌｕで置換され、および／または位置４５９がＬｅｕまたはＰｈｅで置換される。
一部の例では、Ｆｃ重鎖定常領域を補体タンパク質Ｃ１ｑに対する結合を強化するために改変することができる。ＦｃＲとの相互作用に加えて、Ｆｃはまた、補体タンパク質Ｃ１ｑと相互作用し、補体依存細胞障害性（ＣＤＣ）を媒介する。Ｃ１ｑはセリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓと複合体を形成しＣ１複合体を作る。Ｃ１ｑは、６つの抗体と結合可能であるが、２つのＩｇＧとの結合で、補体カスケードを活性化するのに充分である。ＦｃのＦｃＲとの相互作用と同様に、異なるＩｇＧサブクラスは、Ｃ１ｑに対し異なる親和性を有し、通常、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３が、実質的にＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも良好な結合を行う。従って、Ｃ１ｑに対する増加した結合を有する改変Ｆｃは、強化されたＣＤＣを媒介し、真菌性細胞の破壊を強化することができる。Ｃ１ｑへの結合を高めるＦｃ領域の代表的改変には、これに限定されないが、位置３４５および２５３（Ｋａｂａｔナンバリング）でのアミノ酸改変がある。代表的改変には、配列番号２９２２に設定された代表的Ｆｃ配列中のＫ２０９Ｗ、Ｋ２０９Ｙ、およびＥ２１６Ｓに対応するものが含まれる。
別の例では、ＦｃγＲとの結合を低減する、または切断するための置換を有する種々のＦｃ変異体も知られている。このような変異タンパク質は、Ｆｃに媒介されるエフェクター機能の低下または除去が必要な場合に有用である。これは、拮抗作用を望むが、標的抗原を有する細胞の死滅は望まない場合によくあることである。代表的なこのようなＦｃは、米国特許第５、４５７、０３５号に記載のＦｃ変異タンパク質で、これは、アミノ酸位置２４８、２４９および２５１（Ｋａｂａｔナンバリング）で改変されている。配列番号２９２２のアミノ酸１００〜３３０の代表的Ｆｃ配列中で、アミノ酸１１８がＬｅｕからＡｌａに改変され、アミノ酸１１９がＬｅｕからＧｌｕに改変され、およびアミノ酸１２１がＧｌｙからＡｌａに改変される。同様の変異を、いずれのＦｃ配列でも、例えば、代表的Ｆｃ配列で作ることができる。この変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対する親和性の低下を示す。
ｄ．ペグ化
本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体多量体は、ポリマー分子、または水溶性ポリマー、例えば、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合させ、半減期を増加し、および／または薬物動態学的プロファイルを改善することができる。水溶性ポリマーには、これに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１、３−ジオキソラン、ポリ−１、３、６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダム共重合体）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン酸化物／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセリン）、ポリビニルアルコール、およびその混合物、が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定性があるため、製造上の利点がある可能性がある。ポリマーは、どの分子量でもよく、分岐でも非分岐でもよい。抗体に結合したポリマーの数は、変えることができ、２つ以上のポリマーが結合している場合は、それらが同じ分子であっても、異なっている分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使われるポリマーの数および／またはタイプは、改良されるべき抗体の特定の特性または機能、および抗体誘導体が一定の条件下で治療に使われることになるのかどうかを含む（これに限定されない）考察に基づいて判断できる。
当業者に既知の技術により結合を行うことができる。治療の抗体のＰＥＧとの結合は、機能を妨害することなく薬力学を高めることが示されている（例えば、Ｄｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８７：３８２−３９０、２０００；Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １５：４０９−４１８、２００４；Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６−１１９、２００１；およびＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：７６１−７７０、２００３、参照）。ＰＥＧは、抗体または抗原結合断片のＮまたはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的結合により、またはリジン残基上に存在するε−アミノ基経由で、多機能リンカーを用い、または用いないで、抗体または抗原結合断片に結合することができる。生物活性の最小限の損失で済む直鎖または分枝高分子誘導体化を使用することができる。結合度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析でモニターして、ＰＥＧ分子の抗体への適正な結合を確認することができる。未反応ＰＥＧは、抗体−ＰＥＧ複合体から、例えば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができる。ＰＥＧ誘導体化した抗体は、ＤＬＬ４に対する結合活性、ならびにインビボ有効性に関し、当業者に既知の方法、例えば、本明細書に記載の機能的アッセイを使って試験できる。
４．組成物、製剤、投与および製品／キット
ａ．組成物および製剤
本明細書で提供される抗体多量体は、投与用製剤として提供可能である。有効成分を単独で投与することも可能であるが、通常、それは調合薬として存在する。組成物または製剤は、１つまたは複数の受容可能なそのキャリアと一緒に、少なくとも１つの有効成分を含む。各キャリアは、他の成分と適合するという意味で、薬学的および生理学的の両方から受容可能であり、患者に対し非障害性でなければならない。製剤には、経口、直腸、鼻、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与に適切なものが含まれる。製剤は、便利なように単位剤形で存在してもよく、当技術分野でよく知られた薬学の方法で調製されてもよい。例えば、Ｇｉｌｍａｎ、ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：「治療薬の薬理学的基礎」、第８版．、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；および「レミントンの薬学」、第１７版．（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．；Ａｖｉｓ、ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．１９９３）製剤剤形：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．１９９０）製剤剤形：Ｔａｂｌｅｔｓ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎ、ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．１９９０）製剤剤形：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ、参照のこと。
抗体投与経路は、既知の方法と同じで、例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、鞘内、吸入または病巣内経路による注射または注入、局所的または下記に示すように徐放製剤による方法である。抗体は、通常、注入またはボーラス注入により連続的に投与される。抗体は、局地的の、または全身性の方法で投与できる。
本明細書で提供される抗体多量体は、薬学的に許容可能なキャリアを含む混合物として調製できる。化合物の製剤処方および投与のための技術は、当業者には既知である（例えば、「レミントンの薬学」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．参照）。この治療組成物は、静脈内にまたは鼻または肺経由で、好ましくは、液体または粉末エアロゾル（凍結乾燥した）として、投与可能である。また、組成物は、必要に応じ、非経口的にまたは皮下に投与可能である。全身性投与の場合は、治療組成物は、無菌の、発熱性物質のない、ｐＨ、等張性、および安定性に対し当然の配慮を有する非経口的に受容可能な溶液でなければならない。これらの条件は当業者には既知である。
治療製剤は、多くの従来の剤形で投与可能である。簡単に述べれば、抗体本明細書で提供される製剤は、貯蔵または投与のために、所望の純度の生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤を混合することにより調製される。このような材料は、採用される容量と濃度でレシピエントに対し無毒性であり、緩衝液、例えば、トリスＨＣｌ、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および他の有機酸塩；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ペプチド、例えば、ポリアルギニン、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性高分子、例えば、ポリビニルピロリジノン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン；単糖類、二糖類、およびセルロースまたはその誘導体を含む他の炭水化物、グルコース、マンノース、またはデキストリン；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール；対イオン、例えば、ナトリウムおよび／または非イオン性界面活性剤、例えば、ツイーン、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳまたはポリエチレングリコール、を含むことができる。
インビボ投与に使用する場合は、抗体多量体製剤は、無菌でなければならず、従来の薬務に従って処方可能である。これは、凍結乾燥および再構成の前または後で、無菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成可能である。抗体は、通常、凍結乾燥した形態でまたは溶液で貯蔵可能である。他の賦形剤、例えば、ゴマ、ピーナッツ、もしくは綿実オイル、等の天然植物油、またはエチルオレアート等の合成脂肪賦形剤、等が望ましい。緩衝液、防腐剤、抗酸化剤、等は、受け入れられている薬務に従って、組み込むことができる。
使用に適した医薬組成物には、１つまたは複数の抗体多量体が、その意図された目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。治療有効量の決定は、特に、本明細書で提供される詳細開示を考慮すると、当業者の能力の範囲内で充分に処理できる。治療有効投薬量はインビトロおよびインビボの方法を使って決定可能である。
治療に採用される抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存する。さらに、主治医は、重症度および疾患の型、体重、性別、食事、時間および投与経路、他の投薬およびその他の関連する臨床的因子を含む薬剤の作用を変えることがわかっている種々の因子を考慮に入れる。従って、治療専門家は、投与量の力価を評価し、最適治療効果を得られるように投与経路を変更する必要が生じるであろう。通常、臨床医は所望の効果が達成される投与量になるまで抗体を投与する。この治療の進行は、従来のアッセイにより容易にモニターされる。
ペプチドを含むいずれの抗体に対しても、治療有効量は、最初に、細胞培養アッセイから推定可能である。例えば、用量は、細胞培養で求めたＥＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように動物モデル中で処方することができる（例えば、細胞増殖または分化を促進または阻害する試験分子の濃度）。このような情報は、ヒトでの有用な用量を、より正確に決定するために使用できる。
本明細書記載の抗体多量体の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％の致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％の治療的有効用量）の測定のための、細胞培養または実験動物での標準的医薬品手法により測定可能である。有毒性および治療効果の間の用量比率は、治療指数であり、それは、ＬＤ５０とＥＤ５０の間の比率として表現できる。高治療指数を示す分子は、使用可能である。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒトでの使用の投与量の範囲を公式化するのに使用可能である。このような分子の投与量は、ほんのわずかの毒性、または無毒性で、ＥＤ５０を含む循環濃度範囲内に入ることが望ましい。投与量は、採用された剤形および使われた投与経路に依存するこの範囲内で変動してもよい。正確な製剤処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して、個別の医師により選択されうる（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．、１９７５、「治療薬の薬理学的基本」中の１章、ｐ．１、参照）。
投与量および間隔は、細胞増殖もしくは分化を促進もしくは阻害するのに充分な抗体の血漿レベルまたは最小有効濃度（ＭＥＣ）を提供するようにそれぞれ調節できる。ＭＥＣは、各抗体に対し変化すると思われるが、記載のアッセイを使ってインビトロデータから推測可能である。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特性と投与経路に依存するであろう。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを使って血漿中濃度を測定することができる。
また、投与間隔も、ＭＥＣ値を使って決めることができる。抗体分子は、ＭＥＣを超える血漿レベルを１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％の時間の間維持する投与計画により投与しなければならない。
局所投与または選択的取り込みの場合には、抗体の有効局所濃度は、血漿中濃度に関連しない可能性がある。
本明細書で提供される抗体多量体の典型的な毎日投与量の範囲は、約１μ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇまたはそれ超であり、上述の因子に依存する。通常、臨床医は、所望の効果が得られる投与量に達するまで分子の投与を行うであろう。この治療の進行は、従来のアッセイにより容易にモニターされる。
例えば、１つまたは複数の別々の投与による場合でも、または連続注入による場合であっても、疾患の型および重症度に応じて、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１０〜２０ｍｇ／ｋｇの抗体多量体が、最初の患者への投与の候補投与量である。数日、またはさらに長期にわたる反復投与に対しては、状態に応じ、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、または患者の状態の所望の改善が得られるまで、治療が繰り返される。しかし、他の投与計画もまた、意図されている。
ｂ．製品とキット
選択抗体もしくは選択抗体をコードする核酸、または誘導体もしくは生物学的に活性なその一部の医薬品化合物は、パッケージング材料、疾患または障害の治療に有効な医薬組成物、および選択抗体または核酸分子が疾患または障害の治療に使用できることを示すラベルを含む製品としてパッケージされうる。
本明細書で提供される製品は、パッケージング材料を含む。医薬品のパッケージングに使われるパッケージング材料は当業者にはよく知られている。例えば、米国特許第５、３２３、９０７号、同５、０５２、５５８号および同５、０３３、２５２号を参照。これらの特許は、その全体が本明細書に組み込まれる。医薬品パッケージング材料の例には、これに限定されないが、ブリスター包装、ビン、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、コンテナ、注射器、ボトル、および選択製剤および意図したモードの投与と治療に適したいずれかのパッケージング材料、が挙げられる。本明細書で提供される化合物および組成物の多様な製剤は、いずれかのＥＰＯ媒介疾患または障害または治療ポリペプチド媒介疾患または障害に対する種々の治療薬として意図されている。
抗体およびその抗体をコードする核酸分子は、また、キットとして提供可能である。キットは、本明細書記載の医薬組成物および投与のための品目を含むことができる。例えば、選択抗体は、投与用装置、例えば、シリンジ、吸入器、用量カップ、ドロッパー、または塗布具と一緒に提供可能である。キットには、任意選択で、投与量、投与計画および投与方法のインストラクションを含む適用のためのインストラクションが含まれる。また、キットには、本明細書記載の医薬組成物および診断用品目を含めてもよい。例えば、このようなキットには、患者中の抗体の濃度、量または活性を測定する品目を含めてもよい。
５．治療および使用方法
本明細書で、異常血管新生または血管新生を顕在化させる疾患を治療するために、抗ＤＬＬ４抗体多量体による治療の方法、またはその使用の方法が提供される。血管新生は、新血管が形成されるプロセスである。それは、例えば、傷害または侵襲後、創傷の治療のために、および血流を組織に戻すために健常体で発生する。女性では、また、血管新生が、子宮粘膜を形成するために、排卵中に卵を成熟させるために、および妊娠中に胎盤を形成するために、毎月の生殖周期の間に発生する。一部の状況では、「あまりにも多い」血管新生、例えば、炎症反応および他の異常血管新生関連状態における、腫瘍病巣に血液を提供する血管新生、が有害になる可能性がある。慢性炎症中の腫瘍の増殖、または増殖部位は、通常、それらの代謝要求を支援するために、近くの血管および血管内皮細胞の動員を要求する。これが、組織中で、酸素の拡散が制限される理由である。血管新生に関連する代表的状態には、これに限定されないが、固形腫瘍および血液系腫瘍、例えば、リンパ腫、急性白血病、および多発性骨髄腫が含まれ、これらは、病的骨髄中で血管の数の増加が観察される。
従って、血管新生は、種々の障害の発病に関与する。これらには、固形腫瘍および転移、アテローム性動脈硬化、後水晶体線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内の新生血管疾患、例えば、増殖網膜症、例えば、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、および乾癬、が含まれる。Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−３４（１９９２）；Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−３９（１９９１）；およびＧａｒｎｅｒ Ａ．、「眼疾患の病理生物学」中の「血管疾患」。「動的アプローチ」、ＧａｒｎｅｒＡ．、Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ ＧＫ、ｅｄｓ．、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ、１９９４）、ｐｐ１６２５−１７１０。
腫瘍増殖の場合には、血管新生は、腫瘍への過形成から移行し、腫瘍の増殖と転移用栄養物を提供するために重大であると思われる。Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：５８（１９８９）。血管新生は、正常細胞に比べて、腫瘍細胞に増殖の利点と増殖の自立性を獲得させる。腫瘍は、通常、利用可能な毛細管床からの距離に起因して、わずか数立方ミリメーターのサイズに増殖することが可能な単一の異常細胞として始まり、さらなる増殖も内転移もなく長期間「休眠中」状態でのまま留まることができる。次に、一部の腫瘍細胞は、血管新生表現型に切り替わり、内皮細胞を活性化し、新毛細血管へと増殖および成熟する。これらの新しく形成された血管は、原発性腫瘍の増殖を継続させるのみでなく、転移性の腫瘍細胞の内転移および再コロニー化を起こさせる。従って、乳癌ならびにいくつかの他の腫瘍中の腫瘍断面中の微小血管の密度と患者生存の間の相関が観察されている。Ｗｅｉｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２４：１−６（１９９１）；Ｈｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ ３４０：１１２０−２４（１９９２）；Ｍａｃｃｈｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ ３４０：１４５−４６（１９９２）。血管新生切り替えを制御する詳細な機序は、はっきりとは解っていないが、腫瘍塊の血管新生は、血管新生刺激剤および阻害剤の数の正味バランスに起因すると考えられている（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１（１）：２７−３１（１９９５））。
また、血管新生は、炎症性疾患においても一定の役割を果たす。これらの疾患は、腫瘍病巣に類似の増殖成分を有する。関節リウマチでは、１つのこの成分は、滑膜線維芽細胞の異常増殖を特徴とし、パンヌス形成が起こる。パンヌスは、形質転換細胞と同じ表現型特性を有する滑膜線維芽細胞から構成されている。パンヌスが関節内で成長するにつれ、多くの血管新生促進シグナルを発し、多くの腫瘍と同じ新血管新生要求を行う。追加の血液供給の要求、すなわち、血管新生、は重要な意味を持つ。同様に、慢性炎症性状態は、また、増殖性成分を有し、それを含む一部の細胞が、通常、形質転換細胞が原因とされる特性を持つ可能性がある。
過剰血管新生を伴う状態の別の例は、糖尿病性網膜症である（Ｌｉｐｅｔａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ８８：１５４３、２００４））。糖尿病性網膜症は、血管新生、炎症性および増殖性成分；ＶＥＧＦ過剰発現を有し、アンジオポエチン−２がよく見られる。この過剰発現は、同様に、疾患関連リモデリングおよび血管分岐に必要であり、これはその後、疾患の増殖性成分を支援する。
従って、本明細書では、血管新生疾患および状態のための抗ＤＬＬ４抗体多量体による治療方法が提供される。このような疾患または状態には、これに限定されないが、炎症性疾患、免疫疾患、癌、および異常の血管新生および異常な血管新生を顕在化させる他の疾患が含まれる。癌には、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、その他が含まれる。炎症性疾患には、例えば、糖尿病性網膜症および／または神経障害および他の糖尿病の炎症性血管合併症、自己免疫性糖尿病を含む自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化、クローン病、糖尿病性腎臓疾患、嚢胞性繊維症、子宮内膜症、糖尿病誘導血管傷害、炎症性腸疾患、アルツハイマー病および他の神経変性疾患が含まれる。治療は、ポリペプチドとして組成物中に提供される抗体多量体を適切に経路設定して投与するとこにより行うことができる。一部の例では、抗体多量体は、標的送達のためにターゲッティング試薬に結合する、またはリポソーム等の送達賦形剤中でカプセル化することができる。
例えば、本明細書で提供される抗ＤＬＬ４多量体を使った治療には、これに限定されないが、糖尿病関連疾患および歯周部、自己免疫性、血管、および尿細管間質性疾患、を含む状態の治療が含まれる。抗ＤＬＬ４抗体多量体を使った治療には、また、黄斑変性を含む眼疾患、循環器疾患、アルツハイマー病を含む神経変性疾患、炎症性疾患およびリウマチ性関節炎を含む状態、ならびに癌を含む細胞増殖に関連する疾患および状態の治療が含まれる。当業者は、治療される疾患の型、重症度および疾患の経過、分子が予防または治療目的で投与されるのかどうか、前治療、患者の臨床的病歴および治療に対する反応、ならびに主治医の裁量による投与する分子の適切な投与量、に基づいて評価できる。
併用療法
本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体多量体は、別の治療薬と組み合わせて投与できる。例えば、抗ＤＬＬ４抗体多量体は、抗癌治療薬または抗血管新生治療薬と組み合わせて、種々の腫瘍性または非腫瘍性状態を治療するために使われる。一実施形態では、腫瘍性または非腫瘍性状態は、異常のまたは望ましくない血管新生に関連する病理学的障害を特徴とする。また、代表的併用療法には、米国特許公開第２００９０２４６１９９号に述べられた内のいずれかが含まれる。抗ＤＬＬ４抗体多量体は、連続的に、またはこれらの目的に効果的な別の薬剤と、同じ組成物または別々の組成物として組み合わせて投与可能である。抗ＤＬＬ４抗体多量体は、順次、同時にまたは間をおいて、治療薬と投与可能である。代わりに、または、追加して、複数のＤＬＬ４阻害剤を投与可能である。
抗ＤＬＬ４抗体多量体の投与は、例えば、単一の組成物として、または２つ以上の異なる組成物として、同じまたは異なる投与経路を使って、同時に行うことができる。代わりに、または、追加して、順番はどうであれ、順に投与を行うことができる。特定の実施形態では、間隔は分から日、週、月にわたる間隔を、２つ以上の組成物の投与の間におくことができる。例えば、抗癌剤を最初に投与し、次いで、ＤＬＬ４抗体多量体を投与してもよい。同時投与または抗ＤＬＬ４抗体多量体の最初の投与も、また、意図されている。
抗ＤＬＬ４抗体多量体と組み合わせて投与される治療薬の有効量は、医師または獣医師の裁量に任される。服用量の投与および調整は、治療される状態の最高の処置が得られるように行われる。用量はさらに、使用される治療薬の型および治療される特定の患者、等の因子に依存するであろう。適切な抗癌剤投与量は、現在使われている量であり、また、抗癌剤と抗ＤＬＬ４抗体多量体の組み合わせ作用（相乗作用）により低減することが可能である。
通常、抗ＤＬＬ４抗体多量体および抗癌剤は、同じまたは類似の疾患の病理学的障害、例えば、腫瘍増殖または癌細胞の増殖を遮断または低減するのに適している。一実施形態では、抗癌剤は、抗血管新生剤である。癌に関連した抗血管新生治療は、腫瘍増殖を支える栄養素を提供するのに必要な腫瘍血管の成長を阻害することを狙った癌治療戦略である。血管新生は、原発性腫瘍増殖および転移の両方に関与するので、抗血管新生治療は、一般的に、１次部位での腫瘍の新生物形成増殖、ならびに２次部位での腫瘍の転移を阻害することができ、それにより、他の治療薬による腫瘍の攻撃が可能となる。
多くの抗血管新生剤が特定され、当技術分野で既知であり、本明細書で、例えば、定義の下に挙げられたもの、また、例えば、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ ａｎｄ Ｊａｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ４０７：２４９−２５７（２０００）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、３：３９１−４００（２００４）；およびＳａｔｏ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、８：２００−２０６（２００３）により挙げられたものが含まれる。また、米国特許公開第２００３００５５００６号を参照。一実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体多量体は、抗ＶＥＧＦ中和抗体（または断片）および／または別のＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニストと組み合わせて使用される。これらには、例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ニューロピリン（例えば、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２））断片、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断できるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子量阻害剤（ＲＴＫ）、ＶＥＧＦに対するアンチセンス戦略、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するリボザイム、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体；およびこれらのいずれかの組み合わせが含まれる（これに限定されない）。代わりに、または、追加で２つ以上の血管新生阻害剤を、任意選択で、ＶＥＧＦアンタゴニストおよび他の薬剤に追加して、患者に同時投与できる。特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の治療薬、例えば、抗癌剤を、抗ＤＬＬ４抗体多量体、ＶＥＧＦアンタゴニスト、および抗血管新生剤と組み合わせて投与可能である。
特定の態様では、抗ＤＬＬ４抗体多量体との組み合わせ血管新生または腫瘍治療に有用な他の治療には、他の癌治療、（例えば、手術、放射線治療（例えば、放射性活性物質の照射または投与を伴う）、化学療法、本明細書で挙げられ、当技術分野で既知の抗癌剤による治療、またはこれらの組み合わせ）が含まれる。代わりに、または、本明細書で開示の、同じまたは２つ以上の異なる抗原に結合した２つ以上の抗体を患者に同時投与可能である。ときには、１つまたは複数のサイトカインを患者に投与することも有用である。
Ｈ．実施例
下記の実施例は、説明の目的のみのために提示されており、本発明の範囲を限定する意図はない。
実施例１
変異Ｆａｂ抗体の生成
この実施例では、変異Ｆａｂ抗体を、アラニンスキャニング、ＮＮＫ変異誘発、およびオリゴ対の、いずれかの改変ＣＤＲ領域のクローニングを可能とするＢｓａＩ改変プラスミド中への、高スループット方式による連結反応により生成した。
Ａ．アラニン置換変異導入（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
親重鎖または軽鎖ＤＮＡをテンプレートとして使って、アラニン変異体をオーバーラッピングＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）により生成した。標的コドンに所望の変異を特異的に生成する順方向および逆方向プライマーを適切なプラスミド中の親ＤＮＡを増幅するのに使用した。
ＰＣＲの最初のラウンドで、異なるプライマー対を用いた２つの別々のＰＣＲ反応を使って、２つの遺伝子セグメントを増幅した。最初の反応では、ＥｃｏＲＩ順方向プライマーを有する特異的逆方向プライマーを使い、遺伝子の最初の半分を増幅した。第２の反応では、ＦＬＸｈｏＩ逆方向プライマーを有する特異的順方向プライマーを使い、遺伝子の残りの半分を増幅した。次の条件の２０サイクルのＰＣＲを使って遺伝子セグメントを生成した：９４℃で３０秒間；５０℃で３０秒間；および７２℃で９０秒間。ＰＣＲ産物を単離し、１％アガロースゲルから精製し、一緒に混合して、第２ラウンドのＰＣＲ用テンプレートとした。ＰＣＲ第２ラウンドでは、ＥｃｏＲＩ順方向およびＦＬＸｈｏＩ逆方向プライマーを使って、完全長遺伝子産物を増幅した。次の条件の２０サイクルのＰＣＲを使って遺伝子産物を得た：９４℃で３０秒間；５５℃で３０秒間；および７２℃で９０秒間。
ＰＣＲ産物を単離し、その後、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化させて、同様に消化させたプラスミド中に連結した。大腸菌ＤＨ５α中で連結反応生成物の形質転換および平板培養後、個々のコロニーを選択し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、および０．４％グルコースを補充した１．５ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（ＥＭＤ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む９６ウエルブロック中、３７℃で、一晩成長させた。ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってＤＮＡを単離し、アラニン変異をＤＮＡシーケンシングにより確認した。
一例として、表６に、変異体ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１ Ｒ９９ＡおよびＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１ Ｅ１００Ａを生成するために使用したプライマー対を示す。プライマーＲ９９Ａ＿ＦおよびＲ９９Ａ＿Ｒは、Ｒ９９を特異的に増幅しアラニン変異を導入するために利用した。プライマーＥ１００Ａ＿ＦおよびＥ１００Ａ＿Ｒは、Ｅ１００を特異的に増幅しアラニン変異を導入するために利用した。プライマーＥｃｏＲＩ＿ＦおよびＦＬＸｈｏＩ＿Ｒは、遺伝子の残りのセグメントを増幅するために利用した。
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Ｂ．オーバーラッピングＰＣＲによるＮＮＫ変異誘発
アラニン置換変異導入に関し上述したように、所望のＮＮＫ変異を生成する初期プライマーを使って、オーバーラッピングＰＣＲによるＮＮＫ変異誘発を行った。従って、最初のＰＣＲのラウンドでは、標的コドンがＮＮＫ（順方向）およびＭＮＮ（逆方向）で置換された特異的プライマー対を使った。例えば、下の表７に、Ｈ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１ Ｇ１００ ＮＮＫ変異体およびＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１ Ｓ１０２ ＮＮＫ変異体を生成するのに使用した順方向および逆方向プライマーを示す。
それぞれのクローンをＤＮＡシーケンシング（ＢＡＴＪ、Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡで実施）を行い、アミノ酸置換を特定した。ＮＮＫ変異反応毎の採取したコロニーの数に応じて、変異割合は変化し、変異毎に、４〜５アミノ酸変化のように低いものから１８〜１９アミノ酸変化のように高いものまで観察された。
Figure 0006007420
Ｃ．タイプＩＩ制限酵素ベースオリゴ対の消化と連結反応を使ったカセット変異導入
この実施例では、高スループット方式で、事前にＢｓａＩクローニング部位を含むように改変されたプラスミド中へ特異的合成ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列をクローニングしてＦａｂ変異体を生成した。重鎖または軽鎖のそれぞれに対し、特異的にそれぞれ３つのベクターを生成し、それにより、ＢｓａＩ制限酵素部位を各ＣＤＲ領域の５’と３’の両末端に組み込んだ。Ｆａｂ変異体を生成するために、特異的変異および追加のＢｓａＩオーバーラッピング末端を有するＣＤＲをコードする順方向および逆方向プライマーを合成し、アニールした。これらのカセット、または変異ＣＤＲ領域は、次に、対応するＢｓａＩ消化ベクターに連結され、それにより、特異的に改変されたＣＤＲ領域を含むプラスミドを生成する。
例えば、特異的プライマーを合成し（ＩＤＴ、下記表８参照）、重鎖ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１およびＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１ならびに軽鎖Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１およびＶ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１用のそれぞれ３つのベクターを生成するために使用し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の先頭と末端にＢｓａＩ部位を組み込んだ。最初のラウンドのＰＣＲで、特異的順方向および逆方向プライマーを使い、また、親重鎖または軽鎖ＤＮＡをテンプレートとして使って、上述のように、ベクターが生成された。それぞれのクローンのＤＮＡシーケンシング（ＢＡＴＪ、Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡで実施）を行い、各ＣＤＲの２つのＢｓａＩ部位の組み込みを確認した。
引き続いて、各ＢｓａＩ含有プラスミドをＢｓａＩで消化し（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＤＮＡをゲル精製した。特異的プライマー（ＩＤＴ）を合成し、所望の変異体を生成した。簡単に述べれば、各１μｌの順方向および逆方向プライマーを９５℃の加熱下、ＴＥ中で２分間アニールし、続いて、室温までゆっくり冷却した。次に、１μｌのアニールしたプライマーを２ｎｇのＢｓａＩ消化ベクターに連結し、大腸菌ＤＨ５ａ細胞中で形質転換した。変異をＤＮＡシーケンシングにより確認した。連結反応を、９６ウエルプレート中で行い、高スループット変異誘発を可能とする。
例えば、下表８〜９は、ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＿ＡＰＦＦＣＤＲ２変異体を生成するプライマーを示す。
Figure 0006007420
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実施例２
Ｆａｂライブラリーのクローニングおよび高スループット増殖および精製
この実施例では、重鎖または軽鎖可変領域ＤＮＡをそれぞれのプラスミド中にクローニングし、続いて同時形質転換し、高スループットタンパクの質増殖／精製を行うことによりＦａｂ抗体を生成した。
Ａ．可変重鎖および軽鎖のクローニングおよび同時形質転換
必要に応じてコンビナトリアルＦａｂの同時形質転換および発現を行うための定常重鎖または軽鎖を含むプラスミドに、重鎖または軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを挿入した。プラスミドＡ（配列番号８４）およびプラスミドＤ（配列番号８５）は、重鎖定常領域配列を含む。プラスミドＣ（配列番号８６）は、カッパ軽鎖定常領域配列を、また、プラスミドＥ（配列番号８７）は、ラムダ軽鎖定常領域配列を含む。
可変重鎖をコードするＤＮＡをＮｈｅＩおよびＮｃｏＩで消化し、ＳｔＩＩリーダー配列を有するプラスミドＡに連結した。ＤＮＡａ可変カッパ軽鎖をコードするＤＮＡをＮｃｏＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、可変ラムダ鎖をコードするＤＮＡをＮｃｏＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、それぞれ、標準的分子技術を使って、ＳｔＩＩリーダー配列を有するプラスミドＣまたはプラスミドＥに連結した。
プラスミドＡおよびそれぞれ種々の組み合わせの可変重鎖および軽鎖を含むプラスミドＣまたはプラスミドＥの内の１つを大腸菌中で同時形質転換した。このプロセスを、全ての重鎖および軽鎖の組み合わせに対し繰り返した。簡単に述べれば、プラスミドＡ（Ｆａｂ重鎖をコード）およびプラスミドＣまたはプラスミドＥ（Ｆａｂ軽鎖をコード）をＴＥ緩衝液中で１ｎｇ／μＬの最終濃度で別々に再懸濁した。１μＬの重鎖プラスミドおよび１μＬの軽鎖プラスミドをＰＣＲチューブまたはＰＣＲプレート中で混ぜ合わせ、２０μＬの氷冷ＬＭＧ１９４コンピテント細胞と混合した。形質転換反応系を氷上で１０分間インキュベートし、続いて、予熱ＰＣＲブロック中、４２℃で４５秒間、熱ショックを加えた。次に、チューブをさらに２分間氷上に置き、その後、２００μＬのＳＯＣ培地を追加した。細胞を３７℃で１．５時間回収した。１００μＬの形質転換培養液を使って０．４％（ｗ／ｖ）グルコース、１７μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）および３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む０．９ｍＬＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ Ｂｒｏｔｈ）培地に播種した。培養物を激しく振盪を加えながら３０℃で２０時間成長させた。下記に記載のように、Ｐｉｃｃｏｌｏ（登録商標）システムを使って、形質転換培養物を成長させ、精製した。
Ｂ．Ｆａｂ抗体の高スループット増殖および精製
形質転換後、細胞を、通気性のあるテープでカバーした２ｍｌのディープウエル９６ウエルプレート（ＶＷＲ）ブロック中で一晩成長させた。一晩の培養物を使ってＰｉｃｃｏｌｏ（登録商標）に直接播種した（Ｗｏｌｌｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＪＡＬＡ、１１：２９１−３０３）。
タンパク質発現および精製を自動化するＰｉｃｃｏｌｏ（登録商標）（Ｔｈｅ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ（ＴＡＰ））を使ってＦａｂ抗体の高スループット、並列発現および精製を行った。Ｐｉｃｃｏｌｏ（登録商標）用の発現および精製パラメータをＲｕｎ Ｃｏｍｐｏｓｅｒソフトウェア（ＴＡＰ）を使って作成した。種培養プレート中の各クローンの位置をマッピングした「株ファイル（Ｓｔｒａｉｎ Ｆｉｌｅ）」を生成した。これはＲｕｎ Ｃｏｍｐｏｓｅｒソフトウェアで処理され、基本的に装置設定を下記のように設定した：前誘発インキュベーターは３０℃に設定；発現インキュベーター１を１６℃に設定；遠心分離を６℃と５０００ｘｇに設定；ＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ；１Ｌ中に、１２ｇトリプトン、２４ｇ酵母抽出物、９．４ｇ二塩基性カリウムリン酸塩、および２．２ｇ一塩基性カリウムリン酸塩、を含有）（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログＮｏ．７１７５４）を満たした培地ポンプ（Ｍｅｄｉａ Ｐｕｍｐ）１、５０μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．４％（ｗ／ｖ）グルコース（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．０１５％（ｖ／ｖ）Ａｎｔｉｆｏａｍ ２０４（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）；０．２％（ｗ／ｖ）アラビノース（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を満たしたインデューサーポンプ（Ｉｎｄｕｃｅｒ Ｐｕｍｐ）１；インキュベーターガス処理速度を５１％酸素で２秒に設定、０．１ｍＬ播種容量；帰納統計平均を外れ値除外に設定（すなわち、３つの最高値および３つの最低値を除いた後に求められるブロック平均ＯＤ６００）；ｃｕｌｔｕｒｅ ｖｅｓｓｅｌ ｂｌｏｃｋ（ＣＶＢ）前誘発遅延を１時間２０分に設定、および発現インキュベーター順化（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ Ａｃｃｌｉｍａｔｉｚａｔｉｏｎ）を３０分に設定。
種培養を行い、メーカー指定のように、必要な実験器具：２４ウエルｃｕｌｔｕｒｅ ｖｅｓｓｅｌ ｂｌｏｃｋ（ＣＶＢ；Ｔｈｅ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ）、２４ウエルフィルタープレート（Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ）（Ｔｈｅ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ）、２４ウエルアウトプットプレート（ｏｕｔｐｕｔ ｐｌａｔｅ）（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＰｉｐｅｔｔｅ Ｔｉｐ Ｂｏｘｅ（ＭＢＰ）を備えたＰｉｃｃｏｌｏ（登録商標）中に入れた。上述のようにアラビノース誘導因子および関連ポンプを補充したＴＢ培地を無菌条件下で調製し、装置に添加した。遠心分離の釣合い錘の重量を設定し、遠心分離器の内側に設置した。最後に、精製試薬（下記のように、溶解緩衝液、樹脂、洗浄緩衝液および溶出緩衝液）を調製し、システムポンプに添加した。これが終わるとすぐ装置をスタートさせ、処理を開始した。
播種の前に、播種材料を２４ウエルＣＶＢの特定のウエルにマッピングし、発現および誘導条件を下記のように設定した。種プレートからの播種の前に、ＣＶＢの各ウエルに上述のように補充した１０ｍＬのＴＢ培地を満たした。各ＣＶＢの各ウエルに０．１ｍＬの種培養物を播種し、次に、前誘導インキュベーションに入るまでの間、ＣＶＢを貯蔵用カルーセルに戻した。ＣＶＢが前誘導インキュベーション開始待ちになるとすぐに、貯蔵カルーセルから取り出し、通気機構（ａｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）（これは撹拌、ウエルシーリングおよび酸素／空気の制御管理の手段を提供する）に連結し、３０℃に設定した前誘導インキュベーター中に設置した。インキュベーションの開始時とその後、約３０分毎にＯＤ６００を読み取った。Ｐｉｃｃｏｌｏの運転制御ソフトウェアが、ＯＤ６００測定値をモニターし、各ＣＶＢが１．０ＯＤ６００の設定ポイントに到達する時間を予測する。ＣＶＢがＯＤ６００設定ポイントに到達する約３０分前に、機構を発現インキュベーターに移し、発現温度の２０℃に平衡化した後、０．０３２％アラビノース誘導因子の添加によりＣＶＢ中の培養を誘導し、続けて４５時間発現させた。
培養物の播種と培養物の増殖誘導後、Ｆａｂの精製のために細胞を採取し、溶解した。Ｐｉｃｃｏｌｏ（登録商標）を、全培養精製の自動化発現と精製「ライフサイクル（Ｌｉｆｅｃｙｃｌｅ）」を使って、発現Ｆａｂタンパク質の精製のために使用した。制御発現後、溶解の前に貯蔵カルーセル中で６℃、３０分の条件下、ＣＶＢを冷却した。ＣＶＢを液体ハンドリングベッドに移し、溶解緩衝液（１：１０００ Ｌｙｓｏｎａｓｅ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む２．５ｍＬのＰｏｐｃｕｌｔｕｒｅ）を入念に混合しながら各ウエルに添加した。溶解を１０分間行った後、ＣＶＢを５０００ｘｇで１０分遠心分離し、細胞壊死組織片ペレットを形成した。遠心分離の間、フィルタープレートをフィルターベッド中に置き、樹脂（２ｍＬのＮｉ−ｃｈａｒｇｅｄ Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ ｒｅｓｉｎ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の５０％スラリー）を各ウエルに添加した。可溶性ライセートを樹脂含有フィルタープレートの対応するウエルに添加し、廃棄物中に排液する前に１０分間結合させた。洗浄緩衝液（１２ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭナトリウムリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０））を２段に分け各ウエルに添加し、廃棄物中に排液した。最後に、アウトプットプレートをフィルターベッドのフィルタープレートの下に置き、ＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭナトリウムリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）を２段階で添加して、アウトプットプレート中に排液した。他の全実験器具と同様に、アウトプットプレートを貯蔵用カルーセルに戻した。計画した運転の各ＣＶＢに対しこのプロセスが終わると、すぐに装置を解放した。
実施例３
Ｆａｂ抗体の直交２次精製
Ｐｉｃｃｏｌｏ（登録商標）プロセスにより生成された部分的に純粋なＦａｂのさらなる精製を素早く行うために、精製直交法を開発した。上述の実施例２のようにＰｉｃｃｏｌｏ（登録商標）装置を使って、Ｆａｂを発現させ、精製した。
軽鎖クラスに応じて、２つの異なる親和性樹脂を使った。カッパ軽鎖を有するＦａｂは、タンパク質Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製され、ラムダ軽鎖を有するＦａｂは、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ｆａｂ Ｌａｍｂｄａ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎ（ＢＡＣ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）でさらに精製された。最初に、タンパク質試料を深いウエルの９６ウエルブロック（ＶＷＲ）に移した。Ｆａｂ試料毎に約１．８ｍＬのＩＭＡＣ溶出液を、メーカーのプロトコルに従って、４℃、１ｍＬのＨｉ−Ｔｒａｐタンパク質Ｇカラムまたは０．５ｍＬのＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ｆａｂ Ｌａｍｂｄａ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎと、Ａｋｔａ ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＡ−９０５オートサンプラー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使って精製した。タンパク質濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃプレートリーダー上でＡ２８０の吸光度を測定し、対応するＦａｂの消衰係数から計算して求めた。消衰係数は、Ｆａｂ重鎖および軽鎖中のチロシン＋トリプトファン＋フェニルアラニン合計数に基づいて計算される。Ｐｉｃｃｏｌｏ（登録商標）システムを使って精製後、発現したタンパク質は、一般的に、２０％未満の純度であった。タンパク質Ｇを使った直交精製後、Ｆａｂ純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると、９５％を超える純度であった。
実施例４
電気化学発光結合アッセイ
この実施例では、電気化学発光（ＥＣＬ）結合アッセイを使用して、Ｆａｂライブラリー（例えば、表４参照）から、９つの異なる抗原の内の１つと結合可能な抗体を選別する。これらの抗原には、ヒト上皮増殖因子２受容体（ＥｒｂＢ２）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ）、Ｎｏｔｃｈ−１、ＣＤ４４、インスリン様増殖因子−１可溶性受容体（ＩＧＦ−１ｓＲ）、Ｐ−カドヘリン、エリトロポイエチン受容体（ＥｐｏＲ）およびデルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４）、が含まれる。ＥＣＬアッセイでは、抗原−抗体相互作用が、ルテニウムトリビスピリジン（４−メチスルホン）（Ｒｕ（ｂｐｙ）２ ２＋）標識検出抗体の添加により検出される。電流の印加時に、Ｒｕ（ｂｐｙ）２ ２＋−標識が、共反応剤の存在下で、酸化−還元サイクルを受け、光が放出される。シグナルは、Ｒｕ（ｂｐｙ）２ ２＋−標識が電極に接近している場合にのみ発生し、洗浄の必要がない。検出光強度は、捕捉されたタンパク質の量に比例する。
組換え型ヒトタンパク質をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。これには、ｒＨｕｍａｎ ＥｒｂＢ２／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃１１２９−ＥＲ）；ｒＨｕｍａｎ ＥＧＦ Ｒ／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃３４４−ＥＲ）；ｒＨｕｍａｎ ＨＧＦ Ｒ／ｃ−ＭＥＴ／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃３５８−ＭＴ／ＣＦ）；ｒＨｕｍａｎ Ｎｏｔｃｈ−１／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃３６４７−ＴＫ）；ｒＨｕｍａｎ ＣＤ４４／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃３６６０−ＣＤ）；ｒＨｕｍａｎ ＩＧＦ−１ｓＲ、（ＩＧＦ−１ｓＲ）、ＣＦ（Ｃａｔ＃３９１−ＧＲ）；ｒＨｕｍａｎ Ｐ−カドヘリン／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃８６１−ＰＣ）；ｒＨｕｍａｎエリトロポイエチンＲ／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃９６３−ＥＲ）；および組換え型ヒトＤＬＬ４（Ｃａｔ＃１５０６−Ｄ４／ＣＦ）が含まれる。
Ａ．複数抗原に対する結合のためのマルチスポット（Ｍｕｌｔｉｓｐｏｔ）ＥＣＬアッセイ
上記に挙げた各抗原を、９６ウエルマルチスポット１０Ｈｉｇｈｂｉｎｄプレート（メソ・スケール・ディスカバリー；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）の表面上に５０ナノリッター（ｎｌ）の各タンパク質（６０μｇ抗原／ｍＬ）の量でスポット状に配置することにより１０プレートの各ウエル上に固定化した。スポット１０は、対照にするため、ブランクで残した。
１５０μｌの分量の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のトリス緩衝食塩水ツイーン（ＴＢＳＴ）中溶液を各ウエルに添加し、２０℃で３０分間、インキュベートし、続いて、洗浄およびタップ乾燥して残っている溶液を完全に除去した。その後、１２．５μｌの分量の１％ＢＳＡ−ＴＢＳＴを各ウエルに添加し、続いて、１２．５μｌの分量の精製Ｆａｂを添加した。プレートをシールして、振盪を加えながら、２０℃で１時間インキュベートした。
メーカーのインストラクションに従って、検出抗体を、それぞれヤギ抗ヒトカッパ軽鎖ポリクローナル抗体（Ｋ３５０２−１ＭＧ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびヤギ抗ヒトラムダ軽鎖ポリクローナル抗体（Ｌ１６４５−１ＭＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の両方をルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホン）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルフォ−タグＮＨＳ−エステル、メソ・スケール・ディスカバリー）に結合させることにより調製した。２５μｌのＴＡＧ検出抗体を各ウエルに添加し、振盪を加えながら、２０℃で１時間インキュベートした。最後に、１５μｌの読み取り緩衝液（Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ）Ｐを界面活性剤（Ｃａｔ＃Ｒ９２ＰＣ−１、メソ・スケール・ディスカバリー）と一緒に各ウエルに添加した。電気化学発光をＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００（メソ・スケール・ディスカバリー）を使って測定した。各ウエルのブランクに対する抗原のＥＣＬシグナルを比較することによりデータを解析した。４以上のブランクに対するシグナルの比率の場合に、「Ｈｉｔ」Ｆａｂと見なした。
マルチスポットＥＣＬアッセイを使って、選択抗原と結合する抗体が特定された。下表１０、は、マルチスポットＥＣＬアッセイを使って「ｈｉｔ」として特定されたＦａｂ（重鎖および軽鎖を含む）および特定されたＦａｂ「ｈｉｔ」の標的を示す。いくつかのＦａｂが複数の標的と結合することが特定された。例えば、ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−１３＊０１＿ＩＧＨ４１＊０１＆Ｂ３＿ＩＧＫＪ１＊０１は、ヒトＥｒｂＢ２／ＦｃおよびヒトエリトロポイエチンＲ／Ｆｃキメラの両方に親和性を示す。Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ２−１５＊０１＿ＩＧＨＪ２＊０１＆Ｌ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１は、ＥＧＦＲ、ＥｐｏＲおよびＤＬＬ４に結合し、Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｌ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１は、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｐ−カドヘリンおよびＤＬＬ４に結合する。
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最初のマルチスポットＥＣＬ選別から「Ｈｉｔ」を確認するために、Ｆａｂ濃度依存性滴定を行いＦａｂ−抗原結合親和性を測定した。下表に示すように、Ｆａｂ抗体の濃度が、各試験Ｆａｂに応じて、ウエル間で０．１ｎＭ〜２．４μＭ変動することを除いて、マルチスポットＥＣＬアッセイ法の結果は上記と同じであった。データを下表１１〜３３に示す。
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Ｂ．ＤＬＬ４に対する結合に対する９６ウエルプレートＥＣＬアッセイ
試験ウエルプレート毎にただ１つの抗原を単一スポットに固定したこと以外は、同様にＥＣＬアッセイを行った。５μＬ（ＰＢＳ＋０．０３％トリトン−Ｘ−１００中の１０μｇ／ｍｌ ＤＬＬ４溶液の）を各ウエルに添加し、２０℃で一晩インキュベートすることにより、組換え型ヒトＤＬＬ４（Ｃａｔ＃１５０６−Ｄ４／ＣＦ）を９６ウエルプレート上に固定した。１つのウエルは、対照としてブランクのまま残した。タンパク質を取りだし、１５０μ;ｌの分量のＴＢＳＴ中１％ＢＳＡ溶液を各ウエルに添加し、２０℃で１時間インキュベートし、続いて、１５０μｌのＴＢＳＴで２回洗浄後、タップ乾燥して、完全に残っている溶液を除去した。その後、２５μｌの分量の各Ｆａｂ（ＴＢＳＴ中１％ＢＳＡを含む）を各ウエルに添加した。プレートをシールし、振盪を加えながら２０℃で１時間インキュベートした。実施例７と１２で記載のように、２つの異なる抗原とＦａｂ濃度の組み合わせを使用した。１つの実験では、５μＬの３０μｇ／ｍＬ抗原を使って、プレートをコートし、各Ｆａｂを０．０２μＭの濃度で試験した。他の実験では、５μＬの１５μｇ／ｍＬ抗原を使って、プレートをコートし、各Ｆａｂを０．００４μＭの濃度で試験した。
その後、Ｆａｂを取りだし、２５μｌの抗ヒトカッパルテニウム抗体または抗ヒトラムダルテニウム抗体（ＴＢＳＴ中１％ＢＳＡ溶液中の１μｇ／ｍｌ）を各ウエルに添加し、振盪を加えながら２０℃で１時間インキュベートした。最後に、１５μｌの読み取り緩衝液Ｐと界面活性剤（Ｃａｔ＃Ｒ９２ＰＣ−１、メソ・スケール・ディスカバリー）を各ウエルに添加した。Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００（メソ・スケール・ディスカバリー）を使って電気化学発光を測定した。各ウエルのブランクに対する抗原のＥＣＬシグナルを比較することによりデータを解析した。４以上のブランクに対するシグナルの比率を、「Ｈｉｔ」Ｆａｂと見なした。結果を下記の実施例７〜１５に示す。
実施例５
表面プラズモン共鳴法
この実施例では、選択Ｆａｂの組換え型ヒトＤＬＬ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する結合親和性を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｔｏｏｌｓ、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、ＵＴ）を使って解析した。Ｆａｂには、最初のＥＣＬ選別でＤＬＬ４に結合すると特定された生殖系列抗体が含まれる（実施例４に示されるように）。
結果を下表３４に示す。表３４は、Ｆａｂ、ｋａ（Ｍ−１ｓ−１）、ｋｄ（ｓ−１）、およびＫＤ（ｎＭ）ならびに標準偏差（括弧で）を示す。生殖系列Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１は、４．８μＭの平均ＫＤを有する。生殖系列Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１は、ＤＬＬ４に７３０ｎＭの平均ＫＤで結合する。生殖系列Ｆａｂ ＶＨ６−１＿ＩＧＨＤ３−３＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ４−３＿ＩＧＬＪ４＊０１は、３８μＭの平均結合親和性を有し、一方、生殖系列Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｌ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１は、５００ｎＭの平均ＫＤを有する。
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実施例６
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
この実施例では、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使って、ＤＬＬ４に対するＦａｂ抗体の結合を測定した。
Ａ．９６ウエルプレート
簡単に述べれば、０．５μｇ／ｍｌのＤＬＬ４の１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３中溶液（ｐＨ９）５０μｌを９６ウエルＣｏｓｔａｒプレート（Ｃａｔ＃３３７０、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）の各ウエルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをトリス緩衝食塩水ツイーン（ＴＢＳＴ）中の１％ＢＳＡを添加してブロッキングして、室温で１時間インキュベートし、続いて、１５０μｌＴＢＳＴで２回洗浄した。ＴＢＳＴ中の１％ＢＳＡを用い、Ｆａｂ抗体を１０００ｎＭの濃度から出発して系列希釈した。５０μｌの分量の各系列希釈物を３回に分けて各ウエルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした後、２回ＴＢＳＴで洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ（Ｃａｔ＃ＡＢ１２３８−２００、Ａｂｃａｍ）で１：１０００に希釈した５０μｌのヤギ抗ＤＤＤＤＫタグＨＲＰ結合ポリクローナル抗体を各ウエルに添加し、プレートを室温で３０分インキュベート後、２００μｌ ＴＢＳＴで３回洗浄した。最後に、１００μｌのＴＭＢ一液型試薬（Ｃａｔ＃ＴＭＢＷ−１０００−０１、ＢｉｏＦａｘ）を添加し、室温で２分間発色させた。１００μｌの０．５Ｍ Ｈ２Ｓ０４を添加して反応を直ちに停止し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使って、４５０ｎｍの吸光度を測定した。このアッセイを使った結果を実施例９と１０で示す。
Ｂ．３８４ウエルプレート
簡単に述べれば、０．５μｇ／ｍｌの１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３中ＤＬＬ４溶液（ｐＨ９）１０μｌを３８４ウエルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｃａｔ＃４６４７１８、Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の各ウエルに添加し、室温で９０分間インキュベートした。プレートをトリス緩衝食塩水ツイーン（ＴＢＳＴ）中１％ＢＳＡを添加してブロッキングを行い、室温で１時間インキュベートした後、１００μｌＴＢＳＴで２回洗浄した。ＴＢＳＴ中１％ＢＳＡを用いて１０００ｎＭの濃度から出発して、Ｆａｂ抗体を系列希釈した。２０μｌの分量の各系列希釈液を３回に分けて各ウエルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした後、１００μｌのＴＢＳＴで２回洗浄した。軽鎖に依存して、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ（Ｃａｔ＃Ａ７１６４−１ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて１：１０００に希釈したヤギ抗カッパＨＲＰ結合ポリクローナル抗体の２０μｌ、または、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ（Ｃａｔ＃Ｌ１６４５−１ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて１：１０００に希釈したヤギ抗ラムダＨＲＰ結合ポリクローナル抗体の２０μｌを各ウエルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした後、１００μｌのＴＢＳＴで４回洗浄した。最後に、２５μｌのＴＭＢ一液型試薬（Ｃａｔ＃ＴＭＢＷ−１０００−０１、ＢｉｏＦａｘ）を添加し、室温で１〜５分間発色させた。２５μｌの０．５Ｍ Ｈ２Ｓ０４を添加して直ちに反応を停止し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使って４５０ｎｍでの吸光度を測定した。このアッセイを使った結果を、実施例９と１０で示す。
実施例７
抗ＤＬＬ４「Ｈｉｔ」ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の重鎖の親和性成熟
ａ．要約
マルチスポットＥＣＬ結合アッセイを使って実施例４で特定された、ＤＬＬ４に対するＦａｂ「Ｈｉｔ」ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の重鎖および軽鎖アミノ酸配列（配列番号８８および１０７）を、関連重鎖または軽鎖を有するがＤＬＬ４に結合しない関連「ｎｏｎ−Ｈｉｔ」Ｆａｂ抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列と配列比較した。配列比較に基づいて、各重鎖および軽鎖中で、その後の親和性成熟に関与する潜在的アミノ酸として、「Ｈｉｔ」と「ｎｏｎ−Ｈｉｔ」抗体間で差異があるアミノ酸残基を特定した。重鎖の親和性成熟については、実施例７〜９で記載されている。軽鎖の親和性成熟については、実施例１０で記載されている。
簡単に述べれば、特定されたアミノ酸残基に対し、アラニン置換変異導入を行い、生成した変異体Ｆａｂを試験し、ＤＬＬ４と抗体の結合に与える影響を評価した。ＤＬＬ４と抗体の結合に影響しない変異残基を特定し、ＮＮＫ変異誘発を伴うオーバーラッピングＰＣＲを使って、さらなる変異誘発を行った。ＤＬＬ４との結合に関し変異体抗体を評価し、ＤＬＬ４との結合が改善された変異を特定した。それぞれ特定された単一変異体を含む組み合わせ変異体が生成し、組み合わせ変異体をＤＬＬ４との結合に関し、さらにアッセイした。抗体の他の領域を変異させることによりさらなる最適化を行った。この方法により、親「Ｈｉｔ」ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１ Ｆａｂ抗体に比べて、ＤＬＬ４に対し大きな結合親和性を有する抗ＤＬＬ４抗体が生成した。
ｂ．重鎖の親和性成熟
ｉ．ＣＤＲの潜在的結合部位の特定
親「Ｈｉｔ」ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８８）を、ＤＬＬ４に結合しないと特定されたｎｏｎ−Ｈｉｔ抗体、すなわち、ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−１３＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の関連重鎖のアミノ酸配列（配列番号９３）と配列比較した。「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１は、２３．１のＥＣＬシグナル／ブランク比率を有し、一方、ｎｏｎ−Ｈｉｔ Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−１３＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１のその比率は、２．４にすぎなかった。これらの２つのＦａｂは、同じＶＨ生殖系列セグメントを共有しているため、関連がある。さらに、ＤＨ生殖系列セグメントは、同じ遺伝子ファミリー（すなわち、ＩＧＨＤ６）に属する。配列アラインメントについては、図１に説明されている。配列比較に基づいて、「Ｈｉｔ」および「ｎｏｎ−Ｈｉｔ」間で異なり、それにより、「Ｈｉｔ」および「ｎｏｎ−Ｈｉｔ」の抗ＤＬＬ４抗体の結合の差異が説明できるアミノ酸残基が特定された。特定されたアミノ酸残基は、結合親和性にとって重要な重鎖の領域であると特定されたＣＤＲ３に位置していた。
ｉｉ．ＣＤＲ３のアラニンスキャンニング
親Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の重鎖配列のＣＤＲ３中のアミノ酸残基に対しアラニン置換変異導入を行い、ＤＬＬ４結合に関与しそうにないアミノ酸残基を特定した。親Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の重鎖配列のＣＤＲ３領域のアラニンスキャニングを、アミノ酸残基Ａ１０６、Ｙ１０８、およびＦ１０９を除く、ＣＤＲ３領域の全残基のアラニンへの変異を行うことにより実行した。上記実施例２に記載のように、変異Ｆａｂ抗体を発現し、精製した。
実施例４Ｂに記載のように、ＥＣＬ９６ウエルプレートアッセイを使って、精製Ｆａｂアラニン変異体をＤＬＬ４との結合に関し試験した。５μＬの１０μｇ／ｍＬ組換え型ヒトＤＬＬ４抗原を９６ウエルプレートにコートし、を０．０４μＭの濃度で添加した。対照として、９６ウエルプレートのブランクウエルへのＦａｂのバックグラウンド結合も測定した。データをＥＣＬシグナルのシグナル／ノイズ比率として示したが、これは、ＤＬＬ４との結合のＥＣＬシグナルを、プレートに対する残りの結合のＥＣＬシグナルで除算した比率である。表３５で、試験変異体ＦａｂおよびＤＬＬ４との結合に対し観察されたシグナル／ノイズ比率を示す。結果は、Ｅ１００、Ｙ１０１、Ｓ１０５、Ｅ１０７またはＱ１１０のアラニンによる変異が、ＥＣＬシグナルの減少を引き起こし、従って、ＤＬＬ４に対する結合親和性を低減させたことを示している。従って、これらの残基は、ＤＬＬ４結合に関与していると思われ、これ以上は変異誘発しなかった。対照的に、Ｓ１０２、Ｓ１０３、Ｓ１０４またはＨ１１１のアラニンによる変異により、親に比較してＥＣＬシグナルが増加したか、またはＥＣＬシグナルが変化せず、従って、ＤＬＬ４に対する結合親和性を改善したか、または結合親和性に影響を与えなかった。これにより、これらの残基は、さらなる変異誘発用の残基として特定された。
変異体ＦａｂおよびＤＬＬ４タンパク質の濃度を変えて、上記のＥＣＬ結合実験を繰り返した。表３６は、２つの異なる濃度のＤＬＬ４抗原および変異体Ｆａｂに対する変異体Ｆａｂ、ＥＣＬシグナル、およびシグナル／ノイズ比率を示す。結果は、両アッセイで一致し、上述の最初の結果が確認できた。Ｅ１００、Ｙ１０１、Ｓ１０５、Ｅ１０７またはＱ１１０のアラニンによる置換で、ＤＬＬ４との結合に対するＥＣＬシグナルの減少が起こり、一方、Ｓ１０２、Ｓ１０３、Ｓ１０４またはＨ１１１のアラニンによる置換で、ＤＬＬ４との結合に対するＥＣＬシグナルの改善が起こるか、またはＥＣＬシグナルに影響を与えなかった。
Figure 0006007420
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ｉｉｉ．重鎖アミノ酸残基Ｓ１０２、Ｓ１０３、Ｓ１０４のＮＮＫ変異誘発
ＣＤＲ３のアラニン置換変異導入の後で、実施例１に記載のように、重鎖アミノ酸残基Ｓ１０２、Ｓ１０３およびＳ１０４を選択し、親Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１をテンプレートとして使って、ＮＮＫ変異誘発を伴うオーバーラッピングＰＣＲ法によりさらに変異導入した。
実施例４に記載のように、９６ウエルプレートＥＣＬアッセイを使って、ＦａｂおよびＤＬＬ４タンパク質の濃度を変えて、生成したＦａｂ変異体のＤＬＬ４に対する結合親和性を測定した。表３７に、Ｓ１０２、Ｓ１０３およびＳ１０４ＮＮＫ変異体のそれぞれのシグナル／ノイズ比率を示す。シーケンシングの前に、Ｆａｂ ＮＮＫ変異体をランダムに選択し、従って、いくつかの変異体、例えば、Ｓ１０３Ｌは、複数回、精製と試験が行われ、結果は一致した。Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１中のシグナル／ノイズ比率の増加と、従ってＤＬＬ４に対する結合親和性の改善を伴うＦａｂを生ずる３つの変異が特定された。２つのＦａｂ変異体、Ｓ１０２ＡおよびＳ１０３Ｐは、それぞれ親Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１より約３倍大きいＤＬＬ４に対するシグナル／ノイズ比率を有していた。３番目の変異体の重鎖Ｆａｂ変異体Ｓ１０４Ｆは、親Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１よりも少なくとも４倍大きなＤＬＬ４に対するシグナル／ノイズ比率を有していた。２つの別の変異、すなわち、Ｆａｂ重鎖変異体Ｓ１０３ＡおよびＳ１０４ＨがＤＬＬ４との結合に対するシグナル／ノイズ比率のわずかな増加を生じることが特定された。
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重鎖親Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１中にＳ１０２Ａ、Ｓ１０３Ａ、Ｓ１０３Ｐ、Ｓ１０４ＨおよびＳ１０４Ｆ変異をそれぞれ含むＦａｂ重鎖変異体を、次に、実施例４Ａで記載のＥＣＬマルチスポットアッセイを使って再アッセイを行い、ＤＬＬ４に対する結合親和性の増加を確認した。各Ｆａｂ変異体を２つの異なるＦａｂ濃度で一群の抗原に対し試験した。結果を下表３８〜３９に示す。表２９は、ＤＬＬ４に対する結合に関する各変異体のＥＣＬシグナルおよびシグナル／ノイズ比率の結果を示す。表３８は、全試験抗原に対する結合に関するシグナル／ノイズ比率を示す。結果は、重鎖変異体Ｓ１０２Ａ、Ｓ１０３Ｐ、Ｓ１０４ＨおよびＳ１０４Ｆは、全て、親Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１に比べて、ＤＬＬ４に対する結合のシグナルが増加し、さらに、これらの変異体は、用量依存性ならびに抗原特異的様式で結合することを示す。さらに、結果は、重鎖変異体Ｓ１０３ＡのＤＬＬ４に対する結合のシグナルは、親Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１と大略同じであることも示している。
Figure 0006007420
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ｉｖ．ＮＮＫ変異誘発結果に基づく組み合わせ変異体
ＤＬＬ４との結合を増加させるのに寄与すると特定されたＦａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の重鎖変異体Ｓ１０２Ａ、Ｓ１０３ＰおよびＳ１０４Ｆを組み合わせて、三重変異体を生成した。三重変異体は、Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１（Ｈ：ＡＰＦ＆Ｌ：ｗｔ）として設計されている。Ｆａｂ ＡＰＦ三重変異体の結合親和性および特異性を、ＥＣＬマルチスポットアッセイとＥＬＩＳＡの両方を使って測定した。
実施例４Ａで記載のＥＣＬマルチスポットアッセイを使って、ＡＰＦ三重変異体および親抗体のＤＬＬ４および他の抗原に対する結合に関する特異性と結合親和性を種々の抗体濃度で比較した。表４０は、試験抗原に対する親およびＡＰＦ三重変異体の結合のシグナル／ノイズ比率を示す。結果は、重鎖ＡＰＦ三重変異体が、親抗体よりも１０倍大きい結合親和性でＤＬＬ４に結合することを示す。さらに、他のいずれの抗原に対する結合の検出可能なシグナルも認められなかったので、ＡＰＦ三重変異体は、特異的にＤＬＬ４に結合する。
実施例６で記載のように、１２５ｎｍ〜１０００ｎｍ抗体のＦａｂ濃度で、ＡＰＦ三重変異体のＤＬＬ４に対する結合をＥＬＩＳＡによりさらに解析した。結果を、下表４１に示す。試験濃度では、親Ｆａｂ抗体は、ＤＬＬ４との結合に関し検出可能なシグナルを示さなかった。対照的に、ＡＰＦ三重変異体は、検出可能なシグナルを示し、濃度依存性様式によるＤＬＬ４との結合の証拠を示した。これらの結果から、ＥＣＬアッセイがＥＬＩＳＡアッセイより感受性が高いことが確認される。
Figure 0006007420
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実施例８
抗ＤＬＬ４ＡＰＦ三重変異体重鎖のＤＬＬ４に対する結合のさらなる最適化
この実施例では、実施例７で記載ならびに生成したＡＰＦ三重変異体重鎖を、さらに最適化し、ＤＬＬ４に対する結合親和性を改善する。ＡＰＦ三重変異体Ｆａｂを、抗体重鎖の残っているＣＤＲ領域中の重鎖アミノ酸残基のさらなる変異誘発のためのテンプレートとして使用した。上述の実施例１のように、ＣＤＲ２のアミノ酸残基Ｇ５５およびＣＤＲ３のアミノ酸残基Ｅ１００、Ａ１０６、Ｙ１０８、Ｆ１０９、およびＨ１１１に対し、ＮＮＫ変異誘発を伴うオーバーラッピングＰＣＲを使って変異誘発を行った。
アミノ酸残基Ｅ１００、Ａ１０６、Ｙ１０８、Ｆ１０９、およびＨ１１１の位置にさらなる変異を含むＦａｂ ＡＰＦ三重変異体を１０ｎＭＦａｂの濃度で、ＥＣＬマルチスポットアッセイを使って、ＤＬＬ４および他の抗原との結合試験を行った。結果を、下表４２〜４３に示す。ＤＬＬ４との結合に関し試験した各変異体Ｆａｂのシグナル／ノイズ比率を表４２に示す。表４３は、各変異体Ｆａｂの種々の試験抗原に対する結合関するＥＣＬシグナルおよびブランク（抗原不含の対照ウエルに対するバックグラウンド結合）を示す。Ｘ（どのアミノ酸でもよい）と指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さず、従って、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。結果は、アミノ酸残基Ｇ５５、Ｅ１００、Ａ１０６、Ｙ１０８、またはＦ１０９の他のいずれかの他のアミノ酸による変異は、ＥＣＬシグナルの減少からも明らかなように、一般的に、ＤＬＬ４対する結合親和性を減少させたことを示す。一方、Ｈ１１１の置換は、ＥＣＬシグナルの増加またはＥＣＬシグナルの無変化からも明らかなように、ＤＬＬ４に対する結合親和性を改善するか、または結合親和性に影響を与えなかった。特に、Ｆａｂ重鎖変異体ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１（Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ｗｔ）は、Ｆａｂ ＡＰＦ三重変異体より２〜４倍優れたＤＬＬ４との結合に関するシグナル／ノイズ比率であった。さらに、どの変異体も、他の試験抗原のいずれに対しても何ら明らかな結合を示さなかった（下表４３参照）。
Figure 0006007420
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ＥＣＬマルチスポットアッセイを使って、ＡＰＦ三重変異体およびＡＰＦＦ変異体のＤＬＬ４との結合に関し、さらに比較した。Ｆａｂ抗体を種々の濃度でアッセイして、ＤＬＬ４に対する結合の用量依存性を評価した。また、Ｆａｂ抗体を、種々の抗原に対しアッセイし特異性を評価した。ＡＰＦＦ変異体を二通りに試験した。表４４は、ＤＬＬ４に対する結合のシグナル／ノイズ比率を示す。結果は、Ｈ：ＡＰＦ＆Ｌ：ｗｔ変異体（１２２ｎＭ）に比べて、Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ｗｔ変異体がＤＬＬ４に対しわずかに親和性が増加する（７０ｎＭ）ことを示す。さらに、表４５のアッセイで観察されたＥＣＬシグナルの結果から、他の試験抗原に比べて、両Ｆａｂ変異体が特異的にＤＬＬ４結合することが確認される。
Figure 0006007420
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実施例９
ＤＬＬ４との結合に対する抗ＤＬＬ４ ＡＰＦＦ変異体重鎖のさらなる最適化
この実施例では、実施例７と８に記載のようにＤＬＬ４との結合に対し親和性成熟したＡＰＦＦ変異体の重鎖アミノ酸配列を、抗体ポリペプチドの他のＣＤＲ領域のさらなる変異のためのテンプレートとして使用した。変異体Ｆａｂを発現させ、ＤＬＬ４に対する結合に関しアッセイした。
ｉ．ＣＤＲ１のアラニンスキャンニング
重鎖ＡＰＦＦ変異体をＣＤＲ１（アミノ酸２６〜３５）中のアミノ酸残基のアラニン置換変異導入のためのテンプレートとして使用し、ＤＬＬ４に結合する抗体に関与する残基を特定した。アラニンスキャンニングをＣＤＲ１の残基Ｔ２８、Ｆ２９、Ｔ３０、Ｓ３１およびＹ３３のみをアラニンに変異させることにより行った。上記実施例２に記載のように、変異体Ｆａｂ抗体を発現し、精製した。
ＤＬＬ４および他の抗原に対する結合に関して、ＥＣＬマルチスポット結合アッセイを使って、精製Ｆａｂアラニン変異体を１０ｎＭの濃度で試験した。ＥＣＬアッセイの結果を、表４６と４７に示す。表４６は、変異体ＦａｂおよびＤＬＬ４に対する結合のシグナル／ノイズ比率を示す。結果は、アミノ酸残基Ｆ２９およびＹ３３のアラニンでの変異により、ＤＬＬ４に対する結合のシグナル／ノイズ比率の減少を生じることを示す。従って、これらの残基は、さらなる変異誘発の対象としては選択しなかった。アミノ酸残基Ｔ２８、Ｔ３０またはＳ３１のアラニンへの変異により、親重鎖ＡＰＦＦ変異体に比べて、ＤＬＬ４に対する結合のシグナル／ノイズ比率のわずかの増加を生じた。種々の抗原および抗原不含ブランクウエルに対する結合のＥＣＬシグナルを示している表４７から、全試験抗体がＤＬＬ４に対し特異性を示すことが解る。また、表４６は、実施例６に記載のように、１００ｎＭのＦａｂ変異体を使って行ったＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ＥＬＩＳＡの結果もまた、アミノ酸残基Ｙ３３がＤＬＬ４結合に関与することを示す。ＥＬＩＳＡに比べＥＣＬアッセイの観察結果が異なるのは、おそらく、ＥＬＩＳＡアッセイが大きいオフ速度を選択し、一方、ＥＣＬアッセイは平衡結合を検出しているという事実によると思われる。従って、小さいオン速度を有するが、改善されたオフ速度も有する変異体に対しては、ＥＬＩＳＡは強力な結合を示す可能性があるが、それは必ずしも強力なＥＣＬシグナルと相関しないと思われる。対照的に、改善されたオン速度を有するが、小さいオフ速度も有する変異体に対しては、ＥＬＩＳＡは弱い結合を示す可能性がある。
アラニン変異体のＤＬＬ４に対する結合を確認するために、ＥＣＬアッセイを使って、さらなる実験を行った。表４８は、ＤＬＬ４抗原およびブランクに対するＥＣＬシグナルおよび各変異体ＦａｂのＤＬＬ４に対する結合のシグナル／ノイズ比率を示す。表４０は、各変異体Ｆａｂの全試験抗原に対する結合のＥＣＬシグナルを示す。表４８と４９の結果により、表４６と４７で認められたＥＣＬ結果がそれぞれ確認できる。
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ｉｉ．ＣＤＲ２のアラニンスキャンニング
重鎖ＡＰＦＦ変異体をＣＤＲ２（アミノ酸５０〜６６）中のアミノ酸残基のアラニン置換変異導入のためのテンプレートとして使用し、ＤＬＬ４に結合する抗体に関与する残基を決定した。アミノ酸残基Ｙ６０〜Ｇ６６は変異させなかった。上記実施例２に記載のように変異体Ｆａｂ抗体を発現し、精製した。
精製Ｆａｂアラニン変異体を、ＥＣＬマルチスポット結合アッセイを使って、ＤＬＬ４に対する結合に関し１０ｎＭの濃度で試験した。ＥＣＬアッセイの結果を表５０と５１に示した。表５０は、変異体ＦａｂおよびＤＬＬ４に対する結合のシグナル／ノイズ比率を示す。結果は、アミノ酸残基Ｉ５０、Ｇ５５、Ｓ５７、Ｔ５８、またはＳ５９のアラニンへの変異でＤＬＬ４に対する結合のシグナル／ノイズ比率が減少することを示し、従って、これらの残基は、さらなる変異誘発の対照とはしなかった。対照的に、アミノ酸残基Ｉ５１、Ｎ５２、Ｐ５３、Ｓ５４またはＧ５６のアラニンへの変異で、親重鎖ＡＰＦＦ変異体よりもＤＬＬ４に対する結合のシグナル／ノイズ比率を２〜４倍改善し、従って、これらの残基を、さらなる変異誘発用の残基として特定した。種々の抗原および抗原不含のブランクウエルに対する結合のＥＣＬシグナルを表す表５１から、全試験抗体がＤＬＬ４に対する特異性を示すことが解る。また、表５０は、実施例６で記載のように、１００ｎＭのＦａｂ変異体を使って行ったＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ＥＬＩＳＡの結果により、ＥＣＬアッセイにより観察された結果をおおむね確認できた。ＥＬＩＳＡによる観察によると、アミノ酸残基Ｉ５０、Ｇ５５、Ｓ５７、Ｔ５８およびＳ５９の変異は、親ＡＰＦＦ変異体に比べて、ＤＬＬ４に対する結合を低下させた。
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ｉｉｉ．ＣＤＲ２残基Ｎ５２、Ｓ５４およびＧ５６のＮＮＫ変異誘発
次に、Ｆａｂ重鎖ＡＰＦＦ変異体をテンプレートとして使って、上述のように、アミノ酸残基Ｎ５２、Ｓ５４、Ｇ５６のさらなる変異誘発を行った。
親ＡＰＦＦ変異体テンプレートＨ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ｗｔ中にアミノ酸残基Ｎ５２、Ｓ６５およびＧ５６の変異を含むＦａｂ重鎖変異体のＤＬＬ４に対する結合に関し、実施例４Ｂに記載の９６ウエルプレートＤＬＬ４ ＥＣＬ結合アッセイおよび実施例６に記載のＥＬＩＳＡアッセイを使って試験した。表５２は、種々の試験変異体のＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬおよびＥＬＩＳＡシグナルを示す。二重変異体、例えば、Ｉ５１Ｔ／Ｎ５２Ｖが、ＰＣＲ反応中に偶然に生成した。特定のアミノ酸位置に２つの変異の組み合わせを含むようにいくつかのＦａｂ変異体が設計されている。例えば、Ｇ５６Ｅ／Ｄは、試験抗体が、１つは変異Ｇ５６Ｅを含み、他の１つは、変異Ｇ５６Ｄを含む、２つのＦａｂの混合物であったことを示す。ＥＣＬとＥＬＩＳＡの両方の結果はＦａｂＡＰＦＦ変異体中に、Ｎ５２Ｌ、Ｎ５２Ｗ、Ｓ５４Ｔ、Ｇ５６ＨおよびＧ５６Ｗ等の変異を含むいくつかのＦａｂ重鎖変異体は、全て、親Ｆａｂ ＡＰＦＦ変異体より大きい親和性でＤＬＬ４に結合することを示す。
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ｉｖ．ＣＤＲ２アミノ酸残基Ｉ５１のさらなる変異誘発
Ｎ５２Ｌ、Ｓ５４ＴおよびＧ５６Ｈを含むＦａｂ変異体を生成した。従って、生成したＦａｂ変異体は、抗体の重鎖：Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１ＦＮ５２Ｌ／Ｓ５４Ｔ／Ｇ５６Ｈ中に７つの変異を含み、Ｆａｂ変異体ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１ＦＮ５２Ｌ／Ｓ５４Ｔ／Ｇ５６Ｈ＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１（Ｈ：ＡＰＦＦ ＬＴＨ＆Ｌ：ｗｔ）と呼ばれる。Ｈ：ＡＰＦＦ ＬＴＨ変異体をＣＤＲ２アミノ酸残基Ｉ５１のさらなるＮＮＫ変異誘発のためのテンプレートとして使用した。実施例４Ｂで記載の９６ウエルプレートＥＣＬ結合アッセイおよび実施例６に記載のＥＬＩＳＡを使って、Ｉ５１変異体をＤＬＬ４に対する結合の試験を行った。ＥＣＬおよびＥＬＩＳＡシグナルの結果を表５３に示す。結果は、Ｈ：ＡＰＦＦ ＬＴＨ親バックボーン中のアミノ酸残基Ｉ５１のバリン（Ｉ５１Ｖ）への変異により、Ｈ：ＡＰＦＦ ＬＴＨ親に比べて、ＤＬＬ４に対する結合親和性のさらなる増加を生じたことを示す。
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ｖ．ＣＤＲ２アミノ酸残基Ｐ５３のＮＮＫ変異誘発
Ｆａｂ変異体ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１ＦＩ５１Ｔ／Ｎ５２Ｌ／Ｓ５４Ｔ／Ｇ５６Ｈ＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１（Ｈ：ＡＰＦＦ ＴＬＴＨ）をＣＤＲ２アミノ酸残基Ｐ５３のＮＮＫ変異誘発のためのテンプレートとして使用した。実施例４Ｂで記載の９６ウエルプレートＥＣＬ結合アッセイおよび実施例６に記載のＥＬＩＳＡを使って、Ｐ５３変異体のＤＬＬ４に対する結合の試験を行った。表５４は、ＥＣＬおよびＥＬＩＳＡシグナルを示す。結果は、Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１ＦＩ５１Ｔ／Ｎ５２Ｌ／Ｓ５４Ｔ／Ｇ５６Ｈ（Ｈ：ＡＰＦＦ ＴＬＴＨ）＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１重鎖残基Ｐ５３のアラニン（Ｐ５３Ａ）への変異により、Ｈ：ＡＰＦＦ ＴＬＴＨ変異体に比べて、ＤＬＬ４に対する結合親和性の増加を生ずることを示す。
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重鎖変異体ＡＰＦＦ ＬＴＨ（配列番号２０３）、ＡＰＦＦ ＥＬＴＨ（配列番号２０８）、ＡＰＰＦ ＶＬＴＨ（配列番号２０９）、ＡＰＦＦ ＮＬＴＨ（配列番号２１４）、ＡＰＦＦ ＴＬＡＴＨ（配列番号２２１）およびＡＰＦＦＩ５１Ｔ／Ｎ５２Ｖ（配列番号１７１）をそれぞれ、親軽鎖Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号１０７）と対形成させ、２０ｎＭの濃度から開始されるＦａｂの２倍系列希釈を使ってＥＬＩＳＡによりＤＬＬ４に対する結合をさらに解析した。結果を下表５５に示す。結果は、重鎖変異体ＡＰＦＦ ＬＴＨ（配列番号２０６）、ＡＰＦＦ ＥＬＴＨ（配列番号２０８）、ＡＰＰＦ ＶＬＴＨ（配列番号２０９）およびＡＰＦＦ ＮＬＴＨ（配列番号２１４）を含むＦａｂは、約１ｎＭ〜１０ｎＭの間のＫｄでＤＬＬ４と結合することを示す。重鎖変異体ＡＰＦＦ ＴＬＡＴＨ（配列番号２２１）およびＡＰＦＦ Ｉ５１Ｔ／Ｎ５２Ｖ（配列番号１７１）を含むＦａｂは、他の試験Ｆａｂに比べて、ＤＬＬ４に対する低い親和性を有する。重鎖変異体ＡＰＦＦＴＬＡＴＨは、約１００ｎＭを超えるＫｄを有し、重鎖変異体ＡＰＦＦ Ｉ５１Ｔ／Ｎ５２Ｖは、１０〜１００ｎＭの間のＫｄを有する。
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ｖｉ．フレームワークアミノ酸残基Ｓ８４のＮＮＫ変異誘発
Ｆａｂ重鎖ＡＰＦＦ変異体を、上述のＮＮＫ変異誘発を伴うオーバーラッピングＰＣＲを使った、重鎖フレームワーク領域中のアミノ酸残基Ｓ８４のさらなる変異誘発のためのテンプレートとして使用した。実施例４Ａに記載のＥＣＬマルチスポット結合アッセイおよび実施例６に記載のＥＬＩＳＡを使って、生成した変異体のＤＬＬ４および他の抗原に対する結合の試験を行った。ＥＣＬおよびＥＬＩＳＡの結果を表５６に示す。表５６は、変異体ＦａｂおよびＥＣＬ法またはＥＬＩＳＡアッセイによるＤＬＬ４に対する結合のシグナル／ノイズ比率を示す。表５７は、各変異体Ｆａｂの全試験抗原に対する結合のＥＣＬシグナルを示す。一般的に、結果から、Ｆａｂ重鎖ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ Ｓ８４変異体は、ＥＣＬまたはＥＬＩＳＡでは、ＤＬＬ４に対する結合の強化を示さなかったことが認められる。１つの変異体のＦａｂ重鎖ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ Ｓ８４Ｔ（配列番号２３３）が、ＥＣＬ ＭＳＤアッセイでは、より大きなＤＬＬ４に対する結合を示したが、ＥＬＩＳＡでは、同じ結合であった。
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実施例１０
ＤＬＬ４に対し特定された「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１軽鎖の親和性成熟
この実施例では、親のＤＬＬ４に対する「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の軽鎖に、上記実施例７〜９に記載の重鎖の親和性成熟と同様に親和性成熟を行った。
ｉ．ＣＤＲ潜在的結合部位の特定
「Ｈｉｔ」ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１０７）を、ＤＬＬ４に対し結合しないと特定された３つの「ｎｏｎ−Ｈｉｔ」関連軽鎖（下表５８参照）のアミノ酸配列と配列比較した。これら４つのＦａｂは、同じＪＬ生殖系列セグメントを共有するため、関連している。さらに、ＶＬ生殖系列セグメントは同じサブグループ（すなわち、ＩＧＫＶ３）に属する。配列アラインメントを図２に示す。配列比較に基づいて、「Ｈｉｔ」および「ｎｏｎ−Ｈｉｔ」の間で異なっており、それにより、「Ｈｉｔ」および「ｎｏｎ−Ｈｉｔ」間の結合親和性の差異を説明できるアミノ酸残基が特定された。特定されたアミノ酸残基は、ＣＤＲ３中に位置し、これは結合親和性に重要な軽鎖の領域として特定された。
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ＣＤＲ３のＮＮＫ変異誘発
オーバーラッピングＰＣＲを使ってＮＮＫ変異誘発により軽鎖Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１のＣＤＲ３のアミノ酸残基Ｒ９１、Ｓ９２、Ｎ９３、およびＷ９４に変異導入し、ＤＬＬ４に結合するアミノ酸残基をさらに特定した。ＣＤＲ３アミノ酸残基Ｑ８９、Ｑ９０、Ｐ９５、Ｐ９６、Ｗ９７およびＴ９８は、４つの整列させた軽鎖の内で保存されていた（図２参照）ので、ＮＮＫ変異誘発は行わなかった。重鎖三重変異体ＡＰＦ（例えば、実施例７；Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ（Ｈ：ＡＰＦ）＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１を参照）をアミノ酸残基Ｒ９１およびＳ９２のＮＮＫ変異誘発のための親テンプレートとして使用した。重鎖士重変異体ＡＰＦＦ（例えば、実施例９；Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ（Ｈ：ＡＰＦＦ）＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１を参照）をアミノ酸残基Ｓ９２、Ｎ９３およびＷ９４のＮＮＫ変異誘発のための親テンプレートとして使用した。Ｘ（任意のアミノ酸）で指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さなかったので、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。生成した変異体を実施例４Ａに記載のようにＥＣＬマルチスポットアッセイを使ってアッセイした。結果を下表５９と６０に示す。結果は、アミノ酸残基Ｒ９１、Ｓ９２、Ｎ９３およびＷ９４の変異誘発により、ＡＰＦまたはＡＰＦＦ親テンプレート抗体に比較して、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルの減少が起こることを示しており、従って、これらの残基は、これ以上変異誘発しなかった。
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ｉｉｉ．ＣＤＲ１のＮＮＫ変異誘発
オーバーラッピングＰＣＲを使ってＮＮＫ変異誘発により軽鎖Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１のＣＤＲ１のアミノ酸残基Ｓ２８、Ｓ３０、Ｓ３１、およびＹ３２に変異導入し、ＤＬＬ４に対する結合に重要なアミノ酸残基をさらに特定した。ＡＰＦ三重変異体（例えば、実施例７；Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ（Ｈ：ＡＰＦ）＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１を参照）をＳ３０およびＹ３２のＮＮＫ変異誘発用テンプレートとして使用した。ＡＰＦＦ重鎖四重変異体（例えば、実施例９；Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ（Ｈ：ＡＰＦＦ）＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１を参照）をＳ２８、Ｓ３０およびＳ３１のＮＮＫ変異誘発用のテンプレートとして使用した。生成した変異体を、上記実施例４Ａに記載のようにＥＣＬマルチスポットアッセイを使って試験した。結果を下表６１と６２に示す。二重変異体、例えば、Ｒ２４Ｇ／Ｑ２７ＬがＰＣＲ反応中に偶然に生成した。Ｘ（任意のアミノ酸）で指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さなかったので、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。結果は、アミノ酸残基Ｙ３２の変異誘発により、ＡＰＦ親テンプレートに比べてＤＬＬ４に対する結合親和性の減少が起こることを示しており、従って、この残基のこれ以上の変異誘発は行わなかった。アミノ酸残基Ｓ２８、Ｓ３０およびＳ３１の変異誘発は、ＡＰＦまたはＡＰＦＦ親テンプレートに比べて、ＤＬＬ４に対する結合親和性を改善するか、または結合親和性に影響を与えなかったので、これらの残基を、さらなる変異誘発用の残基として特定した。３つの軽鎖変異体、すなわち、Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１ Ｓ２８Ｄ、Ｓ３０Ｎ、およびＳ３１Ｈは、ＤＬＬ４に対する抗体の結合親和性をわずかに増加させた。
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次に、Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ（Ｈ：ＡＰＦＦ）＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１軽鎖変異体Ｓ２８Ｄ、Ｓ２８Ｈ、Ｓ３０ＮおよびＳ３１ＨをＥＬＩＳＡによりＤＬＬ４に対する結合の再アッセイを行った。結果を下表６３に示す。結果は、Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ（Ｈ：ＡＰＦＦ）＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１軽鎖変異体Ｓ２８Ｎ、およびＳ３１Ｈが、Ｈ：ＡＰＦＦ親テンプレート抗体に比べて、ＤＬＬ４に対する結合親和性をわずかに増加させることを示している。試験濃度でのＥＬＩＳＡでは、Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ（Ｈ：ＡＰＦＦ）＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１軽鎖変異体Ｓ２８ＨおよびＳ３０Ｄは、ＡＰＦＦ親テンプレート抗体に比べて、ＤＬＬ４に対する結合親和性を増加させなかった。
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ｉｖ．ＣＤＲ１のＮＮＫ変異誘発に基づく組み合わせ変異体
Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ（Ｈ：ＡＰＦＦ）＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１軽鎖変異体Ｓ２８Ｄ、Ｓ３０ＮおよびＳ３１Ｈを１つの三重変異体に組み合わせて、Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ（Ｈ：ＡＰＦＦ）＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１Ｓ２８Ｄ／Ｓ３０Ｎ／Ｓ３１Ｈ（Ｌ：ＮＤＨ）（Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨ）と呼んだ。Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨ変異体のＤＬＬ４に対する結合親和性を、ＥＬＩＳＡおよび９６ウエルプレートＥＣＬアッセイの両方で試験した。さらに、軽鎖三重変異体Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１Ｓ２８Ｄ／Ｓ３０Ｎ／Ｓ３１Ｈ（Ｌ：ＮＤＨ）を重鎖変異体ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ／Ｇ５６Ａ（Ｈ：ＡＰＦＦＧ５６Ａ）およびＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ／Ｓ５４Ａ（Ｈ：ＡＰＦＦＳ５４Ａ）と組み合わせてアッセイした。
結果を下表６４と６５に示す。結果は、抗体変異体ＡＰＦＦ−ＮＤＨは、親抗体ＡＰＦＦ変異体に比べて、４倍増加した親和性でＤＬＬ４に結合することを示している。抗体Ｆａｂ Ｈ：ＡＰＦＦＧ５６Ａ＆Ｌ：ＮＤＨは、Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ｗｔ親抗体変異体に比べて、８倍大きいＤＬＬ４に対する結合親和性を生じ、また、他の試験抗体に比べ、増加した結合親和性を示した。抗体Ｆａｂ Ｈ：ＡＰＦＦＳ５４Ａ＆Ｌ：ＮＤＨは、Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨ抗体変異体に比べて、結合親和性のわずかな増加を生じた。表６５は、三重軽鎖変異体および種々の重鎖変異体を含む抗体の結合親和性の比較である。表６４および６５の結果から、重鎖中に５変異および軽鎖中に３変異を含むＨ：ＡＰＦＦＧ５６Ａ＆Ｌ：ＮＤＨが、試験した抗体中で最高の結合親和性を示すことが解る。
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ｖ．ＣＤＲ２のアラニンスキャンニング
軽鎖Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１のＣＤＲ２のアミノ酸残基Ｄ５０、Ａ５１、Ｓ５２、Ｎ５３、Ｒ５４、Ａ５５およびＴ５６をアラニン置換変異導入により変異させ、ＤＬＬ４に対する結合に重要なアミノ酸残基をさらに特定した。アミノ酸残基Ａ５１およびＡ５５は、トレオニンに変異させた。ＡＰＦＦ重鎖四重変異体（例えば、実施例９；Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ（Ｈ：ＡＰＦＦ）＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１を参照）をテンプレートとして使用した。
結果を下表６６に示す。結果は、アミノ酸残基Ｄ５０、Ｒ５４およびＴ５６のアラニンへの変異、およびアミノ酸残基Ａ５１のトレオニンによる置換により、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルの減少が生じることを示し、従って、これらの残基をこれ以上変異誘発しなかった。アミノ酸残基Ｓ５２およびＮ５３のアラニンへの変異、およびアミノ酸残基Ａ５５のトレオニンへの変異は、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルを改善したか、またはＥＣＬシグナルに影響を与えなかったので、これらの残基をさらなる変異誘発用のアミノ酸残基として特定した。
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ｖｉ．ＣＤＲ２残基Ｓ５２、Ｎ５３、およびＡ５５のＮＮＫ変異誘発
Ｆａｂ変異体Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨ（上記実施例１０；ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ（Ｈ：ＡＰＦＦ）＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１Ｓ２８Ｄ／Ｓ３０Ｎ／Ｓ３１Ｈ（Ｌ：ＮＤＨ）を参照）をＣＤＲ２アミノ酸残基Ｓ５２、Ｎ５３およびＡ５５のＮＮＫ変異誘発用テンプレートとして使用した。Ｆａｂ変異体を９６ウエルプレートＥＣＬ結合アッセイおよびＥＬＩＳＡを使って、ＤＬＬ４に対する結合の試験を行った。表６７は、ＥＣＬおよびＥＬＩＳＡシグナルを示す。Ｘ（任意のアミノ酸）で指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さなかったので、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。結果は、軽鎖中にさらなる変異Ｓ５２Ｔ、Ｓ５２Ｌ、Ｎ５３Ｈ、Ａ５５ＳおよびＡ５５Ｇを有するものを含む、Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨの種々の変異体が、親Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨに比べて、より大きなＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬおよびＥＬＩＳＡシグナルを呈することを示している。
軽鎖変異体Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨ Ｓ５２Ｔ、Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨ Ｓ５２Ｌ、Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨＳ ５２Ｔ／Ｓ、Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨ Ｓ５２Ｘ、Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨ Ｎ５３Ｈ、Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨ Ａ５５ＳおよびＨ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨ Ａ５５Ｇを、１００ｎＭの濃度から始まるＦａｂの２倍系列希釈を使って、ＥＬＩＳＡによりＤＬＬ４に対する結合をさらに解析した。結果を下表６８に示す。抗体変異体Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨＳ５２Ｌ、Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨＡ５５ＳおよびＨ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨＡ５５Ｇは、親Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨ変異体に比較して、ＤＬＬ４に対する結合の親和性をわずかに増加させた。全てのＦａｂ軽鎖変異体は、親Ｈ：ＡＰＦＦ＆Ｌ：ＮＤＨ変異体と同じ親和性の範囲内でＤＬＬ４と結合する。
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ｖｉｉ．フレームワーク３残基Ｓ７６およびＦ６２のＮＮＫ変異誘発
Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ（Ｈ：ＡＰＦＦ）およびＬ６＿ＩＧＫＪ１＊０１を軽鎖フレームワーク３領域のアミノ酸残基Ｓ７６およびＦ６２のさらなる変異誘発用のテンプレートとして使用した。これらの残基を、上述のＮＮＫ変異誘発を伴うオーバーラッピングＰＣＲを使って、変異導入した。ＤＬＬ４に対する結合を、実施例４Ａに記載のようにＥＣＬマルチスポットアッセイまたは実施例６に記載のようにＥＬＩＳＡアッセイを使って試験した。結果を下表６９〜７１に示す。結果は、アミノ酸残基の変異Ｓ７６およびＦ６２は、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬおよびＥＬＩＳＡシグナルの減少を起こすことを示している。
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実施例１１
重鎖および軽鎖Ｆａｂ組み合わせ変異体
実施例７〜１０でＤＬＬ４に対する結合に寄与するとして特定された重鎖および軽鎖変異体を対形成させ、様々な組み合わせ変異体を得た。重鎖変異体には、ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１ Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１ＦＮ５２Ｌ／Ｓ５４Ｔ／Ｇ５６Ｈ（Ｈ：ＡＰＦＦＬＴＨ）、ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１ Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１ＦＩ５１Ａ／Ｎ５２Ｌ／Ｓ５４Ｔ／Ｇ５６Ｈ（Ｈ：ＡＰＦＦＡＬＴＨ）、およびＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１ Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１ＦＩ５１Ｖ／Ｎ５２Ｌ／Ｓ５４Ｔ／Ｇ５６Ｈ（Ｈ：ＡＰＦＦＶＬＴＨ）を含めた。軽鎖変異体には、Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１ Ｓ２８Ｄ／Ｓ３０Ｎ／Ｓ３１ＨＳ５２Ｌ／Ａ５５Ｓ（Ｌ：ＮＤＨＬＳ）およびＬ６＿ＩＧＫＪ１＊０１Ｓ２８Ｄ／Ｓ３０Ｎ／Ｓ３１ＨＳ５２Ｌ／Ａ５５Ｇ（Ｌ：ＮＤＨＬＧ）を含めた。
下表７２にＦａｂおよびＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルを示す。通常、Ｈ：ＡＰＦＦＬＴＨおよびＨ：ＡＰＦＦＶＬＴＨ重鎖を有するＦａｂは、重鎖Ｈ：ＡＰＦＦＡＬＴＨを有するＦａｂに比べて、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルを増加させた。試験抗体に応じて、特定の軽鎖変異体もまた、ＤＬＬ４に対する結合にさらに影響を及ぼした。類似の結果がＥＬＩＳＡによっても得られた（表７３）。変異体を２０ｎＭの濃度から始まるＦａｂの３倍系列希釈を使って、ＥＬＩＳＡによりＤＬＬ４に対する結合をさらに解析した。結果を下表７３に示す。Ｈ：ＡＰＦＦＬＴＨおよびＡＰＦＦＨ：ＶＬＴＨ重鎖変異を含む抗体は、重鎖変異体Ｈ：ＡＰＦＦＡＬＴＨを含む抗体変異体に比べ、約１０倍増加したＤＬＬ４に対する結合親和性を有していた。
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要約
親和性成熟の結果として、親Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１のＤＬＬ４に対する結合親和性が４３０倍増加した。下表７５に、ＳＰＲ（実施例５参照）により測定した種々の親和性成熟抗体のＤＬＬ４に対する結合親和性を示す。親Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１は、７３０ｎＭのＫＤでＤＬＬ４に結合する。４つの重鎖アミノ酸、すなわち、Ｓ１０２Ａ／Ｓ１０３Ｐ／Ｓ１０４Ｆ／Ｈ１１１Ｆ（Ｈ：ＡＰＦＦ）の変異により、１０倍増加したＤＬＬ４に対する親和性を有するＦａｂを生成した（ＫＤ＝７０．６ｎＭ）。親和性成熟重鎖および軽鎖変異体ＦａｂＨ：ＡＰＦＦＶＬＴＨ＆Ｌ：ＮＤＨＬＳは、１．７ｎＭのＫＤを有し、ＤＬＬ４に対する結合親和性の４３０倍の増加に相当する。
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実施例１２
特定された親「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１のＤＬＬ４に対する親和性成熟
エレクトロルミネセンス・メソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）マルチスポット結合アッセイを使って実施例４で特定された、ＤＬＬ４に対する親「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１（配列番号８９および１０８）に対し、上述の実施例７〜１１のように親和性成熟を行った。この方法により、親「Ｈｉｔ」ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１ Ｆａｂ抗体に比べて、顕著に改善されたＤＬＬ４に対する結合親和性を有する抗ＤＬＬ４抗体が生成された。
Ａ．重鎖
１．ＣＤＲ潜在的結合部位の特定
親「Ｈｉｔ」ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８９）をＤＬＬ４に対し結合しないとして特定されたｎｏｎ−Ｈｉｔ、すなわち、ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ６−２５＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１の関連重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０６）と配列比較した。これらの２つのＦａｂは、同じＶＨおよびＪＨ生殖系列セグメントを共有するため、関連している。配列アラインメントを図３に示す。配列比較に基づいて、「Ｈｉｔ」と「ｎｏｎ−Ｈｉｔ」の間で異なり、それにより、「Ｈｉｔ」と「ｎｏｎ−Ｈｉｔ」抗体のＤＬＬ４に対する結合の差異を説明できるアミノ酸残基が特定された。特定されたアミノ酸残基は、ＣＤＲ３に位置しており、結合親和性に重要な重鎖の領域であるとして特定された。
２．ＣＤＲ３のアラニンスキャンニング
親ＦａｂＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１の重鎖配列のＣＤＲ３中のアミノ酸残基に対しアラニン置換変異導入を行い、ＤＬＬ４との結合に関与しないと思われるアミノ酸残基を特定した。重鎖のＣＤＲ３領域のアラニンスキャニングを、ＣＤＲ３領域のアミノ酸残基Ｙ１０７、Ｆ１０８、Ｄ１０９、およびＹ１１０を除く、全残基をアラニンに変異させることにより行った。精製Ｆａｂアラニン変異体をＤＬＬ４に対する結合の試験を行った。結果を表７６に示す。Ｒ９９、Ｙ１０１、Ｓ１０２、Ｙ１０３、Ｙ１０５、またはＤ１０６のアラニンへの変異により、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルの減少が生じたので、これらの残基に対し、これ以上の変異誘発は行わなかった。対照的に、Ｇ１００またはＧ１０４のアラニンへの変異では、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルの増加を生じたか、またはＥＣＬシグナルに対し影響を与えなかった。従って、これらの残基をさらなる変異誘発用の残基として特定した。結果は、種々の濃度の変異体ＦａｂおよびＤＬＬ４タンパク質を使って反復実験により確認した（表７７参照）。
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３．重鎖アミノ酸残基Ｇ１００およびＧ１０４のＮＮＫ変異誘発
ＣＤＲ３のアラニン置換変異導入後、上記実施例７．ｂ．ｉｉｉに記載の実験と同様の、野生型Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１をテンプレートとして使い、また、ＮＮＫ変異誘発を伴うオーバーラッピングＰＣＲを使ったさらなる変異用として、重鎖アミノ酸残基Ｇ１００およびＧ１０４を選択した。結果を下表７８に示す。Ｘ（どのアミノ酸でもよい）と指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さず、従って、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。重鎖中の２つの変異、Ｇ１００ＫおよびＧ１０４Ｔ、を改善されたＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルを有するＦａｂを生成する変異として特定した。各変異体は、親Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１に比べて、約２倍大きいＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルを示した。
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４．ＣＤＲ３のＮＮＫ変異誘発に基づく組み合わせ変異体
ＤＬＬ４に対する増加した結合親和性を有するとして特定されたＦａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１重鎖変異体Ｇ１００ＫおよびＧ１０４Ｔを組み合わせて、二重変異体を生成し、Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１Ｇ１００Ｋ／Ｇ１０４Ｔ＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１（Ｈ：ＫＴ）と命名した。種々の濃度の各抗体をアッセイすることにより、ＫＴ二重変異体のＤＬＬ４に対する結合を、親Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１のＤＬＬ４に対する結合と比較した。結果を下表７９〜８０に示す。結果から、ＫＴ二重変異体は、親Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１に比べて、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルの増加を示すことが解る。両Ｆａｂは、種々の他の試験抗原に比べて、ＤＬＬ４に対し特異的結合を示す（表８０参照）。
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Ｂ．重鎖のさらなる最適化
１．要約
前に記載し生成したＫＴ二重変異体の重鎖をさらに最適化しＤＬＬ４に対する結合を改善した。重鎖変異体ＫＴ二重変異体を、重鎖のＣＤＲ１（アミノ酸２６〜３５）、ＣＤＲ２（アミノ酸残基５０〜６６）およびフレームワーク領域中の重鎖アミノ酸残基のアラニン置換変異導入によるさらなる変異誘発のためのテンプレートとして使用した。
２．ＣＤＲ１中の残基のアラニンスキャンニング
Ｇ２６を除くＣＤＲ１の全アミノ酸残基を変異させることによりアラニンスキャンニングを行った。また、３つの追加の隣接アミノ酸残基、すなわち、Ｇ２４、Ｉ３４、およびＧ３５をアラニンに変異させた。精製Ｆａｂアラニン変異体を、ＥＣＬマルチスポット結合アッセイを使ってＤＬＬ４に対する結合に関し試験を行った。結果を下表８１〜８３に示す。アミノ酸残基Ｙ２７、Ｆ２９、Ｔ３０、Ｓ３１、Ｙ３２、Ｗ３３、またはＩ３４のアラニンへの変異により、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬおよびＥＬＩＳＡシグナルの減少が生じ、従って、これらの残基は、これ以上変異誘発を行わなかった。アミノ酸残基Ｇ２４、Ｓ２８、またはＧ３５のアラニンへの変異は、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルを改善したか、またはＥＣＬシグナルに影響を与えなかった。従って、これらの残基をさらなる変異誘発用の残基として特定した。また、ＥＬＩＳＡ実験も行ったが、ＥＬＩＳＡ実験では、検出可能なシグナルがほんのわずしか、または全く観察されなかった（表８１）。表８３から、試験抗体は、他の試験抗原に比べ、ＤＬＬ４に対し特異性を示すことが解る。
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３．アミノ酸残基Ｇ２４、Ｓ２８およびＧ３５のＮＮＫ変異誘発
ＣＤＲ１のアラニン置換変異導入後、重鎖ＫＴ二重変異体をテンプレートとし、ＮＮＫ変異誘発を伴うオーバーラッピングＰＣＲを使ったさらなる変異のために、重鎖アミノ酸残基Ｇ２４、Ｓ２８およびＧ３５を選択した。結果を下表８４に示す。Ｘ（どのアミノ酸でもよい）と指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さず、従って、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。特異的アミノ酸位置に２つの変異の組み合わせを含むようにいくつかのＦａｂ変異体が設計された。例えば、Ｇ２４Ｓ／Ｔの場合、試験抗体は、１つが変異Ｇ２４Ｓを含み、もう一つが変異Ｇ２４Ｔを含む、２つのＦａｂの混合物であったことを示す。結果は、ＫＴ二重変異体の重鎖の追加のアミノ酸変異（Ｇ２４Ｌ、Ｓ２８Ｒ、Ｓ２８ＫおよびＧ３５Ｖ）により、親ＫＴ二重変異体テンプレートに比べて、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルの増加が生じることを示している。
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４．Ｇ２４、Ｓ２８およびＧ３５の組み合わせ変異体
Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１Ｇ１００Ｋ／Ｇ１０４Ｔ（ＫＴ）＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１重鎖変異体Ｇ２４Ｌ、Ｇ２４Ｔ、Ｇ２４Ａ、Ｓ２８ＲおよびＧ３５Ｖを組み合わせて、重鎖中に３つから５つの変異を含む抗体を生成した。生成した変異体を表８５に示す。ＥＣＬアッセイを使って、変異体のＤＬＬ４に対する結合を評価した。全組み合わせ変異体が、ＫＴ二重変異体に比べて、より大きなＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルを示した。結果は、変異体Ｆａｂ Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ｗｔがＤＬＬ４に対する結合に関し最大の親和性を持ったことを示している。
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５．ＣＤＲ２のアラニンスキャンニング
ＫＴ二重変異体をＣＤＲ２（アミノ酸５０〜５８）のアラニン置換変異導入用のテンプレートとして使用し、抗体ＤＬＬ４に対する結合に重要な残基を決定した。ＥＣＬマルチスポット結合アッセイを使って精製Ｆａｂアラニン変異体のＤＬＬ４に対する結合試験を行った。結果を下表８６〜８８に示す。アミノ酸残基Ｉ５０、Ｉ５１、Ｙ５２、Ｐ５３、Ｇ５４、Ｄ５５、またはＤ５７のアラニンへの変異により、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルの減少が生じ、従って、これらの残基をこれ以上の変異誘発用の標的とはしなかった。アミノ酸残基Ｓ５６またはＴ５８のアラニンへの置換により、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルが改善されたか、またはＥＣＬシグナルに影響を与えなかった。従って、これらの残基に対し、さらなる変異誘発を行った。また、ＥＬＩＳＡによる類似の実験を行ったが、検出可能なシグナルがほんのわずかしか、または全く検出されなかった。表８８から、全抗体がＤＬＬ４に対し特異性を示すことが明らかである。
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６．アミノ酸残基Ｔ５８およびＳ５６のＮＮＫ変異誘発
ＣＤＲ２のアラニン置換変異導入後、Ｈ：ＫＴ＆Ｌ：ｗｔ二重変異体をテンプレートとし、ＮＮＫ変異誘発を伴うオーバーラッピングＰＣＲを使ったさらなる変異のために、重鎖アミノ酸残基Ｔ５８およびＳ５６を選択した。結果を下表８９に示す。Ｘ（どのアミノ酸でもよい）と指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さず、従って、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。重鎖ＫＴアミノ酸残基Ｔ５８のアラニン（Ｔ５８Ａ）およびアスパラギン酸（Ｔ５８Ｄ）への変異により、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルの増加が生じた。
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７．アミノ酸残基Ｓ８４およびＤ１０９の変異誘発
重鎖ＫＴ二重変異体を、アミノ酸残基Ｓ８４およびＤ１０９の変異誘発用テンプレートとして使用した。これらのアミノ酸残基を、ＮＮＫ変異誘発を伴うオーバーラッピングＰＣＲを使って、またはアラニンスキャンニングによって、変異導入した。結果を下表９０〜９２に示すが、これらの図はＤＬＬ４または種々の抗原に対する結合のＥＣＬおよびＥＬＩＳＡ結果を示す。重鎖残基Ｓ８４およびＤ１０９の変異により、重鎖変異体Ｆａｂ ＫＴ＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ＊０１に比較して、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルの減少を生じた。
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Ｃ．軽鎖
１．ＣＤＲ３のアラニンスキャンニング
親Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１Ｇ１００Ｋ／Ｇ１０４Ｔ（Ｈ：ＫＴ）＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ＊０１の軽鎖のＣＤＲ３中のアミノ酸残基に対しアラニン置換変異導入を行い、ＤＬＬ４結合に関与しないと思われるアミノ酸残基を特定した。ＣＤＲ３の全ての残基を変異させるアラニン置換変異導入を行った。精製Ｆａｂアラニン変異体に対し、ＥＣＬマルチスポットアッセイを使って、０．０４μＭの濃度でＤＬＬ４に対する結合の試験を行った。した。結果を下表９３〜９４に示す。結果は、アミノ酸残基Ｌ９２、Ｙ９３、Ｇ９５、Ｇ９７、Ｉ９８、またはＳ９９のアラニンへの変異により、ＤＬＬ４に対する結合が低減することを示したので、これらの残基に対しては、これ以上の変異誘発を行わなかった。Ｖ９１、Ｍ９４、またはＳ９６のアラニンによる置換は、ＤＬＬ４に対する結合を改善したか、またはＤＬＬ４に対する結合に影響を与えなかった。従って、これらの残基を、さらなる変異誘発のための残基として特定した。
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２．ＣＤＲ３アミノ酸残基Ｖ９１、Ｍ９４およびＳ９６のＮＮＫ変異誘発
ＣＤＲ３のアラニン置換変異導入後、ＦａｂＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１Ｇ１００Ｋ／Ｇ１０４Ｔ＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ＊０１をテンプレートとして使い、ＮＮＫ変異誘発を伴うオーバーラッピングＰＣＲを使ってさらに変異を行うために、軽鎖アミノ酸残基Ｖ９１、Ｍ９４およびＳ９６を選択した。生成した変異体を、実施例４に記載のようにＥＣＬマルチスポットアッセイを使って、または実施例６に記載のようにＥＬＩＳＡによって、アッセイした。結果を表９５に示す。ＥＣＬ結果は、Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ＊０１アミノ酸変異体Ｍ９４Ｒ、Ｓ９６ＭおよびＳ９６ＥがＤＬＬ４に対する結合を増加させたことを示した。ＥＬＩＳＡでは、いずれの試験変異体にも、検出可能なシグナルが観察されなかった。
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３．Ｍ９４およびＳ９６の組み合わせ変異体
ＤＬＬ４に対する結合の強化に貢献すると特定されたＶ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１軽鎖変異体Ｍ９４ＲおよびＳ９６Ｍを組み合わせて、二重変異体を生成した。二重変異体は、Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１Ｍ９４Ｒ／Ｓ９６Ｍ（Ｌ：ＲＭ）と命名された。Ｈ：ＫＴ、Ｈ：ＫＴ Ｓ２８Ｒ、Ｈ：ＫＴ ＬＲＶ、Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ、およびＨ：ＫＴ ＡＲＶを含む種々の重鎖変異体と対を形成した、Ｌ：ＲＭ二重変異体の結合親和性を実施例４に記載のようにＥＣＬアッセイにより測定した。結果を下表９６に示す。Ｆａｂ Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＲＭは、他の試験Ｆａｂ抗体に比べて、最大のＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルを示した。
実施例６に記載のように２０ｎＭの濃度から始まるＦａｂの３倍系列希釈を使い、ＥＬＩＳＡにより、上記変異体ＦａｂのＤＬＬ４に対する結合に関しさらに解析した。結果を下表９７に示す。ＥＣＬの結果と同様に、他の試験変異体Ｆａｂ抗体に比べて、Ｆａｂ Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＲＭが最大のＤＬＬ４に対する結合のＥＬＩＳＡシグナルを示した。
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４．軽鎖ＣＤＲ１のアラニンスキャンニング
重鎖ＫＴ二重変異体（ＦａｂＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１Ｇ１００Ｋ／Ｇ１０４Ｔ＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ＊０１）を、軽鎖ＣＤＲ１（アミノ酸２３〜３３）のアラニン置換変異導入用のテンプレートとして使用し、抗体ＤＬＬ４に対する結合に重要な残基を特定した。
実施例４Ａに記載のようにＥＣＬマルチスポット結合アッセイを使って、精製Ｆａｂアラニン変異体のＤＬＬ４に対する結合の試験を１００ｎＭの濃度で行った。結果を下表９８に示す。アミノ酸残基Ｙ３３、Ｙ３４およびＰ３５のアラニンへの変異は、ＥＣＬシグナルの減少からも明らかなように、ＤＬＬ４に対する結合を低減させた。アミノ酸残基Ｇ２３、Ｌ２４、Ｓ２５、Ｓ２６、Ｇ２７、Ｓ２８、Ｖ２９、Ｓ３０、Ｔ３１、およびＳ３２のアラニンへの変異により、軽鎖に変異を持たない親ＫＴ二重変異体に比較して、ＥＣＬシグナルが増加した、またはＥＣＬシグナルが変化しなかったことからも明らかなように、ＤＬＬ４に対する結合が改善されたか、またはＤＬＬ４に対する結合が影響を受けなかったかのどちらかであった。
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５．アミノ酸残基Ｇ２３のＮＮＫ変異誘発
ＣＤＲ１のアラニン置換変異導入後、Ｆａｂ Ｈ：ＫＴ＆Ｌ：ｗｔ二重変異体をテンプレートとして使用するさらなる変異誘発のために、軽鎖アミノ酸残基Ｇ２３を選択した。ＥＣＬおよびＥＬＩＳＡシグナルを下表９９に示す。Ｘ（どのアミノ酸でもよい）と指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さず、従って、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。
Figure 0006007420
６．ＣＤＲ２のアラニンスキャンニング
重鎖ＫＴ二重変異体（ＦａｂＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１Ｇ１００Ｋ／Ｇ１０４Ｔ＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ＊０１）をＣＤＲ２（アミノ酸５２〜５８）のアラニン置換変異導入用のテンプレートとして使用し、ＤＬＬ４に対する結合抗体として重要な残基を特定した。
実施例４に記載のように、ＥＣＬマルチスポット結合アッセイを使って、精製Ｆａｂアラニン変異体のＤＬＬ４に対する結合の試験を行った。結果を下表１００に示す。アミノ酸残基Ｓ５２、Ｔ５３、Ｎ５４、Ｔ５５、Ｒ５６、Ｓ５７およびＳ５８のアラニンへの変異は、軽鎖中に変異を持たない親ＫＴ二重変に比べて、ＥＣＬシグナルの増加、またはＥＣＬシグナルの無変化からも明らかなように、ＤＬＬ４に対する結合を改善したか、またはＤＬＬ４に対する結合に何ら影響を与えなかったかのどちらかであった。
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７．アミノ酸残基Ｓ５２およびＲ５６のＮＮＫ変異誘発
ＣＤＲ２のアラニン置換変異導入後、重鎖ＫＴ二重変異体をテンプレートとして使用するさらなるＮＮＫ変異誘発のために、軽鎖アミノ酸残基Ｓ５２およびＲ５６を選択した。ＥＣＬおよびＥＬＩＳＡシグナルを下表１０１に示す。Ｘ（どのアミノ酸でもよい）と指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さず、従って、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。軽鎖変異体Ｓ５２Ｇ、Ｒ５６Ｙ／Ｓ、Ｒ５６ＡおよびＲ５６Ｇは、ＥＣＬおよびＥＬＩＳＡの両方で評価して、ＤＬＬ４に対する結合の強化を示した。
重鎖および軽鎖の変異の種々の組み合わせを含む種々のＦａｂを、１００ｎＭの濃度から始まるＦａｂの２倍系列希釈を使って、ＤＬＬ４に対する結合に関しさらに解析した。結果を下記表１０２に示す。他の試験Ｆａｂ変異体に比べた、ＥＬＩＳＡシグナルからも明らかなように、ＦａｂＨ：ＫＴＳ２８Ｒ＆Ｌ：ｗｔは、最大のＤＬＬ４に対する結合を示した。
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８．フレームワーク３アミノ酸残基Ｔ７８の変異誘発
ＫＴ重鎖に重鎖変異体（Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１Ｇ１００Ｋ／Ｇ１０４Ｔ（Ｈ：ＫＴ）＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ＊０１）を、軽鎖フレームワーク３領域内のアミノ酸残基Ｔ７８のさらなる変異誘発のためのテンプレートとして使用した。この残基をＮＮＫ変異誘発を伴うオーバーラッピングＰＣＲを使って変異させた。表１０３は、ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬシグナルを示す。アミノ酸残基Ｔ７８の変異は、軽鎖に変異を持たない親ＫＴ二重変異体に比較して、ＥＣＬシグナルが増加した、またはＥＣＬシグナルが変化しなかったことからも明らかなように、ＤＬＬ４に対する結合が改善されたか、またはＤＬＬ４に対する結合が影響を受けなかったかのどちらかであった。２つの追加の軽鎖二重変異体Ｇ２３Ａ／Ｎ１７５Ｋ（定常領域内）およびＳ５２Ａ／Ａ１１６Ｔ（フレームワーク４領域内）も生成し、ＥＣＬシグナルの増加からも明らかなように、ＫＴ二重変異体テンプレート抗体に比べて、これらはＤＬＬ４との結合の改善を示した。
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９．重鎖ＫＴ ＴＲＶの対形成変異体
ＦａｂＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１およびＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＲＭに対するＳＰＲデータ（実施例５および表１０８参照）は、これらのＦａｂが小さいオフ速度を有することを示している。従って、これらの抗体の結合親和性を増やすために、重鎖Ｈ：ＫＴ ＴＲＶを種々のＶ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１軽鎖変異体と対形成させた。ＥＬＩＳＡアッセイが、大きいオフ速度を選択し、一方、ＥＣＬアッセイは平衡結合を検出するために、ＤＬＬ４に対する結合親和性をＥＬＩＳＡによりアッセイした。
実施例６に記載のように、１００ｎＭ Ｆａｂの濃度でＥＬＩＳＡを使って、精製Ｆａｂ変異体のＤＬＬ４に対する結合の試験を行った。ＥＬＩＳＡアッセイの結果を表１０４に示す。軽鎖変異体Ｖ９１Ａ、Ｔ３１Ａ、Ｓ５２Ａ、Ｔ５３Ａ、Ｓ５７Ａ、Ｖ９１Ｌ、Ｓ９６ＧおよびＳ９６Ｐ含有Ｆａｂは、より大きなＥＬＩＳＡシグナル−ブランクからも明らかなように、親軽鎖Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１を有するＦａｂに比べて、ＤＬＬ４に対する結合の強化を示した。
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１０．アミノ酸残基Ｓ５２、Ｔ５３およびＳ５７のＩＩ型制限酵素連結を使ったカセット変異導入
重鎖Ｈ：ＫＴ ＴＲＶの対形成Ｆａｂ変異体の分析に続いて、軽鎖二重変異体Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１ Ｖ９１Ｌ／Ｓ９６Ｐ（Ｌ：ＬＰ）を生成した。Ｆａｂ Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰをテンプレートとして、タイプＩＩ制限酵素連結反応をつかって行うさらなる変異誘発用残基として、ＥＬＩＳＡによりＤＬＬ４に対する結合の強化が認められた３つの追加の軽鎖アミノ酸残基（Ｓ５２、Ｔ５３およびＳ５７）（上記表１０３参照）を選択した。ＥＬＩＳＡシグナルを下表１０５に示す。軽鎖変異体Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇ、Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｍ、Ｌ：ＬＰ Ｓ５２ＮおよびＬ：ＬＰ Ｓ５２Ｈは、ＥＬＩＳＡで評価して、ＤＬＬ４に対する結合の強化を示した。
１００ｎＭの濃度から始まるＦａｂの３倍系列希釈を使って、ＥＬＩＳＡにより重鎖および軽鎖の種々の組み合わせの変異を含む４つのＦａｂのＤＬＬ４に対する結合のさらなる解析を行った。結果を下表１０６に示す。他の試験Ｆａｂ変異体に比べたＥＬＩＳＡシグナルからも明らかなように、Ｆａｂ Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰＳ５２Ｇが、最大のＤＬＬ４に対する結合を示した。
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Figure 0006007420
Figure 0006007420
Figure 0006007420
１１．対形成Ｆａｂ変異体
１００ｎＭの濃度から始まるＦａｂの２倍系列希釈を使って、ＥＬＩＳＡにより、重鎖および軽鎖の種々の組み合わせの変異を含む２４変異体ＦａｂのＤＬＬ４に対する結合のさらなる解析を行った。結果を下表１０７に示す。ＦａｂＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２ＫおよびＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇは、他の試験Ｆａｂ変異体とのＥＬＩＳＡシグナルの比較からも明らかなように、最大のＤＬＬ４に対する結合親和性を示した。Ｆａｂ Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２ＨおよびＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｎは、Ｆａｂ Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２ＫおよびＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇに比べて、ＤＬＬ４に対する結合親和性がわずかに低下した。
Figure 0006007420
要約
親和性成熟の結果として、親Ｈｉｔ Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１のＤＬＬ４に対する結合親和性が１３０倍増加した（下表１０８のＳＰＲデータ参照）。親Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１は、４．８μＭのＫＤでＤＬＬ４に結合する。重鎖変異体Ｆａｂ Ｈ：ＫＴ＆Ｌ：ｗｔは、ＤＬＬ４に対する親和性が１３倍増加する（ＫＤ＝３５５ｎＭ）。親和性成熟重鎖および軽鎖変異体Ｆａｂ Ｈ：ＫＴＴＲＶ＆Ｌ：ｗｔは、３６．２ｎＭのＫＤを有し、ＤＬＬ４に対する結合親和性の１３０倍の増加になる。親和性成熟重鎖および軽鎖変異体Ｆａｂ Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰおよびＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇは、それぞれ、３．３および５．０ｎＭのＫＤを有し、ＤＬＬ４に対する結合親和性の１０００倍の増加になる。
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実施例１３
生殖系列セグメントスワッピング
この実施例では、マルチスポットＥＣＬ結合アッセイを使って実施例４で特定されたＤＬＬ４に対する２つの抗体「Ｈｉｔ」Ｆａｂに対し、それぞれＪＨまたはＤＨ生殖系列セグメントのＪ−スワッピングまたはＤ−スワッピングによる変異誘発を行った。Ｊ−スワッピングは、親「Ｈｉｔ」Ｆａｂ ＪＨ生殖系列セグメントの異なるＪＨ生殖系列セグメントによる置換を伴う。Ｄ−スワッピングは、親「Ｈｉｔ」ＤＨ生殖系列セグメントの異なるＤＨ生殖系列セグメントによる置換を伴う。ＤＨ生殖系列セグメントが、重鎖ＣＤＲ３の５’末端を構成し、ＪＨセグメントが、重鎖ＣＤＲ３の３’末端を構成するために、Ｄ−スワッピングおよびＪ−スワッピングは、この重要な抗体結合領域の変異誘発を容易にする。
Ａ．Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１
Ｆａｂ ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１に対して、ＩＧＨＪ１＊０１のＩＧＨＪ２＊０１、ＩＧＨＪ４＊０１、およびＩＧＨＪ５＊０１によるＪ−スワッピングにより、ＣＤＲ３の３’末端のアミノ酸残基Ａ１０６からＨ１１１までの解析が可能となる（図４Ａ参照）。実施例４に記載のようにＥＣＬアッセイを使って、精製Ｆａｂ Ｊ−スワップ変異体のＤＬＬ４に対する結合の試験を行った。結果を下表１０９〜１１０に示す。結果は、ＥＣＬシグナルの減少により評価して、ＩＧＨＪ１＊０１のＩＧＨＪ２＊０１、ＩＧＨＪ４＊０１、またはＩＧＨＪ５＊０１によるスワッピングによって、ＩＧＨＪ１＊０１ＪＨ生殖系列セグメント含有親テンプレート抗体と比較して、ＤＬＬ４に対する抗体の結合が低下したこと示す。
Figure 0006007420
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Ｂ．Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ＊０１
Ｆａｂ ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ＊０１に対して、ＩＧＨＪ４＊０１のＩＧＨＪ１＊０１、ＩＧＨＪ３＊０１、およびＩＧＨＪ５＊０１によるＪ−スワッピングにより、ＣＤＲ３の３’末端のアミノ酸残基１０６〜１１０の解析が可能となる（図４Ｂ参照）。ＩＧＨＤ５−１８＊０１のＩＧＨＤ５−１２＊０１およびＩＧＨＤ５−２４＊０１のＤ−スワッピングにより、ＣＤＲ３の５’末端のアミノ酸残基１００〜１０４の解析が可能となる（図４Ｃ参照）。精製Ｊ−スワップおよびＤ−スワップ変異体のＤＬＬ４に対する結合の解析を、実施例４に記載のようにＥＣＬアッセイを使って行った。ＤＬＬ４に対する結合のＥＣＬ結果を下表１１１〜１１２に示す。結果は、ＥＣＬシグナルの減少により評価して、ＩＧＨＪ４＊０１のＩＧＨＪ１＊０１、ＩＧＨＪ３＊０１、またはＩＧＨＪ５＊０１によるスワッピングにより、ＩＧＨＪ４＊０１ＪＨ生殖系列セグメント含有親テンプレート抗体に比較して、ＤＬＬ４に対する抗体の結合が低下したことを示す。さらに、ＥＣＬシグナルで評価して、ＩＧＨＤ５−１８＊０１のＩＧＨＤ５−１２＊０１またはＩＧＨＤ５−２４＊０１によるスワッピングにより、ＩＧＨＤ５−１８＊０１ＤＨ生殖系列セグメント含有親テンプレート抗体に比較して、ＤＬＬ４に対する抗体の結合が低下した。
Figure 0006007420
Figure 0006007420
実施例１４
肝細胞増殖因子受容体に対するＦａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−２１＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１の親和性成熟
エレクトロルミネセンス・メソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）マルチスポット結合アッセイを使って、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ；Ｃ−Ｍｅｔ）に対して特定されたＦａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−２１＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１（配列番号２８０３および５９４）に、上述の実施例７〜９に示すように親和性成熟を行った。実施例１Ｃに記載の方法を使って、オリゴ対の連結によりアミノ酸残基の変位導入を行った。
ｉ．ＣＤＲの潜在的結合部位の特定
親「Ｈｉｔ」ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−２１＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１の重鎖アミノ酸配列（配列番号２８０３）を、わずかに低い親和性であるがＨＧＦＲにも結合する３つの関連「Ｈｉｔ」の３つの重鎖アミノ酸配列（配列番号２７９７、２７９９および２８０１）と配列比較した。これらの４つのＦａｂは同じＶＨおよびＪＨ生殖系列セグメントを共有する。配列アラインメントを図５に示す。配列比較に基づいて、親「Ｈｉｔ」と関連「Ｈｉｔ」の間で違いがあり、それにより、親「Ｈｉｔ」と関連「Ｈｉｔ」の間のＨＧＦＲに対する結合の差異を説明できるアミノ酸残基を特定した。特定されたアミノ酸残基は、ＣＤＲ３中に位置しており、この位置は、結合親和性にとって重要な重鎖の領域であるとして特定された。
ｉｉ．重鎖ＣＤＲ３のアラニンスキャンニング
親Ｆａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−２１＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１（配列番号２８０３および５９４）の重鎖配列のＣＤＲ３に対しアラニン置換変異導入を行い、１００ｎＭ Ｆａｂ濃度でＥＣＬマルチスポットアッセイを使って解析した。結果を下表１１３に示す。ＥＣＬシグナルの減少で評価して、アミノ酸残基Ｅ９９、Ｖ１０２、Ｖ１０３、Ｖ１０４、およびＩ１０５のアラニン置換およびＡ１０６のトレオニン置換により、ＨＧＦＲに対する結合の顕著な低下が生じた。ＥＣＬシグナルの減少で評価して、Ｈ１００、Ｉ１０１、Ｉ１０７、およびＳ１０８のアラニンによる置換により、ＨＧＦＲに対する結合のわずかな低下が生じた。
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ｉｉｉ．Ｙ１１３のＮＮＫ変異誘発
Ｆａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−２１＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１Ｈ１００Ｅ／Ｓ１０８Ｐ（Ｈ：ＥＰ）＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１（配列番号５９３および５９４）の重鎖配列のアミノ酸残基Ｙ１１３に対し、ＮＮＫ変異誘発を行い、２０ｎＭ Ｆａｂ濃度でＥＣＬマルチスポットアッセイを使って解析した。結果を下表１１４に示す。ＥＣＬシグナルの増加からも明らかなように、ＥＰ変異体Ｙ１１３Ｇ、Ｙ１１３Ｉ、Ｙ１１３Ｓ、Ｙ１１３Ｔ、Ｙ１１３Ｎ、Ｙ１１３ＮおよびＹ１１３Ｗは、重鎖ＥＰに比べて、ＨＧＦＲに対する結合が強化された。
Figure 0006007420
ｉｖ．Ｙ１０９、Ｙ１１０、Ｙ１１１、Ｙ１１２およびＹ１１４のＮＮＫ変異誘発
Ｆａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−２１＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１ Ｈ１００Ｅ／Ｓ１０８Ｐ／Ｙ１１３Ｇ（ＥＰＧ）＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１（配列番号６０５および５９４）の重鎖配列のアミノ酸残基Ｙ１０９、Ｙ１１０、Ｙ１１１、Ｙ１１２およびＹ１１４のＮＮＫ変異誘発を行い、２０ｎＭＦａｂの濃度でＥＣＬマルチスポットアッセイを使って解析した。結果を下表１１５に示す。ＥＣＬシグナルの増加からも明らかなように、ＥＰＧ重鎖残基Ｙ１１０のイソロイシンへの置換により、重鎖ＥＰＧに比較して、ＨＧＦＲに対する結合が強化された。また、ＥＣＬシグナルのわずかな増加からも明らかなように、ＥＰＧ変異体Ｙ１０９Ｗ、Ｙ１１２、Ｙ１１２ＴおよびＹ１１２Ｗでは、重鎖ＥＰＧに比べて、ＨＧＦＲに対する結合がわずかに強化された。
Figure 0006007420
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ｖ．重鎖ＣＤＲ１のアラニンスキャンニング
Ｆａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−２１＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１ Ｈ１００Ｅ／Ｓ１０８Ｐ／Ｙ１１３Ｇ（Ｈ：ＥＰＧ）＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１（配列番号６０５および５９４）の重鎖配列のＣＤＲ１のアラニン置換変異導入を行い、２０ｎＭ Ｆａｂの濃度でＥＣＬマルチスポットアッセイを使って解析した。結果を下表１１６に示す。ＥＣＬシグナルの減少からも明らかなように、アミノ酸残基Ｆ２７およびＡ３３のアラニン置換により、ＨＧＦＲに対する結合の低下が起こった。ＥＣＬシグナルの増加、またはＥＣＬシグナルの無変化からも明らかなように、アミノ酸残基Ｇ２６、Ｔ２８、Ｆ２９、Ｓ３０、Ｓ３１、Ｙ３２、Ｍ３４、およびＳ３５のアラニンへの置換により、軽鎖中に変位を持たないＥＰＧ三重変異体に比べて、ＨＧＦＲに対する結合の改善が認められたか、またはＨＧＦＲに対する結合への影響がなかったかのいずれかであった。
Figure 0006007420
ｖｉ．重鎖ＣＤＲ２のアラニンスキャンニング
Ｆａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ２−２１＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１ Ｈ１００Ｅ／Ｓ１０８Ｐ／Ｙ１１３Ｇ（Ｈ：ＥＰＧ）＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１（配列番号６０５および５９４）の重鎖配列のＣＤＲ２のアラニン置換変異導入を行い、２０ｎＭ Ｆａｂの濃度でＥＣＬマルチスポットアッセイを使って解析した。結果を下表１１７に示す。減少したＥＣＬシグナルからも明らかなように、アミノ酸残基Ｉ５１、Ｇ５６、Ｙ５９、およびＡ６１のアラニンによる置換により、ＨＧＦＲに対する結合が低下した。また、ＥＣＬシグナルの減少からも明らかなように、二重変異体Ｓ４６Ａ／Ｇ４７Ａは、ＨＧＦＲに対する結合が低下した。ＥＣＬシグナルの増加、またはＥＣＬシグナルの無変化からも明らかなように、アミノ酸残基Ｇ５３、Ｓ５４、Ｇ５５、Ｓ５７、Ｔ５８、Ｙ６０、Ｄ６２、Ｖ６４およびＫ６５のアラニンによる置換により、軽鎖中に変位を含まないＨ：ＥＰＧ三重変異体に比べて、ＨＧＦＲに対する結合を改善したか、またはＨＧＦＲに対する結合に影響を与えなかったかのいずれかであった。
Figure 0006007420
実施例１５
Ｐ−カドヘリンおよびＥｐｏに対するＦａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１＆Ｏ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１の親和性成熟
実施例４に記載のようにエレクトロルミネセンス・メソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）マルチスポット結合アッセイを使って、Ｐ−カドヘリンおよびＥＰＯに対して特定されたＦａｂ ＶＨ３−２３＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＞３＿ＩＧＨＪ６＊０１＆Ｖ２−１３＿ＩＧＬＪ２＊０１（配列番号６８８および５９４）の親和性成熟を、上述の実施例７〜９に記載のように、行った。
ｖｉｉ．ＣＤＲ３アミノ酸残基Ｒ１０４、Ｙ１１０、Ｙ１１２、Ｙ１１３、およびＹ１１４のＮＮＫ変異誘発
ＣＤＲ３アミノ酸残基Ｒ１０４、Ｙ１１０、Ｙ１１２、Ｙ１１３、およびＹ１１４に対し、ＮＮＫ変異誘発を使って変位導入し、Ｐ−カドヘリンとＥＰＯに結合する能力をＥＣＬマルチスポットアッセイにより試験した。結果を下表１１８に示す。変異体−３Ｙは欠失変異体であり、チロシン１１０、１１１および１１２が欠失している。ＥＣＬ結合シグナルの増加からも明らかなように、アミノ酸残基Ｙ１１５のプロリン（Ｙ１１５Ｐ）への変異およびＹ１１０のバリン（Ｙ１１０Ｖ）への変異により、野生型テンプレート抗体に比べて、Ｐ−カドヘリンおよびＥＰＯの両方に対する結合が強化された。ＥＣＬ結合シグナルの増加からも明らかなように、アミノ酸残基Ｙ１１１のアルギニン（Ｙ１１１Ｒ）への変異により、野生型に比べて、Ｐ−カドヘリンに対する結合が強化された。さらに、下表１１８に示されるように、変異体Ｙ１１５Ｐ、Ｙ１１０ＶおよびＹ１１１Ｒは、全てＰ−カドヘリンに結合する。このことは、ＥＬＩＳＡ結合結果からも明らかである。
Figure 0006007420
実施例１６
ＣＨＯ細胞表面上に発現したＤＬＬ４に対する結合
この実施例では、Ｆａｂ Ｈ：ＡＰＦＦ ＶＬＴＨ＆Ｌ：ＮＤＨ ＬＳ（配列番号２０９および３５０；表７５に示されるように、約１．７ｎＭの親和性を示すと特定された）およびＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇ（配列番号４３０および５４３；表１０８に示されるように、約５ｎＭの親和性を示すと特定された）に対し、フローサイトメトリーで検出されたＣＨＯ細胞の表面上で発現したＤＬＬ４に結合する能力の試験を行った。ＤＬＬ４発現構築物を生成するために、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（配列番号２９３４）中のヒトＤＬＬ４相補ＤＮＡ（配列番号２９０５、受入番号ＢＣ１０６９５０；および配列番号２９０４で設定されたアミノ酸をコードするもの、受入番号ＡＡＩ０６９５１）をグリセロールストックとして、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（クローンＩＤ＃４００３４８８７）から入手した。このストックをカナマイシン寒天プレート上に線状に塗布し、ＤＮＡの精製のため、コロニーを採取した。Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｋ２１００１０）を使ってＤＮＡを得た。
完全長ＤＬＬ４をＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓベクターから消化物として取りだし、ｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ（配列番号２９３５；ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣａｔａｌｏｇ＃Ｋ６０１００１）中のＮｈｅＩとＮｏｔＩの間に挿入した。連結反応をＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔａｌｏｇ＃１１６３５３７９００１）で行い、細胞を熱ショックを使って、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｍａｘ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５αＴＭ−Ｔ１Ｒコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔａｌｏｇ＃１２２９７０１６）に形質転換した。細胞をカルベニシリンプレート上に選択した。コロニーを採取し、１：１０００の１００ｍｇ／ｍＬカルベニシリン含有ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地中で一晩播種した。ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｋ２１００１１）によりプラスミドＤＮＡを抽出した。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのリポフェクタミン（登録商標）トランスフェクション試薬を使って、完全長ＤＬＬ４およびｐＯＧ４４リコンビナーゼベクター（配列番号２９３６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｋ６０１００１）を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴを、Ｆｌｐ−ＩｎＴＭＳｙｓｔｅｍプロトコルに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＦｌｐ−ＩｎＴＭ−ＣＨＯ細胞株（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７５８０７）に形質移入した。細胞を１２ウエルプレート中で約９０％集密とした。２日後、形質移入した細胞を４００μｇ／ｍｌヒグロマイシンで選択した。５日後、コロニーを採取し、１０ｃｍ２組織培養皿に移した。これらの細胞株をヒグロマイシン選択により維持した。
Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｔ＃００−４５５５−５６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使って、完全長ＤＬＬ４および対照ＣＨＯ細胞を発現しているＣＨＯ細胞を組織培養プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ １０ｃｍ２）から取り出した。燐酸塩緩衝食塩水（２％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中の２％ウシ血清アルブミンで細胞を洗浄後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１０ｎＭ〜５０ｎＭ Ｆａｂを添加し、氷上で３０分間、インキュベートした。細胞を２％ＢＳＡ／ＰＢＳで１回洗浄し、マウス抗ヒトカッパＰＥ抗体（１：１００に希釈、Ｃａｔ＃ＭＨ１０５１４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはマウス抗ヒトラムダＰＥ抗体（１：１００に希釈、Ｃａｔ＃ＭＨ１０６１４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、氷上で１０分間、インキュベートした。二次抗体マウス抗ヒトカッパＰＥ単独（Ｆａｂなしの）をＤＬＬ４発現ＣＨＯ細胞用の対照として使用した。次に、細胞を２％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａを使ってフローサイトメトリーにより解析した。結果は、試験Ｆａｂは、ＣＨＯ細胞の表面上に発現したＤＬＬ４に結合することを示す。いずれのＦａｂもＤＬＬ４の高発現が無ければＣＨＯ細胞に顕著な結合を示さなかった。
実施例１７
フローサイトメトリーによるＤＬＬ４−Ｎｏｔｃｈ相互作用の抑制
この実施例では、ＤＬＬ４に対するＮｏｔｃｈ−Ｆｃの結合を遮断する能力により３つのＤＬＬ４結合Ｆａｂを機能的に選別した。このアッセイでは、Ｆａｂおよびビオチン化Ｎｏｔｃｈ−Ｆｃの両方の存在下、ＤＬＬ４発現ＣＨＯ細胞をインキュベートした。ストレプトアビジン−ＰＥを検出分子として使用した。Ｎｏｔｃｈ−ＦｃがＤＬＬ４発現ＣＨＯ細胞に結合する場合、これらの細胞は、５７８ｎｍのＰＥシグナルにより検出可能である。あるいは、ＦａｂがＮｏｔｃｈ−ＦｃのＤＬＬ４に対する結合を遮断する場合、ＤＬＬ４発現ＣＨＯ細胞は、標識されないか、または検出されない。試験Ｆａｂには、Ｈ：ＡＰＦＦ ＶＬＴＨ＆Ｌ：ＮＤＨＬＳ（配列番号２０９および３５０）、Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１（配列番号４３０および１０８）ならびにＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇ（配列番号４３０および５４３）が含まれる。
簡単に述べれば、完全長ＤＬＬ４（ＣＨＯ−ＤＬＬ４）を発現しているＣＨＯ細胞を、実施例１６に記載のように、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｔ＃００−４５５５−５６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使って組織培養プレートから採取した。Ｆａｂを５０ｎＭの出発濃度から開始する２％ＢＳＡ／ＰＢＳの５倍系列により希釈した。メーカーのインストラクションに従って、ＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬（ｃａｔ＃２０２１７．Ｐｉｅｒｃｅ）を使って、Ｎｏｔｃｈ−ＦＣ（ｃａｔ＃３６４７−ＴＫ−０５０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をビオチン化した。採取した細胞を２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の２５０ｎＭビオチン化Ｎｏｔｃｈ−ＦＣおよび３０μＬ Ｆａｂで３０分間、氷上で処理した。次に、ＰＥ−標識ストレプトアビジン（Ｃａｔ＃２１６２７、Ｐｉｅｒｃｅ−Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して１：５の最終希釈度にし、続けて、室温で１０分間インキュベーションを行った。次に、細胞を２％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａを使ってフローサイトメトリーにより分析した。
結果を下表１１９に示す。全３つのＦａｂは、ＣＨＯ−ＤＬＬ４に対するＮｏｔｃｈ−Ｆｃの結合を効果的に遮断する。Ｆａｂ Ｈ：ＡＰＦＦ ＶＬＴＨ＆Ｌ：ＮＤＨ ＬＳは、２ｎＭのＦａｂ濃度で、ＮｏｔｃｈのＤＬＬ４に対する結合を８０％遮断する。Ｆａｂ Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１は、５０ｎＭのＦａｂ濃度で、ＮｏｔｃｈのＤＬＬ４に対する結合を５０％遮断する。Ｆａｂ Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇは、５０ｎＭのＦａｂ濃度で、ＮｏｔｃｈのＤＬＬ４に対する結合を８０％遮断する。
Figure 0006007420
実施例１８
ＩｇＧクローニングおよび発現
この実施例では、ＤＬＬ４に結合するＦａｂ抗体をｐＦＵＳＥベクター中にクローン化することによりＩｇＧに変換した。簡単に述べれば、重鎖および軽鎖をコードする配列を別々にｐＦＵＳＥファミリーベクター（ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ２、Ｃａｔ＃ｐｆｕｓｅ−ｈｆｃ２、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；配列番号２９３８）の含有ＩＬ−２シグナル配列の後ろに挿入した。次に、これら２つのベクターを２９３Ｆ細胞に同時形質転換し、タンパク質を発現させ、精製した。
軽鎖：Ｆａｂ軽鎖をコードする配列（Ｎ末端大腸菌選別シグナルＭｅｔ Ａｌａを除く）をＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩ末端を含むプライマーでＰＣＲ増幅した。増幅Ｆａｂ軽鎖を、予めＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化したｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ２中にサブクローニングした。Ｆａｂ軽鎖は、直ちにＩＬ−２シグナル配列に従い、完全にｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ２中のＦｃ配列を置き換える。
重鎖：ＶＨとＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の間にＮｈｅＩ部位を含む完全長ＩｇＧ１重鎖配列（配列番号２９２２）をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社で合成し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ末端含有プライマーでＰＣＲ増幅し、予めＥｃｏＲＩとＮｈｅＩで消化したｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ２にサブクローニングした。ＸｂａＩおよびＮｈｅＩ適合性付着末端の連結反応により、この位置での両部位を除去し、ＩｇＧ１重鎖配列のＶＨとＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の間のＮｈｅＩ部位を特有のものにする。Ｆａｂ重鎖（Ｎ−末端大腸菌選別シグナルＭｅｔ Ａｌａを除く）をコードする配列をＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩ末端を含むプライマーでＰＣＲ増幅した。次に、完全長さＩｇＧ１重鎖を含むベクターをＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化させ、これにより、ＶＨ配列を除去し、増幅したＦａｂ重鎖を消化ベクターにサブクローニングした。従って、Ｆａｂ重鎖は、ＩＬ−２およびＩｇＧＩ重鎖の間にサブクローニングされた。
タンパク質発現および精製：ＩｇＧを産生するために、メーカーのインストラクションに従い、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｃａｔ＃１２３４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って、重鎖および軽鎖プラスミドを２９３Ｆ細胞（Ｃａｔ＃Ｒ７９０−０７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に同時形質移入した。無血清２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｃａｔ＃１２３３８０２６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた細胞を、５０ｍｌスピナーフラスコ中、１×１０６細胞／ｍｌで、形質移入した。トランスフェクションの３日後および６日後、細胞培地を採取し、タンパク質−Ｇセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使ったカラムクロマトグラフィーによる精製用として、一緒にプールした。ＩｇＧ溶出画分をプールし、ＰＢＳ中に透析した。
実施例１９
ＤＬＬ４−Ｎｏｔｃｈ相互作用による抗体のレポーターアッセイによる活性
この実施例では、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使って、２つのＤＬＬ４結合抗体のＤＬＬ４依存性Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達阻害能力を試験した。細胞表面上にＮｏｔｃｈ１の存在が既知のヒトグリオーマＴ９８Ｇ細胞（Ｐｕｒｏｗ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６５：２３５３−６３、参照）に、６つのＣプロモーター結合因子−１（ＣＢＦ−１）応答配列（配列番号２９３９に設定；Ｎｅｆｅｄｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００４）、Ｂｌｏｏｄ．１０３（９）：３５０３−１０、参照）を含むＮｏｔｃｈレポータープラスミド（ｐ６ｘＣＢＦ）に安定に形質移入することにより、レポーター細胞を生成した。続いて、ＤＬＬ４−ＣＨＯ細胞（上記実施例１６参照）のレポーターＴ９８Ｇ細胞への添加により、Ｎｏｔｃｈ１−ＤＬＬ４相互作用によるホタルルシフェラーゼの発現を起こさせる。従って、ＤＬＬ４結合抗体に起因するＮｏｔｃｈ１−ＤＬＬ４の分断により、ルシフェラーゼ発現が減少する。
Ａ．Ｎｏｔｃｈレポータープラスミド
６つのＣプロモーター結合因子−１（ＣＢＦ−１）応答配列（配列番号２９３９に設定；ＣＢＦＮｏｔｃｈ応答配列を太字で示す；ｇｇｔａｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｔａｇｃｇａｔｃｔｇｇｔｇｔａａａｃａｃｇｃｃｇｔｇｇｇａａａａａａｔｔｔａｔｇｇａｔｃｔｇｇｔｇｔａａａｃａｃｇｃｃｇｔｇｇｇａａａａａａｔｔｔａｔｇｇａｇｃｔｃｇｃｔａｇｃｇａｔｃｔｇｇｔｇｔａａａｃａｃｇｃｃｇｔｇｇｇａａａａａａｔｔｔａｔｇｇａｔｃｔｇｇｔｇｔａａａｃａｃｇｃｃｇｔｇｇｇａａａａａａｔｔｔａｔｇｃｔｃｇａｇｇａｔｃｔｇｇｔｇｔａａａｃａｃｇｃｃｇｔｇｇｇａａａａａａｔｔｔａｔｇｇａｔｃｔｇｇｔｇｔａａａｃａｃｇｃｃｇｔｇｇｇａａａａａａｔｔｔａｔｇａａｇｃｔｔ；）を含むレポーター構築物をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させた。次に、消化産物をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位で、ルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ４．２６（配列番号２９４０；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｅ８４４１）に挿入した。ｐＧＬ４．２６ベクターをヒグロマイシン選択し、これにより、安定に取り込まれたレポーターのコピーを有する細胞株の産生を促進する。また、ｐＧＬ４．２６の使用により、一時的なレポーターの形質移入および可変トランスフェクション効率の正規化の必要性がなくなる。
Ｂ．アッセイ
ＡＴＣＣ（Ｎｏ．ＣＲＬ−１６９０（登録商標））由来のＴ９８Ｇ細胞を、ウエル当たり、１０％胎仔ウシ血清（ＢＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Ｐ／Ｓ／Ｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の２０、０００細胞の量で９６ウエル組織培養プレートに播種した。
次の日、ホタルルシフェラーゼ（ｐ６ｘＣＢＦ）を発現しているＮｏｔｃｈレポーター構築物をＴ９８Ｇ細胞に形質移入し、安定組み込み体を２００ｕｇ／ｍｌヒグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で選択した。ＤＬＬ４または対照ＣＨＯ細胞を発現しているＣＨＯ細胞を１０％ＦＢＳとＰ／Ｓ／Ｇを補充したＦ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖した。１０％ＦＢＳとＰ／Ｓ／Ｇ補充ＥＭＥＭ中のＴ９８Ｇ Ｎｏｔｃｈレポーター細胞（２×１０５細胞／ウエル）を、９６ウエル組織培養プレートに別々に播種した。Ｎｏｔｃｈ発現Ｔ９８Ｇ細胞をＣＨＯ−ＤＬＬ４または対照ＣＨＯ細胞（１×１０５細胞／ウエル）により刺激した。Ｔ９８Ｇ細胞の培地を１００μｌのＰ／Ｓ／Ｇ補充無血清Ｆ１２培地で置換した。Ｆａｂ Ｈ：ＡＰＦＦ ＶＬＴＨ＆Ｌ：ＮＤＨ ＬＳ（配列番号２０９および３５０）およびＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇ（配列番号４３０および５４３）ならびにそれらに対応するＩｇＧ、ならびに対照Ｆａｂ（ＤＬＬ４に結合しない；ＶＨ６−１＿ＩＧＨＤ６−１３＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１およびＶ２−１７＿ＩＧＬＪ２＊０１（それぞれ、配列番号２１５２と２９４１に設定））を１００、２０、４および０．８ｎＭ濃度で添加した。さらに、非親和性成熟生殖系列親Ｆａｂも試験し、Ｎｏｔｃｈレポーター応答を測定した。このため、対応するＩｇＧのＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１（配列番号８９と１０８に設定；Ｈ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇの親生殖系列Ｆａｂ）ならびにＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号８８と１０７に設定；Ｈ：ＡＰＦＦ ＶＬＴＨ＆Ｌ：ＮＤＨ ＬＳ親生殖系列Ｆａｂ）を対照ＩｇＧとして、２００、１００および２０ｎＭの濃度で添加した。
２４時間後、ルシフェラーゼレポーター発現をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｃａｔ＃Ｅ２６２０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って測定した。発光をＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ＩＩ ｍｏｄｅｌ １４２０プレートリーダーを使って読み取った。各条件を４回行った。
結果を下表１２０に示す。表１２０の結果は、ＣＨＯ−ＤＬＬ４を有するＴ９８Ｇレポーター細胞のインキュベーションにより、ＣＨＯ細胞単独でインキュベートしたものに比べて、Ｎｏｔｃｈ１レポーターレベルが８〜９倍増加したことを示す。Ｎｏｔｃｈ１活性化は、ＤＬＬ４に結合しない対照Ｆａｂの存在下でも、一定のままであった。抗ＤＬＬ４抗体Ｆａｂ Ｈ：ＡＰＦＦ ＶＬＴＨ＆Ｌ：ＮＤＨ ＬＳおよびＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇの濃度増大条件下で、その活性化は減少した。減少はＩｇＧバージョンのＨ：ＡＰＦＦ ＶＬＴＨ＆Ｌ：ＮＤＨ ＬＳ（ＩＣ５０は約６ｎＭ）では、さらに顕著であり、対応するＦａｂよりも１０倍以上も効率的であった。ＩｇＧバージョンのＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇはまた、対応するＦａｂよりも効率的であり、０．８ｎＭでＮｏｔｃｈ１活性化の約３０％の減少を示した。さらに高濃度（＞１００ｎＭ）でも、どのＦａｂまたはＩｇＧ型のＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇも、Ｎｏｔｃｈ１活性化の完全な阻害を示さなかった。結果は、ＩｇＧＨ：ＡＰＦＦ ＶＬＴＨ＆Ｌ：ＮＤＨ ＬＳは、ＤＬＬ４−Ｎｏｔｃｈ活性化の完全な阻害剤であり、一方、ＩｇＧＨ：ＫＴ ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ Ｓ５２Ｇは、ＤＬＬ４−Ｎｏｔｃｈ活性化の部分アンタゴニストであることを示している。
Figure 0006007420
変更は、当業者には明らかであるので、本発明は、添付の請求項の範囲によってのみ限定されることが意図されている。

Claims (65)

  1. 標的抗原に対する１次抗体またはその抗原結合部の親和性成熟方法であって、
    ａ）対応する型の１次抗体よりも低下した標的抗原に対する活性を示す関連抗体またはその抗原結合部をアドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーを選別することにより特定するステップであって、関連抗体またはその抗原結合部が、関連可変重鎖または関連可変軽鎖を含み、
    関連抗体またはその抗原結合部の対応する可変重鎖または可変軽鎖の内の１つが、１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖に対する少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を示すが、それに対する１００％の配列同一性を示さない抗体であるか；または
    関連抗体またはその抗原結合部の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同じおよび／または少なくとも１つの可変軽鎖をコードする核酸分子のＶκおよびＪκもしくは少なくとも１つのＶλおよびＪλ生殖系列セグメントが１次抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶκおよびＪκもしくはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントに同じである抗体であるかのいずれかであるステップ；
    ｂ）１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列を比較するステップ；
    ｃ）１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖内の標的領域を特定するステップであって、標的領域が関連抗体またはその抗原結合部中の同じ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の差異を示すステップ；
    ｄ）それぞれ、可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数の改変抗体またはその抗原結合部を産生するステップであって、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖がその標的領域内で単一アミノ酸残基の置換により改変され、それによりそれぞれの複数の抗体またはその抗原結合部中の標的領域が、１次抗体またはその抗原結合部に比べてアミノ酸の別のアミノ酸への置換を含むステップ；
    ｅ）複数の改変抗体またはその抗原結合部のそれぞれを標的抗原に対する活性により選別するステップ；ならびに
    ｆ）１次抗体またはその抗原結合部に比較して標的抗原に対する活性増加を示す改変抗体またはその抗原結合部を選択するステップ、を含む方法であって、
    Ａ）前記１次抗体またはその抗原結合部が、コンビナトリアル抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗原結合抗体フラグメントライブラリーの選別により特定され、
    Ｂ）前記コンビナトリアルライブラリーが、
    ｉ）インフレームでのＶ Ｈ 、Ｄ Ｈ およびＪ Ｈ ヒト生殖系列セグメントまたはその一部を組み合わせてＶＨ鎖またはその一部をコードする核酸分子の配列を生成するステップ、
    ｉｉ）インフレームのＶ κ およびＪ κ ヒト生殖系列セグメントもしくはその一部、またはＶ λ およびＪ λ 生殖系列セグメントもしくはその一部を組み合わせて、ＶＬ鎖またはその一部をコードする核酸分子の配列を生成し、
    ステップｉ）およびｉｉ）で、Ｖ Ｈ 、Ｄ Ｈ 、Ｊ Ｈ 、Ｖ κ 、Ｊ κ 、Ｖ λ またはＪ λ の各部分が、抗原結合部位を形成するのに充分なＶＨまたはＶＬもしくはその一部を含む抗体またはその抗原結合部を産生するのに充分であるステップ、
    ｉｉｉ）ステップｉ）およびｉｉ）を複数回繰り返して、複数の異なる核酸分子の配列を生成するステップ、
    ｉｖ）核酸分子を合成して２つのライブラリーを作製し、
    第１のライブラリーが、ＶＨ鎖またはその一部をコードする核酸分子を含み；および
    第２のライブラリーが、ＶＬ鎖またはその一部をコードする核酸分子を含むステップ、
    ｖ）第１のライブラリー由来および第２のライブラリー由来の核酸分子を細胞中に導入し、これを複数回繰り返して細胞のライブラリーを作製するステップであって、各細胞が細胞ライブラリー中の少なくともいくつかの細胞間で異なる組み合わせのＶＨおよびＶＬをコードする核酸分子を含むステップ、および
    ｖｉ）細胞を増殖して各細胞中で抗体またはその抗原結合部を発現させ、それにより複数の抗体またはその抗原結合部を産生するステップであって、ライブラリー中の各異なる抗体またはその抗原結合部が、異なる組み合わせのＶＨおよびＶＬ鎖または抗原結合部位を形成するのに充分なその部分を含むステップ、を含む方法により作製され、かつ、
    Ｃ）ライブラリーの選別を、
    ｉ）ライブラリー中の抗体またはその抗原結合部を標的タンパク質と接触させ、
    ｉｉ）抗体またはその抗原結合部の標的タンパク質に対する結合および／または抗体またはその抗原結合部が標的タンパク質の機能活性を調節するかどうかを評価し、かつ、
    ｉｉｉ）標的タンパク質に対し活性を示す抗体またはその抗原結合部を特定する（特定された抗体またはその抗原結合部が１次抗体である）ことにより実行し、
    １次抗体またはその抗原結合部のためのライブラリーがアドレス指定できるライブラリーであり、それにより：
    ステップｉｖ）で、合成核酸配列が個別にアドレス指定され、それにより、第１のアドレス指定される核酸ライブラリーおよび第２のアドレス指定される核酸ライブラリーを生成し；
    ステップｖ）で、細胞がアドレス指定され、各座位が、アドレス指定される細胞ライブラリー中の全ての他の細胞からのＶＨおよびＶＬの異なる組み合わせをコードする核酸分子を含む細胞を含み；かつ、
    ステップｖｉ）で、複数の抗体またはその一部がアドレス指定され、
    ここで、ライブラリー中の各座位の抗体またはその一部が、同じ抗体であり、また、各および全ての他の座位のものと異なり；かつ、
    抗体またはその一部の同一性をそのアドレスにより知ることができ、
    ここで、アドレス指定できるライブラリー中の抗体が空間アレイ中に配置され、アレイの各個別座位が異なる抗体メンバーに対応する、方法。
  2. ｄ）において、複数の改変抗体またはその抗原結合部が１次抗体またはその抗原結合部の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することにより産生され、ここで、核酸分子が非改変可変重鎖または可変軽鎖と比較して異なるアミノ酸をコードする標的領域中のアミノ酸をコードする１つのコドン含み、それにより複数の各核酸分子が単一アミノ酸残基の置換により、標的領域中で改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする、請求項１に記載の方法。
  3. １次抗体またはその抗原結合部中の標的領域が、関連抗体またはその抗原結合部の対応する領域に比べて、１〜１０アミノ酸差異を示す、請求項１に記載の方法。
  4. 関連抗体またはその抗原結合部が１〜５個の関連抗体またはその抗原結合部である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 活性が、
    ｉ．結合、
    ｉｉ．シグナル伝達、
    ｉｉｉ．分化、
    ｉｖ．遺伝子発現の変化、
    ｖ．細胞増殖、
    ｖｉ．アポトーシス、
    ｖｉｉ．走化性、
    ｖｉｉｉ．細胞障害性、
    ｉｘ．癌細胞浸潤、
    ｘ．内皮細胞増殖、ならびに
    ｘｉ．管形成
    からなる群から選択され、
    前記結合は、イムノアッセイ、全細胞パニング、および表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）から成る群から選択される方法により評価され、
    前記イムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および電気化学発光測定法から成る群から選択され、
    前記電気化学発光測定法は、メソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. Ｆａｂ型である場合、１次抗体またはその抗原結合部が、１０−４Ｍ以下の結合親和性で標的抗原に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. Ｆａｂ型である場合、１次抗体またはその抗原結合部が、１０−６Ｍ以下の結合親和性で標的抗原に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  8. Ｆａｂ型である場合、１次抗体またはその抗原結合部が、１０−８Ｍ以下の結合親和性で標的抗原に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  9. 関連抗体またはその抗原結合部が、１次抗体またはその抗原結合部の結合親和性よりも低い結合親和性を示し、それにより、Ｆａｂ型の関連抗体またはその抗原結合部の結合親和性が、１０−４Ｍ以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 関連抗体またはその抗原結合部が、１次抗体またはその抗原結合部の結合親和性よりも低い結合親和性を示し、それにより、Ｆａｂ型の関連抗体またはその抗原結合部の結合親和性が、１０−６Ｍ以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  11. 関連抗体またはその抗原結合部が、１次抗体またはその抗原結合部の結合親和性よりも低い結合親和性を示し、それにより、Ｆａｂ型の関連抗体またはその抗原結合部の結合親和性が、１０−８Ｍ以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  12. 関連抗体またはその抗原結合部が、対応する型の１次抗体またはその抗原結合部より８０％以下の活性を示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 関連抗体またはその抗原結合部が、対応する型の１次抗体またはその抗原結合部より６０％以下の活性を示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  14. 関連抗体またはその抗原結合部が、対応する型の１次抗体またはその抗原結合部より４０％以下の活性を示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  15. 関連抗体またはその抗原結合部が、陰性対照に比べて、同じまたは類似のレベルの標的抗原に対する活性を示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  16. 標的領域が１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 標的領域が１次抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  18. 標的領域が１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われ、かつ、別々かつ独立に、標的領域が１次抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  19. 対応する関連可変重鎖を含む関連抗体またはその抗原結合部が、対応する関連可変軽鎖を含む関連抗体またはその抗原結合部とは異なる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 対応する関連可変重鎖を含む関連抗体またはその抗原結合部が、対応する関連可変軽鎖を含む関連抗体またはその抗原結合部と同じである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  21. １次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列が、対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を示す、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. １次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列が、対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の配列同一性を示す、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  23. １次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列が、対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を示す、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  24. １次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖が、対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を示す、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  25. 関連抗体またはその抗原結合部が、関連可変重鎖または可変軽鎖を含み、１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、関連抗体またはその抗原結合部の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同じ抗体である；および／または少なくとも１つのＶκおよびＪκまたは１次抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶλおよびＪλ生殖系列セグメントが、関連抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶκおよびＪκまたはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントと同じ抗体である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 標的抗原が、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸、および小分子からなる群から選択される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 標的抗原が、ウイルス、細菌、腫瘍または他の細胞の表面上に発現しているものであるか、もしくは組換え型タンパク質またはペプチドである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 標的抗原が、治療介入用の標的であるタンパク質である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 治療介入用の標的は、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞増殖因子受容体１、２、および３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体；ＨＧＦＲとしても知られる）、ＤＬＬ４、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体）、ＫＩＴ（ｃ−ｋｉｔ受容体）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４（繊維芽細胞増殖因子受容体１、２、および４）、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ；マクロファージ刺激１受容体としても知られる）、ＴＥＫ（内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ）、ＴＩＥ（イムノグロブリンおよび上皮増殖因子相同領域受容体を備えたチロシンキナーゼ）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１（エリトロポイエチン産生肝細胞受容体Ａ１、Ａ２およびＢ１）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＮＯＴＣＨ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ、ＥＰＯ−Ｒ、カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５２、ＣＤ４４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、リンホトキシン（ＬＴ）、ＩｇＥ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦならびにＥＰＯからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. 標的抗原が、細胞増殖および分化、細胞遊走、アポトーシスまたは血管新生に関与する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  31. 標的領域中のアミノ酸残基のサブセットが、アミノ酸置換により改変される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 標的領域内の１次抗体と関連抗体の間で異なるアミノ酸残基のみが、アミノ酸置換により改変される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 標的領域内の１次抗体と関連抗体の間で同じアミノ酸残基のみが、アミノ酸置換により改変される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  34. 標的領域中の全てのアミノ酸残基がアミノ酸置換により改変される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  35. 標的領域中で改変される各アミノ酸残基が、全１９の他のアミノ酸残基、または制限されたそのサブセットに改変される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. アミノ酸置換不含１次抗体に比べて、改変抗体で変えられたアミノ酸改変を決定するステップをさらに含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記方法が反復繰り返され、その後の親和性成熟のために、前記改変抗体またはその抗原結合部が、前記１次抗体またはその抗原結合部としてステップａ）で選択されかつ使用される、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 選択した改変抗体またはその抗原結合部の１つ以上の可変重鎖または１つ以上の可変軽鎖の標的領域中の１つ以上のアミノ酸置換が、さらなる改変抗体またはその抗原結合部を産生するために組み合わせられ、それにより、前記さらなる改変抗体、またはその抗原結合部が、さらなる改変抗体またはその抗原結合部を特定するために、標的抗原に対する活性により選別され、これは１次抗体またはその抗原結合部ならびに選択された改変抗体またはその抗原結合部に比較して、標的抗原に対する活性の増加を示す、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む抗体その抗原結合部が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、ｓｃＦｖ断片、ならびにｓｃＦａｂ断片からなる群から選択される、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 関連抗体またはその抗原結合部が、関連可変重鎖または可変軽鎖を含み、１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、関連抗体またはその抗原結合部の可変重鎖をコードする核酸分子のＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントの１つと同じ遺伝子ファミリー由来である；および／または少なくとも１つのＶκおよびＪκまたは１次抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶλおよびＪλ生殖系列セグメントが、関連抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖をコードする核酸分子のＶκおよびＪκまたはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントの１つと同じ遺伝子ファミリー由来である、請求項１に記載の方法。
  41. 前記標的領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  42. 空間アレイがマルチウェルプレートである、請求項１に記載の方法。
  43. 前記抗体が、フィルター、チップ、スライド、ビーズおよびセルロースからなる群から選択される固体支持体に結合し、異なる抗体メンバーが、その表面に固定される、請求項１又は４２に記載の方法。
  44. 複数の核酸分子が、ＰＣＲ変異誘発、カセット変異導入、部位特異的変異誘発、ランダム点変異誘発、ウラシル含有テンプレートを使った変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを使った変異誘発、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使った変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、および二重鎖切断修復からなる群から選択される方法により生成される、請求項２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 複数の核酸分子が、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＮ、ＮＮＹ、およびＮＮＲ変異誘発からなる群から選択される方法により生成される、請求項２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
  46. ステップｄ）の前に、
    ｇ）１次抗体またはその抗原結合部の系統的変異導入を行うステップで、可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数の改変抗体またはその抗原結合部を産生するステップであって、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖またはその一部が、標的領域の単一アミノ酸残基のスキャンアミノ酸残基による置換により改変され、それにより、複数の抗体またはその抗原結合部がそれぞれ、１次抗体またはその抗原結合部と比べて標的領域中にアミノ酸置換を含むステップ、
    ｈ）標的抗原に対する活性により複数の改変抗体またはその抗原結合部のそれぞれを選別するステップ、および、
    ｉ）アミノ酸置換不含の１次抗体またはその抗原結合部に比較して、標的抗原に対する活性の保持または増加を示す改変抗体またはその抗原結合部の中から２次抗体またはその抗原結合部を選択し、それにより、ステップｂ）で１次抗体またはその抗原結合部の代わりに２次抗体またはその抗原結合部が使用されるステップ、
    をさらに含む請求項１に記載の方法。
  47. スキャンアミノ酸は、アラニン、トレオニン、プロリン、グリシン、および非天然のアミノ酸からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. ステップｇ）で複数の改変抗体またはその抗原結合部が、標的領域を含む改変型の１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することにより産生され、核酸分子が、スキャンアミノ酸をコードしない非改変可変重鎖または可変軽鎖の対応するコドンに比べて、標的領域中のスキャンアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより各複数の核酸分子が、標的領域内の単一アミノ酸残基の同じスキャンアミノ酸残基による置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする、請求項４６に記載の方法。
  49. 対応する型の１次抗体またはその抗原結合部の少なくとも７５％以上の活性を示す２次抗体またはその抗原結合部が選択される、請求項４６または４８に記載の方法。
  50. 対応する型の１次抗体またはその抗原結合部の少なくとも８０％以上の活性を示す２次抗体またはその抗原結合部が選択される、請求項４６または４８に記載の方法。
  51. 対応する型の１次抗体またはその抗原結合部の少なくとも８５％以上の活性を示す２次抗体またはその抗原結合部が選択される、請求項４６または４８に記載の方法。
  52. 対応する型の１次抗体またはその抗原結合部の少なくとも９０％以上の活性を示す２次抗体またはその抗原結合部が選択される、請求項４６または４８に記載の方法。
  53. 対応する型の１次抗体またはその抗原結合部の少なくとも９５％以上の活性を示す２次抗体またはその抗原結合部が選択される、請求項４６または４８に記載の方法。
  54. ステップｉ）の後に、２次抗体またはその抗原結合部中で、アミノ酸置換不含１次抗体に比べて、中性アミノ酸を含むように改変されたアミノ酸残基位置を決定することをさらに含む、請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  55. 標的領域中のアミノ酸残基のサブセットが、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される、請求項４６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 標的領域内の１次抗体またはその抗原結合部と関連抗体またはその抗原結合部の間で異なるアミノ酸残基のみが、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される、請求項４６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  57. 標的領域内の全てのアミノ酸が、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される、請求項４６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  58. 選択された改変抗体またはその抗原結合部が、１次抗体またはその抗原結合部に比べ、２倍またはそれを超えて改善された標的抗原に対する活性を示す、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 選択された改変抗体またはその抗原結合部が、１次抗体またはその抗原結合部に比べ、５倍またはそれを超えて改善された標的抗原に対する活性を示す、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
  60. 選択された改変抗体またはその抗原結合部が、１次抗体またはその抗原結合部に比べ、１０倍またはそれを超えて改善された標的抗原に対する活性を示す、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
  61. 選択された改変抗体またはその抗原結合部が、１次抗体またはその抗原結合部に比べ、１００倍またはそれを超えて改善された標的抗原に対する活性を示す、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
  62. 改変抗体またはその抗原結合部が１次抗体またはその抗原結合部の結合親和性よりも大きく、また、１ｘ１０−９Ｍ以下の結合親和性を示す、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. １次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖にステップａ）〜ｆ）を実行し、それぞれ標的領域にアミノ酸置換を含む１次改変抗体またはその抗原結合部を選択し；
    １次抗体の可変軽鎖に、独立かつ別々にステップａ）〜ｆ）を実行し、それぞれ標的領域にアミノ酸置換を含む２次改変抗体またはその抗原結合部を選択し；
    １次改変抗体またはその抗原結合部の可変重鎖を２次改変抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖と結合して、それぞれ可変重鎖および可変軽鎖の標的領域内のアミノ酸置換を含む複数の異なる３次改変抗体またはその抗原結合部を生成し；かつ、
    標的抗原に対する結合により複数の３次改変抗体またはその抗原結合部をそれぞれ選別し；かつ、
    １次および２次改変抗体に比較して、標的抗原に対する活性の増加を示す３次改変抗体またはその抗原結合部を選択することを含む請求項１に記載の方法。
  64. ステップｆ）で１次改変抗体またはその抗原結合部を選択後：
    ｊ）さらなる変異誘発のために、１次改変抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖内の別の異なる領域を選択するステップ；
    ｋ）１次改変抗体またはその抗原結合部の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生するステップであって、核酸分子が、選択領域中に、１次改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、複数の各核酸分子が単一アミノ酸残基の置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードするステップ；
    ｌ）それぞれ可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数のさらなる改変抗体またはその抗原結合部を産生するステップであって、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖がステップｋ）で産生されたものであり、それにより、それぞれ複数の抗体またはその抗原結合部の選択領域が、１次改変抗体またはその抗原結合部に比べて、アミノ酸の異なるアミノ酸への置換を含むステップ；
    ｍ）標的抗原に対する結合により、それぞれ複数のさらなる改変抗体またはその抗原結合部を選別するステップ；および
    ｎ）１次改変抗体またはその抗原結合部に比べて、標的抗原に対する活性の増加を示すさらなる改変抗体またはその抗原結合部を選択するステップ、
    をさらに含む請求項１に記載の方法。
  65. 前記さらなる異なる領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群から選択される請求項６４に記載の方法。
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