JP6004515B2

JP6004515B2 - 酵素の活性測定方法

Info

Publication number: JP6004515B2
Application number: JP2012034045A
Authority: JP
Inventors: 茂出口; 美紀子津留; 和紀名垣; 眠戸高; 康紀黒澤
Original assignee: Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co Ltd; Japan Agency for Marine Earth Science and Technology
Current assignee: Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co Ltd; Japan Agency for Marine Earth Science and Technology
Priority date: 2012-02-20
Filing date: 2012-02-20
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2032-02-20
Also published as: EP2818559A1; JP2013169163A; WO2013125579A1; US20150050680A1; EP2818559A4

Description

本発明は、基質が水に不溶性または難溶解性である酵素の活性測定方法に関する。

酵素の活性は、通常は、酵素が水中に溶解または分散している基質に作用したことで生じる化合物を各種クロマトグラフィーや分光学手法などによって測定される。

ところが、セルロースのような水不溶性の基質に作用する酵素の場合には、基質が水に溶解しないので、上記手法を簡単に適用することができない。また、水中に分散した基質に対する酵素の反応については、適用反応が不均一系で進行するために反応速度が遅い、基質の構造特性（結晶化度や比表面積など）が反応速度に大きく影響する、検出感度が低いといった問題もある。

上記方法に替えて、水不溶性基質に対する酵素による加水分解に伴って生じる質量減少に注目して、酵素活性を測定する方法がある（非特許文献１）。

ＷＯ２００５／０８３０５６

S. Ahola, X. Turon, M. Osterberg, J. Laine, O. J. Rojas, Langmuir 24, 11592-11599 (2008). S. Deguchi, M. Tsudome, Y. Shen, S. Konishi, K. Tsujii, S. Ito, K. Horikoshi, Soft Matter, 3 (9), 1170-1175 (2007). S. Hirano, R. Yamaguchi, Biopolymers 15, 1685-1691 (1976).

しかし、非特許文献１に記載の方法は、基質を水中に分散等する必要がない方法ではあるが、感度が低い、多量の酵素溶液を必要とする、ハイスループット化が困難などの問題があった。

そこで本発明は、基質が水に不溶性または難溶解性である酵素の新たな活性測定方法を提供することを目的とする。特に本発明は、感度が高く、反応が迅速で、少量の酵素でのリアルタイム測定が可能であり、ハイスループット化が容易である、基質が水に不溶性または難溶解性である酵素の新たな活性測定方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、水に不溶性または難溶解性である基質を分散質とし、必要に応じて水を分散媒として含むゲル状固体の表面に酵素溶液を滴下した際に、凹みが形成することを見出した。さらに凹みの体積を測定することによって、水に不溶性または難溶解性である基質に作用する酵素の活性を、極微量の酵素溶液を用いて高感度、迅速、リアルタイム、ハイスループットに評価できうることを見出し、本発明を完成させた。

本発明によれば、基質が水に不溶性または難溶解性である酵素の活性を、酵素溶液量がピコリットルのレベルであっても、高感度、迅速、リアルタイム、かつハイスループットに測定することができる。

図１は、ゲル体表面に形成された凹みの２次元像（左、上部の数字は滴下した溶液量、スケールバーは５０μｍ）および３次元像（右、スケールバーは２００μｍ）である。図２は、凹み体積とゲル体に滴下したセルラーゼ溶液量との相関を示す。図３は、凹み体積の時間変化を示す。

本発明の酵素の活性を測定する方法は、
(1)分散質の少なくとも一部が前記酵素の基質からなるゲル体の表面の一部に所定量の前記酵素を配置し、
(2)前記酵素の作用により前記ゲル体表面に形成された凹みを計測し、
(3)計測結果および前記所定量に基づいて前記酵素の活性を算出する、
ことを含む方法である。

＜評価対象の酵素＞
本発明の方法において、測定対象となる酵素は、その作用基質が水に不溶性または難溶解性のものである。本発明において水に不溶性または難溶解性とは、
２５℃での水への溶解度が、１ｍｇ／ｍＬ以下であることを意味する。また本来、水に溶解する基質を、化学架橋、物理架橋などの操作で不溶化したものも含まれる。

上記酵素の例としては、例えば、セルラーゼ、キチナーゼ、アガラーゼ、マンナナーゼ、アルギナーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼなどを挙げることができる。但し、対象の酵素は、これら例示された酵素に限定される意図ではない。

酵素の基質は、重合体化合物(例えば、多糖類、たんぱく質)または油脂であることができる。基質が重合体化合物である場合、水に不溶性または難溶解性であるという観点からは、１万〜５００万の範囲の(数または質量)平均分子量を有する化合物重合体であることができる。但し、この範囲に限定される意図ではない。尚、水に不溶性または難溶解性の重合体化合物は、分子中にグリコシド結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合等で多数の基が重合した化合物であることが多く、従って、上記酵素は、前記基質を加水分解する酵素または前記基質を酸化分解する酵素であることができる。また、油脂は分子内にエステル結合を有しており、油脂を基質とするリパーゼは、油脂のエステル結合を加水分解する酵素である。

本発明の方法においては、「分散質の少なくとも一部が酵素の基質からなるゲル体」を用いる。高感度で迅速な測定が可能であるという観点から、好ましくは「分散質の全部が酵素の基質からなるゲル体」を用いる。尚、本発明においてゲルとは、分散質が架橋してネットワークを形成した状態、あるいはゲル化剤からなる３次元ネットワークの編目内部に基質が保持された状態をいう。分散質の架橋方法には特に制限はなく、共有結合であっても、分子間力であっても、その両者であってもよい。

水に不溶性または難溶解性の基質は、例えば、多糖類（例えば、セルロース、キチン、寒天）、たんぱく質(例えば、卵白たんぱく質、ゼラチン）、油脂（例えば植物油、動物油、鉱物油、脂質）等を挙げることができる。しかし、これらに限定される意図ではない。これらの基質を原料として用いて、基質の種類に応じた方法で、ゲル体を得ることができる。尚、酵素の基質以外の分散質として、例えば、１２−ヒドロキシステアリン酸やジイソステアリルリン酸金属塩などの油ゲル化剤等を含有させることもできる。例えば、基質が油脂の場合には、これらの油ゲル化剤を用いてゲル体の分散質を形成することができる。油脂に対して、油脂の種類によるが、0.1〜10質量%の油ゲル化剤を添加することで、本発明の方法に適したゲル体の分散質を形成することができる。

ゲル体は、分散質が酵素の基質からなり、ゲル体の空孔は、空気等の気体で満たされていても、あるいは水や緩衝液等が充填されていてもよい。但し、本発明の方法で用いる分散質の少なくとも一部が基質からなるゲル体は、分散媒として水を含有するゲル体、ヒドロゲル体であることが望ましい。これによって少量の基質の酵素による反応、例えば、加水分解によって、大きな体積変化が得られ、凹みの検出感度および測定精度が向上する。

感度および反応速度を向上させるためには、ゲル体中の基質（分散質）含有量が低いほうが望ましいが、低くなりすぎるとゲル体の力学的強度が低下し取り扱いが困難、ゲル体表面に存在する水の影響で酵素溶液が良好に滴下できないなどの問題が生じる。一方、基質（分散質）含有量が高すぎる場合には、ゲル体の調製が困難、反応速度が遅く活性評価中に水分の蒸発によって基質表面が変形し凹みの定量が困難になるなどの問題が生じる。

本発明では基質を質量濃度で、例えば、０．１質量％から３０質量％、より望ましくは０．５質量％から２０質量％含むゲル状固化物が、反応基質として良好に使用することができる。本発明に用いるゲル状の固化物の形状は制限されないが、凹みの検出下限は基質表面の粗さで規定されることから、検出感度を上げるためには基質からなるゲル体表面の二乗平均平方根粗さが、例えば、２μｍ以下であることが望ましく、より好ましくは、０．１〜１．０μｍの範囲である。

基質がセルロースである場合、ゲル体は、例えば、分散質がセルロース分子であるゲル状の構造体であることができ、例えば、特許文献１、非特許文献２に記載の方法に従って作製、もしくはバクテリアセルロースを使用することができる。
基質がキチンである場合、ゲル体は、例えば、分散質がキチン分子であるゲル状の構造体であることができ、例えば、非特許文献３に従って作製することができる。

基質が寒天またはゼラチンである場合、ゲル体は、寒天ゲルまたはゼラチンゲルであることができ、例えば、市販の寒天（和光純薬工業製）または市販のゼラチン（和光純薬工業製）を熱水に溶解後、室温まで冷却・固化させて調製することができる。
基質が卵白たんぱく質である場合、ゲル体は、例えば、卵白たんぱく質ゲルからなるゲル状の構造体であることができ、例えば、鶏卵を、水浴中で１５分間煮沸して調製することができる。

上記ゲル体の表面の一部に所定量の前記酵素を配置する。配置する酵素の所定量は、酵素および基質の種類、所要の反応時間等を考慮して適宜決定できる。配置する酵素を所定量、即ち、量としては任意であるが、予め決めた量を用いることで、後続の工程で凹みの計測結果に基づいて、所定量の酵素で得られる基質の分解等の程度を計算でき、その結果、酵素の活性を算出することができる。ここで、酵素の活性とは、単位量の酵素が単位時間当たり示す基質の反応量を意味する。酵素の単位量は、酵素の質量であっても、酵素を含有する溶液の体積であることもできる。酵素を含有する溶液の体積である場合、酵素を含有する溶液中の酵素の含有量が分かれば、酵素の質量当たりの酵素活性も算出できる。

前記ゲル体表面への酵素の配置は、例えば、前記酵素を含有する溶液を滴下または噴射することにより行うことができる。さらに、酵素を含有する溶液の滴下または噴射量は、特に制限はなく、酵素の活性や濃度によって適宜選択されるが、例えば、1pL〜1nLの範囲とすることができる。滴下または噴射量の下限は、滴下または噴射後に酵素の作用で生じる凹みの検出感度に応じて引き下げることができ、1pLとすることも可能である。また、滴下または噴射量の上限は、特になく、迅速かつリアルタイムな測定という観点からは、滴下または噴射量は比較的少量であることの方が好ましく、10pL程度の量であれば、十分高感度での測定が可能である。高感度、迅速、リアルタイム、かつハイスループットな測定という観点からは、酵素を含有する溶液の滴下または噴射量は、1pL〜1nLの範囲とすることが好ましく、1pL〜100pLの範囲とすることがより好ましい。酵素反応は、室温で行うこともできるが、目的とする酵素の活性に応じて、冷却下または加熱下でも実施でき、酵素反応の温度範囲としては、例えば、0〜100℃の範囲とすることができる。

＜測定手法＞
本発明の酵素活性測定方法において、反応の進行度合いが、酵素加水分解によってゲル体表面に形成される凹みを計測することで測定される。凹みの計測としては、例えば凹みの形状および体積を測定する方法、凹み形成に伴うゲル体の光透過率の変化を測定する方法、凹み形成に伴うゲル体表面の光反射率の変化を測定する方法を挙げることができる。但し、凹みの計測に用いる手法は、これら例示された手法に限定される意図ではない。ゲル体表面に形成された凹みの計測は、酵素配置後、経時的に行うか、酵素配置後所定時間経過後に行うことができる。酵素反応の時間は、酵素の種類、ゲル体を構成する基質の種類（例えば、分子量）や濃度（含有量）、さらには測定温度等により適宜決定することができ、例えば、１分〜48時間の範囲とすることができる。但し、この範囲に限定される意図ではなく、条件によっては１分未満の時間でも酵素活性測定が可能な場合もあり得る。また、48時間を超える時間での酵素活性測定も可能である。

凹みの形状および体積を測定する方法は、例えば、３Ｄレーザ顕微鏡を用いて実施することができる。３Ｄレーザ顕微鏡以外にも走査型プローブ顕微鏡、光干渉式の表面形状測定装置、接触式の表面粗さ測定機等を用いても凹みの形状および体積の計測は可能である。凹み形成に伴うゲル体の光透過率の変化を測定する方法は、例えば、分光光度計や光センサー（例えば光電子増倍管やフォトダイオード）等を用いて実施することができる。凹み形成に伴うゲル体表面の光反射率の変化を測定する方法は、例えば、ゲル体表面に光を照射し、反射光の強度を分光光度計や光センサー（例えば光電子増倍管やフォトダイオード）等を用いて測定し実施することができる。

＜活性算出手法＞
本発明の酵素活性測定方法において、凹みの計測結果に基づいて、酵素の活性を算出する。例えば、凹みの形状および体積を測定する方法で得られた計測結果を用いる場合、ゲル体の分散質の密度を予め求めておき、この密度と体積から、酵素により分解された基質(分散質)の質量等を算出することで、使用した酵素量および反応時間から、酵素の活性を算出することができる。

凹み形成に伴うゲル体の光透過率の変化を測定する方法で得られた計測結果を用いる場合、光透過率の変化から例えば、酵素活性の有無や強弱を定性的に検出することができる。また例えば凹みの形状および体積と、それに伴う光透過率の変化を予め求め、校正曲線を作成しておくことで、光透過率の変化量から酵素により分解された基質(分散質)の質量等を算出することで、使用した酵素量および反応時間から、酵素の活性を算出することができる。

凹み形成に伴うゲル体表面の光反射率の変化を測定する方法で得られた計測結果を用いる場合、光反射率の変化から例えば、酵素活性の有無や強弱を定性的に検出することができる。また例えば凹みの形状および体積と、それに伴う光反射率の変化を予め求め、校正曲線を作成しておくことで、光反射率の変化量から酵素により分解された基質(分散質)の質量等を算出することで、使用した酵素量および反応時間から、酵素の活性を算出することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

＜酵素＞
セルラーゼとしては、明治製菓製メイセラーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ由来）およびノボザイム社製セルクラスト（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ由来）を用いた。キチナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ由来）とアガラーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｔｌａｎｔｉｃａ由来）はシグマアルドリッチ社より、またプロテアーゼ（プロテナーゼＫ）は和光純薬工業よりそれぞれ購入した。

＜ゲル体（ゲル）の調製＞
セルロースゲルは非特許文献２の記載に従って作製し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を含浸した。キチンゲルは、非特許文献３の記載に従って作製し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を含浸した。寒天ゲルは、市販の寒天（和光純薬工業製）を熱水に溶解後、室温まで冷却・固化させて調製した。卵白たんぱく質ゲルは鶏卵を、水浴中で１５分間煮沸して調製した。ゼラチンゲルは、市販のゼラチン（和光純薬工業製）を熱水に溶解後、室温まで冷却・固化させて調製した。バクテリアセルロースは、市販のナタデココ（伊豆フェルメンテ製）を水洗後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を含浸し、室温にて離水がなくなる程度乾燥させて調製した。

＜酵素溶液の滴下＞
酵素溶液の滴下には、ＬａｂｏＪｅｔ−５００ｂｉｏ（株式会社マイクロジェット社製）を用い、一度に１０ｐＬの溶液を滴下した。同一箇所に複数回の滴下を行うことで、ゲル体へ滴下する総溶液量を制御（加減）することもできる。

＜酵素活性の定量＞
酵素溶液の滴下後、加水分解によってゲル体表面に形成された凹みの体積を、ＶＫ−９７００ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＩＩ（株式会社キーエンス社製）を用いて測定した。体積の計算には装置付属のソフトウェアを使用した。得られた体積データとゲル体に含まれる基質の濃度から、分解された基質の質量を算出し、さらに使用した酵素量および反応時間から、酵素活性を定量した。

実施例１：セルラーゼ活性の評価
３質量％のセルロースを含むゲル表面に、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０ｐＬのメイセラーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、２００μｍの等間隔で滴下した。室温で３０分反応を行った後、酵素加水分解によってゲル体表面に生じた凹みを３Dレーザ顕微鏡により観察、計測した（図１）。またゲル体の密度（３０ｍｇ／ｍＬ）より、分解されたセルロースの質量を算出した。

凹み体積の測定により、酵素加水分解による１０^−７ｃｍ^３程度の極めて微小な体積変化を良好に測定できることがわかった（図２）。凹み体積は滴下した酵素溶液量に比例したことから、凹み体積を酵素加水分解評価における定量性のある指標として利用できることもわかった。凹み形成に伴って分解されたセルロースの質量は、数ピコグラムと見積もられ、極微量のセルロースの酵素加水分解を超高感度に検出できた。また本手法によって、約２ｃｍ四方のゲル体で、１００反応を分析できることがわかった。メイセラーゼ（セルラーゼ）の酵素活性は、０．１２〜０．２１ｍｇセルロース／ｍｇ酵素／分と算出された。

実施例２：セルラーゼ活性の評価
３質量％のセルロースを含むゲル表面に、１ｎＬのメイセラーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を滴下した。室温で反応を行いながら、酵素加水分解によってゲル体表面に生じた凹みの体積を経時的に測定した。またゲル体の密度（３０ｍｇ／ｍＬ）より、分解されたセルロースの質量を算出した。

凹み体積は時間とともに増大し、反応開始約１５分でほぼ一定となった（図３）。形成された凹みの体積は１０^−６ｃｍ^３程度、またその際に分解されたセルロースの質量は１００ｎｇ程度であった。１ｎＬという微量の酵素溶液を用いて、セルラーゼによる酵素加水分解反応の進行度合いを超高感度かつリアルタイムに追跡できることがわかった。メイセラーゼ（セルラーゼ）の酵素活性は、１．０１ｍｇセルロース／ｍｇ酵素／分と算出された。

実施例３：セルラーゼ活性の評価
１質量％のセルロースを含むゲル表面に、２０、４０、６０、８０、１００ｐＬのメイセラーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、３００μｍの等間隔で滴下した。室温で１４分反応を行った後、酵素加水分解によってゲル体表面に生じた凹みの体積を定量した。またゲル体の密度（１０ｍｇ／ｍＬ）より、分解されたセルロースの質量を算出した。

凹み体積の測定により、酵素加水分解による５．９×１０^−８〜２×１０^−７ｃｍ^３程度の極めて微小な体積変化を良好に測定できることがわかった。凹み体積は滴下した酵素溶液量に比例したことから、凹み体積を酵素加水分解評価における定量性のある指標として利用できることもわかった。凹み形成に伴って分解されたセルロースの質量は、０．６〜２ｎｇであった。その結果、メイセラーゼ（セルラーゼ）の酵素活性は、０．１３〜０．２１ｍｇセルロース／ｍｇ酵素／分と算出された。

実施例４：セルラーゼ活性の評価
１０質量％のセルロースを含むゲル表面に、２０、４０、６０、８０、１００ｐＬのメイセラーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、３００μｍの等間隔で滴下した。室温で１３分反応を行った後、酵素加水分解によってゲル体表面に生じた凹みの体積を定量した。またゲル体の密度（１００ｍｇ／ｍＬ）より、分解されたセルロースの質量を算出した。

凹み体積の測定により、酵素加水分解による４．４×１０^−８〜１．２×１０^−７ｃｍ^３程度の極めて微小な体積変化を良好に測定できることがわかった。凹み体積は滴下した酵素溶液量に比例したことから、凹み体積を酵素加水分解評価における定量性のある指標として利用できることもわかった。凹み形成に伴って分解されたセルロースの質量は、４．４〜１２．０ｎｇであった。その結果、メイセラーゼ（セルラーゼ）の酵素活性は、０．９２〜１．７１ｍｇセルロース／ｍｇ酵素／分と算出された。

実施例５：セルラーゼ活性の評価
３質量％のセルロースを含むゲル表面に、１０、２０、４０、６０、８０、１００ｐＬのセルクラスト溶液（市販の溶液を２倍に希釈）を、４００μｍの等間隔で滴下した。室温で６分反応を行った後、酵素加水分解によってゲル体表面に生じた凹みの体積を定量した。またゲル体の密度（３０ｍｇ／ｍＬ）より、分解されたセルロースの質量を算出した。

凹み体積の測定により、酵素加水分解による３．６×１０^−８〜２．１×１０^−７ｃｍ^３程度の極めて微小な体積変化を良好に測定できることがわかった。凹み体積は滴下した酵素溶液量に比例したことから、凹み体積を酵素加水分解評価における定量性のある指標として利用できることもわかった。凹み形成に伴って分解されたセルロースの質量は、１．１〜６．２ｎｇと見積もられ、極微量のセルロースの酵素加水分解を超高感度に検出できた。その結果、セルクラスト（セルラーゼ）の酵素活性は１０．４１〜１７．８８ｍｇセルロース／ｍL酵素溶液／分と算出された。

実施例６：キチナーゼ活性の評価
３質量％のキチンを含むゲル表面に、１０、２０、４０、１００ｐＬのキチナーゼ溶液（８ｍｇ／ｍＬ）を、４００μｍの等間隔で滴下した。室温で３分反応を行った後、酵素加水分解によってゲル体表面に生じた凹みの体積を定量した。またゲル体の密度（３０ｍｇ／ｍＬ）より、分解されたキチンの質量を算出した。

凹み体積の測定により、酵素加水分解による６．８×１０^−８〜２．２×１０^−７ｃｍ^３程度の極めて微小な体積変化を良好に測定できることがわかった。凹み体積は滴下した酵素溶液量に比例したことから、凹み体積を酵素加水分解評価における定量性のある指標として利用できることもわかった。凹み形成に伴って分解されたキチンの質量は、２．０〜６．７ｎｇと見積もられ、極微量のキチンの酵素加水分解を超高感度に検出できた。その結果、キチナーゼの酵素活性は、２．７〜８．５ｍｇキチン／ｍｇ酵素／分と算出された。

実施例７：アガラーゼ活性の評価
１質量％の寒天を含むゲル表面に、８０ｐＬのアガラーゼ溶液（０．４ｍｇ／ｍＬ）を滴下した。室温で１２０分反応を行った後、酵素加水分解によってゲル体表面に生じた凹みの体積を定量した。またゲル体の密度（１０ｍｇ／ｍＬ）より、分解された寒天の質量を算出した。

凹み体積の測定により、酵素加水分解による２×１０^−８ｃｍ^３程度の極めて微小な体積変化を良好に測定できることがわかった。凹み形成に伴って分解された寒天の質量は、２００ピコグラムと見積もられ、極微量の寒天の酵素加水分解を超高感度に検出できた。その結果、アガラーゼの酵素活性は、０．０５ｍｇ寒天／ｍｇ酵素／分と算出された。

実施例８：プロテアーゼ活性の評価
１２質量％の卵白たんぱく質を含むゲル表面に、６０、８０ｐＬのプロテアーゼ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を、４００μｍの等間隔で滴下した。室温で１５分反応を行った後、酵素加水分解によってゲル体表面に生じた凹みの体積を定量した。またゲル体の密度（１２０ｍｇ／ｍＬ）より、分解された卵白たんぱく質の質量を算出した。

凹み体積の測定により、酵素加水分解による３．１×１０^−７〜５．５×１０^−７ｃｍ^３程度の極めて微小な体積変化を良好に測定できることがわかった。凹み体積は滴下した酵素溶液量に比例したことから、凹み体積を酵素加水分解評価における定量性のある指標として利用できることもわかった。凹み形成に伴って分解された卵白たんぱく質の質量は、３６．６〜６６．２ｎｇと見積もられ、極微量の卵白たんぱく質の酵素加水分解を超高感度に検出できた。その結果、プロテアーゼの酵素活性は、２．０３〜２．７６ｍｇ卵白たんぱく質／ｍｇ酵素／分と算出された。

実施例９：プロテアーゼ活性の評価
１０質量％のゼラチンを含むゲル表面に、１０、４０、６０、８０ｐＬのプロテアーゼ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を、５００μｍの等間隔で滴下した。室温で５分反応を行った後、酵素加水分解によってゲル体表面に生じた凹みの体積を定量した。またゲル体の密度（１００ｍｇ／ｍＬ）より、分解されたゼラチンの質量を算出した。

凹み体積の測定により、酵素加水分解による７．９×１０^−９〜５．５×１０^−８ｃｍ^３程度の極めて微小な体積変化を良好に測定できることがわかった。凹み体積は滴下した酵素溶液量に比例したことから、凹み体積を酵素加水分解評価における定量性のある指標として利用できることもわかった。凹み形成に伴って分解されたゼラチンの質量は、０．７〜５．５ｎｇと見積もられ、極微量のゼラチンの酵素加水分解を超高感度に検出できた。その結果、プロテアーゼの酵素活性は、６．１２〜６．９２ｍｇゼラチン／ｍｇ酵素／分と算出された。

実施例１０：セルラーゼ活性の評価
１質量％のバクテリアセルロースを含むゲル表面に、６０ｐＬのメイセラーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を滴下した。室温で１１分反応を行った後、酵素加水分解によってゲル体表面に生じた凹みの体積を定量した。またゲル体の密度（１０ｍｇ／ｍＬ）より、分解されたバクテリアセルロースの質量を算出した。

凹み体積の測定により、酵素加水分解による１．９×１０^−８ｃｍ^３程度の極めて微小な体積変化を良好に測定できることがわかった。凹み形成に伴って分解されたバクテリアセルロースの質量は、１９０ｐｇと見積もられ、極微量のバクテリアセルロースの酵素加水分解を超高感度に検出できた。その結果、メイセラーゼ（セルラーゼ）の酵素活性は、０．０３ｍｇセルロース／ｍｇ酵素／分と算出された。

本発明は酵素、特に基質が水不溶性または難溶解性である酵素に関連する分野に有用である。

Claims

酵素の活性を測定する方法であって、
分散質の少なくとも一部が前記酵素の基質であるゲル体の表面の一部に所定量の前記酵素を配置し、前記酵素の作用により前記ゲル体表面に形成された凹みの体積を計測し、計測結果および前記所定量に基づいて前記酵素の活性を算出する、前記方法。
前記酵素の基質が水に不溶性または難溶解性の材料である、請求項1に記載の方法。
前記酵素の基質が数または質量平均分子量が１万〜５００万の範囲である重合体化合物である、請求項2に記載の方法。
前記ゲル体は分散媒として水を含有する請求項2または3に記載の方法。
前記酵素は、前記基質を加水分解する酵素または酸化分解する酵素である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
前記ゲル体表面への酵素の配置は、前記酵素を含有する溶液を滴下または噴射することにより行う、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
酵素を含有する溶液の滴下または噴射量は、1pL〜1nLの範囲である、請求項6に記載の方法。
前記ゲル体表面に形成された凹みの計測は、酵素配置後、経時的に行うか、酵素配置後、所定時間経過後に行う、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
凹みの体積の計測は３Ｄレーザ顕微鏡を用いて実施する、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
水に不溶性または難溶解性の基質が多糖類またはたんぱく質である、請求項2〜9のいずれかに記載の方法。
多糖類がセルロース、キチン、または寒天である、請求項10に記載の方法。
たんぱく質が卵白たんぱく質またはゼラチンである、請求項10に記載の方法。