[go: up one dir, main page]

JP6059141B2 - 核内繋留ｒｎａの調節 - Google Patents

核内繋留ｒｎａの調節 Download PDF

Info

Publication number
JP6059141B2
JP6059141B2 JP2013520822A JP2013520822A JP6059141B2 JP 6059141 B2 JP6059141 B2 JP 6059141B2 JP 2013520822 A JP2013520822 A JP 2013520822A JP 2013520822 A JP2013520822 A JP 2013520822A JP 6059141 B2 JP6059141 B2 JP 6059141B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rna
oligonucleotide
antisense
modified
pharmaceutical composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2013520822A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2013538561A (ja
JP2013538561A5 (ja
Inventor
ベネット，シー・フランク
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45497419&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP6059141(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ionis Pharmaceuticals Inc filed Critical Ionis Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2013538561A publication Critical patent/JP2013538561A/ja
Publication of JP2013538561A5 publication Critical patent/JP2013538561A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6059141B2 publication Critical patent/JP6059141B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

配列表
本出願は、電子フォーマットの配列リストと共に出願されている。配列リストは、２０１１年６月１９日に作成された、ＢＩＯＬ０１３３ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔの名称の約７２４ｋｂのサイズのファイルとして提供されている。電子フォーマット配列リスト中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野 本明細書で提供されるのは、アンチセンスオリゴヌクレオチド取込の少ない組織中の薬理学的に関連する核内繋留ＲＮＡ（ｎｕｃｌｅａｒ−ｒｅｔａｉｎｅｄ ＲＮＡ）および核内滞留時間の長いＲＮＡの低減を実現する方法である。このような方法は、動物の核内繋留ＲＮＡおよび核内での長い滞留時間を有するＲＮＡに関連する疾患または障害の症状を、例えば、治療、改善し、進行を遅延させ、または低減するために有用である。
発明の背景
アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身投与は、肝臓および腎臓皮質中の高い組織中濃度、およびいくつかの他の組織、例えば、脂質、脾臓および特定の炎症性細胞中の中程度濃度を作り出す。脾臓および炎症性細胞への２’ＭＯＥギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）オリゴヌクレオチドの取込は、通常、肝臓よりも２〜５倍少ない。骨格、平滑筋および心筋、腫瘍ならびに脳、等の他の組織では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身投与では、オリゴヌクレオチドの低、ないし無蓄積という結果になる。２’ＭＯＥギャップマーオリゴヌクレオチドの全身性送達では、骨格および心筋内濃度は、肝臓よりも約５０倍低いという結果になる。組織内では、オリゴヌクレオチド分布は、細胞型に対して不均質である。例えば、糸球体、遠位尿細管上皮細胞およびリンパ球では、腎臓およびリンパ組織中の他の細胞に比べて、低いオリゴヌクレオチド取込を示す。薬力学的効果は、体内分布データと一致する。標的とする配列が高度に最適化されている場合であっても、２’ＭＯＥギャップマーオリゴヌクレオチドの全身投与は、ＷＴマウスの骨格または心筋では、中程度の標的抑制を生じる（Ｃｒｏｏｋｅ ＳＴ，ｅｄ．アンチセンス薬剤技術：原理、戦略および応用（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）．２ｎｄｅｄ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；２００８：２７３−３０４、中のＢｅｎｎｅｔｔ ＣＦ．２’−Ｏ−メトキシエチル修飾オリゴヌクレオチドの薬理学的特性（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ））。筋肉および心臓中の標的に到達させるための最近の取り組みは、ＡＳＯ化学または処方の改善に注力されており、失望させる結果となっている。オリゴヌクレオチド取込に抵抗性の組織または細胞中で顕在化する多くの疾患があるという理由から、このような組織および細胞中の遺伝子に関連した疾患を効果的に標的化する方法を開発する必要性が残されている。
本明細書で提供されるのは、薬理学的に関連する核内繋留ＲＮＡの減少を実現する方法である。特定の実施形態では、核内繋留ＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチド取込の少ない組織中に存在する。特定の実施形態では、方法は、前記核内繋留ＲＮＡを有すると疑われる動物に、前記薬理学的に関連する量の核内繋留ＲＮＡを切断可能な核リボヌクレアーゼを活性化するのに十分な量の、前記核内繋留ＲＮＡに相補的な化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む。特定の実施形態では、核内繋留ＲＮＡは、前記組織の疾患または状態に関連している。特定の実施形態では、動物は、核内繋留ＲＮＡに関連する疾患または状態を有するものが選択される。
本明細書で提供されるのは、アンチセンスオリゴヌクレオチド取込の少ない組織中の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または傷害の症状の治療、改善、進行の遅延または低減方法である。特定の実施形態では、方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド取込の少ない組織中の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または傷害を有する動物の選定を含む。特定の実施形態では、方法は、薬理学的に関連する量の核内繋留ＲＮＡを切断できる核リボヌクレアーゼを活性化するのに有効な量の核内繋留ＲＮＡに相補的な化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、動物に投与することを含む。
特定の実施形態では、組織は、骨格筋、心筋、平滑筋、脂質、脾臓、骨、腸、副腎、精巣、卵巣、膵臓、下垂体、前立腺、皮膚、子宮、膀胱、腫瘍および脳である。特定の実施形態では、細胞型は、糸球体細胞、遠位尿細管上皮細胞およびリンパ球細胞である。
特定の実施形態では、投与は、オリゴヌクレオチドの全身性の効果（１つの組織を越える効果）をもたらす。特定の実施形態では、投与は、皮下、静脈内、大脳内、脳室内、髄腔内もしくはオリゴヌクレオチドの全身性の効果（１つの組織を越える効果）またはＣＮＳやＣＳＦへの送達をもたらす他の投与である。
特定の実施形態は、本明細書記載のいずれかの治療方法での使用のための薬剤の製造の際の本明細書記載のいずれかの化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
特定の実施形態は、本明細書記載のいずれかの治療方法での使用のための、本明細書記載のいずれかの化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
本明細書記載の方法で使用可能な化学修飾されたオリゴヌクレオチドもまた、提供される。
図１に、ｍｕｔ−ｈＤＭＰＫ ｍＲＮＡ（図１Ａ）および内在性マウスＤｍｐｋ ｍＲＮＡ（図１Ｂ）に対するＴａｑｍａｎアッセイ結果を示す。 図２にオリゴヌクレオチドによる標的ｓｎｏＲＮＡ発現の抑制結果を示す。
発明の詳細な説明 前述の一般説明および以下の詳細説明は、代表的なもので、説明のためのみのものであり、請求項に記載の本発明を制限するものではないことは、理解されよう。本明細書では、別段の特別な規定がなければ、単数形の使用は、複数形を含む。本明細書で使用される、「または」の使用は、別段の規定がなければ、「および／または」を意味する。さらに、用語の「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに他の形、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は、非制限的である。また、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」等の用語は、特に別義が規定されなければ、１つのユニットおよび要素ならびに２つ以上のサブユニットを含む成分を含む両方の要素および成分を包含する。
本明細書で使われるセクションの見出しは、まとめる目的のためのみのものであり、記載動物質を限定すると解釈されるべきではない。本出願中で引用されている全ての文書、または文書の一部、限定されないが、特許、特許出願、原稿、本、および論文は、本明細書で考察の文書の一部、ならびにその全体が明示的に本明細書による参照により組み込まれる。
定義
特段の定義が提供されていなければ、本明細書記載の分析化学、合成有機化学、および医薬品化学に関連した命名、ならびにそれらの手続きおよび技術は、当技術分野でよく知られ、よく使われているものである。化学合成、および化学分析には、標準的な方法を使うことができる。認められる場合は、全ての特許、出願、出願公報および他の出版物、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号および米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）および本明細書の開示全体を通して参照される他のデータ等のデータベースから得られる関連配列情報は、本明細書で考察された文書の一部、ならびにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
別段の指示がなければ、下記の用語は、そこに示す意味を有する：
「２’−Ｏ−メトキシエチル」（または２’−ＭＯＥおよび２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３）は、フロシル環（ｆｕｒｏｓｙｌ ｒｉｎｇ）の２’位置のＯ−メトキシエチル修飾を指す。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖は、修飾された糖である。
「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド」は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分を含むヌクレオチドを意味する。
「５−メチルシトシン」は、５’位置に結合したメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５−メチルシトシンは、修飾されたヌクレオベースである。
「活性医薬品」は、個体に投与された場合、治療上の利益を提供する医薬組成物の物質（複数含む）を意味する。例えば、特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性医薬品である。
「活性標的領域」または「標的領域」は、１つまたは複数の活性アンチセンス化合物が標的とする領域を意味する。「活性アンチセンス化合物」は、標的核酸レベルまたはタンパク質レベルを低下させるアンチセンス化合物を意味する。
「同時に投与される」は、２つの薬剤を、両方の薬理学的効果が患者の中で同時に顕在化するいずれかの手法で同時投与することを指す。同時投与は、両薬剤が同じ剤形の単一の医薬組成物で、または同じ投与経路により投与される必要はない。両薬剤の効果が同時に顕在化する必要はない。効果が、ある時間帯に、重なり合うことが必要なだけであり、同一の広がりを持つ必要はない。
「投与」は、薬剤を動物に与えることを意味し、限定されないが、医療従事者および自己投与による投与が含まれる。
「薬剤」は、動物に投与した場合、治療上の利益を提供することができる活性物質を意味する。「第一薬剤」は、本発明の治療化合物を意味する。例えば、第一薬剤は、ｎｒＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。「第二薬剤」は、本発明の第二の治療化合物（例えば、ｎｒＲＮＡを標的とする第二アンチセンスオリゴヌクレオチド）および／またはｎｒＲＮＡを標的とする非アンチセンスオリゴヌクレオチド治療化合物を意味する。
「改善」は、関連疾患、傷害、または状態の少なくとも１つの指標、徴候、または症状の緩和を意味する。指標の重症度は、当業者には既知の動物の特性に基づいた、または客観的尺度により判断できる。
「動物」は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、等、および限定されないが、サル、チンパンジー等の非ヒト霊長類を含むヒトまたは非ヒト動物を指す。
「アンチセンス活性」は、その標的核酸に対するアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションに起因するいずれかの検出可能な、または測定可能な活性を意味する。特定の実施形態では、アンチセンス活性は、標的核酸またはこのような標的核酸によりコードされるタンパク質の量または発現の減少である。
「アンチセンス化合物」は、水素結合を介して標的核酸にハイブリダイゼーションを行うことができるオリゴマー化合物を意味する。
「アンチセンス抑制」は、アンチセンス化合物が存在しない場合の標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルに比べて、標的核酸に対し相補的なアンチセンス化合物の存在下、標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルの減少を意味する。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応する領域またはセグメントにハイブリダイゼーション可能なヌクレオベース配列を有する単鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
「二環糖」は、２つの非ジェミナル環原子の架橋により修飾されたフロシル環を意味する。二環糖は、修飾された糖である。
「二環核酸」または「ＢＮＡ」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのフラノース部分がフラノース環上の２つの炭素原子に連結する架橋を含み、それにより、二環系を形成するヌクレオシドまたはヌクレオチドを指す。
「キャップ構造」または「末端キャップ部分」は、アンチセンス化合物のどちらかの末端に組み込まれている化学的修飾を意味する。
「化学的に異なる領域」は、同じアンチセンス化合物の別の領域とは、いくつかの点で化学的に異なるアンチセンス化合物の領域を指す。例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾の無いヌクレオチドを有する領域とは化学的に異なる。
「キメラアンチセンス化合物」は、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物を意味する。
「同時投与」は、２つ以上の薬剤の個体への投与を意味する。２つ以上の薬剤は、単一の医薬組成物であっても、または、別々の医薬組成物であってもよい。２つ以上の薬剤のそれぞれは、同じまたは異なる投与経路により投与することができる。同時投与は、並列または逐次投与を包含する。
「相補性」は、第１核酸および第２核酸のヌクレオベース間の対形成能力を意味する。
「近接ヌクレオベース」は、相互にすぐ近くに隣接するヌクレオベースを意味する。
「希釈剤」は、薬理学的活性はないが、薬学的に必要な、または望ましい組成物中の成分を意味する。例えば、注射組成物中の希釈剤は、液体、例えば、食塩水溶液であってもよい。
「用量」は、単回投与で、または指定された期間に与えられる医薬品の指定された量を意味する。特定の実施形態では、用量は、１回、２回、またはそれ超の回数の巨丸剤、錠剤、または注射剤で投与してもよい。例えば、皮下投与が所望の特定の実施形態では、所望の用量は、単回注射剤では容易に対応され得ない用量が必要であり、従って、２回またはそれ以上の回数の注射剤が所望の用量を得るために使用できる。特定の実施形態では、医薬品は、長期間、または連続的注入により投与される。用量は、時間、日、週、または月当たりの医薬品の量で表すことができる。
「有効量」または「治療有効量」は、その薬剤を必要としている個体に所望の生理的な結果をもたらすのに充分な活性医薬品の量を意味する。有効量は、治療される個体の健康および身体状態、治療される個体の分類群、組成物の処方、個体の病態の評価、および他の関連因子に応じて個体の間で変えることができる。
「完全に相補的」または「１００％相補的」は、第１の核酸のヌクレオベース配列の各ヌクレオベースが第２の核酸の第２のヌクレオベース配列中に相補的なヌクレオベースを有することを意味する。特定の実施形態では、第１の核酸は、アンチセンス化合物であり、標的核酸は、第２の核酸である。
「ギャップマー」は、キメラアンチセンス化合物を意味し、この化合物中では、ＲＮアーゼＨ切断を支援する複数のヌクレオシドを有する内部領域が１つまたは複数のヌクレオシドを有する外部領域の間に位置し、この内部領域を含むヌクレオシドは、外部領域を含むヌクレオシドまたは複数ヌクレオシドとは化学的に異なっている。内部領域を、「ギャップセグメント」と呼ぶことができ、外部領域を、「ウイングセグメント」と呼ぶことができる。
「ギャップ拡大（ｇａｐ−ｗｉｄｅｎｅｄ）」は、１〜６ヌクレオシドを有する５’および３’ウイングセグメントの間またはすぐ近くに位置する１２以上の近接２’−デオキシリボヌクレオシドのギャップセグメントを有するキメラアンチセンス化合物を意味する。
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸分子のアニーリングを意味する。特定の実施形態では、相補的な核酸分子は、アンチセンス化合物および標的核酸を含む。
「核内繋留ＲＮＡに関連する疾患または状態の動物の特定」は、核内繋留ＲＮＡに関連する疾患、傷害もしくは状態と診断されている動物の特定、または核内繋留ＲＮＡに関連する疾患、傷害もしくは状態を発症しやすい動物の特定を意味する。例えば、家族病歴を有する個体は、核内繋留ＲＮＡに関連する疾患、傷害もしくは状態に罹りやすい可能性がある。このような特定は、個体の病歴および標準的臨床試験または査定の評価を含む任意の方法により行うことができる。
「すぐ近くに隣接した」は、すぐ近くの配列との間に介在する配列がないことを意味する。
「個体」は、処置または治療のために選択されるヒトまた非ヒト動物を意味する。
「ヌクレオシド間結合」は、ヌクレオシドの間の化学結合を指す。
「連鎖ヌクレオシド」は、一緒に結合した隣接ヌクレオシドを意味する。
「少ない取込」または「取込に対する抵抗性」は、少ないもしくは低減されたオリゴヌクレオチドの取込を示す、またはオリゴヌクレオチドの分布もしくは濃度が低いと解っている細胞または組織を意味する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少ない取込の、または取込に対し抵抗性を有する細胞または組織は、肝臓または腎臓中濃度に比べて、少なくとも５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍または１００倍少ない全身投与後オリゴヌクレオチド濃度を有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少ない取込または取込に対する抵抗性を有する細胞または組織は、不安定な（短い半減期または核内滞留の）または非核内繋留標的を標的としたオリゴヌクレオチドの全身投与に与える測定可能な薬理学的関連効果を示さない。
「ミスマッチ」または「非相補的なヌクレオベース」は、第１の核酸のヌクレオベースが、第２のまたは標的核酸の対応するヌクレオベースと対形成できない場合を指す。
「修飾ヌクレオシド間結合」は、天然ヌクレオシド間結合（すなわち、リン酸ジエステルヌクレオシド間結合）からの置換または何らかの改変を指す。
「修飾ヌクレオベース」は、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、またはウラシル以外の任意のヌクレオベースを指す。「非修飾ヌクレオベース」は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を意味する。
「修飾ヌクレオチド」は、独立に、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、または修飾ヌクレオベースを有するヌクレオチドを意味する。「修飾ヌクレオシド」は、独立に、修飾糖部分または修飾ヌクレオベースを有するヌクレオシドを意味する。
「修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。
「修飾糖」は、天然糖からの置換または改変を指す。
「モチーフ」は、アンチセンス化合物中の化学的に異なる領域パターンを意味する。
「天然ヌクレオシド間結合」は、３’から５’へのリン酸ジエステル結合を意味する。
「天然糖部分」は、ＤＮＡ（２’−Ｈ）またはＲＮＡ（２’−ＯＨ）中に認められる糖を意味する。
「ノンコーディングＲＮＡ」または「ｎｃＲＮＡ」は、タンパク質に翻訳されない機能的ＲＮＡ分子を意味する。ノンコーディングＲＮＡには、非常に豊富に存在し、機能的に重要なＲＮＡ、例えば、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ならびに核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡｓ）、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡならびに長鎖ｎｃＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｃＲＮＡ）（またはｌａｒｇｅ ｎｃＲＮＡ）等のＲＮＡが含まれる。長鎖ｎｃＲＮＡは、通常、約２００ヌクレオチドより長いタンパク質非コード転写物と考えられており、遺伝子転写、転写後調節およびエピジェネティックな調節で重要な役割を果たしていることが示された（例えば、Ｇｕｔｔｍａｎ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．，２００９，４５８，２２３−２２７，を参照）。長鎖ｎｃＲＮＡは、限定されないが、プロモーター標的ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）およびｌｉｎｃＲＮＡを含んでもよい。
「核内繋留ＲＮＡ」または「ｎｒＲＮＡ」は、核中で豊富なまたは安定なＲＮＡを意味する。核内繋留ＲＮＡには、限定されないが、例えば、ｌｉｎｃＲＮＡ、反復配列含有ＲＮＡおよびヌクレオチド反復伸長含有ＲＮＡを含む長鎖ｎｃＲＮＡ、本明細書記載のｓｎｏＲＮＡおよびｓｃａＲＮＡ（ｅｎｒＲＮＡ）を含む低分子ノンコーディングＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）を含むノンコーディングＲＮＡが含まれる。特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡは、核内のみに存在するＲＮＡ、または一部の機能的ＲＮＡのように成熟の間に細胞質を短時間だけ通過するＲＮＡ（細胞質に出た後、すぐに元の核に戻る）であるか、または核中に長い滞留時間を有するＲＮＡ（例えば、長い半減期を有するＲＮＡ）であるが、ある期間または特定のイベント、例えば、限定されないが、刺激（例えば、ストレス）に応答した反復配列（例えば、Ａｌｕ反復配列）の切断、の後に、細胞質に送出されるＲＮＡであってもよい。特定の実施形態では、核内繋留ＲＮＡは、核内のサブオルガネラ中に保持される。核内繋留ＲＮＡの例には、Ｘｌｓｉｒｔ、Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＩＩＩ、ＨｏｘＣ５転写変異体２（ノンコーディング）、Ｍｅｎβ、Ｎｅａｔ１、Ｎｅａｔ２、ｈｓｒ−ｏｍｅｇａ、ｈｏｔｈｅａｄ、Ｋｉｔ、Ｘｉｓｔ、Ａｉｒ、Ｔｓｉｘ、Ｍｉｒｇ、Ｋｃｎｑｌｏｔ１、ＡＫ０４５０７０、Ｐ−ｒｅｘ１、ＺＮＦ１２７ＡＳ、ＮＥＳＰＡＳ、ＳＲＧ１、Ｈｏｔａｉｒ、Ｇｏｍａｆｕ、Ｓｏｘ２ｏｔ、Ｒｉａｎ、ＣＡＴ２、Ｘｉｔｅ、Ｊｐｘ、Ｆｔｘ、ＲｏＸ１、ＲｏＸ２、Ｈ１９、Ｉｇｆ２、ＩＰＷ、ＵＢＥ３Ａ、ＡＴＰ１０Ｃ、ｐｇｃ、７ＳＫ、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ転写伸長因子Ｐ−ＴＥＦｂ、Ｂ２、ＨＳＲ−１、ＢＣ１、ＢＣ２００、ＮＲＳＥ、ＮＲＯＮ、ＮＦＡＴ転写因子、Ｍａｋｏｒｉｎ−ｐ１、ＨＡＲ１Ｆ、ＨＡＲ１Ｒ、ＯＣＣ１、ＤＤ３／ＰＣＡ３、ＰＣＧＥＭ１、ＮＣＲＭＳ、ＨＩＳ−１、ＢＣＭＳ、ＣＭＰＤ、ＮＣ６１２、ＳＲＡ、ＤＩＳＣ２、ＰＳＺＡ１１ｑ１４、ＲＡＹ１／ＳＴ７、ＵＢＥ３Ａ−ＡＳ、ＳＣＡ８、２２ｋ４８、Ｃ６ｏｒｆ３７ＯＳ、ＣＯＰＧ２ＩＴ１、ＤＧＣＲ５、ＫＣＮＱ１オーバーラップ転写１（非タンパク質コード）、ＭＥＳＴＩＴ１、ＰＲＩＮＳ、ＳＣＡ８／アタキシン８、ＡＴＮ１／ＤＲＰＬＡ、ＦＭＲ１、ＡＦＦ２／ＦＭＲ２、フラタキシン／ＦＸＮ、Ｈｔｔ、ジャンクトフィリン−３（ＪＰＨ３）、ＤＭＰＫ、Ｚｎフィンガータンパク質−９、アンドロゲン受容体（ＡＲ）（Ｘ連鎖）、アタキシン−１（ＡＴＸＮ１）、ＡＴＸＮ１０、タンパク質ホスファターゼＰＰ２Ａ（ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ）、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、およびＳＣＡ８が含まれる。
「核リボヌクレアーゼ」は、核内で見つかったリボヌクレアーゼを意味する。核リボヌクレアーゼには、限定されないが、ＲＮアーゼＨ１およびＲＮアーゼＨ２を含むＲＮアーゼＨ、二重鎖ＲＮアーゼドローシャおよび他の二重鎖ＲＮアーゼが含まれる。
「核酸」は、単量体ヌクレオチドから構成される分子を指す。核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、単鎖核酸、二重鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。核酸は、また、これらの配列の組み合わせを単一分子中に含んでもよい。
「ヌクレオベース」は、別の核酸の塩基と対形成可能なヘテロ環式部分を意味する。
「ヌクレオベース配列」は、いずれの糖、結合、またはヌクレオベース修飾とも独立した近接ヌクレオベースの順序を意味する。
「ヌクレオシド」は、糖に連結したヌクレオベースを意味する。
「ヌクレオシド擬態」は、糖または糖と塩基を置き換えるのに使用される構造体を含み、必ずしも、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、ビシクロまたはトリシクロ糖擬態、例えば、非フラノース糖ユニットを有するヌクレオシド擬態のようなオリゴマー化合物の１つまたは複数の位置での結合の必要はない。
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。
「ヌクレオチド擬態」は、ヌクレオシドを置き換えるために使用される構造体を含み、また、例えば、ペプチド核酸またはモルホリノ（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または他の非リン酸ジエステル結合により連結されたモルホリノ）、等のオリゴマー化合物の１つまたは複数の位置での連結を含む。
「ヌクレオチド反復伸長を含むＲＮＡ」（ｅｎｒＲＮＡ）は、反復配列伸長を含むヌクレオチドの配列を含む変異体ＲＮＡ分子を意味し、このＲＮＡ分子では、三つ組みまたは四つ組みのヌクレオチドが前記配列内で連続的に通常の数より多い回数で数回反復され、前記ＲＮＡの通常の処理に影響を与える（例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｔ．Ｃｅｌｌ．，２００９、１３６、７７７−７９３；Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，２８４（１２），７４１９−７４２３、を参照）。
「オリゴマー化合物」または「オリゴマー」は、核酸分子の少なくとも一つの領域にハイブリダイズ可能な連結された単量体サブユニットのポリマーを意味する。
「オリゴヌクレオチド」は、連鎖ヌクレオシドのポリマーを意味する。連鎖ヌクレオシドが修飾されていても、または非修飾でもよく、相互に独立していてもよい。
「非経口投与」は、注射または注入による投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または頭蓋内投与、例えば、髄腔内もしくは脳室内投与が含まれる。投与は、連続、または長期、または短期または間欠的のいずれであってもよい。
「ペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸のアミド結合による連結により形成される分子を意味する。ペプチドは、ポリペプチドおよびタンパク質を指す。
「医薬組成物」は、個体への投与に適した物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、１つまたは複数の活性薬剤および無菌の水溶液を含んでもよい。
「薬学的に許容可能な用量」は、薬理学的に関連する標的の減少をもたらすことができ、耐容性良く、最低限の、極わずかな、または無毒性の用量を意味する。
「薬学的に許容可能な塩」は、生理学的および薬学的に許容可能なアンチセンス化合物の塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの所望の生物活性を維持し、望ましくない毒性効果を付与しない塩を意味する。
「薬理学的に関連する減少」は、薬理学的結果を与えるＲＮＡの減少を意味する。薬理学的結果は、例えば、疾患もしくは状態またはこのような疾患もしくは状態の症状の改善であってもよい。
「ホスホロチオエート結合」は、ヌクレオシド間の結合を意味し、この結合では、非架橋酸素原子の一つを硫黄原子で置換することによりリン酸ジエステル結合が修飾されている。ホスホロチオエート結合は、修飾されているヌクレオシド間結合である。
「部分」は、一定数の核酸の近接（すなわち、連鎖）ヌクレオベースを意味する。特定の実施形態では、部分は、一定数の標的核酸の近接ヌクレオベースである。特定の実施形態では、部分は、一定数のアンチセンス化合物の近接ヌクレオベースである。
「防ぐ」は、分から永久までの時間の間、疾患、傷害、または状態の発症または発生を遅らせるか、または未然に防ぐことを指す。防ぐは、また、疾患、傷害、または状態の発生のリスクを減らすことを意味する。
「プロドラッグ」は、不活性型で調製され、身体またはその細胞内で、内在性酵素または他の化学薬品もしくは条件の作用により、活性型に変換される治療薬を意味する。
「副作用」は、治療が原因の、目的の効果以外の生理的な応答を意味する。特定の実施形態では、副作用には、注射部位反応、肝臓機能検査異常、腎機能異常、肝臓毒性、腎臓毒性、中枢神経系異常、筋障害、および倦怠感が含まれる。例えば、血清中アミノトランスフェラーゼレベルの増加は、肝臓毒性または肝臓機能異常を示している可能性がある。例えば、ビリルビンの増加は、肝臓毒性または肝臓機能異常を示している可能性がある。
「単鎖オリゴヌクレオチド」は、相補的な鎖にハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドを意味する。
「特異的にハイブリダイズ可能な」は、所望の効果を誘導するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的核酸の間の充分な程度の相補性を有するが、特異的結合が所望の条件下、すなわち、インビボアッセイおよび治療処理の場合の生理学的条件下では、非標的核酸に対して最小限の効果を示すか、または無効果であるアンチセンス化合物を指す。
「安定なＲＮＡ」は、長い半減期または非常に低い代謝回転を有するＲＮＡを意味する。特定の実施形態では、安定なＲＮＡは、少なくとも５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、２４時間または２４時間を越える半減期を有する。特定の実施形態では、半減期は、ＲＮＡ合成阻害剤、例えば、アクチノマイシンＤまたはＤＲＢを使ったインビトロアッセイにより示される（実施例参照）。
「皮下投与」は、皮膚直下の投与を意味する。
「糖代用物」は、少し広い意味の用語「ヌクレオシド擬態」と重なり合うが、糖ユニット（フラノース環）の置換のみを示すことを意図している。本明細書で提供されるテトラヒドロピラニル環は、糖代用物の実例であり、この場合、フラノース糖基は、テトラヒドロピラニル環系により置換されている。
「ターゲティング（標的化）」または「標的とする」は、特異的に標的核酸にハイブリダイズして、所望の効果を誘導すると思われるアンチセンス化合物の設計および選択のプロセスを意味する。
「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」および「標的ＲＮＡ転写物」は、全て、アンチセンス化合物により標的とされることが可能な核酸を指す。
「標的セグメント」は、アンチセンス化合物が標的とする標的核酸のヌクレオチド配列を意味する。「５’標的部位」は、標的セグメントの５’最末端側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」は、標的セグメントの３’最末端側のヌクレオチドを指す。
「治療有効量」は、個体に治療の利益をもたらす薬剤の量を意味する。
「治療」は、疾患、傷害、または状態の変化または改善を起こさせるための医薬組成物の投与を指す。
「非修飾ヌクレオチド」は、天然ヌクレオベース、糖部分、およびヌクレオシド間結合から構成されるヌクレオチドを意味する。特定の実施形態では、非修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−リボヌクレオシド）またはＤＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド）である。
特定の実施形態
特定の実施形態は、核内繋留ＲＮＡ（ｎｒＲＮＡ）を抑制する方法、化合物、および組成物を提供する。
特定の実施形態は、動物のｎｒＲＮＡを低減させる方法を提供し、動物にｎｒＲＮＡ標的化修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡは、本明細書で提供されるいずれか、例えば、表ｌまたは表２に挙げた内のいずれか一つの標的である。
特定の実施形態では、本発明の方法を使って標的化され、抑制されたｎｒＲＮＡは、次記から選択されるｎｒＲＮＡである：Ｘｌｓｉｒｔ、Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＩＩＩ、Ｈｏｘ Ｃ５転写変異体２（ノンコーディング）、Ｍｅｎβ、Ｎｅａｔ１、Ｎｅａｔ２、ｈｓｒ−ｏｍｅｇａ、ｈｏｔｈｅａｄ、Ｋｉｔ、Ｘｉｓｔ、Ａｉｒ、Ｔｓｉｘ、Ｍｉｒｇ、Ｋｃｎｑｌｏｔ１、ＡＫ０４５０７０、Ｐ−ｒｅｘ１、ＺＮＦ１２７ＡＳ、ＮＥＳＰＡＳ、ＳＲＧ１、Ｈｏｔａｉｒ、Ｇｏｍａｆｕ、Ｓｏｘ２ｏｔ、Ｒｉａｎ、ＣＡＴ２、Ｘｉｔｅ、Ｊｐｘ、Ｆｔｘ、ＲｏＸ１、ＲｏＸ２、Ｈ１９、Ｉｇｆ２、ＩＰＷ、ＵＢＥ３Ａ、ＡＴＰ１０Ｃ、ｐｇｃ、７ＳＫ、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ転写伸長因子Ｐ−ＴＥＦｂ、Ｂ２、ＨＳＲ−１、ＢＣ１、ＢＣ２００、ＮＲＳＥ、ＮＲＯＮ、ＮＦＡＴ転写因子、Ｍａｋｏｒｉｎ−ｐ１、ＨＡＲ１Ｆ、ＨＡＲ１Ｒ、ＯＣＣ１、ＤＤ３／ＰＣＡ３、ＰＣＧＥＭ１、ＮＣＲＭＳ、ＨＩＳ−１、ＢＣＭＳ、ＣＭＰＤ、ＮＣ６１２、ＳＲＡ、ＤＩＳＣ２、ＰＳＺＡ１１ｑ１４、ＲＡＹ１／ＳＴ７、ＵＢＥ３Ａ−ＡＳ、ＳＣＡ８、２２ｋ４８、Ｃ６ｏｒｆ３７ＯＳ、ＣＯＰＧ２ＩＴ１、ＤＧＣＲ５、ＫＣＮＱ１オーバーラップ転写１（非タンパク質コード）、ＭＥＳＴＩＴ１、ＰＲＩＮＳ、ＳＣＡ８／アタキシン８、ＡＴＮ１／ＤＲＰＬＡ、ＦＭＲ１、ＡＦＦ２／ＦＭＲ２、フラタキシン／ＦＸＮ、Ｈｔｔ、ジャンクトフィリン−３（ＪＰＨ３）、ＤＭＰＫ、Ｚｎフィンガータンパク質−９、アンドロゲン受容体（ＡＲ）（Ｘ連鎖）、アタキシン−１（ＡＴＸＮ１）、ＡＴＸＮ１０、タンパク質ホスファターゼＰＰ２Ａ（ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ）、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、およびＳＣＡ８。特定の実施形態では、本発明の方法を使って標的化され、抑制されたｎｒＲＮＡは、ＮＥＡＴ２（別名ＭＡＬＡＴ１）、ＤＭＰＫ、Ｕ１６、およびＵ５０から選択されたｎｒＲＮＡである。特定の実施形態は、本明細書記載の動物の核内繋留ＲＮＡに関連する疾患または傷害の症状の治療、改善、遅延または低減方法を提供し、本明細書記載のｎｒＲＮＡを標的とした修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含み、修飾オリゴヌクレオチドが動物のｎｒＲＮＡを減らし、それにより、動物の核内繋留ＲＮＡに関連する疾患または傷害の症状を治療、改善し、進行を遅延させ、または低減する。
特定の実施形態は、核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態の動物を治療する方法を提供し、核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態の前記動物を特定し、前記動物に治療有効量のｎｒＲＮＡを標的とする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む。特定の実施形態では、動物に投与される治療有効量の化合物により、動物の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または傷害の症状を治療、改善し、進行を遅延させ、または低減する。
特定の実施形態は、ｎｒＲＮＡを減らす方法を提供し、１０〜３０連鎖ヌクレオシドからなり、前記修飾オリゴヌクレオチド全体にわたり測定して、本明細書記載のｎｒＲＮＡ配列のいずれか一つに少なくとも９０％相補的なヌクレオベース配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含む。特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡの減少により、動物の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または傷害の症状を治療、改善し、進行を遅延させ、または低減する。
特定の実施形態は、核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態の症状の治療、改善、遅延または低減方法を提供する。方法は、核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態の動物を特定し、その動物にオリゴヌクレオチドの取込に対する抵抗性の、または低い取込を示す組織中の核リボヌクレアーゼを活性化するのに有効な量の、前記核内繋留ＲＮＡの相補的な修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む。核リボヌクレアーゼは、アンチセンスオリゴヌクレオチド／ｎｒＲＮＡ二本鎖を認識することにより核内繋留ＲＮＡを切断することができる。特定の実施形態では、核リボヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＨ１、ＲＮアーゼＨ２またはドローシャである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの量は、核内繋留ＲＮＡを薬理学的に関連する量だけ減らすために効果的である。特定の実施形態では、薬理学的に関連する核内繋留ＲＮＡの減少により、動物の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または傷害の症状を治療、改善し、進行を遅延させ、または低減する。
特定の実施形態は、アンチセンスオリゴヌクレオチド取込の少ない組織中の薬理学的に関連する核内繋留ＲＮＡの減少を実現する方法を提供し、核内繋留ＲＮＡを有するか、または有すると疑われる動物に、薬理学的に関連する量だけ核内繋留ＲＮＡを切断することができる核リボヌクレアーゼを活性化するのに有効な量の、前記核内繋留ＲＮＡを標的にしているか、またはそれに相補的な修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む。特定の実施形態では、核内繋留ＲＮＡは、オリゴヌクレオチドの少ない取込を有するかまたは示す、またはオリゴヌクレオチド取込に抵抗性の組織中の疾患または状態に関連しており、動物は、関連疾患または状態を有するとして選択されている。特定の実施形態では、核内繋留ＲＮＡは、安定なＲＮＡである。
特定の実施形態は、アンチセンスオリゴヌクレオチド取込の少ない組織中の、核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または傷害の症状の治療、改善、遅延または低減方法を提供し、組織中の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または傷害を有する動物を選択すること、および動物に、薬理学的に関連する量の核内繋留ＲＮＡ切断を可能とする核リボヌクレアーゼを活性化するのに有効な量の、前記核内繋留ＲＮＡを標的にしているか、またはそれに相補的な修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与し、それにより、疾患または傷害の症状を治療、改善し、進行を遅延させ、または低減することを含む。特定の実施形態では、核内繋留ＲＮＡは、安定なＲＮＡである。
特定の実施形態では、動物は、下記から選択される疾患を有する：ハンチントン病、ハンチントン病類縁疾患２型、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１およびＤＭ２を含む）、脆弱Ｘ関連振戦・失調症候群、脆弱ＸＥ精神遅滞、脊髄小脳失調症（表２に挙げたものを含む）、フリードライヒ運動失調症、早期卵巣機能不全、球脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症（ケネディ病）または歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ハウ・リバー症候群）。
特定の実施形態では、組織は、骨格筋、心筋、平滑筋、脂質、脾臓、硬骨、腸、副腎、精巣、卵巣、膵臓、下垂体、前立腺、皮膚、子宮、膀胱、腫瘍および脳である。特定の実施形態では、細胞型は、糸球体、遠位尿細管上皮細胞およびリンパ球細胞である。特定の実施形態では、細胞型は、限定されないが、乳、肺、結腸および前立腺癌細胞を含む悪性細胞である。
特定の実施形態では、投与は、オリゴヌクレオチドの全身性効果（一つの組織を越える効果）をもたらす。特定の実施形態では、投与は、皮下、静脈内、大脳内、脳室内、髄腔内またはオリゴヌクレオチドの全身性効果（一つの組織を越える効果）もしくはＣＮＳやＣＳＦへの送達をもたらす他の投与である。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡは、少なくとも１つの反復領域および少なくとも１つの非反復領域を含むヌクレオチド反復含有ＲＮＡである。特定の実施形態では、前記ヌクレオチド反復含有ＲＮＡの反復領域は、ＣＡＧ、ＧＣＧ、ＣＵＧ、ＧＣＣ、ＧＣＣ、ＣＧＧ、ＧＡＡ、ＣＡＡ、ＣＣＵＧ、またはＡＵＵＣＵ、から選択される反復配列を含む。特定の実施形態では、反復配列は、伸長される。特定の実施形態では、反復配列は、約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、１００、２５０、５００、１０００、１５００、２０００（またはこれらの数値のいずれかの２つにより定義されるいずれかの範囲）回超、反復領域内で反復される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド反復含有ＲＮＡの非反復領域の非コード配列を標的とする。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド反復含有ＲＮＡのコード領域、イントロン、５’ＵＴＲ、または３’ＵＴＲを標的とする。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡはノンコーディングＲＮＡである。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡは、長鎖ｎｃＲＮＡまたはｌｉｎｃＲＮＡである。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡは、変異ＲＮＡである。特定の実施形態では、変異ＲＮＡは、野性型に比較し少ないのが好ましい。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡは、安定なＲＮＡである。特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡは、少なくとも５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間、２４時間超、２５時間または２５時間超の半減期を有する。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、キメラである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜３０連鎖ヌクレオシドから構成される。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体を測定して、ｎｒＲＮＡに対し少なくとも９０％相補的なヌクレオベース配列を有する。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオベース配列は、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体を測定して、本明細書記載のいずれか１つのｎｒＲＮＡに対し少なくとも９５％相補的である。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオベース配列は、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体を測定して、本明細書記載のいずれか１つのｎｒＲＮＡに対し１００％相補的である。
特定の実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
特定の実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾糖を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は、二環糖である。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチルまたは４’−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−２’架橋を含み、式中、ＲａおよびＲｂは、独立に、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。特定の実施形態では、ＲａおよびＲｂは、それぞれＨである。特定の実施形態では、Ｒａはアルキル、ＲｂはＨである。特定の実施形態では、ＲａはＣＨ３、ＲｂはＨである。特定の実施形態では、修飾糖は、４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋を含み、式中、ｎは、１または２である。
特定の実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾ヌクレオベースを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオベースは、５−メチルシトシンである。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ａ）連鎖デオキシヌクレオシドで構成されるギャップセグメント；ｂ）連鎖ヌクレオシドで構成される５’ウイングセグメント；およびｃ）連鎖ヌクレオシドで構成される３’ウイングセグメント、を含む。ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントおよび３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ａ）１０連鎖デオキシヌクレオシドで構成されるギャップセグメント；ｂ）５連鎖ヌクレオシドで構成される５’ウイングセグメント、およびｃ）５連鎖ヌクレオシドで構成される３’ウイングセグメント、を含む。ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントおよび３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、前記修飾オリゴヌクレオチド中の各シトシンは、５’−メチルシトシンである。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２０連鎖ヌクレオシドで構成される。
特定の実施形態は、動物の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または傷害の症状の治療、改善、遅延または低減方法を提供し、動物に、ｎｒＲＮＡを減らす修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含み、修飾オリゴヌクレオチドは、ａ）１０連鎖デオキシヌクレオシドで構成されるギャップセグメント；ｂ）５連鎖ヌクレオシドで構成される５’ウイングセグメント；およびｃ）５連鎖ヌクレオシドで構成される３’ウイングセグメント、を含む。ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合で、前記修飾オリゴヌクレオチド中の各シトシンは、５’−メチルシトシンであり、前記ｎｒＲＮＡの減少により、動物の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または傷害の症状を治療、改善し、進行を遅延させ、または低減する。
特定の実施形態は、核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態の治療、改善、または予防のための薬物の製造における本明細書記載の化合物の使用を提供する。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、第１の薬剤として指定され、本発明の方法は、第２の薬剤を投与することをさらに含む。特定の実施形態では、第１の薬剤および第２の薬剤は、同時投与される。特定の実施形態では、第１の薬剤および第２の薬剤は、逐次的にまたは同時に同時投与される。
特定の実施形態は、本明細書記載の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態の治療、防止、または改善用キットを提供し、キットは、本明細書記載の化合物、および任意選択で、本明細書記載の追加の薬剤または治療薬を含む。キットには、キットを使用して核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態の治療、防止、または回復を行うためのインストラクションまたはラベルをさらに含めてもよい。
特定の実施形態は、アンチセンスオリゴヌクレオチド取込の少ない組織中の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患の治療のための本明細書記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。特定の実施形態では、皮下、静脈内、大脳内、脳室内もしくは髄腔内治療またはＣＮＳもしくはＣＳＦの治療のための使用が提供される。
特定の実施形態は、本明細書記載のいずれかの治療方法での使用のための薬物の製造における本明細書記載のいずれかの化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
特定の実施形態は、本明細書記載のいずれかの治療方法での使用のための本明細書記載のいずれかの化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
特定の実施形態は、９２〜１１０、１５０〜１６０、および１７１〜１７５のいずれかのヌクレオベース配列の内の少なくとも１２近接ヌクレオベースを含むヌクレオベース配列を有する１２〜３０連鎖ヌクレオシドから構成される修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、９２〜１１０、１５０〜１６０、および１７１〜１７５のいずれかのヌクレオベース配列の内の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも１１近接ヌクレオベースを含むヌクレオベース配列を有する。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、９２〜１１０、１５０〜１６０、および１７１〜１７５のいずれかのヌクレオベース配列の内の少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、または少なくとも１９の、近接ヌクレオベースを含むヌクレオベース配列を有する。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、単鎖オリゴヌクレオチドである。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオベース配列は、配列番号：１、ＸＸＸ、および１７０に対し１００％相補的である。
特定の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
特定の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾糖を含む。
特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は、二環糖である。
特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチルを含む。
特定の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾ヌクレオベースを含む。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオベースは、５−メチルシトシンである。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、
連鎖デオキシヌクレオシドで構成されるギャップセグメント；
連鎖ヌクレオシドで構成される５’ウイングセグメント；
連鎖ヌクレオシドで構成される３’ウイングセグメントを含み、
ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、
１０連鎖デオキシヌクレオシドで構成されるギャップセグメント；
５連鎖ヌクレオシドで構成される５’ウイングセグメント；
５連鎖ヌクレオシドで構成される３’ウイングセグメントを含み、
ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１４連鎖ヌクレオシドで構成される。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１６連鎖ヌクレオシドで構成される。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２０連鎖ヌクレオシドで構成される。
特定の実施形態は、本明細書記載の化合物を含む医薬組成物を提供する。
核構造
真核生物の核は、いくつかの区画および構造物を含む動的構造組織を有する。最も顕著な構造は、核小体の非膜構造であり、その中で、リボソームＲＮＡが転写され、プロセッシングされる（Ｔｈｉｒｙ，Ｍ．ａｎｄ Ｌａｎｆｏｎｔａｉｎｅ，Ｄ．Ｌ．Ｊ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００５．１５：１９４−１９９）。また、クロマチンドメインも重要な構造で、細胞のゲノムＤＮＡを収容し、その発現を調節する（Ｃｒｅｍｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．２０００．１０：１７９−２１２）。
また、核は、スペックル、または一群の顆粒を含み、その中のクロマチン間の顆粒（ＩＣＧ）がよく知られたクラスを形成し（Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９１．１０：２４６７−３４８１）、これが、種々のｓｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＰ（核内低分子ＲＮＡ結合タンパク質）、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩの貯蔵センターである（Ｆｕ，Ｘ．Ｙ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９０．３４３：４３７−４４１）。多くの大きなスペックルは、クロマチン間顆粒群（ＩＧＣ）に対応する。この群は、０．８〜１．８μｍの直径の大きさで、２０〜２５ｎｍの直径粒子からなり、これらは所々で連結されているように見える。ＩＧＣは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシング因子の構築および／または修飾に関与することが提唱されている。
核スプライシングスペックルまたはクロマチン間顆粒群（ＩＧＣ）は、また、核内繋留ＲＮＡを含む（Ｔｈｉｒｙ，Ｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３．６２：２５９−２６９）。特定の核内繋留ＲＮＡは、それらの寿命の持続期間の間は核内に残るが、これらの一部は、特定のシグナル、例えば、細胞ストレスに応答して細胞質に放出されることがある。ＲＮＡは、ＲＮＡアデノシンデアミナーゼによる編集および大きなＲＮＰ複合体形成の結果として核中に保持される。パラスペックル（ＰＳ）は、分離した核小体であり（Ｆｏｘ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ２００５．１６：５３０４−５３１５）、スプライシングスペックルの近くまたは隣接していることが多く、また、特定のＲＮＡの核内繋留に結びつけられている。調査（Ｃｌｅｍｅｎｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ２００９．３３：７１７−７２６；Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００９．１０６：２５２５−２５３０；Ｓｕｎｗｏｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００９．１９：３４７−３５９）により、ＰＳの形成と維持に重要な、構造的要素として、２つのノンコーディングＲＮＡ、Ｍｅｎε／ＮＥＡＴｌおよびＭｅｎβが明らかになっている。
ストレス核小体（ＳＮＢ）の形成はＰＳと同様であり、その類似性は、ｓａｔｅｌｌｉｔｅ反復転写物の周辺の特定の転写部位で生ずる（Ｄｅｎｅｇｒｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ２００２．１３：２０６９−２０７９；Ｊｏｌｌｙ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００２．１５６：７７５−７８１；Ｒｉｚｚｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４．１５：５４３−５５１）。ＳＮＢは、ＲＮＡ転写およびプロセッシングの調節因子に関連しているが、それらの実際の役割は、まだ明らかになっていない。
別の核ドメイン、クロマチン周辺フィブリル（ＰＣＦ）は、核全体に分布し、ｓｎＲＮＰ、非ｓｎＲＮＰおよびｈｎＲＮＰを含む（Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｄ．Ｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３．９：２６５−３１５）。これらは、ＰＣＦが転写およびｐｒｅ−ｍＲＮＡプロセッシング部位であることを示唆している（Ｆａｋａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８４．９８：３５８−３６３）。他のこのような活性核部位は、多くのＲＮＡ転写／処理要求がある細胞で認められるコイル体またはカハール体（ＣＢ）である（Ｌａｍｏｎｄ，Ａ．Ｉ．ａｎｄ Ｃａｒｍｏ−Ｆｏｎｅｓｃａ，Ｍ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９３．３：１９８−２０４；Ｇａｌｌ，Ｊ．Ｇ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０００．１６：２７３−３００）（Ｃａｊａｌ，Ｓ．Ｒ．Ｔｒａｂ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｂｉｏｌ．Ｕｎｉｖ．Ｍａｄｒｉｄ １９０３．２：１２９−２２１）。ＣＢは、ｓｎＲＮＰが成熟／再利用のために入り、最終的に他の機能ドメイン、例えば、スプライシングスペックルや活性転写ユニット、を組み込むために出て行くドメインである可能性がある。
さらなる核小体は、核小体に関連した核周囲区画（ＰＮＣ）で、また、ＲＮＡ代謝（Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０００．１２９：２３３−２４０）、核小体の顆粒および原線維領域、前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）核小体（Ｄｏｕｃａｓ，Ｖ．ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９９６．１２８８：Ｍ２５−Ｍ２９）、ヒストン遺伝子座体、熱ショック因子１病巣、ＳＡＭ−６８体、ＧＡＴＡ−１病巣、および核ドット（ｎｕｃｌｅａｒ ｄｏｔｓ）（Ａｓｃｏｌｉ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ Ｍａｕｌ，Ｇ．Ｇ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９１．１１２：７８５−７９５）に関与している。
特定の実施形態では、本明細書記載の方法で標的化されるｎｒＲＮＡは、限定されないが、核小体、カハール体、スペックル、パラスペックル、ストレス核小体、クロマチン周辺フィブリルおよび核周囲区画、等の本明細書記載の核内構造体の１つに含まれる。特定の実施形態では、本明細書記載の方法で標的にしているｎｒＲＮＡは、リボ核タンパク質またはＲＮＰ複合体に関連している。
核内繋留
細胞核、特に、哺乳動物細胞中の細胞核は、高度に組織化された構造である。特定のタンパク質および核酸が、核内構造体、例えば、核小体、カハール体、パラスペックル、および核スペックル中で濃縮されている（Ｐｌａｔｉｎｉ ａｎｄ Ｌａｍｏｎｄ，２００４）。これらの構造体の多くは、ＲＮＡの保持を介して遺伝子発現の制御に関与する。核内繋留の機序は、ＲＮＡのいくつかの構造体の機能により媒介されると考えられている。例えば、イノシン含有ＲＮＡ（またはアデノシンからイノシンへの超編集を受けるＲＮＡ）ならびに伸長３’ＵＴＲを有するＲＮＡおよび逆方向反復配列、例えば、Ａｌｕ配列を有するＲＮＡは、核内繋留に関連付けられている（Ｂｏｎｄ ａｎｄ Ｆｏｘ ２００９）。逆方向反復配列、例えば、Ａｌｕ反復を有するＲＮＡは、二重鎖ヘアピンを形成することが示されている。これらのヘアピンは、リボ核タンパク質に結合し、アデノシンからイノシンへの（Ａ−ｔｏ−Ｉ）超編集を受けうる（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ２００１；Ｂｏｎｄ ａｎｄ Ｆｏｘ，２００９）。また、他の調査では、安定性の理由から、ヒトＲＮＡにおけるＡ−ｔｏ−Ｉ編集の重要性が示された（Ａｔｈａｎａｓｉａｄｉｓ，２００４；Ｋｉｍ，２００４）。他の調査では、変異伸長ヌクレオチド反復含有ＲＮＡが核タンパク質または他のタンパク質に結合するヘアピンを形成し、それにより、核中に隔離または保持されるようになることが示されている。
従って、伸長３’ＵＴＲの存在、伸長または逆方向反復配列の存在、イノシンまたは特定の配列のＡ−ｔｏ−Ｉ編集の存在、および核タンパク質のＲＮＡに対する結合は、核内繋留または核内繋留ＲＮＡの安定性の増加に対する主要寄与因子である可能性がある。
特定の実施形態では、本明細書記載の方法で標的とされる、または提供されるｎｒＲＮＡは、伸長３’ＵＴＲを有する。特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡは、１つまたは複数の逆方向反復配列を有する。特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡは、イノシンを含むか、またはＡ−ｔｏ−Ｉ編集を受ける。特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡは、核タンパク質、リボ核タンパク質またはｓｎＲＮＰまたはそれらのいずれか１つまたは複数の複合体に結合する。
核内繋留ＲＮＡの安定性
ｎｒＲＮＡは、通常、タンパク質コードＲＮＡに比べて、より大きい安定性を有すると考えられている。比較に基づくｎｒＲＮＡの安定性は、通常、それらの構造ならびにリボ核タンパク質複合体との結合に起因する（Ｖｉｅｇａｓ，Ｓ．Ｃ．ａｎｄ Ａｒｒａｉａｎｏ，Ｃ．Ｍ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２００８．５２３０−２４３）。例えば、長い半減期を有するＭＡＬＡＴ１転写物は、保存され、ゲノムでコードされた短いポリ（Ａ）リッチな領域を有し、これがその成熟転写物の３’−末端の位置に短いポリＡテール様部分を付与する。このような短いポリ（Ａ）領域またはテールの存在は、以前、ＲＮＡ安定性を確実にするのに有効であることが示されている（Ｐｅｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ２００５．１１：９５８−９６５）。Ｕリッチモチーフは、また、ＲＮＡの安定性にある種の役割を果たすと考えられている。ポリＡテール様部分、および近くのＵリッチモチーフの存在は、ＭＡＬＡＴ−１の長い半減期およびそのエキソヌクレアーゼに対する抵抗性の理由であると考えられている（ＷｉｌｕｓｚＪ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２００８．１３５：９１９−９３２）。
特定の実施形態では、本明細書記載の方法で標的にされ、提供されるｎｒＲＮＡは、ポリＡテールまたはＵリッチモチーフを含む。
核内繋留ＲＮＡ
ノンコーディングＲＮＡ
大部分の哺乳類ゲノムは、タンパク質に翻訳されない、長いＲＮＡの転写物に転写される。このような長いノンコーディングＲＮＡは、以前には、細胞中のアーチファクトと考えられていたが、現在では、機能的に特徴付けされ始めている。長鎖ノンコーディングＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡ）は、アンチセンスまたは抑制、および／または他の遺伝子発現の調節により、多くの機能、例えば、構造的、ハウスキーピング、サイレンシングの１つを果たすことができる。Ｍｅｒｃｅｒ等（Ｍｅｒｃｅｒ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００８．１０５：７１６−７２１）は、成体マウス脳中で発現した８４９長鎖ｎｃＲＮＡを特定し、タンパク質コード能力のない大部分のプロセッシングされた転写物が、本来のＲＮＡとして機能することを見出した。Ｇｕｔｔｍａｎ等（Ｇｕｔｔｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．，２００９，４５８，２２３−２２７）は、千を超える長鎖ｎｃＲＮＡを特定し（大型介在性ノンコーディングＲＮＡまたはｌｉｎｃＲＮＡ）、推定機能をそれぞれに割り付け、胚性幹細胞多能性から細胞増殖までのプロセスにおける広範囲の役割を証明した。
構造的機能を有するとして文献に記載されている大型ノンコーディングＲＮＡは、Ｎｅａｔ１（Ｃｌｅｍｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２００９．３３：７１７−７２６）、Ｎｅａｔ２／Ｍａｌａｔ−１（Ｗｉｌｕｓｚ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２００８．１３５：９１９−９３２）、ｈｓｒ−ｏｍｅｇａ（Ｌａｋｈｏｔｉａ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｓｃｉ．１９９９．７７：５５３−５６３）、他のＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞の植物皮質に固定するＸｌｓｉｒｔ（Ｋｌｏｃ，Ｍ．ａｎｄ Ｅｔｋｉｎ，Ｌ．Ｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４．２６５：１１０１−１１０３）、ストレスの間、９ｑ１２動原体周囲領域の特定のクロマチン構造の樹立と維持に関連しているＳａｔｅｌｌｉｔｅ ＩＩＩ（Ｊｏｌｌｙ，Ｃ．ａｎｄ Ｌａｋｈｏｔｉａ，Ｓ．Ｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００６．３４：５５０８−５５１４）、およびＭｅｎβ（Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００９．１０６：２５２５−２５３０）である。最近の調査で、長鎖ｎｃＲＮＡをゲノム外情報の非メンデル型遺伝のメッセンジャーに結びつけた。シロイヌナズナ中の長鎖ｎｃＲＮＡｈｏｔｈｅａｄ（Ｌｏｌｌｅ，Ｓ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ ２００５．４３４：５０５−５０９）およびマウス中のＫｉｔ（Ｒａｓｓｏｕｌｚａｄｅｇａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００６．４４１：４６９−４７４）は、両方とも、代替ゲノムキャッシュとして機能する。
大規模シークエンシングプロジェクトからのデータの計算機分析により、多数の真核生物ゲノム中の天然アンチセンス転写物が明らかになった（Ｌｅｈｎｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２００２．１８：６３−６５；Ｌａｖｏｒｇｎａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２００４．２９：８８−９４）。ヒトの天然アンチセンス転写物として、１６００を越える転写物が特定された（Ｙｅｌｉｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３．２１：３７９−３８６）。これらは、シスまたはトランス配置で転写することができる。アンチセンス機能を有するとして文献に記載のノンコーディングＲＮＡは、Ｘ染色体不活性化の役割を有するＸｉｓｔ（Ｂｒｏｃｋｄｏｒｆｆ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９９２．７１：５１５−５２６，Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９９２．７１：５２７−５４２）；Ｘｉｓｔに対しアンチセンスであるＴｓｉｘ（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．１９９９．２１：４００−４０４）；父性対立遺伝子の常染色体遺伝子を発現抑制するＡｉｒ（Ｓｌｅｕｔｅｌｓ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００２．４１５：８１０−８１３）；Ｃｏｐ２遺伝子に対しアンチセンスで、母系性にインプリントされているＣｏｐ２ａｓ（Ｌｅｅ，Ｙ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０００．４７２：２３０−２３４）；父性的に発現するＲｔｌ１遺伝子に対しアンチセンスであるＭｉｒｇ（Ｓｅｉｔｚ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２００３．３４：２６１−２６２）；系列特異的にサイレンシングを調節するアンチセンス転写物であるＫｃｎｑｌｏｔ１（Ｔｈａｋｕｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００４．２４：７８５５−７８６２；Ｐａｎｄｅｙ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２００８．３２：２３２−２４６）；Ｃｏｕｐ−ＴｆＩＩ遺伝子に対しアンチセンスであるＡＫ０４５０７０；Ｐ−ｒｅｘ１遺伝子に対しアンチセンスであるＰ−ｒｅｘ１ＡＳ（Ｍｅｒｃｅｒ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００８．１０５：７１６−７２１）；ＺＮＦ１２７遺伝子に対しアンチセンスであるＺＮＦ１２７ＡＳ（Ｊｏｎｇ１９９９）；ＮＥＳＰ５５遺伝子に対しアンチセンスであるＮＥＳＰＡＳ（Ｗｒｏｅ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２０００．９７：３３４２−３３４６）；酵母のＳＥＲ３遺伝子の転写を抑えるＳＲＧ１（Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．２００４．１９：２６９５−２７０４）；Ｂ細胞のＥｒｂＡα２ｍＲＮＡに対するアンチセンス転写物（Ｈａｓｔｉｎｇｓ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７．２５：４２９６−４３００；Ｈａｓｔｉｎｇｓ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００．２７５：１１５０７−１１５１３）；鉄代謝に関与するＨＦＥｍＲＮＡに対するアンチセンス転写物（Ｔｈｅｎｉｅ，Ａ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００１．１０：１８５９−１８６６）；ｎＮＯＳタンパク質合成のアンチセンス制御因子である偽ＮＯＳ転写物（Ｋｏｒｎｅｅｖ，Ｓ．Ａ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９９．１９：７７１１−７７２０）；および、ＨＯＸＤ座位のトランス配置の転写を抑えるＨｏｔａｉｒを含む２３１の既知のＨｏｘ ｎｃＲＮＡ（Ｒｉｎｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２００７．１２９：１３１１−１３２３）である。
ノンコーディングＲＮＡは、また、ｄｓＲＮＡとして遺伝子発現を調節でき、また、ＲＮＡｉ経路を介して遺伝子サイレンシングを誘導する。このようなセンス−アンチセンスＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシングは、文献により充分に立証されている（Ａｒａｖｉｎ，Ａ．Ａ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２００１．１１：１０１７−１０２７；Ｓａｉｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．２００６．２０：２２１４−２２２２；Ｖａｇｉｎ，Ｖ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６．３１３：３２０−３２４）。これらの哺乳動物の転写物は、ｐｉＲＮＡと呼ばれており（Ａｒａｖｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００６．４４２：２０３−２０７；Ｇｉｒａｒｄ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２００６．４４２：１９９−２０２）、生殖系列特異的転写および転写後遺伝子サイレンシングに関与する（Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６．３１３：３０５−３０６；Ｌａｕ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６．３１３：３６３−３６７）。
調節の機能を有するとして文献で記載されている他のノンコーディングＲＮＡは、Ｅｖｆ（Ｆｅｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００６．２０：１４７０−１４８４）、これは、ホメオボックス転写因子Ｄｌｘ２；Ｇｌｔ２と相互作用し（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ−Ｇｏｓｓｌｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．１９９８．２１２：２１４−２２８））、また、小人症表現型の調節に関与する；ニューロンの遺伝子発現に関与するＧｏｍａｆｕ（Ｓｏｎｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００７．１２０：２４９８−２５０６）；ニューロン新生の重要な制御因子であるＳｏｘ２遺伝子を含むＳｏｘ２ｏｔ（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００７．４４８：５５３−５６０）、胎仔移植を調節するｍｉｒ−１０１ａを包含するＡＫ０２１３６８、Ｓａｔｂ２遺伝子に対し双方向性で、皮質ニューロン中のクロマチンモデリングを調節する長鎖ｎｃＲＮＡ、Ｋｌｈｌｌ４遺伝子に対し双方向性の長鎖ｎｃＲＮＡ、Ｃａｍｋｋｌ遺伝子に対し双方向性の、雄−特異的記憶形成に関与する長鎖ｎｃＲＮＡ（Ｍｅｒｃｅｒ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００８．１０５：７１６−７２１）、母系性にインプリントされている遺伝子である長鎖ｎｃＲＮＡ Ｒｉａｎ（Ｈａｔａｄａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）２００１．１３０：１８７−１９０）、そのタンパク質コーディングパートナーを調節するＣＡＴ２転写物核内ＲＮＡ、ＣＡＴ２遺伝子（Ｐｒａｓａｎｔｈ，Ｋ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２００５．１２３：２４９−２６３）、Ｘｉｓｔ遺伝子をも調節する長鎖ｎｃＲＮＡ Ｘｉｔｅ、ＪｐｘおよびＦｔｘ（Ｈｅａｒｄ，Ｅ．ａｎｄ Ｄｉｓｔｅｃｈｅ，Ｃ．Ｍ．Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．２００６．２０：１８４８−１８６７；Ｃｈｕｒｅａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００２．１２：８９４−９０８）、雄Ｘ染色体の発現を調節する長鎖ｎｃＲＮＡ ＲｏＸ１およびＲｏＸ２（Ｄｅｎｇ，Ｘ．ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ，Ｖ．Ｈ．Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２００６．３１：５２６−５３２）、母系性にインプリントされている遺伝子の長鎖ｎｃＲＮＡ Ｈ１９およびその対応する父性的にインプリントされている長鎖ｎｃＲＮＡ、Ｉｇｆ２（Ｂｒａｎｎａｎ，Ｃ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０．１０：２８−３６）、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ／Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群に関与する長鎖ｎｃＲＮＡ、ＩＰＷ（Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉにインプリントされている）（Ｗｅｖｒｉｃｋ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９４．３：１８７７−１８８２）、母系性に転写された遺伝子の長鎖ｎｃＲＮＡＵＢＥ３Ａ（Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７．１７：７５−７８）、およびＡＴＰ１０Ｃ（Ｍｅｇｕｒｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２００１．２８：１９−２０）、赤血球細胞中のβ−ｇｌｏｂｉｎの遺伝子間座位から転写された長鎖ｎｃＲＮＡ（Ａｓｈｅ，Ｈ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｓ＆Ｄｅｖ．１９９７．１１：２４９４−２５０９）、Ｔｈ２細胞のＩＬ４／ＩＬ１３座位の遺伝子間座位から転写された長鎖ｎｃＲＮＡ（Ｒｏｇａｎ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００４．１０１：２４４６−２４５１）、ホメオティック遺伝子を調節するｍｉＲＮＡ ｍｉｒ−ｉａｂ−４−５ｐおよびｍｉｒ−ｉａｂ−４−３ｐ（Ａｒａｖｉｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００３．２４：６７４２−６７５０）、ショウジョウバエのＴＲＥ座位を調節する長鎖ｎｃＲＮＡ転写物（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｅｌｓｎｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６．３１１：１１１８−１１２３）、ショウジョウバエの生殖細胞転写抑制に関与する長鎖ｎｃＲＮＡ ｐｇｃ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６．２７４：２０７５−２０７９）、哺乳動物のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ転写伸長因子Ｐ−ＴＥＦｂに結合し、阻害する７ＳＫ（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｖ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００１．４１４：３２２−３２５）、マウスの環境ストレスの間に発現上昇し、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩを阻害する長鎖ｎｃＲＮＡＢ２（Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００４．１１：８１６−８２１）、熱ショック応答を活性化するＨＳＲ−１（Ｓｈａｍｏｖｓｋｙ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００６．４４０：５５６−５６０）、ニューロンの樹状ドメインを標的にし、脆弱Ｘ症候群に結びつけられる長鎖ｎｃＲＮＡ ＢＣ１とＢＣ２００（Ｏ’Ｄｏｎｅｌｌ，Ｗ．Ｔ．ａｎｄ Ｗａｒｒｅｎ，Ｓ．Ｔ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２．２５：３１５−３３８）、ＮＲＳＦ／ＲＥＳＴ転写装置と相互作用し、神経幹細胞から分化型ニューロンへの変化が起こるＮＲＳＥ（Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２００４．１１６：７７９−７９３）、ウイルス様エプスタイン・バーウイルス中のウイルス潜伏の間に発現したウイルス性長鎖ｎｃＲＮＡ ＥＢＥＲ１とＥＢＥＲ２（Ｌｅｍｅｒ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８１．７８：８０５−８０９）、またこれらは、バーキットリンパ腫細胞の悪性表現型の維持に主要な役割を果たす（Ｎａｎｂｏ，Ａ．ａｎｄ Ｔａｋａｄａ，Ｋ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２００２．１２：３２１−３２６）、ＮＦＡＴ転写因子の抑制因子であるＮＲＯＮ（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ａ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５．３０９：１５７０−１５７３）、Ｍａｋｏｒｉｎ−１ｍＲＮＡを安定化するＭａｋｏｒｉｎ−ｐｌ（Ｙａｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００４．８２：４１４−４２２）、両方ともヒト脳進化に結びつけられる長鎖ｎｃＲＮＡ ＨＡＲ１ＦとＨＡＲ１Ｒ（Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００６．４４３：１６７−１７２）、ならびに、活性転写部位の上流で産生され、遺伝子活性と正に関連する長鎖ｎｃＲＮＡ ＰＲＯＭＰＴ（Ｐｒｅｋｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８．３２２：１８５１−１８５４）である。
腫瘍細胞を正常細胞と比較する発現分析では、いくつかの形の癌で特定の長鎖ｎｃＲＮＡの発現レベルの変化が示された。報告された長鎖ｎｃＲＮＡは、小児癌のＨ１９（ＤｅＢａｕｎ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００２．７０：６０４−６１１）、およびウイルムス腫瘍およびいくつかの胎児腫瘍のＩｇｆ２（Ｏｋｕｔｓｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００．１２７：４７５−４８３）（これらの両方は、腫瘍細胞ＯＣＣ１中で発現が低減され、結腸癌中で高発現している（Ｐｉｂｏｕｉｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．２００２．１３３：５５−６０））、前立腺腫瘍中で高発現している長鎖ｎｃＲＮＡ ＤＤ３／ＰＣＡ３およびＰＣＧＥＭ１（Ｂｕｓｓｅｍａｋｅｒｓ，ＭＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９．５９：５９７５−５９７９）、非小細胞肺癌中（Ｊｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００３．２２：８０３１−８０４１）および子宮内膜間質肉腫および肝細胞癌中で高発現しているＭＡＬＡＴ−１（Ｙａｍａｄａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．２００６．９７：１０６−１１２）、胞巣状横紋筋肉腫で高発現しているＮＣＲＭＳ（Ｃｈａｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００２．２１：３０２９−３０３７）、リンパ腫形成および赤白血病形成に結びつけられるＨＩＳ−１（Ｔａｍ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００２．７６：４２７５−４２８６）、乳、頸、食道、肺、卵巣、耳下腺、および舌癌中で高発現しているＢＣ２００（Ｃｈｅｎ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９７．１８３：３４５−３５１）、Ｂ細胞腫瘍に結びつけられるＢＣＭＳ（Ｗｏｌｆ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００１．１０：１２７５−１２８５）、屈曲肢異形成症に結びつけられるＣＭＰＤ（Ｎｉｎｏｍｉｙａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９６．５：６９−７２）、卵巣癌細胞中で発現しているＨＯＳＴ２（Ｒａｎｇｅｌ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００３．２２：７２２５−７２３２）、前立腺癌に結びつけられるＮＣ６１２（Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２００３．３１０：４９−５７）、乳癌中で発現したステロイド受容体活性化ＲＮＡアイソフォームであるＳＲＡ（Ｌａｎｚ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９９９．９７：１７−２７）、ならびに、種々の癌に結びつけられるＴＲＮＧ１０（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．ジェネット．１９９８．７：１１６９−１１７８）である。
種々の傷害に結びつけられる他の長鎖ｎｃＲＮＡは、アルツハイマー病のＢＣ２００（Ｌｕｋｉｗ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９２．１７：５９１−５９７）、統合失調症および双極性感情障害のＤＩＳＣ２（Ｍｉｌｌａｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０００．９：１４１５−１４２３；ＭｉｌｌａｒＪ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２００４．３６：３６７−３７８）、プラダーウィリ症候群のＩＰＷ（Ｗｅｖｒｉｃｋ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９４．３：１８７７−１８８２）、プリオン病態のプリオン関連ＲＮＡ（Ｄｅｌｅａｕｌｔ，Ｎ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００３．４２５：７１７−７２０）、統合失調症患者の脳中で発現が減少したＰＳＺＡｌｌｑｌ４（Ｐｏｌｅｓｓｋａｙａ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２００３．７４：１１１−１２２）、自閉症性障害のＲＡＹ１／ＳＴ７（Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２００２．８０：２８３−２９４）、脊髄小脳失調症８型のＳＣＡ８（Ｎｅｍｅｓ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０００．９：１５４３−１５５１）、アンジェルマン症候群のＵＢＥ３Ａ−ＡＳ（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｂｒａｎｎａｎ，Ｃ．Ｉ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００１．７３：３１６−３２２）、プラダーウィリ症候群のＺＮＦ１２７ＡＳ（Ｊｏｎｇ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９９．８：７８３−７９３）、ディジョージ症候群の２２ｋ４８（Ｐｉｚｚｕｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１９９９．６７：２２７−２３５）、びまん性汎細気管支炎のＣ６ｏｒｆ３７０Ｓ（Ｍａｔｓｕｚａｋａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００２．５４：３０１−３０９）、ラッセル・シルバー症候群のＣＯＰＧ２ＩＴ１（Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０００．６８：３３０−３３５）、ディジョージ症候群で切断されたＤＧＣＲ５（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９９６．５９：２３−３１）、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群のＨＩ９およびＬＩＴｌ（Ｓｐａｒａｇｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２００４．３６：９５８−９６０；Ｎｉｅｍｉｔｚ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００４．７５：８４４−８４９）、ロマノ−ワード、イェルヴェル−ランゲ−ニールセン症候群のＬＩＴ１（Ｈｏｒｉｋｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０００．９：２０７５−２０８３）、ラッセル・シルバー症候群のＭＥＳＴＩＴ１（Ｌｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２．２７７：１３５１８−１３５２７）、および乾癬のＰＲＩＮＳ（Ｓｏｎｋｏｌｙ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００５．２８０：２４１５９−２４１６７）である。
特定の核内のノンコーディングｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ前駆物質は、また、疾患に関連し、本明細書で提供される方法による標的とすることができる。例えば、ＢＩＣは、非ホジキンリンパ腫およびバーキットリンパ腫で高発現している核内ノンコーディングｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ前駆物質である（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２００３．３７：２０−２８）。
核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）は、別のタイプの真核細胞の核内の核小体に局在化している核内繋留ノンコーディングＲＮＡである。特定の例では、このようなｓｎｏＲＮＡは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の前駆物質に関連していることが示された。従って、特定のｓｎｏＲＮＡは、ヌクレオチド修飾およびｐｒｅ−ｒＲＮＡのプロセッシングに関与していると報告されている。ｓｎｏＲＮＡＵ１６およびＵ５０は、他の小分子核内ＲＮＡの修飾に関し機能する（Ｆｒａｇａｐａｎｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２９２１−２９２８，１９９３；Ｔａｎａｋａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．５：２７７−２８７，２０００）。また、核酸は、核内のカハール体中で見付けられた。カハール体で見つかったＲＮＡは、小分子カハール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）と名付けられた。特定のｓｃａＲＮＡは、スプライセオソーム小分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）のヌクレオチド修飾に関与することが報告されている。ＳｎｏＲＮＡ装置は、先天性角化異常症およびプラダーウィリ症候群、等のヒト疾患に関与している（Ｍｅｉｅｒ，Ｕ．Ｔ．，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ ２００５ １１４：１−１４）。
ヌクレオチド反復伸長含有ＲＮＡ
変異体ヌクレオチド反復伸長含有ＲＮＡは、核内に隔離されるか、または繋留されるようになる核タンパク質または他のタンパク質に結合したヘアピンを形成できる。これらのヌクレオチド反復伸長含有ＲＮＡ（ｅｎｒＲＮＡ）は、また、当技術分野で、リボ核タンパク質を隔離し、核内でのＲＮＡ処理の正常な作用を傷害する能力を獲得する「機能獲得型ＲＮＡ（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ＲＮＡ）」と呼ばれる（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｔ．（２００９）Ｃｅｌｌ １３６，７７７−７９３；Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，ＪＲ（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（１２），７４１９−７４２３、を参照）。いくつかの疾患状態が、ｅｎｒＲＮＡに関連し、反復の閾値の数が、ｅｎｒＲＮＡ中に含まれている場合のみに、前記疾患の一部が発生する。例えば、別の疾患または重症度が、特定の遺伝子中の異なる反復数である４００超の反復が原因である場合でも、ある疾患状態は、同じ遺伝子中の５０〜２００反復が原因の可能性がある。ｅｎｒＲＮＡの原因となった一部の変異は、ヘテロ接合である可能性があり、従って、いくつかの遺伝子のコピーは、機能性である可能性があり、結果として、遺伝子の野性型コピーに影響を与えることなく、変異体バージョンの遺伝子で干渉する必要がある。疾患に関わる反復配列伸長を有する可能性のあるヌクレオチド反復含有ＲＮＡ分子の例は、以下のものである：
表からの１例は、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）である。１／７，５００の推定頻度のＤＭ１は、進行性身体障害および若死にの原因となる常染色体優性遺伝病である。骨格、心臓、および平滑筋が罹患する。この障害の経過の変更を示す治療は今まで無かった。ＤＭ１の原因は、サイトゾルプロテインキナーゼをコードする遺伝子であるＤＭＰＫの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中のＣＴＧ反復伸長である。変異は、分裂中の、および有糸分裂後の細胞中で不安定であり、さらなる伸長への偏りを伴う。患者は、典型的には、骨格および心筋で数千回反復を伴うＤＭＰＫ対立遺伝子を有する。
ＤＭ１に関する研究により、ＲＮＡ占有（ＲＮＡ ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）の発見に至った。このＲＮＡ占有の疾患過程で、ＣＵＧ反復伸長（ＣＵＧｅｘｐ）を含むＲＮＡの発現が、細胞機能障害および最終的には、筋肉の細胞変性を誘導する。この過程の重要なステップは、ＣＵＧ反復とＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ様（ＭＢＮＬ１）ファミリー中のスプライシング因子との相互作用である。この相互作用が、核内ドット（ｎｕｃｌｅａｒ ｆｏｃｉ）中へのＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡの繋留を起こし、これが他の遺伝子の転写および転写後調節に悪影響を及ぼす。疾患の治療は、薬剤または試薬が筋肉組織により取り込まれなければならないために、複雑である。筋肉組織のオリゴヌクレオチド取込は非常に少ない。
核内繋留ＲＮＡの低減
本明細書で提供されるデータは、核内繋留ＲＮＡがオリゴヌクレオチド取込の少ない組織中の核内繋留標的を薬理学的に関連する量だけ低減することを可能とするために、ＡＳＯの切断に対する感受性が劇的に増加することを示している。例えば、アンチセンスによって、Ｉｓｉｓが標的としている４，０００を越える転写物の中で、ノンコーディング核内繋留ＲＮＡのＭＡＬＡＴ１は、アンチセンスオリゴヌクレオチド／ＲＮアーゼＨによる抑制に対し、最も感受性の高い標的の１つであることが証明されている。データは、インビトロで５０％超、抑制する転写物の大部分を標的化する多数のオリゴヌクレオチドを示している。データは、また、複数の細胞型中で非常に低いＩＣ５０値を示す。また、半減期の調査は、ＭＡＬＡＴ１は、少なくとも１０時間を越える期間安定であることを示している。他のオリゴヌクレオチド薬剤（例えば、肝臓標的化薬剤）と同一基準の用量でのＭＡＬＡＴ１を標的化するオリゴヌクレオチドの皮下投与により、骨格および心筋中のＭＡＬＡＴ１の薬理学的に関連した減少を実現した。３．５週間の５０ｍｇ／ｋｇ隔週投薬により、腓腹筋および四頭筋で、それぞれ、８９％および８５％の減少、ならびに、心臓で５４％減少（肝臓での９５％減少に比べて）を実現した。薬理学的に関連するＭＡＬＡＴ１の減少は、また、腫瘍異種移植片モデルでも達成された。
核内繋留ＲＮＡが変異体ＲＮＡである場合は、これの感受性が、また、野性型に対して変異体ＲＮＡを選択的に減らす手段を提供する。この手法は、機能的タンパク質欠損を誘導するリスクが減るので、有利である。
アンチセンス化合物
オリゴマー化合物は、限定されないが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡを含む。オリゴマー化合物は、標的核酸に対し「アンチセンス」であってもよく、これは、水素結合により標的核酸に対しハイブリダイゼーションできることを意味する。
特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、５’から３’方向に記述する場合、標的にされる標的核酸の標的セグメントの逆相補配列を含むヌクレオベース配列を有する。特定のこのような実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に記述する場合、標的にされる標的核酸の標的セグメントの逆相補配列を含むヌクレオベース配列を有する。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡ核酸を標的としたアンチセンス化合物は、１０〜３０ヌクレオチドの長さである。すなわち、アンチセンス化合物は、１０〜３０連鎖ヌクレオベースからなる。他の実施形態では、アンチセンス化合物は、８〜８０、１０〜８０、１２〜５０、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、または２０連鎖ヌクレオベースからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。特定のこのような実施形態では、アンチセンス化合物は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０連鎖ヌクレオベースの長さ、または上記値のいずれかの２つで規定される範囲の連鎖ヌクレオベースの長さからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、短縮型、または切断型修飾オリゴヌクレオチドを含む。短縮型または切断型修飾オリゴヌクレオチドは、５’末端から（５’切断）の、または、その代わりに、３’末端から（３’切断）の単一ヌクレオシド欠失があってもよい。短縮型または切断型オリゴヌクレオチドは、５’末端からの２つのヌクレオシド欠失があってもよく、または、代わりに、３’末端から２つのサブユニット欠失があってもよい。あるいは、例えば、５’末端からの１つのヌクレオシド欠失、および３’末端からの１つのヌクレオシド欠失を有するアンチセンス化合物において、欠失ヌクレオシドは、修飾オリゴヌクレオチド全体にばらまかれてもよい。
伸長オリゴヌクレオチドで、単一の追加ヌクレオシドが存在する場合は、追加のヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端に位置してもよい。２つ以上の追加のヌクレオシドが存在する場合は、例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端に（５’付加）、または、代わりに、３’末端（３’付加）に追加された２つのヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドにおいて、追加ヌクレオシドは、相互に隣接していてもよい。あるいは、例えば、５’末端への１つのヌクレオシド追加および３’末端への１つのサブユニット追加を有するオリゴヌクレオチドにおいて、追加ヌクレオシドは、アンチセンス化合物全体にばらまかれてもよい。
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さを増やすか、または減らすことができ、および／または活性を失うことなく、ミスマッチ塩基を導入することができる。例えば、Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７３０５−７３０９，１９９２）中で、一連の１３〜２５ヌクレオベース長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドの卵母細胞投与モデル中の標的ＲＮＡの切断を導入する能力を試験した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端近くに８または１１ミスマッチ塩基を有する２５ヌクレオベース長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも程度は少ないが、標的ｍＲＮＡの特異的切断を指示することができた。同様に、１または３ミスマッチを有するものを含む１３ヌクレオベースアンチセンスオリゴヌクレオチドを使って、標的特異的切断を実現した。
Ｇａｕｔｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９３：４６３−４７１，Ｍａｒｃｈ ２００１）は、ｂｃｌ−２ｍＲＮＡに１００％の相補性を有し、ｂｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡに対し３つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドのｂｃｌ−２およびｂｃｌ−ｘＬの両方の発現をインビトロおよびインビボで低減させる能力を立証した。さらに、このオリゴヌクレオチドは、インビボで強力な抗腫瘍活性を示した。
ＭａｈｅｒとＤｏｌｎｉｃｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：３３４１−３３５８，１９８８）は、それぞれ、２つまたは３つのタンデムアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列からなる一連のタンデム１４ヌクレオベースアンチセンスオリゴヌクレオチド、および２８および４２ヌクレオベースアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ヒトＤＨＦＲの翻訳を抑止する能力をウサギ網状赤血球アッセイにより試験した。それぞれ、３つの１４ヌクレオベースアンチセンスオリゴヌクレオチド単独で、２８または４２ヌクレオベースアンチセンスオリゴヌクレオチドよりもわずかに多いレベルであるが、翻訳を抑制できた。
アンチセンス化合物モチーフ
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、いくつかのパターンまたはモチーフに配置された化学修飾サブユニットを有し、アンチセンス化合物特性、例えば、標的核酸に対し強化された抑制活性、増加した結合親和性、またはインビボのヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性を付与する。
キメラアンチセンス化合物は、典型的には、少なくとも１つの修飾された領域を含み、それにより、標的核酸に対し、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増加、細胞取込の増加、結合親和性の増加、および／または抑制活性の増加を付与する。キメラアンチセンス化合物の２つめの領域が、任意選択で、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する核リボヌクレアーゼＲＮアーゼＨの基質として作用できてもよい。
ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物は、キメラアンチセンス化合物と考えられる。ギャップマー中では、ＲＮアーゼＨ切断を支援する複数のヌクレオチドを有する内部領域は、内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外部領域の間に位置している。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合には、ギャップセグメントは、通常、エンドヌクレアーゼ切断の基質として作用するが、一方、ウイングセグメントは、修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、ギャップマーの領域は、それぞれ異なる領域を含む糖部分の型により識別される。ギャップマーの領域識別のために使われる糖部分の型は、一部の実施形態では、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２’−修飾ヌクレオシド（このような２’−修飾ヌクレオシドは、特に、２’−ＭＯＥ、および２’−Ｏ−ＣＨ３、を含んでもよい）、および二環糖修飾ヌクレオシド（このような二環糖修飾ヌクレオシドは、４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋を含んでもよく、ここで、ｎ＝ｌまたはｎ＝２である）を含んでもよい。好ましくは、各異なる領域は、均一な糖部分を含む。ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載されることが多く、ここで「Ｘ」は、５’ウイング領域の長さを表し、「Ｙ」は、ギャップ領域の長さを表し、および「Ｚ」は、３’ウイング領域の長さを表す。本明細書で使われる、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載されるギャップマーは、ギャップセグメントが、それぞれ、５’ウイングセグメントおよび３’ウイングセグメントのすぐ近くの位置になる配置を有する。従って、５’ウイングセグメントとギャップセグメントの間、またはギャップセグメントと３’ウイングセグメントの間には、介在するヌクレオチドが存在しない。本明細書記載のいずれかのアンチセンス化合物は、ギャップマーモチーフを持つことができる。一部の実施形態では、ＸとＺは同じであり、他の実施形態では、それらは異なる。好ましい実施形態では、Ｙは、８と１５ヌクレオチドの間である。Ｘ、ＹまたはＺは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０またはそれ超のヌクレオチドのいずれかであってよい。従って、ギャップマーは、限定されないが、例えば、５−１０−５、４−８−４、４−１２−３、４−１２−４、３−１４−３、２−１３−５、２−１６−２、１−１８−１、３−１０−３、２−１０−２、１−１０−１、２−８−２、６−８−６、５−８−５、１−８−１、または２−６−２を含む。
特定の実施形態では、「ウイングマー」モチーフとしてのアンチセンス化合物は、ウイング−ギャップまたはギャップ−ウイング配置、すなわち、ギャップマー配置に対する上述のように、Ｘ−ＹまたはＹ−Ｚ配置を有する。従って、ウイングマー配置は限定されないが、例えば、５−１０、８−４、４−１２、１２−４、３−１４、１６−２、１８−１、１０−３、２−１０、１−１０、８−２、２−１３、または５−１３を含む。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、５−１０−５ギャップマーモチーフを有する。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、ギャップ拡大モチーフを有する。
標的核酸、標的領域およびヌクレオチド配列
ｎｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、限定されないが、表１および表２に挙げたものを含む本明細書記載の配列を含む。
本明細書の実施例において各配列番号で規定された配列は、糖部分、ヌクレオシド間結合、またはヌクレオベースに対するどのような修正とも独立していることは理解されよう。従って、配列番号によって規定されるアンチセンス化合物は、独立に、糖部分、ヌクレオシド間結合、またはヌクレオベースに対する１つまたは複数の修飾を含むことができる。Ｉｓｉｓ番号（Ｉｓｉｓ Ｎｏ）により記述されたアンチセンス化合物は、ヌクレオベース配列およびモチーフの組み合わせを示している。
特定の実施形態では、標的領域は、標的核酸の構造的に定義された領域である。例えば、標的領域は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エキソン、イントロン、エキソン／イントロン接合部、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、または他の定義された核酸領域を包含できる。ｎｒＲＮＡ用の構造的に定義された領域は、配列データベース、例えば、ＮＣＢＩからの受入番号により得ることができ、このような情報は、参照によって本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、標的領域は、標的領域内の１つの標的セグメントの５’標的部位から標的領域内の別の標的セグメントの３’標的部位までの配列を含んでもよい。
標的化は、アンチセンス化合物がハイブリダイズし、それにより、所望の効果が生ずる少なくとも１つの標的セグメントの決定を含む。特定の実施形態では、所望の効果は、ｍＲＮＡ標的核酸レベルの減少である。特定の実施形態では、所望の効果は、標的核酸にコードされたタンパク質のレベルの減少、または標的核酸に関連する表現型の変化である。
標的領域は、１つまたは複数の標的セグメントを含むことができる。標的領域内の複数の標的セグメントは、オーバーラップしてもよい。あるいは、それらは、非オーバーラップであってもよい。特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、約３００以下のヌクレオチドにより分離されている。特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド、約前記値のヌクレオチド、前記値以下のヌクレオチド、もしくは約前記値以下のヌクレオチド、または前記の値のいずれか２つにより定義される範囲のいくつかのヌクレオチドにより分離されている。特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の５以下、または約５以下のヌクレオチドにより分離されている。特定の実施形態では、標的セグメントは、近接している。本明細書に挙げた５’標的部位または３’標的部位のいずれかの核酸から始まる範囲により定義される標的領域が意図されている。
適切な標的セグメントは、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、イントロン、エキソン、またはエキソン／イントロン接合部内で見付けることができる。開始コドンまたは停止コドンを含む標的セグメントは、また、適切な標的セグメントである。適切な標的セグメントとして、特に、特定の構造的に定義された領域、例えば、開始コドンまたは停止コドンを除外することができる。
適切な標的セグメントの決定には、標的核酸配列の他のゲノム全体の配列に対する比較を含んでもよい。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使って、異なる核酸の中で類似性のある領域を特定することができる。この比較は、選択標的核酸以外の配列（すなわち、非標的または標的外配列）に非特異的にハイブリダイズできるアンチセンス化合物配列の選択を防ぐことができる。
活性標的領域内のアンチセンス化合物の活性の変化（例えば、標的核酸レベルのパーセント減少率で定義されるような）が生じうる。特定の実施形態では、表現型の変化、例えば、核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または傷害の症状の治療、改善、遅延または低減は、ｎｒＲＮＡの抑制を示す。
ハイブリダイゼーション
一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションが、本明細書で開示のアンチセンス化合物とｎｒＲＮＡの間で起こる。最も一般的なハイブリダイゼーション機序は、核酸分子の相補的なヌクレオベースの間の水素結合（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合）を伴う。
ハイブリダイゼーションは、種々の条件下で起こりうる。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、ハイブリダイズされる核酸分子の性質および組成により決まる。
配列が特異的に標的核酸にハイブリダイズ可能かどうかを判定する方法は、当技術分野でよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），３ｒｄ Ｅｄ．，２００１）。特定の実施形態では、本明細書で提供されるアンチセンス化合物は、ｎｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズ可能である。
相補性
アンチセンス化合物の充分な数のヌクレオベースが、標的核酸の対応するヌクレオベースと水素結合でき、それにより、所望の効果（例えば、ｎｒＲＮＡ等の標的核酸のアンチセンス抑制）が生ずる場合は、アンチセンス化合物および標的核酸は、相互に相補的である。
アンチセンス化合物は、介在するか、または隣接するセグメントがハイブリダイゼーションイベント（例えば、ループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）に関与しないように、ｎｒＲＮＡの１つまたは複数のセグメントにわたりハイブリダイズする。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるアンチセンス化合物、もしくはその指定部分は、ｎｒＲＮＡ、標的領域、標的セグメント、もしくはその指定部分に７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％相補的または少なくとも前記値に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ｎｒＲＮＡ、標的領域、標的セグメント、もしくはその指定部分に対し、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的であり、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、または少なくとも１９の本明細書記載の代表的アンチセンス化合物のいずれかのヌクレオベース配列の近接ヌクレオベースを含む。標的核酸を含むアンチセンス化合物のパーセント相補性は、通常の方法を使って測定できる。
例えば、アンチセンス化合物の２０ヌクレオベースの内の１８が標的領域に相補的であり、従って、特異的にハイブリダイズすると思われるアンチセンス化合物は、９０パーセント相補性を示すであろう。この例では、残りの非相補性ヌクレオベースは、相補的ヌクレオベース内でクラスターを形成するか、または散在し、相互に、または相補的なヌクレオベースに近接する必要はない。従って、１８ヌクレオベース長の、標的核酸を含む２つの完全相補性領域により隣接されている４つの非相補性ヌクレオベースを有するアンチセンス化合物は、標的核酸と７７．８％の全体相補性を持ち、その結果、本発明の範囲に入るであろう。標的核酸領域を有するアンチセンス化合物のパーセント相補性は、当技術分野で既知のＢＬＡＳＴプログラム（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌｓ）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３ ４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９ ６５６）を使って通常の方法で測定できる。パーセント相同性、配列同一性または相補性は、例えば、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列解析パッケージ、Ｕｎｉｘ用Ｖｅｒｓｉｏｎ ８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）により、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２ ４８９）を使用するデフォルト設定を使って、決定できる。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるアンチセンス化合物、またはその指定部分は、標的核酸、またはその指定部分に対し完全に相補的（すなわち、１００％相補的）である。例えば、アンチセンス化合物は、標的核酸、または標的領域、またはその標的セグメントまたは標的配列に完全に相補的であってもよい。本明細書で使用される「完全に相補的な」は、アンチセンス化合物の各ヌクレオベースが標的核酸の対応するヌクレオベースと厳密な塩基対形成可能であることを意味する。例えば、２０ヌクレオベースアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物に完全に相補的な標的核酸の対応する２０ヌクレオベース部分が存在する限り、４００ヌクレオベース長の標的配列に完全に相補的である。完全な相補性は、また、第１および／または第２の核酸の指定部分に関連して使用できる。例えば、３０ヌクレオベースアンチセンス化合物の２０ヌクレオベース部分は、４００ヌクレオベース長の標的配列に対し「完全に相補的」でありうる。標的配列が対応する２０ヌクレオベース部分を有し、各ヌクレオベースがアンチセンス化合物の２０ヌクレオベース部分に相補的である場合は、３０ヌクレオベースオリゴヌクレオチドの２０ヌクレオベース部分は、標的配列に完全に相補的である。同時に、アンチセンス化合物の残りの１０ヌクレオベースも、同様に標的配列に相補的であるかどうかに応じて、全３０ヌクレオベースアンチセンス化合物は、標的配列に完全に相補的でありうる。
非相補的なヌクレオベースの部位は、アンチセンス化合物の５’末端または３’末端であってもよい。あるいは、非相補的なヌクレオベースまたは複数ヌクレオベースは、アンチセンス化合物の内部位置にあってもよい。２つ以上の非相補的なヌクレオベースが存在する場合は、それらは、近接（すなわち、連鎖）していても、または非近接であってもよい。一実施形態では、非相補的なヌクレオベースは、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウイングセグメント中に位置する。
特定の実施形態では、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオベース長の、または前記数値までのヌクレオベース長のアンチセンス化合物は、４以下の、３以下の、２以下の、もしくは１以下のｎｒＲＮＡ等の標的核酸に対する非相補的なヌクレオベース、またはその指定部分を含む。
特定の実施形態では、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオベース長の、または前記数値までのアンチセンス化合物は、６以下の、５以下の、４以下の、３以下の、２以下の、または１以下のｎｒＲＮＡ等の標的核酸に対する非相補的なヌクレオベース、またはその指定部分を含む。
本明細書で提供されるアンチセンス化合物は、また、標的核酸の一部に相補的なものを含む。本明細書で使われる「部分」は、標的核酸の領域またはセグメント内の特定の数の近接（すなわち、連鎖）ヌクレオベースを指す。また、「部分」は、アンチセンス化合物の特定の数の近接ヌクレオベースを指す。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも８ヌクレオベース部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも１０ヌクレオベース部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも１５ヌクレオベース部分に相補的である。また、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、またはそれ超の標的セグメントのヌクレオベース部分、またはこれらの値のいずれか２つにより規定される範囲に相補的なアンチセンス化合物が意図されている。
同一性
本明細書で提供されるアンチセンス化合物は、また、特定のヌクレオチド配列、配列番号、または特定のＩｓｉｓ番号により表される化合物、またはその部分に対し特定のパーセント同一性を有することもできる。本明細書で使われるアンチセンス化合物は、それが同じヌクレオベース対形成能力を有する場合は、本明細書で開示の配列に同じである。例えば、ウラシルおよびチミジンは、アデニンと対形成するという理由から、開示ＤＮＡ配列でチミジンの代わりにウラシルを含むＲＮＡは、そのＤＮＡ配列と同じと見なされるであろう。短縮されたおよび伸長されたバージョンの本明細書記載のアンチセンス化合物ならびに本明細書で提供されるアンチセンス化合物に対して非等価塩基を有する化合物もまた、意図されている。非等価塩基は、相互に隣接しても、またはアンチセンス化合物全体にわたって散在していてもよい。アンチセンス化合物のパーセント同一性は、比較される配列に対して同じ塩基対形成を有する塩基の数を使って計算される。
特定の実施形態では、アンチセンス化合物、またはその部分は、本明細書で開示の１つまたは複数のアンチセンス化合物もしくは配列番号、またはその部分に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同じである。
修飾
ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドのヌクレオベース（塩基としても知られる）部分は、通常、ヘテロ環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに対して、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分に結合できる。オリゴヌクレオチドは、相互に隣接ヌクレオシドの共有結合により形成され、直鎖ポリマーオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合の形成であると見なされる。
アンチセンス化合物に対する修飾は、ヌクレオシド間結合、糖部分、またはヌクレオベースに対する置換または変更を含む。修飾されたアンチセンス化合物は、ネイティブ型よりも好ましいことが多く、理由は、望ましい特性、例えば、強化された細胞取込、強化された核酸標的に対する親和性、ヌクレアーゼの存在下で増加した安定性、または増加した抑制活性が得られるためである。
化学修飾のヌクレオシドは、また、その標的核酸に対する短縮型または切断型アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めるために採用できる。その結果、同程度の結果が、このような化学修飾ヌクレオシドを有する短いアンチセンス化合物で得られることが多い。
修飾ヌクレオシド間結合
ＲＮＡおよびＤＮＡの天然ヌクレオシド間結合は、３’から５’へのリン酸ジエステル結合である。１つまたは複数の修飾された、すなわち、非天然ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物は、天然ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物より優先して選択されることが多い。理由は、望ましい特性、例えば、強化された細胞取込、強化された核酸標的に対する親和性、およびヌクレアーゼの存在下で増加した安定性が得られるためである。
修飾ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するヌクレオシド間結合ならびにリン原子の無いヌクレオシド間結合を含む。代表的リン含有ヌクレオシド間結合には、限定されないが、リン酸ジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホン酸、ホスホロアミド酸、およびホスホロチオエート、が含まれる。亜リン酸含有および非亜リン酸含有結合の調製法は、よく知られている。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシド間結合を含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
修飾糖部分
本発明のアンチセンス化合物は、任意選択で、糖基が修飾されている１つまたは複数のヌクレオシドを含んでもよい。このような糖修飾ヌクレオシドは、強化されたヌクレアーゼ安定性、増加した結合親和性、またはいくつかの他の有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に対し付与することができる。特定の実施形態では、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例には、限定されないが、置換基の付加（５’および２’置換基、二環核酸（ＢＮＡ）のための非ジェミナル環原子の架橋結合、リボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ１）（Ｒ）２（Ｒ＝Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルによる置換、または保護基を含む）およびこれらの組み合わせによる置換が含まれる。化学修飾糖の例には、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（他の開示された５’、２’−ビス置換ヌクレオシドについては、２００８年８月２１日付け広報のＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００８／１０１１５７号を参照のこと）またはリボシル環酸素原子をＳで置換後、２’−位置のさらなる置換（２００５年６月１６日付け公報の米国特許公開第２００５−０１３０９２３号を参照のこと）もしくは、代わりに、ＢＮＡの５’−置換（２００７年１１月２２日付け広報のＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００７／１３４１８１号を参照のこと。この特許では、ＬＮＡは、例えば、５’−メチルまたは５’−ビニル基で置換されている）が含まれる。
修飾糖部分を有するヌクレオシドの例には、限定されないが、５’−ビニル、５’−メチル（ＲまたはＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３および２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含むヌクレオシドが含まれる。２’位置の置換基は、また、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、およびＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択でき、ここで各ＲｍおよびＲｎは、独立に、Ｈまたは置換もしくは未置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。
本明細書で使われる「二環ヌクレオシド」は、二環糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指す。二環ヌクレオシドの例には、限定されないが、４’および２’リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが含まれる。特定の実施形態では、本明細書で提供されるアンチセンス化合物は、４’〜２’架橋の二環ヌクレオシドを含む１つまたは複数の二環ヌクレオシドを含む。このような４’〜２’架橋二環ヌクレオシドの例には、限定されないが、式：４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’および４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（およびその類似体、２００８年７月１５日発行の米国特許第７，３９９，８４５号、参照）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’（およびその類似体、２００９年１月８日付け公報の国際公開第ＷＯ／２００９／００６４７８号、参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’（およびその類似体、２００８年１２月１１日付け公報の国際公開第ＷＯ／２００８／１５０７２９号、参照）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（２００４年９月２日付け公報の米国公開特許第２００４−０１７１５７０号、参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’、ＲはＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、または保護基（２００８年９月２３日発行の米国特許第７，４２７，６７２号、参照）；４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，．７４，１１８−１３４、参照）；および４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’（およびその類似体、２００８年１２月８日付け公報の国際公開第ＷＯ２００８／１５４４０１号、参照）、の内の１つが含まれる。例えば：Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，２２１９−２２２２；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９（２６）８３６２−８３７９（Ｊｕｌ．４，２００７）；米国特許第７，０５３，２０７号；同６，２６８，４９０号；同６，７７０，７４８号；同６，７９４，４９９号；同７，０３４，１３３号；および同６，５２５，１９１号；Ｅｌａｙａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８，１−７；およびＯｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９−２４３；および米国特許第６，６７０，４６１号；国際公開第ＷＯ２００４／１０６３５６号；同ＷＯ９４／１４２２６号；同ＷＯ２００５／０２１５７０号；米国公開特許第２００４−０１７１５７０号；同２００７−０２８７８３１号；同２００８−００３９６１８号；米国特許第７，３９９，８４５号；米国特許出願第１２／１２９，１５４号；米国特許仮出願第６０／９８９，５７４号；同６１／０２６，９９５号；同６１／０２６，９９８号；同６１／０５６，５６４号；同６１／０８６，２３１；同６１／０９７，７８７号；同６１／０９９，８４４号；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１号；同ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４号；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２号；および国際公開第ＷＯ２００７／１３４１８１号、を参照のこと。上出の各二環ヌクレオシドは、例えば、α−Ｌ−リボフラノースおよびβ−Ｄ−リボフラノース、等の１つまたは複数の立体化学糖配置を有するものとして調製できる（１９９９年３月２５日付け公報の国際公開第ＷＯ９９／１４２２６号として公開された国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３参照）。
特定の実施形態では、ＢＮＡヌクレオシド二環糖部分は、限定されないが、ペントフラノシル糖部分の４’と２’位置間に少なくとも１つの架橋を有する化合物を含み、このような架橋は、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲａ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−、および−Ｎ（Ｒａ）−、から独立に選択される１つまたは２〜４つの連結基を独立に含み；
式中：ｘは、０、１、または２であり；
ｎは、１、２、３、または４であり；
各ＲａおよびＲｂは、独立に、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、ヘテロ環ラジカル、置換ヘテロ環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、またはスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１であり；および
各Ｊ１およびＪ２は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ヘテロ環ラジカル、置換ヘテロ環ラジカル、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキルまたは保護基である。
特定の実施形態では、二環糖部分の架橋は、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−または−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。特定の実施形態では、架橋は、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’および４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−であり、各Ｒは、独立に、Ｈ、保護基またはＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
特定の実施形態では、二環ヌクレオシドは、異性体配置によりさらに定義される。例えば、４’−２’メチレンオキシ架橋を含むヌクレオシドは、α−Ｌ配置、またはβ−Ｄ配置であってもよい。以前、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡが、アンチセンス活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチド中に組み込まれた（Ｆｒｉｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。
特定の実施形態では、二環ヌクレオシドは、限定されないが、下図に示す（Ａ）ａ−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、および（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｇ）メチレンチオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレンアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環式（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ、ならびに（Ｊ）プロピレン炭素環式（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡ、を含む。

式中、Ｂｘは、塩基部分であり、Ｒは、独立に、Ｈ、保護基またはＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
特定の実施形態では、二環ヌクレオシドは、式Ｉ：

を有し、式中、
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基部分であり；
−Ｑａ−Ｑｂ−Ｑｃ−は、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−またはＮ（Ｒｃ）−Ｏ−ＣＨ２であり；
Ｒｃは、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたはアミノ保護基であり；さらに
ＴａおよびＴｂは、それぞれ、独立に、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体に対する共有結合である。
特定の実施形態では、二環ヌクレオシドは、式ＩＩ：

を有し、式中、
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基部分であり；
ＴａおよびＴｂは、それぞれ、独立に、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体に対する共有結合であり；
Ｚａは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオである。
一実施形態では、各置換基は、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪｃ、ＮＪｃＪｄ、ＳＪｃ、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊｃ、およびＮＪｅＣ（＝Ｘ）ＮＪｃＪｄから独立に選択される置換基で単一または多置換されており、式中、各Ｊｃ、ＪｄおよびＪｅは、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、ＯまたはＮＪｃである。
特定の実施形態では、二環ヌクレオシドは、式ＩＩＩ：

を有し、式中、
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基部分であり；
ＴａおよびＴｂは、それぞれ、独立に、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体に対する共有結合であり；
Ｚｂは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換アシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である。
特定の実施形態では、二環ヌクレオシドは、式ＩＶ：

を有し、式中、
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基部分であり；
ＴａおよびＴｂは、それぞれ、独立に、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体に対する共有結合であり；
Ｒｄは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり；
各ｑａ、ｑｂ、ｑｃおよびｑａは、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキルである。
特定の実施形態では、二環ヌクレオシドは、式Ｖ：

を有し、式中、
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基部分であり；
ＴａおよびＴｂは、それぞれ、独立に、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体に対する共有結合であり；
ｑａ、ｑｂ、ｑｅおよびｑｆは、それぞれ、独立に、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋもしくはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであり；
またはｑｅおよびｑｆは、共に、＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり；
ｑｇおよびｑｈは、それぞれ、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである。
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡモノマーアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミンおよびウラシルの合成および調製について、それらのオリゴマー化、および核酸認識特性と共に、報告がある（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。ＢＮＡおよびその調製については、同様に、国際公開第ＷＯ９８／３９３５２号および同ＷＯ９９／１４２２６号、に記載されている。
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡおよび２’−チオ−ＢＮＡの類似体もまた、調製されている（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼの基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を含むロックドヌクレオシド類似体の調製についても記載がある（Ｗｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，国際公開第ＷＯ９９／１４２２６号）。さらに、新規の立体構造的に制限された高親和性オリゴヌクレオチド類似体である、２’−アミノ−ＢＮＡの合成について、当技術分野の記述がある（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９）。さらに、２’−アミノ−および２’−メチルアミノ−ＢＮＡが、調製され、それらの相補的なＲＮＡおよびＤＮＡ鎖を持つ二重鎖の熱安定性が、以前に報告されている。
特定の実施形態では、二環ヌクレオシドは、式ＶＩ：

を有し、式中、
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基部分であり；
ＴａおよびＴｂは、それぞれ、独立に、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体に対する共有結合であり；
各ｑｉ、ｑｊ、ｑｋおよびｑｌは、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシル、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋまたはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋ；ならびに
ｑｉおよびｑｊまたはｑｌおよびｑｋは、共に、＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり、式中、ｑｇおよびｑｈは、それぞれ、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである。
４’−（ＣＨ２）３−２’架橋およびアルケニル類似体架橋４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−２’を有する１つの炭素環式二環ヌクレオシドが記載されている（Ｆｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４２９−４４４３およびＡｌｂａｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７１，７７３１−７７４０）。炭素環式二環ヌクレオシドの合成および調製について、それらのオリゴマー化および生化学的調査と共に、報告されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９（２６），８３６２−８３７９）。
本明細書で使われる「４’−２’二環ヌクレオシド」または「４’〜２’二環ヌクレオシド」は、フラノース糖環の２’炭素原子および４’炭素原子の２つの炭素原子を連結する架橋を含むフラノース環を含む二環ヌクレオシドを指す。
本明細書で使われる「単環ヌクレオシド」は、二環糖部分ではない修飾糖部分を含むヌクレオシドを指す。特定の実施形態では、ヌクレオシドの糖部分、または糖部分類似体、は、どの位置で修飾されても、または置換されてもよい。
本明細書で使われる「２’−修飾糖」は、２’位置でのフラノシル糖修飾を意味する。特定の実施形態では、このような修飾は、ハロゲン化物、限定されないが、置換および未置換アルコキシ、置換および未置換チオアルキル、置換および未置換アミノアルキル、置換および未置換アルキル、置換および未置換アリル、ならびに、置換および未置換アルキニル等から選択される置換基を含む。特定の実施形態では、２’修飾は、限定されないが：Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ３およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２、等の置換基から選択され、ｎおよびｍは、１〜約１０である。また、他の２’−置換基は、：Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基（ｃｌｅａｖｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）、レポーター基、インターカレーター、アンチセンス化合物の薬物動態学的特性改善のための基、またはアンチセンス化合物の薬力学的特性改善のための基、および類似の特性を有する他の置換基から選択できる。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ側鎖（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１１９４４−１２０００）を含む。このような２’−ＭＯＥ置換は、非修飾ヌクレオシドおよび他の修飾ヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、およびＯ−アミノプロピルに比べて、改善された結合親和性を有すると記載されている。２’−ＭＯＥ置換基を有するオリゴヌクレオチドは、また、インビボでの使用に対し有望な特性を有するアンチセンス遺伝子発現阻害剤であることが示されている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４；Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｉａ，１９９６，５０，１６８−１７６；Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１９９６，２４，６３０−６３７；およびＡｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６，９１７−９２６）。
本明細書で使われる「修飾テトラヒドロピランヌクレオシド」または「修飾ＴＨＰヌクレオシド」は、通常のヌクレオシド中のペントフラノシル残基の６員テトラヒドロピラン「糖」による置換を有するヌクレオシド（糖代用物）を意味する。修飾ＴＨＰヌクレオシドには、限定されないが、当技術分野でヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール核酸（ＡＮＡ）、マンニトール核酸（ＭＮＡ）（Ｌｅｕｍａｎｎ，ＣＪ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００２）１０：８４１−８５４、を参照）、フルオロＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）と呼ばれているもの、または下記の式Ｘを有する化合物が含まれる。
式Ｘ：

式中、前記少なくとも１つの式Ｘのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体のそれぞれに対し独立に：
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基部分であり；
Ｔ３およびＴ４は、それぞれ、独立に、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間結合基であるか、またはＴ３およびＴ４の１つが、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間結合基であり、Ｔ３およびＴ４の残りが、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連鎖コンジュゲート基または５’または３’−末端基であり；
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６およびｑ７は、それぞれ、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり；さらに、各Ｒ１およびＲ２は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または未置換アルコキシ、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２およびＣＮから選択され、式中、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＪ１であり、各Ｊ１、Ｊ２およびＪ３は、独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
特定の実施形態では、ｑｍ、ｑｎ、ｑＰ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔおよびｑｕがそれぞれＨである式Ｘの修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供される。特定の実施形態では、少なくとも１つのｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔおよびｑｕが、Ｈ以外のものである。特定の実施形態では、少なくとも１つのｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔおよびｑｕがメチルである。特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２の１つがＦである式ＸのＴＨＰヌクレオシドが提供される。特定の実施形態では、Ｒ１は、フルオロ、Ｒ２はＨ；Ｒ１はメトキシ、Ｒ２はＨであり、さらにＲ１は、メトキシエトキシ、Ｒ２はＨである。
本明細書で使われる「２’−修飾」または「２’−置換」は、２’位置でＨまたはＯＨ以外の置換基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。２’−修飾ヌクレオシドは、限定されないが、糖環の２つの炭素原子を連結する架橋が２’炭素および別の糖環の炭素を連結する二環ヌクレオシド；および非架橋２’置換基、例えば、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）を有するヌクレオシドを含み、式中、各ＲｍおよびＲｎは、独立に、Ｈまたは置換もしくは未置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。２’−修飾ヌクレオシドは、他の修飾を、例えば、糖および／またはヌクレオベースの他の位置に、さらに含んでもよい。
本明細書で使われる「２’−Ｆ」は、フルオロ基を２’位置に含む糖を含むヌクレオシドを指す。
本明細書で使われる「２’−ＯＭｅ」または「２’−ＯＣＨ３」または「２’−Ｏ−メチル」は、それぞれ、−ＯＣＨ３基を糖環の２’位置に含む糖を含むヌクレオシドを指す。
本明細書で使われる「ＭＯＥ」または「２’−ＭＯＥ」または「２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３」または「２’−Ｏ−メトキシエチル」は、それぞれ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基を糖環の２’位置に含む糖を含むヌクレオシドを指す。
本明細書で使われる「オリゴヌクレオチド」は、複数の連鎖クレオシドを含む化合物を指す。特定の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオシドが修飾されている。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含む。
アンチセンス化合物中への組み込みのためにヌクレオシドの修飾に使用できる、多くの他のビシクロおよびトリシクロ糖代用環系も、当技術分野で既知である（例えば、概説論文：Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｊ．Ｃ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，１０，８４１−８５４を参照）。このような環系は、種々の追加の置換を受け、活性を高めることができる。
修飾糖の調製方法は、当業者にはよく知られている。
修飾糖部分を有するヌクレオチドでは、ヌクレオベース部分（天然、修飾、またはこれらの組み合わせ）は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために、維持される。
特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、修飾糖部分を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾糖部分は、２’−ＭＯＥである。特定の実施形態では、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフ中に配置される。特定の実施形態では、修飾糖部分は、ｃＥｔである。特定の実施形態では、ｃＥｔ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフのウイング全体にわたり配置される。
修飾ヌクレオベース
ヌクレオベース（または塩基）修飾または置換は、機能的に置き替え可能であるにしても、天然または合成非修飾ヌクレオベースとは構造的に識別可能である。天然および修飾ヌクレオベースの両方は、水素結合に参加できる。このようなヌクレオベース修飾は、アンチセンス化合物に対し、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性またはいくつかの他の有益な生物学的特性を付与することができる。修飾ヌクレオベースは、合成および天然ヌクレオベース、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）を含む。５−メチルシトシン置換、等の特定のヌクレオベース置換は、特に、標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。例えば、５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃だけ核酸二重鎖の安定性を高めることが示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）。
さらなる非修飾ヌクレオベースには、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン；６−メチルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体；アデニンとグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体；２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびに他のピリミジン塩基のアルキニル誘導体；６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン；５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル；８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン；５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン；７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン；ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン、が含まれる。
ヘテロ環式塩基部分は、また、プリンまたはピリミジン塩基が、他のヘテロ環、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンと置換されているものも含みうる。アンチセンス化合物の結合親和性を高めるのに特に有用なヌクレオベースには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびに２アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、等のＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物は、１つまたは複数の修飾ヌクレオベースを含む。特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡを標的とするギャップ拡大アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオベースを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオベースは、５−メチルシトシンである。特定の実施形態では、各シトシンは、５−メチルシトシンである。
医薬組成物処方のための組成および方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または製剤の調製のために薬学的に許容可能な活性または不活性物質を混合できる。医薬組成物製剤のための組成および方法は、限定されないが、投与経路、疾患の程度、または投与すべき用量、等のいくつかの条件に依存する。
ｎｒＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物を適切な薬学的に許容可能な希釈剤またはキャリアと組み合わせて、医薬組成物において利用できる。薬学的に許容可能な希釈剤には、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。ＰＢＳは、非経口的に送達される組成物の使用に適する希釈剤である。従って、一実施形態では、本明細書記載の方法で、ｎｒＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物および薬学的に許容可能な希釈剤を含む医薬組成物が採用される。特定の実施形態では、薬学的に許容可能な希釈剤は、ＰＢＳである。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンス化合物を含む医薬組成物は、いずれかの薬学的に許容可能な塩、エステル、もしくはこのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物への投与時に、（直接または間接的に）生物学的に活性な代謝物またはその残渣を与えることができるいずれかの他のオリゴヌクレオチドを包含する。従って、例えば、本開示は、また、アンチセンス化合物の薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、このようなプロドラッグの薬学的に許容可能な塩、および他の生物学的等価物に関する。適切な薬学的に許容可能な塩には、限定されないが、ナトリウムおよびカリウム塩が含まれる。
プロドラッグは、アンチセンス化合物の片方または両方の末端に追加のヌクレオシドの組み込みを含むことができ、これは、身体の中で内在性ヌクレアーゼにより切断され、活性アンチセンス化合物を形成する。
コンジュゲートアンチセンス化合物
アンチセンス化合物は、得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込を強める１つまたは複数の部分またはコンジュゲートに共有結合できる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール部分および脂質部分が含まれる。さらなるコンジュゲート基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料が含まれる。
アンチセンス化合物は、また、通常、アンチセンス化合物片方または両方の末端に結合して、特性、例えば、ヌクレアーゼ安定性、を増大させる１つまたは複数の安定化基を持つように修飾できる。安定化基には、キャップ構造が含まれる。これらの末端修飾は、末端核酸を有するアンチセンス化合物をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内の送達および／または局在化を支援することができる。キャップは、５’−末端にあっても（５’−キャップ）、もしくは３’−末端にあっても（３’−キャップ）、または両端にあってもよい。キャップ構造は、当技術分野でよく知られており、例えば、逆位デオキシ脱塩基キャップを含む。アンチセンス化合物の片方または両方の末端をキャップしてヌクレアーゼ安定性を付与することが可能な、さらなる３’および５’−安定化基には、２００３年１月１６日付公報の国際公開第ＷＯ０３／００４６０２号に記載のものが含まれる。
細胞培養およびアンチセンス化合物処理
ｎｒＲＮＡのレベルまたは活性に与えるアンチセンス化合物の効果は、種々の細胞型でインビトロで試験できる。このような分析に使われる細胞型は、市販品メーカー（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、Ｍａｎａｓｓｕｓ，ＶＡ；Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能であり、細胞は、メーカーのインストラクションに従って、市販の試薬（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使って培養できる。実例となる細胞型には、限定されないが、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、初代培養肝細胞、Ａ５４９細胞、ＧＭ０４２８１線維芽細胞およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞が含まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ試験
本明細書では、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する方法が記載されるが、他のアンチセンス化合物で処理するために、適切に変更できる。
一般的に、細胞が培養液中で約６０〜８０％の集密度に到達すると、その細胞がアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養した細胞中に導入するためによく使用される１つの試薬には、カチオン脂質トランスフェクション試薬リポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポフェクチン（登録商標）とＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で混合され、所望最終濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および通常、１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチド当たり２〜１２ｕｇ／ｍＬの範囲のリポフェクチン（登録商標）濃度を得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養した細胞中へ導入するのに使用する別の試薬には、リポフェクタミン２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポフェクタミン２０００（登録商標）とＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１血清使用量低減培地（ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で混合され、所望濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および通常、１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチド当たり２〜１２ｕｇ／ｍＬの範囲のリポフェクタミン（登録商標）濃度を得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養した細胞中へ導入するのに使用する別の試薬には、サイトフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドをサイトフェクチン（登録商標）とＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１血清使用量低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で混合し、所望濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および通常、１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチド当たり２〜１２ｕｇ／ｍＬの範囲のサイトフェクチン（登録商標）濃度を得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養した細胞中へ導入するのに使用する別の技術には、電気穿孔が含まれる。
細胞は、常法によりアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される。通常、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後、細胞を採取し、この時点で、標的核酸のＲＮＡまたはタンパク質レベルを、当技術分野で既知の、本明細書記載の方法で測定する。一般的には、複数回繰り返して処理を行う場合は、データは、繰り返し処理の平均として表される。
使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株毎に変わる。特定の細胞株に対し最適アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定する方法は、当技術分野でよく知られている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポフェクタミン２０００（登録商標）、リポフェクチンまたはサイトフェクチンで形質移入される場合、通常、１ｎＭ〜３００ｎＭの範囲の濃度で使用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、電気穿孔を使って形質移入する場合は、６２５〜２０，０００ｎＭの範囲の、より高い濃度で使用される。
ＲＮＡ単離
ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行うことができる。ＲＮＡ単離の方法は、当技術分野でよく知られている。ＲＮＡは、当技術分野でよく知られた方法、例えば、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使って、メーカーの推奨プロトコルに従って、調製される。
標的レベルまたは発現の抑制の分析
ｎｒＲＮＡのレベルまたは活性の抑制は、当技術分野で既知の種々の方法でアッセイできる。例えば、標的核酸レベルは、例えば、ノーザン法分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または定量リアルタイムＰＣＲ、により定量できる。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行うことができる。ＲＮＡ単離の方法は、当技術分野でよく知られている。ノーザン法分析もまた、当技術分野でルーチン的な手法である。定量リアルタイムＰＣＲは、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な市販のＡＢＩプリズム（登録商標）７６００、７７００、または７９００配列検出システムを使って都合よく行うことができ、メーカーのインストラクションに従って使用できる。
標的ＲＮＡレベルの定量リアルタイムＰＣＲ分析
標的ＲＮＡレベルの定量は、定量リアルタイムＰＣＲで、ＡＢＩプリズム（登録商標）７６００、７７００、または７９００配列検出システム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使って、メーカーのインストラクションに従って行うことができる。定量リアルタイムＰＣＲの方法は、当技術分野でよく知られている。
リアルタイムＰＣＲの前に、単離ＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲ増幅用基質として使用される相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を産生する逆転写（ＲＴ）酵素反応に供する。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲ反応を同じウエル中で順次行う。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲ試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手される。ＲＴ、リアルタイムＰＣＲ反応は、当業者にはよく知られた方法で行なわれる。
発現が一定のシクロフィリンＡ等の遺伝子の発現レベルを使って、またはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使って全ＲＮＡを定量化することによりリアルタイムＰＣＲにより得られた遺伝子（またはＲＮＡ）標的の量を正規化する。シクロフィリンＡ発現は、リアルタイムＰＣＲにより、標的と同時に、多重処理でまたは別々に実行するとにより、定量化される。全ＲＮＡは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使って定量化される。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によるＲＮＡ定量化の方法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ，（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，２６５，３６８−３７４）中で教示されている。ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ（登録商標）４０００装置（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）蛍光を測定する。
プローブおよびプライマーは、ｎｒＲＮＡ配列にハイブリダイズするように設計されている。リアルタイムＰＣＲプローブおよびプライマーを設計する方法は、当技術分野でよく知られており、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）等のソフトウェアの使用を含めてもよい。
アンチセンス効果の尺度として、ｎｃＲＮＡにより誘導された核内ドット（ｎｕｃｌｅａｒ ｆｏｃｉ）、スペックル、パラスペックルおよび他の核サブストラクチャー等の核構造の定量化のために、免疫蛍光法の使用が可能である（例えば、実施例２６参照）。インサイツハイブリダイゼーションもまた、ＲＮＡの測定に使用可能である。
タンパク質レベルの分析
特定のｎｒＲＮＡのアンチセンス抑制は、関連タンパク質レベルを測定することにより評価できる。タンパク質レベルは、当技術分野でよく知られた種々の方法、例えば、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、定量タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ（例えば、カスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫細胞化学または蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、で評価または定量可能である。標的に対する抗体は、種々のソース、例えば、ＭＳＲＳ抗体カタログ（Ａｅｒｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ）から特定、入手でき、または当技術分野でよく知られた従来のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体生成方法により調製できる。
アンチセンス化合物のインビボ試験
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを動物で試験し、ｎｒＲＮＡを抑制するその能力を評価し、表現型の変化を作り出す。試験は、正常な動物、または実験疾患モデルで行うことができる。動物への投与のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的に許容可能な希釈剤、例えば、リン酸塩緩衝食塩水で処方した。投与は、非経口の投与経路を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理期間後、ＲＮＡを組織から単離し、ｎｒＲＮＡレベルまたは活性の変化を測定する。特定の実施形態では、関連タンパク質レベルの変化も測定される。
特定の適応症
特定の実施形態では、本明細書では、個体の治療方法が提供され、この方法は、本明細書記載の１つまたは複数の医薬組成物を投与することを含む。特定の実施形態では、個体は、核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態を有する。
従って、本明細書では、改善を必要としている動物の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態に関連した症状の改善方法が提供される。特定の実施形態では、核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態に関連した症状の発症の割合を低減する方法が提供される。特定の実施形態では、核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態に関連した症状の重症度の低減方法が提供される。このような実施形態では、方法は、治療有効量のｎｒＲＮＡを標的とする化合物を、それを必要としている個体に投与することを含む。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物の投与は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の、またはこれらの値の内の２つにより規定される範囲のｎｒＲＮＡレベルの減少を生ずる。
特定の実施形態では、ｎｒＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態に罹患しているか、または罹患しやすい患者の治療用薬物の調製に使用される。
投与
特定の実施形態では、本明細書記載の化合物および組成物は、非経口的に投与される。
特定の実施形態では、非経口の投与は、注射による。注射は、シリンジを使って送達できる。
特定の併用療法
特定の実施形態では、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを含む第１の薬剤は、１つまたは複数の第２の薬剤と同時に投与される。特定の実施形態では、このような第２の薬剤は、本明細書記載の第１の薬剤と同じ核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または状態を治療するよう設計されている。特定の実施形態では、このような第２の薬剤は、本明細書記載の第１の薬剤とは異なる疾患、傷害、または状態を治療するよう設計されている。特定の実施形態では、このような第２の薬剤は、本明細書記載の１つまたは複数の医薬組成物の望ましくない副作用を治療するように設計されている。特定の実施形態では、第２の薬剤は、第１の薬剤と同時投与され、第１の薬剤の望ましくない効果を治療する。特定の実施形態では、第２の薬剤は、第１の薬剤と同時投与され、組み合わせ効果を生み出す。特定の実施形態では、第２の薬剤は、第１の薬剤と同時投与され、相乗的効果を生み出す。
特定の実施形態では、第１の薬剤および１つまたは複数の第２の薬剤が、同時に投与される。特定の実施形態では、第１の薬剤および１つまたは複数の第２の薬剤が、異なる時間に投与される。特定の実施形態では、第１の薬剤および１つまたは複数の第２の薬剤が、一緒に単一の製剤に調製される。特定の実施形態では、第１の薬剤および１つまたは複数の第２の薬剤が別々に調製される。
実施例
非制限的開示および参照による組込み
本明細書記載の特定の化合物、組成物および方法を、特定の実施形態に応じて具体的に記載してきたが、以下の実施例は、本明細書記載の化合物を説明する目的のためのみのものであり、これら化合物を制限する意図はない。本出願で取り上げたそれぞれの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
実施例１：Ａ５４９細胞中のヒトＭＡＬＡＴ１のアンチセンス抑制
ノンコーディング核内繋留ＲＮＡ転写物である転移関連肺腺癌転写物１（ＭＡＬＡＴ１）核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物に与える効果をインビトロで試験した。５，０００細胞／ウエルの密度で培養したＡ５４９細胞に、リポフェクチン試薬を使って、６０ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約２４時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、定量リアルタイムＰＣＲでＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルを測定した。ヒトプライマープローブセットＲＴＳ２７３６（フォワード配列ＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＣＣＡＣＡＡＧ、本明細書では配列番号８９と命名；リバース配列ＴＧＡＡＧＧＧＴＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＣＡＡＡＡ、本明細書では配列番号９０と命名；プローブ配列ＴＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＸ、本明細書では配列番号９１と命名）を使用して、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡを定量した。ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量に基づき調節した。結果を未処理対照細胞に対する、ＭＡＬＡＴ１のパーセント抑制として表した。
表３のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ギャップマーである。これは、ギャップセグメントが、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウイングセグメントが、５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。５’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドおよび３’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー全域のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全域の全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。「標的開始部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的にしている５’−最末端ヌクレオチドを指す。「標的終了部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的にしている３’−最末端ヌクレオチドを指す。表３に挙げた全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＥＦ１７７３８１）を標的にしている。
実施例２：Ａ５４９細胞中のヒトＭＡＬＡＴ１のアンチセンス抑制
ＭＡＬＡＴ１核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡに与える効果をインビトロで試験した。５，０００細胞／ウエルの密度で培養したＡ５４９細胞に、リポフェクチン試薬を使って、１５０ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約２４時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、定量リアルタイムＰＣＲでＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルを測定した。ヒトプライマープローブセットＲＴＳ２７３６を使って、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡを定量した。ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量に基づき調節した。結果を未処理対照細胞に対するＭＡＬＡＴ１のパーセント抑制として表した。
表４のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ギャップマーであり、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウイングセグメントは、５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。５’ウイングセグメント中の各ヌクレオチド、および３’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー全域のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全域の全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。「標的開始部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的にしている５’−最末端ヌクレオチドを指す。「標的終了部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的にしている３’−最末端ヌクレオチドを指す。表４に挙げた全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＥＦ１７７３８１）を標的にしている。
実施例３：Ａ５４９細胞中のヒトＭＡＬＡＴ１の用量依存性アンチセンス抑制
インビトロでＡ５４９細胞中のＭＡＬＡＴ１の抑制を示すいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例２参照）を種々の用量で試験した。細胞を、５，０００細胞／ウエルの密度で播種し、リポフェクチン試薬を使って、７．５ｎＭ、１５ｎＭ、３０ｎＭ、および６０ｎＭの濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、定量リアルタイムＰＣＲでＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルを、プライマープローブセットＲＴＳ２７３６を使って、測定した。ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量で正規化した。結果を未処理対照細胞に対するＭＡＬＡＴ１のパーセント抑制として表５に示した。
種々のオリゴヌクレオチドによるＭＡＬＡＴ１の抑制がＭＡＬＡＴ１転写物全体にわたり均一かどうかを試験するために、上記用量反応実験を２つの追加のプライマープローブセットを用いて繰り返した。
プローブセットＲＴＳ２７３８は、フォワード配列：ＧＡＡＴＴＧＣＧＴＣＡＴＴＴＡＡＡＧＣＣＴＡＧＴＴ、配列番号１１１；リバース配列：ＴＣＡＴＣＣＴＡＣＣＡＣＴＣＣＣＡＡＴＴＡＡＴＣＴ、配列番号１１２；およびプローブ配列：ＡＣＧＣＡＴＴＴＡＣＴＡＡＡＣＧＣＡＧＡＣＧＡＡＡＡＴＧＧＡＸ、配列番号１１３を有する。
プローブセットＲＴＳ２７３９は、フォワード配列：ＡＧＧＣＧＴＴＧＴＧＣＧＴＡＧＡＧＧＡＴ、配列番号１１４；リバース配列：ＡＡＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＡＧＴＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡ、配列番号１１５；およびプローブ配列：ＡＧＴＧＧＴＴＧＧＴＡＡＡＡＡＴＣＣＧＴＧＡＧＧＴＣＧＧＸ、配列番号１１６を有する。
結果を表６と７に、非処理対照細胞に対するＭＡＬＡＴ１パーセント抑制として示す。

実施例４：ＨｅＬａ細胞中のヒトＭＡＬＡＴ１の用量依存性アンチセンス抑制
ＭＡＬＡＴ１のインビトロ抑制を示すいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＨｅＬａ細胞中、種々の用量で試験した。細胞を５，０００細胞／ウエルの密度で播種し、表８と９に示すように、リポフェクチン試薬を使って、４．７ｎＭ、９．４ｎＭ、１８．８ｎＭ、３７．８ｎＭ、７５ｎＭ、および１５０ｎＭの濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約１６時間処理後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルを定量リアルタイムＰＣＲにより測定した。ヒトＭＡＬＡＴ１プライマープローブセットＲＴＳ２７３６およびＲＴＳ２７３８（実施例３参照）を使って、ＲＮＡ転写物レベルを測定した。ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全体ＲＮＡ含量に基づいて調節した。結果を、非処理対照細胞に対するＭＡＬＡＴ１のパーセント抑制として表した。表８と９に示すように、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルは、用量依存的に減少した。

実施例５：ＨｅＬａ細胞中のヒトＭＡＬＡＴ１の用量依存性アンチセンス抑制
ＭＡＬＡＴ１のインビトロ抑制を示すいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＨｅＬａ細胞中、種々の用量で試験した。細胞を４，０００細胞／ウエルの密度で播種し、リポフェクチン試薬を使って、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ、および１００．０ｎＭの濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約１６時間処理後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルを定量リアルタイムＰＣＲにより測定した。ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全体ＲＮＡ含量に基づいて調節した。結果を、非処理対照細胞に対するＭＡＬＡＴ１のパーセント抑制として表した。表１０に示すように、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルは、用量依存的に減少した。
実施例６：Ｕ８７ＭＧ細胞中のヒトＭＡＬＡＴ１の用量依存性アンチセンス抑制
ＭＡＬＡＴ１のインビトロ抑制を示すいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ｕ８７ＭＧ細胞中、種々の用量で試験した。細胞を４，０００細胞／ウエルの密度で播種し、リポフェクチン試薬を使って、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ、および１００．０ｎＭの濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約１６時間処理後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルを定量リアルタイムＰＣＲにより測定した。ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全体ＲＮＡ含量に基づいて調節した。結果を、非処理対照細胞に対するＭＡＬＡＴ１のパーセント抑制として表した。表１１に示すように、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルは、用量依存的に減少した。
実施例７：ｓｉＲＮＡによるＨｅＬａ細胞中のヒトＭＡＬＡＴ１の用量依存性アンチセンス抑制
いくつかのヒトＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物特異的ｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞株中、種々の用量で試験した。細胞を５，０００細胞／ウエルの密度で播種し、リポフェクタミン（登録商標）試薬を使って、０．７８ｎＭ、１．５６ｎＭ、３．１３ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭの濃度の各ｓｉＲＮＡを形質移入した。約４時間のインキュベーション後、トランスフェクション培地を破棄し、新しい培地を添加し、細胞をさらに１８時間インキュベートした。ＲＮＡを細胞から単離し、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルを定量リアルタイムＰＣＲにより測定した。プライマープローブセットＲＴＳ２７３９を使って、ＲＮＡ転写物レベルを測定した。表１２に、非処理対照細胞に対する抑制結果を示す。
実施例８：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた用量反応試験およびｂ．ＥＮＤ細胞中のＲＮＡ安定性との相関
マウス核内繋留標的分子：ＭＡＬＡＴ１のノンコーディングＲＮＡ安定性と標的のノックダウンに必要なアンチセンスオリゴヌクレオチドの用量の相関を調査した。
マウスＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号３１４４＿０９７Ａ、本明細書では、配列番号１２５と命名）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ３９５２５１（ＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧＡＣＴＣＡＧ、標的部位３３３８）（本明細書に配列番号９６として組み込む）；ＩＳＩＳ３９９４６２（ＧＧＧＴＣＡＧＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＡＧ、標的部位１２８０）（本明細書に配列番号１１７として組み込む）；ＩＳＩＳ３９９４７９（ＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＧＧＡＡＴＴ、標的部位４００４）（本明細書に配列番号１１８として組み込む）；ＩＳＩＳ３９９４８８（ＴＴＡＣＣＣＴＡＧＡＴＧＴＴＴＡＧＣＣＡ、標的部位４６２１）（本明細書に配列番号１１９として組み込む）；ＩＳＩＳ３９９４９５（ＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＴＧＴＣＴＧＣＴＴＣ、標的部位１２０）（本明細書に配列番号１２０として組み込む）；ＩＳＩＳ３９９４６２（ＧＧＧＴＣＡＧＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＡＧ、標的部位１２８０）（本明細書に配列番号１１７として組み込む）；ＩＳＩＳ３９５２９０（ＴＡＡＧＡＴＧＣＴＡＧＣＴＴＧＧＣＣＡＡ、標的部位６５５２）（本明細書に配列番号１２１として組み込む）；ＩＳＩＳ３９５２７５（ＡＡＣＡＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＴＴ、標的部位５３４８）（本明細書に配列番号１０７として組み込む）；ＩＳＩＳ３９９５０３（ＡＡＡＴＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧ、標的部位６３１６）（本明細書に配列番号１２２として組み込む）；ＩＳＩＳ３９９４７３（ＡＴＡＴＧＣＡＧＣＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴ、標的部位３４７５）（本明細書に配列番号１２３として組み込む）；およびＩＳＩＳ３９９４８４（ＡＣＡＡＧＴＡＣＡＴＴＧＧＡＧＣＡＣＡＴ、標的部位４２０６）（本明細書に配列番号１２４として組み込む）、を種々の用量で試験した。ｂ．ＥＮＤ細胞を、４，０００細胞／ウエルの密度で播種し、サイトフェクチン試薬を使って、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、および１００ｎＭの濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルを定量リアルタイムＰＣＲにより、プライマープローブセットｍＭＡＬＡＴｌ＃２（フォワード配列ＴＧＧＧＴＴＡＧＡＧＡＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＧ、本明細書では配列番号１２６と命名；リバース配列ＴＣＡＧＣＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡ、本明細書では配列番号１２７と命名；およびプローブ配列ＣＧＴＴＧＧＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧＧＧＡＣＴＸ、本明細書では配列番号１２８と命名）を使って測定した。ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物レベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全体ＲＮＡ含量に正規化した。結果を、非処理対照細胞に対するＭＡＬＡＴ１のパーセント抑制として表１３に示す。
表１３の全てのギャップマーは、５−１０−５ギャップマーであり、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウイングセグメントは、５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全域のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全域の全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。
ＭＡＬＡＴ１ノンコーディングＲＮＡの安定性を測定するために、ｂ．ＥＮＤ細胞を１０時間にわたり８μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤで処理した。別の細胞セットを、７５μＭの５，６−クロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）で同じ時間処理した。両方のＲＮＡ合成阻害剤は、表１４に示すように、同じ結果を与えた。表１４は、ＰＢＳ対照に対する異なる時点でのアクチノマイシンＤまたはＤＲＢで処理後のパーセントｍＲＮＡレベルを表す。データは、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡは、分解されず、従って、処理期間中安定であることを示す。
表１３と１４のデータは、安定なＲＮＡ転写物を標的とするオリゴヌクレオチドのＩＣ５０は小さいことを示し、これらのＲＮＡ転写物は、安定でないＲＮＡ転写物に比べて、より標的化に適することを示唆している。従って、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞によるオリゴヌクレオチド取込の少ない場合に用いると有益であると思われる。

実施例９：アンチセンスオリゴヌクレオチドの用量反応試験およびｂ．ＥＮＤ細胞中のマウス標的ｍＲＮＡ安定性との相関
マウス標的分子のｍＲＮＡ安定性とノックダウンに必要なアンチセンスオリゴヌクレオチドの用量の相関を調査した。
「標的３」遺伝子配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ５、ＩＳＩＳ６、ＩＳＩＳ７、ＩＳＩＳ８、ＩＳＩＳ９、ＩＳＩＳ１０、ＩＳＩＳ１１、ＩＳＩＳ１２、ＩＳＩＳ１３、およびＩＳＩＳ１４を種々の用量で試験した。ｂ．ＥＮＤ細胞を４，０００細胞／ウエルの濃度で播種し、サイトフェクチン試薬を使って、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、および２００ｎＭの濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、「標的３」のＲＮＡ転写物レベルを、定量リアルタイムＰＣＲで測定した。「標的３」ＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量で正規化した。結果を非処理対照細胞に対する「標的３」のパーセント抑制として表１５に示す。
「標的４」ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ Ｆ、ＩＳＩＳ Ｇ、ＩＳＩＳ Ｈ、ＩＳＩＳ Ｉ、ＩＳＩＳ Ｊ、ＩＳＩＳ Ｋ、ＩＳＩＳ Ｌ、ＩＳＩＳ Ｍ、ＩＳＩＳ Ｎ、およびＩＳＩＳ Ｏを、種々の用量で試験した。ｂ．ＥＮＤ細胞を４，０００細胞／ウエルの濃度で播種し、サイトフェクチン試薬を使って、１．４０６３ｎＭ、２．８１２５ｎＭ、５．６２５ｎＭ、１１．２５ｎＭ、２２．５ｎＭおよび４５ｎＭの濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、「標的４」のＲＮＡ転写物レベルを、定量リアルタイムＰＣＲで測定した。「標的４」ＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量で正規化した。結果を非処理対照細胞に対する「標的４」のパーセント抑制として表１６に示す。
表１５と１６の全ギャップマーは、５−１０−５ギャップマーであり、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウイングセグメントは、５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全域のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全域の全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。
表１５と１６で示されるデータは、「標的４」を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＣ５０は、同じ細胞株の類似のモチーフを有するギャップマーに対し、「標的３」を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＣ５０よりも、約２０倍小さいことを示す。
標的ｍＲＮＡの安定性を測定するために、ｂ．ＥＮＤ細胞を８μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤで９時間にわたり処理した。別の細胞セットを７５μＭの５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）で同じ時間処理した。両方のＲＮＡ合成阻害剤は、表１７と１８に示すように、類似の結果を与えた。表１７と１８は、アクチノマイシンＤまたはＤＲＢによる処理後の、ＰＢＳ対照に対する異なる時点でのパーセントｍＲＮＡレベルを示す。データは、「標的３」ｍＲＮＡは、「標的４」ｍＲＮＡよりも有意に小さい安定性を有することを示す。
表１５〜１８のデータは、比較的により安定である標的ｍＲＮＡのアンチセンス抑制は、低い安定性の標的ｍＲＮＡのアンチセンス抑制よりも達成が容易であることを示唆している。



ＳＲ−Ｂ１安定性
ＳＲ−Ｂ１ｍＲＮＡの安定性を測定するために、ｂ．ＥＮＤ細胞を８μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤで１０時間にわたり処理した。別の細胞セットを７５μＭの５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）で同じ時間処理した。両方のＲＮＡ合成阻害剤は、表１９に示すように、類似の結果を与えた。表１９は、アクチノマイシンＤまたはＤＲＢによる処理後の、ＰＢＳ対照に対する異なる時点でのパーセントｍＲＮＡレベルを示す。データは、ＳＲ−Ｂ１ｍＲＮＡが１０時間にわたる処理で大きく分解せず、従って、処理の間、安定であることを示す。
実施例１０：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた用量反応試験およびＨＵＶＥＣ細胞中の標的ｍＲＮＡ安定性との相関
ヒト標的分子のｍＲＮＡ安定性とノックダウンに必要なアンチセンスオリゴヌクレオチドの用量の相関を調査した。
「標的１」ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ１、ＩＳＩＳ２、ＩＳＩＳ３、およびＩＳＩＳ４を種々の用量で試験した。ＨＵＶＥＣ細胞を５，０００細胞／ウエルの濃度で播種し、リポフェクタミン２０００（登録商標）試薬を使って、０．００６９ｎＭ、０．０２０６ｎＭ、０．０６１７ｎＭ、０．１８５２ｎＭ、０．５５５６ｎＭ、１．６６６７ｎＭ、５ｎＭおよび１５ｎＭの濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、「標的１」のＲＮＡ転写物レベルを、定量リアルタイムＰＣＲで測定した。「標的１」ＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量で正規化した。結果を、非処理対照細胞に対する「標的１」のパーセント抑制として表２０に示す。
「標的２」ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ Ａ、ＩＳＩＳ Ｂ、ＩＳＩＳ Ｃ、ＩＳＩＳ Ｄ、およびＩＳＩＳ Ｅを、種々の用量で試験した。ＨＵＶＥＣ細胞を５，０００細胞／ウエルの濃度で播種し、リポフェクタミン２０００（登録商標）試薬を使って、０．６１７３ｎＭ、１．８５１９ｎＭ、５．５５５６ｎＭ、１６．６６６７ｎＭ、５０ｎＭおよび１５０ｎＭの濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、「標的２」のＲＮＡ転写物レベルを、定量リアルタイムＰＣＲで測定した。
「標的２」ＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量で正規化した。結果を非処理対照細胞に対する「標的２」のパーセント抑制として表２１に示す。
表２０と２１の全ギャップマーは、２−１３−５ギャップマーであり、ギャップセグメントは、１３の２’−デオキシヌクレオシドを含み、５’ウイングセグメントは、２つの２’−ＭＯＥヌクレオシド、および３’ウイングセグメントは、５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全域のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全域の全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。
表２０と２１で示されるデータは、「標的１」を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＣ５０は、同じ細胞株の類似のモチーフを有するギャップマーに対し、「標的２」を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＣ５０よりも、１０倍小さいことを示す。
標的ｍＲＮＡの安定性を測定するために、ＨＵＶＥＣ細胞を８μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤで９時間にわたり処理した。別の細胞セットを７５μＭの５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）で同じ時間処理した。別の細胞セットを３０μｇ／ｍＬのα−アマニチンで同じ時間処理した。表２１と２２に示す時点で、ｍＲＮＡを採取し、「標的１」または「標的２」ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲで定量した。３つ全てのＲＮＡ合成阻害剤は、表２２と２３に示すように、類似の結果を与えた。表２２は、ＰＢＳ対照に対する、アクチノマイシンＤまたはＤＲＢで処理後の異なる時点でのパーセントｍＲＮＡレベルを示す。表２３は、ＰＢＳ対照に対する、ＤＲＢおよびα−アマニチンで処理後の異なる時点でのパーセントｍＲＮＡレベルを示す。２つの異なるアッセイの結果に基づくと、「標的２」ｍＲＮＡの半減期は、２〜４時間以内であると計算される。「標的１」ｍＲＮＡの半減期は、利用可能なデータからは計算できず、そのため９時間を越える。従って、表２２、２３のデータは、「標的２」ｍＲＮＡが、「標的１」ｍＲＮＡよりも有意に低い安定性を有することを示す。
表２０〜２３のデータは、比較的安定性の高い標的ｍＲＮＡのアンチセンス抑制は、低い安定性の標的ｍＲＮＡのアンチセンス抑制よりも達成が容易であることを示唆している。



ＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた用量反応試験およびＨＵＶＥＣ細胞中のＲＮＡ安定性との相関
非核内繋留標的分子ＳＴＡＴ３のＲＮＡの安定性と標的ノックダウンに必要なアンチセンスオリゴヌクレオチドの用量の相関を調査した。
ヒトＳＴＡＴ３ ＲＮＡ転写物（ヌクレオベース４１８５０００〜４２６４０００（本明細書では、配列番号１４８と命名）から切断したＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＴ＿０１０７５５．１４の相補配列）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ３３７３３２（ＧＡＡＧＣＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＧＴ、本明細書では配列番号１２９と命名）、ＩＳＩＳ３４５７８５（ＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＴ、本明細書では配列番号１３０と命名）、ＩＳＩＳ４５５２６９（ＧＣＴＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＣ、本明細書では配列番号１３１と命名）、ＩＳＩＳ４５５２７１（ＡＡＡＴＧＣＴＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＡ、本明細書では配列番号１３２と命名）、ＩＳＩＳ４５５２７２（ＴＡＡＡＡＴＧＣＴＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＴ、本明細書では配列番号１３３と命名）、ＩＳＩＳ４５５２９１（ＣＡＧＣＡＧＡＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＧＡ、本明細書では配列番号１３４と命名）、ＩＳＩＳ４５５３７０（ＴＡＧＧＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＣＧＣＡＣＡ、本明細書では配列番号１３５と命名）、ＩＳＩＳ４５５３７１（ＧＣＴＡＧＧＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＣＧＣＡ、本明細書では配列番号１３６と命名）、ＩＳＩＳ４５５３９１（ＴＣＡＡＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＡ、本明細書では配列番号１３７と命名）、ＩＳＩＳ４５５３９３（ＣＡＣＡＴＣＡＡＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣ、本明細書では配列番号１３８と命名）、ＩＳＩＳ４５５３９４（ＧＡＣＡＣＡＴＣＡＡＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧ、本明細書では配列番号１３９と命名）、ＩＳＩＳ４５５４１１（ＡＡＣＣＣＡＡＴＧＧＴＡＡＧＣＣＣＡＡＧ、本明細書では配列番号１４０と命名）、ＩＳＩＳ４５５４１２（ＴＡＡＡＣＣＣＡＡＴＧＧＴＡＡＧＣＣＣＡ、本明細書では配列番号１４１と命名）、ＩＳＩＳ４５５４７１（ＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＧＣ、本明細書では配列番号１４２と命名）、ＩＳＩＳ４５５５２５（ＧＴＡＣＡＣＡＣＴＡＴＡＣＡＣＡＴＴＴＴ、本明細書では配列番号１４３と命名）、ＩＳＩＳ４５５５２７（ＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＣＣＣＡＴ、本明細書では配列番号１４４と命名）、ＩＳＩＳ４５５５３０（ＡＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＴＣＡＡＧＧＣＴＣ、本明細書では配列番号１４５と命名）、ＩＳＩＳ４５５５３６（ＡＧＡＡＣＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣ、本明細書では配列番号１４６と命名）、および４５５５４０（ＡＡＧＴＡＣＴＣＴＴＴＣＡＧＴＧＧＴＴＴ、本明細書では配列番号１４７と命名）を、種々の用量で試験した。ＨＵＶＥＣ細胞を５，０００細胞／ウエルの濃度で播種し、リポフェクタミン２０００（登録商標）試薬を使って、１．１１１ｎＭ、３．３３３ｎＭ、１０ｎＭ、および３０ｎＭの濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＳＴＡＴ３ ＲＮＡ転写物レベルを、定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ＳＴＡＴ３ ＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量で正規化した。結果を、非処理対照細胞に対するＳＴＡＴ３のパーセント抑制として表２４に示す。
表２４の全てのギャップマーは、５−１０−５ギャップマーであり、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウイングセグメントは、５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全域のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全域の全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。
ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの安定性を測定するために、ＨＵＶＥＣ細胞を８μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤで１０時間にわたり処理した。別の細胞セットを７５μＭの５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）で同じ時間処理した。両方のＲＮＡ合成阻害剤は、表２５に示すように、類似の結果を与えた。表２５は、ＰＢＳ対照に対する、アクチノマイシンＤまたはＤＲＢで処理後の異なる時点でのパーセントｍＲＮＡレベルを示す。データは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡが、分解せず、従って、処理の間安定であることを示す。
表２４と２５のデータは、安定なＲＮＡ転写物を標的とするオリゴヌクレオチドのＩＣ５０は小さいことを示し、これらのＲＮＡ転写物は、安定でないＲＮＡ転写物に比べて、より標的化に適することを示唆している。従って、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞によるオリゴヌクレオチド取込の少ない場合に用いると有益であると思われる。

実施例１１：ＢＡＬＢ／ｃマウス中のマウスＭＡＬＡＴ１のアンチセンス抑制
マウスＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号３１４４＿０９７Ａ、本明細書では配列番号１２５と命名）を標的とし、統計的に有意な用量依存性インビトロ抑制を示したＩＳＩＳ３９５２５１（ＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧＡＣＴＣＡＧ；標的部位３３３８）（本明細書に配列番号９６として組み込む）；ＩＳＩＳ３９９４６２（ＧＧＧＴＣＡＧＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＡＧ、標的部位１２８０）（本明細書に配列番号１１７として組み込む）；ＩＳＩＳ３９９４７９（ＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＧＧＡＡＴＴ、標的部位４００４）（本明細書に配列番号１１８として組み込む）；およびＩＳＩＳ３９９４８４（ＡＣＡＡＧＴＡＣＡＴＴＧＧＡＧＣＡＣＡＴ、標的部位４２０６）（本明細書に配列番号１２４として組み込む）の、マウスＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物をインビボで低減させる能力を評価した。
処理
雄ＢＡＬＢ／ｃマウスを１２時間の明暗サイクルで維持し、通常のＰｕｒｉｎａマウス固形飼料を自由に与えた。実験の開始前、動物を研究施設中で少なくとも７日間順化した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で調製し、０．２ミクロンフィルターを通して殺菌した。オリゴヌクレオチドを、注射のために０．９％ＰＢＳ中に溶解した。
マウスを６つの処理群に分割した。最初の４つの群は、ＩＳＩＳ３９５２５１、ＩＳＩＳ３９９４６２、ＩＳＩＳ３９９４７９、またはＩＳＩＳ３９９４８４を、５０ｍｇ／ｋｇ用量で、週２回、３週間の腹腔内注射を受けた。５番目の群は、対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１４１９２３を、５０ｍｇ／ｋｇ用量で、週２回、３週間の腹腔内注射を受けた。第６群は、食塩水の腹腔内注射を、週２回、３週間受けた。食塩水注射群は、オリゴヌクレオチド処理群と比較される対照群の役割をした。
ＭＡＬＡＴｌ ＲＮＡの抑制
最後の投与の２４時間後、動物を屠殺し、肝臓組織を取り出した。ＭＡＬＡＴｌのリアルタイムＰＣＲ分析用として、肝臓ＲＮＡを単離した。表２６に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理は、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ転写物の発現を低減させた。結果をＰＢＳ対照に対するＭＡＬＡＴｌ ＲＮＡ転写物のパーセント抑制として表した。対照オリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ１４１９２３は、予想されるように、ＭＡＬＡＴｌ ＲＮＡの有意な抑制を示さなかった。
実施例１２：マウスＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡの用量依存性アンチセンス抑制
統計的に有意なインビボＭＡＬＡＴ１抑制を示したＩＳＩＳ３９９４６２およびＩＳＩＳ３９９４７９を、用量反応試験でさらに評価した。
処理
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、もしくは４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ３９９４６２またはＩＳＩＳ３９９４７９を、週２回、３週間注射した。別の群のマウスに、ＩＳＩＳ１４１９２３を、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、週２回、３週間注射した。マウス対照群に、ＰＢＳを週２回、３週間注射した。
ＲＮＡ分析
ＭＡＬＡＴ１のリアルタイムＰＣＲ分析用に、ＲＮＡを肝臓組織から抽出した。表２７に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＢＳ対照に比べ、マウスＭＡＬＡＴ１の用量依存性減少を示した。結果を、ＰＢＳ対照に対するＭＡＬＡＴ１のパーセント抑制として表す。対照オリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ１４１９２３は、予想されたように、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡの有意な抑制を示さなかった。
実施例１３：種々のマウス組織中のＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡの用量依存性アンチセンス抑制
統計的に有意なインビボＭＡＬＡＴ１抑制を示したＩＳＩＳ３９９４６２を、用量反応試験でさらに評価した。
処理
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ３９９４６２を、週２回、３．５週間、注射した。マウス対照群に、ＰＢＳを週２回、３．５週間、注射した。
ＲＮＡ分析
ＭＡＬＡＴ１のリアルタイムＰＣＲ分析用に、ＲＮＡを、肝臓、心臓、前脛骨筋（ＴＡ）、横隔膜、四頭筋、および腓腹筋組織から抽出した。表２８に示すように、ＩＳＩＳ３９９４６２は、ＰＢＳ対照に比べ、全組織中でマウスＭＡＬＡＴ１の用量依存性減少を示した。結果を、ＰＢＳ対照に対するＭＡＬＡＴ１のパーセント抑制として示す。
実施例１７：ＭＨＴ２Ｗ腫瘍細胞中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの用量反応試験
ＭＨＴ２Ｗ細胞中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を試験した。
ＭＨＴ２Ｗ細胞を４，５００細胞／ウエルの密度で９６ウエルプレートに播種した。次の日に、細胞を、０．０２μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、２．５μＭ、および１０μＭの濃度のＩＳＩＳ１５（ＳＲ−Ｂ１を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）、ＩＳＩＳ１９（ＭＡＬＡＴ−１を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）、ＩＳＩＳ２０（ＭＡＬＡＴ−１を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）、ＩＳＩＳ２１（ＳＴＡＴ３を標的とする３−１０−３（Ｓ）−ｃＥｔギャップマー）、またはＩＳＩＳ２２（ＳＴＡＴ３を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）で処理した。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、標的ｍＲＮＡ転写物レベルを、定量リアルタイムＰＣＲで測定した。各標的ｍＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量で正規化した。結果を、非処理対照細胞に対するＳＲ−Ｂ１またはＰＴＥＮのパーセント抑制として表２９に示す。
表２９の５−１０−５ギャップマーは、オリゴヌクレオチドであり、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウイングセグメントは、５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全域のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全域の全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。３−１０−３ギャップマーは、オリゴヌクレオチドであり、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウイングセグメントは、（Ｓ）−ｃＥｔ糖に結合した３つのデオキシヌクレオシドを含む。
実施例１８：ヒト神経膠芽腫腫瘍細胞中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの用量反応試験
ヒト神経膠芽細胞腫細胞株、ＳＮＢ１９およびＵ２５１中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を試験した。
ＳＮＢ１９細胞を４，５００細胞／ウエルの密度で９６ウエルプレートに播種した。翌日、細胞を、０．０２μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、２．５μＭおよび１０μＭの濃度のＩＳＩＳ２３（ＳＴＡＴ３を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）、ＩＳＩＳ２１（ＳＴＡＴ３を標的とする３−１０−３（Ｓ）−ｃＥｔギャップマー）、ＩＳＩＳ２４（ＳＴＡＴ３を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）、ＩＳＩＳ２０（ＭＡＬＡＴ１を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）、またはＩＳＩＳ２５（キネシンファミリーメンバー１１またはＥｇ５を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）で処理した。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、標的ｍＲＮＡ転写物レベルを、定量リアルタイムＰＣＲで測定した。各標的ｍＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量で正規化した。結果を、非処理対照細胞に対するＳＴＡＴ３、ＭＡＬＡＴ−１またはＥｇ５のパーセント抑制として表３０に示す。
Ｕ２５１細胞を４，５００細胞／ウエルの密度で９６ウエルプレートに播種した。翌日、細胞を、０．０２μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、２．５μＭおよび１０μＭの濃度のＩＳＩＳ２３（ＳＴＡＴ３を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）、ＩＳＩＳ２１（ＳＴＡＴ３を標的とする３−１０−３（Ｓ）−ｃＥｔギャップマー）、ＩＳＩＳ２４（ＳＴＡＴ３を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）、ＩＳＩＳ２０（ＭＡＬＡＴ１を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）、またはＩＳＩＳ２５（キネシンファミリーメンバー１１またはＥｇ５を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）で処理した。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、標的ｍＲＮＡ転写物レベルを、定量リアルタイムＰＣＲで測定した。各標的ｍＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量で正規化した。結果を、非処理対照細胞に対するＳＴＡＴ３、ＭＡＬＡＴ−１またはＥｇ５のパーセント抑制として表３１に示す。
表３０と３１の５−１０−５ギャップマーは、オリゴヌクレオチドであり、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウイングセグメントは、５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全域のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全域の全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。３−１０−３ギャップマーは、オリゴヌクレオチドであり、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウイングセグメントは、（Ｓ）−ｃＥｔ糖に結合した３つのデオキシヌクレオシドを含む。

実施例１９：ＭＨＴ２Ｗ異種移植片腫瘍モデルでのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたインビボ試験
核内繋留ＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ取込および効力を、異種移植片腫瘍モデル中の非核内繋留ＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較した。
処理
ＭＨＴ２Ｗ腫瘍細胞（１×１０６、ヒト由来）を、雌Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに皮下注射した。４〜７日後、ＩＳＩＳ３９５２５１（ＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧＡＣＴＣＡＧ（配列番号９６）、標的とする核内繋留ＲＮＡ：ＭＡＬＡＴ１）またはＩＳＩＳ３８３７４１（ＧＡＣＴＣＴＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＧＧＣＴ（配列番号１４９）、標的とする非核内繋留ＲＮＡ：Ｓｔａｔ３）を、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、毎週２回、全体で７回腹腔内注射した。マウスを最後の投与の一日後、安楽死させた。
ｍＲＮＡ分析
ＭＡＬＡＴｌおよびＳｔａｔ３のリアルタイムＰＣＲ分析用として、試験の最後に、肝臓および腫瘍細胞からＲＮＡを単離し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した。結果を、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡ転写物のパーセント抑制として表３２に示す。
実施例２３：マウス骨髄細胞中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬理作用のインビボ試験
アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ取込および効力をＣ５７Ｂ１／６マウス骨髄細胞で試験した。
処理
マウス群に、毎日４０ｍｇ／ｋｇの用量のＩＳＩＳ１９（ＭＡＬＡＴ−１を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）、ＩＳＩＳ２３（ＳＴＡＴ３を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）またはＩＳＩＳ１５（ＳＲ−Ｂ１を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー）を４日間、静脈内注射することにより処理した。マウス対照群に、ＰＢＳを、４日間、毎日静脈内注射した。最後の投与の１日後、マウスを安楽死させた。マウスから骨髄および肝臓組織を採取した。分析用として、ＣＤ４５＋白血球細胞を骨髄から単離した。
ｍＲＮＡ分析
ＭＡＬＡＴ−１、ＳＴＡＴ３およびＳＲ−Ｂ１のリアルタイムＰＣＲ分析用として、試験の最後に、ＲＮＡを肝臓、骨髄細胞および骨髄ＣＤ４５＋白血球細胞から単離し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した。表３３は、ＰＢＳ対照に対するマウスＲＮＡ転写物のパーセント抑制を示す。データは、ＳＲ−Ｂ１およびＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、肝臓では強力であるが、腫瘍細胞中に容易には拡散できないことを示す。核内繋留標的ＭＡＬＡＴ−１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、骨髄細胞中に拡散でき、標的ＲＮＡの強力な抑制を生じた。
実施例２４：ＨｅｐＧ２細胞中のヒトα１骨格アクチンのアンチセンス抑制
ヒトα１骨格アクチン核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、αアクチンＲＮＡ転写物に与える効果をインビトロで試験した。２０，０００細胞／ウエルの密度でＨｅｐＧ２細胞を培養し、電気穿孔を使って、１０，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約２４時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、α１アクチンＲＮＡ転写物レベルを定量リアルタイムＰＣＲにより測定した。α１アクチンＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定した全ＲＮＡ含量に基づいて調節した。結果を、非処理対照細胞に対するα１アクチンのパーセント抑制として、表す。
表３４のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ギャップマーであり、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウイングセグメントは、５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全域のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全域の全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。「標的開始部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的にする５’−最末端ヌクレオチドを指す。「標的終了部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的にする３’−最末端ヌクレオチドを指す。表３４に挙げた全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号ＸＸＸ（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿００１１００．３）を標的にする。
実施例２５：ＨｅｐＧ２細胞中のヒトα１アクチンの用量依存性アンチセンス抑制
ＨｅｐＧ２細胞中でα１アクチンのインビトロ抑制を示すいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例２６参照）を、種々の用量で試験した。細胞を、２０，０００細胞／ウエルの密度で播種し、電気穿孔を使って、６２５ｎＭ、１，２５０ｎＭ、２，５００ｎＭ、５，０００ｎＭ、１０，０００ｎＭおよび２０，０００ｎＭの濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、α１アクチンＲＮＡ転写物レベルを定量リアルタイムＰＣＲで、プライマープローブセットＲＴＳ３１５４（フォワード配列ＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣ、本明細書では配列番号１６１と命名；リバース配列ＣＣＣＣＣＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＣ、本明細書では配列番号１６２と命名；プローブ配列ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＴＸ、本明細書では配列番号１６３と命名）を使って測定した。α１アクチンＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量で正規化した。結果を、非処理対照細胞に対するα１アクチンのパーセント抑制として表３５に示す。
実施例２６：遺伝子導入マウス中のヒトα１アクチンのインビボアンチセンス抑制
ヒト骨格アクチンの３’ＵＴＲに２５０ＣＴＧ反復を持つ導入遺伝子をＦＶＢ／Ｎマウス中に挿入することにより、ＨＳＡ（ヒト骨格アクチン）ＬＲ（長い反復）マウスを生成した。導入遺伝子は、マウス中でＣＵＧ反復ＲＮＡとして発現し、これは、核中に繋留され、筋緊張性ジストロフィー患者のヒト組織試料に見られるものと類似の核封入体または核内ドット（ｎｕｃｌｅａｒ ｆｏｃｉ）を形成する。
インビトロで統計的に有意な用量依存性抑制を示すＩＳＩＳ１９０４０３、ＩＳＩＳ４４５２３６およびＩＳＩＳ４４５２３８の、ヒトα１アクチンＲＮＡ転写物をインビボで低減する能力を評価した。
処理
ＨＳＡＬＲマウスを、１２時間の明暗サイクルで維持し、通常のＰｕｒｉｎａマウス固形飼料を自由に与えた。実験開始に先立ち、動物を研究施設中で少なくとも７日間順化した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＰＢＳ中で調製し、０．２ミクロンフィルターを通して殺菌した。注射用として、オリゴヌクレオチドを０．９％ＰＢＳに溶解した。
マウスを４つの処理群に分割した。最初の３つの群は、ＩＳＩＳ１９０４０３、ＩＳＩＳ４４５２３６またはＩＳＩＳ４４５２３８の皮下注射を２５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回、４週間受けた。４番目の群は、ＰＢＳの皮下注射を週２回、４週間受けた。ＰＢＳ注射群は、オリゴヌクレオチド処理群が比較される対照群としての役割をした。
α１アクチンＲＮＡの抑制
最後の投与の２４時間後、動物を屠殺し、四頭筋（左と右）、腓腹筋（左と右）、および前脛骨筋（左と右）から組織を取り出した。α１アクチンのリアルタイムＰＣＲ分析用として、ＲＮＡを単離し、１８ｓ ＲＮＡに正規化した。表３６に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理で、ヒトα１アクチンＲＮＡ転写物発現が低減した。結果を、対照に対するα１アクチン転写物のパーセント抑制として示す。
筋肉中のα１アクチンの蛍光インサイツハイブリダイゼーション
凍結筋肉組織切片を新鮮なＰＢＳ溶液中の３％パラホルムアルデヒドで１５〜２０分間固定し、その後、ＰＢＳで５分間のすすぎを２回行った。核を０．５％トリトンＸ−１００で５分間透過処理した後、組織を正常なヤギ血清で３０分間ブロッキングした。α１アクチンを標的とする、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５’標識した２’−Ｏ−メチルＲＮＡと共に切片をインキュベートした。切片をＤＡＰＩで対比染色し、核を標識した。切片をマウントし、標準的蛍光顕微鏡で観察した。画像の取込をＭｅｔａｖｕｅソフトウェアにより行い、解析をＡｕｔｏｑｕａｎｔソフトウェアで行った。
ＩＳＩＳ４４５２３６およびＩＳＩＳ４４５２３８で処理したマウス由来の全筋肉組織切片は、リボ核ドット（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｒ ｆｏｃｉ）でのα１アクチンシグナルの低減した蛍光強度を示し、ヒトα１アクチンｍＲＮＡのアンチセンス抑制および核ドット（ｎｕｃｌｅａｒ ｆｏｃｉ）中のＲＮＡの減少を示唆している。
筋電図検査による筋緊張の評価
筋緊張は、筋肉繊維の遅延緩和に起因する反復性活動電位による。この現象は、筋緊張性ジストロフィーの患者ならびにＨＳＡＬＲマウスで観察される。ＥＭＧニードルを筋緊張性筋肉に挿入すると、刺入時電位が正常に止むべき場合に、電気活動が数秒過ぎるまで持続する。筋緊張性放電の頻度は、毎秒５０〜１００インパルスの範囲である。
筋緊張は、筋電図検査により測定でき、次のような方式で、グレード付けされる：グレード０は、針挿入による誘発が全くない筋緊張（０％針挿入）を表し；グレード１は、５０％未満の針挿入により誘発された筋緊張を表し；グレード２は、５０％を越える針挿入により誘発された筋緊張を表し；さらに、グレード３は、１００％の針挿入により誘発された筋緊張を表す。
筋電図検査の前に、マウスに、腹腔内投与１００ｍｇ／ｋｇケタミン、１０ｍｇ／ｋｇキシラジン、および３ｍｇ／ｋｇアセプロマジンまたは２５０ｍｇ／ｋｇの２，２，２−トリブロモエタノールで麻酔をかけた。左と右四頭筋、左と右腓腹筋、左と右前脛骨筋および腰部傍脊柱筋の筋電図検査を、３０ゲージ同心円状針電極を使い、各筋肉に対し最小で１０針挿入を行って、以前に記載（Ｋａｎａｄｉａ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０２：１９７８−１９８０）のように実施した。データを、各群の４匹のマウスで観察された平均筋緊張グレードとして、表３７に示したが、このデータは、ＩＳＩＳ４４５２３６およびＩＳＩＳ４４５２３８で処理したマウスの筋緊張の有意な減少を明示している。
実施例２７：遺伝子導入マウスへの皮下投与による長いＣＵＧ反復ｍＲＮＡ（ＨＳＡＬＲマウス）および短いＣＵＧ反復（ＨＳＡＳＲマウス）の用量依存性抑制
長いＣＵＧ反復（ＨＳＡＬＲマウス）および短いＣＵＧ反復（ＨＳＡＳＲマウス）を含むｍＲＮＡ転写物の用量依存性抑制を評価した。ＨＳＡ短い反復（ＨＳＡＳＲ）マウスは、３’ＵＴＲの位置に２５０ＣＵＧ反復に代わりに５つの反復が挿入されている以外は、ＨＳＡｌｒマウスと同じ導入遺伝子を発現する。ＨＳＡＳＲマウスには、筋緊張、スプライシングによる変化、または他のいずれの観察可能な筋緊張表現型もない。ＩＳＩＳ４４５２３６をこのアッセイに使用した。
処理
ＨＳＡＬＲマウスを４つの処理群に分割した。最初の３つの群は、ＩＳＩＳ４４５２３６の２．５ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇの用量の皮下注射を週２回、４週間受けた。４つめの群は、ＰＢＳの皮下注射を週２回、４週間受けた。ＰＢＳ注射群は、オリゴヌクレオチド処理群が比較される対照群として機能した。ＨＳＡＳＲマウスも、４つの群に分割され、同様に処理された。
α１アクチンＲＮＡの抑制
最後の投与の２４時間後、動物を屠殺し、組織を四頭筋（左と右）、腓腹筋（左と右）、および前脛骨筋（左と右）から採取した。ＲＮＡをα１アクチンのリアルタイムＰＣＲ分析用として単離し、１８ｓ ＲＮＡに正規化した。結果を、表３８と３９に示し、対照に対するα１アクチン転写物のパーセント抑制として表している。ＨＳＡＳＲマウスの筋肉中の非核内繋留の短い反復に比べて、ＨＳＡＬＲマウスの筋肉中の核内繋留された長い反復のより大きな抑制が達成された。

実施例２８：ＤＭ１繊維芽細胞中のヒト筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを使った用量反応試験
大きなＣＵＧ反復を含む変異型のＤＭＰＫ ｍＲＮＡは、完全に転写され、ポリアデニル化されているが、核内に捕捉されて残っている（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，７３８８−７３９３）。これらの変異体核内繋留ｍＲＮＡは、筋緊張性ジストロフィー１（ＤＭ１）の最も重要な病理学的特徴の１つである。ＤＭ１繊維芽細胞中の変異体ＤＭＰＫ ｍＲＮＡのアンチセンス抑制を試験した。
ＤＭ１繊維芽細胞を４，５００細胞／ウエルの密度で播種し、サイトフェクチン試薬を使って、９．３７５ｎＭ、１８．７５ｎＭ、３７．５ｎＭ、７５ｎＭ、１５０ｎＭ、および３００ｎＭの濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドを形質移入した。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＤＭＰＫ ＲＮＡ転写物レベルを定量リアルタイムＰＣＲを用い、プライマープローブセットＲＴＳ３１６４（フォワード配列ＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡＴＧ、本明細書では配列番号１６４と命名；リバース配列ＧＣＧＴＡＧＴＴＧＡＣＴＧＧＣＧＡＡＧＴＴ、本明細書では配列番号１６５と命名；およびプローブ配列ＡＧＧＣＣＡＴＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＡＡＣＣＸ、本明細書では配列番号１６６と命名）を使って測定した。ＤＭＰＫ ＲＮＡ転写物レベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により測定した全ＲＮＡ含量で正規化した。結果を、未処理対照細胞に対するＤＭＰＫのパーセント抑制として、表４１に示した。
また、ＤＭＰＫ転写物の３’−末端を標的とするプライマープローブセットＲＴＳ３１６２（フォワード配列ＣＧＧＧＣＣＧＴＣＣＧＴＧＴＴ、本明細書では配列番号１６７と命名；リバース配列ＣＴＴＴＧＣＡＣＴＴＴＧＣＧＡＡＣＣＡＡ、本明細書では配列番号１６８と命名；およびプローブ配列ＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＸ、本明細書では配列番号１６９と命名）を使って類似の条件でアッセイを行った。結果を、未処理対照細胞に対するＤＭＰＫのパーセント抑制として、表４２に示す。
アッセイした全てのギャップマーを表４０に記載し、これらは、５−１０−５ギャップマーであり、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウイングセグメントは、５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全域のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全域の全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。全ギャップマーは、標的配列番号１７０（ヌクレオチド１８５４０６９６を１８５５５１０６に切断したＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＴ＿０１１１０９．１５の相補配列）を標的とする。「標的開始部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とする５’−最末端ヌクレオチドを指す。「標的終了部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とする３’−最末端ヌクレオチドを指す。
実施例２９：遺伝子導入マウス中のヒトＤＭＰＫのインビボアンチセンス抑制
ＬＣ１５マウス、Ｌｉｎｅ Ａ、は、（ロチェスター大学のＷｈｅｅｌｅｒ等により開発された）全ヒトＤＭＰＫ３’ＵＴＲ含有遺伝子導入マウスである。このマウスは、ＦＶＢ遺伝的背景と戻し交配された第二世代マウスである。導入遺伝子は、マウス中でＣＵＧ反復ＲＮＡとして発現し、核内に保持され、核封入体または核内ドット（ｎｕｃｌｅａｒ ｆｏｃｉ）を形成するが、これらは、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）の患者のヒト組織試料に見られるものに類似している。ＤＭＰＫ導入遺伝子中に３５０〜４００のＣＵＧ反復がある。これらのマウスは、早期にＤＭ１の徴候を示し、筋肉組織の筋緊張を全く示さない。
統計的に有意な用量依存性のインビトロ抑制を示したＩＳＩＳ４４５５６９、ＩＳＩＳ４４４４０４、ＩＳＩＳ４４４４３６およびＩＳＩＳ４７３８１０（実施例５参照）のヒトＤＭＰＫ ＲＮＡ転写物をインビボで低減する能力を評価した。
処理
ＬＣ１５、Ｌｉｎｅ Ａマウスを、１２時間の明暗サイクルで維持し、通常のＰｕｒｉｎａマウス固形飼料を自由に与えた。実験開始前に、動物を研究施設中で少なくとも７日間順化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＰＢＳ中で調製し、０．２ミクロンフィルターを通して殺菌した。注射用に、オリゴヌクレオチドを０．９％ＰＢＳに溶解した。
マウスを５つの処理群に分割した。最初の３つの群は、ＩＳＩＳ４４５５６９、ＩＳＩＳ４４４４０４またはＩＳＩＳ４４４４３６を２５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回、４週間の皮下注射を受けた。４番目の群は、ＩＳＩＳ４７３８１０を１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回、４週間の皮下注射を受けた。５番目の群は、ＰＢＳを週２回、４週間の皮下注射を受けた。ＰＢＳ注射群は、オリゴヌクレオチド処理群が比較される対照群としての役割をした。
ＤＭＰＫ ＲＮＡの抑制
最後の投与の２４時間後、動物を屠殺し、四頭筋由来の組織を取り出した。ＤＭＰＫのリアルタイムＰＣＲ分析用として、ＲＮＡを単離し、１８ｓ ＲＮＡに正規化した。表４３に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理により、ヒトＤＭＰＫ ＲＮＡ転写物発現が低減された。結果をＰＢＳ対照に対するＤＭＰＫ転写物のパーセント抑制として表している。
筋電図検査による筋緊張の評価
左と右の四頭筋、左と右の腓腹筋、左と右の前脛骨筋および腰部傍脊柱筋の筋電図検査を、以前記載（Ｋａｎａｄｉａ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０２：１９７８−１９８０）のように、３０ゲージ同心円状針電極を使って、各筋肉に対し最小の１０針挿入により実施した。ＬＣ１５マウスは、筋緊張がないので、対照群も、処理群も、試験したどの筋肉においても、筋緊張を全く示さなかった。
実施例３０：遺伝子導入マウス中のヒトＤＭＰＫのインビボアンチセンス抑制
ＬＣ１５マウス、Ｌｉｎｅ Ｄは、（ロチェスター大学のＷｈｅｅｌｅｒ等により開発された）全ヒトＤＭＰＫ３’ＵＴＲ含有遺伝子導入マウスである。このマウスは、ＦＶＢ遺伝的背景と戻し交配された第三世代マウスである。導入遺伝子は、マウス中でＣＵＧ反復ＲＮＡとして発現し、核内に保持され、核封入体または核内ドット（ｎｕｃｌｅａｒ ｆｏｃｉ）を形成するが、これらは、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）の患者のヒト組織試料に見られるものに類似している。ＤＭＰＫ導入遺伝子中に３５０〜４００のＣＵＧ反復がある。これらのマウスは、早期にＤＭ１の徴候を示し、筋肉組織の筋緊張を全く示さない。
ＩＳＩＳ４４５５６９、ＩＳＩＳ４４４４０４、ＩＳＩＳ４４４４３６およびＩＳＩＳ４７３８１０のヒトＤＭＰＫ ＲＮＡ転写物をインビボで低減する能力をさらに評価した。
処理
ＬＣ１５、Ｌｉｎｅ Ａマウスを、１２時間の明暗サイクルで維持し、通常のＰｕｒｉｎａマウス固形飼料を自由に与えた。実験開始前に、動物を研究施設中で少なくとも７日間順化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＰＢＳ中で調製し、０．２ミクロンフィルターを通して殺菌した。注射用に、オリゴヌクレオチドを０．９％ＰＢＳに溶解した。
マウスを６つの処理群に分割した。最初の３つの群は、ＩＳＩＳ４４５５６９、ＩＳＩＳ４４４４０４またはＩＳＩＳ４４４４３６を２５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回、４週間の皮下注射を受けた。４番目の群は、ＩＳＩＳ４７３８１０を１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回、４週間の皮下注射を受けた。５番目の群は、ＩＳＩＳ４７３８１０を６．２５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回、４週間の皮下注射を受けた。６番目の群は、ＰＢＳを週２回、４週間の皮下注射を受けた。ＰＢＳ注射群は、オリゴヌクレオチド処理群が比較される対照群としての役割をした。
ＤＭＰＫ ＲＮＡの抑制
最後の投与の２４時間後、動物を屠殺し、四頭筋由来の組織を取り出した。ＤＭＰＫのリアルタイムＰＣＲ分析用として、ＲＮＡを単離し、１８ｓ ＲＮＡに正規化した。表４４に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理により、ヒトＤＭＰＫ ＲＮＡ転写物発現が低減された。結果をＰＢＳ対照に対するＤＭＰＫ転写物のパーセント抑制として示す。
筋電図検査による筋緊張の評価
左と右の四頭筋、左と右の腓腹筋、左と右の前脛骨筋および腰部傍脊柱筋の筋電図検査を、以前記載（Ｋａｎａｄｉａ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０２：１９７８−１９８０）のように、３０ゲージ同心円状針電極を使って、各筋肉に対し最小の１０針挿入により実施した。ＬＣ１５マウスは、筋緊張がないので、対照群も、処理群も、試験したどの筋肉においても、筋緊張を全く示さなかった。
実施例３１：ＳＸＬ遺伝子導入マウスモデル中のヒトＤＭＰＫのインビボアンチセンス抑制
ｈＤＭＰＫを標的とするＡＳＯ４４４４０１および２９９４７１を使って、ＳＸＬマウスでヒラメ筋中の標的ノックダウンを測定した。ＳＸＬマウスは、全ＤＭＰＫ遺伝子およびプロモーターに対し形質転換されており、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲに１０００ＣＵＧ反復配列を含む。マウスに、週２回、４週間、５０ｍｇ／ｋｇ投与した（各群に対し、食塩水注射対照のｎ＝２を除く、ｎ＝３マウスに）。図１に、ｍｕｔ−ｈＤＭＰＫ ｍＲＮＡ（図１Ａ）および内在性マウスＤｍｐｋ ｍＲＮＡ（図１Ｂ）に対するＴａｑｍａｎアッセイ結果を示す。
実施例３２：ｓｎｏＲＮＡのインビボでの抑制
Ｕ１６とＵ５０ ｓｎｏＲＮＡの有意な抑制を示すＩＳＩＳ４６２０２６（Ｕ１６を標的とする）およびＩＳＩＳ４７７４９９（Ｕ５０を標的とする）をマウスで試験し、ギャップマーの効力を評価した。
処理
２つの群の５匹の７週齢ｂａｌｂ−ｃマウスに、それぞれ、１００ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ４６２０２６またはＩＳＩＳ４７７４９９を皮下投与した。別の群の５匹のマウスに、１００ｍｇ／ｋｇの対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１４１９２３（ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣ、本明細書では配列番号１７６と命名）を注射した。別の群の５匹のマウスに、ＰＢＳを皮下注射した。ＰＢＳを投与されたマウスは、対照群の役割をした。マウスを７２時間後屠殺し、標的ｍＲＮＡ分析用として、いくつかの組織を採取した。採取した組織は、肝臓、心臓、脾臓、白色脂肪組織（ＷＡＴ）、腎臓、および筋肉であった。
ＲＮＡ分析
種々の組織のそれぞれ由来の全ＲＮＡを、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔを使って、メーカーのインストラクションに基づいて別々に調製した。５μｇの全ＲＮＡを８％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲル中に分離し、セミドライトランスファー装置を使って膜上に移した。ノーザンハイブリダイゼーションを、Ｕ１６ ｓｎｏＲＮＡ特異的５’−末端標識オリゴヌクレオチドプローブ（５’−ＴＴＧＣＴＣＡＧＴＡＡＧＡＡＴＴＴＴＣＧ−３’、本明細書では配列番号１７７と命名）、およびＵ５０ ｓｎｏＲＮＡ特異的５’−末端標識オリゴヌクレオチドプローブ（５’−ＧＧＴＴＣＧＧＧＡＴＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＣＡ−３’、本明細書では配列番号１７８と命名）を使って行った。Ｕ２ ｓｎＲＮＡを検出し、ローディングコントロールとして使用した。バンドの密度を、ＩｍａｇｅＪ濃度計を使ってスキャンした。抑制結果を図２に示す。データは、ＩＳＩＳ４６２０２６およびＩＳＩＳ４７７４９９は、有意にそれらの標的ｓｎｏＲＮＡ発現を抑制したことを示している。
ｒＲＮＡメチル化の評価
肝臓飼料由来の全ＲＮＡを各群用にプールし、プライマー伸長分析を行い、Ｕ１６ ｓｎｏＲＮＡにより標的にされる１８ＳｒＲＮＡ中の位置Ａ４８５、またはＵ５０ ｓｎｏＲＮＡにより標的にされる２８ＳｒＲＮＡ中の位置Ｃ２６１３でのｒＲＮＡメチル化を検出した。結果を表４５に示すが、ＰＢＳ対照に比べて、０．０５ｍＭのｄＮＴＰ濃度で有意な抑制を示している。
実施例３３：ｌｉｎｃＲＮＡ＿ＳＦＰＱＥ、ｌｉｎｃＲＮＡ＿ｐ２１、ｌｉｎｃＲＮＡ＿ＨＯＸＡ１、ＨＯＴＡＩＲ、ＰＣＧＥＭ１、およびＭＩＡＴｍＲＮＡのインビトロ抑制
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ｌｉｎｃＲＮＡ＿ＳＦＰＱＥ、ｌｉｎｃＲＮＡ＿ｐ２１、ｌｉｎｃＲＮＡ＿ＨＯＸＡ１、ＨＯＴＡＩＲ、ＰＣＧＥＭ１、およびＭＩＡＴ ｍＲＮＡ配列を標的とするよう設計した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、インビトロで試験した。種々の用量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それぞれ、種々の細胞中で試験し、対応する標的のｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
結果は、核内繋留ＲＮＡ、例えば、ｌｉｎｃＲＮＡ＿ＳＦＰＱＥ、ｌｉｎｃＲＮＡ＿ｐ２１、ｌｉｎｃＲＮＡ＿ＨＯＸＡ１、ＨＯＴＡＩＲ、ＰＣＧＥＭ１、およびＭＩＡＴに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＡＬＡＴ１を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドにより示されたものと類似の効力（実施例１〜６参照）で、それらの標的ｍＲＮＡ配列を低減させることができたことを示した。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］アンチセンスオリゴヌクレオチド取込の少ない細胞または組織中の、薬理学的に関連する核内繋留ＲＮＡの減少を実現する方法であって、前記核内繋留ＲＮＡを持っていると疑われる動物に、核内繋留ＲＮＡを切断し、前記薬理学的に関連する減少を実現できる核リボヌクレアーゼを活性化するのに有効な量の前記核内繋留ＲＮＡに相補的な化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
［態様２］前記核内繋留ＲＮＡが、前記組織中の疾患または状態と関連し、前記動物が、前記疾患または状態を持っているとして選択される態様１に記載の方法。
［態様３］前記核内繋留ＲＮＡが、ノンコーディングＲＮＡである態様１または２に記載の方法。
［態様４］前記ノンコーディングＲＮＡが、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、短鎖ノンコーディングＲＮＡ、大型介在性ノンコーディングＲＮＡ（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）、反復配列含有ＲＮＡ、ヌクレオチド反復伸長含有ＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、またはｅｎｒＲＮＡである態様３に記載の方法。
［態様５］前記ノンコーディングＲＮＡが、Ｘｌｓｉｒｔ、Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＩＩＩ、Ｈｏｘ Ｃ５転写変異体２（ノンコーディング）、Ｍｅｎβ、Ｎｅａｔ１、Ｎｅａｔ２、ｈｓｒ−ｏｍｅｇａ、ｈｏｔｈｅａｄ、Ｋｉｔ、Ｘｉｓｔ、Ａｉｒ、Ｔｓｉｘ、Ｍｉｒｇ、Ｋｃｎｑｌｏｔ１、ＡＫ０４５０７０、Ｐ−ｒｅｘ１、ＺＮＦ１２７ＡＳ、ＮＥＳＰＡＳ、ＳＲＧ１、Ｈｏｔａｉｒ、Ｇｏｍａｆｕ、Ｓｏｘ２ｏｔ、Ｒｉａｎ、ＣＡＴ２、Ｘｉｔｅ、Ｊｐｘ、Ｆｔｘ、ＲｏＸ１、ＲｏＸ２、Ｈ１９、Ｉｇｆ２、ＩＰＷ、ＵＢＥ３Ａ、ＡＴＰ１０Ｃ、ｐｇｃ、７ＳＫ、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ転写伸長因子Ｐ−ＴＥＦｂ、Ｂ２、ＨＳＲ−１、ＢＣ１、ＢＣ２００、ＮＲＳＥ、ＮＲＯＮ、ＮＦＡＴ転写因子、Ｍａｋｏｒｉｎ−ｐ１、ＨＡＲ１Ｆ、ＨＡＲ１Ｒ、ＯＣＣ１、ＤＤ３／ＰＣＡ３、ＰＣＧＥＭ１、ＮＣＲＭＳ、ＨＩＳ−１、ＢＣＭＳ、ＣＭＰＤ、ＮＣ６１２、ＳＲＡ、ＤＩＳＣ２、ＰＳＺＡ１１ｑ１４、ＲＡＹ１／ＳＴ７、ＵＢＥ３Ａ−ＡＳ、ＳＣＡ８、２２ｋ４８、Ｃ６ｏｒｆ３７ＯＳ、ＣＯＰＧ２ＩＴ１、ＤＧＣＲ５、ＫＣＮＱ１オーバーラップ転写物１（非タンパクコード）、ＭＥＳＴＩＴ１、およびＰＲＩＮＳの内のいずれかである態様３または４に記載の方法。
［態様６］前記ヌクレオチド反復伸長含有ＲＮＡが、ＳＣＡ８／アタキシン８、ＡＴＮ１／ＤＲＰＬＡ、ＦＭＲ１、ＡＦＦ２／ＦＭＲ２、フラタキシン／ＦＸＮ、Ｈｔｔ、ジャンクトフィリン−３（ＪＰＨ３）、ＤＭＰＫ、Ｚｎフィンガータンパク質−９、アンドロゲン受容体（ＡＲ）（Ｘ−連鎖）、アタキシン−１（ＡＴＸＮ１）、ＡＴＸＮ１０、タンパク質ホスファターゼＰＰ２Ａ（ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ）、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、およびＳＣＡ８の内のいずれかである態様４に記載の方法。
［態様７］前記ノンコーディングＲＮＡが、ＮＥＡＴ２（別名ＭＡＬＡＴ１）、ＤＭＰＫ、Ｕ１６、およびＵ５０の内のいずれかである態様３または４に記載の方法。
［態様８］前記組織が、骨格筋、心筋、平滑筋、脂質、脾臓、骨、腸、副腎、精巣、卵巣、膵臓、下垂体、前立腺、皮膚、子宮、膀胱、腫瘍および脳の内のいずれかである態様１〜７のいずれか１に記載の方法。
［態様９］細胞が、糸球体細胞、遠位尿細管上皮細胞、またはリンパ球である態様１〜７のいずれか１に記載の方法。
［態様１０］細胞が悪性細胞である態様１〜７のいずれか１に記載の方法。
［態様１１］細胞が、悪性乳腺細胞、悪性肺細胞、悪性結腸細胞、および悪性前立腺細胞の内のいずれかである態様１０に記載の方法。
［態様１２］アンチセンスオリゴヌクレオチド取込の少ない組織の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または傷害の症状を治療、改善し、遅延または低減させる方法であって、
ａ． 前記組織中の前記核内繋留ＲＮＡに関連した疾患または傷害を有する動物を選択すること；および
ｂ． 前記動物に、前記薬理学的に関連する量で、核内繋留ＲＮＡを切断できる核リボヌクレアーゼを活性化するのに有効な量の化学修飾された前記核内繋留ＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与し、それにより、前記疾患または傷害の症状を治療、改善し、遅延または低減させること、
を含む方法。
［態様１３］動物が、ハンチントン病、ハンチントン病様２、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１およびＤＭ２を含む）、脆弱Ｘ関連振戦・失調症候群、脆弱ＸＥ精神遅滞、脊髄小脳失調症（表２に挙げたものを含む）、フリードライヒ運動失調症、早期卵巣機能不全、球脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症（ケネディ病）および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ハウ・リバー症候群）から選択される疾患である態様１２に記載の方法。
［態様１４］前記組織が、骨格筋、心筋、平滑筋、脂質、脾臓、骨、腸、副腎、精巣、卵巣、膵臓、下垂体、前立腺、皮膚、子宮、膀胱、腫瘍および脳の内のいずれかである態様１２または１３に記載の方法。
［態様１５］細胞が、糸球体細胞、遠位尿細管上皮細胞、またはリンパ球である態様１２または１３に記載の方法。
［態様１６］細胞が、悪性細胞である態様１２または１３に記載の方法。
［態様１７］細胞が、悪性乳腺細胞、悪性肺細胞、悪性結腸細胞、および悪性前立腺細胞の内のいずれかである態様１６に記載の方法。
［態様１８］化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与が、全身性の効果をもたらす態様１〜１７のいずれか１に記載の方法。
［態様１９］投与が皮下である態様１〜１８のいずれか１に記載の方法。
［態様２０］投与が静脈内である態様１〜１８のいずれか１に記載の方法。
［態様２１］投与がＣＮＳに対して行われる態様１〜１８のいずれか１に記載の方法。
［態様２２］投与がＣＳＦに対して行われる態様１〜１８のいずれか１に記載の方法。
［態様２３］ＲＮＡが、少なくとも１つの反復領域および少なくとも１つの非反復領域を含むヌクレオチド反復含有ＲＮＡである態様１〜２２のいずれか１に記載の方法。
［態様２４］前記ヌクレオチド反復含有ＲＮＡの反復領域が、ＣＡＧ、ＧＣＧ、ＣＵＧ、ＧＣＣ、ＧＣＣ、ＣＧＧ、ＧＡＡ、ＣＡＡ、ＣＣＵＧ、およびＡＵＵＣＵから選択される反復配列を含む態様２３に記載の方法。
［態様２５］反復配列が、反復領域内で、約２０倍超、約２５倍超、約３０倍超、約３５倍超、約４０倍超、約４５倍超、約５０倍超、約５５倍超、約６０倍超、約６５倍超、約７０倍超、または約７５倍超の反復である態様２３または２４に記載の方法。
［態様２６］オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド反復含有ＲＮＡの非反復領域内のノンコーディング配列を標的とする態様２３〜２５のいずれか１に記載の方法。
［態様２７］オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド反復含有ＲＮＡのコード領域、イントロン、５’ＵＴＲ、または３’ＵＴＲを標的とする態様２３〜２５のいずれか１に記載の方法。
［態様２８］ＲＮＡが、ノンコーディングＲＮＡである態様１〜１８のいずれか１に記載の方法。
［態様２９］ＲＮＡが、長鎖ｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ含有反復配列、ヌクレオチド反復伸長含有ＲＮＡ、低分子ノンコーディングＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡおよびｓｃａＲＮＡから選択される態様２８に記載の方法。
［態様３０］ＲＮＡが、変異体ＲＮＡである態様１〜２９のいずれか１に記載の方法。
［態様３１］好ましくは、変異体ＲＮＡが、野性型に比べて、低減している態様３０に記載の方法。
［態様３２］ＲＮＡが、安定なＲＮＡである態様１〜３１のいずれか１に記載の方法。
［態様３３］ＲＮＡが、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間または２４時間超の半減期を有する態様１〜３２のいずれか１に記載の方法。
［態様３４］オリゴヌクレオチドがキメラである態様１〜３３のいずれか１に記載の方法。
［態様３５］オリゴヌクレオチドがギャップマーである態様１〜３４のいずれか１に記載の方法。
［態様３６］オリゴヌクレオチドのヌクレオベース配列が、前記オリゴヌクレオチドの全体にわたって測定して、核内繋留ＲＮＡに対し、少なくとも９５％相補的である態様１〜３５のいずれか１に記載の方法。
［態様３７］修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオベース配列が、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体にわたって測定して、核内繋留ＲＮＡに対し、１００％相補的である態様１〜３５のいずれか１に記載の方法。
［態様３８］前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、修飾されたヌクレオシド間結合である態様１〜３７のいずれか１に記載の方法。
［態様３９］各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である態様３８に記載の方法。
［態様４０］前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが、修飾糖を含む態様１〜３９のいずれか１に記載の方法。
［態様４１］少なくとも１つの修飾糖が二環糖である態様４０に記載の方法。
［態様４２］少なくとも１つの修飾糖が、２’−Ｏ−メトキシエチルまたは４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋を含み、ｎが１または２である態様４０に記載の方法。
［態様４３］前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが、修飾ヌクレオベースを含む態様１〜４２のいずれか１に記載の方法。
［態様４４］修飾ヌクレオベースが、５−メチルシトシンである態様４３に記載の方法。
［態様４５］オリゴヌクレオチドが、
連鎖デオキシヌクレオシドから構成されるギャップセグメント；
連鎖ヌクレオシドから構成される５’ウイングセグメント；
連鎖ヌクレオシドから構成される３’ウイングセグメント；
を含み、ギャップセグメントが、５’ウイングセグメントおよび３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、
態様１〜４４のいずれか１に記載の方法。
［態様４６］修飾オリゴヌクレオチドが、２０連鎖ヌクレオシドから構成される態様４５に記載の方法。
［態様４７］オリゴヌクレオチドが、
ａ． １０連鎖デオキシヌクレオシドから構成されるギャップセグメント；
ｂ． ５連鎖ヌクレオシドから構成される５’ウイングセグメント；
ｃ． ５連鎖ヌクレオシドから構成される３’ウイングセグメント；
を含み、ギャップセグメントが、５’ウイングセグメントおよび３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合であり、前記修飾オリゴヌクレオチド中の各シトシンが、５’−メチルシトシンである態様４６に記載の方法。
［態様４８］修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号９２〜１１０、１５０〜１６０、および１７１〜１７５のヌクレオベース配列の内のいずれかの少なくとも１２近接ヌクレオベースを含むヌクレオベース配列を有する態様１〜４７のいずれか１に記載の方法。
［態様４９］アンチセンスオリゴヌクレオチド取込の少ない組織中の核内繋留ＲＮＡに関連した疾患の治療用の核リボヌクレアーゼを活性化できる化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
［態様５０］皮下処置のための態様４９に記載の使用。
［態様５１］静脈内処置のための態様４９に記載の使用。
［態様５２］ＣＮＳ治療のための態様４９に記載の使用。
［態様５３］ＣＳＦ治療のための態様４９に記載の使用。
［態様５４］９２〜１１０、１５０〜１６０、および１７１〜１７５のヌクレオベース配列の内のいずれかの少なくとも１２近接ヌクレオベースを含むヌクレオベース配列を有する１２〜３０連鎖ヌクレオシドから構成される修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物。
［態様５５］修飾オリゴヌクレオチドが、単鎖オリゴヌクレオチドである態様５４に記載の化合物。
［態様５６］修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオベース配列が、配列番号１、１７７、および１９８に１００％相補的である態様５４または５５に記載の化合物。
［態様５７］少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合である態様５５〜５７のいずれか１に記載の化合物。
［態様５８］各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である態様５７に記載の化合物。
［態様５９］少なくとも１つのヌクレオシドが、修飾糖を含む態様５５〜５８のいずれか１に記載の化合物。
［態様６０］少なくとも１つの修飾糖が二環糖である態様５９に記載の化合物。
［態様６１］少なくとも１つの修飾糖が、２’−Ｏ−メトキシエチルを含む態様５９に記載の化合物。
［態様６２］少なくとも１つのヌクレオシドが修飾ヌクレオベースを含む態様５５〜６１のいずれか１に記載の化合物。
［態様６３］修飾ヌクレオベースが５−メチルシトシンである態様６２に記載の化合物。
［態様６４］修飾オリゴヌクレオチドが、
連鎖デオキシヌクレオシドから構成されるギャップセグメント；
連鎖ヌクレオシドから構成される５’ウイングセグメント；
連鎖ヌクレオシドから構成される３’ウイングセグメント、を含み、
ギャップセグメントが、５’ウイングセグメントおよび３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む態様５５〜６３のいずれか１に記載の化合物。
［態様６５］修飾オリゴヌクレオチドが、
１０連鎖デオキシヌクレオシドから構成されるギャップセグメント；
５連鎖ヌクレオシドから構成される５’ウイングセグメント；
５連鎖ヌクレオシドから構成される３’ウイングセグメント、を含み、
ギャップセグメントが、５’ウイングセグメントおよび３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み；さらに、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である態様５５〜６４のいずれか１に記載の化合物。
［態様６６］修飾オリゴヌクレオチドが、１４連鎖ヌクレオシドから構成される態様５５〜６５のいずれか１に記載の化合物。
［態様６７］修飾オリゴヌクレオチドが、１６連鎖ヌクレオシドから構成される態様５５〜６５のいずれか１に記載の化合物。
［態様６８］修飾オリゴヌクレオチドが、２０連鎖ヌクレオシドから構成される態様５５〜６５のいずれか１に記載の化合物。
［態様６９］態様５４〜６７のいずれか１に記載の化合物を含む医薬組成物。

Claims (24)

  1. 筋肉中の、薬理学的に関連する核内繋留RNAの減少を実現するための医薬組成物であって、核内繋留RNAを切断できる核リボヌクレアーゼを活性化して前記薬理学的に関連する減少を実現するのに有効な量の、前記核内繋留RNAに相補的な化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、
    該核内繋留RNAが、DMPKであり、
    該オリゴヌクレオチドが、
    連鎖デオキシヌクレオシドから構成されるギャップセグメント；
    連鎖ヌクレオシドから構成される5'ウイングセグメント；
    連鎖ヌクレオシドから構成される3'ウイングセグメント；
    を含み、ギャップセグメントが、5'ウイングセグメントおよび3'ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含み、
    該オリゴヌクレオチドが、皮下投与又は静脈内投与される、
    前記医薬組成物。
  2. 前記筋肉が、骨格筋、心筋、及び平滑筋のいずれかである、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与が、全身性の効果をもたらす、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. RNAが、少なくとも１つの反復領域および少なくとも１つの非反復領域を含むヌクレオチド反復含有RNAである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 前記ヌクレオチド反復含有RNAの反復領域が、CAG、GCG、CUG、GCC、GCC、CGG、GAA、CAA、CCUG、およびAUUCUから選択される反復配列を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 反復配列が、反復領域内で、20回超、25回超、30回超、35回超、40回超、45回超、50回超、55回超、60回超、65回超、70回超、または75回超の反復である、請求項４または５に記載の医薬組成物。
  7. オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド反復含有RNAの非反復領域内のノンコーディング配列を標的とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド反復含有RNAのコード領域、イントロン、5'UTR、または3'UTRを標的とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. RNAが、変異体RNAである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 変異体RNAの量が、野性型RNAの量に比べて、低減している、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. RNAが、安定なRNAである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. RNAが、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも12時間、少なくとも15時間、少なくとも20時間、少なくとも24時間または24時間超の半減期を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、前記オリゴヌクレオチドの全体にわたって測定して、核内繋留RNAに対し、少なくとも95％相補的である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. 修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体にわたって測定して、核内繋留RNAに対し、100％相補的である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  15. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、修飾されたヌクレオシド間結合である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  16. 各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが、修飾糖を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. 少なくとも１つの修飾糖が二環糖である、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 少なくとも１つの修飾糖が、2'-O-メトキシエチルまたは4'-（CH2）n-O-2'架橋を含み、nが１または２である、請求項１７に記載の医薬組成物。
  20. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが、修飾核酸塩基を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  21. 修飾核酸塩基が、5-メチルシトシンである、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 修飾オリゴヌクレオチドが、20連鎖ヌクレオシドから構成される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  23. オリゴヌクレオチドが、
    a． 10連鎖デオキシヌクレオシドから構成されるギャップセグメント；
    b． 5連鎖ヌクレオシドから構成される5'ウイングセグメント；
    c． 5連鎖ヌクレオシドから構成される3'ウイングセグメント；
    を含み、ギャップセグメントが、5'ウイングセグメントおよび3'ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが、2'-O-メトキシエチル糖を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合であり、前記修飾オリゴヌクレオチド中の各シトシンが、5'-メチルシトシンである、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号171〜175の核酸塩基配列の内のいずれかの少なくとも12近接核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
JP2013520822A 2010-07-19 2011-07-19 核内繋留ｒｎａの調節 Active JP6059141B2 (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36576210P 2010-07-19 2010-07-19
US36577510P 2010-07-19 2010-07-19
US61/365,775 2010-07-19
US61/365,762 2010-07-19
US201161478021P 2011-04-21 2011-04-21
US61/478,021 2011-04-21
PCT/US2011/044583 WO2012012467A2 (en) 2010-07-19 2011-07-19 Modulation of nuclear-retained rna

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2013538561A JP2013538561A (ja) 2013-10-17
JP2013538561A5 JP2013538561A5 (ja) 2014-09-04
JP6059141B2 true JP6059141B2 (ja) 2017-01-11

Family

ID=45497419

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013520815A Active JP5981428B2 (ja) 2010-07-19 2011-07-19 筋緊張性ジストロフィー・プロテインキナーゼ（ｄｍｐｋ）発現の調整
JP2013520822A Active JP6059141B2 (ja) 2010-07-19 2011-07-19 核内繋留ｒｎａの調節
JP2016147984A Active JP6343308B2 (ja) 2010-07-19 2016-07-28 筋緊張性ジストロフィー・プロテインキナーゼ（ｄｍｐｋ）発現の調整
JP2018095820A Active JP6698740B2 (ja) 2010-07-19 2018-05-18 筋緊張性ジストロフィー・プロテインキナーゼ（ｄｍｐｋ）発現の調整
JP2020078906A Pending JP2020183379A (ja) 2010-07-19 2020-04-28 筋緊張性ジストロフィー・プロテインキナーゼ（ｄｍｐｋ）発現の調整

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013520815A Active JP5981428B2 (ja) 2010-07-19 2011-07-19 筋緊張性ジストロフィー・プロテインキナーゼ（ｄｍｐｋ）発現の調整

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016147984A Active JP6343308B2 (ja) 2010-07-19 2016-07-28 筋緊張性ジストロフィー・プロテインキナーゼ（ｄｍｐｋ）発現の調整
JP2018095820A Active JP6698740B2 (ja) 2010-07-19 2018-05-18 筋緊張性ジストロフィー・プロテインキナーゼ（ｄｍｐｋ）発現の調整
JP2020078906A Pending JP2020183379A (ja) 2010-07-19 2020-04-28 筋緊張性ジストロフィー・プロテインキナーゼ（ｄｍｐｋ）発現の調整

Country Status (13)

Country Link
US (7) US20130225659A1 (ja)
EP (5) EP2595663A4 (ja)
JP (5) JP5981428B2 (ja)
KR (2) KR20180105730A (ja)
CN (2) CN106434648A (ja)
AU (6) AU2011282217B2 (ja)
CA (2) CA2805791A1 (ja)
DK (1) DK3031920T3 (ja)
ES (1) ES2756326T3 (ja)
HR (1) HRP20191753T1 (ja)
IL (2) IL223962B (ja)
PL (1) PL3031920T3 (ja)
WO (2) WO2012012443A2 (ja)

Families Citing this family (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2049664T3 (da) 2006-08-11 2012-01-02 Prosensa Technologies Bv Enkeltstrengede oligonukleotider, som er komplementære til repetitive elementer, til behandling af med DNA-repetitiv-ustabilitet associerede lidelser
CN101896186A (zh) 2007-10-26 2010-11-24 莱顿教学医院 对抗肌肉病症的方式和方法
AU2011282217B2 (en) 2010-07-19 2015-12-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) expression
EP2638163B1 (en) 2010-11-12 2017-05-17 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding rnas
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
US9976138B2 (en) 2011-08-29 2018-05-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compounds useful in conditions related to repeat expansion
EP2756080B1 (en) 2011-09-14 2019-02-20 Translate Bio MA, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
CA2859729C (en) * 2011-12-22 2021-03-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating metastasis-associated-in-lung-adenocarcinoma-transcript-1(malat-1) expression
BR112014018427B1 (pt) 2012-01-27 2021-11-03 Biomarin Technologies B.V. Oligonucleotídeos moduladores de rna com características melhoradas para o tratamento da distrofia muscular de duchenne e becker
EP2841578B1 (en) 2012-04-23 2017-06-07 BioMarin Technologies B.V. RNA modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of neuromuscular disorders
KR20160074368A (ko) 2012-05-16 2016-06-28 라나 테라퓨틱스, 인크. Utrn 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
CN104583398A (zh) 2012-05-16 2015-04-29 Rana医疗有限公司 用于调节基因表达的组合物和方法
WO2013173638A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating smn gene family expression
BR112014028631A2 (pt) 2012-05-16 2017-10-17 Rana Therapeutics Inc composições e métodos para modulação da expressão da família de genes da hemoglobina
EA201492120A1 (ru) 2012-05-16 2015-10-30 Рана Терапьютикс, Инк. Композиции и способы для модулирования экспрессии atp2a2
AU2013262709A1 (en) 2012-05-16 2015-01-22 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating MECP2 expression
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
EP2864479B1 (en) * 2012-06-25 2018-08-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of ube3a-ats expression
US20150307937A1 (en) * 2012-08-22 2015-10-29 Wayne State University Activity-dependent gene pairs as therapeutic targets and methods and devices to identify the same
WO2014043544A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 Rana Therapeutics, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
US9175291B2 (en) 2012-10-11 2015-11-03 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of androgen receptor expression
EP2906697A4 (en) 2012-10-15 2016-06-22 Ionis Pharmaceuticals Inc METHOD FOR MONITORING THE C9ORF72 EXPRESSION
RU2730677C2 (ru) * 2012-10-15 2020-08-24 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Соединение для модуляции экспрессии гена c9orf72 и его применение
EP2906696B2 (en) * 2012-10-15 2022-12-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating c9orf72 expression
KR101507505B1 (ko) * 2013-04-18 2015-04-07 사회복지법인 삼성생명공익재단 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법
US10435430B2 (en) * 2013-07-31 2019-10-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compounds useful in conditions related to repeat expansion
TW201536329A (zh) 2013-08-09 2015-10-01 Isis Pharmaceuticals Inc 用於調節失養性肌強直蛋白質激酶(dmpk)表現之化合物及方法
WO2015023941A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 Rana Therapeutics, Inc. Oligonucleotides targeting euchromatin regions of genes
EP3033114A4 (en) * 2013-08-16 2017-04-05 Rana Therapeutics Inc. Heterochromatin forming non-coding rnas
BR112016004671B1 (pt) * 2013-09-13 2020-12-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. compostos moduladores do fator b do complemento, composição compreendendo os referidos compostos e usos dos compostos ou da composição
US10017765B2 (en) 2013-09-25 2018-07-10 The University Of Chicago Inhibitors of CACNA1A/ALPHA1A subunit internal ribosomal entry site (IRES) and methods of treating spinocerebellar ataxia type 6
WO2015051283A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
BR112016007751A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-12 Ionis Pharmaceuticals Inc composições para modulação de expressão de c9orf72
US11162096B2 (en) 2013-10-14 2021-11-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc Methods for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
WO2015118156A1 (en) * 2014-02-07 2015-08-13 Vib Vzw Inhibition of neat1 for treatment of solid tumors
WO2015143245A1 (en) * 2014-03-19 2015-09-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating ataxin 2 expression
LT3119888T (lt) 2014-03-19 2021-10-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Kompozicijos, skirtos ataksino 2 raiškos moduliavimui
WO2015161189A1 (en) * 2014-04-17 2015-10-22 Cornell University Neat1 as a prognostic marker and therapeutic target for prostate cancer
US10436802B2 (en) 2014-09-12 2019-10-08 Biogen Ma Inc. Methods for treating spinal muscular atrophy
WO2016070060A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 The General Hospital Corporation Methods for modulating atrx-dependent gene repression
US10400243B2 (en) 2014-11-25 2019-09-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of UBE3A-ATS expression
WO2016130943A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Rana Therapeutics, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
WO2016149455A2 (en) 2015-03-17 2016-09-22 The General Hospital Corporation The rna interactome of polycomb repressive complex 1 (prc1)
MX366128B (es) 2015-04-16 2019-06-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones para modular la expresion de c90rf72.
CN105586399A (zh) * 2015-09-07 2016-05-18 张国新 一种与胃癌相关的血清/血浆lncRNA标志物试剂盒
US10533175B2 (en) 2015-09-25 2020-01-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating Ataxin 3 expression
WO2017053999A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
EP3365446A4 (en) 2015-10-19 2019-06-26 Phio Pharmaceuticals Corp. SMALL SELF-LEANING NUCLEIC ACID COMPOUNDS TURNED AGAINST LONG NON-CODING RNA
US11260073B2 (en) 2015-11-02 2022-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating C90RF72
MA67580B1 (fr) 2015-11-12 2024-09-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucléotides pour induire l'expression de paternal ube3a
CN105331720A (zh) * 2015-11-27 2016-02-17 首都医科大学宣武医院 检测dm致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒
EA201800367A1 (ru) 2015-12-10 2019-02-28 ПиТиСи ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. Способы лечения болезни хантингтона
EP3397288A4 (en) 2015-12-31 2019-09-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. PROCESS FOR REDUCING ATAXIN-2 EXPRESSION
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
EP3471779A4 (en) 2016-06-16 2020-07-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMBINATIONS FOR MODULATING SMN EXPRESSION
US11427838B2 (en) * 2016-06-29 2022-08-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 (DM1) and other related disorders
US20190330626A1 (en) * 2016-07-15 2019-10-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for use in dystrophin transcript
PE20190513A1 (es) * 2016-07-15 2019-04-10 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para la modulacion de smn2
CA3027177A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulation of transcript processing
ES2659845B1 (es) * 2016-09-19 2019-01-04 Univ Valencia Modulación de microRNAs contra la distrofia miotónica tipo 1 y antagonistas de microRNAs para ello
JOP20190104A1 (ar) * 2016-11-10 2019-05-07 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير عن atxn3
AU2017368050A1 (en) 2016-11-29 2019-06-20 Puretech Lyt, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
MX2019008199A (es) 2017-01-06 2019-11-25 Avidity Biosciences Llc Composiciones de acido nucleico polipeptido y metodos de induccion de la omision de exon.
US11512312B2 (en) 2017-03-10 2022-11-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Treatment of Fuchs' endothelial corneal dystrophy
US11359200B2 (en) * 2017-04-09 2022-06-14 The Cleveland Clinic Foundation Cancer treatment by MALAT1 inhibition
KR20200033249A (ko) 2017-06-05 2020-03-27 피티씨 테라퓨틱스, 인크. 헌팅턴병 치료 화합물
EP3599844A4 (en) * 2017-06-07 2021-01-13 University of Massachusetts ANTI-ADAM33 OLIGONUCLEOTIDES AND RELATED PROCESSES
CA3067591A1 (en) 2017-06-28 2019-01-03 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating huntington's disease
US11395822B2 (en) 2017-06-28 2022-07-26 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating Huntington's disease
CN107446012B (zh) * 2017-07-10 2020-06-05 浙江大学 一类肿瘤荧光显像剂及制备和应用
GB201711809D0 (en) 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
EP3662060A2 (en) 2017-08-03 2020-06-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
KR20250148679A (ko) 2017-12-06 2025-10-14 어비디티 바이오사이언시스 인크. 근위축증 및 근긴장성 이영양증을 치료하는 조성물 및 방법
US12103926B2 (en) 2018-03-27 2024-10-01 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating huntington's disease
MX2020011911A (es) 2018-05-09 2021-01-29 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para reducir de la expresion de atxn3.
JP2021522836A (ja) * 2018-05-15 2021-09-02 ユニバーシティ オブ ワシントンＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ スプライスオパシーの軽減、及びｒｎａドミナンス障害の治療のための組成物及び方法
JP7379387B2 (ja) 2018-06-05 2023-11-14 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ａｔｘｎ２発現を制御するためのオリゴヌクレオチド
BR112020026545A2 (pt) 2018-06-27 2021-03-23 Ptc Therapeutics, Inc. Compostos heterocíclicos e de heteroarila para o tratamento da doença de huntington
EA202092899A1 (ru) 2018-06-27 2021-05-14 ПиТиСи ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. Гетероарильные соединения для лечения болезни гентингтона
TWI843738B (zh) 2018-07-25 2024-06-01 美商Ionis製藥公司 用於減少atxn2表現之化合物及方法
US12018087B2 (en) 2018-08-02 2024-06-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject
US12370264B1 (en) 2018-08-02 2025-07-29 Dyne Therapeutics, Inc. Complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and method of delivering oligonucleotide to a subject
US20220193250A1 (en) 2018-08-02 2022-06-23 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US12097263B2 (en) 2018-08-02 2024-09-24 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
EP3829596A4 (en) * 2018-08-02 2022-05-11 Dyne Therapeutics, Inc. MUSCLE TARGETED COMPLEXES AND THEIR USES IN THE TREATMENT OF MYOTONIC DYSTROPHY
WO2020028832A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
GB201812972D0 (en) 2018-08-09 2018-09-26 Univ Oxford Innovation Ltd Cell-penetrating peptides
GB201812980D0 (en) 2018-08-09 2018-09-26 Univ Oxford Innovation Ltd Cell-penetrating peptides
CA3110466A1 (en) 2018-08-22 2020-02-27 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant virus products and methods for inhibiting expression of dystrophia myotonica protein kinase and/or interfering with a trinucleotide repeat expansion in the 3' untranslated region of the dmpk gene
EP3884050A1 (en) * 2018-11-19 2021-09-29 uniQure IP B.V. Rnai induced reduction of ataxin-3 for the treatment of spinocerebellar ataxia type 3
CN113453723A (zh) 2018-12-07 2021-09-28 牛津大学科技创新有限公司 接头
IL319265A (en) 2018-12-21 2025-04-01 Avidity Biosciences Inc Anti-transferrin receptor antibodies and their uses
MY208565A (en) 2019-02-27 2025-05-15 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulators of malat1 expression
CR20210538A (es) 2019-03-29 2021-12-06 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y métodos para modular ube3a-ats
US11286485B2 (en) 2019-04-04 2022-03-29 Hoffmann-La Roche Inc. Oligonucleotides for modulating ATXN2 expression
CN111826432A (zh) * 2019-04-18 2020-10-27 南京大学 细胞去服务化状态的分子标记物检测及其调控方法
EP3959319A4 (en) 2019-04-25 2023-06-07 Avidity Biosciences, Inc. NUCLEIC ACID COMPOSITIONS AND METHODS FOR MULTI-EXON SKIPPING
JP7565620B2 (ja) * 2019-05-28 2024-10-11 株式会社モダリス Ｄｍｐｋ遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法
ES3048358T3 (en) * 2019-07-26 2025-12-10 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for modulating gfap
WO2021035128A1 (en) * 2019-08-21 2021-02-25 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Compositions and methods for treating chronic myelomonocytic leukemia
AU2020377204A1 (en) 2019-11-01 2022-06-02 Novartis Ag The use of a splicing modulator for a treatment slowing progression of huntington's disease
CN110876752B (zh) * 2019-11-18 2021-04-30 暨南大学 长链非编码rna nron功能基序在制备抑制骨吸收及防治骨质疏松药物中的应用
JP7446443B2 (ja) 2020-02-28 2024-03-08 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｓｍｎ２を調節するための化合物及び方法
IL296387B2 (en) 2020-03-19 2024-08-01 Avidity Biosciences Inc Preparations and methods for the treatment of facial, back and arm muscle atrophy
MX2022011880A (es) 2020-03-27 2022-10-20 Avidity Biosciences Inc Composiciones y metodos para tratar distrofia muscular.
IL297435A (en) 2020-05-01 2022-12-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for modulating atxn1
CN114075598B (zh) * 2020-08-12 2023-09-19 复旦大学附属华山医院 一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因ctg区域的pcr检测试剂盒及应用
IL304048A (en) 2020-12-31 2023-08-01 Dyne Therapeutics Inc Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
CN114790478B (zh) * 2021-01-26 2025-09-30 上海昂朴生物科技有限公司 一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因ctg区域的pcr检测试剂盒及应用
US20240189434A1 (en) * 2021-03-12 2024-06-13 Pepgen Inc. Methods of treating myotonic dystrophy type 1 using peptide-oligonucleotide conjugates
TW202304446A (zh) 2021-03-29 2023-02-01 瑞士商諾華公司 剪接調節子用於減慢杭丁頓氏舞蹈症進展的治療之用途
US11633498B2 (en) 2021-07-09 2023-04-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US11969475B2 (en) 2021-07-09 2024-04-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11833221B2 (en) 2021-09-01 2023-12-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for reducing DMPK expression
KR20240055874A (ko) 2021-09-16 2024-04-29 어비디티 바이오사이언시스 인크. 안면견갑상완 근이영양증을 치료하는 조성물 및 방법
CN118679257A (zh) * 2021-12-23 2024-09-20 马萨诸塞大学 用于脆性x相关病症的治疗性治疗
US12071621B2 (en) 2022-04-05 2024-08-27 Avidity Biosciences, Inc. Anti-transferrin receptor antibody-PMO conjugates for inducing DMD exon 44 skipping
AU2023254846A1 (en) 2022-04-15 2024-10-10 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy
WO2024063570A1 (ko) * 2022-09-23 2024-03-28 주식회사 셀리버리 근긴장성 이영양증 단백질 키나아제를 표적화하는 세포투과성 펩티드 융합 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도
CN116059370B (zh) * 2022-09-28 2025-03-28 南京医科大学 敲低或抑制长链非编码rna jpx的物质的医药用途

Family Cites Families (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2699808A (en) 1944-10-06 1955-01-18 Mark W Lowe Apparatus for peeling tomatoes
US2699805A (en) 1951-10-23 1955-01-18 Richter Albert Guiding attachment for hand planes
US2699508A (en) 1951-12-21 1955-01-11 Selectronics Inc Method of mounting and construction of mounting for low frequency piezoelectric crystals
US2699504A (en) 1952-06-28 1955-01-11 Itt Automatic tuning device
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
JP2828642B2 (ja) 1987-06-24 1998-11-25 ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン ヌクレオシド誘導体
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
WO1991004753A1 (en) 1989-10-02 1991-04-18 Cetus Corporation Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof
DE69034150T2 (de) 1989-10-24 2005-08-25 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad 2'-Modifizierte Oligonukleotide
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DK0455905T3 (da) 1990-05-11 1998-12-07 Microprobe Corp Dipsticks til nukleinsyrehybridiseringsassays og fremgangsmåde til kovalent immobilisering af oligonukleotider
JPH0874B2 (ja) 1990-07-27 1996-01-10 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 遺伝子発現を検出および変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
DE637965T1 (de) 1991-11-26 1995-12-14 Gilead Sciences Inc Gesteigerte bildung von triple- und doppelhelices aus oligomeren mit modifizierten pyrimidinen.
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5955265A (en) * 1992-02-06 1999-09-21 Massachusetts Institute Of Technology DNA sequence encoding the myotonic dystrophy gene and uses thereof
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
JPH08504559A (ja) 1992-12-14 1996-05-14 ハネウエル・インコーポレーテッド 個別に制御される冗長巻線を有するモータシステム
US5552282A (en) 1993-02-19 1996-09-03 Baylor College Of Medicine Diagnosis of myotonic muscular dystrophy
ES2107205T3 (es) 1993-03-30 1997-11-16 Sanofi Sa Analogos de nucleosidos aciclicos y secuencias oligonucleotidas que los contienen.
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
JP3345700B2 (ja) 1994-01-11 2002-11-18 株式会社リコー 電子写真用感光体
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5656408A (en) 1996-04-29 1997-08-12 Xerox Corporation Coated carrier particles
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
USRE44779E1 (en) 1997-03-07 2014-02-25 Santaris Pharma A/S Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogues
US6329501B1 (en) * 1997-05-29 2001-12-11 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to muscle
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
AU9063398A (en) 1997-09-12 1999-04-05 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6007992A (en) 1997-11-10 1999-12-28 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US6028183A (en) 1997-11-07 2000-02-22 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives and oligonucleotides containing same
US20030228597A1 (en) 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6107092A (en) * 1999-03-29 2000-08-22 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of SRA expression
AU776362B2 (en) 1999-05-04 2004-09-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S L-ribo-LNA analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
JP2003509030A (ja) 1999-09-17 2003-03-11 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド トランスフォーミング成長因子−β発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド調節
AU2698301A (en) 1999-12-30 2001-07-16 K.U. Leuven Research And Development Cyclohexene nucleic acids
WO2001077384A2 (de) 2000-04-07 2001-10-18 Epigenomics Ag DETEKTION VON SNPs UND CYTOSIN-METHYLIERUNGEN
WO2002001953A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Brown University Research Foundation Methods to screen for antibiotic agents and their use in treatment of opportunistic infections
CA2446810A1 (en) * 2001-05-07 2002-11-14 Hybridon, Inc. Epidermal growth factor receptorantisense oligonucleotides
US20030207804A1 (en) 2001-05-25 2003-11-06 Muthiah Manoharan Modified peptide nucleic acids
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
EP1499627A2 (en) 2001-07-03 2005-01-26 ISIS Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US7407943B2 (en) * 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
AU2002326589B2 (en) 2001-08-07 2008-06-05 University Of Delaware Compositions and methods for the prevention and treatment of Huntington's disease
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
JP2006500066A (ja) * 2002-09-25 2006-01-05 ファルマシア・コーポレーション ミクロソームのプロスタグランジンｅ２シンターゼ発現のアンチセンス調節
EP2957568B1 (en) 2002-11-05 2016-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
AU2003291753B2 (en) 2002-11-05 2010-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
EP2213738B1 (en) 2002-11-14 2012-10-10 Dharmacon, Inc. siRNA molecules targeting Bcl-2
US20050019746A1 (en) 2003-01-23 2005-01-27 Eirx Therapeutics Limited Apoptosis-related kinase/GPCRs
US7598227B2 (en) * 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US7589189B2 (en) 2003-05-14 2009-09-15 Japan Science And Technology Agency Inhibition of the expression of huntingtin gene
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
ATE555118T1 (de) 2003-08-28 2012-05-15 Takeshi Imanishi Neue synthetische nukleidsäuren vom typ mit quervernetzter n-o-bindung
JP5379347B2 (ja) 2003-09-18 2013-12-25 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ４’−チオヌクレオシドおよびオリゴマー化合物
US7208174B2 (en) 2003-12-18 2007-04-24 Hoffmann-La Roche Inc. Liposome compositions
AU2003300239A1 (en) 2003-12-29 2005-07-21 Galapagos Genomics N.V. Modulators of bone homeostasis identified in a high-throughput screen
US7374927B2 (en) * 2004-05-03 2008-05-20 Affymetrix, Inc. Methods of analysis of degraded nucleic acid samples
CA2566286A1 (en) 2004-05-11 2005-12-08 Rnai Co., Ltd. Polynucleotide causing rna interfere and method of regulating gene expression with the use of the same
EP1766052A4 (en) 2004-06-03 2009-12-16 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGOMERIC CHIMERIC COMPOSITIONS WITH BRECH
CA2569419A1 (en) 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
EP1799859B1 (en) * 2004-09-17 2014-07-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced antisense oligonucleotides
WO2006047842A2 (en) 2004-11-08 2006-05-11 K.U. Leuven Research And Development Modified nucleosides for rna interference
WO2007089611A2 (en) * 2006-01-26 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Compositions and their uses directed to huntingtin
EP1984381B1 (en) 2006-01-27 2010-09-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
US8178503B2 (en) * 2006-03-03 2012-05-15 International Business Machines Corporation Ribonucleic acid interference molecules and binding sites derived by analyzing intergenic and intronic regions of genomes
US7901882B2 (en) * 2006-03-31 2011-03-08 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation using nucleic acid arrays
US8158364B2 (en) * 2006-04-11 2012-04-17 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions involving nucleotide repeat disorders
ES2389737T3 (es) 2006-05-11 2012-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en 5'
CN101501193B (zh) * 2006-08-11 2013-07-03 普罗森那技术公司 用于治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病的方法和手段
DK2049664T3 (da) * 2006-08-11 2012-01-02 Prosensa Technologies Bv Enkeltstrengede oligonukleotider, som er komplementære til repetitive elementer, til behandling af med DNA-repetitiv-ustabilitet associerede lidelser
WO2008036406A2 (en) 2006-09-21 2008-03-27 University Of Rochester Compositions and methods related to protein displacement therapy for myotonic distrophy
EP2410053B2 (en) * 2006-10-18 2020-07-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds
BRPI0720689A2 (pt) * 2006-12-20 2014-02-25 Novarx Vacina de célula tumoral universal para utilização profilática e terapêutica anticâncer
EP2125852B1 (en) 2007-02-15 2016-04-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted-2'-f modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US8278425B2 (en) 2007-05-30 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
WO2009005793A2 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Avi Biopharma, Inc. Tissue specific peptide conjugates and methods
US20100016215A1 (en) * 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
US8278283B2 (en) 2007-07-05 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted or unsaturated bicyclic nucleic acid analogs
US9434997B2 (en) * 2007-08-24 2016-09-06 Lawrence Livermore National Security, Llc Methods, compounds and systems for detecting a microorganism in a sample
US7973019B1 (en) 2007-10-03 2011-07-05 Alcon Research, Ltd. Transferrin/transferrin receptor-mediated siRNA delivery
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
EP2240768A1 (en) * 2008-02-04 2010-10-20 Galapagos N.V. Target sequences and methods to identify the same, useful in treatment of neurodegenerative diseases
JP2011510678A (ja) * 2008-02-08 2011-04-07 プロセンサ ホールディング ビーブイ Ｄｎａ反復不安定性関連遺伝性障害を治療するための方法及び手段
EP2317847B1 (en) * 2008-07-29 2019-04-17 The Board of Regents of The University of Texas System Selective inhibition of polyglutamine protein expression
GB0816778D0 (en) 2008-09-12 2008-10-22 Isis Innovation Gene silencing
WO2010036698A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
EP2361256B1 (en) 2008-09-24 2013-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cyclohexenyl nucleic acid analogs
AT507215B1 (de) 2009-01-14 2010-03-15 Boehler Edelstahl Gmbh & Co Kg Verschleissbeständiger werkstoff
US8623107B2 (en) 2009-02-17 2014-01-07 Mcalister Technologies, Llc Gas hydrate conversion system for harvesting hydrocarbon hydrate deposits
PL2417257T3 (pl) * 2009-04-10 2016-11-30 Antysensowne oligonukleotydy tricyklo-dna, kompozycje i sposoby leczenia choroby
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
US9574191B2 (en) 2010-02-03 2017-02-21 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Selective inhibition of polyglutamine protein expression
JP2013518603A (ja) 2010-02-08 2013-05-23 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 反復伸張に関連する疾患または病態の治療に有用な方法および組成物
EP2547768B1 (en) 2010-03-17 2015-12-30 Association Institut de Myologie Modified u7 snrnas for treatment of neuromuscular diseases
AU2011282217B2 (en) * 2010-07-19 2015-12-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) expression
KR20160074368A (ko) 2012-05-16 2016-06-28 라나 테라퓨틱스, 인크. Utrn 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
JP2016522674A (ja) 2012-05-16 2016-08-04 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド 遺伝子発現を調節するための組成物及び方法
US9984408B1 (en) 2012-05-30 2018-05-29 Amazon Technologies, Inc. Method, medium, and system for live video cooperative shopping
DK2951191T3 (en) 2013-01-31 2019-01-14 Ionis Pharmaceuticals Inc PROCEDURE FOR MANUFACTURING OLIGOMERIC COMPOUNDS USING MODIFIED CLUTCH PROTOCOLS
TW201536329A (zh) 2013-08-09 2015-10-01 Isis Pharmaceuticals Inc 用於調節失養性肌強直蛋白質激酶(dmpk)表現之化合物及方法
US20210052631A1 (en) 2015-09-25 2021-02-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
US9778708B1 (en) 2016-07-18 2017-10-03 Lenovo Enterprise Solutions (Singapore) Pte. Ltd. Dual sided latching retainer for computer modules
EP4396351A4 (en) 2021-09-01 2025-12-24 Ionis Pharmaceuticals Inc COMPOUNDS AND METHODS FOR REDUCING DMPK EXPRESSION
US11833221B2 (en) 2021-09-01 2023-12-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for reducing DMPK expression

Also Published As

Publication number Publication date
AU2011282243A2 (en) 2013-10-10
AU2016269447B2 (en) 2018-12-13
JP2018150344A (ja) 2018-09-27
EP2595663A4 (en) 2014-03-05
EP2595664A4 (en) 2014-09-17
AU2011282217A1 (en) 2013-02-21
US20180163209A1 (en) 2018-06-14
US20130237585A1 (en) 2013-09-12
WO2012012467A2 (en) 2012-01-26
JP2020183379A (ja) 2020-11-12
US10526604B2 (en) 2020-01-07
AU2020202315A1 (en) 2020-04-23
US12480126B2 (en) 2025-11-25
US20180127758A1 (en) 2018-05-10
US20130225659A1 (en) 2013-08-29
KR101900770B1 (ko) 2018-09-20
PL3031920T3 (pl) 2020-01-31
EP3633038A3 (en) 2020-07-29
CN106434648A (zh) 2017-02-22
CA2805765A1 (en) 2012-01-26
CA2805791A1 (en) 2012-01-26
JP6698740B2 (ja) 2020-05-27
IL223962B (en) 2018-03-29
WO2012012467A3 (en) 2012-04-26
JP6343308B2 (ja) 2018-06-13
US20160068845A1 (en) 2016-03-10
WO2012012443A2 (en) 2012-01-26
AU2018200825A1 (en) 2018-02-22
IL257936A (en) 2018-05-31
KR20130106811A (ko) 2013-09-30
EP3489360A2 (en) 2019-05-29
AU2011282217A9 (en) 2015-12-03
HRP20191753T1 (hr) 2019-12-27
JP2013538561A (ja) 2013-10-17
AU2011282243B2 (en) 2016-09-22
WO2012012443A3 (en) 2013-05-23
EP2595664A2 (en) 2013-05-29
EP3633038A2 (en) 2020-04-08
AU2016269447A1 (en) 2017-01-05
US20200362353A1 (en) 2020-11-19
AU2016201288A1 (en) 2016-03-31
CN103167883A (zh) 2013-06-19
EP3489360A3 (en) 2019-08-28
JP5981428B2 (ja) 2016-08-31
EP3031920A1 (en) 2016-06-15
JP2017014235A (ja) 2017-01-19
EP2595664B1 (en) 2018-10-17
US9765338B2 (en) 2017-09-19
KR20180105730A (ko) 2018-09-28
EP2595663A2 (en) 2013-05-29
DK3031920T3 (da) 2019-10-14
CN103167883B (zh) 2016-08-03
AU2011282243A1 (en) 2013-02-21
AU2016269447C1 (en) 2019-06-20
JP2013538560A (ja) 2013-10-17
US20230174987A1 (en) 2023-06-08
ES2756326T3 (es) 2020-04-27
EP3031920B1 (en) 2019-08-21
AU2011282217B2 (en) 2015-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6059141B2 (ja) 核内繋留ｒｎａの調節
US11981897B2 (en) Compounds and methods for modulation of dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) expression
JP7422816B2 (ja) Ｐｎｐｌａ３発現のモジュレーター
EP3950006A1 (en) Compound, method and pharmaceutical composition for dux4 expression adjustment
HK40065731A (en) Compound, method and pharmaceutical composition for dux4 expression adjustment

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140502

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140717

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20140717

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150727

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20151027

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160127

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20160623

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20161020

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20161027

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20161124

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20161208

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6059141

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250