JP6049493B2 - 抗リン脂質抗体を有する試料を見出すためのスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、凝固診断法の分野の発明であって、抗リン脂質抗体を含有する試料を見出すためのスクリーニング方法に関する。

抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）は、最も一般的な自己免疫障害の一つであり、血栓症、反復性流産及び妊娠合併症を引き起こす。抗リン脂質症候群は、陰イオン性リン脂質に、タンパク質に又はタンパク質／リン脂質複合体に結合する「抗リン脂質抗体」（ＡＰＡ）によって引き起こされる。特定のタンパク質及びリン脂質と複合体を形成する抗リン脂質抗体は、多様な抗原、例えば、アポリポタンパク質β２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）、カルジオリピン、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、アネキシンＶ、トロンボモジュリン、ファクターＸＩＩ等、に対して、そして、これらのタンパク質とリン脂質との複合体に対して作用し得る、極めて雑多な自己抗体群である。

「ループス抗凝固物質」は、その名が示すとおり、特定の凝固アッセイ、例えばａＰＴＴ、の凝固時間を長引かせる抗リン脂質抗体である。逆説的に、ループス抗凝固物質は、インビトロでの凝固反応を阻害し、一方で、インビボでは、凝固反応の増大（凝固性亢進）が抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）を引き起こす。しかしながら、これらのアッセイの適用外であるにも拘わらず血栓形成促進作用を有する抗リン脂質抗体も存在する。

抗リン脂質抗体が、インビボで、その血栓形成促進作用を発現する有様は、決定的に明らかにはされていない。その作用の１つのメカニズムは、血小板の活性化に関連していると思われる（非特許文献１）。

実験室内での抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）の診断は、抗リン脂質抗体の不均一性によって妨げられている。抗体の直接検出のためには免疫学的方法が適用される。しかしながら、この方法では、インビボで血栓形成促進作用を持たない多くの抗体もが捕捉されてしまう。抗体の間接的検出には、凝固アッセイが適用される。ＤＲＶＶＴ（Dilute Russell' s Viper Venom Time：希釈ラッセル蛇毒時間法）に基づくアッセイ法は、特に、抗リン脂質抗体の血栓形成促進効力と比較的良好な相関を示す。ループス診断法は、各患者の試料を複数の試験工程に供さなければないため、非常に複雑である（概説として、非特許文献２参照）。

従って、血栓形成促進作用を有する抗リン脂質抗体を含む可能性の高い試料を特定できるようにするスクリーニングアッセイを利用可能にすることが望まれている。これにより、第一の指標としてのスクリーニングアッセイによって、血栓形成促進性の抗リン脂質抗体を含むことが示された試料のみを、前述の複雑で特異的な検出法を用いて試験すればよい、という利点が得られる。

アーバナス（Urbanus,R.T.）ら，「血小板と抗リン脂質症候群（Platelets and the antiphospholipid syndrome）」，ループス（Ｌｕｐｕｓ），２００８年１０月，１７（１０），ｐ８８８−９４ デブリース（Devreese, K）及びホイラーツ（Hoy1aerts, M.F.），「抗リン脂質症候群の診断における課題（Challenges in the diagnosis of the antiphospholipid syndrome）」，クリニカルケミストリー（Clinical Chemistry）, ２０１０年，５６（６），ｐ９３０−９４０

従って、本発明の目的は、血栓形成促進性の抗リン脂質抗体を含む可能性の高い試料を特定できるようにする方法を提供することである。

この目的は、
ａ）患者からの試料を血小板含有試薬と混合してアッセイ混合物を得るステップ、
ｂ）血小板活性化剤を前記アッセイ混合物に添加するステップ、及び
ｃ）前記アッセイ混合物中の血小板凝集を測定するステップ
を有する方法によって達成される。

図１は、明らかに健康なドナーからの試料、正常血漿プール試料及び抗リン脂質症候群の患者５名からの試料における、エピネフリン誘発性の血小板凝集速度（ｍＥ／ｓ）を、ＬＡ１／ＬＡ２比の関数として示す図である。 図２は、明らかに健康なドナーからの試料及び抗リン脂質症候群の患者５名からの試料におけるエピネフリン誘発性の血小板凝集速度と正常血漿プール試料におけるエピネフリン誘発性血小板凝集速度との比率（患者／正常血漿比）を、ＬＡ１／ＬＡ２比の関数として示す図である。 図３は、明らかに健康なドナーからの試料及び抗リン脂質症候群の患者５名からの試料におけるＡＤＰ誘発性の血小板凝集速度と正常血漿プール試料におけるＡＤＰ誘発性血小板凝集速度との比率（患者／正常血漿比）を、ＬＡ１／ＬＡ２比の関数として示示す図である。 図４は、試料（ループス血漿プール、細かい斜線）の抗リン脂質抗体が、抗リン脂質抗体を含まない試料（正常血漿プール、粗い斜線）と比較して、血小板機能分析システムにおける閉鎖時間を短縮させたことを示す図である。

アッセイ混合物における血小板凝集の正常値を上回る増加は、患者の試料中に血栓形成促進性の抗リン脂質抗体が存在していることを示す。

患者の試料と血小板含有試薬との混合物中では、前記患者の試料中に存在する血栓形成促進性抗リン脂質抗体が、血小板の凝集を促進することが分かった。血小板凝集を刺激する他の因子、例えばトロンビン濃度の上昇など、も、また、血小板凝集の促進をもたらすことがあるため、このアッセイは、血栓形成促進性抗リン脂質抗体に特異的なものではない。それでも、本アッセイにおいて血小板の凝集を促進しない試料を排除でき、この後に行なう抗リン脂質抗体を特異的に判定するためのアッセイでは、それらは試験する必要がない。

用語「血栓形成促進性の抗リン脂質抗体」とは、インビトロで血漿試料の凝固時間を延長させる抗リン脂質抗体を指す。延長された凝固時間は、例えば、ＤＲＶＶＴに基づく凝固アッセイを用いて決定し得る。しかしながら、こうした「ループス抗凝固物質」アッセイは、感度が不十分であり、そのため、検知されない血栓形成促進性抗リン脂質抗体もある。本発明の方法は、インビトロにおける血栓形成促進作用の測定をも含むため、より感度が高くなる可能性が高い。インビトロでは、抗凝固作用ではなくて、実際の血小板凝集促進作用が測定される。

用語「患者の試料」は、主に、体液、特に多血小板血漿、乏血小板血漿、血清及び全血、を含む。

用語「血小板含有試薬」は、ヒト由来の、機能性の、即ち、凝集可能な血小板（栓球）を含有する懸濁液を含む。それは、例えば、単離された血小板の緩衝溶液中懸濁液であってもよい。用語「懸濁液」は、凍結乾燥された血小板の再懸濁液を意味することもある。或いは、ドナーからの多血小板血漿若しくは全血又は複数のドナーからの血漿プールであってもよい。

用語「血小板活性化剤」は、血小板凝集を誘発し得る物質を意味する。血小板活性化剤の好適な例は、ＡＤＰ（アデノシン５’−二リン酸）、コラーゲン、エピネフリン、アラキドン酸、リストセチン及びトロンビンである。また、血小板活性化剤の組み合わせ、例えば、コラーゲンとＡＤＰとの組み合わせ（Ｃｏｌ／ＡＤＰ）又はコラーゲンとエピネフリンとの組み合わせ（Ｃｏｌ／Ｅｐｉ）、をアッセイ混合物に加えることも可能である。

アッセイ混合物中のエピネフリンの好ましい濃度は、１〜２０μｍｏｌ／Ｌである。アッセイ混合物中のＡＤＰの好ましい濃度は、０．２〜３０μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．２〜１０μｍｏｌ／Ｌである。

アッセイ混合物中での血小板凝集は、患者の試料中に存在する抗リン脂質抗体の血小板凝集刺激作用と相関性を示し、散乱光の強度を測定すること（比濁分析法）により又はアッセイ混合物の濁度を測定すること（濁度測定法）により、定量的に決定することができる。

アッセイ混合物中の血小板凝集速度を測定することが好ましい。アッセイ混合物に血小板活性化剤を添加した後、１２〜５０秒の間の血小板凝集速度を測定することが特に有効であることが分かっている。或いは、血小板凝集の最大速度を決定してもよい。

本発明の方法の他の態様では、血小板凝集は、流動条件下で、従って、高せん断力の存在下で、測定される。このようなアッセイの原理は、例えば、血小板機能分析システム（Platelet Function Analyzer System）（ＰＦＡ−１００（登録商標）、ＰＦＡ−２００、シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス プロダクツ社（Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH）、ドイツ、マルブルク（Marburg））において、実行される。この測定法は、患者の試料及び／又は血小板含有試薬が全血からなる場合に、特に好適である。

比較的小さな動脈血管中に見られるような流動条件及びせん断力をシミュレートするために、特殊な測定セル中に約−４０ミリバールの負圧を生成し、試料リザーバ中に入れられたクエン酸全血を、直径約１００〜２００μｍの毛細管に、流す。毛細管は、中央毛細開口（開孔）を備えた分離要素、例えば膜、によって仕切られた測定チャンバに導かれ、血液は、この開口（開孔）を負圧によって通過する。大抵の場合、膜には、少なくとも開孔周辺の領域において、血小板凝集を誘発する１つ以上の活性化剤が設けられ、その結果、通流した血液が開孔の領域で凝集誘発物質と接触する。血小板の誘発された接着及び凝固に因り、その開孔領域で血小板の塊（血栓）が形成され、これが膜開口を閉鎖して血液の流れを停止させる。このシステムでは、通常、膜開口が閉鎖されるまでに要する時間が測定される。この「閉鎖時間」（ＣＴ）は、血小板の機能性と相関する。例えば、国際公開第ＷＯ９７／３４６９８号パンフレットは、閉鎖時間に基づいて血小板機能を決定する方法で使用するための測定セルについて記述している。好ましい測定セルは、コラーゲン（Ｃｏｌ）と更にＡＤＰかエピネフリン（Ｅｐｉ）のどちらかとにより被覆された、又はＡＤＰとプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）とで被覆された膜を、備えている。種々の分離要素並びにその製法及び使用が、例えば欧州特許第７１６７４４Ｂ１号又は欧州特許第１８５０１３４Ａ１号に、記載されている。

本発明の方法の好ましい態様では、血小板活性の測定は、このように、血小板含有試薬と混合された試料を、毛細管に、次いで分離要素の開口に、通すステップと、血小板の塊が分離要素の開口に形成されて開口が閉鎖されるまでに要する時間を測定するステップとを含む。

血栓形成促進性の抗リン脂質抗体が試料中に存在する場合、好ましくは全血からなる、血小板含有試薬に試料を加えると、血栓形成促進性抗リン脂質抗体を含んでいない正常な試料を加えた場合と比較して、閉鎖時間が短くなる（図４）。

更に、患者試料の試験結果の正常試料の試験結果（標準）に対する比率（商）を決定することが好ましい。正常試料は、健康なドナーからの試料又は複数の健康なドナー由来の試料プールからの試料であってよい。この目的のために、第２のアッセイでは、リン脂質抗体を含まない正常な試料を血小板含有試薬と混合してアッセイ混合物を得て、正常な血小板凝集を測定し、試験結果の比率を求める。正常な血小板凝集に対する患者の試料のアッセイ混合物において測定された血小板凝集の比率が１．０よりも大きい場合は、患者の試料中に抗リン脂質抗体が存在することを示している。

（実施例１）
〔患者の血漿における抗リン脂質抗体の血小板凝集刺激作用の測定〕
患者の血漿としては、５人の抗リン脂質症候群の患者からの試料、明らかに健康なドナーからの試料及び正常血漿プール（対照用血漿Ｎ、シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス プロダクツ社（Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH）、ドイツ、マルブルク（Marburg））を使用した。

血小板含有試薬としては、明らかに健康な血液ドナーからの新鮮血から遠心分離（１８０ｇ、１０分）により調製された、ヒト多血小板血漿（ＰＲＰ試薬）を使用した。４人の異なるドナーからの血液により４種の血小板含有試薬（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を調製した。

ＰＲＰ試薬１３５μＬを患者の血漿４０μＬと混合して、３７℃でインキュベートした。５分後、エピネフリン溶液（１００μｍｏｌ／Ｌ エピネフリン）１５μＬ又はＡＤＰ溶液（１２μｍｏｌ／Ｌ ＡＤＰ）１５μＬを添加して血小板を活性化し、アッセイ混合物の６２０ｎｍにおける吸光度を濁度測定法により測定した。血小板活性化剤の添加後１２〜５０秒の期間の吸光度の変化（ｍE／秒）を決定し、血小板凝集の尺度とした。

全ての試料について、並行して、ループス抗凝固物質検出用ＤＲＶＶＴ凝固アッセイに基づく市販のアッセイ（スクリーニング試薬ＬＡ１／確認試薬ＬＡ２、シーメンス ヘルスケア ダイアグノティクス プロダクツ社（Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH））を用いて、試験した。健康なドナーの「ＬＡ１／ＬＡ２比」は、１に近い。ＬＡ１／ＬＡ２比が１よりも著しく大きいことは、抗リン脂質症候群を発症していることを非常に強く示唆する。発症の重篤度は、ＬＡ１／ＬＡ２比のレベルと相関がある。

ここで血小板含有試薬として使用された異なるドナーからの多血小板血漿の凝集速度は、比較的高い程度で変動する恐れがあるので、患者血漿／正常血漿プールの商（割合）を求めることにより、患者の試料の結果を規格化した（図２及び３）。抗リン脂質症候群のドナーからの試料の規格化された商（割合）は、正常ドナーのそれ（１に近い）よりも顕著に高い（表１）。

結果を、図１〜３に示す。

図１は、明らかに健康なドナーからの試料、正常血漿プール試料及び抗リン脂質症候群の患者５名からの試料におけるエピネフリン誘発性の血小板凝集速度（ｍＥ／ｓ）を、ＬＡ１／ＬＡ２比の関数として示している。２つの異なる血小板含有試薬：ＰＲＰ試薬Ａ（○）及びＰＲＰ試薬Ｂ（■）を、使用した。抗リン脂質症候群の患者からの試料（ＬＡ１／ＬＡ２が１より大きい）は、正常試料（ＬＡ１／ＬＡ２＝１）を上回る血小板凝集の促進を示している。

図２は、明らかに健康なドナーからの試料及び抗リン脂質症候群の患者５名からの試料におけるエピネフリン誘発性の血小板凝集速度と正常血漿プール試料におけるエピネフリン誘発性血小板凝集速度との比率（患者／正常血漿比）を、ＬＡ１／ＬＡ２比の関数として示している。２つの異なる血小板含有試薬：ＰＲＰ試薬Ａ（●）及びＰＲＰ試薬Ｂ（□）を使用した。抗リン脂質症候群の患者からの試料（ＬＡ１／ＬＡ２が１より大きい）は、正常試料（ＬＡ１／ＬＡ２＝１）を上回る患者／正常血漿比の増加を示している。

図３は、明らかに健康なドナーからの試料及び抗リン脂質症候群の患者５名からの試料におけるＡＤＰ誘発性の血小板凝集速度と正常血漿プール試料におけるＡＤＰ誘発性血小板凝集速度との比率（患者／正常血漿比）を、ＬＡ１／ＬＡ２比の関数として示している。２つの異なる血小板含有試薬：ＰＲＰ試薬Ｃ（○）及びＰＲＰ試薬Ｄ（■）を使用した。抗リン脂質症候群の患者からの試料（ＬＡ１／ＬＡ２が１より大きい）は、正常試料（ＬＡ１／ＬＡ２＝１）を上回る患者／正常血漿比の増加を示している。

（実施例２）
〔血小板機能分析装置を用いた、患者の血漿中の抗リン脂質抗体の閉鎖時間短縮作用の測定〕
血小板機能分析システム（ＰＦＡ−１００（登録商標）、ＰＦＡ−２００、シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス プロダクツ社（Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH））を共通して使用して、流動条件下で、従って高せん断力の存在下で、全血試料における一次止血を測定した。このシステムは、特殊な測定セル中の膜開口が閉鎖されるまでに要する時間（閉鎖時間）を測定して、血小板機能の尺度とする。閉鎖時間の延長は、凝集能を減少させるという意味での、血小板機能障害の存在を示す。閉鎖時間の短縮は、凝集能を増大させるという意味での、血小板機能障害の存在を示す。

患者の血漿としては、抗リン脂質症候群の患者からの複数の血漿の血漿プール（ループス血漿プール、ＬＡ１／ＬＡ２比が２．５３）及び正常血漿プール（対照用血漿Ｎ、シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス プロダクツ社（Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH））を使用した。

血小板含有試薬としては、明らかに健康な血液ドナーからの新鮮な全血を使用した。４人の異なるドナーからの全血により４種の血小板含有試薬（１、２、３、４）を調製した。

新鮮な全血からなる血小板含有試薬を１０％（ｖ／ｖ）の患者の血漿と混合して１０分間インキュベートした。次いで、コラーゲン（Ｃｏｌ）及びＡＤＰ（Ｃｏｌ／ＡＤＰ）でコーティングした膜を備えたＰＦＡ測定セル中に、このアッセイ混合物をピペット分取し、血小板機能分析装置中で閉鎖時間（秒）を測定した。

抗リン脂質症候群の患者からの複数の血漿の血漿プール（ループス血漿プール）は、正常血漿プールと比較して短縮された閉鎖時間を示した（図４参照）。

図４は、試料（ループス血漿プール、細かい斜線）中の抗リン脂質抗体が、抗リン脂質抗体を含まない試料（正常血漿プール、粗い斜線）と比較して、血小板機能分析システムにおける閉鎖時間を短縮させたことを示している。異なる健康なドナーからの新鮮な全血の４つの異なる血小板含有試薬（１〜４）を使用した。

Claims (10)

1. 血栓形成促進性の抗リン脂質抗体を含有する可能性の高い試料を特定するためのスクリーニング方法であって、
   ａ）患者からの試料を血小板含有試薬と混合してアッセイ混合物を得るステップ、
   ｂ）前記アッセイ混合物に血小板活性化剤を添加するステップ、及び
   ｃ）前記アッセイ混合物における血小板凝集を測定するステップ
   を含み、
   前記アッセイ混合物における、正常値を上回る血小板凝集の増加が、患者の試料中に血栓形成促進性の抗リン脂質抗体が存在することを示す、スクリーニング方法。
2. 前記患者の試料が、多血小板血漿、乏血小板血漿、血清又は全血からなる、請求項１に記載の方法。
3. 前記血小板含有試薬が、単離された血小板の緩衝溶液中懸濁液、多血小板血漿又は全血からなる、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
4. ＡＤＰ、コラーゲン、エピネフリン、アラキドン酸及びトロンビンからなる群から選択される血小板活性化剤を前記アッセイ混合物に添加する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記アッセイ混合物における血小板凝集が濁度測定法によって測定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記アッセイ混合物における血小板凝集が比濁分析法によって測定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記アッセイ混合物における血小板凝集が、
   ｉ）前記アッセイ混合物を、毛細管に、次いで、分離要素の開口に通すステップ、及び
   ｉｉ）前記分離要素の前記開口において血小板の塊が形成されて前記開口が閉鎖されるまでに要する時間を測定するステップ
   によって測定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記アッセイ混合物における血小板凝集速度が、前記アッセイ混合物に血小板活性化剤を添加した後、１２秒から５０秒までの間に測定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
9. 血小板凝集の最大速度を測定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
10. 正常試料を前記血小板含有試薬と混合してアッセイ混合物を得る第２のアッセイにおいて正常な血小板凝集を測定し、次いで、ステップｃ）で測定された前記アッセイ混合物における前記血小板凝集の前記正常な血小板凝集に対する比率を求め、１．０を超える比率は、患者の試料中に抗リン脂質抗体が存在することを示す、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

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