JP5995803B2 - カテコール−ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤 - Google Patents
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Description
本開示は、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤に関する。
カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（catechol-O-methyltransferase、以下、「ＣＯＭＴ」ともいう）は、カテコールアミン類を分解する酵素の一つであり、ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリンやカテコール骨格を有するフラボノイド等を分解する（非特許文献１）。
それによりこの酵素は神経伝達にかかるさまざまな生体反応を調整する。精神疾患、人格特性、統合失調症、ＡＤＨＤ（注意欠陥多動性障害）、痛がりとの関連等が示唆されている。とりわけパーキンソン病においては、治療薬であるレボド−パの代謝を行い、この酵素を阻害することは薬効の上昇につながることから、ＣＯＭＴ阻害剤はレボド−パ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）等との併用薬としてパーキンソン病治療に使用されている（非特許文献２）。
それによりこの酵素は神経伝達にかかるさまざまな生体反応を調整する。精神疾患、人格特性、統合失調症、ＡＤＨＤ（注意欠陥多動性障害）、痛がりとの関連等が示唆されている。とりわけパーキンソン病においては、治療薬であるレボド−パの代謝を行い、この酵素を阻害することは薬効の上昇につながることから、ＣＯＭＴ阻害剤はレボド−パ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）等との併用薬としてパーキンソン病治療に使用されている（非特許文献２）。
ＣＯＭＴ阻害剤については、１９５８年にAxelrodらにより酵素が発見されて以来、数多く報告され、植物由来天然物（非特許文献３）や生薬由来（特許文献１）の成分が知られ、阻害効果の強弱を検討している。最初に発見開発されたものはピロガロールやカテコール骨格を有する誘導体等、或いはフラボノイド由来、アスコルビン酸、トロポロン等であった。多くのＣＯＭＴ阻害剤はＣＯＭＴの酵素触媒部位に結合し、作用する合成化合物である。
１９８０年代になり、カテコール基のオルト位にニトロ基等を持つものが開発され、これらの中には、トルカポン（非特許文献４）やエンタカポン（非特許文献５）が含まれ医薬品となっている。ＣＯＭＴ阻害剤のほとんどが低分子のものであり高分子タンパク質は利用されておらず、抗体等を除きほとんど知られていない（非特許文献６）。
また、ＣＯＭＴ阻害剤の中には肝障害等の重篤な副作用を持つものもあり（非特許文献７）、新規物質の開発には細胞毒性は注視されている（特許文献２）。
１９８０年代になり、カテコール基のオルト位にニトロ基等を持つものが開発され、これらの中には、トルカポン（非特許文献４）やエンタカポン（非特許文献５）が含まれ医薬品となっている。ＣＯＭＴ阻害剤のほとんどが低分子のものであり高分子タンパク質は利用されておらず、抗体等を除きほとんど知られていない（非特許文献６）。
また、ＣＯＭＴ阻害剤の中には肝障害等の重篤な副作用を持つものもあり（非特許文献７）、新規物質の開発には細胞毒性は注視されている（特許文献２）。
Mannisto PT. ら， 「Pharmacological Reviews」, 1999年, p.593-628
永山寛，「Clinical Neuroscience」, 2011年, 29巻, 5号, p.568−569
Guldberg HC．ら， 「Pharmacological Reviews」，1975年， 27巻，p．135-206
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Benabou R．ら, 「Expert Opin. Drug Saf.」, 2003年, 2巻, 3号, p．263-267
このように、副作用が少ないＣＯＭＴ阻害可能な物質が求められている。そこで、本開示は、安全性の高い優れたＣＯＭＴ阻害剤を提供するものである。
本発明者らは、鋭意研究の結果、ラクトフェリン類がＣＯＭＴと結合することで、その活性を阻害することを見出した。
前記ラクトフェリン類は、従来の化学合成されたＣＯＭＴ阻害用の人工物、生薬のような天然物とは異なる構造を有している。一般的に、構造上異なる物質で作用機序の異なる物質は、既存化学物質と同時に使用できる可能性；既存の物質が使用できない状況下での使用等の置き換えができる可能性を持つと考えられる。このようなことから、本開示のラクトフェリン類と他の薬剤とを併用した場合の相乗効果も本開示のラクトフェリン類は期待できる。
さらにラクトフェリンは生体内に由来するタンパク質であるので、この分解物等も食品として摂取可能であり、また安全性の高いタンパク質である。また、ラクトフェリンはこれまで知られているＣＯＭＴ阻害剤とは異なる生体内物質でもある。このようなことから、本開示のラクトフェリン類も安全に摂取することができると考えられる。
さらにラクトフェリンは生体内に由来するタンパク質であるので、この分解物等も食品として摂取可能であり、また安全性の高いタンパク質である。また、ラクトフェリンはこれまで知られているＣＯＭＴ阻害剤とは異なる生体内物質でもある。このようなことから、本開示のラクトフェリン類も安全に摂取することができると考えられる。
また、ラクトフェリンを処理することで、ＣＯＭＴ阻害作用が向上することも明らかにした。このことは、ラクトフェリンが分解や変性等の各種処理を受けてもその効能が低減することがなく、むしろ向上する。このため、工業的に生産される幅広い製品に使用することが可能である。例えば、工業的に生産される飲食品の場合、酸・アルカリ処理や熱処理等を行うことや長期間保存による成分変化が多いが、原料にラクトフェリン類を入れて加工処理することやラクトフェリン類を入れて液状又は固形状として長期間保存すること等が可能と考える。このように、工業的な製造分野においてＣＯＭＴ阻害のためのラクトフェリン類は有益に利用できると考える。
また、医薬等では、例えば酸・アルカリや常温で効能が経時的にて減少することが問題となることが多いが、本開示のラクトフェリン類であれば効能が低下する可能性は低く、また適宜ラクトフェリンを処理することでより所望の効能を安定的に維持できると考える。このように、安定的な効能を期待する分野においてＣＯＭＴ阻害のためのラクトフェリン類は有益に利用できると考える。
このようにして、本発明者らは、本技術を完成するに至った。
また、医薬等では、例えば酸・アルカリや常温で効能が経時的にて減少することが問題となることが多いが、本開示のラクトフェリン類であれば効能が低下する可能性は低く、また適宜ラクトフェリンを処理することでより所望の効能を安定的に維持できると考える。このように、安定的な効能を期待する分野においてＣＯＭＴ阻害のためのラクトフェリン類は有益に利用できると考える。
このようにして、本発明者らは、本技術を完成するに至った。
本開示は、ラクトフェリンを８０〜１２５℃で１分以上熱処理してラクトフェリンの熱処理物を得る工程、ラクトフェリン含有溶液をｐＨ５以下で５分〜１時間放置又は撹拌し、て酸処理してラクトフェリンの酸処理物を得る工程、ラクトフェリン含有溶液をｐＨ９以上で５分〜１時間放置又は撹拌し、アルカリ処理してラクトフェリンのアルカリ処理物を得る工程、ラクトフェリンをトリプシンで加水分解処理してラクトフェリンの加水分解処理物を得る工程、並びに、ラクトフェリンを前記熱処理、前記酸処理、前記アルカリ処理及び前記加水分解処理を２種以上組み合わせて処理してラトフェリンの処理物を得る工程、を含むカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の製造方法を提供するものである（ただし、前記ラクトフェリンの熱処理物を有効成分とするカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤は、飲食品の態様を除く）。
また、本開示は、ラクトフェリンＮ−ｌｏｂｅ部分に属し、Ｎ末端がアラニン−プロリン−アルギニン−リジン−アスパラギンであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が３０〜４０ｋＤａのペプチドを有効成分とするＣＯＭＴ阻害剤を提供するものである。
さらに、本開示は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするＣＯＭＴ阻害剤を提供するものである。
また、本開示は、ラクトフェリンＮ−ｌｏｂｅ部分に属し、Ｎ末端がアラニン−プロリン−アルギニン−リジン−アスパラギンであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が３０〜４０ｋＤａのペプチドを有効成分とするＣＯＭＴ阻害剤を提供するものである。
さらに、本開示は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするＣＯＭＴ阻害剤を提供するものである。
本開示によれば、安全性の高い優れたＣＯＭＴ阻害剤を提供することができる。
本開示の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本開示は以下の好ましい実施形態に限定されず、本開示の範囲内で自由に変更することができるものである。
本開示のラクトフェリン類とは、ラクトフェリン、ラクトフェリンの熱処理物、ラクトフェリンの酸処理物、ラクトフェリンのアルカリ処理物、ラクトフェリン加水分解物、並びに、熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理を２種以上組み合わせて処理されたラクトフェリンの処理物から選ばれる１種又は２種以上のものである。
また、本開示のラクトフェリン類には、前記加水分解物が、ラクトフェリンＮ−ｌｏｂｅ部分に属し、Ｎ末端がアラニン−プロリン−アルギニン−リジン−アスパラギンであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が３０〜４０ｋＤａのペプチドのものも含まれる。
また、本開示のラクトフェリン類には、配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、当該ペプチドを含んでなるペプチド、当該ペプチドを含んでなるタンパク質から選ばれる１種又は２種以上のものも含まれる。なお、これらペプチド又はタンパク質は、ＣＯＭＴ阻害活性を有する範囲において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したものであってもよい。
また、本開示のラクトフェリン類には、前記加水分解物が、ラクトフェリンＮ−ｌｏｂｅ部分に属し、Ｎ末端がアラニン−プロリン−アルギニン−リジン−アスパラギンであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が３０〜４０ｋＤａのペプチドのものも含まれる。
また、本開示のラクトフェリン類には、配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、当該ペプチドを含んでなるペプチド、当該ペプチドを含んでなるタンパク質から選ばれる１種又は２種以上のものも含まれる。なお、これらペプチド又はタンパク質は、ＣＯＭＴ阻害活性を有する範囲において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したものであってもよい。
上記ラクトフェリンは、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等を乳原料とし、例えばイオン交換クロマトグラフィー等の公知の分離・精製方法を用いることで、前記原料から分離して得られるものを用いることができる。さらに、ラクトフェリン中の金属含有量は特に限定されず、上記ラクトフェリンは、この分離ラクトフェリンを塩酸やクエン酸等により脱鉄したアポ型ラクトフェリン；該アポ型ラクトフェリンを、鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせて得られる飽和度１００％の状態の金属飽和ラクトフェリン；及び１００％未満の各種飽和度で金属が結合している状態の金属部分飽和ラクトフェリンからなる群から選ばれる、いずれか１種又は複数種の混合物を用いることも可能である。
上記ラクトフェリンは、市販のラクトフェリンを使用してもよい。この市販のラクトフェリンとして、工業的規模で製造されているもの（例えば、森永乳業社製）を使用することが好適である。
上記ラクトフェリンは、市販のラクトフェリンを使用してもよい。この市販のラクトフェリンとして、工業的規模で製造されているもの（例えば、森永乳業社製）を使用することが好適である。
また、上記ラクトフェリンは、遺伝子工学的手法により、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等で生産したラクトフェリンを使用することも可能である。好ましくは、ヒト若しくはウシ由来のラクトフェリン又はその対応する遺伝子に基づいて遺伝子工学的に製造されたラクトフェリンである。
本開示に使用するラクトフェリンの好ましい形態としては、ヒト由来のラクトフェリン及びウシ由来のラクトフェリン（配列番号２）が例示され、１種を単独で使用することも、複数種を混合して用いることも可能である。
ここで、本開示に用いられるラクトフェリンの調製（乳等の原料からのラクトフェリンの分離、精製）方法の一例を以下に示すが、これに限定されるものではない。
乳原料を陽イオン交換カラムに通液し、この通過液を回収し、適宜この通過液を繰り返しカラムに通液する。このカラムに脱イオン水を通液し、食塩水を通液し、この陽イオン交換カラムに吸着した塩基性タンパク質の溶出液を得る。この溶出液に硫酸アンモニウム沈殿法にて、これを回収し、適宜洗浄する。回収された沈殿物を脱イオン水にて溶解し、この溶解液を限外ろ過膜にてろ過する。さらに、脱塩処理、凍結乾燥することで、粉末状のラクトフェリンが得られる。
乳原料を陽イオン交換カラムに通液し、この通過液を回収し、適宜この通過液を繰り返しカラムに通液する。このカラムに脱イオン水を通液し、食塩水を通液し、この陽イオン交換カラムに吸着した塩基性タンパク質の溶出液を得る。この溶出液に硫酸アンモニウム沈殿法にて、これを回収し、適宜洗浄する。回収された沈殿物を脱イオン水にて溶解し、この溶解液を限外ろ過膜にてろ過する。さらに、脱塩処理、凍結乾燥することで、粉末状のラクトフェリンが得られる。
より詳細には、まず、イオン交換体（例えば、ＣＭ−セファロースＦＦ（商品名、アマシャムファルマシア社製））をカラムに充填し、塩酸を通液し、水洗してイオン交換体を平衡化する。続いて、４℃に冷却したｐＨ６．９の脱脂乳をカラムに通液し、透過液を回収し、再度同様にカラムに通液する。次いで、脱イオン水をカラムに通液し、食塩水を通液し、イオン交換体に吸着した塩基性タンパク質の溶出液を得る。この溶出液に飽和度８０％の硫酸アンモニウムを添加し、タンパク質を沈殿させ、遠心分離して沈殿物を回収する。回収した沈殿物を、飽和度８０％の硫酸アンモニウム溶液で洗浄し、脱イオン水を添加して溶解し、得られた溶液を限外ろ過膜モジュール（例えば、ＳＬＰ００５３（商品名、旭化成社製））を用いて脱塩し、凍結乾燥して、粉末状ウシラクトフェリンを得る。このようにして、純度が９５質量％以上のウシラクトフェリンが得られる。
本開示に用いられるラクトフェリンにおいては、種、属、個体等の違いによって、１又は複数の位置での１又は複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異が当然存在し、このような変異を有する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸においても変異が生じている場合がある。
本開示に用いることができるラクトフェリンには、ＣＯＭＴ阻害活性が損なわれない範囲において、このような変異を含むものも含有される。
本開示に用いることができるラクトフェリンには、ＣＯＭＴ阻害活性が損なわれない範囲において、このような変異を含むものも含有される。
本開示のラクトフェリンはＣＯＭＴ阻害作用を有するが、さらに熱処理、酸処理、アルカリ処理、加水分解処理等の各種処理を行ったラクトフェリン処理物は、ラクトフェリンと比較してＣＯＭＴ阻害作用が同等以上に向上するので、好適である。
本開示のラクトフェリン処理物の好適な物理的及び／又は化学的処理方法としては、例えば、ラクトフェリンの変性を目的として熱処理、酸処理、及びアルカリ処理が挙げられ、ラクトフェリンの加水分解を目的として加水分解処理が挙げられる。なお、これらを２種以上組み合わせて、本開示のラクトフェリン処理物を得ることも可能である。
本開示のラクトフェリン処理物の好適な物理的及び／又は化学的処理方法としては、例えば、ラクトフェリンの変性を目的として熱処理、酸処理、及びアルカリ処理が挙げられ、ラクトフェリンの加水分解を目的として加水分解処理が挙げられる。なお、これらを２種以上組み合わせて、本開示のラクトフェリン処理物を得ることも可能である。
また、本開示のラクトフェリンの変性等の処理物の製造方法については、熱変性又はｐＨ変化による変性（「タンパク質ハンドブック」，丸善株式会社 2003年発行）、圧力変性（Mazri Cら，「J. Dairy Sci.」，2012年，95巻，ｐ．549-557）等多くの方法により行うことが可能である。
なお、ラクトフェリン変性物は、処理前のラクトフェリンの構造とは異なり変化しているタンパク質であり、ＣＯＭＴ阻害作用が処理前のラクトフェリンと比較して同等以上にあるものをいう。
なお、ラクトフェリン変性物は、処理前のラクトフェリンの構造とは異なり変化しているタンパク質であり、ＣＯＭＴ阻害作用が処理前のラクトフェリンと比較して同等以上にあるものをいう。
熱処理の際の加熱処理温度は、好ましくは６０℃以上、より好ましくは６５℃以上であり、例えば８０〜１２５℃や９０〜１０５℃の範囲で加熱処理することも好適である。
また、加熱処理時間は、好ましくは１分以上、より好ましくは５分以上、さらに好ましくは５分〜１時間であり、５〜３０分間とするのが特に好適である。また、加熱処理時の圧力は、好ましくは０．８〜２気圧、より好ましくは０．８〜１．２気圧で行うのが好適である。
さらに、必要に応じて加熱処理後に、遠心分離等にて沈殿物を回収してもよい。
一例として、加熱処理ラクトフェリンは、ラクトフェリン水溶液を５〜３０分間熱湯中で煮沸し、遠心分離の沈殿物を回収することで得ることができる。
また、酸・アルカリ処理する際には、ラクトフェリン含有溶液のｐＨを調整して処理すればよい。当該ｐＨ調整による処理の場合は、処理液のｐＨが、好ましくはｐＨ５以下又はｐＨ９以上であり、より好ましくはｐＨ４以下又はｐＨ１０以上である。また、ラクトフェリン水溶液の規定を、鉱酸やナトリウム溶液等の酸アルカリ剤にて、０．０００１〜１Ｎ（より好適には０．００５〜０．０５Ｎ）にして処理を行なってもよい。
このようにｐＨ調整された処理液は、室温にて数分以上、好ましくは５分〜１時間、放置又は撹拌することによって、処理物として調製することができる。
なお、「室温」とは、４〜４０℃程度であるが、当該温度範囲でより好ましくは１０〜３０℃である。
また、加熱処理時間は、好ましくは１分以上、より好ましくは５分以上、さらに好ましくは５分〜１時間であり、５〜３０分間とするのが特に好適である。また、加熱処理時の圧力は、好ましくは０．８〜２気圧、より好ましくは０．８〜１．２気圧で行うのが好適である。
さらに、必要に応じて加熱処理後に、遠心分離等にて沈殿物を回収してもよい。
一例として、加熱処理ラクトフェリンは、ラクトフェリン水溶液を５〜３０分間熱湯中で煮沸し、遠心分離の沈殿物を回収することで得ることができる。
また、酸・アルカリ処理する際には、ラクトフェリン含有溶液のｐＨを調整して処理すればよい。当該ｐＨ調整による処理の場合は、処理液のｐＨが、好ましくはｐＨ５以下又はｐＨ９以上であり、より好ましくはｐＨ４以下又はｐＨ１０以上である。また、ラクトフェリン水溶液の規定を、鉱酸やナトリウム溶液等の酸アルカリ剤にて、０．０００１〜１Ｎ（より好適には０．００５〜０．０５Ｎ）にして処理を行なってもよい。
このようにｐＨ調整された処理液は、室温にて数分以上、好ましくは５分〜１時間、放置又は撹拌することによって、処理物として調製することができる。
なお、「室温」とは、４〜４０℃程度であるが、当該温度範囲でより好ましくは１０〜３０℃である。
本開示のラクトフェリンの加水分解物の製造方法については、ラクトフェリンが加水分解される方法を適宜選択することが可能であり、中でも酵素加水分解処理が好ましく、これら加水分解される方法を１種又は２種以上組み合わせて行なってもよい。加水分解により、ラクトフェリンに由来し、ＣＯＭＴ阻害作用を有するペプチドを得ることができる。
なお、本開示の加水分解物（例えば、酵素加水分解処理物等）は、ラクトフェリンを加水分解処理し、未精製のままの状態で使用しても効能を発揮することが可能である。さらに、後述するが、効能を向上させるために、適宜ＣＯＭＴ阻害作用を有する成分又はこの成分を含有する画分を分離精製することも可能である。
なお、本開示の加水分解物（例えば、酵素加水分解処理物等）は、ラクトフェリンを加水分解処理し、未精製のままの状態で使用しても効能を発揮することが可能である。さらに、後述するが、効能を向上させるために、適宜ＣＯＭＴ阻害作用を有する成分又はこの成分を含有する画分を分離精製することも可能である。
本開示のタンパク質酵素加水分解処理にて得られるタンパク質分解酵素加水分解処理物の製造方法については、通常知られている方法により行うことが可能である。具体的には、Takayama Yらの方法が知られている（Takayama Y ら, 「B.B.R.C.」， 2002年， 299巻，p．813-817）。
酵素加水分解処理において、好ましくは、トリプシン又は類似の反応特異性を有する酵素による製造である。
一例として、ｐＨ７．５〜８．５程度に調整したラクトフェリン水溶液に、トリプシン酵素を加え、３５〜３９℃で２〜２４時間程度処理することで本開示のタンパク質分解酵素生成物を得ることができる。さらに適宜分離精製処理してもよい。
酵素加水分解処理において、好ましくは、トリプシン又は類似の反応特異性を有する酵素による製造である。
一例として、ｐＨ７．５〜８．５程度に調整したラクトフェリン水溶液に、トリプシン酵素を加え、３５〜３９℃で２〜２４時間程度処理することで本開示のタンパク質分解酵素生成物を得ることができる。さらに適宜分離精製処理してもよい。
また、本開示のラクトフェリンの熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理、の処理物の製造方法については、上述の処理物の製造方法及び加水分解物の製造方法を、適宜組み合わせて行うことも可能である。
さらに、ラクトフェリンの熱処理物、ラクトフェリンの酸処理物、ラクトフェリンのアルカリ処理物、ラクトフェリン加水分解物、並びに、熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理を２種以上組み合わせて処理されたラクトフェリンの処理物を、公知の分離精製を行うことで、さらにＣＯＭＴ阻害活性を有するペプチド又は低分子化されたタンパク質を得ることも可能である。例えば、ポリマー系逆相カラム分画により各溶出画分を得、各溶出画分のＣＯＭＴ阻害活性を確認することで、より活性の高い溶出画分を得ることが可能である。また、当該ペプチド又は低分子化されたタンパク質は、活性の高い抽出画分からさらに単離することも可能であり、また化学合成で得ることも可能である。
このようにして得ることが可能なＣＯＭＴ阻害活性を有する好適なペプチド又はタンパク質としては、例えば、ラクトフェリンＮ−ｌｏｂｅ部分に属し、Ｎ末端がアラニン−プロリン−アルギニン−リジン−アスパラギンであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が３０〜４０ｋＤａのペプチド；配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなるペプチド；配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなるタンパク質等が挙げられる。なお、これらペプチド又はタンパク質は、ＣＯＭＴ阻害活性を有する範囲において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したものであってもよい。
これらラクトフェリン処理物のペプチド又はタンパク質に、ＣＯＭＴ阻害作用を発揮するための活性中心となり得る部分があると考えられる。当該活性の中心の一つとして、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが考えられる。
このようにして得ることが可能なＣＯＭＴ阻害活性を有する好適なペプチド又はタンパク質としては、例えば、ラクトフェリンＮ−ｌｏｂｅ部分に属し、Ｎ末端がアラニン−プロリン−アルギニン−リジン−アスパラギンであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が３０〜４０ｋＤａのペプチド；配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなるペプチド；配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなるタンパク質等が挙げられる。なお、これらペプチド又はタンパク質は、ＣＯＭＴ阻害活性を有する範囲において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したものであってもよい。
これらラクトフェリン処理物のペプチド又はタンパク質に、ＣＯＭＴ阻害作用を発揮するための活性中心となり得る部分があると考えられる。当該活性の中心の一つとして、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが考えられる。
本開示のラクトフェリン類は、後記実施例に示すように、ＣＯＭＴ阻害作用を有する。さらに、本開示のラクトフェリン類は、後記実施例に示すように、他のＣＯＭＴ阻害剤と併用することにより、ＣＯＭＴ阻害作用が相乗的に向上する。また、他のＣＯＭＴ阻害剤の使用量を減らすことも可能となる。さらに、本開示のラクトフェリン類は乳由来で安全性が高いので、他のＣＯＭＴ阻害剤を使用することによる副作用をより低減することができる。
前記「他のＣＯＭＴ阻害剤」としては、既存のＣＯＭＴ阻害剤に限定されないが、既存のＣＯＭＴ阻害剤として、例えば、ピロガロール、ガリック酸、コーヒー酸、アスコルビン酸、エンタカポン、ニテカポン、トルカポン等が挙げられ、これらから１種又は２種以上選択することができる。
前記「他のＣＯＭＴ阻害剤」としては、既存のＣＯＭＴ阻害剤に限定されないが、既存のＣＯＭＴ阻害剤として、例えば、ピロガロール、ガリック酸、コーヒー酸、アスコルビン酸、エンタカポン、ニテカポン、トルカポン等が挙げられ、これらから１種又は２種以上選択することができる。
よって、ラクトフェリン類は、ＣＯＭＴ阻害剤として使用することができ、さらにＣＯＭＴに関わる様々な状態の制御、例えばパーキンソン病等の疾患の予防及び／又は改善のために使用することができる。
従って、本開示のＣＯＭＴ阻害剤は、ラクトフェリン類を有効成分として含有する。また、本開示のＣＯＭＴ阻害剤は、ラクトフェリン類及び他のＣＯＭＴ阻害剤を有効成分として含有することも可能である。
従って、本開示のＣＯＭＴ阻害剤は、ラクトフェリン類を有効成分として含有する。また、本開示のＣＯＭＴ阻害剤は、ラクトフェリン類及び他のＣＯＭＴ阻害剤を有効成分として含有することも可能である。
上記使用とは、適用対象であるヒト若しくは非ヒト動物における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。
また、本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転；疾患、症状又は状態の悪化の防止、遅延若しくは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、本明細書において、「予防」とは、適用対象における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、或いは適用対象の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。
また、本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転；疾患、症状又は状態の悪化の防止、遅延若しくは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、本明細書において、「予防」とは、適用対象における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、或いは適用対象の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
本開示のラクトフェリン類は、ＣＯＭＴ阻害のため、或いはパーキンソン病等の疾患の予防及び／又は改善のための組成物、医薬、医薬部外品、飲食品若しくはその原料、又は飼料若しくはその原料に素材として配合することができ、その製造のために使用することができる。
ところで、カテコール部分を構造上含む生理活性物質は、抗酸化作用、抗炎症作用、血流改善作用等の種々の生理活性作用を有することが知られている。カテコール部分を構造上含む生理活性物質は、例えば、ポリフェノール；アントシアニジン及びその配糖体（例えばアントシアニン等）；フラボノイド；カテコールアミン、ニトロカテコール及びその誘導体（例えば、ドパミン、エンタカポン等）；カテコールエストロゲン等が挙げられる。
さらに、カテコール基を持つ生理活性物質は、食品（特に植物由来の食品）等に多く存在している。食品に存在するものとして、例えば、フラボノイド（例えばカテキン、アントシアニン、ルチン）等が知られている。 カテコール部分を構造上含む生理活性物質は、生体内ではＣＯＭＴ等の酵素により、カテコール部分のＯＨがＯＣＨ３と代謝されるが、この代謝によって生理活性作用の大きさが異なってくることも知られている（参考文献１：中野大介ら，「Bulletin of Osaka University of Pharmaceutical Sciences」2007年， 1巻、p．135―141）。このようなことから、例えば、ＣＯＭＴ阻害作用を有するクェルセチンと緑茶とを混合して投与することで緑茶の化学的予防効果を高めることが提案されている（参考文献２：Wang Pら，「Food Funct.」 2012年， 3巻， 6号，p．635−642）。
後記実施例に示すように、本開示のラクトフェリン類は食品成分として安全に摂取でき、これまでのものと作用機序が異なることから、カテコール部分を含む生理活性物質（好適にはカテコール基を持つ生理活性物質）と同時又は別々に摂取しＣＯＭＴの活性阻害を調節することで、カテコール部分を含む生理活性物質が奏する効果を調節する等により、医薬、飲食品等に汎用が期待できる。
ところで、カテコール部分を構造上含む生理活性物質は、抗酸化作用、抗炎症作用、血流改善作用等の種々の生理活性作用を有することが知られている。カテコール部分を構造上含む生理活性物質は、例えば、ポリフェノール；アントシアニジン及びその配糖体（例えばアントシアニン等）；フラボノイド；カテコールアミン、ニトロカテコール及びその誘導体（例えば、ドパミン、エンタカポン等）；カテコールエストロゲン等が挙げられる。
さらに、カテコール基を持つ生理活性物質は、食品（特に植物由来の食品）等に多く存在している。食品に存在するものとして、例えば、フラボノイド（例えばカテキン、アントシアニン、ルチン）等が知られている。 カテコール部分を構造上含む生理活性物質は、生体内ではＣＯＭＴ等の酵素により、カテコール部分のＯＨがＯＣＨ３と代謝されるが、この代謝によって生理活性作用の大きさが異なってくることも知られている（参考文献１：中野大介ら，「Bulletin of Osaka University of Pharmaceutical Sciences」2007年， 1巻、p．135―141）。このようなことから、例えば、ＣＯＭＴ阻害作用を有するクェルセチンと緑茶とを混合して投与することで緑茶の化学的予防効果を高めることが提案されている（参考文献２：Wang Pら，「Food Funct.」 2012年， 3巻， 6号，p．635−642）。
後記実施例に示すように、本開示のラクトフェリン類は食品成分として安全に摂取でき、これまでのものと作用機序が異なることから、カテコール部分を含む生理活性物質（好適にはカテコール基を持つ生理活性物質）と同時又は別々に摂取しＣＯＭＴの活性阻害を調節することで、カテコール部分を含む生理活性物質が奏する効果を調節する等により、医薬、飲食品等に汎用が期待できる。
上記組成物、医薬、医薬部外品、飲食品、飼料又は飲食品若しくは飼料の原料は、ヒト又は非ヒト動物用として製造され、又は使用され得る。本開示のラクトフェリン類は、上記組成物、医薬、医薬部外品、飲食品、飼料又は飲食品若しくは飼料の原料に素材として配合することが可能であり、ＣＯＭＴ阻害のため、或いはパーキンソン病等の疾患の予防及び／又は改善のための有効成分として含有させることが可能である。
以下の製剤等に使用するラクトフェリン類は、上記で製造されたラクトフェリン由来の生成物を含むものである。
上記医薬又は医薬部外品は、本開示のラクトフェリン類を有効成分として含有する。当該医薬又は医薬部外品の投与形態は特に限定されず、任意の投与形態で投与され得る。投与形態は、治療やサプリメントとしての予防等の目的に応じて適宜選択でき、経口投与でも非経口投与でもよい。例えば、経口投与形態として、錠剤、被覆錠剤、散剤、カプセル剤のような固形投与形態；シロップ及び懸濁液のような液体投与形態が挙げられ、非経口投与形態としては、注射、輸液、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、ボーラス、湿布剤等が挙げられる。
上記医薬又は医薬部外品は、本開示のラクトフェリン類を単独で含有していてもよく、又は製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、流動性促進剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。これらを用いて常法に従ってＣＯＭＴ阻害剤の製剤を製造することができる。
結合剤として、デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が例示される。
崩壊剤としては、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が例示される。
界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が例示される。
滑沢剤としては、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が例示される。
流動性促進剤としては、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が例示される。
崩壊剤としては、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が例示される。
界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が例示される。
滑沢剤としては、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が例示される。
流動性促進剤としては、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が例示される。
本開示の製剤中に含まれる本開示のラクトフェリン類の量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えばいずれも通常製剤中に０．０００１〜７５質量％、好ましくは０．００１〜５０質量％とするのがよい。
本発明の製剤の投与方法と投与量は特に限定されず、各種製剤形態、投与対象となる方の年齢、性別、その他の条件、摂取する医薬品や同様の効果を有するサプリメントとの摂取状況、或いはＣＯＭＴにより分解を受ける医薬品やサプリメントの摂取状況等により決定される。
通常有効成分としての本開示のラクトフェリン類の量は、０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、特に好ましくは５〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる量を目安とするのが良く、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
通常有効成分としての本開示のラクトフェリン類の量は、０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、特に好ましくは５〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる量を目安とするのが良く、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
上記飲食品や飼料は、ＣＯＭＴ阻害のため、或いはパーキンソン病等の疾患の予防及び／又は改善等の機能を有し、当該機能を必要に応じて表示した食品若しくは飲料、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品、ペットフード等であり得る。
本開示の有効成分であるラクトフェリン類を、食品又は飲料に対して、食品添加剤として添加して、飲食品組成物（飲食品）の形態で製造することができ、経口または経管的に摂取することが可能である。
このような飲食品組成物（飲食品）の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料、アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；惣菜、パン類；経腸栄養食品、流動食、スポーツ飲料；健康補助食品等の機能性食品等が例示される。
機能性食品の形態としては、顆粒状、タブレット状又は液状のサプリメントであることが、有効成分の摂取量を把握し易いという点で好ましい。
このような飲食品組成物（飲食品）の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料、アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；惣菜、パン類；経腸栄養食品、流動食、スポーツ飲料；健康補助食品等の機能性食品等が例示される。
機能性食品の形態としては、顆粒状、タブレット状又は液状のサプリメントであることが、有効成分の摂取量を把握し易いという点で好ましい。
本開示の飲食品組成物において、本開示のラクトフェリン類を添加する量は、飲食品組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の食品又は飲料中０．０００１〜７５質量％、好ましくは０．００１〜５０質量％となるように添加すればよい。
本開示の飲食品には、有効成分である前記ラクトフェリン類の他に、例えば、ラクチュロース、マルチトール、及びラクチトール等のアルコール吸収抑制性の糖類、及びそれ以外の糖類、例えばデキストリン、デンプン等；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を含有させることができる。
本開示のための食品添加剤は、各種食品添加剤を製造する際に、ラクトフェリン類を含有させることによって製造することができる。
食品添加剤には、有効成分としての本開示のラクトフェリン類の他に、通常使用される賦形剤等の添加剤を所望により含有させることができる。また、食品添加剤として公知の他の成分を所望により含有させることもできる。食品添加剤の形態には特に制限はなく、粉末、顆粒、タブレット、液体等、食品添加剤の通常の形態をとることができる。
本開示の有効成分であるラクトフェリン類は、ヒトに限られることなく、ほ乳類に対しても、効果を示すものである。したがって、本開示は、ラクトフェリン類を有効成分として含有する飼料、及び飼料添加剤にもあり、特にほ乳動物飼育用の粉乳、及び粉乳添加剤にもある。
本開示のための食品添加剤は、各種食品添加剤を製造する際に、ラクトフェリン類を含有させることによって製造することができる。
食品添加剤には、有効成分としての本開示のラクトフェリン類の他に、通常使用される賦形剤等の添加剤を所望により含有させることができる。また、食品添加剤として公知の他の成分を所望により含有させることもできる。食品添加剤の形態には特に制限はなく、粉末、顆粒、タブレット、液体等、食品添加剤の通常の形態をとることができる。
本開示の有効成分であるラクトフェリン類は、ヒトに限られることなく、ほ乳類に対しても、効果を示すものである。したがって、本開示は、ラクトフェリン類を有効成分として含有する飼料、及び飼料添加剤にもあり、特にほ乳動物飼育用の粉乳、及び粉乳添加剤にもある。
本技術は、以下の構成を採用することも可能である。
（１） ラクトフェリン、ラクトフェリン加水分解物、ラクトフェリンの熱処理物、ラクトフェリンの酸処理物、ラクトフェリンのアルカリ処理物、ラクトフェリン加水分解物、並びに、熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理を２種以上組み合わせて処理されたラクトフェリンの処理物から選ばれる１種又は２種以上のものを有効成分とするＣＯＭＴ阻害剤。
（２） 配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド及び／又は当該ペプチドを含んでなるペプチド若しくはタンパク質を有効成分とするＣＯＭＴ阻害剤。
（３） 次の（ａ）又は（ｂ）のペプチドを有効成分とするカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤。
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害作用を有するペプチド
（４） ＣＯＭＴ阻害剤の製造のための、ラクトフェリン、ラクトフェリンの熱処理物、ラクトフェリンの酸処理物、ラクトフェリンのアルカリ処理物、ラクトフェリン加水分解物、並びに、熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理を２種以上組み合わせて処理されたラクトフェリンの処理物、の使用。
（５） ＣＯＭＴ阻害剤の製造のための、配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド及び／又は当該ペプチドを含んでなるペプチド若しくはタンパク質の使用。当該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入してもよい。
（６） 配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド及び／又は当該ペプチドを含んでなるペプチド若しくはタンパク質の、ＣＯＭＴ阻害剤への使用。当該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入してもよい。
（７） ラクトフェリン、ラクトフェリンの熱処理物、ラクトフェリンの酸処理物、ラクトフェリンのアルカリ処理物、ラクトフェリン加水分解物、並びに、熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理を２種以上組み合わせて処理されたラクトフェリンの処理物を有効成分とする、ＣＯＭＴに起因する疾患、パーキンソン病の予防、改善又は治療方法。
（８） 配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド及び／又は当該ペプチドを含んでなるペプチド若しくはタンパク質を有効成分とする、ＣＯＭＴに起因する疾患、パーキンソン病の予防、改善又は治療方法。当該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入してもよい。
（１） ラクトフェリン、ラクトフェリン加水分解物、ラクトフェリンの熱処理物、ラクトフェリンの酸処理物、ラクトフェリンのアルカリ処理物、ラクトフェリン加水分解物、並びに、熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理を２種以上組み合わせて処理されたラクトフェリンの処理物から選ばれる１種又は２種以上のものを有効成分とするＣＯＭＴ阻害剤。
（２） 配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド及び／又は当該ペプチドを含んでなるペプチド若しくはタンパク質を有効成分とするＣＯＭＴ阻害剤。
（３） 次の（ａ）又は（ｂ）のペプチドを有効成分とするカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤。
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害作用を有するペプチド
（４） ＣＯＭＴ阻害剤の製造のための、ラクトフェリン、ラクトフェリンの熱処理物、ラクトフェリンの酸処理物、ラクトフェリンのアルカリ処理物、ラクトフェリン加水分解物、並びに、熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理を２種以上組み合わせて処理されたラクトフェリンの処理物、の使用。
（５） ＣＯＭＴ阻害剤の製造のための、配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド及び／又は当該ペプチドを含んでなるペプチド若しくはタンパク質の使用。当該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入してもよい。
（６） 配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド及び／又は当該ペプチドを含んでなるペプチド若しくはタンパク質の、ＣＯＭＴ阻害剤への使用。当該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入してもよい。
（７） ラクトフェリン、ラクトフェリンの熱処理物、ラクトフェリンの酸処理物、ラクトフェリンのアルカリ処理物、ラクトフェリン加水分解物、並びに、熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理を２種以上組み合わせて処理されたラクトフェリンの処理物を有効成分とする、ＣＯＭＴに起因する疾患、パーキンソン病の予防、改善又は治療方法。
（８） 配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド及び／又は当該ペプチドを含んでなるペプチド若しくはタンパク質を有効成分とする、ＣＯＭＴに起因する疾患、パーキンソン病の予防、改善又は治療方法。当該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入してもよい。
以下に、具体的な実施例等を説明するが、本発明（本開示）はこれに限定されるものではない。
試験例１
（ＣＯＭＴとラクトフェリンとの結合測定）
９６穴マイクロタイタープレートに５０μｌのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に溶解させたウシラクトフェリン（森永乳業社製）２０μｇ／ｍｌを入れ、４℃で一晩放置する。その後、ＰＢＳで３回洗浄して１％ウシアルブミンを含むＰＢＳ溶液１００μｌでブロッキングを行う。
ＰＢＳで洗浄後、１０、１、０．１μｇ／ｍｌに溶解したＣＯＭＴ溶液５０μｌを加え、室温で１時間４０分反応させる。その後、０．１容量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳで洗浄し、抗ＣＯＭＴ抗体５０μｌを加え、室温で１時間３０分反応させる。さらに洗浄後、パーオキシダーゼ標識した抗ヤギＩｇＧ抗体を５０μｌ加え、室温で１時間反応後、０．１容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、オルトフェニレンジアミンによる発色を行い硫酸により反応停止後４９２ｎｍで吸収を測定した。
コントロールとして抗ＣＯＭＴ抗体なしを使用した。
表１に結果を示した。その結果、ＣＯＭＴ濃度上昇に伴い吸光度が増加し、ＣＯＭＴとラクトフェリンの結合が確認された。
（ＣＯＭＴとラクトフェリンとの結合測定）
９６穴マイクロタイタープレートに５０μｌのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に溶解させたウシラクトフェリン（森永乳業社製）２０μｇ／ｍｌを入れ、４℃で一晩放置する。その後、ＰＢＳで３回洗浄して１％ウシアルブミンを含むＰＢＳ溶液１００μｌでブロッキングを行う。
ＰＢＳで洗浄後、１０、１、０．１μｇ／ｍｌに溶解したＣＯＭＴ溶液５０μｌを加え、室温で１時間４０分反応させる。その後、０．１容量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳで洗浄し、抗ＣＯＭＴ抗体５０μｌを加え、室温で１時間３０分反応させる。さらに洗浄後、パーオキシダーゼ標識した抗ヤギＩｇＧ抗体を５０μｌ加え、室温で１時間反応後、０．１容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、オルトフェニレンジアミンによる発色を行い硫酸により反応停止後４９２ｎｍで吸収を測定した。
コントロールとして抗ＣＯＭＴ抗体なしを使用した。
表１に結果を示した。その結果、ＣＯＭＴ濃度上昇に伴い吸光度が増加し、ＣＯＭＴとラクトフェリンの結合が確認された。
試験例２
（ＣＯＭＴ阻害活性測定）
ＣＯＭＴ阻害活性測定は、Ｆｌｏｄｅｒｕｓ Ｙらの方法（Floderus Y.ら,「Upsala J. Med. Sci.」,1981年,86巻, p.309-318）によって実施した。
詳細には、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１４Ｃ放射性同元素ラベルの１１．２μＭ ＳＡＭ（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、１ｍＭ ＤＢＡ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＣＯＭＴ酵素０．０３ｍｇ／ｍｌ（ＡＴＧｅｎ 社）指定濃度のウシラクトフェリン等の被検物質を含む５０μｌ反応液にて、３７℃、１６分反応させることによって行った。
酵素反応は、３７℃、４分反応させた後、ＤＢＡを添加することで開始させた。反応後、２５μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加し、反応を停止させた。停止後、３００μｌのイソアミルアルコール３：トルエン７の溶液を加えて抽出し、２層の上部を取り、液体シンチレーションカウンターによりＤＢＡの放射線ラベル量をカウントした。
表中の「bLF」はウシラクトフェリン；「Albumin」はアルブミン；「α-LA」は、α−ラクトアルブミン；「γ-Globulin」はγ−グロブリン；「Apo-Transferrin」はアポトランスフェリンである。
なお、既存の合成ＣＯＭＴ阻害剤としては、エンタカポン（製品名：コムタン、ノバルティスファーマ株式会社）を使用した。
ＩＣ５０は酵素活性を５０％阻害する濃度とした。
結果を表２に示した。その結果、他の生体由来たんぱく質に比べてウシラクトフェリン（ｂＬＦ）は高いＣＯＭＴ阻害活性を示した。コントロールとして医薬品であるエンタカポンの値を示した。
（ＣＯＭＴ阻害活性測定）
ＣＯＭＴ阻害活性測定は、Ｆｌｏｄｅｒｕｓ Ｙらの方法（Floderus Y.ら,「Upsala J. Med. Sci.」,1981年,86巻, p.309-318）によって実施した。
詳細には、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１４Ｃ放射性同元素ラベルの１１．２μＭ ＳＡＭ（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、１ｍＭ ＤＢＡ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＣＯＭＴ酵素０．０３ｍｇ／ｍｌ（ＡＴＧｅｎ 社）指定濃度のウシラクトフェリン等の被検物質を含む５０μｌ反応液にて、３７℃、１６分反応させることによって行った。
酵素反応は、３７℃、４分反応させた後、ＤＢＡを添加することで開始させた。反応後、２５μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加し、反応を停止させた。停止後、３００μｌのイソアミルアルコール３：トルエン７の溶液を加えて抽出し、２層の上部を取り、液体シンチレーションカウンターによりＤＢＡの放射線ラベル量をカウントした。
表中の「bLF」はウシラクトフェリン；「Albumin」はアルブミン；「α-LA」は、α−ラクトアルブミン；「γ-Globulin」はγ−グロブリン；「Apo-Transferrin」はアポトランスフェリンである。
なお、既存の合成ＣＯＭＴ阻害剤としては、エンタカポン（製品名：コムタン、ノバルティスファーマ株式会社）を使用した。
ＩＣ５０は酵素活性を５０％阻害する濃度とした。
結果を表２に示した。その結果、他の生体由来たんぱく質に比べてウシラクトフェリン（ｂＬＦ）は高いＣＯＭＴ阻害活性を示した。コントロールとして医薬品であるエンタカポンの値を示した。
試験例３
（ＣＯＭＴ阻害活性を有するウシラクトフェリンフラグメントの調製）
ウシラクトフェリン（森永乳業社製）を１０ｍｇ／ｍｌ含む５０ｍＭ（ｐＨ８）トリス溶液１ｍｌに、１Ｍ ＣａＣｌ２を１０μｌ、トリプシン溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ、それぞれ加えて、３７℃で一晩反応させて分解を行った。
フラグメントの分離はＨＰＬＣによって行った。カラムはＰｈｅｎｙｌ−５ｐｗｒｐ（東ソー株式会社）、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、移動層は０．５％ ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄを含む０％から８０％のアセトニトリルの濃度勾配によった。溶出画分のＣＯＭＴ阻害活性を含む部分を、さらにＨＰＬＣにより精製を行った。２回目の精製では、移動層を０．１％ＴＦＡを含む５−６５％のアセトニトリル濃度勾配により溶出させ、活性を有するペプチドを得た。
活性フラクションのＮ末端アミノ酸シークエンスとＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量とこれまでの報告（Takayama Y ら, 「B.B.R.C.」, 2002年, 299巻,p.813-817）等から、ラクトフェリンＮ−ｌｏｂｅ部分に属する分子量約３．６万（Ｐ３６）のペプチドであった（配列番号１）。比較のため、Ｃ−ｌｏｂｅを含む分子量約５万のフラグメント（Ｐ５１）、分子量約２万のフラグメント（Ｐ２０）を調製し、実験を行った（試験例４）。
Ｐ３６、Ｐ５１、Ｐ２０のＮ末端アミノ酸シークエンスは、Ｎ末端よりそれぞれＰ３６：アラニン−プロリン−アルギニン−リジン−アスパラギン、Ｐ５１：セリン−フェニルアラニン−グルタミン−ロイシン−フェニルアラニン、Ｐ２０：グルタミン酸−セリン−プロリン−グルタミン−スレオニンであった。
（ＣＯＭＴ阻害活性を有するウシラクトフェリンフラグメントの調製）
ウシラクトフェリン（森永乳業社製）を１０ｍｇ／ｍｌ含む５０ｍＭ（ｐＨ８）トリス溶液１ｍｌに、１Ｍ ＣａＣｌ２を１０μｌ、トリプシン溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ、それぞれ加えて、３７℃で一晩反応させて分解を行った。
フラグメントの分離はＨＰＬＣによって行った。カラムはＰｈｅｎｙｌ−５ｐｗｒｐ（東ソー株式会社）、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、移動層は０．５％ ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄを含む０％から８０％のアセトニトリルの濃度勾配によった。溶出画分のＣＯＭＴ阻害活性を含む部分を、さらにＨＰＬＣにより精製を行った。２回目の精製では、移動層を０．１％ＴＦＡを含む５−６５％のアセトニトリル濃度勾配により溶出させ、活性を有するペプチドを得た。
活性フラクションのＮ末端アミノ酸シークエンスとＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量とこれまでの報告（Takayama Y ら, 「B.B.R.C.」, 2002年, 299巻,p.813-817）等から、ラクトフェリンＮ−ｌｏｂｅ部分に属する分子量約３．６万（Ｐ３６）のペプチドであった（配列番号１）。比較のため、Ｃ−ｌｏｂｅを含む分子量約５万のフラグメント（Ｐ５１）、分子量約２万のフラグメント（Ｐ２０）を調製し、実験を行った（試験例４）。
Ｐ３６、Ｐ５１、Ｐ２０のＮ末端アミノ酸シークエンスは、Ｎ末端よりそれぞれＰ３６：アラニン−プロリン−アルギニン−リジン−アスパラギン、Ｐ５１：セリン−フェニルアラニン−グルタミン−ロイシン−フェニルアラニン、Ｐ２０：グルタミン酸−セリン−プロリン−グルタミン−スレオニンであった。
試験例４
（ラクトフェリン由来ペプチドの活性測定）
ＣＯＭＴ阻害活性測定は、Ｆｌｏｄｅｒｕｓ Ｙ．らの方法（Floderus Y.ら,「Upsala J. Med. Sci.」,1981年,86巻, p.309-318）を参考に実施した。
詳細には、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１４Ｃ放射性同元素ラベルの１１．２μＭ ＳＡＭ、１ｍＭ ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ＣＯＭＴ酵素０．００４ｍｇ／ｍｌ、及び指定濃度のペプチド等の被検物質を含む２２．５μｌ反応液にて、３７℃、１５分反応させることによった。反応はチューブを３７℃、１５分反応させた後、５ｍＭ ＤＢＡを２．５μｌ添加することで開始させた。反応後、１２．５μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加し、反応を停止させた。
停止後３００μｌのイソアミルアルコール３：トルエン７の溶液を加え抽出し、液体シンチレーションカウンターにより放射線量をカウントしたＩＣ５０は酵素活性を５０％阻害する濃度とした。
結果を表３に示した。その結果、Ｐ３６に活性があった。ウシラクトフェリン（ｂＬＦ）に比較して高い活性を有していた。
（ラクトフェリン由来ペプチドの活性測定）
ＣＯＭＴ阻害活性測定は、Ｆｌｏｄｅｒｕｓ Ｙ．らの方法（Floderus Y.ら,「Upsala J. Med. Sci.」,1981年,86巻, p.309-318）を参考に実施した。
詳細には、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１４Ｃ放射性同元素ラベルの１１．２μＭ ＳＡＭ、１ｍＭ ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ＣＯＭＴ酵素０．００４ｍｇ／ｍｌ、及び指定濃度のペプチド等の被検物質を含む２２．５μｌ反応液にて、３７℃、１５分反応させることによった。反応はチューブを３７℃、１５分反応させた後、５ｍＭ ＤＢＡを２．５μｌ添加することで開始させた。反応後、１２．５μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加し、反応を停止させた。
停止後３００μｌのイソアミルアルコール３：トルエン７の溶液を加え抽出し、液体シンチレーションカウンターにより放射線量をカウントしたＩＣ５０は酵素活性を５０％阻害する濃度とした。
結果を表３に示した。その結果、Ｐ３６に活性があった。ウシラクトフェリン（ｂＬＦ）に比較して高い活性を有していた。
試験例５
（加熱処理ラクトフェリンの調製と活性測定）
ウシラクトフェリン水溶液（２ｍｇ／ｍｌ：ｐＨ未調整で約ｐＨ７〜８） ４０μｌを、１．５ｍｌポリプロピレン遠心チューブに入れ、０分間，５分間，１５分間それぞれ熱湯中で煮沸し、その後氷冷し、１００００ｒｐｍで１秒遠心分離して、加熱処理ラクトフェリンを得た。得られたラクトフェリンを使用し活性測定を行った。
詳細には、５０ｍＭリン酸（ｐＨ７．８）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１４Ｃ放射性同元素ラベルの１１．２μＭ ＳＡＭ、１ｍＭ ＤＴＴ、ＣＯＭＴ酵素０．００４ｍｇ／ｍｌ、及びラクトフェリン最終濃度２．４μＭ含む２２．５μｌ反応液にて、３７℃、１５分反応させることによった。酵素反応はチューブを３７℃、１５分反応させた後、５ｍＭ ＤＢＡを２．５μｌ添加することで開始させた。１５分反応後、１２．５μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加し、反応を停止させた。停止後、３００μｌのイソアミルアルコール：トルエン＝３：７の溶液を加えて抽出し、液体シンチレーションカウンターにより放射線量をカウントした。
結果を表４に示した。その結果、熱処理時間０分のＣＯＭＴ残存活性を１００とした場合に、５分、１５分処理により、それぞれ５０．６％、３５．９％となり、阻害は増加した。
（加熱処理ラクトフェリンの調製と活性測定）
ウシラクトフェリン水溶液（２ｍｇ／ｍｌ：ｐＨ未調整で約ｐＨ７〜８） ４０μｌを、１．５ｍｌポリプロピレン遠心チューブに入れ、０分間，５分間，１５分間それぞれ熱湯中で煮沸し、その後氷冷し、１００００ｒｐｍで１秒遠心分離して、加熱処理ラクトフェリンを得た。得られたラクトフェリンを使用し活性測定を行った。
詳細には、５０ｍＭリン酸（ｐＨ７．８）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１４Ｃ放射性同元素ラベルの１１．２μＭ ＳＡＭ、１ｍＭ ＤＴＴ、ＣＯＭＴ酵素０．００４ｍｇ／ｍｌ、及びラクトフェリン最終濃度２．４μＭ含む２２．５μｌ反応液にて、３７℃、１５分反応させることによった。酵素反応はチューブを３７℃、１５分反応させた後、５ｍＭ ＤＢＡを２．５μｌ添加することで開始させた。１５分反応後、１２．５μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加し、反応を停止させた。停止後、３００μｌのイソアミルアルコール：トルエン＝３：７の溶液を加えて抽出し、液体シンチレーションカウンターにより放射線量をカウントした。
結果を表４に示した。その結果、熱処理時間０分のＣＯＭＴ残存活性を１００とした場合に、５分、１５分処理により、それぞれ５０．６％、３５．９％となり、阻害は増加した。
試験例６
（酸処理・アルカリ処理のラクトフェリン溶液の調製と活性測定）
５０ｍｇ/ｍｌのウシラクトフェリン溶液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）に溶解）１００μｌに、１Ｍ ＨＣｌを、５μｌ、７．５μｌ、又は１Ｍ ＮａＯＨを、５μｌ、７．５μｌそれぞれ添加し、室温（２０〜３０℃程度）に約１時間放置することにより、酸とアルカリによる処理を行った。反応液中のｐＨは、それぞれｐＨ４、ｐＨ２．５、ｐＨ１０、ｐＨ１１．５であった。
各処理後、２倍濃度のＰＢＳを１００μｌ添加し、その後、１Ｍ ＨＣｌ、又は１Ｍ ＮａＯＨを少しずつ添加して、それぞれ中和し、酸処理ラクトフェリン溶液、及びアルカリ処理ラクトフェリン溶液をそれぞれ調製した。コントロールは無処置（ｐＨ８に溶解）のウシラクトフェリン溶液に２倍濃度のＰＢＳを添加したものを使用した。
活性測定は、反応液中のラクトフェリン濃度を６μＭとした他は、試験例５の方法と同様に行った。
結果を表５に示した。その結果、ラクトフェリンを、酸処理又はアルカリ処理することにより、ＣＯＭＴ阻害活性は増加した。
（酸処理・アルカリ処理のラクトフェリン溶液の調製と活性測定）
５０ｍｇ/ｍｌのウシラクトフェリン溶液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）に溶解）１００μｌに、１Ｍ ＨＣｌを、５μｌ、７．５μｌ、又は１Ｍ ＮａＯＨを、５μｌ、７．５μｌそれぞれ添加し、室温（２０〜３０℃程度）に約１時間放置することにより、酸とアルカリによる処理を行った。反応液中のｐＨは、それぞれｐＨ４、ｐＨ２．５、ｐＨ１０、ｐＨ１１．５であった。
各処理後、２倍濃度のＰＢＳを１００μｌ添加し、その後、１Ｍ ＨＣｌ、又は１Ｍ ＮａＯＨを少しずつ添加して、それぞれ中和し、酸処理ラクトフェリン溶液、及びアルカリ処理ラクトフェリン溶液をそれぞれ調製した。コントロールは無処置（ｐＨ８に溶解）のウシラクトフェリン溶液に２倍濃度のＰＢＳを添加したものを使用した。
活性測定は、反応液中のラクトフェリン濃度を６μＭとした他は、試験例５の方法と同様に行った。
結果を表５に示した。その結果、ラクトフェリンを、酸処理又はアルカリ処理することにより、ＣＯＭＴ阻害活性は増加した。
試験例７
（組み合わせ処理によるＣＯＭＴ阻害剤の調製の検討１） 表６に示すウシラクトフェリン処理物１−４を調製した後、２倍濃度の氷冷ＰＢＳを添加することで反応を停止した。活性測定は、反応液中のラクトフェリン濃度を１．３μＭとした他は、試験例５の方法と同様に行った。酸と熱処理によりＣＯＭＴ阻害活性が増強した。ウシラクトフェリンを添加しない場合の酵素活性を１００とした場合の比活性を表に示した。
なお、処理物１は、２ｍｇ／ｍｌのウシラクトフェリン溶液１５３μｌ（水溶液）を３０℃で２０分間処理を行った。処理物２は、ラクトフェリン溶液に塩酸を添加し、ラクトフェリン濃度２ｍｇ／ｍＬで０．０１Ｎ ＨＣｌ溶液にした後、３０℃で２０分間処理を行った。処理物３は、２ｍｇ／ｍｌのウシラクトフェリン溶液１５３μｌ（水溶液）を６５℃で２０分間熱処理を行った。処理物４は、処理物３に塩酸を添加し、０．０１Ｎ ＨＣｌ溶液にした後、６５℃で２０分間熱処理を行った。
すなわち、表６に示す処理物２及び４のように、ラクトフェリンを弱酸にて弱酸処理物を得た際に、当該ラクトフェリンのによるＣＯＭＴ残存活性効果が高く認められた。このうち、６０℃以上で熱処理した弱酸処理物のＣＯＭＴ残存活性効果が最も高く認められた。
ラクトフェリンは酸処理や熱処理による変性を受けることで活性が増強されることが判明し、酸処理や加熱処理を組み合わせると活性は増強されることも明らかとなった。
（組み合わせ処理によるＣＯＭＴ阻害剤の調製の検討１） 表６に示すウシラクトフェリン処理物１−４を調製した後、２倍濃度の氷冷ＰＢＳを添加することで反応を停止した。活性測定は、反応液中のラクトフェリン濃度を１．３μＭとした他は、試験例５の方法と同様に行った。酸と熱処理によりＣＯＭＴ阻害活性が増強した。ウシラクトフェリンを添加しない場合の酵素活性を１００とした場合の比活性を表に示した。
なお、処理物１は、２ｍｇ／ｍｌのウシラクトフェリン溶液１５３μｌ（水溶液）を３０℃で２０分間処理を行った。処理物２は、ラクトフェリン溶液に塩酸を添加し、ラクトフェリン濃度２ｍｇ／ｍＬで０．０１Ｎ ＨＣｌ溶液にした後、３０℃で２０分間処理を行った。処理物３は、２ｍｇ／ｍｌのウシラクトフェリン溶液１５３μｌ（水溶液）を６５℃で２０分間熱処理を行った。処理物４は、処理物３に塩酸を添加し、０．０１Ｎ ＨＣｌ溶液にした後、６５℃で２０分間熱処理を行った。
すなわち、表６に示す処理物２及び４のように、ラクトフェリンを弱酸にて弱酸処理物を得た際に、当該ラクトフェリンのによるＣＯＭＴ残存活性効果が高く認められた。このうち、６０℃以上で熱処理した弱酸処理物のＣＯＭＴ残存活性効果が最も高く認められた。
ラクトフェリンは酸処理や熱処理による変性を受けることで活性が増強されることが判明し、酸処理や加熱処理を組み合わせると活性は増強されることも明らかとなった。
試験例８（組み合わせ処理によるＣＯＭＴ阻害剤の調製の検討２）
２ｍｇ／ｍｌのウシラクトフェリンを含む２ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．８）にトリプシンを０．１ｍｇ／ｍｌとなるように添加した反応液３０μｌを３７℃で２０分間処理し酵素分解を行った。ウシラクトフェリン（ｂＬＦ）を添加しないもの（Ｎｏ．３，４）、トリプシンを添加しないもの（Ｎｏ．１，３）をコントロールとして使用した。
酵素加水分解処理した後、５分間１００℃熱処理（ｐＨ７）を行い、沈殿を１２０００ｒｐｍで１分遠心で除きＣＯＭＴ阻害活性を有する上澄を得た。活性測定は試験例５の方法によった。Ｎｏ．３を１００とした場合のＣＯＭＴ残存活性を示した。
すなわち、表７に示す処理物２のように、ラクトフェリンをトリプシン加水分解にて酵素加水分解物を得た際に、当該ラクトフェリンの酵素加水分解物のＣＯＭＴ残存活性効果が高く認められた。
２ｍｇ／ｍｌのウシラクトフェリンを含む２ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．８）にトリプシンを０．１ｍｇ／ｍｌとなるように添加した反応液３０μｌを３７℃で２０分間処理し酵素分解を行った。ウシラクトフェリン（ｂＬＦ）を添加しないもの（Ｎｏ．３，４）、トリプシンを添加しないもの（Ｎｏ．１，３）をコントロールとして使用した。
酵素加水分解処理した後、５分間１００℃熱処理（ｐＨ７）を行い、沈殿を１２０００ｒｐｍで１分遠心で除きＣＯＭＴ阻害活性を有する上澄を得た。活性測定は試験例５の方法によった。Ｎｏ．３を１００とした場合のＣＯＭＴ残存活性を示した。
すなわち、表７に示す処理物２のように、ラクトフェリンをトリプシン加水分解にて酵素加水分解物を得た際に、当該ラクトフェリンの酵素加水分解物のＣＯＭＴ残存活性効果が高く認められた。
試験例９（ラクトフェリン類と他のＣＯＭＴ阻害剤との併用によるＣＯＭＴ阻害の増強）
活性測定は、反応液中の阻害剤としてウシラクトフェリンは１２．５μＭ、エンタカポンは７０ｎＭとした。５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）、２ｍＭＭｇＣｌ２、１４Ｃ放射性同元素ラベルの１１．２μＭＳＡＭ、１ｍＭＤＴＴ、ＣＯＭＴ酵素０．００４ｍｇ／ｍｌおよび阻害剤を含む２２．５μｌ反応液にて３７℃１０分反応させ、その後、５ｍＭＤＢＡを２．５μｌ添加することで酵素反応を開始させた。１５分後、１２．５μｌの１Ｍ塩酸を添加し、反応を停止した。ラクトフェリンとエンタカポンを添加したものは、単独よりも酵素阻害活性は増加した。
すなわち、表８に示すように、エンタカポン７０ｎＭに、ラクトフェリン１２．５μＭを配合することで、相乗的なＣＯＭＴ残存活性効果が認められた。ラクトフェリンは食品由来のため安全性が高く、このような安全性の高いラクトフェリンにて、エンタカポンの投与量を減らすことができることは有益である。
活性測定は、反応液中の阻害剤としてウシラクトフェリンは１２．５μＭ、エンタカポンは７０ｎＭとした。５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）、２ｍＭＭｇＣｌ２、１４Ｃ放射性同元素ラベルの１１．２μＭＳＡＭ、１ｍＭＤＴＴ、ＣＯＭＴ酵素０．００４ｍｇ／ｍｌおよび阻害剤を含む２２．５μｌ反応液にて３７℃１０分反応させ、その後、５ｍＭＤＢＡを２．５μｌ添加することで酵素反応を開始させた。１５分後、１２．５μｌの１Ｍ塩酸を添加し、反応を停止した。ラクトフェリンとエンタカポンを添加したものは、単独よりも酵素阻害活性は増加した。
すなわち、表８に示すように、エンタカポン７０ｎＭに、ラクトフェリン１２．５μＭを配合することで、相乗的なＣＯＭＴ残存活性効果が認められた。ラクトフェリンは食品由来のため安全性が高く、このような安全性の高いラクトフェリンにて、エンタカポンの投与量を減らすことができることは有益である。
試験例１０
（合成ペプチド（ウシラクトフェリン由来のペプチド）のＣＯＭＴ活性阻害効果）
ウシラクトフェリン（配列番号１）のアミノ酸配列６番目−５０番目からなるペプチドであるＰ５（配列番号３）及びアミノ酸配列４２番目−８４番目からなるペプチドであるＰ４（配列番号４）を化学合成し、ＣＯＭＴ阻害活性を試験例５の方法と同様に行った。
コントロールとしてウシラクトフェリンを使用した。Ｐ５はウシラクトフェリンよりも低濃度で阻害効果が見られた。Ｐ５とＰ４のアミノ酸配列は以下の様である。
ペプチドＰ５（配列番号３）:Val-Arg-Trp-Cys-Thr-Ile-Ser-Gln-Pro-Glu-Trp-Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe-Ala-Leu-Glu-Cys-Ile-Arg-Ala-lle-Ala
ペプチドＰ４（配列番号４）：Ala-Leu-Glu-Cys-Ile-Arg-Ala-Ile-Ala-Glu-Lys-Lys-Ala-Asp-Ala-Val-Thr-Leu-Asp-Gly-Gly-Met-Val-Phe-Glu-Ala-Gly-Arg-Asp-Pro-Tyr-Lys-Leu-Arg-Pro-Val-Ala-Ala-Glu-Ile-Tyr-Gly-Thr
すなわち、表９に示すペプチドＰ５は、ウシラクトフェリンよりもＣＯＭＴ活性阻害効果が高かった。このことはウシラクトフェリン（配列番号１）のアミノ酸配列６番目−５０番目にＣＯＭＴ阻害活性の中心的部分があると考えることができる。また、ペプチドＰ５は、ウシラクトフェリンの加水分解物とも言える。さらにペプチドＰ５にＣＯＭＴ阻害活性の中心的部分が存在する可能性がある。また、ペプチドＰ５のうちの１〜３個程度のアミノ酸が置換、欠失、挿入しても、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害作用を有すると考えられる。
（合成ペプチド（ウシラクトフェリン由来のペプチド）のＣＯＭＴ活性阻害効果）
ウシラクトフェリン（配列番号１）のアミノ酸配列６番目−５０番目からなるペプチドであるＰ５（配列番号３）及びアミノ酸配列４２番目−８４番目からなるペプチドであるＰ４（配列番号４）を化学合成し、ＣＯＭＴ阻害活性を試験例５の方法と同様に行った。
コントロールとしてウシラクトフェリンを使用した。Ｐ５はウシラクトフェリンよりも低濃度で阻害効果が見られた。Ｐ５とＰ４のアミノ酸配列は以下の様である。
ペプチドＰ５（配列番号３）:Val-Arg-Trp-Cys-Thr-Ile-Ser-Gln-Pro-Glu-Trp-Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe-Ala-Leu-Glu-Cys-Ile-Arg-Ala-lle-Ala
ペプチドＰ４（配列番号４）：Ala-Leu-Glu-Cys-Ile-Arg-Ala-Ile-Ala-Glu-Lys-Lys-Ala-Asp-Ala-Val-Thr-Leu-Asp-Gly-Gly-Met-Val-Phe-Glu-Ala-Gly-Arg-Asp-Pro-Tyr-Lys-Leu-Arg-Pro-Val-Ala-Ala-Glu-Ile-Tyr-Gly-Thr
すなわち、表９に示すペプチドＰ５は、ウシラクトフェリンよりもＣＯＭＴ活性阻害効果が高かった。このことはウシラクトフェリン（配列番号１）のアミノ酸配列６番目−５０番目にＣＯＭＴ阻害活性の中心的部分があると考えることができる。また、ペプチドＰ５は、ウシラクトフェリンの加水分解物とも言える。さらにペプチドＰ５にＣＯＭＴ阻害活性の中心的部分が存在する可能性がある。また、ペプチドＰ５のうちの１〜３個程度のアミノ酸が置換、欠失、挿入しても、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害作用を有すると考えられる。
試験例９及び１０の結果より、本開示のラクトフェリン類は、他のＣＯＭＴ阻害剤と併用することによりＣＯＭＴ阻害作用の相乗的効果がある。また、本開示のラクトフェリン類は、カテコール部分を構造上含む化合物であって生理活性物質と併用することで、当該カテコール部分を構造上含む生理活性物質の生理活性作用の低減を抑制することができる。このような他のＣＯＭＴ阻害剤や生理活性物質の使用量を減らしたり、これらの使用量をそのままで本開示のラクトフェリン類の使用量を増やすことが、本開示のラクトフェリン類は安全性が高いので可能である。
実施例１
ウシラクトフェリン（森永乳業社製）１５０ｇ、ラクチュロース粉末（森永乳業社製）１００ｇ、マルツデキストリン（松谷化学工業社製）６３５ｇ、脱脂粉乳（森永乳業社製）８５ｇ、ステビア甘味料（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１ｇ、ヨーグルト・フレーバー（三栄源エフ・エフ・アイ社製）５ｇ、グリセリン脂肪酸エステル製剤（理研ビタミン社製）２４ｇの各粉末を添加して均一に混合し、打錠機（畑鉄鋼所社製）を使用して、錠剤１錠当り０．５ｇとし、１２錠／分打錠速度、９．８ＫＰａの圧力で前記混合粉末を連続的に打錠し、ラクトフェリンを含有するタブレット１８００錠（約９００ｇ）を製造した。
ウシラクトフェリン（森永乳業社製）１５０ｇ、ラクチュロース粉末（森永乳業社製）１００ｇ、マルツデキストリン（松谷化学工業社製）６３５ｇ、脱脂粉乳（森永乳業社製）８５ｇ、ステビア甘味料（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１ｇ、ヨーグルト・フレーバー（三栄源エフ・エフ・アイ社製）５ｇ、グリセリン脂肪酸エステル製剤（理研ビタミン社製）２４ｇの各粉末を添加して均一に混合し、打錠機（畑鉄鋼所社製）を使用して、錠剤１錠当り０．５ｇとし、１２錠／分打錠速度、９．８ＫＰａの圧力で前記混合粉末を連続的に打錠し、ラクトフェリンを含有するタブレット１８００錠（約９００ｇ）を製造した。
Claims (3)
- ラクトフェリンを８０〜１２５℃で１分以上熱処理してラクトフェリンの熱処理物を得る工程、ラクトフェリン含有溶液をｐＨ５以下で５分〜１時間放置又は撹拌し、酸処理してラクトフェリンの酸処理物を得る工程、ラクトフェリン含有溶液をｐＨ９以上で５分〜１時間放置又は撹拌し、アルカリ処理してラクトフェリンのアルカリ処理物を得る工程、ラクトフェリンをトリプシンで加水分解処理してラクトフェリンの加水分解処理物を得る工程、並びに、ラクトフェリンを前記熱処理、前記酸処理、前記アルカリ処理及び前記加水分解処理を２種以上組み合わせて処理してラクトフェリンの処理物を得る工程、を含むカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の製造方法（ただし、前記ラクトフェリンの熱処理物を有効成分とするカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤は、飲食品の態様を除く）。
- ラクトフェリンＮ−ｌｏｂｅ部分に属し、Ｎ末端がアラニン−プロリン−アルギニン−リジン−アスパラギンであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が３０〜４０ｋＤａのペプチドを有効成分とするカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤。
- 配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤。
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