JP5993113B2 - Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells for the treatment of Alzheimer's disease - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の培養方法、およびこの方法に用いるためのヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞培養用無血清培地、ならびにかかる方法により得られたヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いる、アルツハイマー病の治療に関する。 The present invention relates to a method for culturing human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, a serum-free medium for culturing human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells for use in this method, and a human adipose tissue-derived mesenchyme obtained by such a method. The present invention relates to the treatment of Alzheimer's disease using stem cells.
MSCと治療対象の疾患
間葉系幹細胞は、脂肪、臍帯、骨髄中、滑膜などに存在する、多分化能を有する体性幹細胞である。間葉系幹細胞は種々の中胚葉細胞，例えば，骨芽細胞，軟骨細胞，骨格筋細胞，心筋細胞，および血管内皮細胞に分化することができる。間葉系幹細胞はその多分化能から、骨、関節、筋肉、肝臓、腎臓、心臓、中枢神経系および膵臓等の臓器再生医療への応用が期待されており、例えば、間葉系幹細胞の移植による心筋梗塞、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、自己免疫疾患、慢性腎不全、変形性関節症、脳梗塞、ならびに脳神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病）等の治療に関する研究が進められている。
MSC and disease to be treated Mesenchymal stem cells are multipotent somatic stem cells present in fat, umbilical cord, bone marrow, synovium, and the like. Mesenchymal stem cells can differentiate into various mesodermal cells, such as osteoblasts, chondrocytes, skeletal muscle cells, cardiomyocytes, and vascular endothelial cells. Mesenchymal stem cells are expected to be applied to organ regeneration medicine such as bone, joint, muscle, liver, kidney, heart, central nervous system and pancreas because of their multipotency. For example, transplantation of mesenchymal stem cells Myocardial infarction, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), autoimmune disease, chronic renal failure, osteoarthritis, cerebral infarction, and cranial nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease) Studies on such treatment are underway.
従来のMSCの採取法、培養法について
間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯血、脂肪および滑膜に存在するが、生体組織から採取できる細胞の数は少ないため、細胞治療に用いるためには、これらの細胞を生体外で培養して増殖させることが必要である。間葉系幹細胞は通常、ウシ胎児血清や患者の自己血清を添加した血清含有培地を用いて培養される。血清には、細胞の増殖や培養皿への接着を促進するための成長因子等の生理活性物質や細胞外基質タンパク質が含まれている。しかし、血清を用いて培養した細胞を患者に臨床応用する際には、外来ウイルスによる汚染、異種タンパク質の混入による投与時のアレルギー反応、培地成分のロット間の性能変動と、それに伴う細胞の不均一性などが問題となる。また、一般的な無血清培地においては、その細胞増殖速度が血清添加培地と比較すると減少するが、それはすなわち、治療までに時間を要することとなる。十分な増殖速度を達成することも治療の機を逃さないためにも重要である。
About conventional MSC collection method and culture method Mesenchymal stem cells are present in bone marrow, umbilical cord blood, fat and synovium, but since the number of cells that can be collected from living tissues is small, in order to use for cell therapy, It is necessary to grow these cells in vitro. Mesenchymal stem cells are usually cultured using a serum-containing medium supplemented with fetal bovine serum or patient autologous serum. Serum contains physiologically active substances such as growth factors and extracellular matrix proteins for promoting cell proliferation and adhesion to culture dishes. However, when clinically applying cells cultured with serum to patients, contamination with foreign viruses, allergic reactions during administration due to contamination with heterologous proteins, performance fluctuations among lots of medium components, and associated cell defects. Uniformity is a problem. Further, in a general serum-free medium, the cell growth rate is reduced as compared with a serum-added medium, which means that it takes time until treatment. Achieving a sufficient growth rate is important to not miss the treatment.
このため、血清を全く含まない無血清培地の開発が進められており、細胞培養用基礎培地にＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β等の各種の増殖因子や、インスリン、トランスフェリン、デキサメタゾンなどのホルモン類、リン脂質、脂肪酸等を添加した各種の無血清培地が開示されている（例えば、WO2007/080919、特開平８−３０８５６１、特表２００２−５２９０７１等を参照）。なお、間葉系幹細胞の培養および／または分化用の培地として数種類の無血清培地が市販されているが、いずれもその詳細な成分は明らかにされていない。 For this reason, development of a serum-free medium that does not contain serum at all has been promoted. Various growth factors such as FGF, PDGF, TGF-β, and hormones such as insulin, transferrin, dexamethasone, Various serum-free media supplemented with phospholipids, fatty acids and the like have been disclosed (see, for example, WO2007 / 080919, JP-A-8-308561, Special Table 2002-529071, etc.). Several types of serum-free media are commercially available as media for culturing and / or differentiating mesenchymal stem cells, but none of the detailed components have been clarified.
このような背景において、その組成が明らかである無血清培地により、十分な増殖速度をもって、未分化性を維持した細胞数を達成することは、間葉系幹細胞による再生医療の実現のためには避けられない命題となる。また、その細胞が造腫瘍性、染色体異常を伴わない安全なものであること、また、対象疾患の治療機序において、その治療に特化したプロファイルをその細胞が有する必要がある。 In such a background, achieving the number of cells maintaining undifferentiation with a sufficient growth rate by using a serum-free medium whose composition is clear is necessary for realizing regenerative medicine with mesenchymal stem cells. It becomes an inevitable proposition. In addition, the cell must be safe and have no tumorigenicity or chromosomal abnormality, and the cell must have a profile specialized for the treatment in the treatment mechanism of the target disease.
従来のアルツハイマー病治療について
アルツハイマー病（Alzheimer's Disease：AD）は、世界で約1800万人が罹患する最も一般的な認知症の1つである。その最大の危険因子は加齢であるが、若年層で発症が認められる家族性アルツハイマー病におけるアミロイドβペプチド（Aβ）の蓄積は、遺伝的要因によるAβの産生の増進が原因と考えられる。一方で、孤発性アルツハイマー病においては、Aβの分解系の異常に起因するAβの異常蓄積にあるとされる。全アルツハイマー病の９割以上は“孤発性アルツハイマー病”が占めており、最も治療で重要な点は、Aβの分解促進に寄与する治療法の開発である。
Conventional treatment of Alzheimer's disease for Alzheimer's disease (A lzheimer's D isease: AD ) is, about 18 million people in the world is one of the most common dementia suffering. The biggest risk factor is aging, but the accumulation of amyloid β peptide (Aβ) in familial Alzheimer's disease, which is observed in young people, is thought to be due to the increased production of Aβ by genetic factors. On the other hand, in sporadic Alzheimer's disease, it is said that Aβ is abnormally accumulated due to abnormalities in the degradation system of Aβ. Over 90% of all Alzheimer's disease is accounted for by “spontaneous Alzheimer's disease”, and the most important point in treatment is the development of a treatment method that contributes to the promotion of Aβ degradation.
現在、神経細胞の変性・脱落に直接起因するアルツハイマー病の中核症状の治療においては、コリンエステラーゼ阻害薬（ChEI）、およびN-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDA受容体）拮抗薬があるが、進行の抑制ないしは症状の軽減を目的として使用されており、アルツハイマー病は不可逆的な症候である。このうち、日本において認可されているのはChEI（ドネペジル）である。アルツハイマー病脳では様々な神経伝達物質の低下が認められるが、ドネペジルは皮質や海馬のコリン作動性ニューロンでアセチルコリンを補うことによりアルツハイマー病症状の改善効果をもたらすとされる。しかし、ドネペジルによる治療効果は永続的ではないとともに、この薬剤は軽症および中等症のアルツハイマー病型認知症を適応としており、重症のアルツハイマー病は適応に含まれていない。 Currently, there are cholinesterase inhibitors (ChEIs) and N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA receptor) antagonists in the treatment of the core symptoms of Alzheimer's disease caused directly by neuronal degeneration and loss. It is used to suppress progression or reduce symptoms, and Alzheimer's disease is an irreversible symptom. Of these, ChEI (Donepezil) is approved in Japan. In the brain of Alzheimer's disease, various neurotransmitters are decreased, but donepezil is said to have an effect of improving Alzheimer's disease symptoms by supplementing acetylcholine with cortical and hippocampal cholinergic neurons. However, the therapeutic effect of donepezil is not permanent, and the drug is indicated for mild and moderate Alzheimer's disease dementia, and severe Alzheimer's disease is not included in the indication.
ネプリライシン（Neprilysin）とアルツハイマー病について
アルツハイマー病の病理所見においては、大脳皮質・辺縁系におけるシナプスの崩壊や神経細胞の脱落に伴う能の委縮、および老人班などの異常が認められる。老人班はAβが細胞外で凝集魂を形成したものである。Aβの蓄積はアルツハイマー病発症初期に起こる疾患特異性の高い病理造として知られ、孤発性アルツハイマー病では、Aβ分解系の機能低下によりAβが蓄積するものと考えられている。その分解に関わる主要な酵素は、ＩＩ型膜貫通型のメタロプロテアーゼであるネプリライシンであると知られている。ネプリライシンは神経細胞のプレシナプスに存在し、シナプス間隙のAβ濃度の調節に寄与する。ネプリライシンのノックアウトマウスの脳では、著しいAβ分解活性の低下と内在性Aβ量の上昇が認められ（Iwata N, Tsubuki S, Takaki Y, et al. Metabolic regulation of brain Aβ by neprilysin. Science.２００１;２９２:１５５０-１５５２.）、逆に神経細胞で過剰発現すると、Aβの細胞内外での蓄積が減少する（Hama E, Shirotani K, Masumoto H, Sekine-Aizawa Y, Aizawa H, Saido TC. Clearance of extracellular and cell-associated amyloid β peptide through viral expression of neprilysin in primary neurons. J Biochem.２００１;１３０:７２１-７２６.）。アルツハイマー病の発症前予防と発症後の治療のためには、脳内Aβ量を低下させることが必要であり、そのためにネプリライシン活性に着目したアルツハイマー病治療戦略が取られている。
About Neprilysin and Alzheimer's Disease In the pathological findings of Alzheimer's disease, synaptic disruption in the cerebral cortex and limbic system, atrophy of ability associated with the loss of nerve cells, and abnormalities such as the elderly population are observed. In the elderly group, Aβ forms an agglomerated soul outside the cell. Accumulation of Aβ is known as a pathological structure with high disease specificity that occurs in the early onset of Alzheimer's disease. In sporadic Alzheimer's disease, Aβ is considered to accumulate due to a decrease in the function of the Aβ degradation system. The main enzyme involved in the degradation is known to be neprilysin, a type II transmembrane metalloprotease. Neprilysin is present in the presynapse of neurons and contributes to the regulation of Aβ concentration in the synaptic cleft. In the brains of neprilysin knockout mice, a marked decrease in Aβ-degrading activity and an increase in endogenous Aβ amount were observed (Iwata N, Tsubuki S, Takaki Y, et al. Metabolic regulation of brain Aβ by neprilysin. Science. 2001; 292). : 1550-1552. Conversely, overexpression in neurons reduces the accumulation of Aβ in and out of cells (Hama E, Shirotani K, Masumoto H, Sekine-Aizawa Y, Aizawa H, Saido TC. Clearance of extracellular and cell-associated amyloid β peptide through viral expression of neprilysin in primary neurons. J Biochem. 2001; 130: 721-726.). In order to prevent Alzheimer's disease before the onset and treatment after the onset, it is necessary to reduce the amount of Aβ in the brain. For this reason, an Alzheimer's disease treatment strategy focusing on neprilysin activity has been adopted.
ネプリライシンとMSCについて
近年、間葉系幹細胞が中枢神経系の治療に利用されつつあるが、アルツハイマー病の治療においても同細胞が効果的であることが、下記の通り報告されている（図１を参照）。
１． 2009年にJongらは、Aβ1-42をC57BL/6マウスの海馬歯状回に注入して作製した急性アルツハイマー病モデルマウスモデルにおいて、骨髄由来間葉系幹細胞の脳内直接投与により脳内Aβ量が減少することを明らかにし、これはミクログリアの活性化によるものであるとしている（Neurosci Lett. 2009 Jan 30;450(2):136-41. Epub 2008 Dec 6.）。Jongらが唱える機序としては、間葉系幹細胞が病態環境によるミクログリアのファゴサイトーシスなどの機能を活性化し、ミクログリアによるAβのクリアランス効率を上昇させることで、Aβ沈着に伴うプラーク形成を抑制するというものである。一方で本論文においてJongらは、慢性化アルツハイマー病などの治療においても間葉系幹細胞の投与が効果的であるかについては、さらなる検証が必要としている。
２． 続いて2010年にJongらは、骨髄由来間葉系幹細胞が免疫系を調節することでAβ沈着を抑制すると報告している。彼らはアルツハイマー病モデルマウスであるアミロイド前駆体蛋白質（amyloid precursor protein ; APP) と プレセニリン・ワン（presenilin one; PS1)のダブルトランスジェニックマウス（APP／PS1）の脳内に骨髄由来間葉系幹細胞を注入することで、Aβ40とAβ42の両ペプチドの集積が海馬と皮質の両方で顕著に減少することを確認した（Stem Cells. 2010 Feb;28(2):329-43.）。著者らは、Aβの分解に関与するインスリン分解酵素（insulin degrading enzyme; IDE）、ネプリライシン（NEP）、マトリクスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinase）9（MMP-9）などの酵素のミクログリアからの分泌が、骨髄由来間葉系幹細胞の投与により増加することを示し、同時にTNF-αやIL-1βなどの炎症性サイトカインンの発現の減少を確認している。また、アルツハイマー病の発症にはAβの沈着と同時にtauのリン酸化が必要とされているが、APP／PS1マウスへの骨髄由来間葉系幹細胞の投与により、tauのリン酸化がコントロールのPBS投与群と比較して約40%抑制される。さらに行動学的にも、モリス水迷路試験で成績の改善を認めており、分子レベルの機序から治療効果まで検証されている。
３． 2010年のHabischらの報告により、間葉系幹細胞を神経外胚葉に分化させた際、F-sapondinとCD10（ネプリライシン）が顕著な発現誘導を受けることが示された（それぞれ4,992±697倍と692±226倍）。両タンパク質は、Aβペプチドの形成と分解に関与する。間葉系幹細胞それ自体の神経系への分化が、アルツハイマー病の治療に効果的であることを示した（Stem Cells Dev. 2010 May;19(5):629-33.）。
About Neprilysin and MSC In recent years, mesenchymal stem cells are being used for the treatment of the central nervous system, but it has been reported that the cells are also effective in the treatment of Alzheimer's disease (see FIG. 1). reference).
1. In 2009, Jong et al. In a mouse model of acute Alzheimer's disease prepared by injecting Aβ1-42 into the hippocampal dentate gyrus of C57BL / 6 mice, directly administered bone marrow-derived mesenchymal stem cells into the brain. It is said that this is due to the activation of microglia (Neurosci Lett. 2009 Jan 30; 450 (2): 136-41. Epub 2008 Dec 6.). The mechanism proposed by Jong et al. Is that mesenchymal stem cells activate functions such as phagocytosis of microglia by pathologic environment and increase the clearance efficiency of Aβ by microglia, thereby suppressing plaque formation associated with Aβ deposition That's it. On the other hand, in this paper, Jong et al. Need further verification whether mesenchymal stem cells are effective in the treatment of chronic Alzheimer's disease and the like.
2. Subsequently, Jong et al. Reported in 2010 that bone marrow-derived mesenchymal stem cells regulate Aβ deposition by regulating the immune system. They developed bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the brain of Alzheimer's disease model mice, amyloid precursor protein (APP) and presenilin one (PS1) double transgenic mice (APP / PS1). It was confirmed by injection that the accumulation of both Aβ40 and Aβ42 peptides was significantly reduced in both the hippocampus and cortex (Stem Cells. 2010 Feb; 28 (2): 329-43.). The authors reported that secretion of microglia from enzymes such as insulin degrading enzyme (IDE), neprilysin (NEP), and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) involved in the degradation of Aβ It has been shown to increase with administration of derived mesenchymal stem cells, and at the same time it has been confirmed that expression of inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β is decreased. In addition, tau phosphorylation is required at the same time as Aβ deposition for the development of Alzheimer's disease. By administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to APP / PS1 mice, tau phosphorylation is administered as a control PBS. About 40% is suppressed compared to the group. Furthermore, behaviorally, the Morris water maze test has shown improved results, and has been validated from molecular mechanisms to therapeutic effects.
3. A 2010 report by Habisch et al. Showed that F-sapondin and CD10 (neprilysin) were significantly induced to induce mesenchymal stem cells to differentiate into neuroectodermal cells (4,992 ± 697 times, respectively). 692 ± 226 times). Both proteins are involved in the formation and degradation of Aβ peptides. Differentiation of mesenchymal stem cells themselves into the nervous system has been shown to be effective in the treatment of Alzheimer's disease (Stem Cells Dev. 2010 May; 19 (5): 629-33.).
アルツハイマー病の臨床的治療に向けたMSC培養法の必要性について
間葉系幹細胞によるアルツハイマー病治療の有効性は十分に推察されるが、解決すべき課題が存在する。第１の課題としては、細胞治療剤の安全性の担保が上げられる。ヒトに投与する際には動物血清を使用しないことが望ましく、また、ヒト自己血清を使用する場合においても、その患者が何らかのウイルス感染症に罹患する場合においては、免疫系から隔離されたin vitroにおける培養系で爆発的にそのウイルスが増殖する危険性がある。また、培養効率の上昇の効果に血清には個人差があることから、各患者に安定的に細胞を供給するためには、血清から離脱した完全無血清培養が必要とされる。また、治療のために細胞数を達成する必要から、PD8程度まで継代培養を繰り返すことも想定されるが、培養過程で細胞が何らかの形質転換を生じないことも極めて重要である。第２の課題としては、アルツハイマー病治療に適した間葉系幹細胞を調製することである。スタートの組織、培地組成、培養器材、培養方法などにより、間葉系幹細胞のプロファイルは劇的に変化する。アルツハイマー病の治療機序が分子レベルで解明されつつある今、間葉系幹細胞の培養系をそれに適したものにコントロールすることにより、疾患特異的細胞治療剤として用意することが重要である。
Necessity of MSC culture method for clinical treatment of Alzheimer's disease Although the effectiveness of Alzheimer's disease treatment by mesenchymal stem cells is sufficiently inferred, there are problems to be solved. As a first problem, the security of the cell therapeutic agent is ensured. It is desirable not to use animal sera when administered to humans, and even when human autologous sera are used, in vitro isolated from the immune system if the patient suffers from some viral infection There is a risk that the virus will grow explosively in the culture system of. In addition, since serum has individual differences in the effect of increasing the culture efficiency, complete serum-free culture that is detached from the serum is required to stably supply cells to each patient. In addition, since it is necessary to achieve the number of cells for treatment, it is assumed that the subculture is repeated up to about PD8, but it is extremely important that the cells do not undergo any transformation during the culture process. The second problem is to prepare mesenchymal stem cells suitable for the treatment of Alzheimer's disease. The mesenchymal stem cell profile changes dramatically depending on the starting tissue, medium composition, culture equipment, culture method, and the like. Now that the therapeutic mechanism of Alzheimer's disease is being elucidated at the molecular level, it is important to prepare a disease-specific cell therapeutic agent by controlling the mesenchymal stem cell culture system to be suitable for it.
本発明は、アルツハイマー病の治療に有効な安全性の高い脂肪組織由来間葉系幹細胞を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a highly safe adipose tissue-derived mesenchymal stem cell effective for the treatment of Alzheimer's disease.
本発明者らは、特定の成分を添加した無血清培地を用いることにより、脂肪組織由来の間葉系幹細胞を大量に安定的に培養しうることを見いだした。すなわち、本発明は
［１］ 間葉系幹細胞の初代培養方法であって、ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞を、血清を含まない培地を用いて培養することを特徴とする方法；
［２］ 培地が還元型グルタチオンおよびフィブロネクチンを含む、上記［１］に記載の方法；
［３］ 培地中の還元型グルタチオンの濃度が２０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌである、上記［２］に記載の方法；
［４］ 培地中のフィブロネクチンがカイコ発現リコンビナントタンパク質である、上記［２］または［３］に記載の方法；
［５］ 培地がエコチンをさらに含む、上記［１］−［４］のいずれかに記載の方法；
［６］ 培地が分子量4,000以下から成る超低分子ヒアルロン酸をさらに含む、上記［１］−［５］のいずれかに記載の方法；
［７］ 上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法により得られるヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞集団；
［８］ FCSを用いた培養法で得られた細胞集団と比較して、ネプリライシンの発現および活性が高い、上記［７］に記載のヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞集団；
［９］ アルツハイマー病治療に対して効果を有する、上記［７］または［８］に記載のヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞集団；
［１０］ 超低免疫性NOGマウス造腫瘍性試験、染色体異常試験、軟寒天コロニー試験において、造腫瘍性または染色体異常が否定される、上記［７］〜［９］のいずれかに記載の細胞集団；
［１１］ 細胞が、Nanog、Oct3/4、ネスチン、CD105、CD271、CMAHからなる群より選択される１またはそれ以上の幹細胞マーカーを発現する、上記［７］〜［１０］のいずれかに記載の細胞集団；
［１２］ 細胞がTSG-6、VEGF、HGF、STC-1、TGF-βおよびb-FGFを発現する、上記［７］〜［１１］のいずれかに記載の細胞集団；
［１３］ 上記［９］〜［１２］のいすれかに記載のヒト脂肪組織間葉系幹細胞集団を主要有効成分として含む、アルツハイマー病治療剤；
［１４］ 上記［１３］に記載の治療剤をアルツハイマー病患者に投与することを含む、アルツハイマー病治療方法；
［１５］ 上記［１３］に記載の治療剤を被験者に投与することを含む、アルツハイマー病の再発予防方法、
を提供する。
The present inventors have found that a mesenchymal stem cell derived from adipose tissue can be stably cultured in a large amount by using a serum-free medium to which a specific component is added. That is, the present invention is [1] a primary method for culturing mesenchymal stem cells, which comprises culturing mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue using a medium not containing serum;
[2] The method according to [1] above, wherein the medium contains reduced glutathione and fibronectin;
[3] The method according to [2] above, wherein the concentration of reduced glutathione in the medium is 20 μg / ml to 200 μg / ml;
[4] The method according to [2] or [3] above, wherein the fibronectin in the medium is a silkworm-expressed recombinant protein;
[5] The method according to any one of [1] to [4] above, wherein the medium further contains ecotin;
[6] The method according to any one of [1] to [5] above, wherein the medium further contains ultra-low molecular hyaluronic acid having a molecular weight of 4,000 or less;
[7] A human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell population obtained by the method according to any one of [1] to [6] above;
[8] The human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell population according to the above [7], wherein the expression and activity of neprilysin is high compared to a cell population obtained by a culture method using FCS;
[9] The human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell population according to [7] or [8] above, which has an effect on Alzheimer's disease treatment;
[10] The cell according to any one of [7] to [9], wherein tumorigenicity or chromosomal abnormality is denied in the ultra-low immunity NOG mouse tumorigenicity test, chromosomal aberration test, and soft agar colony test. Group;
[11] The cell according to any one of [7] to [10], wherein the cell expresses one or more stem cell markers selected from the group consisting of Nanog, Oct3 / 4, nestin, CD105, CD271, and CMAH. Cell populations of
[12] The cell population according to any one of [7] to [11] above, wherein the cells express TSG-6, VEGF, HGF, STC-1, TGF-β and b-FGF;
[13] A therapeutic agent for Alzheimer's disease comprising the human adipose tissue mesenchymal stem cell population according to any one of [9] to [12] as a main active ingredient;
[14] A method for treating Alzheimer's disease, comprising administering the therapeutic agent according to the above [13] to an Alzheimer's disease patient;
[15] A method for preventing recurrence of Alzheimer's disease, comprising administering to the subject the therapeutic agent according to [13] above,
I will provide a.
本発明の特に好ましい態様においては、エコチン、還元型グルタチオン、フィブロネクチン、β2-ミクログロブリン、超低分子ヒアルロン酸を添加した無血清培地により、脂肪組織から約3週間以内に、1x108個オーダーの脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を、血清に全く依存することなく、培養することが可能である。さらにその細胞集団は血清培地中で培養された骨髄由来間葉系幹細胞よりも顕著に高いネプリライシンをタンパク質レベルで発現し、その細胞を重症例のアルツハイマー病患者に静脈注射により投与することで、その症状の顕著な回復をもたらすことをが見出された。 In a particularly preferred embodiment of the present invention, serum-free medium supplemented with ecotin, reduced glutathione, fibronectin, β2-microglobulin, and ultra-low molecular weight hyaluronic acid is used in the order of 1 × 10 8 fats within about 3 weeks from adipose tissue. Cell populations containing tissue-derived mesenchymal stem cells can be cultured without any dependence on serum. In addition, the cell population expressed neprilysin at a protein level significantly higher than bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in serum medium, and the cells were administered intravenously to severe Alzheimer's disease patients. It has been found to provide a significant recovery of symptoms.
本発明はまた、臨床的利用を前提とした、アルツハイマー病治療を対象とした安全で有効性の高い脂肪組織由来間葉系幹細胞の培養法と、それにより得られる細胞集団に関する。 The present invention also relates to a safe and highly effective method for culturing adipose tissue-derived mesenchymal stem cells for the treatment of Alzheimer's disease on the premise of clinical use, and a cell population obtained thereby.
本発明はまた、脂肪組織由来間葉系幹細胞が、ネプリライシン（CD10）強陽性である細胞集団から成る治療薬にも関する。 The present invention also relates to a therapeutic agent comprising a cell population in which the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells are strongly positive for neprilysin (CD10).
本発明はまた、脂肪組織由来間葉系幹細胞が、TNF-αに応答してTSG-6やSTC-1などの強力な抗炎症性タンパク質を、通常の血清培地における培養系と比較して高度に分泌する細胞集団であり、神経変性部位の抗炎症効果も有する治療薬にも関する。 The present invention also provides that adipose tissue-derived mesenchymal stem cells are highly potent in response to TNF-α and have strong anti-inflammatory proteins such as TSG-6 and STC-1 compared to culture systems in normal serum media. It is also related to a therapeutic agent that has an anti-inflammatory effect at the site of neurodegeneration.
本発明による培養系で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞は、アルツハイマー病の治療に極めて有効である。従来の薬剤投与による治療法ではアルツハイマー病の進行を遅らすことはできても改善することは難しいが、本発明による治療法においては、症状を改善することができる。また、本治療に用いる細胞は脂肪組織に由来するため、適切な培養工程の管理を条件に、iPS細胞やES細胞のように倫理面・安全面での問題が生じにくいことがある。 The adipose tissue-derived mesenchymal stem cells obtained by the culture system according to the present invention are extremely effective for the treatment of Alzheimer's disease. Although the treatment by conventional drug administration can slow the progression of Alzheimer's disease but is difficult to improve, the treatment by the present invention can improve the symptoms. In addition, since the cells used in this treatment are derived from adipose tissue, there are cases where ethical and safety problems such as iPS cells and ES cells are unlikely to occur on condition that appropriate culture process management is performed.
本発明によれば、脂肪組織由来間葉系幹細胞集団をアルツハイマー病患者に投与した際、アルツハイマー病診断マーカーとして知られる、脳脊髄液中のリン酸化tauタンパク質が減少する。 According to the present invention, when a population of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells is administered to an Alzheimer's disease patient, phosphorylated tau protein in cerebrospinal fluid, which is known as an Alzheimer's disease diagnostic marker, decreases.
本発明の治療法によれば、アルツハイマー病患者に脂肪組織由来間葉系幹細胞集団を投与した際、STECTにより脳内血流量の改善が、CTによる組織形態的異常の改善が確認される。 According to the treatment method of the present invention, when an adipose tissue-derived mesenchymal stem cell population is administered to an Alzheimer's disease patient, STECT confirms improvement in cerebral blood flow and CT improves histomorphological abnormality.
上記のような治療効果を得るに当たり、本発明の治療方法は、間葉系幹細胞を静脈内投与することによっても達成可能である。 In obtaining the therapeutic effect as described above, the treatment method of the present invention can also be achieved by intravenous administration of mesenchymal stem cells.
本発明からなる脂肪組織由来間葉系幹細胞の静脈内投与により、アルツハイマー病患者の脳内のβアミロイドを分解して老人斑の沈着を減少させるとともに、TSG-6などの因子を介した抗炎症作用により、アルツハイマー病発症の原因の１つと考えられる炎症を改善し、病態の再燃を抑制する予防効果を発揮する。 Intravenous administration of the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells according to the present invention degrades β-amyloid in the brain of Alzheimer's disease patients to reduce senile plaque deposition and anti-inflammatory via factors such as TSG-6 The action improves the inflammation considered to be one of the causes of the onset of Alzheimer's disease, and exerts a preventive effect of suppressing relapse of the disease state.
本発明の無血清培地によれば、治療に必要な1x107〜1x108までの脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を、血清培地と同等かそれ以下の期間内において、培養達成が可能である。 According to the serum-free medium of the present invention, it is possible to achieve culturing of a cell population containing adipose tissue-derived mesenchymal stem cells required for treatment within a period equivalent to or lower than that of a serum medium, from 1x10 7 to 1x10 8 It is.
本発明によれば、継代数P7（≒PD20）まで、アルツハイマー病治療に関する分子マーカーの発現を維持した状態で、腫瘍化や染色体異常における臨床上の安全性が確認されうる脂肪組織由来間葉系幹細胞の大量培養が可能である。 According to the present invention, up to passage number P7 (≈PD20), the expression of molecular markers for treatment of Alzheimer's disease is maintained, and clinical safety in tumorigenesis and chromosomal abnormalities can be confirmed. Mass culture of stem cells is possible.
本発明は、血清を含まない培地を用いてヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を培養する方法を特徴とする。培地としては、DMEM、MCDB201、α-MEMのいずれか、またはそれらを混合して基本培地とした無血清培地を用いることができる。 The present invention is characterized by a method for culturing human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells using a serum-free medium. As the medium, any of DMEM, MCDB201, and α-MEM, or a serum-free medium that is a mixture of them can be used.
本発明の好ましい態様においては、培地には還元型グルタチオンおよびフィブロネクチンが含まれる。好ましくは、培地中の還元型グルタチオンの濃度は1μg/ml〜200μg/mlであり、好ましくは2μg/ml以上、より好ましくは20μg/ml以上である。培地中のフィブロネクチンの濃度は、1μg/ml〜10μg/mlであり、好ましくは2〜5μg/mlである。 In a preferred embodiment of the present invention, the medium contains reduced glutathione and fibronectin. Preferably, the concentration of reduced glutathione in the medium is 1 μg / ml to 200 μg / ml, preferably 2 μg / ml or more, more preferably 20 μg / ml or more. The concentration of fibronectin in the medium is 1 μg / ml to 10 μg / ml, preferably 2 to 5 μg / ml.
本発明の１つの好ましい態様においては、10nM〜1μM（好ましくは100nM）エコチン、1μg/ml〜100μg/ml（好ましくは20μg/ml）還元型グルタチオン、1μg/ml〜10μg/ml（好ましくは5μg/ml）フィブロネクチン、100ng/ml〜10μg/ml（好ましくは1μg/ml）β2-ミクログロブリン、100ng/ml〜10μg/ml（好ましくは1μg/ml）超低分子ヒアルロン酸を添加した、DMEM、MCDB201、α-MEMのいずれか、またはそれらを混合して基本培地とした無血清培地を用いて、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を培養する。これらの中でタンパク性の成分は、大腸菌発現リコンビナントタンパク質、もしくはカイコ発現リコンビナントタンパク質として提供され、バキュロウイルスを用いた昆虫細胞発現系由来、もしくは動物由来成分は含有しない。 In one preferred embodiment of the invention, 10 nM to 1 μM (preferably 100 nM) ecotin, 1 μg / ml to 100 μg / ml (preferably 20 μg / ml) reduced glutathione, 1 μg / ml to 10 μg / ml (preferably 5 μg / ml). ml) fibronectin, 100 ng / ml to 10 μg / ml (preferably 1 μg / ml) β2-microglobulin, 100 ng / ml to 10 μg / ml (preferably 1 μg / ml) ultra low molecular weight hyaluronic acid, DMEM, MCDB201, Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells are cultured using any of α-MEM or a serum-free medium obtained by mixing them with basal medium. Among these, the protein component is provided as an E. coli expressed recombinant protein or a silkworm expressed recombinant protein, and does not contain an insect cell expression system using baculovirus or an animal derived component.
エコチンとは、大腸菌に由来するペプチドであって、セリンプロテアーゼ阻害活性をもつことが知られている。プロテアーゼ阻害剤を培地に加えることにより、タンパク質分解酵素の残存活性を効率的に阻害し、間葉系幹細胞の初期接着効率を高めることができる。 Ecotin is a peptide derived from E. coli and is known to have serine protease inhibitory activity. By adding a protease inhibitor to the medium, the residual activity of the proteolytic enzyme can be efficiently inhibited, and the initial adhesion efficiency of mesenchymal stem cells can be increased.
超低分子ヒアルロン酸とは、分子量約４，０００以下のヒアルロン酸を意味する。ヒアルロン酸の構成単位である二糖の分子量は約４００であるので、分子量約４，０００以下のヒアルロン酸は、約１０個以下の二糖単位により構成される。本発明において無血清培地に添加されるヒアルロン酸は、好ましくは平均分子量約２，０００以下であり、より好ましくは、平均分子量約１，２００以下であり、特に好ましくは、分子量約８００の４糖ヒアルロン酸（HA4）である。 Ultra low molecular weight hyaluronic acid means hyaluronic acid having a molecular weight of about 4,000 or less. Since the molecular weight of the disaccharide which is a structural unit of hyaluronic acid is about 400, hyaluronic acid having a molecular weight of about 4,000 or less is composed of about 10 or less disaccharide units. The hyaluronic acid added to the serum-free medium in the present invention preferably has an average molecular weight of about 2,000 or less, more preferably an average molecular weight of about 1,200 or less, and particularly preferably a tetrasaccharide having a molecular weight of about 800. Hyaluronic acid (HA4).
本発明の方法においては、初代培養用培地とその後の継代用培地でその培地組成が異なってもよく、特に初代培養においては、エコチンと還元型グルタチオン、フィブロネクチンの濃度を上記至適濃度かそれ以上で添加することが望ましい。初代培養、継代培養用培地にはこれらの成分のいずれか、または複合的に含まれており、その他にも、間葉系幹細胞の性能と安全性、治療効果を高めるためのいかなるタンパク性因子、脂質、糖質、無機塩類、低分子無機化合物、低分子有機化合物が含まれていてもよい。例えば、間葉系幹細胞の増殖および分化を促進するために、ＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦ−ＢＢを加えてもよい。さらに、他の増殖因子（ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ等）、リン脂質（フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリンなど）、脂肪酸（リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸）、コレステロール、インスリン、デキサメタゾン、トランスフェリン、セレン酸塩などを加えることができる。 In the method of the present invention, the composition of the medium may be different between the primary culture medium and the subsequent subculture medium. In particular, in the primary culture, the concentrations of ecotin, reduced glutathione, and fibronectin are the optimal concentrations or higher. It is desirable to add at. Primary and subculture media contain one or more of these components, and any other protein factors that enhance the performance and safety of mesenchymal stem cells and therapeutic effects , Lipids, carbohydrates, inorganic salts, low molecular weight inorganic compounds, and low molecular weight organic compounds may be included. For example, TGF-β and PDGF-BB may be added to promote mesenchymal stem cell proliferation and differentiation. Further, other growth factors (FGF, HGF, EGF, CTGF, VEGF, etc.), phospholipids (phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, etc.), fatty acids (linoleic acid, oleic acid, linolenic acid) Arachidonic acid, myristic acid, palmitoyl acid, palmitic acid, and stearic acid), cholesterol, insulin, dexamethasone, transferrin, selenate, and the like.
本発明による間葉系幹細胞を得るためには、被験者から外科的に切除ないし吸引することにより採取された皮下脂肪組織から、間質細胞画分（Stromal Vascular fraction: SVF）を抽出し、本発明による無血清培地を用いてフラスコまたはシャーレを用いて接着培養を行う。90〜95％コンフルエントになった時点で継代を繰り返し、必要に応じて継代の途中でもNanog、Oct3/4、ネスチン、CD105、CD271、CMAHなどの幹細胞マーカーとCD10の発現を、フローサイトメーターや細胞の免疫染色法で確認し、少なくとも最終継代ではそれらを確認する。初代培養開始から約3週間以内に、1x108個オーダーの脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を得たのち、細胞製剤のエンドトキシン濃度、無菌性試験、特定ウイルス感染否定試験、マイコプラズマ否定試験、生存率などの必要な品質管理基準項目について試験を行う。それらをクリアした細胞について、重症例のアルツハイマー病患者に静脈注射により投与することで、その症状の治療に使用することができる。本発明のアルツハイマー病治療剤には、さらに薬学的に許容しうる担体や賦形剤を加えてもよい。 In order to obtain mesenchymal stem cells according to the present invention, a stromal cell fraction (SVF) is extracted from subcutaneous adipose tissue collected by surgical excision or aspiration from a subject. Adhesive culture is performed using a flask or petri dish using a serum-free medium according to 1. Passage is repeated at 90-95% confluence, and if necessary, stem cell markers such as Nanog, Oct3 / 4, Nestin, CD105, CD271, CMAH and CD10 are expressed in the flow cytometer even during passage. Or by immunostaining of cells and at least at the final passage. Within about three weeks from the start primary culture, after obtaining a cell population comprising adipose tissue-derived mesenchymal stem cells 1x10 8 pieces order endotoxin concentration of cell preparation, sterility testing, certain viral infections negative test, mycoplasma negative test Test necessary quality control standard items such as survival rate. The cells that have cleared them can be used for the treatment of symptoms by being administered intravenously to severe Alzheimer's disease patients. A pharmaceutically acceptable carrier or excipient may be further added to the Alzheimer's disease therapeutic agent of the present invention.
下記に本発明を具体的に実施するに当たり説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 The present invention will be specifically described below, but the present invention is not limited to these examples.
脂肪組織由来間葉系幹細胞の無血清培養
最初に、被験者から皮下脂肪組織を無菌的に採取する。採取部位の選択肢としては、腹部または臀部が望ましいが、その他の部位でもよい。脂肪組織をコラゲナーゼで処理することで細胞を分散し、遠心に供してSVFを回収する。PBS（-）などでSVFを洗浄した後、DMEM/F12に20μg/mlの還元型グルタチオン、５μg/mlのフィブロネクチンおよび100nMのエコチンを加えた初代培養用無血清培地に懸濁し、適切なサイズのTフラスコに播種したうえで、37℃／5%CO2条件下で約95%コンフルエントに達するまで培養する。その間、必要に応じて、培地交換を初代培養用無血清培地で行う。初代培養用無血清培地はその他に、リコンビナントタンパク質として供給される0.15%（w/v）ヒト型血清アルブミン、500μM LiCl、100μg/ml Ascorbic Acid、10μg/mlGentasinを等を含有する。
Serum-free culture of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells First, subcutaneous adipose tissue is aseptically collected from a subject. As an option for the collection site, the abdomen or the buttocks is desirable, but other sites may be used. Cells are dispersed by treating adipose tissue with collagenase and centrifuged to collect SVF. After washing SVF with PBS (-), etc., it is suspended in a serum-free medium for primary culture in which 20 μg / ml reduced glutathione, 5 μg / ml fibronectin and 100 nM ecotin are added to DMEM / F12. Inoculate in a T-flask and incubate at 37 ° C / 5% CO2 until it reaches about 95% confluence. Meanwhile, if necessary, the medium is exchanged with a serum-free medium for primary culture. In addition, the serum-free medium for primary culture contains 0.15% (w / v) human serum albumin, 500 μM LiCl, 100 μg / ml Ascorbic Acid, 10 μg / ml Gentasin, etc. supplied as recombinant proteins.
その後、細胞へのダメージの少ない適切な剥離剤を用いて細胞をはく離回収し、PBS(-)などによる洗浄ののち、DMEM/F12に20μg/mlの還元型グルタチオンを加えた継代培養用無血清培地に懸濁してTフラスコに播種して、37℃／5%CO2条件下で培養する。この継代作業を繰り返し、本発明によるアルツハイマー病の治療に必要な1x107〜1x108個の目的の細胞数を得て、投与用の乳酸リンゲル液に懸濁して4℃で使用時まで保管する。継代培養用無血清培地はその他に、リコンビナントタンパク質として供給される0.15%（w/v）ヒト型血清アルブミン、500μM LiCl、100μg/ml Ascorbic Acid、10μg/ml Gentasin等を含有する。 After that, the cells are peeled and collected using an appropriate exfoliant with little damage to the cells, washed with PBS (-), etc., and then subcultured with 20μg / ml reduced glutathione added to DMEM / F12. It is suspended in a serum medium, seeded in a T flask, and cultured under conditions of 37 ° C / 5% CO 2 . This passaging operation is repeated, and the desired number of cells of 1 × 10 7 to 1 × 10 8 cells necessary for treatment of Alzheimer's disease according to the present invention is obtained, suspended in lactate Ringer's solution for administration, and stored at 4 ° C. until use. In addition, the serum-free medium for subculture contains 0.15% (w / v) human serum albumin, 500 μM LiCl, 100 μg / ml Ascorbic Acid, 10 μg / ml Gentasin, etc. supplied as recombinant proteins.
脂肪組織由来間葉系幹細胞の品質試験
回収した脂肪組織由来間葉系幹細胞を高度に含む細胞集団について、フローサイトメーター法や細胞免疫染色法により、その特性解析と品質確認を行う。陽性マーカーとしては、Nanog、Oct3/4、ネスチン、CD105、CD271、CMAH、CD10などを用い、陰性マーカーとしては、CD34、CD45などを用いる。陽性マーカーは90%以上の細胞における発現を基準値とし、陰性は10%以下の細胞での発現を基準とする。その他、安全性試験としてエンドトキシン試験や無菌性試験、ウイルス否定試験とマイコプラズマ否定試験を行った後、最後に投与1時間以内に投与細胞の生存率試験を行い、70%以上の細胞生存率が確認された場合において投与に用いる。
Quality test of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells About the cell population that contains highly collected adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, the characteristics analysis and quality confirmation are performed by flow cytometer method and cell immunostaining method. Nanog, Oct3 / 4, nestin, CD105, CD271, CMAH, CD10, etc. are used as positive markers, and CD34, CD45, etc. are used as negative markers. Positive markers are based on expression in 90% or more cells, and negative are based on expression in 10% or less cells. In addition, after conducting endotoxin test, sterility test, virus negative test and mycoplasma negative test as safety tests, the cell viability test is finally performed within 1 hour after administration, and cell viability of 70% or more is confirmed If used, it is used for administration.
脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与
品質試験をクリアした細胞について、静脈注射により投与する。本発明よる間葉系幹細胞は、脳関門を突破して患部にホーミングし、直接患部でβアミロイドを分解する活性を有する。従来の血清培地で培養された細胞は、投与された後に患部の栄養源の枯渇、炎症、虚血環境などにより、投与後著しい生存率の低下を伴い、それが要因で期待される治療効果に結び付かないことがある一方、本発明による無血清培地で培養された間葉系幹細胞は、それから大量に分泌されるTSG-6などの強力な抗炎症性因子による炎症環境の改善の作用もあり、投与細胞の生存率が従来法と比較して高く保たれ、結果的に高い治療効果をもたらすことになる。
Cells that have passed the administration quality test of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells are administered by intravenous injection. The mesenchymal stem cells according to the present invention have the activity of breaking through the brain barrier and homing to the affected area, and directly decomposing β-amyloid at the affected area. Cells that have been cultured in conventional serum media are accompanied by a significant decrease in the survival rate after administration due to depletion of nutrients in the affected area, inflammation, ischemic environment, etc. On the other hand, mesenchymal stem cells cultured in serum-free medium according to the present invention may also have an effect of improving the inflammatory environment by powerful anti-inflammatory factors such as TSG-6 secreted in large quantities from them. Therefore, the survival rate of the administered cells is kept high as compared with the conventional method, resulting in a high therapeutic effect.
脂肪組織由来間葉系幹細胞投与によるアルツハイマー病の治療効果
本発明よる脂肪組織由来間葉系幹細胞を重症例のアルツハイマー病患者に投与した場合、投与約2週間目から徐々に、時間の認識、自己の認識、好きな食べ物や家族の認知など、これまで不可能であったこれらの事象についての認識を回復し始め、投与3ヶ月後には息子の名前を答えるようになり、治療のために病院に行った際も、「あなたはなぜここにきているのですか？」とのいつもの医師からの問いに対して、「認知症の治療のためです」と問答が可能となった。
Therapeutic effect of Alzheimer's disease by administration of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells When the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells according to the present invention are administered to patients with severe Alzheimer's disease, gradually recognition of time, self Recognizing these events, which were previously impossible, such as recognition of food, favorite food and family, etc., began to answer his son's name three months after administration and went to the hospital for treatment When I went there, I was able to answer the question “Why are you here?” From the usual doctor, “It's for treatment of dementia”.
現在、アルツハイマー病の中核症状の治療においては、本邦ではコリンエステラーゼ阻害薬（ChEI）が認可されている。本薬は病態進行の抑制ないしは症状の軽減を目的として使用されており、従来の治療法の範疇においてアルツハイマー病は不可逆的な症候である。ドネペジルによる治療効果は永続的ではないとともに、この薬剤は軽症および中等症のアルツハイマー病型認知症を適応としており、重症のアルツハイマー病は適応に含まれていない。なお、アルツハイマー病の介護は介護者にも長期にわたり経済的、精神的、体力的に大きな負担を伴うため、本発明を適用することで、本発明を利用することにより、そのような負担を軽減することが可能となる。 Currently, a cholinesterase inhibitor (ChEI) is approved in Japan for the treatment of the core symptoms of Alzheimer's disease. Ezetimibe is used for the purpose of suppressing the progression of disease state or reducing symptoms, and Alzheimer's disease is an irreversible symptom in the category of conventional treatment. The therapeutic effect of donepezil is not permanent, and the drug is indicated for mild and moderate Alzheimer's disease dementia, and severe Alzheimer's disease is not included in the indication. In addition, care for Alzheimer's disease is accompanied by a large burden on the caregiver for a long time, economically, mentally, and physically. Therefore, by applying the present invention, such burden can be reduced. It becomes possible to do.
本発明によると、脂肪組織由来幹細胞を含む細胞集団の無血清培養が安定的に可能となる。従来は動物血清や自己血清を用いた培養が主であり、間葉系幹細胞の臨床治験においても動物血清が使用されているが、安全性やロット間にわたる一定の培養性能と成果物の性状の担保という意味で、細胞製剤の製造工程バリデーションを困難にすることが本質的に予想される。本発明は、脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の培養の産業化を本質的に達成することを前提としている。 According to the present invention, serum-free culture of a cell population containing adipose tissue-derived stem cells becomes possible. Conventionally, animal serum and autologous serum are mainly used for culturing, and animal serum is also used in clinical trials of mesenchymal stem cells. In terms of security, it is inherently expected to make it difficult to validate the manufacturing process of cell preparations. The present invention is premised on essentially achieving industrialization of the culture of a cell population containing adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.
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