JP5988199B2 - ＩｇＡ腎症診断法 - Google Patents
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Description
本発明は、ＩｇＡ腎症を他の腎症と区別して診断する方法に関する。
ＩｇＡ腎症は、世界で最も多い慢性糸球体腎炎であり、糸球体メサンギウム領域へのＩｇＡの沈着を主体とする顆粒状沈着を特徴とするメサンギウム増殖性腎炎、と定義され、約２５年の経過で約半数が末期腎不全へと進行する予後不良な疾患である。メサンギウム領域には、しばしばＩｇＧの共沈着がみられる。その発症機序はいまだ十分に解明されておらず、その治療方法も、食事療法、抗血小板薬、降圧薬、副腎皮質ステロイド等による薬物治療が行なわれているが、十分な治療効果は得られていない。
ＩｇＡ腎症は、前記の定義に従い、現在、腎生検により診断されている。しかし、腎生検は、入院を要し、出血・感染のリスクを伴うために患者に対する負担が大きい、片腎の患者には腎生検施行が困難である等の問題がある。従って、採血や採尿などの非侵襲的な検者データによってＩｇＡ腎症を診断することは重要課題である。
しかし、ＩｇＡ腎症には、ＩｇＡ及びＩｇＧがともに沈着する症例、ＩｇＡのみが沈着する症例が混在し、非侵襲的診断は困難である。また、ＩｇＡ腎症患者の血中には、糖鎖不全型ＩｇＡ１が増加している（非特許文献１）ことが知られている。しかし、糖鎖不全ＩｇＡ１だけで、本症の病態を説明することは困難であり、糖鎖不全ＩｇＡ１が高分子の免疫複合体を形成し、腎臓に沈着することが病態において重要であると考えられる。免疫複合体を形成するＩｇＡは糖鎖不全ＩｇＡ１であり、患者血中には、糖鎖不全ＩｇＡ１−ＩｇＡ、および糖鎖不全ＩｇＡ１−ＩｇＧ免疫複合体が増加していることが判明し、近年本発明者らは、糖鎖不全ＩｇＡ１を特異的に認識するＩｇＧ抗体を同定し、測定系を樹立した（非特許文献２）。これまでに、ＩｇＡ腎症患者の血中で増加していると報告がある血中糖鎖不全ＩｇＡ１や免疫複合体値でも、健常人やＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者群の血中の値とオーバーラップが認められ、これらのバイオマーカーでは診断に用いることが困難である。
Kidney Int, 2007, 71: 1148-1154
J Clin Invest, 2009, 119: 1668-1677
本発明の課題は、腎生検に頼ることなく、ＩｇＡ腎症を高確率で診断できる手段を提供することにある。
そこで本発明者は、ＩｇＡ腎症の正確な診断手段を開発すべく、種々の血中バイオマーカー、尿中マーカー等を組み合わせて検討してきたが、従来知られている種々のマーカーを組み合わせても腎生検の結果との相関性は向上しなかった。そこでさらに検討した結果、特定の血中バイオマーカーと尿中マーカーとを組み合わせ、これを変数としてロジスティック回帰モデルによる解析を行ったところ、９０％以上の正確さでＩｇＡ腎症の診断ができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の［１］〜［４］に関するものである。
［１］少なくとも血中ＩｇＡ値、血中糖鎖不全ＩｇＡ１値、血中ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値、血中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値及び尿中タンパク値の５種の測定値をロジスティック回帰モデルにより解析することを特徴とするＩｇＡ腎症診断のための検査法。
［２］ロジスティック回帰モデルの変数としてさらに、年齢及び性別を加えて解析する［１］記載の検査法。
［３］ロジスティック回帰モデルの変数としてさらに、血中クレアチニン値を加えて解析する［１］又は［２］記載の検査法。
［４］被験者由来、及びＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者由来の各測定値のロジスティック回帰モデル解析結果を対比することにより判定するものである［１］〜［３］のいずれか１項記載の検査法。
［１］少なくとも血中ＩｇＡ値、血中糖鎖不全ＩｇＡ１値、血中ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値、血中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値及び尿中タンパク値の５種の測定値をロジスティック回帰モデルにより解析することを特徴とするＩｇＡ腎症診断のための検査法。
［２］ロジスティック回帰モデルの変数としてさらに、年齢及び性別を加えて解析する［１］記載の検査法。
［３］ロジスティック回帰モデルの変数としてさらに、血中クレアチニン値を加えて解析する［１］又は［２］記載の検査法。
［４］被験者由来、及びＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者由来の各測定値のロジスティック回帰モデル解析結果を対比することにより判定するものである［１］〜［３］のいずれか１項記載の検査法。
本発明によれば、採血及び採尿により得られる非侵襲的な検査データのみから、ＩｇＡ腎症を正確に診断できる。これにより、早期の治療が可能になるとともに、治療中の経過観察も患者に負担をかけずに行うことができる。
本発明の検査法は、少なくとも血中ＩｇＡ値、血中糖鎖不全ＩｇＡ１値、血中ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値、血中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値及び尿中タンパク値の５種の測定値をロジスティック回帰モデルにより解析する。本発明の検査法においては、診断をより正確にするために、上記５種に加えて、年齢及び性別をロジスティック回帰モデルの解析変数として追加するのが好ましい。さらに、上記５又は７種に加えて、血中クレアチニン値、血尿の有無を当該解析変数として追加するのが好ましい。
血中ＩｇＡ値は、例えばＥＬＩＳＡ、放射免疫定量法（ＲＩＡ）等の免疫測定法により測定することができる。このうち、ＥＬＩＳＡ法により測定するのが、方法論が確立されており好適である。血中ＩｇＡ値は、通常血漿を対象として測定され、血漿１ｍｌ中の濃度として得られるので、この数値（ｍｇ／ｍｌ）を直接解析に使用し、ロジスティックモデル解析に使用する。
血中糖鎖不全ＩｇＡ１値は、例えばレクチンを用いたアフィニティクロマト法、ＥＬＩＳＡ等の免疫測定法により測定することができる。このうち、ＥＬＩＳＡにより測定するのが、正確であり好ましい。血中糖鎖不全ＩｇＡ１値は、精製された糖鎖不全ＩｇＡ１蛋白を対象として測定され、血中ＩｇＡ １００ｎｇ中に含まれる糖鎖異常ＩｇＡ１値が吸光度（ＯＤ）として得られるので、この数値を血中ＩｇＡ値と掛け合わせ、血中の糖鎖異常ＩｇＡ１値を算出し（Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ロジスティックモデル解析に使用する。
血中ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値は、ＥＬＩＳＡ法より測定することができる。血中ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値は、通常血漿を対象として測定され、血漿１ｍｌ中の濃度が吸光度（ＯＤ）として得られるので、この数値をロジスティックモデル解析に使用する。
血中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値は、ＥＬＩＳＡ法により測定することができる。ＥＬＩＳＡで測定するのが、正確であり好ましい。血中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値は、通常血漿を対象として測定され、血漿１ｍｌ中の濃度が吸光度（ＯＤ）として得られるので、この数値をロジスティックモデル解析に使用する。
尿タンパク値は、例えば比濁法、色素比色法（ＰＲ法、ＣＢＢ法など）、Ｌｏｗｒｙ法により測定することができる。このうち、色素比色法（ＰＲ法）法による測定値を用いるのが簡便である点で好ましい。尿タンパク値は、通常尿１ｍｌ中の濃度として得られる。しかし、随時尿中の尿蛋白は尿の比重によって影響を受けるため、１日の尿蛋白排泄量を推定する方法として、通常尿中のクレアチニン値で補正をする。尿中クレアチニン値は、酵素法で測定され、通常１ｍｌ中の濃度として得られる。随時尿中の尿蛋白排泄量として、尿中蛋白／尿中クレアチニン値（ｇ／ｇ・Ｃｒ）として算出され、この数値をロジスティックモデル解析に使用する。
血中クレアチニン値は、例えば酵素法、Ｊａｆｆｅ法等により測定することができる。このうち、酵素法による測定値を用いるのが簡便であり好ましい。血中クレアチニン値は、通常血漿を対象として測定され、血漿１ｍｌ中の濃度として得られるので、この数値をロジスティックモデル解析に使用する。
血尿の程度は尿中赤血球数で判断する。尿中赤血球数は、通常顕微鏡下で目視することで測定できる。尿中赤血球数は、１〜５個／視野を０、６〜１０個／視野を１、１１〜１５個／視野を２、１６〜２０個／視野を３、２１〜２５個／視野を４、２６〜３０個／視野を５、多数／視野を６と定量化してロジスティックモデル解析に使用する。また、年齢はそのままロジスティックモデル解析に使用し、性別は男性を１、女性を２としてロジスティックモデル解析に使用する。
ロジスティック回帰モデルによる解析は、市販の統計解析ソフトに含まれる多変量解析（ロジスティック回帰モデル）を用いて、前記５種〜９種の変数を入力して解析すればよい。ロジスティック回帰モデルは、ＪＭＰ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｊａｐａｎ株式会社）より入手できる。具体的には、ロジスティック回帰モデルの変数として、血中ＩｇＡ値、糖鎖異常ＩｇＡ１値、ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値、糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値、尿中蛋白量（尿中蛋白／尿中クレアチニン値）、血中クレアチニン値、尿中赤血球数、年齢、性別を入力し、ＩｇＡ腎症患者とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者の各々の数値を定量化する。
得られた解析結果を、健常者についての解析結果、他の腎疾患患者の解析結果と対比すれば、さらに正確な診断が可能である。また、健常者の解析結果、ＩｇＡ腎症の患者の解析結果、他の腎疾患患者の解析結果を多数データベース化すれば、より正確な診断が可能となる。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例
（１）血漿中糖鎖不全ＩｇＡ１の測定値を健常者群とＩｇＡ腎症（腎生検による）群とを対比した結果は、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２００７，７１：１１４８−１１５４に報告されており、その選択性は９０．０％であるが、感度は７６．５％と報告されている。
一方、本発明者の以前の検討によれば、血漿中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＧを用いて診断を行った結果、ＩｇＡ腎症と健常者で感度９５％、特異度８８％であった（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００９，１１９：１６６８−１６７７）。
（２）今回、ＩｇＡ腎症患者１３５名及び健常者７４名の以下のマーカーを用いてロジスティック回帰モデル解析を行った。
（ａ）ＩｇＡ（ＥＬＩＳＡ法）
以下ＥＬＩＳＡプレートはＮｕｎｃ社のＭａｘｉＳｏｒｐプレートを使用することとする。
１）抗ヒトＩｇＡ抗体＜Ｆ（ａｂ’）2 ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＡ （α ｃｈａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）＞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１μｇ／ｍｌに調整し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加して４℃で一晩インキュベートし、プレートをコーティングする。
２）ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加して作成した０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液（ＰＢＳ−Ｔ）を用いてプレートを３回洗浄する。（以下特に記載がなければ、プレートの洗浄にはＰＢＳ−Ｔを使用するものとする）
３）ＰＢＳ−Ｔに１％のｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加して作成した１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔ溶液を２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートしてプレートをブロッキングする。
４）プレートを５回洗浄する。
５）ＰＢＳ−Ｔで至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した酵素標識抗ヒトＩｇＡ抗体＜ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｆ（ａｂ’）2 ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｇｏａｔ ＩｇＧ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＡ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社）＞をＰＢＳ−Ｔを用いて１００００倍に希釈し、１００μＬずつ各ウェルに添加する。３７℃で２時間インキュベートし、酵素標識を行う。
８）プレートを５回洗浄する。
９）発色基質液＜０．０５Ｍのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて作成した、０．４ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤ溶液＞を１００μＬずつ各ウェルに添加して５分間室温で待ち発色する。１規定の硫酸で反応を止める。
10）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。
結果を図１に示す。
（１）血漿中糖鎖不全ＩｇＡ１の測定値を健常者群とＩｇＡ腎症（腎生検による）群とを対比した結果は、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２００７，７１：１１４８−１１５４に報告されており、その選択性は９０．０％であるが、感度は７６．５％と報告されている。
一方、本発明者の以前の検討によれば、血漿中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＧを用いて診断を行った結果、ＩｇＡ腎症と健常者で感度９５％、特異度８８％であった（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００９，１１９：１６６８−１６７７）。
（２）今回、ＩｇＡ腎症患者１３５名及び健常者７４名の以下のマーカーを用いてロジスティック回帰モデル解析を行った。
（ａ）ＩｇＡ（ＥＬＩＳＡ法）
以下ＥＬＩＳＡプレートはＮｕｎｃ社のＭａｘｉＳｏｒｐプレートを使用することとする。
１）抗ヒトＩｇＡ抗体＜Ｆ（ａｂ’）2 ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＡ （α ｃｈａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）＞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１μｇ／ｍｌに調整し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加して４℃で一晩インキュベートし、プレートをコーティングする。
２）ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加して作成した０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液（ＰＢＳ−Ｔ）を用いてプレートを３回洗浄する。（以下特に記載がなければ、プレートの洗浄にはＰＢＳ−Ｔを使用するものとする）
３）ＰＢＳ−Ｔに１％のｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加して作成した１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔ溶液を２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートしてプレートをブロッキングする。
４）プレートを５回洗浄する。
５）ＰＢＳ−Ｔで至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した酵素標識抗ヒトＩｇＡ抗体＜ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｆ（ａｂ’）2 ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｇｏａｔ ＩｇＧ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＡ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社）＞をＰＢＳ−Ｔを用いて１００００倍に希釈し、１００μＬずつ各ウェルに添加する。３７℃で２時間インキュベートし、酵素標識を行う。
８）プレートを５回洗浄する。
９）発色基質液＜０．０５Ｍのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて作成した、０．４ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤ溶液＞を１００μＬずつ各ウェルに添加して５分間室温で待ち発色する。１規定の硫酸で反応を止める。
10）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。
結果を図１に示す。
（ｂ）糖鎖不全ＩｇＡ１（ＥＬＩＳＡ法）
１）抗ヒトＩｇＡ抗体をＰＢＳを用いて２．５μｇ／ｍｌに調整し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加して４℃で一晩インキュベートし、プレートをコーティングする。
２）プレートを３回洗浄する。
３）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔ溶液を２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートし、プレートをブロッキングする。
４）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔで１回洗浄する。
５）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔを用いて至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）を用いて１０ｍＵ／ｍｌに調整し、各ウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で３時間インキュベートする。
８）プレートを７回洗浄する。
９）ビオチンで標識されたＨｅｌｉｘ ａｓｐｅｒｓａ ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎレクチン（ＨＡＡレクチン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１％ＢＳＡで５００倍に希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加して３７℃で２時間インキュベートする。
10）プレートを７回洗浄する。
11）Ｅｘｔｒａ−Ａｖｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１％ＢＳＡで２０００倍に希釈し、１００μＬずつウェルに添加して３７℃で１時間インキュベートする。
12）プレートを５回洗浄する。
13）発色基質液を用いて１５分間発色する。１規定の硫酸で発色を停止する。
14）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。
結果を図２に示す。
１）抗ヒトＩｇＡ抗体をＰＢＳを用いて２．５μｇ／ｍｌに調整し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加して４℃で一晩インキュベートし、プレートをコーティングする。
２）プレートを３回洗浄する。
３）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔ溶液を２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートし、プレートをブロッキングする。
４）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔで１回洗浄する。
５）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔを用いて至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）を用いて１０ｍＵ／ｍｌに調整し、各ウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で３時間インキュベートする。
８）プレートを７回洗浄する。
９）ビオチンで標識されたＨｅｌｉｘ ａｓｐｅｒｓａ ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎレクチン（ＨＡＡレクチン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１％ＢＳＡで５００倍に希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加して３７℃で２時間インキュベートする。
10）プレートを７回洗浄する。
11）Ｅｘｔｒａ−Ａｖｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１％ＢＳＡで２０００倍に希釈し、１００μＬずつウェルに添加して３７℃で１時間インキュベートする。
12）プレートを５回洗浄する。
13）発色基質液を用いて１５分間発色する。１規定の硫酸で発色を停止する。
14）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。
結果を図２に示す。
（ｃ）ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体（ＥＬＩＳＡ法）
１）抗ヒトＩｇＧ抗体＜Ｆ（ａｂ’）2 ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃγ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）＞をＰＢＳを用いて２μｇ／ｍｌに調整し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加して４℃で一晩インキュベートし、プレートをコーティングする。
２）プレートを３回洗浄する。
３）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔを２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートしてプレートをブロッキングする。
４）プレートを５回洗浄する。
５）ＰＢＳ−Ｔで至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）ＨＲＰ酵素標識抗ヒトＩｇＡ抗体をＰＢＳ−Ｔを用いて１００００倍に希釈し、１００μＬずつ各ウェルに添加する。３７℃で２時間インキュベートし、酵素標識を行う。
８）プレートを５回洗浄する。
９）発色基質液を用いて５分間発色する。１規定の硫酸で反応を止める。
10）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。
結果を図３に示す。
１）抗ヒトＩｇＧ抗体＜Ｆ（ａｂ’）2 ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃγ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）＞をＰＢＳを用いて２μｇ／ｍｌに調整し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加して４℃で一晩インキュベートし、プレートをコーティングする。
２）プレートを３回洗浄する。
３）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔを２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートしてプレートをブロッキングする。
４）プレートを５回洗浄する。
５）ＰＢＳ−Ｔで至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）ＨＲＰ酵素標識抗ヒトＩｇＡ抗体をＰＢＳ−Ｔを用いて１００００倍に希釈し、１００μＬずつ各ウェルに添加する。３７℃で２時間インキュベートし、酵素標識を行う。
８）プレートを５回洗浄する。
９）発色基質液を用いて５分間発色する。１規定の硫酸で反応を止める。
10）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。
結果を図３に示す。
（ｄ）糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ（ＥＬＩＳＡ法）
１）糖鎖異常ＩｇＡ１のＦａｂ領域・ヒンジ部をＰＢＳで１．０μｇ／ｍｌに調整し、４℃で一晩インキュベートしプレートをコーティングする。
２）プレートを３回洗浄する。
３）２％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔを２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートしてプレートをブロッキングする。
４）プレートを５回洗浄する。
５）ＰＢＳ−Ｔで至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）Ｆｃ領域特異的マウス抗ヒトＩｇＡ抗体＜ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＩｇＡ（Ｆｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．）＞をＰＢＳ−Ｔで０．５μｇ／ｍｌに調整し、各ウェルに１００μＬずつ添加し３７℃で２時間インキュベートする。
８）プレートを５回洗浄する。
９）ペルオキシダーゼで酵素標識された抗マウスＩｇＧ抗体＜Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）＞をＰＢＳ−Ｔで２００００倍に希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃２時間でインキュベートする。
10）プレートを５回洗浄する。
11）発色基質液を用いて１５分間発色する。１規定の硫酸で反応を停止する。
12）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。
結果を図４に示す。
１）糖鎖異常ＩｇＡ１のＦａｂ領域・ヒンジ部をＰＢＳで１．０μｇ／ｍｌに調整し、４℃で一晩インキュベートしプレートをコーティングする。
２）プレートを３回洗浄する。
３）２％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔを２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートしてプレートをブロッキングする。
４）プレートを５回洗浄する。
５）ＰＢＳ−Ｔで至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）Ｆｃ領域特異的マウス抗ヒトＩｇＡ抗体＜ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＩｇＡ（Ｆｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．）＞をＰＢＳ−Ｔで０．５μｇ／ｍｌに調整し、各ウェルに１００μＬずつ添加し３７℃で２時間インキュベートする。
８）プレートを５回洗浄する。
９）ペルオキシダーゼで酵素標識された抗マウスＩｇＧ抗体＜Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）＞をＰＢＳ−Ｔで２００００倍に希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃２時間でインキュベートする。
10）プレートを５回洗浄する。
11）発色基質液を用いて１５分間発色する。１規定の硫酸で反応を停止する。
12）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。
結果を図４に示す。
（ｅ）血中クレアチニン（酵素法）
病院内での通常診療における検査値を解析に用いた。
（ｆ）尿タンパク（色素比色法（ＰＲ法）法）
病院内での通常診療における検査値を解析に用いた。
（ｇ）尿クレアチニン（酵素法）
病院内での通常診療における検査値を解析に用いた。
（ｈ）血尿（顕微鏡による尿枕査検査）
病院内での通常診療における検査値を解析に用いた。
（ｉ）年齢
年齢は、そのまま解析に用いた。
（ｊ）性別
性別は、男性を１、女性を２として解析に用いた。
病院内での通常診療における検査値を解析に用いた。
（ｆ）尿タンパク（色素比色法（ＰＲ法）法）
病院内での通常診療における検査値を解析に用いた。
（ｇ）尿クレアチニン（酵素法）
病院内での通常診療における検査値を解析に用いた。
（ｈ）血尿（顕微鏡による尿枕査検査）
病院内での通常診療における検査値を解析に用いた。
（ｉ）年齢
年齢は、そのまま解析に用いた。
（ｊ）性別
性別は、男性を１、女性を２として解析に用いた。
用いたロジスティック回帰モデルは、実際には、透析解析ソフトに変数を入力し、自動的に算出されるものであるが、ロジスティックモデルの計算式を以下に示す。
Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｍｏｄｅｌの式
ｌｉｎｅａｒ［Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ］
＝１４．２３５０５４４８０１２１３＋７．１４９１９９４４２００６４３＊［ｌｏｇ１０［ＩｇＡ］］−８．１６３９７５３４２４３７３３＊［ｌｏｇ１０［ＩＣ］］−１１．５００６１９７４３００５＊［ｌｏｇ１０［Ｇｄ−ＩｇＡ１］］−１．６１６２４０６４２４７９３９＊［ｌｏｇ１０［ＩｇＡ＿Ａｂ］］＋０．０９６３５７４２００３１９８２７ ＊年齢＋Ｍａｔｃｈ（性，Ｆ，−０．１６８２０３０９０６８５０７７，Ｍ，０．１６８２０３０９０６８５０７７，．）＋０．９７００７４３２２２０１３１７＊［ＵＰｇ／ｇ・Ｃｒ］＋Ｍａｔｃｈ（［血尿（グレード）］，
１， ０，
２， −２．０６０８０９３４５３３２８，
３， −４．６５８３３９４３０３７７０８，
４， −３．５７２５２０３９５７３２９１，
５， −４．２５５７９７１１２０８７０１，
６， −２３．３６０５６０４１５６５６９，
７， −３．２８８５５５３５２５７９１２，
８， −４．７７１７１３３９５９７０５２，
．）
＋０．８８０１６５２５６５１９１１＊［ｌｏｇ１０［Ｓ−Ｃｒｅ］］
注１：Ｍａｔｃｈ（ｖａｒ，Ａ，ａ，Ｂ，ｂ，Ｃ，ｃ…ｚ）は、変数ｖａｒの値がＡならａ，Ｂならｂ，…，どれでもないのならｚをとる関数
注２：数字は出力リストの中でパラメータ推定値の表の中の推定値の欄の数字。資料とするなら桁数は小数点以下３桁程度にする。
Ｐｒｏｂ［Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ］＝１／（１＋Ｅｘｐ（−［ｌｉｎｅａｒ［Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ］］））
Ｐｒｏｂ［ＩｇＡＮ］＝１／（１＋Ｅｘｐ（［ｌｉｎｅａｒ［Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ］］））
ｌｉｎｅａｒ［Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ］
＝１４．２３５０５４４８０１２１３＋７．１４９１９９４４２００６４３＊［ｌｏｇ１０［ＩｇＡ］］−８．１６３９７５３４２４３７３３＊［ｌｏｇ１０［ＩＣ］］−１１．５００６１９７４３００５＊［ｌｏｇ１０［Ｇｄ−ＩｇＡ１］］−１．６１６２４０６４２４７９３９＊［ｌｏｇ１０［ＩｇＡ＿Ａｂ］］＋０．０９６３５７４２００３１９８２７ ＊年齢＋Ｍａｔｃｈ（性，Ｆ，−０．１６８２０３０９０６８５０７７，Ｍ，０．１６８２０３０９０６８５０７７，．）＋０．９７００７４３２２２０１３１７＊［ＵＰｇ／ｇ・Ｃｒ］＋Ｍａｔｃｈ（［血尿（グレード）］，
１， ０，
２， −２．０６０８０９３４５３３２８，
３， −４．６５８３３９４３０３７７０８，
４， −３．５７２５２０３９５７３２９１，
５， −４．２５５７９７１１２０８７０１，
６， −２３．３６０５６０４１５６５６９，
７， −３．２８８５５５３５２５７９１２，
８， −４．７７１７１３３９５９７０５２，
．）
＋０．８８０１６５２５６５１９１１＊［ｌｏｇ１０［Ｓ−Ｃｒｅ］］
注１：Ｍａｔｃｈ（ｖａｒ，Ａ，ａ，Ｂ，ｂ，Ｃ，ｃ…ｚ）は、変数ｖａｒの値がＡならａ，Ｂならｂ，…，どれでもないのならｚをとる関数
注２：数字は出力リストの中でパラメータ推定値の表の中の推定値の欄の数字。資料とするなら桁数は小数点以下３桁程度にする。
Ｐｒｏｂ［Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ］＝１／（１＋Ｅｘｐ（−［ｌｉｎｅａｒ［Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ］］））
Ｐｒｏｂ［ＩｇＡＮ］＝１／（１＋Ｅｘｐ（［ｌｉｎｅａｒ［Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ］］））
得られた結果を図５に示す。その結果、図５より、選択性８１％、感度９１％の高率でＩｇＡ腎症が判定できた。
Claims (4)
- 少なくとも血中ＩｇＡ値、血中糖鎖不全ＩｇＡ１値、血中ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値、血中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値及び尿中タンパク値の５種の測定値をロジスティック回帰モデルにより解析することを特徴とするＩｇＡ腎症診断のための検査法。
- ロジスティック回帰モデルの変数としてさらに、年齢及び性別を加えて解析する請求項１記載の検査法。
- ロジスティック回帰モデルの変数としてさらに、血中クレアチニン値を加えて解析する請求項１又は２記載の検査法。
- 被験者由来、正常者由来、及びＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者由来の各測定値のロジスティック回帰モデル解析結果を対比することを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の検査法。
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