JP5961551B2

JP5961551B2 - 多糖リポソーム、その調製法及びその使用

Info

Publication number: JP5961551B2
Application number: JP2012502414A
Authority: JP
Inventors: チェン，バンイン; ホアン，リン; ジャン，ウェンジュン
Original assignee: ウーハンダーアンジーイャオヨウシェンゴンス
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2016-08-02
Anticipated expiration: 2029-04-03
Also published as: WO2010111807A1; KR101395858B1; KR20120028868A; JP2012522730A

Description

発明の分野
本発明は、多糖リポソーム、多糖リポソームの調製法及び多糖リポソームの使用に関し、より特定的には、レンチナンリポソームに関する。

発明の背景
多糖類は自然界に広く存在する。多糖類は、生命体の重要な部分であり、生命を維持するために必要な多くの生理的機能と関連する。多糖類は、抗腫瘍効果、抗感染効果、血管心臓障害、糖代謝、老化防止効果などの場面で特別な役割を有し、体の免疫力を向上することもできる。

しかしながら、実際の臨床分野において、多糖類は意図した望ましい薬理活性を達成することはほとんどできない。これは、生体内で影響を受けた病巣に到達する前に、多糖薬物が代謝されてしまい、病巣を標的にしないことが主な理由である。したがって、技術的に緊急の解決を必要とする深刻な問題は、病巣に到達する前に多糖薬物の最小の代謝にする方法、及び、病巣を標的として望ましい臨床効果を得る方法にある。

リポソームの運搬システムは、臨床分野において示されるよい効果のため、多くの利益を引き込む。しかしながら、調製法、特に高いカプセル化率の多糖リポソームの調製法は、よく起こる問題がある。高いカプセル化率と小さい粒子径とを有する多糖リポソームを得ることは非常に難しい。

発明の概要

本発明者は、繰り返し研究した結果、多糖薬物のカプセル化するリポソーム及びその調製方法を得た。さらに、本発明者は、驚くべきことに、本発明の多糖リポソームが高いカプセル化率と小さい粒子径とを有することを見出した。

したがって、本発明は、多糖、リン脂質、コレステロール、界面活性剤及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む出発原料から調製されたリポソームを提供する。

また、本発明は、ａ．リン脂質、コレステロール、界面活性剤及びポリエチレングリコールを含む前記出発原料を有機溶剤に溶解して油相混合物を得るステップと、ｂ．多糖及び界面活性剤を含む出発原料を水または水溶液に溶解して水相混合物を得るステップと、ｃ．前記水相混合物を前記油相混合物に加えて乳化を行うステップと、ｄ．一定温度で減圧された保護ガス下、蒸発により前記溶剤を除去するステップと、ｅ．水または水溶液を加え、その後水浴中で前記生成物を放置（定温放置）するステップとを備える調製方法を提供する。

さらに、本発明は、上述したリポソームを含む組成物を提供する。

さらに、本発明は、リポソーム、または、抗腫瘍薬剤または人間または動物の免疫機能を制限するための薬剤を製造するためのリポソームを含む組成物の使用を提供する。

本発明の多糖リポソームは、１μｍ以下の粒子径で均一な径分布に制御可能である。本発明の多糖リポソームは６５％以上のカプセル化率を有する。本発明の多糖リポソームは、リポソーム中にカプセル化されていない多糖と比較して、投与後に生体内で非常に向上した薬理活性を示す。

図１は、実施例１における本発明のリポソームの粒子径分布を示すグラフである。図２は、実施例１における本発明のリポソームの透過電子顕微鏡の画像である。

本発明の詳細な説明
本出願において開示された化合物、組成物、方法、試薬は、ここで具体的に挙げられたものに限定されず、異なっていてもよい。ここでの具体的な実施形態は、本発明のよりよい理解の目的のために提供されるものであって、本発明の範囲を制限するものではない。

具体的な実施形態を参照して、本発明を詳細に説明する。

ここで用いられる「リポソーム」という用語は、薬理活性材料がカプセル化された脂質二分子層の構造を有する囲まれた小胞を意味する。リポソームは、単層リポソームであっても複数層リポソームであってもよい。本発明のリポソームは、修飾された表面を有するリポソームである。

本発明の多糖は、レンチナン（lentinan）又はアストラガリン（astragalan）である。
もっとも好ましくは、多糖はレンチナンである。

ここで用いられる「リン脂質」という用語は、大豆リン脂質（soybean phosphatide）、レシチン（lecithin）、水素化大豆リン脂質（hydrogenated soybean phosphatide）、水素化レシチン（hydrogenated lecithin）、ホスファチジル・エタノールアミン（phosphatidyl ethanolamine）、ジステアロイルホスファチジルコリン（distearoyl phosphatidylcholine）、ＰＥＧにより修飾されたリン脂質（PEGylated phospholipid）、及びそれらの混合物からなる群より選択されてもよい。

本発明のポリエチレングリコールは、ＰＥＧ８００−５０００、リン脂質修飾ポリエチレングリコール誘導体（phospholipids-modified polyethylene glycol derivatives）及びその混合物からなる群より選択されてもよい。好ましくは、ポリエチレングリコールは、ＰＥＧ１０００−２４００である。より好ましくは、ポリエチレングリコールは、ＰＥＧ２０００である。

本発明の界面活性剤は、デオキシコール酸塩（deoxycholates）、ポロキサマー（poloxamer）、ポリソルベート８０（Tween-80）及びそれらの混合物からなる群より選択されてもよい。好ましくは、界面活性剤は、デオキシコール酸ナトリウム及びデオキシコール酸カリウムのようなデオキシコール酸塩である。

本発明のリポソームを調製するための出発原料は、リポソームを調製するために適したものをさらに含んでいてもよい。本発明の一実施形態において、例えば、出発原料は、リポソームの保存安定性を向上するための抗酸化剤をさらに含む。本発明のリポソームの別の実施形態において、リポソームが、凍結乾燥された粉末注射剤に処方されることが可能になるように、出発原料は、凍結乾燥のための保護剤をさらに含む。

本発明の抗酸化剤は、ビタミンＥ、ビタミンＣ、システイン、メチオニン、亜硫酸水素ナトリウム及びそれらの混合物のような薬学的に許容される抗酸化剤のいずれかであってもよい。

本発明の凍結乾燥のための保護剤は、マンニトール（mannitol）、トレハロース（trehalose）、スクロース（sucrose）、グリシン（glycine）及びその混合物のような薬学的に許容される凍結乾燥のための保護剤のいずれかであってもよい。

本発明の一実施形態において、出発原料は以下の比の成分を含む。１部のレンチナン、３０〜１００部のリン脂質及び２〜２０部のコレステロール（レンチナン１部に対して、リン脂質３０〜１００部、コレステロール２〜２０部）；好ましくは、１部のレンチナン、４０〜９０部のリン脂質及び５〜１５部のコレステロール；より好ましくは、１部のレンチナン、５０〜７０部のリン脂質、５〜１５部のコレステロール。

特別の定めがない限り、ここで用いられる「部」は、重量部である。

本発明の一実施形態において、出発原料は３〜１２部の界面活性剤を含む。本発明の他の実施形態において、出発原料は１〜８部のポリエチレングリコールを含む。

本発明のさらに別の実施形態において、出発原料は、当業者の標準的な知識にしたがって容易に決定できる適量の抗酸化剤を含む。例えば、１〜８部の抗酸化剤を用いることができる。

本発明のリポソームは、対象者に投与するために適したいかなる処方中にも存在可能である。例えば、本発明のリポソームは、注射液または粉末注射剤のような注射、または、タブレット、カプセル、または顆粒のような経口剤に処方されることが可能である。好ましくは、本発明のリポソームは、注射液または粉末注射剤の形態である。

本発明のリポソームは、前記ステップａ〜ｅを備える方法により得られる。

本発明のリポソームが粉末注射剤に処方される場合、本発明のリポソームの製造方法は、ステップｅから得られた溶剤を分離して、凍結乾燥するステップｆをさらに備える。

ステップａにおいて、用いられる溶剤は、クロロホルム、クロロホルム−メタノールまたはジエチルエーテルのような出発原料を溶解するために適したいずれの有機溶剤であってもよい。有機溶剤は、出発原料が溶解可能な量、用いられる。その量は原料に依存し、一般的に当業者による標準的な知識にしたがって容易に決められる。

ステップｂにおいて、用いられる水溶液は、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液または酒石酸塩緩衝液などのような緩衝液、または、生理食塩水のような塩化ナトリウム溶液であってもよい。ステップｂで用いられる水または水溶液は、出発原料が溶解可能な量、用いられる。その量は原料に依存し、一般的には当業者による標準的な知識にしたがって容易に決められる。

ステップｃにおいて、本発明の調製方法の乳化は、超音波処理または高圧での実施により達成され得る。乳化は、一般的には、１０℃以下のような低温で実施される。乳化時間は、粒子径に依存するが、当業者により既知の方法を用いて適切に決定され得る。例えば、乳化時間は、３〜１０分であってもよい。好ましくは、本発明の超音波処理は、超音波バッチ処理であることが好ましく、高圧での乳化は、高圧での循環乳化であることが好ましい。

本発明の調製方法のステップｄにおいて、保護ガスは、窒素を含む不活性ガスであってもよい。

本発明の調製方法のステップｄにおいて、回転蒸発装置は適切な温度で実施されてもよく、３５〜４５℃の範囲内の一定温度で行われることが好ましい。

本発明の調製方法のステップｅにおいて、放置は、水浴中で３５〜５０℃の範囲の温度で実行されることが好ましく、より好ましくは４０℃である。

本発明の調製方法のステップｅにおいて、放置は１〜２時間実施されることが好ましい。

本発明の調製方法のステップｅにおいて、水溶液は、塩化ナトリウム溶液、または、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、炭酸水素ナトリウム塩緩衝液、酒石酸塩緩衝液などのような緩衝液であってもよい。

好ましくは、ステップｂにおける反応環境のｐＨ値は、ステップｅと異なる。より好ましくは、ステップｂにおける反応環境の酸性度または塩基性度は、ステップｅと反対である。反対の酸性度または塩基性度は、ステップｂ及びｅにおける反応環境が酸性であり、他方が塩基性である場合を意味する。特に好ましくは、ステップｂにおける反応環境は塩基性であり、ステップｅにおける反応環境は酸性である。

本発明のリポソームの一実施形態において、ステップａにおける出発原料は、抗酸化剤を含む。

本発明のリポソームの他の実施形態において、ステップｅにおける水溶液は凍結乾燥のための保護剤を含む。凍結乾燥のための保護剤は、当業者による標準的な知識にしたがって容易に決められる。

本発明の多糖リポソームは、肝臓、骨、脊髄、腫瘍及び炎症組織のような特定組織または細胞を特に対象とし、循環を引き延ばす。

本発明の多糖リポソームは、肝臓、卵巣、腸、肺、胸、前立腺、膵臓、腎臓、胃、子宮内膜、食道、頭、首、悪性胸水、腹水腫瘍などのような腫瘍を処置するための補助的療法、または腫瘍のための補助的療法として用いることができる。本発明の多糖リポソームは、免疫調節効果も有する。例えば、肺炎、リウマチ性関節炎またはエイズで苦しむ患者の免疫を向上するために用いることもできる。多糖をそのまま投与する場合と比較して、リポソームにカプセル化された形態で投与された場合に、多糖は大きく向上した効能を示す。

本発明の多糖リポソームは、高いカプセル化率を有する。本発明の多糖リポソームのカプセル化率は、６５％以上である。カプセル化率は、７０％以上が好ましく、８０％以上であることがより好ましい。高いカプセル化率に加えて、本発明の多糖リポソームは、小さい粒子径を有する。リポソームの粒子径は、略１μｍ以下であり、１００〜５００ｎｍ以下であることが好ましく、１４０〜３００ｎｍであることがより好ましい。

ここでのリポソームのカプセル化率は、リポソームを製造するための出発原料における多糖の全量に対するリポソームにおいてカプセル化された多糖の量の割合を意味し、割合は重量パーセントで表される。

医薬組成物は、本発明のリポソームから調製され、以下の薬学的に有効な成分と組み合わせられる。
細胞毒性剤、例えば、ブレオマイシン(Bleomycin)、ドキソルビシン（Doxorubicin）、マイトマイシン(Mitomycin)、カルムスチン(Carmustin)、カルボプラチン（Carboplatin）、シスプラチン（Cisplatin）、イプロプラチン(Iproplatin)、シクロホスファミド（Cyclophophamide）、ゲムシタビン（Gemcitabine）、ドセタキセル(Docetaxel)、エトポシド（Etoposide）、フルオロウラシル（Fluorouracil）、メルファラン（Melphalan）、メトトレキサート(Methotrexate)、ビノレルビン（Vinorelbine）、ビンクリスチン（Vincristine）、パクリタキセル（Paclitaxel）などのような抗腫瘍薬剤、及び、アミノグルテチミド（Aminoglutethinmide）、アナストロゾール（Anastrozole）、ビカルタミド(Bicalutamide)、イリノテカン(Irinotecan)、リツキシマブ（Rituximab）、タモキシフェン(Tamoxifen)、トラスツブマブ（Trastuzumab）などのようなホルモンまたは抗ホルモン、
抗炎剤、例えば、ガンシクロビル（Ganciclovir）、リバビリン（Ribavirin）、ビダラビン（Vidarabine）、ファムシクロビル（Famciclovir）、ラミブジン（Lamivudine）、アバカビル（Abacavir）、ネビラピン（Nevirapine）、インジナビル（Indinavir）などのような抗ウイルス剤、アスピリン(Aspirin)、イブプロフェン（Ibuprofen）、インドメタシン(Indometacin)、ピロキシカム（Piroxican）、ニメスリド（Nimesulide）、グルコサミン（Glucosamine）などのような抗感染症薬剤、及び、
免疫調節薬剤、例えばインターフェロン薬剤（interferon agent）またはインターロイキン剤（interleukin agent）のような免疫調節薬剤。

本発明のリポソーム組成物は、充填剤、吸着剤、潤湿剤、接着剤、潤滑剤、着色剤、芳香薬、安定剤、防腐剤、バッファー、崩壊剤、塗布材料、拡散剤、沈殿防止剤などのような医薬品添加剤及び補助剤のように、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて用いられることもできる。

本発明の多糖リポソームまたは組成物は、様々なルートにより対象の目標領域に運ばれることが可能である。例えば、リポソームまたは組成物は、静脈注射、筋肉注射、腹腔内注射及び皮下注射のように、経口投与または注射を介して適した形態で処理されるためにその場で標的とされ、改善された免疫調節性効果または抗腫瘍効果を得る。

本発明のリポソームは、治療効果を得るために、１種またはそれ以上の例えば上述したような他の薬学的活性剤と組み合わせて投与されることもできる。

本発明の実施形態は、以下の実施例を参照してさらに説明される。本実施例で用いられる化合物及び薬剤は市販の、または、その技術分野における既知の標準的な方法を用いて当業者により調製されることが可能であり、本実験で用いられる装置も、市販のものである。

実施例１
リポソーム１の出発原料の処方

リポソーム１の調製：
８．０ｇの大豆リン脂質、１．０ｇのコレステロール、０．２ｇのＰＥＧ２０００及び０．２ｇのビタミンＥを、撹拌しながら９００ｍｌのクロロホルムに溶解し、油相混合物を得た。０．１ｇの注射可能なグレードのレンチナン及び０．９ｇのデオキシコール酸ナトリウムを３００ｍｌの注射用水に添加し、レンチナンが溶解するまで適量の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を添加した。０．１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液によって溶液をｐＨ７．０〜８．０に調製し、油相混合物を得た。氷水浴中の油相混合物に水相混合物をゆっくり添加し、その後にバッチ乳化超音波を５分間実施し、均質な乳白色のＷ／Ｏエマルジョンを得た。回転蒸発装置により減圧下４０℃で窒素の保護下で溶剤を除去し、淡黄色の濃厚な乳液状の物質を生じた。２００ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液を添加し、その後、結果として生じる混合物を４０℃で１時間放置し、リポソーム１の溶液を得た。リポソーム溶液は、１００アリコットのレンチナンリポソームの注射液に分割する前に、ミリポアフィルターを介して殺菌された。

リポソーム１の評価：
（１）カプセル化率
０．２ｍｌのリポソーム１を１０ｍｌのテーパー状の遠心管に添加し、０．２ｍｌのプロテイン（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。それらを均一に振動し、３分間放置し、その後、合計量が５ｍｌに達するように０．０５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を添加した。結果として生じる混合物を、室温の下３０分間、３０００ｒ／ｍｉｎで遠心分離した。２ｍｌの上澄み液を取り除き、４ｍｌの０．２％アンスロン硫酸溶液（０．２ｇのアンスロン及び１００ｍｌの濃硫酸から調製された）を添加した。結果として生じる混合物を均一に振動させ、沸騰水浴中で６分間加熱し、氷水浴で２分間冷却し、１０分間室温で放置し、その後、吸光度を測定した。それに加えて、対象群として、一定重量を有するようにＰ₂Ｏ₅で乾燥された適正な量のレンチナンを、正確に秤量し、粉砕により少量の０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液に溶解させ、水で希釈して、２０μｇ／ｍｌの濃度の溶液を作製した。吸光度を上述した方法と同様に決定した。リポソームにカプセル化されなかったレンチナンの量を算出した。カプセル化率を以下の式により算出した。
カプセル化率（％）＝（１−カプセル化されなかったレンチナンの量／レンチナンの全量）×１００％
サンプルのレンチナンのカプセル化率は８２．８％と決定された。

（２）粒子径及び顕微鏡的形態
リポソーム１は、２００〜４００ｎｍの範囲における粒子径、及び、レーザ粒子径分析器（DELSA 440S laser particle size analyzer, Beckman, USA）（図１）を用いることによって３１６ｎｍの平均径を有していることが決定された。リポソーム１は、透過電子顕微鏡（Tecnai G212 transmission electron microscope, FEI, Holland）(図２)の下、球形の外観及びはっきりと見える輪郭を有することが観察された。

実施例２
リポソーム２の出発原料の処方：

調製：
８．０ｇの大豆リン脂質、１．０ｇのコレステロール、０．２ｇのＰＥＧ２０００及び０．２ｇのビタミンＥを撹拌しながら９００ｍｌのクロロホルムに溶解し、油相混合物を得た。０．１ｇの注射可能なグレードのレンチナン及び０．９ｇのデオキシコール酸ナトリウムを３００ｍｌの注射用水に添加し、レンチナンが溶解するまで適量の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を添加した。０．１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液によって溶液をＰＨ７．０〜８．０に調製し、油相混合物を得た。氷水浴中の油相混合物に水相混合物をゆっくり添加し、その後にバッチ乳化超音波を５分間実施し、均質な乳白色のＷ／Ｏエマルジョンを得た。回転蒸発装置により減圧下４０℃で窒素の保護下で溶剤を除去し、淡黄色の濃厚な乳液状の物質を生じた。ｐＨが６．０〜６．５であり、２００ｍｌのリン脂質バッファー溶液中の２％のマンニトールを添加し、その後、結果として生じる混合物を４０℃で１時間放置し、リポソーム２の溶液を得た。
リポソーム溶液を、１００アリコットに分割する前に、ミリポアフィルターを介して殺菌し、２時間−５０℃で予め凍結させた。温度を８時間で−６℃ずつ徐々に高め、その後、１２時間かけて３０℃まで徐々に高め、淡黄色の固まり、つまりリポソーム２の粉末注射剤を得た。

生成された粉末注射剤を再構成した後、実施例１の方法によれば、リポソーム２は、８４．３％のカプセル化率を有し、３１８ｎｍの平均粒子径を有することが測定された。リポソーム２は、透過電子顕微鏡下で、球形の外形及びはっきりと見える輪郭を有することが観察された。

実施例３
リポソーム３の出発原料の処方：

調製：
６．１ｇの大豆リン脂質、０．８ｇのコレステロール、０．２ｇのＰＥＧ１０００及び０．２ｇのビタミンＥを撹拌しながら９００ｍｌのクロロホルムに溶解し、油相混合物を得た。０．１ｇの注射可能なグレードのレンチナン及び０．５ｇのデオキシコール酸ナトリウムを３００ｍｌの注射用水に添加し、レンチナンが溶解するまで適量の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を添加した。０．１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液によって溶液をｐＨ７．０〜８．０に調製し、油相混合物を得た。水相混合物は、氷水浴中で、油相混合物にゆっくり添加され、その後にバッチ乳化超音波を６分間実施し、均質な乳白色のＷ／Ｏエマルジョンを得た。回転蒸発装置により減圧下４０℃で窒素の保護下で溶剤を除去し、淡黄色の濃厚な乳液状の物質を生じた。ｐＨが６．０〜６．５であり、２００ｍｌのリン脂質バッファー溶液を添加し、その後、結果として生じる混合物を４０℃で１．５時間放置し、リポソーム３の溶液を得た。
実施例１の方法によれば、レンチナンのカプセル化率は８２．２％であり、平均粒子径は３０２ｎｍであることが測定された。リポソーム３は、透過電子顕微鏡下で、球形の外形及びはっきりと見える輪郭を有することが観察された。

実施例４
リポソーム４の出発原料の処方：

調製：
５．２ｇの大豆リン脂質、０．７ｇのコレステロール、０．２ｇのＰＥＧ２０００及び０．２ｇのビタミンＥを撹拌しながら９００ｍｌのクロロホルムに溶解し、油相混合物を得た。０．１ｇの注射可能なグレードのレンチナン及び０．７ｇのデオキシコール酸ナトリウムを３００ｍｌの注射用水に添加し、レンチナンが溶解するまで適量の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を添加した。０．１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液によってｐＨ７．０〜８．０に溶液を調製し、油相混合物を得た。氷水浴中での油相混合物に水相混合物をゆっくり添加し、その後にバッチ乳化超音波を６分間実施し、均質な乳白色のＷ／Ｏエマルジョンを得た。回転蒸発装置により減圧下４０℃で窒素の保護下で溶剤を除去し、淡黄色の濃厚な乳液状の物質を生じた。２００ｍｌの２％マンニトールを添加し、その後、結果として生じる混合物を４０℃で１．５時間放置し、ミリポアフィルターを介して殺菌し、リポソーム４の溶液を得た。リポソーム４の粉末注射剤を実施例２の方法にしたがって調製した。再構成の後、実施例１の方法によれば、レンチナンのカプセル化率は７５．１％であり、平均粒子径は２９７ｎｍであることが測定された。リポソーム４は、透過電子顕微鏡下で、球形の外形及びはっきりと見える輪郭を有することが観察された。

実施例５
リポソーム５の出発原料の処方：

調製：
１０．０ｇの大豆リン脂質、１．５ｇのコレステロール及び０．３ｇのＰＥＧ２０００を撹拌しながら９００ｍｌのクロロホルムに溶解し、油相混合物を得た。０．２ｇのアストラガリン及び１．０ｇのデオキシコール酸ナトリウムを撹拌しながら３００ｍｌの注射用水に溶解し、水相混合物を得た。氷水浴中の油相混合物に水相混合物をゆっくり添加し、その後にバッチ乳化超音波を６分間実施し、均質な乳白色のＷ／Ｏエマルジョンを得た。回転蒸発装置により減圧下４０℃で窒素の保護下で溶剤を除去し、淡黄色の濃厚な乳液状の材料を生じた。２００ｍｌの注射用水を添加し、その後、結果として生じる混合物を４０℃で１．５時間放置し、ミリポアフィルターを介して殺菌し、１００アリコットのアストラガリンの注射液に分割した。実施例１の方法によれば、アストラガリンのカプセル化率は７５．２％で、平均粒子径は２９３ｎｍであることが測定された。リポソーム５は、透過電子顕微鏡下で、球形の外形及びはっきりと見える輪郭を有することが観察された。

実施例６
リポソーム６の出発原料の処方：

調製：
１０．０ｇの大豆リン脂質、１．５ｇのコレステロール及び０．７ｇのＰＥＧ２０００を撹拌しながら９００ｍｌのクロロホルムに溶解し、油相混合物を得た。０．２ｇのアストラガリン及び０．９ｇのデオキシコール酸ナトリウムを撹拌しながら３００ｍｌの注射用水に溶解し、水相混合物を得た。氷水浴中の油相混合物に水相混合物をゆっくり添加し、その後にバッチ乳化超音波を６分間実施し、均質な乳白色のＷ／Ｏエマルジョンを得た。回転蒸発装置により減圧下４０℃で窒素の保護下で溶剤を除去し、淡黄色の濃厚な乳液状の物質を生じた。ｐＨが６．５で、２００ｍｌのリン脂質バッファー溶液中の２％のマンニトールを添加し、その後、結果として生じる混合物を４０℃で１．５時間放置し、リポソーム６の溶液を得た。
リポソーム６の粉末注射剤を実施例２の方法にしたがって調製した。リポソームの再構成の後、実施例１の方法によれば、アストラガリンのカプセル化率は８４．５％であり、平均粒子径は３０８ｎｍであることが測定された。リポソーム６は、透過電子顕微鏡下で、球形の外形及びはっきりと見える輪郭を有することが観察された。

実施例７
リポソーム７の出発原料の処方：

調製：
５．０ｇの大豆リン脂質、０．６ｇのコレステロール、０．２ｇのＰＥＧ２０００及び０．２ｇのビタミンＥを撹拌しながら９００ｍｌのクロロホルムに溶解し、油相混合物を得た。０．１ｇの注射可能なグレードのレンチナン及び０．４ｇのポリソルベート８０を３００ｍｌの注射用水に添加し、レンチナンが溶解するまで適量の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を添加した。０．１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液によってｐＨ７．０〜８．０に溶液を調製し、油相混合物を得た。氷水浴中の油相混合物に水相混合物をゆっくり添加し、その後にバッチ乳化超音波を６分間実施し、均質な乳白色のＷ／Ｏエマルジョンを得た。回転蒸発装置により減圧下４０℃で窒素の保護下で溶剤を除去し、淡黄色の濃厚な乳液状の物質を生じた。ｐＨが６．０〜６．５で、２００ｍｌのリン脂質バッファー溶液を添加し、その後、結果として生じる混合物を４０℃で１．５時間放置し、リポソーム７の溶液を得た。実施例１の方法によれば、レンチナンのカプセル化率は８０．２％であり、平均粒子径は２９３ｎｍであることが測定された。リポソーム７は、透過電子顕微鏡下で、球形の外形及びはっきりと見える輪郭を有することが観察された。

実施例８
リポソーム８の出発原料の処方：

調製：
６．１ｇの大豆リン脂質、１．５ｇのコレステロール、０．２ｇのＰＥＧ２０００及び０．２ｇのビタミンＥを撹拌しながら９００ｍｌのクロロホルムに溶解し、油相混合物を得た。０．１ｇの注射可能なグレードのレンチナン及び０．４ｇのポリソルベート８０を３００ｍｌの注射用水に添加し、レンチナンが溶解するまで適量の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液に添加した。０．１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液によって溶液をｐＨ７．０〜８．０に調製し、油相混合物を得た。氷水浴中の油相混合物に水相混合物をゆっくり添加し、その後にバッチ乳化超音波を６分間実施し、均質な乳白色のＷ／Ｏエマルジョンを得た。回転蒸発装置により減圧下４０℃で窒素の保護下で溶剤を除去し、淡黄色の濃厚な乳液状の物質を生じた。ｐＨが６．０〜６．５で、２００ｍｌのリン脂質バッファー溶液中の２％のマンニトールを添加し、その後、結果として生じる混合物を４０℃で１．５時間放置し、リポソーム８の溶液を得た。リポソーム８の粉末注射剤を実施例２の方法にしたがって調製した。リポソームの再構成の後、実施例１の方法によれば、レンチナンのカプセル化率は８２．１％であり、平均粒子径は３０５ｎｍであることが測定された。リポソーム８は、透過電子顕微鏡下で、球形の外形及びはっきりと見える輪郭を有することが観察された。

実施例９
リポソーム９の出発原料の処方：

調製：
７．０ｇの大豆リン脂質、０．８ｇのコレステロール、０．６ｇのＰＥＧ１０００及び０．２ｇのビタミンＥを撹拌しながら９００ｍｌのクロロホルムに溶解し、油相混合物を得た。０．１ｇの注射可能なグレードのレンチナン及び０．５ｇのデオキシコール酸ナトリウム（deoxysodium cholate）を撹拌しながら３００ｍｌの注射用水に溶解し、レンチナンが溶解するまで適量の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を添加した。０．１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液によって溶液をｐＨ７．０〜８．０に調製し、水相混合物を得た。氷水浴中の油相混合物に水相混合物をゆっくり添加し、その後にバッチ乳化超音波を約６分間実施し、均質な乳白色のＷ／Ｏエマルジョンを得た。回転蒸発装置により減圧下３５℃で窒素の保護下で溶剤を除去され、淡黄色の濃厚な乳液状の物質を生じた。ｐＨが６．０〜６．５で、２００ｍｌのリン脂質バッファー溶液を添加し、その後、結果として生じる混合物を４０℃で１．５時間放置し、リポソーム９の溶液を得た。実施例１の方法によれば、レンチナンのカプセル化率は７５．０％であり、平均粒子径は３１２ｎｍであることが測定された。リポソーム９は、透過電子顕微鏡下で、球形の外形及びはっきりと見える輪郭を有することが観察された。

実施例１０
本発明の多糖リポソームの生体内の抗腫瘍及び免疫調節性効果を、上記の実施例のように調製されたレンチナンリポソーム（リポソーム９）を用いて実験した。治療効果は、マイクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）及びリンパ球の活性を評価することで測定され、腫瘍阻止率も測定した。

マウス腫瘍モデル：
（華中科技大学の同済医科大学の動物研究センターにより提供された）２０〜２４ｇの重さの健康で成熟したオスの昆明のマウスを用いた。マウスは、（武漢大学の医学部の教育及び研究部により快く提供された）Ｈ₂₂肝癌細胞が接種され、少なくとも３代継代された。腹水を継代されたマウスの腹腔から取り出し、ＲＰＭＩ１６４０培養液（ギブコ）で２×１０⁷／ｍｌの細胞濃度に希釈した。腫瘍に接種するために１回０．２ｍｌ／マウスで、希釈液をマウスの右肢下に皮下注射した。モデルのマウスにおいて、腫瘍は、０．４ｇの平均重量で、１．１３ｇから３．１ｇの範囲内であった。

グループ分け及び投与：
試験される薬品及びその量によって、腫瘍モデルグループ、シクロホスファミドグループ、レンチナン＋シクロホスファミドグループ、及びレンチナンリポソームシクロホスファミドグループにマウスをグループ分けした。グループ分けの情報を、下記の表１に具体的に示す。

肝臓マクロファージの食作用活性、脾臓リンパ球の形質転換活性及びＮＫ細胞の活性において、動物は、Ｈ₂₂肝癌細胞の接種２日後に、上述の４のグループにランダムにグループ分けされ、薬品は１５日間腹腔内に投与された。腫瘍阻害率の分析において、動物は、Ｈ₂₂肝癌細胞の接種４日後に、上述の４のグループにランダムにグループ分けされ、薬品は１５日間腹腔内に投与された。

（１）マクロファージ活性の分析
マウスは最終投薬から２４時間後に犠牲になった。肝細胞の停止を、以下のように調製した。マウスを７５％エタノールにしばらく浸け、肝臓を殺菌して取り除き、３分間D-Hank's溶液で洗浄し、秤量した。同じグループの動物の肝臓を、ＲＰＭＩ１６４０培養液（ギブコ）に入れ、ホモジネートした。細胞の最終濃度を２×１０⁵／ｍｌに調製した。

得られた肝細胞の懸濁液は、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ入れた。プレートは、ＣＯ₂培養器中で２４時間培養し、その後、ＲＰＭＩ１６４０培養液（ギブコ）で３度洗浄し、粘着性のマクロファージの短分子層を得た。その後、通常生理食塩水溶液における０．０７２％のニュートラルレッド（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）を、１０μ／ｗｅｌｌの量で添加した。細胞を４時間培養し、上澄み液を廃棄した。酢酸エタノール溶液（１：１）を１５０μｍ／ｗｅｌｌの量、添加した。結晶を完全に溶解させるために、９６ｗｅｌｌのマイクロプレートを撹拌器で１０分間振動した。その後、吸光度をプレートリーダー（ZS-3, Xinfeng Mechanical-Electronic Technology Inc., 北京、中国）において各ウエル４９２ｎｍで測定し、マクロファージの食作用活性（ＯＤ値）を算出した。その結果をＳＰＳＳ統計ソフトウエアを用いることにより分析した。
群間の比較は、ｔ検定により行った。その結果を下記の表２に示した。

注：腫瘍モデルグループと比べて、^**p < 0.01；レンチナン＋シクロホスファミドグループと比べて^##p < 0.01

結果を以下のように示す。
シクロホスファミドグループと腫瘍モデルグループとの間のマクロファージ活性の差は小さく、このことから、シクロホスファミドは、担癌マウスの肝臓マクロファージの食作用活性の効果が小さいことが示唆された。
レンチナン＋シクロホスファミドグループとシクロホスファミドグループとの間のマクロファージ活性の差は小さく、このことから、レンチナンも、担癌マウスのマクロファージの食作用活性の効果が小さいことが示唆された。
マクロファージの食作用活性は、レンチナンリポソーム＋シクロホスファミドグループにおけるレンチナンにおいて、腫瘍モデルグループまたはシクロホスファミドグループ（ｐ＜０．０１）を有するものと比較して、大幅に向上されており、このことから、レンチナンリポソームは、担癌マウスのマクロファージの食作用活性を大幅に向上させることが示唆された。
レンチナンリポソーム＋シクロホスファミドグループにおける担癌マウスのマクロファージの食作用活性も、同一用量（ｐ＜０．０１）のレンチナン＋シクロホスファミドグループに比べて大幅に向上させた。
したがって、リポソームの形態のレンチナンは、肝臓のマクロファージの活性を大幅に向上させることが示された。

（２）ナチュラルキラー細胞分析
マウスは最終投薬から２４時間後に犠牲になった。肝細胞の停止は、以下のように調製された。マウスを７５％エタノールにしばらく浸け、肝臓を殺菌して取り除き、３分間D-Hank's溶液で洗浄し、秤量した。同じグループの動物の肝臓を、ＲＰＭＩ１６４０培養液（ギブコ）に入れられ、１：１の比重量でホモジネートした。細胞の最終濃度を２×１０⁶／ｍｌに調製した。

１００ｍｌのエフェクター細胞（上述した方法で調製された脾臓細胞）及び１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培養液（ギブコ）を９６ｗｅｌｌマイクロプレートのＥｗｅｌｌに入れ、１００μｍのターゲット細胞（K562 cells, 華中科技大学の同済医科大学の研究センターにより提供された）及び１００μｍＲＰＭＩ１６４０培養液（ギブコ）をＴｗｅｌｌに入れ、１００ｍｌの効果細胞及び１００ｍｌのターゲット細胞をＥ＋Ｔｗｅｌｌに入れ、それぞれ３つ作製した。プレートはＣＯ₂培養器中で３７℃２４時間培養した。培養終了前４時間、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）を２０μｌ／ｗｅｌｌの量、添加し、細胞をさらに４時間培養した。上澄み液を捨て、ＤＭＳＯを１５０μｌ／ｗｅｌｌの量、添加した。結晶を完全に溶解させるために、９６ｗｅｌｌのマイクロプレートを撹拌器で１０分間振動した。その後、ブランク溶剤としてＤＭＳＯを用い、それぞれの細胞の吸光度を４９２ｎｍで測定した。その結果を以下のように算出した。ＮＫ細胞の殺傷率＝［１−（Ｄ_E+T−Ｄ_T）］×１００％。その結果を、ＳＰＳＳ統計ソフトウエアを用いることにより分析した。
群間の比較は、ｔ検定により行った。その結果を下記の表３に示した。

注：シクロホスファミドグループと比べて、^*p < 0.05；レンチナン＋シクロホスファミドグループと比べて^#p < 0.05

結果を以下のように示す。
シクロホスファミドグループのＮＫ細胞の殺傷率は、腫瘍モデルグループ（Ｐ＜０．０５）と比較して非常に小さく、このことから、シクロホスファミドは、担癌マウスのＮＫ細胞の殺傷率への抑制効果を有することが示唆された。
レンチナン＋シクロホスファミドグループのＮＫ細胞殺傷率は、腫瘍モデルグループのそれと比較して非常に小さく、シクロホスファミドグループのそれと比較して統計学上わずかに増加しており、このことから、シクロホスファミドと組み合わせたレンチナンは、担癌マウスのＮＫ細胞へのシクロホスファミドの有毒性及び副作用を部分的に殺傷することが示唆された。
レンチナンリポソーム＋シクロホスファミドグループのＮＫ細胞の殺傷率は、腫瘍モデルグループまたはシクロホスファミドグループ（Ｐ＜０．０５）のいずれとも比較して、大幅に向上されており、このことから、シクロホスファミドと組み合わせたレンチナンは、担癌マウスのＮＫ細胞へのシクロホスファミドの有毒性及び副作用を部分的に殺傷するだけでなく、担癌マウスのＮＫ細胞の殺傷率を大幅に増加することが示唆された。
レンチナンリポソーム＋シクロホスファミドグループのＮＫ細胞の殺傷率も、同一用量（Ｐ＜０．０５）のレンチナン＋シクロホスファミドグループに比べて大幅に向上され、このことから、レンチナンと比較して、レンチナンリポソームは、担癌マウスのＮＫ細胞の殺傷率を大幅に増加することが示唆された。

（３）リンパ球増殖分析
脾臓細胞の懸濁液を、上述したように調製した。懸濁液を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ入れた。対照用ウエル及び試験用ウエルを、試験される個々の薬品ごとにセットした。１００μｌ（１２．５μｇ／ｍｌ）のＰＨＡ−Ｐ（Ｓｉｇｍａ）を、それぞれの試験用ウエルに入れ、１００μｌのＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）をそれぞれの対照用ウエルに入れた。５％ＣＯ₂中３７℃２４時間、プレートを培養した。その次のステップは、上記（２）で述べた。その結果を、以下のように算出した。分解率＝（ＯＤ_{test well}−ＯＤ_{control well}）／ＯＤ_{control well}×１００％。その結果は、ＳＰＳＳ統計ソフトウエアを用いることにより分析した。
群間の比較は、ｔ検定により行った。その結果を下記の表４に示された。

結果を以下のように示す。
シクロホスファミドグループの脾臓リンパ球の増殖率は、腫瘍モデルグループ（Ｐ＜０．０５）のそれと比較して非常に小さく、このことから、シクロホスファミドは、担癌マウスの脾臓リンパ球の増殖率への抑制効果を有することが示唆された。
レンチナン＋シクロホスファミドグループの増殖率は、腫瘍モデルグループのそれからわずかに変化しているが、シクロホスファミドグループのそれと比較して増加しており、このことから、シクロホスファミドと組み合わせたレンチナンは、担癌マウスのリンパ球へのシクロホスファミドの有毒性及び副作用を減少することが示唆された。
レンチナンリポソーム＋シクロホスファミドグループのリンパ球の増殖率は、腫瘍モデルグループまたはシクロホスファミドグループ（Ｐ＜０．０５）のいずれとも比較して、大幅に増加しており、このことから、シクロホスファミドと組み合わせたレンチナンは、担癌マウスのリンパ球へのシクロホスファミドの有毒性及び副作用を部分的に殺傷するだけでなく、担癌マウスのリンパ球の増殖率を大幅に増加することが示唆された。
レンチナンリポソーム＋シクロホスファミドグループのリンパ球の増殖率も、同一用量（Ｐ＜０．０５）のレンチナン＋シクロホスファミドグループに比べて大幅に増加され、このことから、レンチナンと比較して、レンチナンリポソームは、担癌マウスの脾臓リンパ球の増殖率を大幅に増加することが示唆された。

（４）腫瘍抑制率の分析
最終投薬から２４時間後にマウスは犠牲になった。腫瘍をマウスから分離し、秤量した。そして、腫瘍抑制率を算出した。その結果は、ＳＰＳＳ統計ソフトウエアを用いることにより分析した。
群間の比較は、ｔ検定により行った。その結果を下記の表５に示した。

注：シクロホスファミドグループと比べて、^*p < 0.05

抗腫瘍薬剤の薬理学のガイドラインにおける治療効果の評価の基準にしたがうと、効果のない基準は腫瘍抑制率が４０％以下で、効果のある基準は腫瘍抑制率が４０％以上で、統計学上（腫瘍モデルグループと比べて）ｐ＜０．０５である。

結果を以下のように示す。
レンチナン＋シクロホスファミドグループの腫瘍抑制率は、シクロホスファミドグループのそれと比較して増加しており、このことから、レンチナンは、シクロホスファミドの腫瘍抑制効果を向上させるが、その差は統計学上大きくないことが示唆された。
レンチナンリポソーム＋シクロホスファミドグループの腫瘍抑制率は、シクロホスファミドグループ（ｐ＜０．０５）と比較して大幅に増加しており、このことから、レンチナンリポソームは、シクロホスファミドの腫瘍抑制効果を大幅に向上させることが示唆された。
したがって、レンチナンリポソームは、レンチナンより優れた、大きな抗腫瘍活性を有することが示されている。

Claims

リポソームにおいて、前記リポソームの製造のための出発原料は、レンチナン又はアストラガランである多糖、リン脂質、コレステロール及び界面活性剤を含み、以下の方法で調整されることを特徴とする、リポソーム。

ａ．リン脂質、コレステロール及びポリエチレングリコールを含む前記出発原料を有機溶剤に溶解して油相混合物を得るステップと、
ｂ．多糖及び界面活性剤を含む前記出発原料を水または水溶液に溶解して水相混合物を得るステップと、
ｃ．前記水相混合物を前記油相混合物に添加して乳化を行うステップと、
ｄ．一定温度で減圧された保護ガス下、蒸発により前記溶剤を除去するステップと、
ｅ．水または水溶液を加え、その後水浴中でその生成物を放置するステップとを備える、
方法。
前記リン脂質は、大豆リン脂質、レシチン、水素化大豆リン脂質、水素化レシチン、ホスファチジル・エタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ＰＥＧにより修飾されたリン脂質、またはそれらの混合物であることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
前記界面活性剤は、デオキシコール酸塩、ポロキサマー、ポリソルベート８０またはそれらの混合物であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のリポソーム。
前記界面活性剤は、デオキシコール酸ナトリウムまたはデオキシコール酸カリウムであることを特徴とする、請求項３に記載のリポソーム。
前記ポリエチレングリコールは、ＰＥＧ８００−５０００、リン脂質修飾ポリエチレングリコール誘導体及びその混合物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
前記ポリエチレングリコールは、ＰＥＧ１０００−２４００であることを特徴とする、請求項５に記載のリポソーム。
前記ポリエチレングリコールは、ＰＥＧ２０００であることを特徴とする、請求項６に記載のリポソーム。
前記出発原料は、抗酸化剤及び／または凍結乾燥のための保護剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
前記出発原料は、１部の多糖、３０〜１００部のリン脂質、２〜２０部のコレステロール、３〜１２部の界面活性剤及び１〜８部のポリエチレングリコールを含むことを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
前記出発原料は、１重量部のレンチナン、４０〜９０重量部のリン脂質及び５〜１５重量部のコレステロールを含むことを特徴とする、請求項９に記載のリポソーム。
前記出発原料は、１部のレンチナン、５０〜７０部のリン脂質、及び５〜１５部のコレステロールを含むことを特徴とする、請求項９に記載のリポソーム。
１〜８部の抗酸化剤を更に含むことを特徴とする、請求項１０に記載のリポソーム。
前記リポソームのカプセル化率は、６５％以上であることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
前記リポソームのカプセル化率は、７０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
前記リポソームのカプセル化率は、８０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
前記リポソームは、１μｍ以下の粒子径を有することを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
前記リポソームは、１００〜５００ｎｍの粒子径を有することを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
前記リポソームは、１４０〜３００ｎｍの粒子径を有することを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
前記リポソームは、注射液または粉末注射剤の形態である、請求項１に記載のリポソーム。
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のリポソームを含む、組成物。
前記組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
１種またはそれ以上の抗腫瘍または免疫調節性有効成分をさらに含むことを特徴とする、請求項２０または２１に記載の組成物。
前記組成物は、注射液または粉末注入剤の形態であることを特徴とする、請求項２０または２１に記載の組成物。
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のリポソームを調製する方法であって、

ａ．リン脂質、コレステロール、界面活性剤及びポリエチレングリコールを含む前記出発原料を有機溶剤に溶解して油相混合物を得るステップと、
ｂ．レンチナン又はアストラガランである多糖及び界面活性剤を含む前記出発原料を水または水溶液に溶解して水相混合物を得るステップと、
ｃ．前記水相混合物を前記油相混合物に添加して乳化を行うステップと、
ｄ．一定温度で減圧された保護ガス下、蒸発により前記溶剤を除去するステップと、
ｅ．水または水溶液を加え、その後水浴中でその生成物を放置するステップとを備える、
方法。
ｆ．ステップｅから得られた溶液を分離して、凍結乾燥するステップをさらに備えることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
ステップａにおける前記有機溶剤は、クロロホルムまたはクロロホルム−メタノールであることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
ステップｃにおける前記乳化は、超音波バッチ処置または高圧での循環乳化であることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
ステップｅにおける前記水浴中での放置は、３５〜５０℃の範囲内の温度で実施されることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
ステップｅにおける前記水浴中での放置は、４０℃で実施されることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
ステップｂにおける反応環境のｐＨ値は、ステップｅにおける反応環境のｐＨ値と異なることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
ステップｂにおける反応環境の酸性度または塩基性度は、ステップｅにおける反応環境の酸性度または塩基性度と反対であることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
ステップｅにおける前記放置は、１〜２時間実施されることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
ステップａにおける前記出発原料は、抗酸化剤をさらに含むことを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
ステップｅにおける前記水溶液は、凍結乾燥する保護剤をさらに含むことを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
抗腫瘍または免疫調節性剤を製造するための請求項１〜１９のいずれか１項に記載のリポソームの使用。
抗腫瘍または免疫調節性剤を製造するための請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の組成物の使用。