JP5952890B2 - 膵臓癌を治療するための医薬製剤 - Google Patents

Description

本発明は、（Ｚ）−ブチリデンフタリドを含む医薬製剤の使用、特に膵臓癌の治療における当該医薬製剤の使用に関する。

膵臓は、生体の腹腔の背部内に位置する、柔らかく細長い腺である。一般的に、ヒトの膵臓は、約１５ｃｍから２０ｃｍの範囲の長さ、約２．５ｃｍの幅および約７５グラムから１００グラムの範囲の重さを有している。“膵臓癌”は、膵臓細胞から生じる悪性腫瘍を示している。管腺癌は膵臓癌の９０％を占めており、そのうちの約８０％が膵臓腺の上部内で発生する。

膵臓癌は高齢者において発生する傾向があり、男性における発生率は女性より２倍高くなっている。初期の膵臓癌は、通常明らかな症状を示さないが、膵臓腫瘍が徐々に増殖するに伴って、患者は腹痛、背部痛、黄疸、体重減少および下痢の症状を示し得る。さらに、典型的な膵臓癌では、周囲の組織への線維症および癒着が現れる。膵臓癌細胞は、しばしば、末梢神経の中へ浸透し、および／または血管へ侵入するので、膵臓癌の９０％近くが、手術によって治療することができない。膵臓癌は予後不良を有し、５年の生存率は５％未満である。

膵臓癌のための現在の臨床療法には、手術、化学療法および放射線治療等が含まれている。一般的に、膵臓癌患者の状態が許す場合には、生存率を上昇させるため、手術が第１の選択治療である。化学療法では、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビンの代謝拮抗物質薬のような単一の薬剤、または様々な薬剤の組み合わせを、膵臓癌の臨床段階に基づいて選択することができる。しかし、化学療法の治療効果は低い。従来の化学療法では、膵臓癌の再発の場合においては、ほとんど効果が無い。放射線治療は、切除不能な膵臓腫瘍を治療することができないため、通常、膵臓癌のための治療の間のアジュバント療法（補助療法）として使用される。このように、膵臓癌を治療するための薬剤の必要性が依然として存在する。

本発明の発明者らは、Ｚ−ブチリデンフタリド（Ｚ−ＢＰ）が、膵臓癌細胞の増殖を阻害することができ、従って、膵臓癌を治療するために使用することができるということを見出した。特に、Ｚ−ブチリデンフタリドを含有する制御放出剤形を、手術後の膵臓癌細胞を有する領域内へと移植することができ、Ｚ−ブチリデンフタリドの局所的に安定した高用量を達成する。その結果、Ｚ−ブチリデンフタリドは、“侵入残存癌細胞”を死滅させるように周囲の膵臓組織の中へ浸透することができ、所望の治療効果を達成する。

本発明の目的は、膵臓癌を治療するための医薬製剤を提供することである。当該医薬製剤は（Ｚ）−ブチリデンフタリドを含み、（Ｅ）−ブチリデンフタリドは実質的に含まれない。好ましくは、当該医薬製剤において、（Ｚ）−ブチリデンフタリドは、制御放出剤形における医薬製剤の、生体適合性ポリマーマトリックス中に含まれている。

さらに別の本発明の目的は、薬剤の製造における医薬製剤の使用を提供することである。当該薬剤は、膵臓癌を治療するために使用される。当該医薬製剤は、（Ｚ）−ブチリデンフタリドを含み、（Ｅ）−ブチリデンフタリドは実質的に含まれない。好ましくは、当該医薬製剤において、（Ｚ）−ブチリデンフタリドは、制御放出剤形における薬剤を提供するために、生体適合性ポリマーマトリックス中に含まれている。

さらに別の本発明の目的は、対象における膵臓癌を治療するための方法を提供することである。当該方法は、それを必要とする対象に医薬製剤の治療的有効量を投与することを含み、当該医薬製剤は、（Ｚ）−ブチリデンフタリドを含み、（Ｅ）−ブチリデンフタリドは実質的に含まれない。好ましくは、当該医薬製剤において、（Ｚ）−ブチリデンフタリドは、当該医薬製剤が制御放出剤形において使用されるように、生体適合性ポリマーマトリックス中に含まれている。

詳細な技術および本発明のために実施される好ましい実施の形態は、本技術分野における当業者が特許請求の範囲の発明の特徴を認識できるように、以下の段落において記載される。

膵臓癌細胞株の細胞生存率における（Ｅ）−ブチリデンフタリドの効果を示す棒グラフの図である。 膵臓癌細胞株の細胞生存率における（Ｚ）−ブチリデンフタリドの効果を示す棒グラフの図である。 ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマーを調製するフローチャート図である。 ２つのｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰウェーハの写真の図であり、左のＺ−ＢＰの濃度は０％であり、右のＺ−ＢＰの濃度は１７．５％である。 ０から２５日におけるｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰウェーハのゆっくりと継続的な放出を示す吸光度の曲線図である。 ＰＡＣＡ−２細胞の生存率減少におけるｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰの効果を示す棒グラフの図である。 ＰＡＣＡ−２細胞のアポトーシス誘導におけるｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰの効果を示す写真の図である。 膵臓癌細胞株をＺ−ＢＰで処置した後の異なる時点での膵臓癌細胞株におけるアポトーシス関連遺伝子の発現レベルの増加を示す電気泳動図である。 異なるＺ−ＢＰの濃度で処置した膵臓癌細胞株におけるアポトーシス関連遺伝子の発現レベルの増加を示す電気泳動図である。 Ｚ−ＢＰに誘発されるＮｕｒｒ１遺伝子の発現レベルを阻害するための、Ｎｕｒｒ１マイクロＲＮＡを用いたＰＡＣＡ−２の処置を示す電気泳動図である。 Ｚ−ＢＰによって減少する細胞生存率を戻すための、Ｎｕｒｒ１マイクロＲＮＡを用いたＰＡＣＡ−２の処置を示す棒グラフの図である。 膵臓癌細胞でのＮｕｒ７７遺伝子経路関連タンパク質の発現レベルの増加におけるＺ−ＢＰの効果を示す電気泳動図である。 膵臓癌細胞でのアポトーシス経路関連タンパク質の発現レベルの増加におけるＺ−ＢＰの効果を示す電気泳動図である。 異なるＺ−ＢＰの濃度においてｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰを皮下移植したマウスにおける膵臓腫瘍の大きさを示す曲線図である。 異なるＺ−ＢＰの濃度においてｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰを皮下移植したマウスの体重を示す曲線図である。

以下に、詳細における本発明のいくつかの実施の形態について記載する。しかし、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は様々な実施の形態において具体化され得るし、本明細書に記載される実施の形態に限定されるべきではない。さらに、本明細書において他に言及のない限り、本発明の明細書において（特に、特許請求の範囲において）用いられる“１”、“当該”および同様の用語は、単数形式および複数形式の両方を包含すべきである。さらに、本明細書において使用される“治療（処置）” または“治療する（処置する）”という用語は、それを必要とする対象に医薬製剤の治療的有効量（処置的有効量）を投与することを示しており、当該対象は、腫瘍もしくは腫瘍徴候を有しているか、腫瘍に由来する疾患もしくは症状に苦しんでいるか、または、癌に対して罹患性がある。当該投与は、腫瘍、腫瘍徴候、腫瘍に由来する疾患もしくは症状または癌に対する罹患性を、癒やす、緩和する、軽減する、治療する、または改善する効果を達成するためのものである。本明細書において使用されている“有効量”という用語は、対象に投与される場合、被疑対象において治療されている状態を少なくとも部分的に軽減することができる成分（化合物）の量を示している。本明細書において使用されている“対象”という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む、哺乳動物を示している。本明細書において使用されている“ｍｇ／ｋｇ−体重”という用語は、ｋｇ−体重当たり必要とされる用量（ｍｇ）を示す。本明細書において使用されている“制御放出剤形”という用語は、対象に投与した後に、その中に含有されている活性成分（活性化合物）を、ゆっくりと継続的に放出することができる剤形を示している。本発明の意図における“（Ｅ）−ブチリデンフタリドは実質的に含まれない”とは、当該医薬製剤が、１重量％未満、好ましくは０．５重量％未満、より好ましくは０．０５重量％未満、および、さらに好ましくは０．００１重量％未満、０．０００１重量％未満または０．０重量％の（Ｅ）−ブチリデンフタリドを含むということを意味している。ここで、重量％は、当該医薬製剤の全重量に基づくものである。

ブチリデンフタリド（ＢＰ）は、アンジェリカ・シネンシス（Ａｎｇｅｌｉｃａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）から抽出される成分（化合物）である。本発明の発明者らは、（Ｅ）−ブチリデンフタリドと比較して、（Ｚ）−ブチリデンフタリド（すなわち、以下の化合物（Ｉ））が膵臓癌細胞の増殖の阻害において有意に効果的であり、従って、膵臓癌を治療するために使用することができるということを見出した。

そこで、本発明は、（Ｚ）−ブチリデンフタリドを含み、（Ｅ）−ブチリデンフタリドは実質的に含まれない医薬製剤を提供する。（Ｚ）−ブチリデンフタリドは市販されており（例えば、ＥＣＨＯ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．，ＬＴＤ，ＴＷから購入することができる）、天然素材から抽出することができ、またはアンジェリカ・シネンシスのクロロホルム抽出物から分離することができる。抽出および分離によって提供された（Ｚ）−ブチリデンフタリドは、使用される前に、フラッシュカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは結晶化法によって、さらに精製することができる。

任意において、本発明の医薬製剤は、生体適合性ポリマーマトリックスを含んでもよい。ここで、膵臓癌治療において長期の効果を提供するために、医薬製剤が制御放出剤形において使用され得るように、（Ｚ）−ブチリデンフタリドは当該ポリマーマトリックス中に含まれている。本発明のために適している生体適合性ポリマーマトリックスは、一般的に疎水性であり、適当な分解性を有している。好ましくは、生体適合性ポリマーマトリックスは、乳酸・グリコール酸コポリマー（共重合体）、キトサン、コラーゲン、ヒドロゲル、ポリ無水物およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。制御放出剤形において使用される場合、本発明の医薬製剤は、膵臓癌の継続的な治療の効果を達成するために、長期間（例えば、２０、３０、３５、４０、５０、６０日間）にわたって、対象の投与部位に隣接する組織（複数可）へ、ゆっくりと継続的に（Ｚ）−ブチリデンフタリドを放出することができる。

本発明の１つの実施の形態では、（Ｚ）−ブチリデンフタリドは、制御放出剤形を可能にするために、ポリ無水物中に含まれている。好ましくは、ポリ無水物は、以下のモノマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）のコポリマー（共重合体）である。

ここで、ｍは１から１０の範囲の整数であり、ｎは０から２０の範囲の整数である。好ましくは、ｍは２から８の範囲の整数であり、ｎは３から１０の範囲の整数である。さらに、モノマー（Ａ）のベンゼン環上の２つのカルボキシル基は、同時に、オルト位、メタ位またはパラ位であることが好ましい。より好ましくは、パラ位である。

モノマー（Ａ）は、限定はされないが、次の１以上のようなものとすることができる。ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）エタン、ビス（ｏ−カルボキシ−フェノキシ）エタン、ビス（ｍ−カルボキシ−フェノキシ）エタン、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）プロパン、ビス（ｏ−カルボキシ−フェノキシ）プロパン、ビス（ｍ−カルボキシ−フェノキシ）プロパン、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）ブタン、ビス（ｏ−カルボキシ−フェノキシ）ブタン、ビス（ｍ−カルボキシ−フェノキシ）ブタン、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）ペンタン、ビス（ｏ−カルボキシ−フェノキシ）ペンタン、ビス（ｍ−カルボキシ−フェノキシ）ペンタン、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）ヘキサン、ビス（ｏ−カルボキシ−フェノキシ）ヘキサン、ビス（ｍ−カルボキシ−フェノキシ）ヘキサン、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）ヘプタン、ビス（ｏ−カルボキシ−フェノキシ）ヘプタン、ビス（ｍ−カルボキシ−フェノキシ）ヘプタン、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）オクタン、ビス（ｏ−カルボキシ−フェノキシ）オクタン、および、ビス（ｍ−カルボキシ−フェノキシ）オクタン。好ましくは、モノマー（Ａ）は、次の１以上のものである。ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）エタン、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）プロパン、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）ブタン、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）ペンタン、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）ヘキサン、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）ヘプタン、および、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）オクタン。

本発明のために適しているモノマー（Ｂ）は、限定はされないが、次の１以上のようなものとすることができる。マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、および、セバシン酸。本発明の１つの実施の形態では、セバシン酸がモノマー（Ｂ）として使用される。

好ましくは、生体適合性ポリマーマトリックスとして使用されるポリ無水物では、モノマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）のモル比（モノマー（Ａ）：モノマー（Ｂ））は、約１：２から約１：１０であり、より好ましくは、約１：３から約１：６である。さらに、生体適合性ポリマーマトリックスは、モノマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）のブロックコポリマー（ブロック共重合体）であることが好ましい。本発明の１つの実施の形態では、生体適合性ポリマーマトリックスは、１：４のモル比におけるビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）プロパンおよびセバシン酸により提供されるブロックコポリマーである、ポリ無水物である。

本発明の医薬製剤のために適している生体適合性ポリマーマトリックスは、市販されているか、または当該分野における公知の合成方法によって調製することができる。例えば、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）プロパンおよびセバシン酸からポリ無水物を調製するには、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）プロパンプレポリマーおよびセバシン酸プレポリマーをそれぞれ得るために、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）プロパンおよびセバシン酸を、無水酢酸中において別々に還流する。その後、ポリ無水物であるブロックコポリマー（“ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマー”としても示される）を提供するために、溶融重縮合法によって、２つのプレポリマーを共重合させる。溶融重縮合法の工程は、ＤｏｍｂらのＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２５：３３７３−３３８６において見ることができ、その全体は参照により本明細書中に組み込まれる。

本発明の医薬製剤では、当該製剤における（Ｚ）−ブチリデンフタリドの比率は、実践的な要求に応じて調整することができる。例えば、医薬製剤における（Ｚ）−ブチリデンフタリドの濃度は、約１重量％から約４０重量％の範囲、好ましくは約２重量％から約３０重量％の範囲とすることができる。

本発明によると、当該医薬製剤は、任意の適切な方法で適用される任意の適切な投与形状における薬剤を提供するために、使用することができる。例えば、当該医薬製剤は、限定はされないが、ウェーハ、粉末、膜、フレーク、ロッド、微小粒子、ナノ粒子、ペーストまたはゲルのような形状へと製造することができる。さらに、当該医薬製剤は、経口投与、皮下移植、間質性インプラント、イントラ膵臓移植、鼻投与または静脈内注射等のために適している形状へと製造することができる。

例として、経口投与に適した剤形における薬剤の製造に使用すると、当該医薬製剤は、溶媒、油性溶媒、希釈剤、安定化剤、吸収遅延剤、崩壊剤、乳化剤、酸化防止剤、結合剤、潤滑剤および吸湿剤のような、活性成分（活性化合物）の所望される活性に悪影響を与えない、薬学的に許容される担体を含んでもよい。当該医薬製剤は、任意の適切な方法によって、経口投与形状における薬剤へと調製することができる。例えば、当該医薬製剤は、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、抽出液、溶液、シロップ、懸濁液、乳濁液またはチンキ剤等としての薬剤を製造するために、使用することができる。

皮下注射または静脈内注射に適した剤形における薬剤の製造では、当該医薬製剤は、静脈内注射、エマルジョン静脈内注射、粉末注射、懸濁液注射または粉末−懸濁液注射等としての製剤を製造するために、等張液、生理食塩緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはクエン酸塩緩衝液）、可溶化剤、乳化剤および他の担体のような、１以上の成分（化合物）を含んでもよい。

形状および目的に応じて、本発明の医薬製剤は、１以上の薬学的に許容される担体を含んでもよい。担体（複数可）に加えて、当該医薬製剤は、得られる製剤の味および視覚的な質を向上させるため、香味剤、トナーまたは着色剤等のような他の添加物を、任意において含んでもよい。こうして提供される薬剤の保存性を改善するために、当該製剤は、適切な量の保存剤、貯蔵剤、防腐剤または抗カビ試薬等をも含んでもよい。任意において、本発明の医薬製剤は、こうして提供される薬剤の有益性をさらに向上させるために、または薬剤の適用柔軟性および順応性を増強するために、酸化防止剤（例えば、ビタミンＥ）、化学療法薬または免疫モジュレーター等のような、１以上の他の活性成分（活性化合物）を含んでもよい。しかし、これは、当該他の活性成分（活性化合物）が、（Ｚ）−ブチリデンフタリドに悪影響を及ぼさない場合に限る。

本発明の医薬製剤が生体適合性ポリマーマトリックスを含む場合、当該医薬製剤は、好ましくは、皮下移植、間質性インプラントおよびイントラ膵臓移植に適した剤形（ウェーハのようなもの）における薬剤として製造される。すると、対象に投与された後に、対象の投与部位に隣接する組織へと、当該医薬製剤が（Ｚ）−ブチリデンフタリドをゆっくりと放出することができ、局所的に安定した高用量での治療効果を達成する。その結果、当該医薬製剤を、腫瘍（例えば、膵臓腫瘍）の周囲に直接的に移植することができ、正確な期間（例えば、２０、３０、３５、４０、５０、６０日間）にわたって投与部位に隣接する組織へと（Ｚ）−ブチリデンフタリドをゆっくりと継続的に放出することができる。そして、それによって、膵臓癌の長期治療の効果および／または膵臓癌の再発減少の効果を達成する。

例として、皮下移植、間質性インプラントおよびイントラ膵臓移植に適した剤形における薬剤の製造に使用すると、ウェーハ、錠剤、カプセルまたは顆粒のような、皮下移植、間質性インプラントおよびイントラ膵臓移植のための形状における薬剤を調製するために、当該医薬製剤は、付形剤（添加物）、安定化剤および吸湿剤等のような、中に含まれている活性成分（活性化合物）の活性に悪影響を与えない薬学的に許容される担体を含むことができる。本発明の１つの実施の形態では、（Ｚ）−ブチリデンフタリドを、混合物を提供するためにｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマーと混合し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解し、粉末を形成するように乾燥させた。そして、皮下移植、間質性インプラントおよびイントラ膵臓移植用ウェーハとしての薬剤を形成するために、乾燥させた粉末を鋳型に充填し、わずかな圧力下において圧縮した。膵臓癌患者における膵臓腫瘍を切除した後、より徹底的に膵臓癌を治療するために、および／または膵臓癌の再発を減少させるために、当該ウェーハ（すなわち、（Ｚ）−ブチリデンフタリドおよびｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマーを含む、医薬製剤）を患者の疾患領域に移植した。ウェーハを調製するための前述の方法は、添付の実施例およびＷａｌｔｅｒらのＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９４，５４（８）：２２０７−１２においてさらに説明されている。当該文献は、参照によりその全体を本明細書中に組み込む。

対象の要求に応じて、本発明の医薬製剤または当該医薬製剤を使用して製造された薬剤は、１日に１回、１日に数回または数日に１回等のような、様々な投与頻度で適用することができる。例えば、膵臓癌の治療のためにヒト対象に投与する場合、当該医薬製剤は、１日当たり約１０ｍｇから約１０００ｍｇの範囲の（Ｚ）−ブチリデンフタリド／ｋｇ−体重での量において、好ましくは１日当たり約５０ｍｇから約５００ｍｇの範囲の（Ｚ）−ブチリデンフタリド／ｋｇ−体重での量において、投与される。しかし、重篤状態での患者では、実践的な要求に応じて、用量を数倍または数十倍に増加させることもできる。

本発明は、膵臓癌を治療するための方法をも提供する。当該方法は、それを必要とする対象に医薬製剤の治療的有効量を投与することを含み、当該医薬製剤は（Ｚ）−ブチリデンフタリドを含み、（Ｅ）−ブチリデンフタリドは実質的に含まれない。好ましくは、当該医薬製剤は生体適合性ポリマーマトリックスをさらに含み、（Ｚ）−ブチリデンフタリドは当該生体適合性ポリマーマトリックス中に含まれている。当該医薬製剤の成分（化合物）およびその特性、ならびに、（Ｚ）−ブチリデンフタリドの有効性および用量については、全て上述したものと同様である。

本発明は、さらに、以下の具体的な実施例の詳細において説明される。しかし、以下の実施例は、本発明を説明するためのみに提供されるものにすぎず、それにより本発明の範囲は限定されない。

（実施例１）異なる膵臓癌細胞株における（Ｚ）−ブチリデンフタリドでの死滅効果

（Ｚ）−ブチリデンフタリドで処置した場合、異なる膵臓癌細胞株の細胞生存率に影響を与えるか否かを判定するために、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，４−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を使用した。ヒト膵臓癌細胞株（３×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）のＰＡＮＣ−１およびＰＡＣＡ−２を、９６ウェルマイクロ培養プレートにおいて、一晩培養した。異なる濃度での（Ｚ）−ブチリデンフタリド（０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌもしくは１００μｇ／ｍｌ）、異なる濃度での（Ｅ）−ブチリデンフタリド（０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌもしくは８００μｇ／ｍｌ）、または、５０μＭのゲムシタビン（コントロール群としての膵臓癌を治療するための従来の薬品）を、内壁に沿って９６ウェルマイクロ培養プレートのそれぞれのウェル中に加えて、２４時間培養した。培地を除去し、その後、５００μｇ／ｍｌＭＴＴ（２００μｌ）を含有する培地を加え、４時間培養した。培地を除去し、その後、プレート中にＤＭＳＯ２００μｌを加えた。そして、それぞれのウェル中におけるサンプルの吸光度を、５７０ｎｍの波長で分光光度計によって測定した。その後、（Ｚ）−ブチリデンフタリドおよび（Ｅ）−ブチリデンフタリドを用いて処置したそれぞれの膵臓癌細胞株の、生存率およびＩＣ５０（５０％阻害濃度）を決定するために、当該データを計算した。結果を、図１Ａ（（Ｅ）−ブチリデンフタリド）および図１Ｂ（（Ｚ）−ブチリデンフタリド）において示す。

図１Ａおよび図１Ｂにおいて示すように、（Ｅ）−ブチリデンフタリドのＩＣ５０は、ＰＡＮＣ−１では約２５７．１μｇ／ｍｌ（約１３６７μＭ）であり、ＰＡＣＡ−２では約１６２．５μｇ／ｍｌ（約８６４．５μＭ）であった。（Ｚ）−ブチリデンフタリドのＩＣ５０は、ＰＡＮＣ−１では約４５μｇ／ｍｌ（約２３４μＭ）であり、ＰＡＣＡ−２では約２５μｇ／ｍｌ（約１３３μＭ）であった。これらの実験データは、膵臓癌細胞株での（Ｚ）−ブチリデンフタリドのＩＣ５０は、（Ｅ）−ブチリデンフタリドのものよりも、はるかに小さかったことを示している。

（実施例２）（Ｚ）−ブチリデンフタリドを含有する制御放出剤形の調製

（１）ＳＡプレポリマーの調製
まず、セバシン酸（ＳＡ）をエタノールによって２回再結晶化した。２．７ｇのセバシン酸モノマーを６０ｍｌの無水酢酸中に加え、１３５℃から１４０℃の真空下（１０^−４ｔｏｒｒ）で３０分間還流した。その後、ＳＡプレポリマーを得るために、未反応の無水酢酸を除去した。ＳＡプレポリマーを６０℃の真空下で乾燥し、その後、乾燥トルエン中に溶解させた。得られた溶液を、１：１０の体積比において、無水エーテルおよび石油エーテル（１：１、ｖｏｌ：ｖｏｌ）の混合物と混合し、ＳＡプレポリマーを沈殿させるために（１０：１、ｖｏｌ：ｖｏｌ）一晩放置した。そして、無水エーテルおよび石油エーテルを除去し、得られたＳＡプレポリマーを真空下で乾燥した。

（２）ＣＰＰプレポリマーの調製
３ｇのビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）プロパン（ＣＰＰ）および５０ｍｌの無水酢酸を混合し、１５０℃の真空下（１０^−４ｔｏｒｒ）で３０分間還流し、冷却した。その後、混合物を濾過した。未反応の無水酢酸を除去することによって、濾液を濃縮した。次いで、ＣＰＰプレポリマーを得るために、０℃において結晶化を行った。さらに、ＣＰＰプレポリマーを得るために、未反応の無水酢酸を除去した。ＣＰＰプレポリマーをエーテルで洗浄し、真空下で乾燥させた。次いで、ジメチルホルムアミドおよび無水エーテル（ジメチルホルムアミドおよび無水エーテルの体積比は１：９）を、ＣＰＰプレポリマーに順次加えた。１２時間後、ジメチルホルムアミドおよびエーテルを除去した。得られたＣＰＰ結晶プレポリマーを、真空下において乾燥させた。

（３）ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマーの調製
ＣＰＰプレポリマーおよびＳＡプレポリマー（２０：８０のモル比）をガラス管（２×２０ｃｍ）中に充填し、油浴中において１８０℃で１分間加熱し、その後、１０^−４ｍｍＨｇまで減圧した。重合工程では、真空（減圧）は１５分毎に取り除いた。そして、当該管をジクロロメタンで洗浄し、ＣＰＰプレポリマーとＳＡプレポリマーとのコポリマー（“ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマー”として示す）を沈殿させるために、石油エーテルを加えた。その後、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマーを無水エーテルで洗浄した。前述の調製工程は、図２において示されている。

得られたｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマーの特性を、赤外分光法（ＩＲ）および核磁気共鳴分光法（１Ｈ ＮＭＲ）（図示せず）によって分析した。実験結果は、１８１２．７６ｃｍ−１において観察できる無水結合のシグナルが存在するということを示している。ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマーの１Ｈ ＮＭＲスペクトルでは、ＣＰＰの芳香族部分の特徴的シグナルを６．９ｐｐｍから８．２ｐｐｍにおいて観察でき、ＳＡのメチレン部分の特徴的シグナルを１．３ｐｐｍにおいて観察できる。さらに、１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおけるＣＰＰおよびＳＡのピーク強度によると、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマーにおけるＣＰＰおよびＳＡのモル比は、約１：４から約１：５として判定された。

（４）ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰ医薬製剤の調製
（Ｚ）−ブチリデンフタリド（ＥＣＨＯ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．，ＬＴＤ，ＴＷ）を、約０重量％、１７．５重量％および２５重量％の重量比によって、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマーと混合した。当該混合物を、１０％の濃度（重量／体積）における塩化メチレン中に溶解させた。そして、溶液を真空下で７２時間乾燥し、乾燥粉末を得た。次いで、ステンレススチール鋳型（内径１３ｍｍ）を使用して、２００ｐｓｉのわずかな圧力下（カバープレス）で乾燥粉末を圧縮し、ウェーハを形成した（１００ｍｇ／ウェーハ）。当該ウェーハは、（Ｚ）−ブチリデンフタリドおよびｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマーを含む医薬製剤を含んでおり、以降、“ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰ”として示される。ウェーハの外観を、図３において示す。

（実施例３）ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰ医薬製剤の薬物放出動態試験

実施例２において調製したｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰウェーハ（１７．５％Ｚ−ＢＰまたは２５％Ｚ−ＢＰを含む）を、１．０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（０．１ｍＭ、ｐＨ７．４）および１．０ｍｌのｎ−オクタールを含有するシンチレーションバイアルの中に加え、３７℃でインキュベートした。様々な時点において溶液を新しい緩衝液に置き換え、当該緩衝液中の（Ｚ）−ブチリデンフタリドの濃度を測定するために、分光光度計を使用して、３１０ｎｍにおける当該溶液の吸光度を測定した。前述の方法は、ＷｅｉｎｇａｒｔらのＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９５，６２（５）：６０５−９に記載されており、その全体を参照により本明細書に組み込む。

図４に示すように、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰウェーハは、０から１４４時間において、ゆっくりと継続的に内部に含有されている活性成分（活性化合物）を放出することができる。これらのデータは、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰを、（Ｚ）−ブチリデンフタリドを含有する制御放出剤形として使用することができるということを示している。従って、対象の中へｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰウェーハを移植した場合、（Ｚ）−ブチリデンフタリドを周囲の膵臓組織へとゆっくりと継続的に放出することができ、そのため、継続した治療効果を達成することができる。

（実施例４）細胞実験：ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰ医薬製剤の細胞毒性効果

ヒト膵臓癌細胞株ＰＡＣＡ−２を、（Ｚ）−ブチリデンフタリドをそれぞれ０重量％（コントロール群）、１７．５重量％または２５重量％含む、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰと共に、２４時間培養し、その後、腫瘍細胞形態および細胞生存率を観察した。

図５Ａにおいて示すように、コントロール群（すなわち、（Ｚ）−ブチリデンフタリド無しのｐ（ＣＰＰ−ＳＡ））と比較して、１７．５重量％または２５重量％の（Ｚ）−ブチリデンフタリドを含むｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰは、ＰＡＣＡ−２細胞株の生存率を効果的に減少させることができていた。図５Ｂにおいて示すように、１７．５重量％または２５重量％の（Ｚ）−ブチリデンフタリドを含むｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰの処置では、ＰＡＣＡ−２細胞株にアポトーシスを引き起こしていた。前述の実験データは、本発明のｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰ医薬製剤が、膵臓癌細胞の増殖を効果的に阻害することができるということを示している。

（実施例５）細胞実験：Ｚ−ＢＰにより誘導されるアポトーシス

（１）ｍＲＮＡの発現レベルの分析
オーファン受容体−１（ＮＯＲ−１）、Ｎｕｒｒ１およびＮｕｒ７７のアップレギュレートされた発現には、アポトーシスが関連していることが知られている。この実験では、膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１およびＰＡＣＡ−２を、１００μｇ／ｍｌのＺ−ＢＰを用いて０、１、３、６または２４時間処置し、その後、当該膵臓癌細胞株でのＮＯＲ−１、Ｎｕｒｒ１およびＮｕｒ７７の遺伝子発現レベルにおいてＺ−ＢＰの効果を分析するために、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した（図６Ａ）。さらに、膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１およびＰＡＣＡ−２を、異なる濃度のＺ−ＢＰを用いて３時間処置し、その後、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した（図６Ｂ）。コントロール群として、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を使用した。

図６Ａに示すように、膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１およびＰＡＣＡ−２がＺ−ＢＰを用いて１から３時間処置された後、当該膵臓癌細胞株におけるＮＯＲ−１およびＮｕｒｒ１のｍＲＮＡ発現レベルが増加していた。図６Ｂに示すように、膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１およびＰＡＣＡ−２が異なる濃度のＺ−ＢＰを用いて３時間処置された後、当該膵臓癌細胞株におけるＮｕｒｒ１のｍＲＮＡ発現レベルが増加していた。当該Ｎｕｒｒ１のアップレギュレートされた発現の結果は、Ｚ−ＢＰにより誘導された、ＰＡＮＣ−１およびＰＡＣＡ−２のアポトーシスの初期段階を明らかとするものであった。

（２）マイクロＲＮＡ干渉試験
ヒト膵臓癌細胞株ＰＡＣＡ−２におけるＮｕｒｒ１のＲＮＡ発現を、マイクロＲＮＡ干渉技術によって阻害した。当該細胞を１３３μＭのＺ−ＢＰを用いて処置し、その後、細胞中のＮｕｒｒ１のＲＮＡ発現における変化を検出するために、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。図７Ａにおいて示される結果のように、ＰＡＣＡ−２を５０ｎＭのＮｕｒｒ１マイクロＲＮＡを用いて処置した場合、Ｚ−ＢＰにより誘導されたＮｕｒｒ１の約５０％が阻害された。これらの結果は、Ｚ−ＢＰの処置が実際にＮｕｒｒ１の発現量を増加することができるということを示している。

さらに、ヒト膵臓癌細胞株ＰＡＣＡ−２を、１０ｎＭまたは５０ｎＭのＮｕｒｒ１マイクロＲＮＡを用いて処置し、その後、１３３μＭのＺ−ＢＰで処置した。次いで、実施例４において記載した同様の方法を使用して、細胞生存率を観察した。図７Ｂにおいて示すように、ＰＡＣＡ−２細胞が５０ｎＭのＮｕｒｒ１マイクロＲＮＡを用いて処置された後には、Ｚ−ＢＰによって阻害された細胞生存率を戻すことができている。これらの結果は、Ｚ−ＢＰの処置がＰＡＣＡ−２細胞の細胞生存率を減少し得るということを示している。

（３）ウェスタンブロッティング試験
ヒト膵臓癌細胞株ＰＡＣＡ−２を、Ｚ−ＢＰを用いて０、３０、６０、１２０または１８０分間処置し、その後、Ｎｕｒ７７遺伝子に関与する経路関連タンパク質の発現レベルをウェスタンブロッティングによって分析した。当該タンパク質は、Ｐａｎ−ＰＫＣ、ＡＫＴ、ＥＲＫおよびＪＮＫを含んでいる（図８Ａ）。さらに、アポトーシス関連タンパク質の発現レベルも分析した。これには、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、切断ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ｃＰＡＲＰ）およびカスパーゼ−３が含まれる（図８Ｂ）。コントロール群として、β−アクチンを使用した。

図８Ａにおいて示すように、ＰＡＣＡ−２細胞がＺ−ＢＰを用いて１８０分間処置された後には、ＰＡＣＡ−２細胞におけるホスホ−ＪＮＫ（Ｐｉ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ）およびホスホ−ＡＫＴ（Ｐｉ−ＡＫＴ）の発現レベルは増加していた。これは、Ｚ−ＢＰの処置でＮｕｒ７７遺伝子経路関連タンパク質の発現レベルを増加させることができるということを示している。図８Ｂにおいて示すように、ＰＡＣＡ−２細胞をＺ−ＢＰを用いて２４時間または４８時間処置された後には、ＰＡＣＡ−２細胞におけるカスパーゼ−３、ＰＡＲＰおよびｃＰＡＲＰの発現レベルは増加していた。これは、Ｚ−ＢＰの処置でアポトーシス関連タンパク質の発現レベルを増加させることができるということを示している。

（実施例６）動物実験：ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰによるマウスの膵臓腫瘍の大きさの縮小

ヌードマウス（６マウス／群）に、ＰＡＣＡ−２細胞（１×１０^６ｃｅｌｌｓ）を含む皮下背部移植の処置をした。その後、０％（コントロール群）、１７．５％または２５％のＺ−ＢＰを含むｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰを、ＰＡＣＡ−２細胞を移植した領域を介してマウスの中へ移植した。そして、それぞれのマウスにおける腫瘍の大きさを測定器（較正器）によって測定し、それぞれのマウスの体重を測定した。腫瘍の体積は、長さ（長軸の長さ）×高さ×幅（短軸の長さ）×０．５２３６（Ｌ×Ｈ×Ｗ×０．５２３６）（立方ミリメートル）の式によって算出した。結果を、図９および図１０において示す。

図９において示すように、コントロール群のマウス（Ｚ−ＢＰ無しのｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰで処置されたマウス）における膵臓腫瘍の相対的な大きさは、実験開始から３０日後には、１０００よりも大きく急速に拡大していた。一方、実験群のマウス（１７．５％または２５％のＺ−ＢＰを含むｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰで処置されたマウス）における膵臓腫瘍の相対的な大きさは、約２００であった。図１０において示すように、それぞれの群でのマウスの体重における有意な変化は無かった。これらの実験結果は、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−Ｚ−ＢＰの処置（治療）が、マウスにおける膵臓腫瘍の増殖を効果的に阻害することができることを示している。

上記の実験結果は、本発明の（Ｚ）−ブチリデンフタリドを含む医薬製剤が、膵臓癌細胞の増殖を効果的に阻害でき、従って、膵臓癌を治療するために使用することができるということを示している。加えて、本発明の医薬製剤は、制御放出剤形を形成するための疎水性の生体適合性ポリマーをさらに含むことができ、それにより、膵臓癌においてゆっくりと継続的な治療効果を提供することができる。

上記の実施例は、本発明の原理および効果を説明するために使用されるものであり、本発明を限定するために使用されるものではない。当業者は、本発明に記載されている開示および提案に基づいて、その技術的原理および精神から逸脱することなく、様々な修正および代替を用いて実施できるだろう。従って、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲において規定されているものである。

（関連する出願）
本出願は、台湾特許出願１０３１１９３９３（出願日２０１４年６月４日）に基づく優先権を主張しており、その内容は本明細書に参照として取り込まれる。

Claims (14)

1. （Ｚ）−ブチリデンフタリドを含み、（Ｅ）−ブチリデンフタリドは実質的に含まれない、膵臓癌を治療するための医薬製剤。
2. 生体適合性ポリマーマトリックスをさらに含み、
   （Ｚ）−ブチリデンフタリドは、前記マトリックス中に含まれている、請求項１に記載の医薬製剤。
3. 前記生体適合性ポリマーマトリックスは、乳酸・グリコール酸コポリマー、キトサン、コラーゲン、ヒドロゲル、ポリ無水物およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の医薬製剤。
4. 前記生体適合性ポリマーマトリックスはポリ無水物である、請求項２に記載の医薬製剤。
5. 前記ポリ無水物は、モノマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）のコポリマーであり、
   
   
   ｍは１から１０の範囲の整数であり、ｎは０から２０の範囲の整数である、請求項４に記載の医薬製剤。
6. ｍは２から８の範囲の整数であり、ｎは３から１０の範囲の整数である、請求項５に記載の医薬製剤。
7. 前記ポリ無水物は、モノマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）のブロックコポリマーである、請求項５に記載の医薬製剤。
8. 前記モノマー（Ａ）はビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）プロパンであり、前記モノマー（Ｂ）はセバシン酸である、請求項５ないし７のいずれか１項に記載の医薬製剤。
9. 前記モノマー（Ａ）および前記モノマー（Ｂ）のモル比は、約１：２から約１：１０の範囲である、請求項５ないし８のいずれか１項に記載の医薬製剤。
10. 前記モノマー（Ａ）および前記モノマー（Ｂ）のモル比は、約１：３から約１：６の範囲である、請求項５ないし９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
11. （Ｚ）−ブチリデンフタリドの濃度は、約２重量％から約３０重量％である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の医薬製剤。
12. 前記医薬製剤はウェーハの形状である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の医薬製剤。
13. 前記医薬製剤は、皮下移植、間質性インプラントおよびイントラ膵臓移植の少なくとも１つによって、投与される、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の医薬製剤。
14. 前記医薬製剤は、１日当たり、約１０ｍｇ（（Ｚ）−ブチリデンフタリドとして）／ｋｇ−体重から約１０００ｍｇ（（Ｚ）−ブチリデンフタリドとして）／ｋｇ−体重の範囲の量において投与される、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の医薬製剤。