JP5715325B2

JP5715325B2 - 血液からの病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質の体外除去法

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Publication number: JP5715325B2
Application number: JP2008545539A
Authority: JP
Inventors: オーレ・ラーム; トーマス・ベルイストレム
Original assignee: エクステラ・メディカル・コーポレーション
Priority date: 2005-12-13
Filing date: 2006-12-13
Publication date: 2015-05-07
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Description

本発明は、哺乳動物の血液からの病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質の体外除去法；哺乳動物の血液から病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質を体外除去するための、固体担体に固定化された、当該病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質に対して結合親和性を有する糖質を含むデバイスの使用；病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質により引き起こされるまたは悪化する状態を処置するためのデバイスの製造における、固体担体に固定化された、当該病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質に対して結合親和性を有する糖質の使用；および病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質により引き起こされるまたは悪化する状態に罹患した哺乳動物対象の処置法に関する。

生物学
長い進化の過程で、多くの病原性微生物は、組織のコロニー化および侵襲プロセスを促進する細胞付着のための受容体分子として、真核細胞表面の複合糖質、すなわち、糖脂質、糖タンパク質、およびプロテオグリカンを利用することを学習してきた。簡潔に説明すると、細菌、ウイルス、真菌、および寄生生物の表面上の付着因子と呼ばれる特定のタンパク質が複合糖質の糖鎖と相互作用し、それによって微生物は粘膜表面および組織病変にコロニーを形成することができる。

病原体の宿主細胞への結合におけるシアル酸の役割は、長年にわたって報告がなされている。ごく最近、それら糖鎖を有するプロテオグリカン（グリコサミノグリカン）は多くの異なる病原体に結合することが示された。単分子層の細胞上これらの様々な複合糖質の末端糖質部分をシアリダーゼおよび他のエキソグリコシダーゼによってまたはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分解酵素によって除去することにより、これらの構造が、様々なシアロアドヘシンおよびヘパラン硫酸結合タンパク質（ＨｅＢＰ）の受容体分子であることが証明された。

これらのメカニズムは、１７ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｅｃｔｉｎＭｅｅｔｉｎｇｉｎＷｕｅｒｚｂｕｒｇ，１９９７の会報、ＥｄｉｌｂｅｒｔｖａｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ、ＳｏｎｉａＢｅｅｃｋｍａｎｓおよびＴｈｏｒｋｉｌｄＣ．Ｂｏｇ−Ｈａｎｓｅｎ編、ＴＥＸＴＯＰ，Ｌｅｍｃｈｅｓｖｅｊ１１，ＤＫ−２９００Ｈｅｌｌｅｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ発行、ＩＳＢＮ番号８７−９８４５８３−０−２、を含む、ＳｉｉｒｉＨｉｒｍｏ，ＭｅｅｍｅＵｔｔａｎｄＴｏｒｋｅｌＷａｄｓｔｒｏｅｍ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＣｌｉｎｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１２による総説に要約されている。

微生物感染の間、炎症性メディエーターが放出され活性化される。これらのいわゆる「炎症促進性サイトカイン」には、腫瘍壊死因子アルファおよびベータ（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）が含まれる。これらのサイトカインは、敗血症の炎症反応における不可欠の要素である。敗血症により誘発される多臓器不全は、現在、集中治療室における最大の死因である。

炎症反応は、微生物感染および心血管手術、例えば心肺バイパスに関連して誘発され、無症状性の臓器不全から重症の多臓器不全に及ぶ多くの生物学的影響を有する。サイトカインは、この反応における重要なメディエーターであると考えられている。

上記のサイトカインは、組織内ならびに内皮細胞および白血球の両方の表面上で、ヘパラン硫酸を含む一定範囲のグリコサミノグリカンすなわちＧＡＧに選択的に結合する能力を有する。

受容体
ヘパラン硫酸は、ほぼ全ての哺乳動物細胞の表面に存在するグリコサミノグリカンである。ヘパラン硫酸は、Ｄ−グルコサミンおよびウロン酸残基（Ｌ−イズロン酸およびＤ−グルクロン酸）を交互に配置することによって構築される。ヘパラン硫酸は、高度に荷電（硫酸化）した不均一な多糖類（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）であり、細胞表面上の多くの複合糖質（シンデカン、パールカン、グリピカン）の糖質部分となる。

多くの微生物は、受容体として、哺乳動物細胞表面のヘパラン硫酸を利用する。このメカニズムは、ほぼ全ての細菌、ウイルス、および寄生生物に共通でありかつ有効である。いくつかの微生物は、複数の複合糖質受容体を利用する。ヘパラン硫酸と共に使用される他の受容体の例は、特定のコンドロイチン硫酸およびシアル酸含有糖タンパク質である。

ヘパラン硫酸／コンドロイチン硫酸に結合する微生物は、口唇ヘルペスの原因因子である、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）；陰部ヘルペスの原因因子である単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）；免疫抑制性の患者における主要な悪化因子であるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；回帰熱を引き起こすデング熱ウイルス；およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等のウイルスによって；ならびにヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）、サングイス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）等の細菌によって；ならびに、（マラリアを引き起こす）熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）および（トリパノソーマ症を引き起こす）クルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉ）等の寄生生物によって例示される。

さらに、ＴＮＦ−β等のサイトカインも、結合および活性化のために細胞表面のヘパラン硫酸を利用する。

受容体としてのヘパリン
ヘパリンは、哺乳動物組織から単離された多糖類である。米国人科学者ＭｃＬｅａｎによって１９１６年に発見されて以来、ヘパリンはその抗凝血特性について知られており、そしてヘパリンは、５０年以上もの間、抗凝固剤および抗血栓剤として臨床的に使用されている。

ヘパラン硫酸は、全ての組織形成型の動物生命体（ｔｉｓｓｕｅ−ｏｒｇａｎｉｚｅｄａｎｉｍａｌｌｉｆｅｆｏｒｍｓ）において遍在的な成分であるのに対して、ヘパリンは哺乳動物組織において極めて特有の分布を有する。ヘパリンは、ヘパラン硫酸と対照的に、マスト細胞の好塩基性顆粒にのみ存在する。しかし、今日、ヘパリンは、血栓塞栓性疾患の予防および治療における確立された立場に加えて、抗凝固性と関係しない幅広いスペクトルの様々な活性を有することが実証されている。

血中の多くのタンパク質は、高い親和性で、ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸に結合する。その例は、抗トロンビン（ＡＴ）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、成長因子（例えば線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子等）である。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もまた結合するが、その親和性は低い。他方、ＨＳＡは、血中に多量に存在する。

感染を妨げるのにこれらのヘパリンの特性を利用するため、ヘパリンフラグメントおよび／またはシアル酸含有フラグメントを血管系に導入することが企図されている。それによって、これらのフラグメントは微生物のレクチンに結合し、それらをブロックし、そしてそれらが哺乳動物細胞表面上の受容体に結合するのを妨げることになると考えられた。このコンセプトは、多くの科学者によって試行されたが、その成功は限定的であり、その原因はほとんどの場合、大量のヘパリンを血管系に導入した際の出血性合併症であった。

ＵＳ６,１９７,５６８は、フラビウイルスおよび出血熱ウイルスの硫酸化ポリアニオン依存的な相互作用に基づくフラビウイルスおよびその他の出血熱ウイルス、例えばデング熱ウイルスの単離検出方法を記載している。

腎臓透析、心肺バイパス、および血漿瀉血を含む様々な臨床状況において体外デバイスが使用されている。

「体外療法」は、酸素、抗凝固剤、麻酔剤等の所望の成分を体液に添加できる手技を意味する。逆に、毒物等の望ましくない成分を体液から体外に除去することもできる。その例は、血液から老廃物を洗い流す技術である血液透析および血液濾過である。

本発明の目的は、様々な病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質により引き起こされるまたは悪化する疾患または状態に罹患した哺乳動物を、当該哺乳動物の血液から当該病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質を除去することによって処置する方法を提供することである。

本発明の別の目的は、哺乳動物の血液からの病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質の体外除去法を提供することである。

上記の目的および以下の説明を読んだ後に当業者に明らかとなるであろう本発明のさらなる目的は、本明細書中に記載されるような本発明の様々な側面によって達成される。

本発明の第一の側面は、
ａ）哺乳動物の血液サンプルを供給する工程、
ｂ）該サンプルを、固体担体に固定化された、病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質に対して結合親和性を有する糖質に、血液サンプル中の任意の病原性微生物、炎症性細胞および炎症性タンパク質が糖質に結合できる条件下で接触させる工程、
ｃ）サンプルを、病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質が少なくとも部分的に固体担体上に保持されるように、固体担体から分離する工程、および
ｄ）病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質の量が減少したサンプルを回収する工程、
を含む、哺乳動物の血液からの病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質の体外除去法を提供する。

ヘパリンフラグメントおよび／またはシアル酸含有フラグメントを患者の血管系に導入するという先行技術のコンセプトは、限定的な成功しか示しておらず、その原因はほとんどの場合、大量のヘパリンを血管系に導入した際の出血性合併症であった。本発明に従う方法は、特に製造実施例６に記載される、固体表面に固定化された糖質によってこれらの問題を解決する。

本発明の方法により定義される固定化糖質の使用はまた、さらなる予想外の利点を提供する。本発明者らは、この糖質が相当量の除去対象化合物に結合するのに必要な能力を得るためには、この糖質を固体表面に固定する必要があることを見出した。この予想外の特性は、溶液中では過剰なヘパリンに対して３％未満のウイルスしか結合しない（比較実施例１）が、固定化ヘパリンに対しては９４％以上のウイルスが結合する（実施例１）ことを示す、ＨＳＶ−１についての比較実施例１および実施例１に記載されている。

本発明の方法は、敗血症または敗血症性ショックに罹患した患者の血流からその状態の原因となる病原体を除去することによって該患者の安全かつ効率的な処置を実現する。本発明の方法は、多くの異なる病原性微生物、炎症性細胞および炎症性タンパク質の除去を可能にする。本発明の方法を用いて除去され得る、敗血症に共通して関連する病原性微生物の例には、ブドウ球菌属、例えば黄色ブドウ球菌、連鎖球菌属、および大腸菌が含まれる。

ヘパリンおよびヘパラン硫酸は両方とも、発明の背景の節で例示したように多くの成分に結合するので、ヘパリン表面は、血液と接触させた場合、これらの多くのタンパク質で覆われてしまい、従って微生物が付着するのを防止するであろうということは期待された。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の方法およびデバイスを用いることで、ヒトを含む哺乳動物由来の血清および全血の極めて効率的な浄化を達成できることを見出した。本発明においては、並のサイズのカラムを取り扱って（ｍａｎａｇｅｄ）、血液の血清および全血から相当量のウイルスをほぼ完全に除去することができたことを開示する。例えば、実施例２、３、および４を参照されたい。

一つの実施態様において、前記病原性微生物は、細菌、ウイルス、および寄生生物からなる群より選択される。

一つの実施態様において、病原性微生物はウイルスである。より特定の実施態様において、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、インフルエンザＡ型ウイルス、サイトメガロウイルス、およびヒト免疫不全ウイルスからなる群より選択される。別のより特定の実施態様において、ウイルスは、単純ヘルペスウイルス１型および単純ヘルペスウイルス２型からなる群より選択される。

別の実施態様において、前記病原性微生物は細菌である。より特定の実施態様において、細菌は、ヘリコバクター・ピロリ、サングイス連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、および結核菌からなる群より選択される。好ましい実施態様において、病原性微生物はヘリコバクター・ピロリまたは黄色ブドウ球菌である。

さらに別の実施態様において、前記病原性微生物は寄生生物である。より特定の実施態様において、寄生生物は、熱帯熱マラリア原虫およびクルーズ・トリパノソーマからなる群より選択される。

さらなる実施態様において、前記炎症性細胞は、炎症性リンパ球および炎症性マクロファージからなる群より選択される。

なおさらなる実施態様において、前記炎症性タンパク質は炎症促進性サイトカインである。より特定の実施態様において、炎症促進性サイトカインは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ−β）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）からなる群より選択される。

一つの実施態様において、前記哺乳動物の血液はヒトの血液である。

本発明の方法の一つの実施態様において、前記糖質は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、シアル酸含有糖質、およびノイラミン酸含有糖質からなる群より選択される。より特定の実施態様において、糖質はヘパリンである。

さらに別の実施態様において、前記固体担体は、微粒子または中空繊維を含む。本発明の特定の実施態様において、前記固体担体の原材料は、ガラス、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、架橋型デキストラン、架橋型アガロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、シリコン、テフロン^(R)、およびポリウレタンからなる群より選択される。

さらなる実施態様において、前記糖質は、前記固体担体に共有結合により連結されている。より特定の実施態様において、前記糖質は、前記固体担体に共有結合性末端結合により連結されている。糖質の固体担体への共有結合性結合は、非共有結合性結合と比較して、表面密度および固定化分子の配向等のパラメータのより良い制御を提供する。これらのパラメータは、固定化された糖質分子に対する病原体の最適な結合を提供するために重要であることが本発明者らによって示されている。固体担体における糖質の表面濃度は、好ましくは、１〜１０μｇ／ｃｍ²の範囲内であるべきである。共有結合性末端結合は、糖質が、糖質分子の末端残基を通じて固体担体に共有結合により結合していることを意味する。本発明の第二の側面は、哺乳動物の血液からの病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質を体外除去するための、固体担体に固定化された、病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質に対して結合親和性を有する糖質を含むデバイスの使用を提供する。

本発明の第二の側面に従う使用の実施態様は、病原性微生物、炎症性細胞、炎症性タンパク質、哺乳動物の血液、糖質、固体担体、および固定化に関しては、本発明の第一の側面に従う方法について上述したそれらに対応する。

本発明の第三の側面は、病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質により引き起こされるまたは悪化する状態を処置するためのデバイスの製造における、固定担体に固定化された、病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質に対して結合親和性を有する糖質の使用を提供する。

本発明の第三の側面に従う使用の実施態様は、病原性微生物、炎症性細胞、炎症性タンパク質、哺乳動物の血液、糖質、固体担体、および固定化に関しては、本発明の第一の側面に従う方法について上述したそれらに対応する。

本発明に従う使用および方法において言及されるデバイスは、患者、例えば腎不全に罹患した患者由来の血液および血清の体外処置のための従来的なデバイスを含み得る。

体外循環用の医療デバイスに接触した血液の局所血流パターンは、剪断の促進（ｓｈｅａｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を介する血塊の形成および停滞域における血小板の凝集に影響することが知られている。従って、本発明の第二、第三、および第四の側面において使用されるデバイスは、これらの問題を生じない様式で設計される必要がある。

本発明のいくつかの実施態様において使用されるデバイスは、例えば、以下の特徴を有し得る：
- １〜５００ｍｌ／分、好ましくは５〜２５０ｍｌ／分の範囲の血流
- 低い血流抵抗
- 糖質を固定化する担体の大きな表面積、例えば約０.１〜１ｍ²
- 安定なコーティング（接触した血液に糖質が漏出しないこと）
- デバイス内での適切な血行動態特性（停滞域がないこと）
- 最適な生体適合性

本発明に従う使用または方法において使用され得るこのようなデバイスの非限定的な例は、小児科血液透析装置、例えばＧａｍｂｒｏＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ製のＰｒｉｓｍａＭ１０血液フィルター／透析装置である。血液または血清の体外処置用の他のモデルまたはタイプのデバイスもまた使用され得る。

本発明の第四の側面は、
ａ）対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）から血液を抽出する工程、
ｂ）抽出した血液を、固体担体に固定化された、病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質に対して結合親和性を有する糖質を含むデバイスに、病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質が糖質に結合できる条件下で接触させる工程、および
ｃ）病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質の量が減少した血液を対象の血流に再導入する工程、
を含む、病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質により引き起こされるまたは悪化する状態に罹患した哺乳動物対象の処置方法を提供する。

本発明に従う処置方法の実施態様において、血液の抽出および再導入は、対象の血流の一部を含む連続的なループにおいて行われる。

本発明の第四の側面に従う処置法の実施態様は、病原性微生物、炎症性細胞、炎症性タンパク質、哺乳動物の血液、糖質、固体担体、および固定化に関しては、本発明の第一の側面に従う方法について上述したそれらに対応する。

本明細書中で使用する場合、「病原性微生物」という用語は、生体に導入されたときに、その生体において疾患を引き起こし得る微生物を意味する。「病原性微生物」の例には、細菌、ウイルス、および寄生生物が含まれる。

本明細書中で使用する場合、「炎症性細胞」と言う用語は、哺乳動物において炎症反応に関与する細胞を意味する。「炎症性細胞」の例には、炎症性リンパ球および炎症性マクロファージが含まれる。

本明細書中で使用する場合、「炎症性タンパク質」という用語は、例えば、微生物感染または免疫に関連して放出されるタンパク質、例えばサイトカインを意味する。

本明細書中で使用する場合、「サイトカイン」という用語は、例えば、微生物感染または免疫に関連して放出される、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、および腫瘍壊死因子からなる群より選択されるタンパク質を意味する。

実施例
製造実施例１
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５のアミノ化
メタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ₄、６.０ｇ）を水（９９４ｍｌ）に溶解し、水１Ｌ中のＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（５０ｇ）に加えた。この混合物を、暗所にて２４時間振盪した。水５×１ｌおよび最後は０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.０で濾過および洗浄を行った後、得られた生成物をリン酸緩衝液、ｐＨ７.０（３５０ｍｌ）に懸濁し、ポリエチレンイミン溶液（１００ｍｌＬｕｐａｓｏｌ（ＢＡＳＦ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、水中５％）を加えた。ＮａＢＨ₃ＣＮ、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１００ｍｌ中０.５ｇ、リン酸緩衝液、０.１Ｍ、ｐＨ７.０）の水溶液を添加することによってゲルを安定化させた。このゲルを上記のように濾過および洗浄し、最後に酢酸緩衝液（５００ｍｌ、０.１Ｍ、ｐＨ４.０）で洗浄することによってアミノ化ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５（８５ｇ）を得た。

製造実施例２
クロマトグラフゲルへのヘパリンの共有結合性末端結合
製造実施例１に記載のようにして得たアミノ化ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５（８５ｇ）を酢酸緩衝液（８００ｍｌ、０.１Ｍ、ｐＨ４.０）に懸濁し、亜硝酸分解ヘパリン４.０ｇ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ製のヘパリン）を加えた。０.５時間振盪した後、ＮａＢＨ₃ＣＮ（０.４ｇ）を加えた。この反応混合物を２４時間振盪し、次いで上記のように処理することによってヘパリン化ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５（８０ｇ）を得た。
このゲルは、２％ヘパリン（ｗ／ｗ、硫黄分析）を含むものであった。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５ビーズは、５０〜１５０μｍの平均径を有した。大まかな計算から、１ｃｍ³に１０⁶個のビーズが含まれ、０.０３ｍ²／ｃｍ³のビーズ表面積を有することが示された。さらに、ヘパリンがビーズの表面にのみ結合したとすれば、２％ヘパリンｗ／ｗを含むヘパリン化ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５は、約０.００３μｇヘパリン／ｃｍ³を有するものであった。

製造実施例３
アミノ化グラスウールへのヘパリンの共有結合性結合
以下に記載する一般的な手順を用いてグラスウール素材をヘパリン化した。
グラスウールを酸（ＨＣｌ）で十分に洗浄し、無水エタノールでリンスし、オーブンに入れて１００℃で４時間乾燥させた。
ポリアミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはキトサンの水溶液で処理することにより、反応性アミノ官能基をグラスウール表面に導入した。いくつかの目的のために、表面上のポリアミンを、二官能性試薬、例えばクロトンアルデヒドまたはグルタルアルデヒドで架橋することによって安定化させることができる。
硫酸化多糖類（硫酸デキストランまたはヘパリン）によるイオン性架橋によりコーティングをさらに安定化させた。必要に応じてこれらの工程を繰り返し、サンドイッチ構造を構築した。各工程の間で注意深くリンス（水、適当な緩衝液）を行う必要があった。ネイティブヘパリンのアミノ化表面への末端結合（ＥＰＡ）は、最後のＰＥＩまたはキトサン添加の後に、ネイティブヘパリンの還元末端残基におけるアルデヒド官能基を利用した還元的アミノ化によって行った。カップリングは、水溶液中で、本質的に製造実施例２に記載した還元的アミノ化（シアノ水素化ホウ素、ＣＮＢＨ₃ ⁻）によって行った。
製造実施例２に記載した表面の分析により、およそ１０ｍｇ／ｃｍ²のヘパリンがガラス表面に結合したことを確認した。

製造実施例４
アミノ化ポリマー表面へのヘパリンの共有結合性結合
以下に記載する一般的な手順を用いてポリマー表面をヘパリン化した。
いくつかの反応性官能基（−ＳＯ₃Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ＝Ｏ、−Ｃ＝Ｃ−）と共に親水性の特性を導入するため、ポリマー表面を、酸化剤（過マンガン酸カリウム、ペルオキシ二硫酸アンモニウム）でエッチングした。表面はまた、プラズマまたはコロナによってもエッチングすることができる。
ポリアミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはキトサンによる処理により、反応性アミノ官能基を導入した。いくつかの目的のために、表面上のポリアミンを、二官能性試薬、例えばクロトンアルデヒドまたはグルタルアルデヒドで架橋することによって安定化させることができる。
硫酸化多糖類（硫酸デキストランまたはヘパリン）による架橋によりコーティングをさらに安定化させた。必要に応じて、これらの工程を繰り返し、サンドイッチ構造を構築した。各工程の間で注意深くリンス（水、適当な緩衝液）を行う必要があった。ネイティブヘパリンのアミノ化表面への末端結合（ＥＰＡ）は、最後のＰＥＩまたはキトサンの添加の後に、ネイティブヘパリンの還元末端残基におけるアルデヒド官能基を利用した還元的アミノ化によって行った。ヘパリンの部分的な亜硝酸分解により、還元末端残基においてより反応性のアルデヒド官能基を達成することもできる。これにより反応時間が短縮されるが、固定化したヘパリンの分子量が小さくなる。カップリングは、水溶液中で、本質的に製造実施例２に記載した還元的アミノ化（シアノ水素化ホウ素、ＣＮＢＨ₃ ⁻）によって行った。
１〜１０μｇ／ｃｍ²のヘパリンを、ガラス、セルロース、キチン等の全ての親水性表面に、およびポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ＰＴＦＥ等のおおよそ全ての疎水性ポリマーに結合させることができた。

製造実施例５
ポリマー表面へのヘパリンの一点型または多点型共有結合性結合
水溶液中での過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化によってヘパリン鎖にアルデヒド官能基を導入したことを除いて製造実施例２に記載の通りに行った。

製造実施例６
中空繊維の内腔へのヘパリンの結合
この製造実施例においては、小児科血液透析装置を使用した。透析装置の繊維は、内径２００ミクロンおよび壁厚４０ミクロンのポリスルホン製であった。血液に接触する資材の総表面積は４０００ｃｍ²であり、血液側充填量（ｐｒｉｍｉｎｇｖｏｌｕｍｅ）は２８ｍｌであった。
エッチング工程を省略したことを除いて概ね製造実施例４に記載の通りにアミノ化手順を行った。ポリスルホンは親水性であり、エッチングは不要であった。ヘパリンの固定化は、製造実施例２に記載のように、ＮａＢＨ₃ＣＮと共に亜硝酸分解ヘパリン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製のヘパリン）を含む溶液をポンプ送りすることによって行った。ヘパリンの量の測定は破壊的な手順なので、同一条件下でヘパリン化した参照透析装置を分解し、その繊維を硫黄分析に供した。その結果から、ヘパリン含有量が約５μｇヘパリン／ｃｍ²であり、このデバイスにヘパリンが２０ｍｇが含まれることになることが明らかになった。

製造実施例７
中空繊維の内腔への末端シアル酸残基を有するオリゴマーの共有結合性結合
この製造実施例においては、還元末端残基のアルデヒド基をカップリングに使用した。繊維のアミノ化は、製造実施例６に記載の通りに行い、末端シアル酸残基を含む式Ｉのオリゴ糖のカップリングは、ＮａＢＨ₃ＣＮ（０.４ｇ）と共に酢酸緩衝液（８００ｍｌ、０.１Ｍ、ｐＨ４.０）に溶解した式Ｉの化合物を室温で２４時間循環させることによって行った。その結果から、シアル酸含有量が約２μｇ／ｃｍ²であることが明らかになった。

比較実施例１
溶液中のヘパリンへのＨＳＶ−１の結合
１０⁷プラーク形成単位のウイルス（単純ヘルペスウイルス１型ＫＯＳ３２１株）を含む溶液（１０μｌ）を、総量４００μｌの緩衝ＮａＣｌ中２０μｌの³Ｈ標識ヘパラン硫酸（ＨＳ）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、この溶液を、ウイルスおよび結合したＨＳを保持するＭｉｃｒｏｓｅｐ１Ｍフィルターを通じて遠心分離した。ＨＳの２.３％がウイルスに結合し（４７９ＣＰＭ）、ＨＳの９７.７％が未結合でありフィルターを通過した。

実施例１
Ｓｅｐｈａｄｅｘビーズに固定化したヘパリンへの結合による緩衝生理食塩水からのＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルス粒子の除去
製造実施例２のようにヘパリンでコーティングしたＳｅｐｈａｄｅｘビーズを緩衝ＮａＣｌ（ＰＢＳ）に浸し、０.８ｍｌを二つの小さな使い捨てカラムの各々に移し、およそ１ｃｍのゲル層を形成した。三回洗浄した後、³Ｈチミジン放射標識ウイルス５０μｌをＰＢＳ１５０μｌに懸濁した。１０¹¹個のウイルス粒子に相当する１０⁹プラーク形成単位のＨＳＶ−１をカラム１に加え、１０¹⁰個のウイルス粒子に相当する１０⁸プラーク形成単位のＨＳＶ−２をカラム２に加えた。ウイルスを各々のカラムに吸着させた。その後、ＰＢＳ０.８ｍｌを各カラムに加え、非吸着ウイルスの概算のために通過液を集めた。

その後、両方のカラムをＰＢＳ１ｍｌで４回の洗い出しを行い、その洗浄液を洗い流されたウイルスの定量のためのフラクションとして集めた。これらおよびその後のフラクションをシンチレーションバイアルに移し、ベータカウンターによるｃｐｍの測定を通じてウイルス量の定量を行った。次の工程において、カラムを、３回の、２ＭＮａＣｌ１ｍｌによる各々のヘパリン結合ウイルスの溶出に供し、各カラムから３つのフラクションを集めた。その後、ＰＢＳ中５％ＳＤＳ（ＰＢＳ−ＳＤＳ）１ｍｌを二度添加することによって溶出を行い、各カラムから二つのフラクションを集めた。最後に、二つのカラムのヘパリンコートビーズを各々ＰＢＳ−ＳＤＳ１ｍｌに懸濁し、２００μｌアリコートを、放射活性の測定による残存する結合ウイルス粒子の定量に供した。

その結果を以下の表１に示す。示されるように、ＨＳＶ−１粒子の５.５％およびＨＳＶ−２粒子の１１.７％のみがカラムに吸着しなかった。さらに、放射活性で標識されているのはウイルスＤＮＡであってヘパリン結合タンパク質ではないので、これらの非吸着粒子は、エンベロープ（すなわち、ヘパリンに結合する外側の、脆いウイルス部分）が破壊された非感染性ウイルスを表わす可能性がある。残りのウイルス（ＨＳＶ−１の９４.５％およびＨＳＶ−２の８８.３％）は、このカラムのヘパリンコートビーズに結合した。４連続の洗い出しによってはＨＳＶ−１の０.５％およびＨＳＶ−２の１.１％のみしか除去されなかったという事実から判断すれば、その結合は強いものと考えられる。ウイルスを溶出させるための３連続の試行における２ＭＮａＣｌの限られた能力は、ヘパリンコートビーズに対する両ウイルスの結合の高親和性という特性を強調している。一方、ＰＢＳ−ＳＤＳによっては、相当量のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２が溶出された。

合計するとＨＳＶ−１の４８％およびＨＳＶ−２の６８.８％がカラムから回収された。これは、２ＭＮａＣｌがサンプルの放射活性を、本発明者らの以前の観察によればおよそ３０％自然減させるという事実、およびおそらくはＳＤＳ−ＰＢＳもこの効果を有することに起因し得る。

まとめると、この結果は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルス粒子が、ヘパリンコートＳｅｐｈａｄｅｘビーズを含む短いカラムを通過させることによって液相から除去され得る、および抽出されたウイルスはカラムに高い親和性で結合するという原理を証明する。

実施例２
Ｓｅｐｈａｄｅｘビーズに固定化したヘパリンに対する結合によるヒト血清からのＨＳＶ−１ウイルス粒子の除去
１０¹¹個のウイルス粒子に相当する１０⁹ＰＦＵの量の放射標識ＨＳＶ−１ウイルス粒子をヒト血清０.５ｍｌと混合した点が異なるが実施例１に記載される実験手順を使用し、次いでこれを使い捨てカラム中のヘパリンコートビーズにアプライした。その後、溶出および洗い出しを含む手順を実施例１に従い行った。その結果を以下の表２に示す。

示されるように、ヒト血清に懸濁したＨＳＶ−１粒子の９７.６％がカラムに結合した。洗い出しを４回行うことによっても、ウイルス粒子の３.８％しか除去されなかった。２ＭＮａＣｌを使用しても、ウイルスの２.７％しか溶出せず、ＳＤＳによってはさらに３.５％が溶出したにすぎなかった。これらの結果の結論は、重症播種性感染中の現実の生物状況である、血清中へのウイルスの懸濁が、放射標識ウイルスの結合に関するウイルス除去用カラムの性能を改善したこと、およびＨＳＶ−１粒子の２.４％のみが非吸着であったことである。考えられる説明としては、血清タンパク質がウイルス粒子を安定化させるのを助け、それによってヘパリン化ＳｅｐｈａｄｅｘビーズによるＨＳＶ−１の除去が改善されたということである。

実施例３
中空繊維血液透析装置に固定化したヘパリンへの結合によるヒト血清からのＨＳＶ−１ウイルス粒子の除去
１０¹¹個のウイルス粒子に相当する１０⁹ＰＦＵの量の放射標識ＨＳＶ−１ウイルス粒子をヒト血清０.５ｍｌと混合した点が異なるが実施例１に記載される実験手順を使用し、次いでこれを製造実施例６のヘパリンコート中空繊維透析装置にアプライした。その後、溶出および洗い出しを含む手順を実施例１に従い行った。その結果を以下の表３に示す。
示されるように、ヒト血清に懸濁したＨＳＶ−１粒子の９２.３％がこのカラムに結合した。４回の洗い出しによっても、ウイルス粒子の４.２％しか除去されなかった。２ＭＮａＣｌによっても、ウイルスの４.０％しか溶出せず、ＳＤＳによってはさらに４.５％が溶出したにすぎなかった。これらの結果の結論は、ヒト血清に懸濁したウイルス粒子のヘパリン化繊維への結合は、同じように懸濁したウイルスのヘパリンコートＳｅｐｈａｄｅｘビーズへの結合に匹敵すること、およびＨＳＶ−１粒子の７.７％のみが非吸着であったということである。

実施例４
Ｓｅｐｈａｄｅｘビーズに固定化したヘパリンへの結合によるヒト全血からのＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルス粒子の除去
１ｍｌあたり１０¹¹個のウイルス粒子に相当する量の放射標識ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルス粒子をヒト血液１ｍｌと混合した点が異なるが実施例１に記載される実験手順を使用し、次いでこれをヘパリンコートビーズ１ｍｌを含む使い捨てカラムにアプライした。その後、溶出および洗い出しを含む手順を実施例１に従い行った。
その結果を以下の表４に示す。示されるように、ヒト血液に懸濁したＨＳＶ−１粒子の９９.１％およびＨＳＶ−２粒子の９９.８％がこのカラムに結合した。

実施例５
固定化したシアル酸含有オリゴ糖への結合によるヒト血清からのインフルエンザＡ型ウイルスの除去
インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１のウイルスストックを、３５℃、標準的な条件下で３日間培養したＭＤＣＫ細胞中で複製させた後、細胞をホモジナイズし、フォーカス形成単位（ＦＦＵ）／ｍｌの数を評価するため滴定を行った。終濃度１０⁶ＦＦＵ／ｍｌになるようウイルス粒子をヒト血清に懸濁した。懸濁物１０ｍｌを、製造実施例７に記載の方法を用いて製造したシアル酸コート中空繊維透析装置にアプライした。透析装置を通した後のインフルエンザＡ型含有血清の感染力を滴定し、これをこのデバイスを通さなかった同じウイルス含有血清のアリコートと比較したところ、インフルエンザＡ型ウイルスのＦＦＵの８７％がこの繊維への結合を維持したことが分かった。

実施例６
固定化したヘパリンへの結合によるヘリコバクター・ピロリおよび黄色ブドウ球菌の除去
４つの滅菌ピペットに、製造実施例３に記載のようにヘパリン化したグラスウール（０.５ｍｌ）を充填した。このようにして作製した「カラム」を、３ｍｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７.２で洗浄した。二つの異なるヘリコバクター・ピロリ株および二つの異なる黄色ブドウ球菌株を試験した。４つの異なる細菌サンプルの各々をＰＢＳ緩衝液に懸濁し、これを別々の「カラム」にアプライした。サンプル中の細菌量を、カラムへの適用前およびカラムからの溶出後に、５６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）および生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）により測定した。以下の表から明らかなように、ヘリコバクター・ピロリのほぼ９０％および黄色ブドウ球菌のほぼ５０％がカラムに固定された。

Claims

ａ）哺乳動物の全血サンプルを準備し、
ｂ）該サンプルを、固体担体に固定化された、病原性微生物に対して結合親和性を有するヘパリンに、全血サンプル中の任意の病原性微生物がヘパリンに結合できる条件下で接触させ、ここで該ヘパリンは固体担体に共有結合性末端結合により連結されており、
ｃ）サンプルを、病原性微生物が少なくとも部分的に固体担体上に保持されるように、固体担体から分離し、そして
ｄ）病原性微生物の量が減少したサンプルを回収する、
段階を含む、哺乳動物の全血からの、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、インフルエンザＡ型ウイルス、ヘリコバクター・ピロリ、および黄色ブドウ球菌からなる群より選択される病原性微生物の体外除去法。
哺乳動物の全血がヒトの全血である、請求項１に記載の方法。
固体担体が微粒子を含む、請求項１または２に記載の方法。
固体担体が一つまたはそれ以上の中空繊維を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
固体担体の原材料が、ガラス、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、架橋型デキストラン、架橋型アガロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、シリコン、テフロン、およびポリウレタンからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、インフルエンザＡ型ウイルス、ヘリコバクター・ピロリ、および黄色ブドウ球菌からなる群より選択される病原性微生物により引き起こされるまたは悪化する状態を処置するためのデバイスの製造における、固体担体に固定化された、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、インフルエンザＡ型ウイルス、ヘリコバクター・ピロリ、および黄色ブドウ球菌からなる群より
選択される病原性微生物に対して結合親和性を有するヘパリンの使用であって、ここで該ヘパリンは固体担体に共有結合性末端結合により連結されている、上記使用。
哺乳動物の全血がヒトの全血である、請求項６に記載の使用。
固体担体が微粒子を含む、請求項６または７に記載の使用。
固体担体が一つまたはそれ以上の中空繊維を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用。
固体担体が、ガラス、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、架橋型デキストラン、架橋型アガロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、シリコン、テフロン、およびポリウレタンからなる群より選択される、請求項６〜９のいずれか一項に記載の使用。