JP5713251B2 - 細胞判別方法、細胞判別用の参照データ生成方法、および細胞判別装置 - Google Patents

Description

本発明は、細胞判別方法、細胞判別用の参照データ生成方法、および細胞判別装置に関するものである。

規則正しく振動する細胞の代表的な一例として、心筋細胞がある。しかし、一般的に、細胞の多くは心筋細胞のように規則的に振動するわけではないので（例えば、下記の非特許文献１を参照）、細胞の振動に伴う規則的な周波数を用いた細胞判別は、一般的な細胞には適用できない。

また、蛍光ラベルをせずに、生細胞の細胞膜の状態を測定する技術として、例えば走査型プローブ顕微鏡（SPM；Scanning probe microscope）や、原子間力顕微鏡（AFM；Atomic force microscope、下記の非特許文献２を参照）などが知られている。いずれもプローバーであるカンチレバーを細胞に接触あるいはオングストローム単位で接近させて細胞全体をスキャンする方式であるが、このような装置を用いて細胞判別を行うには以下のような問題点が存在する。すなわち、測定には細胞に機械的応力を加えることが必要であるため、細胞への影響を避けられない。また、生きた細胞を簡便に測定するにはある程度の熟練を要する。更に、１個１個の細胞をカンチレバーで走査する必要があるために、複数の細胞について細胞膜の変位の時間変化を計測するには長時間がかかり、現実的でない。更にまた、細胞膜の変動を指標とした細胞の識別や状態の把握にまで踏み込んだ技術はまだ公開されていない。特に、細胞診断への応用を考えた際に、生細胞に対して非侵襲で計測を実現することが重要であるが、上記の従来技術はその要件を満たしていない。

一方で、光学顕微鏡における位相差コントラスト観察や微分干渉コントラスト観察は細胞の形態を非侵襲で光学的に観察する手段として広く利用されている。しかしながら、上記の観察方法によると、細胞内の構造の変化は明瞭に観察できるが、細胞膜の状態を例えばナノメートルの高精度で計測することはできない。

Jan Domke, "Mappingthe mechanical pulse of signal cardiomyocytes with the atomic forcemicroscope", Eur. Biophys.J, 28, 179, 1999 Balint Szabo, "Atomicforce microscopy of height fluctuations of fibroblast cells", Phy. ReviewE, 65, 041910, 2002

ここで、上記の非特許文献２によれば、原子間力顕微鏡（以下、ＡＦＭ）を用いる場合には細胞の高さの変動をナノメータスケールの高精度で捉えることができるとされている。その一方で、細胞１つにおける各部位の高さ方向の変動の様子の差異は、生物学的な活動が異なることに起因していることとしている。すなわち、上記の事実は、ＡＦＭを用いて細胞を振動によって判別しようとした場合、高い精度で細胞の振動を計測できたとしても、細胞の特徴的な変動を示す部位を何らかの方法で予め知っておく必要があることを示唆する。しかし、非特許文献２にも記述されているように、ＡＦＭは探針を使うため、１つの細胞に複数の探針を配置することは物理的に難しい。そのため、１つのみの探針により細胞の特徴的な変動を示す部位を探し出すのは現実的でなく、結果的に、ＡＦＭを用いて細胞を判別することには難があるということとなる。また、細胞全体の走査のために分単位で時間がかかるという事実からも、ＡＦＭを用いて細胞判別をすることが困難であることが分かる。

そこで、本発明は上記に鑑みてなされたもので、細胞を非侵襲且つ高精度で判別することが可能な細胞判別方法、細胞判別用の参照データ生成方法、および細胞判別装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の細胞判別方法は、被検体である細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し、且つ当該計測結果に対して周波数解析を行うことにより、前記細胞を判別するための参照データを生成する参照データ生成ステップと、前記細胞の前記振動を前記定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し且つ当該計測結果に対して前記周波数解析を行った結果を、前記参照データ生成ステップにて生成された前記参照データと照らし合わせることにより、前記被検体の前記細胞を判別する細胞判別ステップと、を備えることを特徴とする。

また、本発明の細胞判別用の参照データ生成方法は、細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測する振動計測ステップと、前記振動計測ステップにおける当該計測結果に対して周波数解析を行う周波数解析ステップと、前記周波数解析ステップにおける当該周波数解析結果を近似することにより、前記振動の特性を数値化する数値化ステップと、前記数値化ステップにおける当該数値化の結果を元に散布図を作成する散布図作成ステップと、前記散布図作成ステップにて作成された前記散布図における所定領域を前記細胞を判別するための判別領域として区画する領域区画ステップと、を備えることを特徴とする。

また、本発明の細胞判別装置は、被検体である細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し、且つ当該計測結果に対して周波数解析を行うことにより、前記細胞を判別するための参照データを生成する参照データ生成手段と、前記細胞の前記振動を前記定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し且つ当該計測結果に対して前記周波数解析を行った結果を、前記参照データ生成手段が生成した前記参照データと照らし合わせることにより、前記被検体の前記細胞を判別する細胞判別手段と、を備えることを特徴とする。

このような本発明の細胞判別方法、細胞判別用の参照データ生成方法、および細胞判別装置によれば、細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて計測する。定量位相顕微鏡を用いた計測方法によれば、光を使った非侵襲で、更にナノメータスケールの高精度で、細胞の振動を計測することができる。また、ＡＦＭの場合と異なり、多点計測ができるため、細胞の特徴的な変動を示す部位を知らなくても、細胞全体としての特徴を捉えることができる。更に、計測時間面において、ＡＦＭの場合でのような長時間はかからないというメリットがある。そして、以上のような定量位相顕微鏡による計測方法を用いて、参照データを生成し、また当該参照データを用いて被検体の細胞を判別するため、結果的に、非侵襲、高精度、更に高速で細胞判別を行うことができる。

また、本発明において、前記参照データ生成ステップは、前記細胞の前記振動を前記定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測する振動計測ステップと、前記振動計測ステップにおける当該計測結果に対して前記周波数解析を行う周波数解析ステップと、前記周波数解析ステップにおける当該周波数解析結果を近似することにより、前記振動の特性を数値化する数値化ステップと、前記数値化ステップにおける当該数値化の結果を元に散布図を作成する散布図作成ステップと、前記散布図作成ステップにて作成された前記散布図における所定領域を前記細胞を判別するための判別領域として区画する領域区画ステップと、を備え、前記参照データは、前記領域区画ステップにて当該領域区画された当該散布図であっても良い。

また、本発明において、前記参照データ生成手段は、前記細胞の前記振動を前記定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測する振動計測手段と、前記振動計測手段による当該計測結果に対して前記周波数解析を行う周波数解析手段と、前記周波数解析手段による当該周波数解析結果を近似することにより、前記振動の特性を数値化する数値化手段と、前記数値化手段による当該数値化の結果を元に散布図を作成する散布図作成手段と、前記散布図作成手段が作成した前記散布図における所定領域を前記細胞を判別するための判別領域として区画する領域区画手段と、を備え、前記参照データは、前記領域区画手段が当該領域区画した当該散布図であっても良い。

この発明によれば、細胞判別を行う際に用いられる参照データを生成するための具体的な方法が提供される。

また、本発明において、前記振動計測ステップでは、前記細胞に設けられた複数の計測領域に対してそれぞれ当該計測を行い、前記周波数解析ステップでは、それぞれの前記計測領域の当該計測結果に対して前記周波数解析を行い、且つ当該周波数解析結果を平均化することにより前記細胞全体としての周波数解析結果を得ても良い。

この発明によれば、細胞の振動計測および当該計測結果に対する周波数解析の具体的な方法が提供される。一つの細胞に対して多点計測を行った結果を平均化することにより、細胞全体としての周波数解析結果が得られる。このため、細胞の特徴的な変動を示す部位を知らなくても、細胞全体としての周波数解析結果を得ることができ、これをもって細胞判別を行うことができる。

また、本発明において、前記周波数解析ステップでは、周波数およびパワースペクトルにより前記周波数解析が行われ、前記数値化ステップでは、前記周波数に対する前記パワースペクトルの値を近似化した近似線、および前記近似線における傾きを求め、前記散布図作成ステップでは、前記傾きを一の軸とし且つ所定の周波数における前記パワースペクトルの値を他の軸とする２次元上に、前記傾きに対して前記パワースペクトルの値を前記被検体の前記細胞ごとにプロットした図を、前記散布図として作成しても良い。

この発明によれば、周波数解析、近似による数値化、および参照データ生成の具体的な方法が提供される。

また、本発明において、前記散布図作成ステップでは、複数の前記所定の周波数に応じて複数の前記散布図が作成され、当該複数の前記散布図のうち、プロットされた前記パワースペクトルの値における決定係数の値が所定の値以下である前記散布図を、前記領域区画ステップにて当該領域区画される前記散布図として選択する散布図選択ステップを更に備えても良い。

この発明によれば、複数の散布図のうち細胞判別に適した散布図を選択するための具体的な方法が提供される。

また、本発明において、前記領域区画ステップにおける当該領域区画は、前記散布図上で区画線を設定することにより行われても良い。

この発明によれば、散布図上に細胞判別を行うための判別領域を区画する具体的な方法が提供される。区画線を設定することにより、領域区画を容易に行うことができる。

本発明によれば、細胞を非侵襲且つ高精度で判別することが可能な細胞判別方法、細胞判別用の参照データ生成方法、および細胞判別装置を提供することができる。

細胞判別装置１の構成概要図である。 細胞判別装置１のハードウェア構成図である。 定量位相顕微鏡の構成図である。 撮像部２５１または受光部２６１に到達する光の強度と光路長差との関係を示す図である。 被測定物２０９の一構成例を示す図である。 定量位相顕微鏡における干渉像の撮像を説明するための図である。 定量位相顕微鏡を用いて細胞の振動に対する時間変動を計測した一例を説明するための図である。 定量位相顕微鏡を用いて細胞の振動に対する時間変動を計測した一例を説明するための図である。 定量位相顕微鏡を用いて細胞の振動に対する時間変動を計測した一例を説明するための図である。 定量位相顕微鏡を用いて細胞の振動に対する時間変動を計測した一例を説明するための図である。 定量位相顕微鏡を用いて細胞の振動に対する時間変動を計測した一例を説明するための図である。 定量位相顕微鏡を用いて細胞の振動に対する時間変動を計測した一例を説明するための図である。 定量位相顕微鏡を用いて細胞の振動に対する時間変動を計測した一例を説明するための図である。 参照データ生成手順を示すフローチャートである。 本実施形態における周波数解析および数値化を説明するための図である。 図１５のグラフから作成される散布図の一例を示す図である。 第１実施形態における散布図の選択方法を説明するための図である。 第１実施形態における散布図の選択方法を説明するための図である。 細胞判別手順を示すフローチャートである。 図１９の細胞判別手順により細胞を判別した一例を示す図である。 第２実施形態における散布図の選択方法を説明するための図である。 第２実施形態における散布図の選択方法を説明するための図である。

以下、添付図面を参照して本発明にかかる細胞判別方法、細胞判別用の参照データ生成方法、および細胞判別装置の好適な実施形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

［第１実施形態］
（細胞判別装置１の構成）
まず、本発明の第１実施形態に係る細胞判別装置１の構成について説明する。図１は細胞判別装置１の構成概要図であり、図２は細胞判別装置１のハードウェア構成図である。

図２に示すように、細胞判別装置１は、物理的には、ＣＰＵ１１、ＲＯＭ１２及びＲＡＭ１３等の主記憶装置、キーボード及びマウス等の入力デバイス１４、ディスプレイ等の出力デバイス１５、他の装置との間でデータの送受信を行うためのネットワークカード等の通信モジュール１６、ハードディスク等の補助記憶装置１７などを含む通常のコンピュータシステムとして構成される。後述する細胞判別装置１の各機能は、ＣＰＵ１１、ＲＯＭ１２、ＲＡＭ１３等のハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、ＣＰＵ１１の制御の元で入力デバイス１４、出力デバイス１５、通信モジュール１６を動作させると共に、主記憶装置１２，１３や補助記憶装置１７におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。

図１に示すように、細胞判別装置１は、機能的には、振動計測部１１０（特許請求の範囲における「振動計測手段」に対応）、周波数解析部１２０（特許請求の範囲における「周波数解析手段」に対応）、数値化部１３０（特許請求の範囲における「数値化手段」に対応）、散布図作成部１４０（特許請求の範囲における「散布図作成手段」に対応）、散布図選択部１５０、領域区画部１６０（特許請求の範囲における「領域区画手段」に対応）、参照データ格納部１７０、およびデータ照合部１８０を備えて構成される。

細胞判別装置１は、被検体である細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し、且つ当該計測結果に対して周波数解析を行うことにより、細胞を判別するための参照データを生成する参照データ生成部（特許請求の範囲における「参照データ生成手段」に対応）と、細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し且つ当該計測結果に対して周波数解析を行った結果を、参照データ生成部が生成した参照データと照らし合わせることにより、被検体の細胞を判別する細胞判別部（特許請求の範囲における「細胞判別手段」に対応）に大別される。参照データ生成部には、振動計測部１１０、周波数解析部１２０、数値化部１３０、散布図作成部１４０、散布図選択部１５０、領域区画部１６０、および参照データ格納部１７０が含まれる。細胞判別部には、振動計測部１１０、周波数解析部１２０、数値化部１３０、およびデータ照合部１８０が含まれる。

振動計測部１１０は、細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測するものである。定量位相顕微鏡については、後述する。

周波数解析部１２０は、振動計測部１１０による当該計測結果に対して周波数解析を行うものである。

数値化部１３０は、周波数解析部１２０による当該周波数解析結果を近似することにより、振動の特性を数値化するものである。

散布図作成部１４０は、数値化部１３０による当該数値化の結果を元に散布図を作成するものである。散布図作成部１４０は、複数の所定の周波数に応じて複数の散布図を作成する。

散布図選択部１５０は、散布図作成部１４０が作成した当該複数の散布図のうち、プロットされたパワースペクトルの値における決定係数の値が所定の値以下である散布図を、領域区画部１６０により当該領域区画される散布図として選択するものである。

領域区画部１６０は、散布図作成部１４０により作成され散布図選択部１５０により選択された散布図における所定領域を細胞を判別するための判別領域として区画するものである。「参照データ」とは、領域区画部１６０が当該領域区画した当該散布図をいう。

参照データ格納部１７０は、参照データを格納するものである。

データ照合部１８０は、被検体の細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し、当該計測結果に対して周波数解析し、更に数値化した結果を、参照データ格納部１７０に格納されている参照データと照らし合わせることにより、被検体の細胞を判別するものである。

（定量位相顕微鏡）
次に、図１に示した振動計測部１１０を構成し、細胞の振動を計測する際に用いられる定量位相顕微鏡について説明する。振動計測部１１０は定量位相顕微鏡そのものであっても良く、定量位相顕微鏡を備えた測定モジュールであっても良い。なお、定量位相顕微鏡に関する以下の説明は、下記の参考文献１および参考文献２を更に参考にすることで、より容易に理解できる。
＜参考文献１＞ 特開２００９−１２２０３３号公報
＜参考文献２＞ Toyohiko Yamauchi,"Low-coherent quantitative phase microscope for nanometer-scalemeasurement of living cells morphology", Opt. Exp.、16, 12227, 2008

図３は、定量位相顕微鏡の構成図である。この図に示される定量位相顕微鏡は、被測定物２０９の表面形状を測定するものであって、光源２１１，２１２、レンズ２２１〜２２５、アパーチャ２３１、光合波器２４１、光分波器２４２、ハーフミラー２４３、撮像部２５１、解析部２５２、受光部２６１、変位検出部２６２、ピエゾアクチュエータ２７１、駆動部２７２、ミラー２７３、ステージ２８１、駆動部２８２および制御部２９０を備える。

光源２１１は、コヒーレント長が比較的短い光λ１を出力するものであり、例えば波長帯域６００ｎｍ〜９００ｎｍの広帯域光を出力することができるタングステンランプまたはハロゲンランプである。一方、光源２１２は、コヒーレント長が比較的長い光λ２を出力するものであり、例えば波長１.３１μｍのレーザ光を出力する半導体レーザ光源である。光合波器２４１は、光源２１１から出力されてレンズ２２１およびアパーチャ２３１を経て到達した光λ１を反射させるとともに、光源２１２から出力されて到達した光λ２を透過させて、これらの光を合波してレンズ２２２へ出力する。

ハーフミラー２４３は、光合波器２４１により合波されてレンズ２２２を経て到達した光λ１，λ２を２分岐して第１分岐光および第２分岐光とし、第１分岐光をレンズ２２３へ出力し、第２分岐光をレンズ２２４へ出力する。また、ハーフミラー２４３は、第１分岐光がレンズ２２３を経てミラー２７３により反射されて生じる第１反射光を再びレンズ２２３を経て入力するとともに、第２分岐光がレンズ２２４を経て被測定物２０９により反射されて生じる第２反射光を再びレンズ２２４を経て入力して、これら第１反射光と第２反射光とを干渉させて当該干渉光をレンズ２２５へ出力する。すなわち、ハーフミラー２４３は、干渉光学系を構成する要素である。

光分波器２４２は、ハーフミラー２４３から出力されてレンズ２２５を経た光を入力し、そのうち光λ１を反射させて撮像部２５１へ出力し、光λ２を透過させて受光部２６１へ出力する。レンズ２２３〜２２５は、ハーフミラー２４３から出力されて光分波器２４２により分波された干渉光λ１を撮像部２５１の撮像面上に結像する結像光学系を構成する要素である。撮像部２５１は、その結像された干渉光λ１の干渉パターンを撮像するものであり、例えばＣＣＤカメラである。受光部２６１は、ハーフミラー２４３から出力されて光分波器２４２により分波された光λ２の強度を検出するものであり、例えばフォトダイオードである。

ここで、ハーフミラー２４３からミラー２７３により反射されて再びハーフミラー２４３に到るまでの光路長と、ハーフミラー２４３から被測定物２０９により反射されて再びハーフミラー２４３に到るまでの光路長との光路長差をΔＬとする。前述したように、光源２１２から出力され受光部２６１に到達する光λ２のコヒーレント長は比較的長いので、図４（ａ）に示されるように、受光部５１に到達する光λ２の強度は、比較的広い光路長差ΔＬの範囲において周期的に変化する。これに対して、光源２１１から出力され撮像部２５１に到達する光λ１のコヒーレント長は比較的短いので、図４（ｂ）に示されるように、撮像部２５１に到達する光λ１の強度は、比較的狭い光路長差ΔＬの範囲において周期的に変化し、しかも、光路長差ΔＬが値０に近いほど干渉の振幅が大きい。

このことを利用して、解析部２５２は、光路長差が複数の目標値それぞれに設定されたときに撮像部２５１により撮像された光λ１の干渉パターン像を取得し、それらの複数の干渉パターン像に基づいて、像の各位置において干渉の振幅が最大となる光路長差を求め、これにより被測定物２０９の表面形状（高さ分布）を求める。

ここで、被測定物２０９は、好適には例えば図５に示されるように、略平坦な基板２９１の主面に薄膜２９２が形成され、その薄膜２９２の上に半透明な測定対象物２９３が置かれたものである。薄膜２９２は、光λ２を高い反射率で反射させることで、後述するフィードバック制御の際の基準面として好適に用いられる。また、測定対象物２９３は細胞であるのが好適である。

また、被測定物２０９の表面形状が波長未満の微小な凹凸を持つ場合には、干渉の振幅が最大となる光路長差付近において、光λ２の中心波長をλ２０とおいて、λ２０／４ずつ４回光路長差をシフトさせると共に干渉パターン像を取得し、それら４つの干渉パターン像に基づいて、像の各位置において干渉波形の位相オフセット値を求めることにより、被測定物２０９の表面形状（高さ分布）を求めることも可能である。

さらには、干渉の振幅が最大となる光路長差を求める方法と、干渉波形の位相オフセット値を求める方法の両方によって得られた高さ分布を総合することによって、広い高さ範囲の表面形状を、波長未満の精度で得ることもできる。

また、変位検出部２６２は、受光部２６１により検出された光λ２の強度の変化から、光路長差の変化量を求める。すなわち、光源２１２、受光部２６１および変位検出部２６２は、光路長差を検出する光路長差検出手段を構成する要素である。なお、ピエゾアクチュエータ２７１によりミラー２７３に微小振動を与えて、或る光路長差を中心にして変調を与えることで、より正確に光路長差を検出することができる。

ピエゾアクチュエータ２７１、駆動部２７２、ステージ２８１および駆動部２８２は、光路長差を調整する光路長差調整手段を構成する要素である。ステージ２８１は、駆動部２８２により駆動され、ハーフミラー２４３と被測定物２０９との間の光学系の光軸に平行な方向に被測定物２０９を移動させる。このとき、レンズ２２４を移動させることなく、ハーフミラー２４３と被測定物２０９との間の光学系を維持したままとする。すなわち、ハーフミラー２４３から測った被測定物２０９側のフォーカス面までの距離を維持したままとする。ピエゾアクチュエータ２７１は、駆動部２７２により駆動され、ハーフミラー２４３とミラー２７３との間の光学系の光軸に平行な方向に、ミラー２７３を移動させる。このとき、レンズ２２３を移動させることなく、ハーフミラー２４３とミラー２７３との間の光学系を維持したままとする。ピエゾアクチュエータ２７１（第１移動手段）の作動範囲は、ステージ２８１（第２移動手段）の作動範囲より狭い。また、ピエゾアクチュエータ２７１の位置精度は、ステージ２８１の位置精度より高い。なお、ステージ２８１を移動させるための駆動部２８２としては、例えば長距離移動型のピエゾアクチュエータや、ステッピングモータによる回転機構を用いることが可能である。

制御部２９０は、変位検出部２６２による光路長差検出結果に基づいて、光路長差が複数の目標値に順次になるように、駆動部２７２，２８２を介してピエゾアクチュエータ２７１およびステージ２８１による光路長差調整動作を制御する。特に、制御部２９０は、複数の目標値それぞれにおいて、ピエゾアクチュエータ２７１による移動量が作動範囲内の所定範囲内となるように、ステージ２８１による移動動作を連続的または断続的に行わせる。また、制御部２９０は、ステージ２８１による移動動作の際にも、変位検出部２６２による光路長差検出結果に基づいて、光路長差が各目標値になるようにピエゾアクチュエータ２７１による移動動作をフィードバック制御する。

以上で説明した定量位相顕微鏡は、二光束干渉顕微鏡において、細胞膜からの反射光の位相計測を行う装置であり、細胞の厚みよりも十分に短い（例えば細胞の厚みの１／３未満）コヒーレンス長の光源を有し、焦点深度が１μｍ未満の対物レンズを備え、二光束の分岐点から測った被測定細胞の細胞膜表面までの光路長と、同分岐点から測った参照鏡までの光路長との差をコヒーレンス長未満に制御し、且つサンプル側対物レンズの焦点位置を当細胞膜表面に合わせこんだ状態で、一定時間連続して（例えば１秒間隔で３分間など）干渉画像を得る。

具体的には、図６に示すように、波長フィルタリングしたハロゲンランプ（中心波長８５０ｎｍ）を用いて対物レンズを通して目的の細胞に照明光を照射し、フィードバック制御しながら細胞膜表面にフォーカスを合わせると同時に、物体光と参照光の光路長を合わせることにより、細胞膜からの反射光の干渉像を撮像する。干渉像の撮像には、参照光の光路長を光源波長の１／４ずつ変化させながら、７枚で１組の画像、すなわちＩ_１、Ｉ_２、Ｉ_３、Ｉ_４、Ｉ_５、Ｉ_６、Ｉ_７を取得する。これら７枚１組の画像から、
Ａ＝Ｉ_１−３＊Ｉ_３＋３＊Ｉ_５−Ｉ_７…（１）
Ｂ＝−２＊Ｉ_２＋４＊Ｉ_４−２＊Ｉ_６…（２）
を求め、更には、
φ＝ｔａｎ−１（Ａ／Ｂ）…（３）
を求める（位相抽出）。

（定量位相顕微鏡を用いて細胞の振動に対する時間変動を計測した一例）
次に、以上で説明した定量位相顕微鏡を用いて細胞の振動に対する時間変動を計測した一例について、図７〜図１３を参照しながら説明する。細胞膜にフォーカスを合わせて得られた位相画像（図７）では、なだらかに連続する細胞膜の形状を反映して、細胞膜の高さに応じて干渉縞が空間的に連続して表示される。一方、細胞膜が、定量位相顕微鏡の測定領域に存在していない領域は連続した位相が得られず、干渉縞は見られない。干渉縞が空間的に連続する領域と位相がランダムになる領域との境界を検出することは容易であり、境界に対して位相が空間的に連続する側の領域を細胞膜の存在領域として特定する（図８において白線で囲まれた領域）。

その上で、時間的に連続する位相画像の各画素において、時間的に位相アンラッピングを行い、すべての隣接する撮像フレーム同士の間で、ある閾値φmaxを超えるような不連続な位相の変化のない画素を細胞膜の時間変動情報が得られた画素と判定する。本実施例では、φmaxをπ／２とし、π／２を超えるような不連続な位相の変化のない画素を細胞膜の時間変動情報が得られた画素と判定した（図９における白色画素）。すなわち、空間位相から特定した細胞膜領域内に存在する画素（図８において白線で囲まれた領域の画素）、および時間位相アンラッピングにて連続する位相が得られた画素（図９における白色画素）の共通部分を、細胞膜からの時間変動情報が記録できた画素として特定する（図１０における白線内の白色画素）。

次に、それぞれの個々の細胞における細胞膜の変位を数値化する段階に進む。細胞膜の振動は細胞膜上で波のようにダイナミックに変化しているため、振動の周波数に共通性はあっても計測する空間的な場所に応じて振動の位相が異なる。そのため、一つの細胞に対して細胞全体を含むようにすべての画素の平均値の変位を求めても、細胞膜の振動は打ち消されて細胞膜の挙動を十分に反映することはできない。そこで、一つの細胞につき５〜７箇所の複数の計測領域を設ける。

図１１は各々の細胞に設けた複数の計測領域を示しており、計測領域が四角のマークで表示されている。設定した複数の計測領域において、領域を構成する画素の平均値について時間変化を求める。細胞膜の変位の時間変化は測定開始後からの変化量として評価してよい。

このようにして、一つの細胞に対して細胞膜の領域を複数領域に細分し、複数の領域の細胞膜の時間変位を求めると、図１２および図１３に示すような、各計測領域における時間と変位のグラフを描くことができる。図１２および図１３では２つの種類の異なる細胞の細胞膜の時間変位を示しており、細胞の種類によって細胞膜の時間的な挙動が異なることを示唆するものである。図１２は未分化な幹細胞の時間変位を示しており、図１３は分化した破骨細胞の時間変位を示している。

なお、細胞の膜の変位を計測する際には温度により細胞膜の変動の大きさが変化するので、一定の温度管理下で計測することが望ましい。

（細胞判別装置１により行われる動作）
続いて、細胞判別装置１により行われる動作（特許請求の範囲における「細胞判別用の参照データ生成方法」および「細胞判別方法」に対応）の一例として、被検体の細胞の種類を判別する方法について説明する。被検体の細胞の種類を判別する手順は、被検体である細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し、且つ当該計測結果に対して周波数解析を行うことにより、細胞を判別するための参照データを生成する参照データ生成手順（特許請求の範囲における「参照データ生成ステップ」に対応）と、細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し且つ当該計測結果に対して周波数解析を行った結果を、参照データ生成手順にて生成された参照データと照らし合わせることにより、被検体の細胞を判別する細胞判別手順（特許請求の範囲における「細胞判別ステップ」に対応）に大別される。以下、各手順の詳細について説明する。

（参照データ生成手順）
図１４は、参照データ生成手順を示すフローチャートである。参照データ生成手順では、予め細胞の種類が判別されている細胞集団を用意し、当該細胞集団の細胞を計測した結果から参照データを作成する。

図１４に示すように、最初に、レファランス（参照）となる細胞集団を２種類以上用意する（ステップＳ１０１）。

次に、ステップＳ１０１にて用意した複数の細胞集団における細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測する。具体的には、それぞれの細胞について複数の計測領域を設定し、当該複数の計測領域のそれぞれに対して振動計測を行い、細胞の振動の時間変位量を得る（ステップＳ１０２、特許請求の範囲における「振動計測ステップ」に対応）。

次に、ステップＳ１０２で得た複数の計測領域のそれぞれにおける細胞振動の時間変位量（計測結果）に対して、周波数およびパワースペクトルによる周波数解析を行う（ステップＳ１０３、特許請求の範囲における「周波数解析ステップ」に対応）。周波数解析の指標であるパワースペクトル（ＰＳＤ）は、以下の数式（４）および（５）で計算される。


上記の数式（４）および（５）において、Nは時間軸上でのサンプリング点数である。Δｔはサンプリングの時間間隔である。Δｈ（ｍ）は、ｔ＝Δｔ＊ｍの時点での計測開始時からの細胞膜の変位量である。なお、ｍ＝０、１、２、３、…（Ｎ−１）である。

次に、ステップＳ１０３で求めたパワースペクトルを平均化することにより細胞全体としての周波数解析結果を得る（ステップＳ１０４）。つまり、一つの細胞における周波数パワースペクトルを得るには、一つの細胞に複数の計測領域を設けて得られたそれぞれの計測領域の細胞膜の時間変位データからそれぞれ周波数解析を行いパワースペクトルデータを取得し、複数の計測領域のパワースペクトルを平均化して、一つの細胞の全体としての周波数パワースペクトルを得る。

次に、ステップＳ１０３およびステップＳ１０４における当該周波数解析結果を近似することにより、細胞の振動の特性を数値化する。この手順では、周波数に対するパワースペクトルの値を近似化した近似線、および当該近似線における傾きを求める（ステップＳ１０５、特許請求の範囲における「数値化ステップ」に対応）。

具体的には、離散化された周波数を横軸に、且つパワースペクトルを縦軸に取って、ステップＳ１０３およびステップＳ１０４における当該周波数解析結果を両対数でプロットすると、図１５に示すようなパワースペクトルのグラフが得られる。図１５には特性の異なる４種類のパワースペクトル（Ａ〜Ｄ）の例を模式的に示した。グラフＡは、振幅が大きく、パワースペクトルが周波数の−１乗に比例するような特性、グラフＢは、振幅が大きく、パワースペクトルが周波数によらず一定であるような特性、グラフＣは、振幅が小さく、パワースペクトルが周波数の−１乗に比例するような特性、グラフＤは、振幅が小さく、パワースペクトルが周波数によらず一定であるような特性である。

この細胞膜の振動のパワースペクトルを、両対数グラフ上において直線で近似することで、つまり図１５のグラフＡ〜Ｄを直線で近似することで、振動の特性を数値化することができる。なお、両対数グラフ上での直線は、パラメータＡとｓを用いて、式（６）によって表される。Ａは図１５においてｆ＝１Ｈｚにおける近似直線の値であり、ｓは両対数グラフ上に引いた直線の傾き（つまりグラフＡ〜Ｄの傾き）である。
ＰＳＤ_ｆｉｔ（ｆ）＝Ａ＊ｆ^ｓ…（６）

次に、ステップＳ１０５における当該数値化の結果を元に散布図を作成する。この手順では、傾きを一の軸とし且つ所定の周波数におけるパワースペクトルの値を他の軸とする２次元上に、傾きに対してパワースペクトルの値を被検体の細胞ごとにプロットした図を、散布図として作成する（ステップＳ１０６、特許請求の範囲における「散布図作成ステップ」に対応）。

具体的に、細胞集団の中のそれぞれの細胞について、細胞膜の振動計測を行い、パワースペクトルを集計するにあたって、得られたパワースペクトルの近似直線の傾きｓを横軸に、ある周波数ｆ＝ｆ０におけるパワースペクトルの近似直線の値（ＰＳＤ_ｆｉｔ（ｆ０））を縦軸に取ってプロットすると、視覚的に分かりやすく、また統計的にも処理しやすい散布図を得ることができる。例えば、所定の周波数としてｆ０＝０．１Ｈｚを用いて、図１５の４つのパワースペクトルを散布図にプロットすると、図１６のような散布図が得られる。

次に、ステップＳ１０６にて作成された散布図における所定領域を細胞を判別するための判別領域として区画する（ステップＳ１０８、特許請求の範囲における「領域区画ステップ」に対応）。この手順における当該領域区画は、散布図上で区画線を設定することにより行われる。そして、この手順にて当該領域区画された当該散布図を、細胞を判別するための判断基準となる参照データとして参照データ格納部１７０に格納する（ステップＳ１０９）。以下、散布図作成や領域区画について、より詳しく説明する。

散布図を作成するにあたっては、上述したステップＳ１０６にて複数の所定の周波数に対して散布図が作成され、当該複数の散布図のうち、プロットされたパワースペクトルの値における決定係数の値が所定の値以下である散布図を、ステップＳ１０８にて当該領域区画される散布図として選択する手順を更に含む（ステップＳ１０７、特許請求の範囲における「散布図選択ステップ」に対応）。

図１７に、異なるｆ０を用いて作成した、細胞膜のパワースペクトルの近似直線の散布図を示す。元となるデータは生細胞を用いた実験によって得られたものである。元データは、ヒト乳癌細胞由来の細胞株ＭＣＦ７（細胞数Ｎ＝１１）のものと、マウス膵臓由来の細胞株ＩＮＳ１（細胞数Ｎ＝１０）のものからなる。図１７（ａ）は、ｆ０＝０．０２Ｈｚを用いて、細胞集団のパワースペクトルの特性をプロットしたものである。図１７（ｂ）は、ｆ０＝０．１Ｈｚを用いて、細胞集団のパワースペクトルの特性をプロットしたものである。図１１（ｃ）は、ｆ０＝１Ｈｚを用いて、細胞集団のパワースペクトルの特性をプロットしたものである。それぞれのグラフにおいて、横軸はパワースペクトルの近似直線の傾きであり、縦軸は近似直線のｆ＝ｆ０におけるパワースペクトル値の常用対数（ｌｏｇ_１０（ＰＳＤ_ｆｉｔ（ｆ０）））である。図１７においては細胞の種類を区別せずに、被測定細胞すべてを対象にしてプロットした。

図１７のそれぞれについて、最小二乗法により一次関数による近似直線を引いて、決定係数Ｒ^２を求めた。ｆ０＝０．０２Ｈｚを用いた場合は決定係数Ｒ^２＝０．８５３７、ｆ０＝０．１Ｈｚを用いた場合は決定係数Ｒ^２＝０．５７７９、ｆ０＝１Ｈｚを用いた場合は決定係数Ｒ^２＝０．２７２６となった。図からも視覚的に明らかなように、ｆ０＝０．０２Ｈｚを用いた場合（図１７（ａ））では横軸と縦軸の相関が大きく（Ｒ^２＞０．６）、二変数でプロットしている意義が失われてしまっている。したがって、ｆ０＝０．０２Ｈｚを用いるのは適切ではないと判断する。

次に、細胞集団ごとの違いを定量化するため、被測定細胞に含まれるＭＣＦ７とＩＮＳ１を区別してプロットしたのが図１８である。決定係数Ｒ^２が大きいｆ０＝０．０２Ｈｚを用いた場合のグラフは除外した。ｆ０＝０．１Ｈｚを用いた場合（図１８（ａ））と、ｆ０＝１Ｈｚを用いた場合（図１８（ｂ））を比べると、図１８（ａ）の場合には垂直線と水平線を用いた単純な区画線でＩＮＳ１の細胞集団とＭＣＦ７の細胞集団を区別することができる。この細胞弁別を、細胞集団からＭＣＦ７のみを区別する試験と考えた場合、図１８（ａ）の場合は図に示した太線の区画線を用いて、感度９１％、特異度１００％で弁別ができるのに対し、図１８（ｂ）の場合は感度７２％、特異度９０％となり、明らかに弁別の性能が劣る。

したがって、これらの結果から、上記示した実施例において、散布図の縦軸ＰＳＤ_ｆｉｔ（ｆ０）に用いるｆ０としては、ｆ０＝０．１Ｈｚが適切であることが分かる。ｆ０＝０．１Ｈｚを用いた散布図（図１８（ａ））を用いることで、細胞一個一個の違いが２変数を用いて分布的に示され、細胞集団同士の弁別も容易になる。このようにして特定の２種類の細胞集団の細胞弁別を行う判断基準が設定できる。これをリファレンスデータ（参照データ）とする。リファレンスデータは種類や状態の異なる２種類以上の細胞集団について取得し、格納しておく。

（細胞判別手順）
引き続き、細胞判別手順について説明する。細胞判別手順は、被検体となる未知の細胞の細胞膜の振動を一定時間計測し、細胞膜の振動の周波数解析を行い、既に格納されているリファレンスデータの２成分散布図に当てはめることによって行う。弁別したい被検体の細胞は、リファレンスデータとして既に取得済みである種類と同種類の細胞である。以下、図１９を参照しながら細胞判別手順の詳細について説明する。図１９は、細胞判別手順を示すフローチャートである。

図１９に示すように、最初に、被検体となる未知の細胞を用意する（ステップＳ２０１）。

次に、ステップＳ２０１にて用意した被検体の細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測する。具体的には、被検体細胞について複数の計測領域を設定し、当該複数の計測領域のそれぞれに対して振動計測を行い、細胞の振動の時間変位量を得る（ステップＳ２０２）。

次に、ステップＳ２０２で得た複数の計測領域のそれぞれにおける細胞振動の時間変位量（計測結果）に対して、周波数およびパワースペクトルによる周波数解析を行う（ステップＳ２０３、ステップＳ２０４）。周波数解析の手法は上述のステップＳ１０３およびステップＳ１０４と同様であるため、ここでは説明を省略する。

次に、ステップＳ２０３およびステップＳ２０４における当該周波数解析結果を近似することにより、細胞の振動の特性を数値化する（ステップＳ２０５）。数値化の手法は上述のステップＳ１０５と同様であるため、ここでは説明を省略する。

次に、ステップＳ２０５における当該数値化の結果を、参照データ生成手順で作成した参照データに当てはめる。図２０に示すように、参照データには２種類の細胞（ＭＣＦ７とＩＮＳ１）を識別するための区画線Ｍが引かれており、判別領域ＬがＭＣＦ７を判別するための判別領域である。図２０のような参照データを用いて、被検体となる未知の細胞の振動の特性を数値化したものが判別領域Ｌ内に位置するのであれば、当該未知の細胞はＭＣＦ７であると判別することができる（ステップＳ２０６）。

（参照データ生成手順および細胞判別手順のまとめ）
以上、参照データ生成手順および細胞判別手順を説明した。以上の説明を簡単にまとめると次のようである。（１）細胞一個一個の細胞膜の変動の周波数パワースペクトルを計算し、それぞれを式（６）に基づきフィッティングし、フィッティング直線の傾きｓとフィッティング直線の複数のｆ＝ｆ０におけるパワースペクトルの値を求め、各細胞の細胞膜振動の周波数パラメータとする。（２）リファレンスとなる２種類以上の細胞集団についてフィッティング直線の傾きｓを横軸、フィッティング直線のｆ＝ｆ０における値を縦軸にして、各細胞のパワースペクトルの特性を２変数の散布図にプロットする。（３）異なるｆ０を用いて複数の２変数散布図を作成する。（４）２変数散布図の中で、プロットされた点の決定係数の大きいものを除外し、決定係数の値が所定の値以下のものを選択する。上記の例においては決定係数が例えば０．６以下のものを選択した。（５）２変数散布図を、細胞集団ごとに別のシンボルや色を用いてプロットし、細胞集団同士の弁別が単純な区画線を用いて可能となるようなｆ０を採用し、２変数散布図と区画線を決定し、２種類の細胞集団を弁別するためのリファレンスデータとする。（６）被検体である未知細胞について細胞膜の変動を計測し、得られた周波数パラメータをリファレンスデータの２変数散布図と区画線に当てはめて細胞を弁別する。このような手続きを経ることで、細胞膜の変動の周波数解析をもとにして細胞を弁別する方法および装置を提供することができる。

［第２実施形態］
引き続き、本発明の第２実施形態について説明する。第２実施形態では、複数作成した散布図の選択方法が、第１実施形態と主に相違している。つまり、第１実施形態における図１４のステップＳ１０７において相違点がある。以下ではこの相違点を中心に説明する。

第１実施形態で既に説明したステップＳ１０１〜ステップＳ１０６を経て、異なるｆ０を複数用いて複数作成した、細胞膜のパワースペクトルの近似直線の散布図を図２１に示す。元となるデータは生細胞を用いた実験によって得られたものである。元データは、ヒト乳癌細胞由来の細胞株ＭＣＦ７（細胞数Ｎ＝１１）のものと、マウス膵臓由来の細胞株ＩＮＳ１（細胞数Ｎ＝１０）のものからなり、細胞の種類が区別できるようにプロットしたものである。それぞれのグラフにおいて、横軸はパワースペクトルの近似直線の傾き、縦軸は近似直線のｆ＝ｆ０における値の常用対数（ｌｏｇ_１０（ＰＳＤ_ｆｉｔ（ｆ０）））である。図２１（ａ）は、ｆ０＝０．０２Ｈｚを用いて、細胞集団のパワースペクトルの特性をプロットしたものである。図２１（ｂ）は、ｆ０＝０．１Ｈｚを用いて、細胞集団のパワースペクトルの特性をプロットしたものである。図２１（ｃ）は、ｆ０＝１Ｈｚを用いて、細胞集団のパワースペクトルの特性をプロットしたものである。

図２１において、ＩＮＳ１の細胞集団とＭＣＦ７の細胞集団をもっとも良く区別するために直線と水平線を用いた単純な区画線を引くことを行う。この細胞弁別を、細胞集団からＭＣＦ７のみを区別する試験と考えた場合、図２１（ａ）の場合は図に示した太線の区画線を用いて、感度１００％、特異度８５％、図２１（ｂ）の場合は感度９１％、特異度１００％で弁別できるのに対し、図２１（ｃ）の場合は感度７２％、特異度９０％となり明らかに弁別の性能が劣る。そこで、この中で、ｆ０＝０．０２Ｈｚを用いた場合（図２１（ａ））とｆ０＝０．１Ｈｚを用いた場合（図２１（ｂ））を弁別能力の高い候補として残し、ｆ０＝１Ｈｚを用いた場合（図２１（ｃ））を候補から除く。

次に、絞られた候補に対し、すべての細胞のプロットに対して、最小二乗法により一次関数による近似直線を引いて、決定係数Ｒ^２を求めた（図２２）。ここでは、細胞の種類を区別せずに、被測定細胞すべてを対象にしてプロットした。ｆ０＝０．０２Ｈｚを用いた場合は決定係数Ｒ^２＝０．８５３７、ｆ０＝０．１Ｈｚを用いた場合は決定係数Ｒ^２＝０．５７７９となった。図からも視覚的に明らかなように、ｆ０＝０．０２Ｈｚを用いた場合（図２２（ａ））では横軸と縦軸の相関が大きく（Ｒ^２＞０．６）、二変数でプロットしている意義が失われてしまっている。したがって、ｆ０＝０．０２Ｈｚを用いるのは適切ではないと判断する。

したがって、これらの結果から、上記示した実施例において、散布図の縦軸ＰＳＤ_ｆｉｔ（ｆ０）に用いるｆ０としては、ｆ０＝０．１Ｈｚが適切であることが分かる。ｆ０＝０．１Ｈｚを用いた散布図（図２２（ｂ））を用いることで、細胞一個一個の違いが２変数を用いて分布的に示され、細胞集団同士の弁別も容易になる。このようにして特定の２種類の細胞集団の細胞弁別を行う判断基準が設定できる。これをリファレンスデータ（参照データ）とする。リファレンスデータは種類や状態の異なる２種類以上の細胞集団について取得し、格納しておく。

（本実施形態の作用・効果、そして応用）
本実施形態によれば、細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて計測する。定量位相顕微鏡を用いた計測方法によれば、光を使った非侵襲で、更にナノメータスケールの高精度で、細胞の振動を計測することができる。また、ＡＦＭの場合と異なり、多点計測ができるため、細胞の特徴的な変動を示す部位を知らなくても、細胞全体としての特徴を捉えることができる。更に、計測時間面において、ＡＦＭの場合でのような長時間はかからないというメリットがある。そして、以上のような定量位相顕微鏡による計測方法を用いて、参照データを生成し、また当該参照データを用いて被検体の細胞を判別するため、結果的に、非侵襲、高精度、更に高速で細胞判別を行うことができる。

従来、培養した細胞の状態を把握したり、分化／未分化やがん化などの細胞の変化を判断する手段としては、観測者が光学顕微鏡を用いて細胞の形態を肉眼で観察し、経験的な判断に委ねられることが多く、再現性や品質の安定性のうえでは十分とは言いがたかった。また、定量的に判断する手段として、蛍光試薬や蛍光で標識された細胞特異的な抗体等で処理して判断する方法が用いられているが、標識した細胞の培養を継続することは事実上困難であるので、判定した細胞を引き続き培養するなど、生きたまま再利用することができなかった。

本実施形態では生きた細胞のまま細胞膜の状態を測定することによって細胞を非侵襲に評価、識別することができるため、蛍光ラベルができない用途に広く利用できると考えられる。具体的には培養している細胞の状態をモニタリングする装置が考えられる。細胞の状態モニタリング装置は細胞選別装置の前処理として、目的の細胞を非侵襲に識別してその座標を記憶する装置としても役立つ。また細胞の状態モニタリング装置は細胞を用いた創薬スクリーニングにおける試験の前処理として、試験に用いる培養した細胞の状態を把握して測定結果に重みづけをする装置としても役に立つ。応用面では、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を含む幹細胞からの分化誘導における分化／未分化状態の識別、正常細胞とがん細胞の識別、異なる細胞集団が混在する環境における細胞の種類の識別、凍結解凍直後における細胞蘇生率の迅速判定などに利用することができる。

１…細胞判別装置、１１０…振動計測部、１２０…周波数解析部、１３０…数値化部、１４０…散布図作成部、１５０…散布図選択部１６０…領域区画部、１７０…参照データ格納部、１８０…データ照合部。

Claims (9)

1. 予め細胞の種類が判別されている細胞である参照細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し、且つ当該計測結果に対して周波数解析を行うことにより、細胞判別用の参照データを生成する参照データ生成ステップと、
   被検体である細胞の前記振動を前記定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し、且つ当該計測結果に対して前記周波数解析を行うことにより、解析結果データを生成し、当該解析結果データを前記参照データと照らし合わせることにより、前記被検体である細胞を判別する細胞判別ステップと、
   を備えることを特徴とする細胞判別方法。
2. 前記参照データ生成ステップは、
   前記参照細胞の前記振動を前記定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測する振動計測ステップと、
   前記振動計測ステップにおける当該計測結果に対して前記周波数解析を行う周波数解析ステップと、
   前記周波数解析ステップにおける当該周波数解析結果を近似することにより、前記振動の特性を数値化する数値化ステップと、
   前記数値化ステップにおける当該数値化の結果を元に散布図を作成する散布図作成ステップと、
   前記散布図作成ステップにて作成された前記散布図における所定領域を前記被検体である細胞を判別するための判別領域として区画する領域区画ステップと、
   を備え、
   前記参照データは、前記領域区画ステップにて当該領域区画された当該散布図である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞判別方法。
3. 前記振動計測ステップでは、前記参照細胞に設けられた複数の計測領域に対してそれぞれ当該計測を行い、
   前記周波数解析ステップでは、それぞれの前記計測領域の当該計測結果に対して前記周波数解析を行い、且つ当該周波数解析結果を平均化することにより前記参照細胞全体としての周波数解析結果を得る、
   ことを特徴とする請求項２に記載の細胞判別方法。
4. 前記周波数解析ステップでは、周波数およびパワースペクトルにより前記周波数解析が行われ、
   前記数値化ステップでは、前記周波数に対する前記パワースペクトルの値を近似化した近似線、および前記近似線における傾きを求め、
   前記散布図作成ステップでは、前記傾きを一の軸とし且つ所定の周波数における前記パワースペクトルの値を他の軸とする２次元上に、前記傾きに対して前記パワースペクトルの値を前記参照細胞ごとにプロットした図を、前記散布図として作成する、
   ことを特徴とする請求項２または３に記載の細胞判別方法。
5. 前記散布図作成ステップでは、複数の前記所定の周波数に応じて複数の前記散布図が作成され、
   当該複数の前記散布図のうち、プロットされた前記パワースペクトルの値における決定係数の値が所定の値以下である前記散布図を、前記領域区画ステップにて当該領域区画される前記散布図として選択する散布図選択ステップを更に備える、
   ことを特徴とする請求項４に記載の細胞判別方法。
6. 前記領域区画ステップにおける当該領域区画は、前記散布図上で区画線を設定することにより行われる、
   ことを特徴とする請求項２〜５の何れか１項に記載の細胞判別方法。
7. 予め細胞の種類が判別されている細胞である参照細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測する振動計測ステップと、
   前記振動計測ステップにおける当該計測結果に対して周波数解析を行う周波数解析ステップと、
   前記周波数解析ステップにおける当該周波数解析結果を近似することにより、前記振動の特性を数値化する数値化ステップと、
   前記数値化ステップにおける当該数値化の結果を元に散布図を作成する散布図作成ステップと、
   前記散布図作成ステップにて作成された前記散布図における所定領域を被検体である細胞を判別するための判別領域として区画する領域区画ステップと、
   を備えることを特徴とする細胞判別用の参照データ生成方法。
8. 予め細胞の種類が判別されている細胞である参照細胞の振動を定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し、且つ当該計測結果に対して周波数解析を行うことにより、細胞判別用の参照データを生成する参照データ生成手段と、
   被検体である細胞の前記振動を前記定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測し、且つ当該計測結果に対して前記周波数解析を行うことにより、解析結果データを生成し、当該解析結果データを前記参照データと照らし合わせることにより、前記被検体である細胞を判別する細胞判別手段と、
   を備えることを特徴とする細胞判別装置。
9. 前記参照データ生成手段は、
   前記参照細胞の前記振動を前記定量位相顕微鏡を用いて一定時間計測する振動計測手段と、
   前記振動計測手段による当該計測結果に対して前記周波数解析を行う周波数解析手段と、
   前記周波数解析手段による当該周波数解析結果を近似することにより、前記振動の特性を数値化する数値化手段と、
   前記数値化手段による当該数値化の結果を元に散布図を作成する散布図作成手段と、
   前記散布図作成手段が作成した前記散布図における所定領域を前記被検体である細胞を判別するための判別領域として区画する領域区画手段と、
   を備え、
   前記参照データは、前記領域区画手段が当該領域区画した当該散布図である、
   ことを特徴とする請求項８に記載の細胞判別装置。