JP5781621B2

JP5781621B2 - 生体細胞凍結保存具

Info

Publication number: JP5781621B2
Application number: JP2013537503A
Authority: JP
Inventors: 井上　太; 太井上
Original assignee: Kitazato Biopharma Co Ltd
Current assignee: Kitazato Biopharma Co Ltd
Priority date: 2011-10-03
Filing date: 2012-10-01
Publication date: 2015-09-24
Anticipated expiration: 2032-10-01
Also published as: JPWO2013051520A1; US20140212962A1; EP2765181A4; EP2765181B1; KR20140070575A; US9538746B2; WO2013051520A1; CN103842493B; EP2765181A1; CN103842493A; HK1198177A1; KR101934031B1

Description

本発明は、哺乳動物の卵子、胚などの卵、精子、造血幹細胞、多能性幹細胞等の幹細胞などの生体細胞を凍結保存する際に使用する細胞凍結保存具に関する。

哺乳動物胚の凍結保存は、特定の系統や品種の遺伝資源の保存を可能とする。また、絶滅の危機に瀕している動物種の維持にも有効である。さらに、ヒトの不妊治療においても有用である。

哺乳動物胚の凍結保存方法としては、特許文献１（特開２０００−１８９１５５）において、哺乳動物胚または卵子を滅菌処理した凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、これらの胚または卵子を包被するに充分な最少量のガラス化液で貼り付け、この凍結保存用容器を密封し、そしてこの容器を液体窒素に接触させて急速に冷却することが提案されている。そして、融解方法では、前記の方法で保存した凍結保存用容器を前記液体窒素から取り出し、容器の一端部を開口し、この容器内に３３〜３９℃の希釈液を直接注入し、胚または卵子の凍結を融解希釈するものである。この方法によれば、哺乳動物胚または卵子をウイルスや細菌による感染のおそれがなく高い生存率で保存および融解希釈することのできるという優れた効果を備えている。
しかし、凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、胚または卵子などの卵を包被するに充分な最少量のガラス化液で貼り付ける作業が必ずしも容易ではなかった。

特開２０００−１８９１５５特開２００２−３１５５７３（ＷＯ０２−０８５１１０Ａ１）特開２００４−３２９２０２（ＵＳ公開２００４−０２５９０７２）

そこで、本願発明者は、特許文献２（特開２００２−３１５５７３、ＷＯ０２−０８５１１０Ａ１）を提案している。特許文献２の卵凍結保存具１は、耐寒性材料により形成された本体部２と、本体部２の一端に取り付けられ、可撓性かつ透明性かつ液体窒素耐性材料により形成された卵付着保持用ストリップ３と、卵付着保持用ストリップ３を被包可能に本体部２に着脱自在に取り付けられる一端が封鎖され、かつ耐寒性材料により形成された筒状部材４とからなるものである。
また、本願発明者は、特許文献３（特開２００４−３２９２０２、ＵＳ公開２００４−０２５９０７２）も提案している。特許文献３の卵凍結保存具１は、耐液体窒素材料で形成された卵凍結保存用チューブ２と、チューブ２を保護するための金属製筒状保護部材３とを備える。チューブ２は、本体部２１と、内径が０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの卵保存用細径部２２とを備えるとともに、細径部の先端側にてヒートシール可能であり、本体部２１にてヒートシール可能である。筒状保護部材３は、チューブ２の細径部２２の先端部を収納する筒状部３１と、細径部２２の筒状部３１に収納されない部分および本体部２１の先端部２１ａを収納する半筒状部３２とを備えている。
特許文献２および３の卵凍結保存具は、有効である。
しかし、より容易に卵凍結操作が行え、かつ、凍結された卵の離脱を確実に防止できる卵凍結保存具が望まれている。
本発明の目的は、生体細胞凍結保存具への生体細胞載置操作が容易であり、かつ、生体細胞の凍結作業時における生体細胞の離脱がなく、かつ生体細胞の凍結を迅速に行うことができる生体細胞凍結保存具を提供するものである。

上記目的を達成するものは、以下のものである。
耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、前記生体細胞保持部は、細長い生体細胞付着保持部を備え、前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞付着保持部の長手方向に複数設けられた生体細胞収納用凹部と、前記生体細胞収納用凹部と連通する余剰凍結保存液排出路を有する生体細胞凍結保存具。

図１は、本発明の実施例の生体細胞凍結保存具の正面図である。図２は、図１に示した生体細胞凍結保存具の先端側部分の拡大正面図である。図３は、図２に示した生体細胞凍結保存具の左側面図である。図４は、図２のＡ−Ａ線断面図である。図５は、図２のＢ−Ｂ線断面図である。図６は、図２に示した生体細胞凍結保存具の拡大平面図である。図７は、図２のＣ−Ｃ線拡大断面図である。図８は、図１に示した生体細胞凍結保存具の先端部の拡大正面図である。図９は、図８のＤ−Ｄ線断面図である。図１０は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞収納用凹部にて切断した拡大横断面図である。図１１は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の拡大縦断面図である。図１２は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の先端部の拡大正面図である。図１３は、図１２のＥ−Ｅ線断面図である。図１４は、図１２のＦ−Ｆ線断面図である。

本発明の生体細胞凍結保存具を図面に示す実施例を用いて説明する。
本発明の生体細胞凍結保存具１は、耐寒性材料により形成された本体部３と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部（卵保持部）２とを備える。卵保持部２は、細長い卵付着保持部２２を備え、卵付着保持部２２は、卵付着保持部２２の長手方向に複数設けられた生体細胞収納用凹部（卵収納用凹部）２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅと、卵収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅと連通する余剰凍結保存液排出路２９ａ，２９ｂ，２９ｃ，２９ｄ，２９ｅ，２９ｆを有している。

特に、この実施例の細胞凍結保存具１は、卵凍結保存具であり、生体細胞保持部材２は、卵保持部となっている。なお、本発明の細胞凍結保存具は、胚などの卵、卵子、精子、造血幹細胞、多能性幹細胞等の幹細胞などの細胞、特に上記のような生体細胞を凍結保存するために用いることができる。

生体細胞凍結保存具１は、図１ないし図５に示すように、耐寒性材料により形成された本体部３と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部２とを備える。この実施例のものでは、図２ないし図５（特に、図４）に示すように、生体細胞保持部２の基端部には、先端方向に所定長延びる穴部２１ａが形成されており、本体部３の先端部には、上記穴部２１ａ内に進入可能な所定長延びる突出部２４が設けられている。そして、本体部３の突出部２４が、生体細胞保持部２の穴部２１ａ内に挿入され、両者は、固定されている。

生体細胞保持部２は、断面が略矩形状であり、上述したように、本体部３と接続された基端部と、この基端部より先端側に突出する生体細胞付着保持部２２を備えている。そして、この実施例のものでは、生体細胞付着保持部２２は、細長い幅の狭い帯状（薄板状）のものとなっている。そして、その表面が、生体細胞付着保持面を形成している。

そして、本発明の生体細胞凍結保存具１では、図２ないし図９に示すように、生体細胞付着保持部２２の表面には、長手方向に複数設けられた生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅが設けられている。生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅは、図４および図９に示すように、略半球状の凹部となっている。また、複数の凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅは、生体細胞凍結保存具１の先端より所定長基端側の位置より、基端側に直線状に並ぶものとなっており、また、各凹部は、ほぼ等間隔離間している。この実施例では、凹部は、複数設けられているが、１つでもよい。また、複数設ける場合には、２〜８が好ましい。凹部の深さは、０．０５〜０．５ｍｍが好ましく、凹部の上面の開口径は、０．１〜０．５ｍｍが好ましい。また、凹部間の離間距離は、１〜３ｍｍが好ましい。

さらに、この実施例のものでは、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅが形成されている部分の裏面側部分は、図７および図９に示すように、膨出部３８ａ、３８ｂ、３８ｃ、３８ｄ，３８ｅとなっており、生体細胞収納用凹部を形成する部分が薄肉ではなく、十分な強度を有するものとなっている。なお、生体細胞収納用凹部を設けず、生体細胞凍結保存具１の表面を平坦に形成し、その平坦面を生体細胞付着保持部としてもよい。また、生体細胞付着保持部２２の幅は、０．４〜１．０ｍｍが好ましく、長さは、５〜３０ｍｍが好ましく、全体の厚さおよび凹部部分での厚さは、０．０８〜１．０ｍｍが好ましい。また、生体細胞保持部２の肉厚な基端部の長さは、５〜３０ｍｍが好ましく、本体部の長さは、２０〜１００ｍｍが好ましい。

さらに、この実施例の生体細胞凍結保存具１では、図６ないし図８に示すように、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅが形成された部分の生体細胞付着保持部２２の両側部に設けられかつ生体細胞付着保持部２２の長手方向に延びる２つの側部膨出部３５，３６を有している。このため、生体細胞凍結保存具１は、生体細胞収納用凹部の両側部に膨出部を有するため、生体細胞載置時における生体細胞の側部方向への移動を確実に抑制でき、かつ、載置された生体細胞の生体細胞収納凹部からの離出も防止する。

さらに、この実施例の生体細胞凍結保存具１では、図１ないし図９（特に、図６および図７）に示すように、生体細胞付着保持部２２は、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅより生体細胞付着保持部２２の先端側に設けられた突出部２７を備えている。突出部２７は、生体細胞付着保持部２２の先端より、上面側（生体細胞収納用凹部形成側）に突出するものとなっている。また、突出部２７は、図９に示すように、先端面は、若干基端側に傾斜する傾斜面となっている。このような突出部２７を形成することにより、もし、生体細胞収納部より生体細胞が離脱して、先端側に移動したとき、生体細胞凍結保存具１、言い換えれば、生体細胞付着保持部２２からの落下を防止することができる。特に、この実施例の生体細胞凍結保存具１では、上述したように、生体細胞付着保持部２２の両側部に設けられた膨出部３５，３６と協同することにより、生体細胞の落下を防止する。

さらに、この実施例の生体細胞凍結保存具１では、図２ないし図９（特に、図８および図９）に示すように、生体細胞付着保持部２２は、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅと連通する余剰凍結保存液排出路を備えている。この実施例の生体細胞凍結保存具１では、余剰凍結保存液排出路は、生体細胞付着保持部２２の長手方向に延びる溝部２９ａ，２９ｂ，２９ｃ，２９ｄ，２９ｅ，２９ｆにより構成されている。そして、この実施例のものでは、溝部２９ｂ，２９ｃ，２９ｄ，２９ｅは、隣り合う生体細胞収納用凹部を連結している。具体的には、溝部２９ｂは、凹部２８ａと凹部２８ｂを連通し、溝部２９ｃは、凹部２８ｂと凹部２８ｃを連通し、溝部２９ｄは、凹部２８ｃと凹部２８ｄを連通し、溝部２９ｅは、凹部２８ｄと凹部２８ｅを連通している。

さらに、この実施例では、図８および図９に示すように、生体細胞付着保持部２２は、生体細胞付着保持部２２の最も先端側に位置する生体細胞収納用凹部２８ａより、先端側に延びる溝部２９ａを備えており、その端部は、上述した突出部に到達もしくはその付近まで延びるものとなっている。さらに、この実施例のものでは、生体細胞付着保持部２２は、生体細胞付着保持部２２の最も基端側に位置する生体細胞収納用凹部２８ｅより、基端側に延びる溝部２９ｆを備えている。

このような生体細胞収納用凹部と連通する余剰凍結保存液排出路を設けることにより、生体細胞収納用凹部に生体細胞とともに収納された凍結保存液の余剰分が、この溝部内に流入するため、生体細胞が過剰な凍結保存液により被覆されることを抑制し、凍結を迅速に行うことができる。さらに、隣り合う生体細胞収納用凹部が、溝部により連通しているので、生体細胞収納用凹部からの凍結保存液の移動が容易となり、また、複数の生体細胞収納用凹部に残る凍結保存液量も均一化する。溝部の幅としては、１００μｍ〜５００μｍが好ましく、また、溝部の深さとしては、５０μｍ〜５００μｍが好ましい。

本体部３および生体細胞保持部２は、耐寒性材料により形成されている。特に、本体部３および生体細胞保持部２は、液体窒素耐性材料、言い換えれば、液体窒素に接触しても脆化しないものが好ましい。また、生体細胞保持部２は、透明もしくは半透明体であることが好ましく、また、多少の可撓性を有するものであることが好ましい。本体部３および生体細胞保持部２の形成材料としては、例えば、３−フッ化ポリエチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリイミド、超高分子量ポリエチレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体などの合成樹脂、また、それら合成樹脂により形成されたフィルムの積層体が好適に使用される。

上述した実施例の生体細胞凍結保存具１では、図６，図７および図９（特に、図７）に示すように、溝部２９ａ，２９ｂ，２９ｃ，２９ｄ，２９ｅは、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅの底部に到達しないものとなっている。このようにすることにより、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅの底部に若干の凍結保存液の貯留が可能なものとなっている。
しかし、上述のようなものに限定されるものではなく、図１０および図１１に示す生体細胞凍結保存具１０のように、溝部２９ａ，２９ｂ，２９ｃ，２９ｄ，２９ｅは、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅの底部に到達するものであってもよい。このようにすることにより、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅに貯留する凍結保存液をより少ないものとすることができる。

また、生体細胞収納用凹部およびそれと連通する余剰凍結保存液排出路の形態は、上述したようなものに限定されるものではない。
例えば、図１２ないし図１４に示すような生体細胞凍結保存具２０のようなタイプのものであってもよい。図１２は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の先端部の拡大正面図である。図１３は、図１２のＥ−Ｅ線断面図である。図１４は、図１２のＦ−Ｆ線断面図である。
生体細胞凍結保存具２０では、生体細胞付着保持部２２は、上面に形成された複数の短円筒状突出部を備えており、それら突出部の内部に生体細胞収納用凹部５１，５２，５３，５４，５５が形成されている。そして、突出部の側壁には、凹部５１と連通する２つのスリット６１ａ，６１ｂ、凹部５２と連通する２つのスリット６２ａ，６２ｂ、凹部５３と連通する２つのスリット６３ａ，６３ｂ、凹部５４と連通する２つのスリット６４ａ，６４ｂ、凹部５５と連通する２つのスリット６５ａ，６５ｂを有している。また、各スリットは、それぞれの凹部の底部に連通している。なお、凹部と連通するスリットは、１つでもよいが、２つ以上設けることが好ましい。また、凹部の深さは、０．０５〜０．５ｍｍが好ましい。さらに、この生体細胞凍結保存具２０では、その裏面側（短円筒状突出部の非形成面側）には、軸方向に延びかつ凹部５１の底面の下方を通過するように延びる凹部５６が形成されている。このため、凹部５１の底面を形成する部分は、肉薄部となっており、凹部への熱伝導を良好なものとしている。

次に、本発明の生体細胞凍結保存具１の使用方法について説明する。
この説明では、生体細胞（具体的には、卵子）を凍結保存する場合を例に取り説明する。
まず、複数の生体細胞である卵子を採取し、卵子の細胞内液を平衡液に置換する作業を行い、さらに、細胞外液をガラス化液に置換する作業を行う。そして、顕微鏡下において、生体細胞凍結保存具１の生体細胞付着保持部２２に設けられたそれぞれの生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅに卵子を少量のガラス化液とともに配置させ、付着させる。卵子が付着した生体細胞凍結保存具１を先端側（生体細胞保持部２２側）より、あらかじめ準備しておいた液体窒素に浸漬し凍結（ガラス化）させる。液体窒素との接触により、生体細胞は、急激冷却される。凍結生体細胞が付着した生体細胞凍結保存具１は、別途準備した筒状容器内に収納した後、さらに、収納容器（ケーン）に収納し、収納容器を液体窒素タンク内に入れ保存する。

本発明の生体細胞凍結保存具は、以下のものである。
（１）耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、前記生体細胞保持部は、細長い生体細胞付着保持部を備え、前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞付着保持部の長手方向に複数設けられた生体細胞収納用凹部と、前記生体細胞収納用凹部と連通する余剰凍結保存液排出路を有する生体細胞凍結保存具。

上記生体細胞凍結保存具は、生体細胞付着保持部が複数の生体細胞収納用凹部を有することにより、生体細胞配置操作において、生体細胞を配置するターゲットとなり、配置操作が良好に行え、さらに、生体細胞収納用凹部に収納された生体細胞は、移動が規制されるため、その後の凍結作業中での生体細胞の移動、離脱を防止できる。さらに、生体細胞収納用凹部と連通する余剰凍結保存液排出路を有するため、凹部内に過剰な凍結保存液が貯留することがなく、凍結作業時における生体細胞の冷却が迅速に行われる。

そして、本発明の実施態様は、以下のものであってもよい。
（２）前記余剰凍結保存液排出路は、前記生体細胞収納用凹部と連通し、かつ、前記生体細胞付着保持部の長手方向に延びる溝部である上記（１）に記載の生体細胞凍結保存具。
（３）前記生体細胞保持部は、前記生体細胞収納用凹部が形成された部分の前記生体細胞付着保持部の両側部に設けられかつ前記生体細胞付着保持部の長手方向に延びる２つの側部膨出部を有している上記（１）または（２）に記載の生体細胞凍結保存具。
（４）前記生体細胞付着保持部は、最も先端側の前記生体細胞収納用凹部より先端側に設けられた突出部を有する上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
（５）前記溝部は、隣り合う前記生体細胞収納用凹部を接続している上記（２）ないし（４）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。

（６）前記生体細胞付着保持部は、最も先端側に位置する前記生体細胞収納用凹部より、先端側に延びる溝部を備えている上記（２）ないし（５）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
（７）前記生体細胞付着保持部は、最も基端側に位置する前記生体細胞収納用凹部より、基端側に延びる溝部を備えている上記（２）ないし（６）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
（８）前記耐寒性材料は、液体窒素耐性材料である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
（９）前記生体細胞付着保持部は、薄板状のものである上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。

Claims

耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、
前記生体細胞保持部は、細長い生体細胞付着保持部を備え、前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞付着保持部の長手方向に複数設けられた生体細胞収納用凹部と、前記生体細胞収納用凹部と連通する余剰凍結保存液排出路を有することを特徴とする生体細胞凍結保存具。
前記余剰凍結保存液排出路は、前記生体細胞収納用凹部と連通し、かつ、前記生体細胞付着保持部の長手方向に延びる溝部である請求項１に記載の生体細胞凍結保存具。
前記生体細胞保持部は、前記生体細胞収納用凹部が形成された部分の前記生体細胞付着保持部の両側部に設けられかつ前記生体細胞付着保持部の長手方向に延びる２つの側部膨出部を有している請求項１または２に記載の生体細胞凍結保存具。
前記生体細胞付着保持部は、最も先端側の前記生体細胞収納用凹部より先端側に設けられた突出部を有する請求項１ないし３のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
前記溝部は、隣り合う前記生体細胞収納用凹部を接続している請求項２ないし４のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
前記生体細胞付着保持部は、最も先端側に位置する前記生体細胞収納用凹部より、先端側に延びる溝部を備えている請求項２ないし５のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
前記生体細胞付着保持部は、最も基端側に位置する前記生体細胞収納用凹部より、基端側に延びる溝部を備えている請求項２ないし６のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
前記耐寒性材料は、液体窒素耐性材料である請求項１ないし７のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
前記生体細胞付着保持部は、薄板状のものである請求項１ないし８のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。