JP5777011B2 - コルホルシンダロパートを含む骨疾患の予防または治療用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、コルホルシンダロパート（Ｃｏｌｆｏｒｓｉｎ Ｄａｒｏｐａｔｅ）を含む骨疾患の予防または治療用薬学的組成物に関するものであって、詳細に本発明の薬学的組成物は、破骨細胞の分化及びそれによる骨吸収を抑制し、造骨細胞の分化及びそれの活性を促進させ、骨折及び骨粗鬆症のような骨疾患の予防または治療用組成物、及び健康機能食品用組成物に関する。

骨組織は、軟骨と骨格系を構成し、機械的機能として支持と筋付着の役割を果たし、生体器官及び骨髓を保護する機能をし、カルシウムとリンイオンの恒常性維持のためにそれらを保存する機能を担当する。このような機能をする骨組織は、膠原質、糖タンパク質のような細胞基質と造骨細胞、破骨細胞及び骨細胞など様々な種類の細胞などからなる。それらのうち、破骨細胞は造血母細胞から由来した細胞であって、老化された骨の吸収を担当し、造骨細胞は骨髓内間質細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）から由来した細胞であって、骨形成に主な役割を担当する。

そのうち、破骨細胞はマウスのＲＡＷ２６４．７単核球 細胞がＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κＢ （ＲＡＮＫ） ｌｉｇａｎｄ）によって多核破骨細胞（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ）に分化される。このような分化過程は細胞外部のＲＡＮＫＬがＲＡＮＫに結合してマイトジェン活性タンパク質キナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫ）の活性を促進し、これはＮＦ−κＢという転写因子が核内に入り込んで破骨細胞分化と関連したＴＲＡＰ（ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＭＭＰ−９（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９）、ｃ−Ｓｒｃチロシンキナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）などの発現を増加させることによって可能であるが、このような過程で形成された多核破骨細胞は無機質骨（ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ）を吸収する役割を果たす。また、ＲＡＮＫＬがＲＡＮＫに結合すると、ＴＲＡＦ６（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ６）の活性を促進させてＭＡＰＫ、またはＮＦ−κＢ、ＡＰ−１、ＮＦＡＴｃ１のような転写因子などの活性を促進させる（Ｌｅｅ ＺＨ，Ｋｉｍ ＨＨ．Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ ｉｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００３ Ｍａｙ ３０，３０５，２１１−４）。従って、ＲＡＮＫＬによって活性化される信号伝逹経路の遮断は骨粗鬆症とその他の骨疾患の治療のための治療的接近方法中の一つとして認知されている。

一方、造骨細胞は間葉幹細胞から起源して形成されるが、造骨細胞の分化によるカルシウム形成のような無機質化は骨の強さを維持させてくれるだけでなく、身体全体のカルシウム及びホルモン代謝の恒常性にも非常に重要な機能をしている。造骨細胞の分化によるカルシウム形成はビタミンＤ及び副甲状線ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）などによって調節され、造骨細胞の分化による骨形成は細胞内で骨形態形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）、Ｗｎｔ、ＭＡＰキナーゼ、カルシニューリン−カルモジュリンキナーゼ（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ−ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｋｉｎａｓｅ）、ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１などの様々な信号伝逹体系の相互作用（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）によって造骨細胞の分化と関連したアルカリ性ホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＬＰ）が初期分化段階で合成された後、無機質化と関連したオステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、タイプＩコラーゲンなどが合成されることによってなされると知られている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．； Ｍａｃｋａｙ，Ａ．Ｍ．； Ｂｅｃｋ，Ｓ．Ｃ．； Ｊａｉｓｗａｌ，Ｒ．Ｋ．； Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｒ．； Ｍｏｓｃａ，Ｊ．Ｄ．； Ｍｏｏｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｓｉｍｍｏｎｅｔｔｉ，Ｄ．Ｗ．； Ｃｒａｉｇ，Ｓ．； Ｍａｒｓｈａｋ，Ｄ．Ｒ．Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８４，１４３−１４７）。従って、アルカリ性ホスファターゼの活性を促進する化合物などは、骨細胞の分化を促進するようになって骨疾患の治療として開発され得る。

このように骨形成は、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）による骨吸収（ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｐｒｔｉｏｎ）と、造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）による骨形成との対等な作用によるリモデリング過程が持続的に調節されることによって維持される。しかし、破骨細胞の過度な活性や造骨細胞の活性低下は、骨形成のリモデリング過程で不均衡をもたらし、生体内で破骨細胞と造骨細胞との平衡が崩れることによって骨疾患を誘発するようになる。

骨疾患の代表的な例として骨粗鬆症は、骨形成と骨吸収の平衡が崩れて骨吸収が優越に起こることによって骨の密度が弱化されて起こる疾患であって、現在、米国のみで約１０００万人が既に骨粗鬆症にかかっており、１８００万人が低い骨密度を持っているから骨粗鬆症の危険に置かれている。また、一生をかけて女性２人のうち１人、男性の場合は８人のうち１人が骨粗鬆症と関連した骨折を経験し、既に２００万人以上の米国男性らが骨粗鬆症疾患を病んでいる。米国では骨粗鬆症と関連した疾病と骨折による直接的な支出が毎年１４０億ドルに達している。大韓民国内での場合にも約４００万人が骨粗鬆症にかかっているとかその危険にあり、これは老令化社会に入りながらもっと増加すると推定され、これによる社会的支出と家族構成員の精神的、経済的支出が大きいと予想される。

前記のような骨疾患を治療するためには破骨細胞と造骨細胞との均衡を調節することが必要であり、従って、これに対する治療剤として大きく骨吸収抑制剤と骨形成刺激剤がある。これらのうち、骨形成刺激剤に対する研究が活発に進行されているが、骨形成刺激剤による骨密度強化が必ず骨折の減少を意味しないので、骨形成刺激剤が臨床的に広く使用されるためにはもっと多い研究が必要である。それだけでなく、このように骨形成を刺激するための製剤で造骨細胞を活性化させるための促進剤及び破骨細胞の骨吸収を抑制するための抑制剤は、一般的に患者に長期投与しなければならないから毒性が少なく、経口投与が可能なものが好ましいので、これに対する研究が切実に必要な実情である。

本発明者らは破骨細胞と造骨細胞との骨形成メカニズムの不均衡によって発生する骨疾患の予防または治療用薬学的組成物を開発するために鋭意努力した結果、コルホルシンダロパートが造骨細胞及び破骨細胞の均衡を維持することによって骨疾患治療効果を示すことを確認し、本発明を完成した。

本発明の目的は、コルホルシンダロパート（Ｃｏｌｆｏｒｓｉｎ Ｄａｒｏｐａｔｅ）を含む骨疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む骨疾患を治療する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、コルホルシンダロパートを含む骨疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供することである。

本発明によるコルホルシンダロパートを含む薬学的組成物は、破骨細胞の分化及び骨吸収を効果的に抑制し、造骨細胞の分化及び無機質化を促進させて骨形成を増進させるので、骨粗鬆症を含んだ骨疾患の予防及び治療に有用に利用され得る。

コルホルシンダロパートの単核球細胞の増殖に及ぶ影響を評価したグラフである。 コルホルシンダロパートのＲＡＮＫＬによって誘導された破骨細胞分化マーカーであるＴＲＡＰの活性を抑制することを示したグラフである。 コルホルシンダロパートの造骨細胞の分化マーカーであるＡＬＰの活性に及ぶ影響を示したグラフである（Ａ：ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、Ｂ：Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２）。 卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける本発明のコルホルシンダロパートの骨密度増加効果を生体用高画質微細電算断層撮影システムで検証した写真（Ａ）及び定量化グラフ（Ｂ）である。

前記目的を達成するための一つの態様として、本発明は、コルホルシンダロパート（Ｃｏｌｆｏｒｓｉｎ Ｄａｒｏｐａｔｅ）を含む骨疾患の予防または治療用組成物に関するものであっって、好ましくは下記の化学式１で表記される化合物または薬剤学的に許容可能なその塩を含む骨疾患の予防または治療用組成物に関するものである。

本発明における用語“コルホルシンダロパート”とは、（＋）−（３Ｒ、４ａＲ、５Ｓ、６Ｓ、６ａＳ、１０Ｓ、１０ａＲ、１０ｂＳ−５−アセトキシル−６−（３−ジメチルアミノプロピオニルオキシ）−ドデカヒドロ−１０、１０ｂ−ジヒドロキシ−３、４ａ、７、７、１０ａ−ペンタメチル−３−ビニル−１Ｈ−ナフト［２、１−ｂ］ピラン−１−ワンモノハイドロクロライドであって、分子式はＣ_２７Ｈ_４４ＣｌＮＯ_８であり、分子量は５４６．０９３１６（ｇ／ｍｏｌ）であり、下記の化学式１で表記される。

コルホルシンダロパートは、水溶性フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）誘導体であって、陽性心筋変力（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎｏｔｒｏｐｉｃ）、血管平滑筋弛緩作用及びアデニルシクラーゼ活性化作用をすると知られており、心室機能不全（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）の治療に有用な血管弛緩効果があると知られたことがある。しかし、いままでコルホルシンダロパートの骨吸収抑制及び骨形成増進と関連した生物学的有用性に対する研究は報告されたことがない。好ましくは本発明のコルホルシンダロパートは、ＲＡＮＫＬによって誘導される信号伝逹経路を遮断することによって破骨細胞の活性を抑制することができ、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性を増加させることによって造骨細胞活性を促進することができる。より好ましくは本発明の組成物は、ＲＡＮＫＬによって誘導されたＴＲＡＰの発現を阻害させることができ、ＡＬＰによって誘導されたオステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、タイプＩコラーゲンの合成を増加させ得る。また、本発明の組成物は、このような効果を毒性なく示すことができる。好ましい本発明の実施例では、単核球細胞でコルホルシンダロパートを処理した結果、活性を示す濃度で細胞毒性がないことを確認した（図１）。

本発明の薬学組成物は、前記化学式１のコルホルシンダロパートを有効成分として含み、本発明において使用されるコルホルシンダロパートは、公知の製造方法によって当業者が容易く製造して使用することができ、或いは、商業的に利用可能な製造されたコルホルシンダロパートを使用することができる。好ましく本発明では、公知の製造方法で天然植物体からコルホルシンダロパートの前駆物質であるフォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）を分離精製し（Ｓｈａｎ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ）．２００７，５５，３７６−８１．）、前記分離精製したフォルスコリンを対象に公知の製造方法によってコルホルシンダロパートを合成した（Ｔａｔｅｅ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ）．１９９６，４４，２２７４−９．）。

本発明の薬学的組成物は、前記化学式１のコルホルシンダロパートまたは薬剤学的に許容可能なその塩の形態で使用され得るが、塩としては薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、通常の方法、例えば、化合物を過量の酸水溶液に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを使用して沈澱させて製造する。同モル量の化合物及び水中の酸またはアルコール（例えば、グリコールモノメチルエーテル）を加熱し、引き継いで前記混合物を蒸発させて乾燥させるとか、または析出された塩を吸引ろ過させ得る。この時、遊離酸としては有機酸と無機酸を使用することができ、無機酸としては塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、スズ酸などを使用することができ、有機酸としてはメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸（ｍａｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸（ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ）、マンデル酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸などを使用することができ、これらに制限されない。

また、塩基を使用して薬学的に許容可能な金属塩を作ることができる。アルカリ金属またはアルカリ土金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土金属水酸化物溶液の中に溶解させ、非溶解化合物塩をろ過した後、ろ液を蒸発、乾燥させて得る。この時、金属塩としては、特にナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造するのが製薬上適合するが、これらに制限されるのではない。また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土金属塩を適当な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させて得ることができる。

前記化学式１のコルホルシンダロパートの薬剤学的に許容可能な塩は、他に指示されない限り、コルホルシンダロパートの化合物に存在できる酸性または塩基性基の塩をほとんど含む。例えば、薬学的に許容可能な塩としては、ヒドロキシル基のナトリウム、カルシウム及びカリウム塩などが含まれることができ、アミノ基のその他の薬学的に許容可能な塩としては、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩（メシル酸塩）、及びｐ−トルエンスルホン酸塩（トシル酸塩）などがあり、当業界で知られた塩の製造方法を介して製造され得る。

本発明の組成物は、造骨細胞及び破骨細胞の不均衡によって誘発される骨関連疾患に制限なく使用することができ、このような疾患の例としては、成長期発育不振、骨折、過度な破骨細胞の骨吸収による骨粗鬆症、リウマチ性関節炎、歯周疾患（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、パジェット病（Ｐａｇｅｔ ｄｉｓｅａｓｅ）及び転移性癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒｓ）などのような病理学的骨疾患であって、骨破壊を促進する疾患が含まれるが、前記骨疾患に限定されるのではない。

本発明における用語“骨疾患の予防または治療”とは、前記骨疾患の予防及び完全なまたは部分的な治療を含む。これは、また骨疾患症状の減少、改善、その症状の苦痛軽減、骨疾患発生率の減少または治療結果を増加させる患者のいかなる他の変化を含む。

好ましい一つの態様として、本発明の組成物は破骨細胞の分化または骨吸収を抑制することを特徴とする。

本発明における用語“破骨細胞”とは、大食細胞前駆体（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）から派生される細胞であって、破骨細胞前駆細胞などは大食細胞コロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，Ｍ−ＣＳＦ）、ＮＦ−κＢの受容体活性因子リガンド（ＲＡＮＫＬ）などによって破骨細胞に分化され、融合を通じて多核破骨細胞（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）を形成する。破骨細胞は、αｖβ３インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）などを通じて骨に結合し、酸性環境を造成する一方、各種コラゲナーゼ及びプロテアーゼを分泌して骨吸収（ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）を起こす。破骨細胞は、完全に分化された細胞で増殖せず、約２週間の寿命が終えれば細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を起こす。

好ましい本発明の実施例では破骨細胞に分化したマウス単核球細胞に本発明の組成物を投与した後、破骨細胞分化標識因子であるＴＲＡＰ（ｔａｒｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）染色を実施した結果、ＴＲＡＰ活性を濃度依存的に阻害させることを確認した（図２）。このように本発明の組成物は、ＴＲＡＰ活性抑制を通じて破骨細胞の分化を効果的に抑制するので、破骨細胞の活性増加による骨粗鬆症のような骨疾患を予防または治療することができる。

また、本発明の組成物は、造骨細胞の分化または活性を促進することを特徴とする。

本発明における用語“造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）”とは、間葉幹細胞から分化して生成される細胞であって、骨質を作って骨密度を増加させる役割を果たし、時には造骨細胞の活性が過度に増加されると、骨密度が増加されて骨の奇形や骨石火症などを起きるようにする。

本発明の好ましい実施例でコルホルシンダロパートを含む組成物を造骨細胞に処理すると、造骨細胞分化初期段階で分化標識因子であるＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の活性が著しく増加することを確認した（実施例３及び図３）。また卵巣摘出を通じる骨密度低下実験マウスに本発明のコルポシンを経口から投与した結果、骨密度が著しく増加することを確認した（実施例４及び図４）。このような結果は、本発明の組成物が細胞水準で造骨細胞の分化をさせることができることを立証するだけでなく、実際の動物においても骨密度を増加させることを示唆することであり、これで本発明の組成物が造骨細胞の分化または活性を促進させて骨疾患の予防または治療効果があることを裏付けることである。本発明の組成物は、ＡＬＰ活性増加を通じてオステオポンチン （ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、 オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、タイプＩコラーゲンなどの合成を促進することができ、これを通じて窮極的に造骨細胞の分化及び活性を促進することができるから、造骨細胞の分化及び活性抑制に応じて誘発される疾患を効果的に予防及び治療することができる。

また、好ましく本発明の薬学的組成物は、有効成分としてコルホルシンダロパートを組成物の総重量を基準に０．０００１〜５０重量％、より好ましくは０．０１〜１重量％の量で含有することができる。

好ましい一つの態様として、本発明の薬学的組成物は薬学的に許容可能な担体を更に含むことができる。前記薬学的に許容される担体は、経口投与の時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学的組成物の剤形は、上述したような薬学的に許容される担体と混合して多様に製造され得る。例えば、経口投与の時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウェーハなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐方形製剤などに剤形することができる。

この時、使用可能な適合した担体、希釈剤または賦形剤の実例としては、澱粉、糖、及びマンニトールのような賦形剤；リン酸カルシウム及び珪酸誘導体のような充填剤及び増量剤；カルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ゼラチン、アルギン酸塩、及びポリビニルピロリドンのような結合剤；滑石、ステアリン酸カルシウムまたはマグネシウム、水素化ヒマシ油、及び固相ポリエチレングリコールのような潤滑剤；ポビドン、クロスカルメロースナトリウム、及びクロスポビドンのような崩壊剤；ポリソルベート、セチル（ｃｅｔｙｌ）アルコール、及びグリセロールモノステアレートなどのような界面活性剤などを挙げることができる。

また一つの態様として、本発明は前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む骨疾患を治療する方法に関する。

本発明における用語“個体”とは、マウス、家畜、ヒトなどを含む哺乳動物を制限なく含む。

また、本発明による薬学的組成物は、多くの経路を介して投与され得る。本発明における投与は、いかなる適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記結合体の投与経路は、薬物が目的組織に到逹できる限りいかなる一般的な経路を介して投与され得る。具体的に、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与され得るが、これに制限されない。しかし、経口投与の時、ペプチドは消化されるから経口用組成物は活性薬剤をコーティングするとか胃での分解から保護されるように剤形化することが好ましい。好ましくは注射剤形態で投与され得る。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与され得る。

本発明におけるコルホルシンダロパートを含む薬学的組成物の実際投与量は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び疾患の重症度などの多くの関連因子とともに、活性成分である薬物の種類に応じて決定される。好ましく、有効成分としてのコルホルシンダロパートは、ヒトを含む哺乳動物に一日間１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇで１回または分割して投与され得る。

また他の一つの態様として、本発明は前記化学式１の化合物または食品学的に許容可能なその塩を含む骨疾患の予防または改善用健康機能食品組成物に関する。本発明の組成物を食品添加物として使用する場合、前記コルホルシンダロパートをそのまま添加するとか、他の食品または食品成分とともに使用することができ、通常的な方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）に応じて適合に決定され得る。

本発明における用語“健康機能食品”とは、健康補助の目的で特定成分を原料にするとか食品原料に入っている特定成分を抽出、濃縮、精製、混合などの方法で製造、加工した食品をいい、前記成分によって生体防御、生体リズムの調節、疾病の防止と回復などの生体調節機能を生体に対して十分に発揮するように設計されて加工された食品をいうものであって、前記健康食品用組成物は疾病の予防及び疾病の回復などと関連した機能を行うことができる。

また、本発明の組成物が使用され得る健康食品の種類には制限がない。合わせて、本発明のコルホルシンダロパートを含む活性成分として含む組成物は、当業者の選択によって健康機能食品に含有され得る適切なその他の補助成分と公知の添加剤を混合して製造することができる。添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含んだ酪農製品、各種スープ、飲料水、車、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、本発明による抽出物を主成分にして製造した汁、お茶、ゼリー及びジュースなどに添加して製造することができる。

以下、本発明を下記実施例を参照して具体的に説明する。ただ、下記実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、本発明の範囲が下記実施例に限定されない。

実施例１：単核球細胞培養及び細胞毒性評価
単核球細胞としてマウスのＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＴＣ ＴＩＢ−７１）を１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地で培養しながら２日間隔で培地を入れ替った。細胞培養と関連した試薬は、ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）社で購入して使用した。ＲＡＷ２６４．７細胞が７０％程度育った時、採取した細胞を９６−ウェルプレートに１×１０^３／ウェルに分株して、２４時間培養した。引き継いで、コルホルシンダロパートを濃度別（０、１０、２０及び３０μＭ）に処理した後、９６時間培養した。培養１日、２日及び４日目に、それぞれのウェルの細胞に対してＣＣＫ−８キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ，日本）を用いて化合物毒性を測定した。

その結果、コルホルシンダロパートは活性を示す濃度で細胞毒性がないことを確認した（図１）。

実施例２：破骨細胞への分化、及びＴＲＡＰ染色及び活性測定
ＲＡＷ２６４．７細胞が７０％程度育った時、採取した細胞を９６−ウェルプレートに１×１０^３／ウェルになるように再び分株し、この時、細胞を浮游させる培地としては、１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０％ＦＢＳが含まれたα−ＭＥＭを使用した。２４時間後、コルホルシンダロパートを濃度別（０、０．２、１、２、１０、及び２０μＭ）に処理した後、３日後にＬｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅキット（Ｓｉｇｍａ）を用いてＴＲＡＰ染色を行った。染色された細胞は、先ず１０％ホルマリンで１０分間固定させた後、９５％エタノールで脱水させて常温でよく乾燥させた。引き継いで、１０ｍＭの酒石酸ナトリウムと５ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸が添加された１００μｌのクエン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．６）をそれぞれのウェルに添加して２０〜３０分間反応させた。次に、新しい９６−ウェルプレートに酵素反応液を移し、１００μｌの０．１ＮのＮａＯＨで反応を終決させた後、４０５ｎｍで吸光度を測定した。ＴＲＡＰ活性は、対照群に対するパーセント（％）値にして、同時にｔ−テストで有意性検証を行った（パルモルファミン処理、ｐ＜０．０１；コルホルシンダロパート処理、ｐ＜０．００１）。比較化合物としてはパルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）を使用した。

その結果、コルホルシンダロパートが単核球ＲＡＷ２６４．７細胞でＲＡＮＫＬによって誘導されるＴＲＡＰ活性を濃度依存的に阻害したことを確認した（図２）。また、コルホルシンダロパートは、細胞毒性なく破骨細胞への分化を抑制する効能を示すことが分かる（図１及び図２）。

実施例３：造骨細胞のアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性分析
コルホルシンダロパートの造骨細胞分化の初期段階で活性及び発現が増加されると知られたＡＬＰの活性に及ぶ影響を調べるために、次のような方法で実験を行った。

マウス造骨細胞として、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１サーブクローン４（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ｓｕｂｃｌｏｎｅ ４，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２５９３）にコルホルシンダロパートを処理した後、８日後に細胞を溶菌溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を用いて３０分間常温で溶菌し、これを１２、０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。その次、得られた上層液からＢＣＡキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＡＬＰを定量し、ラボアッセイＡＬＰキット（ＬａｂＡｓｓａｙ ＡＬＰ ｋｉｔ）（Ｗａｋｏ，日本）を用いてＡＬＰ活性を測定した。この時、測定された活性は対照群に対する相対パーセントで示した。また、有意性検証をｔ−テストで行った（コルホルシンダロパート処理、ｐ＜０．０５；比較化合物としてパルモルファミン処理、ｐ＜０．０５）。同様の実験を多分化細胞（骨細胞を含んで多様な細胞に分化可能な細胞）Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２で実施した。

その結果、コルホルシンダロパート処理によって造骨細胞分化初期マーカーであるＡＬＰの活性が著しく増加した（図３Ａ）。また、多分化細胞であるＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２においでもＡＬＰの活性を著しく増加させることを確認した（図３Ｂ）。すなわち、コルホルシンダロパートがマウス造骨細胞であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１サーブクローン４に処理の時、細胞増殖には何らの影響を及ぼさないのに、造骨細胞の分化に関連したＡＬＰの活性を１ｍＭの濃度で比較化合物であるパルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）よりもっと増加させることを確認した。

実施例４：実験動物でのコルポシンの骨密度増加効果検証
骨粗鬆症治療剤としての効果を検証するために多い研究が進行されているが、ヒトを対象にする研究には限界があるから大部分動物を用いている。そのうち、閉経期後の骨粗鬆症の標本として最も多く用いられるモデルが卵巣を摘出したマウスであるが、これは卵巣摘出マウスが初期閉経女性の特徴とよほど似ているため、骨粗鬆症治療剤研究で多く利用されている。本発明者らは、５週齢ＤＤＹマウスのメスを対象に卵巣摘出手術を行った。ペントバルビタールナトリウム（中外製薬）２５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注入して全身痲酔させた後、腓腹部の毛を削毛した後、腹部上で毛を削毛して手術部位を消毒して手術を行った。腓部下側から約１．５ｃｍの皮膚及び筋肉と腹膜まで切開した後、卵巣を露出させた後、卵巣を切除し、腹膜、筋肉そして皮膚を縫合した。そして、一部に対しては腹膜までのみに同様な方法で接近し、卵巣は摘出しないまま再び縫合する偽手術（ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）を行ってこれを対照群として使用した。

卵巣摘出後の骨消失が誘発されたモデルマウスにコルポシン化合物を経口（ｐ．ｏ．）にそれぞれ５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇで濃度を異なりにして４週間一日に一回投与してその効果を生体用高画質微細電算断層撮映システム（ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ−ｖｉｖｏ ｍｉｃｒｏ−ＣＴ ｓｙｓｔｅｍ、 ｅｘｐｌｏｒｅ Ｌｏｃｕｓ ｓｃａｎｎｅｒ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，米国）で撮影後、骨密度を分析した。その結果、図４に示したように、卵巣摘出によって減少された骨密度がコルポシン投与４週後に著しく増加されることを確認した。

Claims (7)

1. 下記化学式１で表記される化合物または薬剤学的に許容可能なその塩を含む骨疾患の予防または治療用薬学的組成物。
   
2. 前記組成物は、破骨細胞の分化または骨吸収を抑制することを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
3. 前記組成物は、造骨細胞の分化または活性を促進することを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
4. 前記骨疾患は、骨粗鬆症、パジェット病、歯周疾患、骨成長障害、骨転移癌及びリウマチ性関節炎から構成された群から選択されたものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
5. 薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
6. 前記化学式１で表記される化合物を０．０１〜１重量％を含有することを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
7. 下記化学式１で表記される化合物または食品学的に許容可能なその塩を含む骨疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。