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JP5766179B2 - 筋肉増殖を増加させるための組成物および方法 - Google Patents

筋肉増殖を増加させるための組成物および方法 Download PDF

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Description

技術分野
本発明は、抗アクチビン受容体ＩＩＢ（ＡｃｔＲＩＩＢ）抗体の分野である。特に、疾患または不使用による筋肉障害、例えば、筋肉疲労を処置するための該抗体の使用に関する。
背景技術
アクチビンは、構造的に関係があるシグナル伝達タンパク質の形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーに属する二量体の増殖および分化因子である。アクチビンは、少なくとも２つのＩ型（ＩおよびＩＢ）および２つのＩＩ型（ＩＩおよびＩＩＢ、ａｋａ ＡＣＶＲ２ＡおよびＡＣＶＲ２Ｂ）受容体を含む受容体セリンキナーゼのヘテロ二量体複合体を介して信号を送る。これらの受容体は、システインリッチ領域を有するリガンド−結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニン特異性を有する細胞質ドメインを含む全て膜貫通タンパク質である。Ｉ型受容体は、シグナル伝達のために必須であり、ＩＩ型受容体はリガンド結合およびＩ型受容体の発現のために必要である。ＩおよびＩＩ型受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。
アクチビン受容体ＩＩＢ（ＡｃｔＲＩＩＢ）は、ミオスタチンに対する受容体である。ミオスタチンとこの受容体間の相互作用は、Ｓｍａｄ依存経路を介する骨格筋分化の阻害を制御する。したがって、ミオスタチンのＡｃｔＲＩＩＢへの結合を阻害または防止することにより、骨格筋の形成を誘導することができる。
種々のグループがこれを研究している。Bogdanovich et al (Nature, 2002, 420:418-421)は、抗ミオスタチン抗体がミオスタチンを阻止し、デュシェンヌ筋ジストロフィーのマウスモデルにおける筋肉量の増加をもたらすことができることを記載している。Bradley et al (Cell Mol. Life Sci. 2008, 65:2119-2124)は、ミオスタチンプロペプチドを投与すること、ミオスタチン受容体を阻止するためにフォリスタチンを投与すること、フォリスタチン生産を誘導するためにＨＤＡＣ阻害剤を投与すること、ミオスタチンの受容体への結合を防止する改変されたミオスタチンペプチドを投与すること、およびミオスタチンに対する可溶性デコイ受容体を投与することにより成熟ミオスタチンの放出を阻害する、前記抗ミオスタチン抗体を含むミオスタチン／ＡｃｔＲＩＩＢ相互作用を調節するための異なる利用できるアポローチを記載している。
これらの可能性のある治療にもかかわらず、患者の処置のために利用できる製品は存在しない。事実、最近、１つの会社がその抗ミオスタチン抗体プロジェクトを解散した。
したがって、患者における筋肉量および強度を増加させる方法の必要性が存在する。
発明の開示
ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に指向する抗体が、ミオスタチンの受容体への結合を防止し、したがってＳｍａｄ依存経路による筋肉の分化の阻害を防止することができることを見出した。これは、患者における筋肉量および強度の増加をもたらす。
したがって、１つの局面において、本発明は、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、または該抗体の抗原結合部分を含む機能性タンパク質を提供する。１つの態様において、ＡｃｔＲＩＩＢはヒトＡｃｔＲＩＩＢである。ヒトＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチド配列は配列番号：１８１に記載されている（ＡＡＣ６４５１５．１、ＧＩ：３７６９４４３）。１つの態様において、抗体または機能性タンパク質は、例えば、ヒトまたはラクダ起源を有する哺乳動物由来である。したがって、該抗体は、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体であり得る。特定の態様において、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、標的タンパク質ＡｃｔＲＩＩＢに特異的であり、ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＢのフラグメントに結合する抗原結合領域を有するとして特徴付けられる。好ましくは、該抗体は治療における使用のために適当である。
１つの態様において、本発明の抗体は、アゴニスト活性が存在しないか、または該活性が低いＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストである。別の態様において、該抗体または機能性フラグメントは、標的タンパク質ＡｃｔＲＩＩＢに結合し、ミオスタチンのＡｃｔＲＩＩＢへの結合を基底レベルに減少させる。この態様の１つの局面において、該抗体または機能性フラグメントは、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するミオスタチンの量を減少させる。この態様のさらなる局面において、該抗体または機能性フラグメントは、ミオスタチンのＡｃｔＲＩＩＢへの結合を完全に防止する。さらなる態様において、該抗体または機能性フラグメントは、Ｓｍａｄ活性化を阻害する。さらなる態様において、該抗体または機能性フラグメントは、Ｓｍａｄ依存経路を介する骨格分化のアクチビン受容体ＩＩＢ型介在ミオスタチン−誘導阻害を阻害する。
該結合は、抗体による拮抗作用または作動作用(agonism)のいずれかの活性を測定するために使用することができる１つ以上のアッセイにより測定され得る。好ましくは、該アッセイは、ＡｃｔＲＩＩＢに対する抗体の少なくとも１つの効果を測定する。ＥＬＩＳＡによるＡｃｔＲＩＩＢに対するミオスタチン結合の阻害、ミオスタチン誘導シグナル伝達の阻害（例えば、Ｓｍａｄ依存性レポーター遺伝子アッセイによる）、ミオスタチン誘導Ｓｍａｄリン酸化の阻害（Ｐ−Ｓｍａｄ ＥＬＩＳＡ）および骨格筋細胞分化のミオスタチン誘導阻害の阻害（例えば、クレアチンキナーゼアッセイによる）を含む。
１つの態様において、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢのミオスタチン結合領域（すなわち、リガンド結合ドメイン）に特異的に結合する抗体を提供する。このリガンド結合ドメインは、配列番号：１８１のアミノ酸１９−１３４からなり、本明細書において配列番号：１８２と指定されている。
１つの態様において、該抗体は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下のＫＤでＡｃｔＲＩＩＢに結合する。好ましくは、本発明の抗体は、１００ｐＭ以下（すなわち１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ以下）の親和性でＡｃｔＲＩＩＢに結合する。１つの態様において、本発明の抗体は、１０から２０ｐＭの親和性でＡｃｔＲＩＩＢに結合する。
１つの態様において、本発明の抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢ関連タンパク質と交差反応せず、特に、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ（ＮＰ＿００１６０７．１、ＧＩ：４５０１８９７）と交差反応しない。
１つの態様において、本発明の抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡよりもＡｃｔＲＩＩＢに優先的に結合する。１つの態様において、本発明の抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡへの結合よりも５倍以上、さらに好ましくは１０倍、さらに好ましくは５０倍、さらに好ましくは１００倍の親和性でＡｃｔＲＩＩＢに結合する。
１つの態様において、本発明の抗体は、１００ｐＭ以上（すなわち２５０ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ、５ｎＭ以上）の親和性でＡｃｔＲＩＩＡに結合する。
１つの態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
別の態様において、本発明の抗体はＩｇＧ１アイソタイプである。さらなる態様において、本発明の抗体はＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｆｃ領域の変異を介する改変されたエフェクター機能を有する。１つの態様において、該改変されたエフェクター機能は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を減少させる。１つの態様において、該改変されたエフェクター機能は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性をサイレンスにさせる。
別の関連態様において、本発明の抗体は、抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性またはＣＤＣ活性を有さない完全ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１抗体であり、配列番号：１８１のアミノ酸１９−１３４からなるＡｃｔＲＩＩＢの領域に結合する。
別の関連態様において、本発明の抗体は、減少した抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性またはＣＤＣ活性を有する完全ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１抗体であり、配列番号：１８１のアミノ酸１９−１３４からなるＡｃｔＲＩＩＢの領域に結合する。
本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢに対するミオスタチン結合を阻害し、インビトロおよびインビボでの骨格筋分化を活性化する単離された抗体、特にヒトまたはヒト化抗体に関する。１つの態様において、本発明の抗体は、特定の重鎖および軽鎖配列由来であり、および／または特定の構造的特徴、例えば、特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域を含む。本発明は、単離された抗体、このような抗体を作製する方法、このような抗体を含む免疫抱合体および多量体または多特異的分子、ならびに該抗体を含む医薬組成物、本発明の免疫抱合体または二重特異性分子を提供する。本発明は、また、Ｓｍａｄ活性化を阻害し、それにより骨格筋分化を誘導し、例えば、病理学的障害の処置をもたらすために、ＡｃｔＲＩＩＢの機能を阻害する、すなわち拮抗するために抗体を使用する方法に関する。
病理学的障害は、筋骨格疾患または障害、例えば、筋萎縮であり得る。グルココルチコイド、例えば、コルチゾール、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、またはプレドニゾロンでの処置の結果として含む、筋萎縮の多数の原因が存在する。筋萎縮は、また、神経外傷による脱神経の結果または、変性、代謝性または炎症性神経障害（例えば、Ｇｕｉｌｌｉａｎ−Ｂａｒｒｅ症候群、末梢性神経障害、または環境毒素または薬物への暴露）の結果であり得る。
加えて、筋萎縮は、筋障害、例えば、筋緊張症；先天性筋障害、例えば、ネマリン筋障害、マルチミニコア(multi/minicore)筋障害および筋細管（中心核）筋障害；ミトコンドリア性筋障害；家族性周期性四肢まひ；炎症性筋炎；例えば、グリコーゲンまたは脂質蓄積症により引き起こされる代謝性筋障害；皮膚筋炎；多発性筋炎；封入体筋炎；骨化性筋炎；横紋筋融解症およびミオグロビン尿症の結果であり得る。
筋障害は、筋ジストロフィー症候群、例えば、デュシェンヌ、ベッカー、筋緊張、顔面肩甲上腕、エメリー・ドレフュス、眼咽頭筋、肩甲上腕、肢帯、福山、先天型筋ジストロフィー、または遺伝的末梢性ミオパシーにより引き起こされ得る。筋骨格疾患は、また、骨粗鬆症、骨折、低身長症、または小人症であり得る。
加えて、筋萎縮は、成人運動ニューロン疾患、小児脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、若年性脊髄性筋萎縮症、多巣性伝導ブロックでの自己免疫性運動神経障害、卒中または脊髄損傷による麻痺、外傷による骨格固定化、長期のベッド休養、自発的不活化、不随意不活化、代謝ストレスまたは栄養不足、癌、ＡＩＤＳ、空腹時、甲状腺障害、糖尿病、良性先天性低血圧、セントラルコア病、やけど、慢性閉塞性肺疾患、肝臓疾患（例えば、線維症、肝硬変症）、敗血症、腎不全、鬱血性心不全、加齢、宇宙旅行または無重力状態で過ごすことの結果であり得る。
処置され得る加齢関連状態の例は、サルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、前立腺癌、卒中、平均寿命の減少、衰弱、記憶障害、しわ、腎機能障害、および加齢性難聴；代謝障害、例えば、ＩＩ型糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖、および肥満を含む。
本発明の抗体で処置され得る他の状態は、急性および／または慢性腎疾患または不全、肝線維症または肝硬変症、癌、例えば、乳癌、パーキンソン病；神経細胞死と関連する状態、例えば、ＡＬＳ、脳萎縮、または認知症および貧血を含む。
さらなる状態は、悪液質、リウマチ性関節炎に伴う悪液質および癌に伴う悪液質を含む。
今日までに、これらの障害を処置するための信頼できる、または有効な治療は、ほとんど開発されていない。
肝、腎および肺線維症に寄与する他の受容体中のＡｃｔＲＩＩＢへのアクチビン結合の役割（Werner and Alzheimer, Cytokine Growth Factors Rev 2006, 17(3):157-171）、ならびに癌におけるミオスタチン、アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩＢに対する役割（Tsuchida et al, Endo J, 2008, 55(1):11-21）の報告されている証拠に基づいて、本発明の抗体は、肝臓、腎臓、肺線維症、および限定はしないが、横紋筋肉腫、骨量減少を誘導する癌、肝細胞腺腫、消化器癌により例示される癌を処置するために使用され得る。
防止は、加齢関連状態または代謝障害の完全非存在、例えば、全非存在であり得る。防止は、また、対象における加齢関連状態または代謝障害の発生する可能性が、本発明の抗体を受けていない対象よりも起こる可能性が低いという部分的であり得る。
本発明の理解をさらに容易にするために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明中に記載する。
「免疫応答」なる用語は、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または、自己免疫もしくは病理学的な炎症の場合、正常なヒト細胞もしくは組織の選択的な損傷、破壊または人体からの除去をもたらす、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上記細胞または肝臓により生産される可溶性巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用を示す。
「シグナル変換経路」または「シグナル伝達活性」は、一般的にタンパク質−タンパク質相互作用、例えば、受容体への増殖因子の結合に開始し、ある部分の細胞から別の部分の細胞へシグナルの伝達をもたらす生化学的因果関係を示す。一般的に、伝達は、シグナル変換を引き起こす一連の反応のおける１つ以上のタンパク質上の１つ以上のチロシン、セリンまたはスレオニン残基の特異的なリン酸化を含む。最後から２番目のプロセスは、一般的に、遺伝子発現の変化をもたらす核事象を含む。
ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔ ＩＩＢ受容体なる用語は、配列番号：１８１（ＡＡＣ６４５１５．１、ＧＩ：３７６９４４３）において定義されるヒトＡｃｔＲＩＩＢを示す。研究レベルのポリクローナルおよびモノクローナル抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、例えば、R&D Systems(登録商標), MN, USAにより作製されているものは、当該分野で知られている。治療用抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、以前に公開されていない。もちろん、抗体を他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢに対して作製し、これらの種における病理学的状態を処置するために使用することができる。
本明細書において示される「抗体」なる用語は、全抗体およびそれらのあらゆる抗原結合フラグメント（すなわち「抗原結合部分」）または一本鎖を含む。天然「抗体」は、ジスルフィド結合により相互結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらにフレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存されている領域で散在されている相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に細分することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を介在し得る。
本明細書において使用される抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗原部分」）なる用語は、抗原に特異的に結合する能力を維持している抗体の全長または１つ以上のフラグメント（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの部分）を示す。抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントにより行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」なる用語内に包含される結合フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨが別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、ｂｙＶＬおよびＶＨ領域が対合し、一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426;およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883参照）として作製することが可能である合成リンカーにより結合させることができる。このような一本鎖抗体は、また、抗体の「抗原結合領域」なる用語内に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている慣用の技術を使用して得られ、該フラグメントは、無傷な抗体と同じ方法において有用性についてスクリーニングされる。
本明細書において使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示す（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢに特異的に結合する単離された抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ＡｃｔＲＩＩＢに特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば、他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢ分子に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないこともある。
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
本明細書において使用される「ヒト抗体」なる用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列由来である可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含むとき、定常領域は、また、かかるヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系配列、または変異型ヒト生殖細胞系配列または、例えば、Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86)に記載されている、ヒトフレームワーク配列分析に由来する抗体含有コンセンサスフレームワーク配列に由来する。
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異により導入される変異）。しかしながら、本明細書において使用される「ヒト抗体」なる用語は、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖細胞系由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体を含むことを意図しない。
「ヒトモノクローナル抗体」なる用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト配列に由来する可変領域を含む単一の結合特異性を示す抗体を示す。１つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入非ヒト動物、例えば、遺伝子導入マウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより生産される。
本明細書において使用される「組換えヒト抗体」なる用語は、組換え方法により調製、発現、創造または単離されるすべてのヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子導入または導入染色体を含む動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマ、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列のすべてまたは一部の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含むあらゆる他の方法により調製、発現、創造または単離される抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。１つの態様において、しかしながら、このような組換えヒト抗体は、インビトロで変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対する動物遺伝子導入を使用するとき、インビボ体細胞変異誘発）に付すことができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来し関連するけれども、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。
本明細書において使用される「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）を示す。
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」なる句は、「抗原に特異的に結合する抗体」なる用語と互換的に使用される。
本明細書において使用される、「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合する」抗体は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下のＫＤでヒトＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する抗体を示すことが意図される。「ＡｃｔＲＩＩＢ以外の抗原と交差反応する」抗体は、１０×１０−９Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下または２×１０−９Ｍ以下のＫＤで抗原に結合する抗体を示すことが意図される。「特定の抗原と交差反応しない」抗体は、１．５×１０−８Ｍ以上のＫＤまたは５−１０×１０−８Ｍもしくは１×１０−７Ｍ以上のＫＤで抗原に結合する抗体を示すことが意図される。１つの態様において、抗原と交差反応しないこのような抗体は、標準結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対する本質的に検出不可能な結合を示す。ＫＤは、バイオセンサーシステム、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム、またはSolution Equilibrium滴定を使用して決定され得る。
本明細書において使用される「アンタゴニスト抗体」なる用語は、ミオスタチンの存在下でＡｃｔＲＩＩＢ誘導シグナル伝達活性を阻害する抗体を示すことが意図される。これを検出するためのアッセイの例は、ミオスタチン誘導シグナル伝達の阻害（例えば、Ｓｍａｄ依存性レポーター遺伝子アッセイによる）、ミオスタチン誘導Ｓｍａｄリン酸化の阻害（Ｐ−Ｓｍａｄ ＥＬＩＳＡ）および骨格筋細胞分化のミオスタチン誘導阻害の阻害（例えば、クレアチンキナーゼアッセイによる）を含む。
いくつかの態様において、抗体は、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下または１００ｐＭ以下のＩＣ５０でＳｍａｄ依存性レポーター遺伝子アッセイにおいて測定されるミオスタチン誘導シグナル伝達を阻害する。
本明細書において使用される「アゴニスト活性を有さない」抗体は、ミオスタチンの非存在下で細胞ベースアッセイ、例えば、ミオスタチン誘導シグナル伝達の阻害（例えば、Ｓｍａｄ依存性レポーター遺伝子アッセイによる）、ミオスタチン誘導Ｓｍａｄリン酸化の阻害（Ｐ−Ｓｍａｄ ＥＬＩＳＡ）および骨格筋細胞分化のミオスタチン誘導阻害の阻害（例えば、クレアチンキナーゼアッセイによる）において、ＡｃｔＲＩＩＢ介在シグナル伝達活性を有意に増加させない抗体を示すことが意図される。このようなアッセイは、以下の実施例でより詳細に記載されている。
本明細書において使用される「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」なる用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を示すことが意図され、一方で、本明細書において使用される「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」なる用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を示すことが意図される。本明細書において使用される「ＫＤ」なる用語は、解離定数を示すことが意図され、Ｋｄ対Ｋａの割合（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として示される。抗体に対するＫＤ値は、当該分野で確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）のバイオセンサーシステム、またはSolution Equilibrium滴定（ＳＥＴ）を使用することによる方法である（Friguet B et al. (1985) J. Immunol Methods; 77(2): 305-319およびHanel C et al. (2005) Anal Biochem; 339(1): 182-184、参照）。
本明細書において使用される「親和性」なる用語は、単一の抗原性部位での抗体と抗原間の相互作用の強度を示す。それぞれの抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位で抗原と弱い非共有の力を介して相互作用し；相互作用が増すほど、親和性は強くなる。
本明細書において使用される「アビディティー」なる用語は、抗体−抗原複合体の全体的な安定性または強度の情報尺度を示す。３つの主要な因子：抗体エピトープ親和性；抗原および抗体両方の価数；および相互作用部分の構造的配置により制御される。結局、これらの因子は、抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が正確な抗原エピトープと結合する確率を定義する。
本明細書において使用される、「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞毒性」活性なる用語は、ヒトＢ細胞欠失活性を示す。ＡＤＣＣ活性は、当該分野で知られているヒトＢ細胞欠失アッセイにより測定することができる。
より高いアビディティープローブを得るために、二量体抱合体（ＦＡＣＳマーカーと結合している抗体タンパク質の２分子）を構築することができ、したがって親和性の低い相互作用（例えば、生殖細胞系抗体と）がＦＡＣＳによりさらに容易に検出できるようにさせる。加えて、抗原結合のアビディティーを増強する別の方法は、本明細書に記載されている抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の構築物のいずれかの二量体、三量体または多量体を作製することを含む。このような多量体は、例えば、天然Ｃ−から−Ｎ−末端結合を模倣することにより、または定常領域を介してともに保持される抗体二量体を模倣することにより、個々のモジュール間の共有結合を介して作製され得る。Ｆｃ／Ｆｃ接触に操作される結合は、共有または非共有であり得る。加えて、Ｆｃ以外の二量体または多量体パートナーは、ＡｃｔＲＩＩＢハイブリッドにおいて使用され、このようなより高次の構造を作製することができる。例えば、多量体ドメイン、例えば、ＷＯ２００４／０３９８４１に記載されている三量体ドメインまたはＷＯ９８／１８９４３に記載されている五量体ドメインを使用することが可能である。
本明細書において使用される抗体に対する「選択性」なる用語は、特定の標的ポリペプチドに結合するが、密接に関連するポリペプチドに結合しない抗体を示す。
本明細書において使用される抗体に対する「高親和性」なる用語は、標的抗原に対して１ｎＭ以下のＫＤを有する抗体を示す。本明細書において使用される「対象」なる用語は、すべてのヒトまたは非ヒト動物を含む。
「非ヒト動物」なる用語は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類などを含む。
本明細書において使用される「最適化された」なる用語は、ヌクレオチド配列が、生産細胞または生物、一般的に、真核細胞、例えば、ピチア細胞、トリコデルマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように改変されているヌクレオチド配列を意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、出発ヌクレオチド配列（「親」配列としても知られている）によりもともとコードされるアミノ酸配列を完全に保持するか、もしくはできるだけ保持するように操作される。本明細書において最適化された配列は、ＣＨＯ哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されているが、しかしながら、他の真核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現は、また、本明細書で想定される。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、また、最適化されているとことを示す。
本発明の種々の局面は、以下のサブセクションにさらに詳細に記載されている。
種々の種のＡｃｔＲＩＩＢに対する抗体の結合能力を評価する標準アッセイは、当該分野で知られており、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡを含む。適当なアッセイは、実施例に詳細に記載されている。抗体の結合親和性は、また、当該分野で知られている標準アッセイ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ分析またはSolution Equilibrium滴定により評価することができる。表面プラズモン共鳴に基づく技術、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅは、結合親和性の計算を可能にする結合反応速度を決定することができる。ＡｃｔＲＩＩＢの機能特性に対する抗体の効果を評価するアッセイ（例えば、受容体結合、ヒトＢ細胞増殖またはＩｇＧ生産の防止または誘導）は、実施例に詳細に記載されている。
したがって、当該分野で知られている、および本明細書に記載されている方法論にしたがって決定される１つ以上のこれらのＡｃｔＲＩＩＢ機能特性（例えば、生化学的、免疫化学的、細胞的、生理学的または他の生物学的活性など）を「阻害する」抗体は、抗体の非存在下で（例えば、または不適切な特異性のコントロール抗体が存在するとき）見られるものと比較して特定の活性における統計的に有意な減少に関係すると理解される。ＡｃｔＲＩＩＢ活性を阻害する抗体は、測定されるパラメーターの少なくとも１０％、少なくとも５０％、８０％または９０％の統計的に有意な減少をもたらし、１つの態様において、本発明の抗体は、９５％、９８％または９９％以上のＡｃｔＲＩＩＢ機能活性を阻害し得る。
「交差阻止する」、「交差阻止された」および「交差阻止」なる用語は、本明細書において互換的に使用され、標準競合結合アッセイにおいて、他の抗体または結合剤のＡｃｔＲＩＩＢ、特にリガンド結合ドメインへの結合を妨げる抗体または他の結合剤の能力を意味する。
抗体または他の結合剤が別の抗体または結合分子のＡｃｔＲＩＩＢへの結合を妨げることができる能力または程度、したがって本発明による交差阻止することができるか否かは、標準競合結合アッセイを使用して測定することができる。１つの適当なアッセイは、表面プラズモン共鳴技術を使用して相互作用の程度を測定することができるＢｉａｃｏｒｅ技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置(Biacore, Uppsala, Sweden)を使用することによる）の使用を含む。交差阻止を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースのアプローチを使用する。さらなるアッセイは、ＡｃｔＲＩＩＢ発現細胞への結合に対する種々の抗体の競合を試験するＦＡＣＳ分析を使用する（例えば、実施例に記載されている）。
本発明において、本発明の交差阻止する抗体または他の結合剤は、抗体または結合剤の組合せ（混合物）の記録された結合が、組合せにおける２つの抗体または結合剤の最大理論結合の８０％から０．１％（例えば、８０％から４％）、具体的には最大理論結合の７５％から０．１％（例えば、７５％から４％）、さらに具体的には最大理論結合（上記のとおり）の７０％から０．１％（例えば、７０％から４％）、さらに具体的には６５％から０．１％（例えば、６５％から４％）であるように、記載されているＢＩＡｃｏｒｅ交差阻止アッセイにおいてＡｃｔＲＩＩＢに結合する。
試験抗体が陽性コントロールウェルと比較したとき（すなわち、同じ抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢであり、交差阻止する「試験」抗体でない）、６０％から１００％、具体的には７０％から１００％、さらに具体的には８０％から１００％のＡｃｔＲＩＩＢへの抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体結合の減少を引き起こすことができるとき、抗体はＥＬＩＳＡアッセイにおいて本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体が交差阻止すると定義される。本明細書に記載されているとおり交差阻止抗体の例は、ＭＯＲ０８１５９およびＭＯＲ０８２１３である。したがって、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢへの結合に対してＭＯＲ０８１５９またはＭＯＲ０８２１３を交差阻止する抗体を提供する。
組換え抗体
本発明の抗体は、実施例に記載されているとおりに単離され、構造的に特性化されたヒト組換え抗体を含む。本発明の単離された抗体のＶＨアミノ酸配列は、配列番号：９９−１１２に示されている。本発明の単離された抗体のＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：８５−９８に示されている。本発明の抗体の好ましい全長重鎖アミノ酸配列の例は、配列番号：１４６−１５０および１５６−１６０に示されている。本発明の抗体の好ましい全長軽鎖アミノ酸配列の例は、それぞれ配列番号：１４１−１４５および１５１−１５５に示されている。本発明の他の抗体は、アミノ酸欠失、挿入または置換により変異されているが、ＣＤＲ領域において上記の配列に示されるＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９７または９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの態様において、それは、上記の配列に示されるＣＤＲ領域と比較したとき、わずか１、２、３、４または５個のアミノ酸がＣＤＲ領域においてアミノ酸欠失、挿入または置換により変異されている変異体アミノ酸配列を含む。
さらに、可変重鎖親ヌクレオチド配列は、配列番号：１２７−１４０に示されている。可変軽鎖親ヌクレオチド配列は、配列番号：１１３−１２６に示されている。哺乳動物細胞における発現のために最適化された全長軽鎖ヌクレオチド配列は、配列番号：１６１−１６５および１７１−１７５に示されている。哺乳動物細胞における発現のために最適化された全長重鎖ヌクレオチド配列は、配列番号：１６６−１７０および１７６−１８０に示されている。本発明の他の抗体は、変異されているが、上記の配列と少なくとも６０以上（すなわち、８０、９０、９５、９７、９９以上）パーセントの同一性を有するアミノ酸または核酸を含む。いくつかの態様において、それは、上記の配列に示される可変領域と比較したとき、わずか１、２、３、４または５個のアミノ酸が可変領域においてアミノ酸欠失、挿入または置換により変異されている変異体アミノ酸配列を含む。
これらの抗体のそれぞれが同じエピトープに結合し、同じ親抗体由来の産物であるため、ＶＨ、ＶＬ、全長軽鎖、および全長重鎖配列（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）を「混合し、マッチングして」、本発明の他の抗ＡｃｔＲＩＩＢ結合分子を創造することができる。このような「混合し、マッチングした」抗体のＡｃｔＲＩＩＢ結合は、上記されている、および実施例に記載されている結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。これらの鎖を混合し、マッチングするとき、特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＨ配列は、構造的に同様のＶＨ配列と置き換えられるべきである。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対由来の全長重鎖配列は、構造的に同様の全長重鎖配列と置き換えられるべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＬ配列は、構造的に同様のＶＬ配列と置き換えられるべきである。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対由来の全長軽鎖配列は、構造的に同様の全長軽鎖配列と置き換えられるべきである。したがって、１つの局面において、本発明は、配列番号：９９−１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号：８５−９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、単離された組換え抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体またはそれらの抗原結合領域を提供する。
別の局面において、本発明は以下のものを提供する：
（ｉ）配列番号：９９−１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長重鎖；および配列番号：８５−９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長軽鎖を有する単離された組換え抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、または
（ｉｉ）それらの抗原結合部分を含む機能性タンパク質。
別の局面において、本発明は以下のものを提供する：
（ｉ）配列番号：１２７−１４０からなる群から選択される哺乳動物の細胞における発現のために最適化されているヌクレオチド配列によってコードされる全長重鎖、および配列番号：１１３−１２６からなる群から選択される哺乳動物の細胞における発現のために最適化されているヌクレオチド配列によってコードされる全長軽鎖を有する単離された組換え抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、または
（ｉｉ）それらの抗原結合部分を含む機能性タンパク質。
抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号：１−１４に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号：１５−２８に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号：２９−４２に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号：４３−５６に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号：５７−７０に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号：７１−８４に示されている。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ系（Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)を使用して表される。ＣＤＲ領域を決定する代替方法は、Ｃｈｏｔｈｉａ（Chothia et al. 1989, Nature, 342:877-883）により考案された方法を使用する。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づく。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａにより使用された番号付け系の変化によって（例えば、http://www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/GeneralInfo.htmlおよびhttp://www.bioinf.org.uk/abs/、参照）、現在、この系はあまり一般的に使用されていない。ＣＤＲを定義するための他の系が存在し、また、２つのウェブサイトにおいても記載されている。
これらの抗体のそれぞれがＡｃｔＲＩＩＢに結合することができる、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２および３領域により提供されることを考えると、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列を「混合し、マッチングする」ことができる（すなわち、異なる抗体由来のＣＤＲを混合し、マッチングすることができ、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２および３を含むそれぞれの抗体は、本発明の他の抗ＡｃｔＲＩＩＢ結合分子を創造する）。このような「混合し、マッチングした」抗体のＡｃｔＲＩＩＢ結合は、上記されている、および実施例に記載されている結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合し、マッチングするとき、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に同様のＣＤＲ配列と置き換えられるべきである。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合し、マッチングするとき、特定のＶＬ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に同様のＣＤＲ配列と置き換えられるべきである。新規ＶＨおよびＶＬ配列が１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を本発明のモノクローナル抗体のために本明細書で示されるＣＤＲ配列由来の構造的に同様の配列と置き換えることにより創造できることが、当業者に容易に理解される。
単離された組換え抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、またはそれらの抗原結合領域は、配列番号：１−１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１５−２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：２９−４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：４３−５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：５７−７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７１−８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を有する。
１つの態様において、抗体は、配列番号：１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：２９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：４３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：５７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７１の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３０の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：４４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：５８の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７２の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１７の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：４５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：５９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３２の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：４６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：６０の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１９の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：４７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：６１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：６の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３４の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：４８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：６２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２１の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：４９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：６３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７７の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３６の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：５０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７８の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２３の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：５１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７９の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：１０の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３８の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：５２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：６６の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：８０の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：１１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：５３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：６７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：８１の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：１２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：４０の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：５４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：６８の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：８２の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：１３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２７の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：４１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：５５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：６９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：８３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、抗体は、配列番号：１４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：４２の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：５６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：７０の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：８４の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号：８５の可変重鎖配列および配列番号：９９の可変軽鎖配列；（ｂ）配列番号：８６の可変重鎖配列および配列番号：１００の可変軽鎖配列；（ｃ）配列番号：８７の可変重鎖配列および配列番号：１０１の可変軽鎖配列；（ｄ）配列番号：８８の可変重鎖配列および配列番号：１０２の可変軽鎖配列；（ｅ）配列番号：８９の可変重鎖配列および配列番号：１０３の可変軽鎖配列；（ｆ）配列番号：９０の可変重鎖配列および配列番号：１０４の可変軽鎖配列；（ｇ）配列番号：９１の可変重鎖配列および配列番号：１０５の可変軽鎖配列；（ｈ）配列番号：９２の可変重鎖配列および配列番号：１０６の可変軽鎖配列；（ｉ）配列番号：９３の可変重鎖配列および配列番号：１０７の可変軽鎖配列；（ｊ）配列番号：９４の可変重鎖配列および配列番号：１０８の可変軽鎖配列；（ｋ）配列番号：９５の可変重鎖配列および配列番号：１０９の可変軽鎖配列；（ｌ）配列番号：９６の可変重鎖配列および配列番号：１１０の可変軽鎖配列；（ｍ）配列番号：９７の可変重鎖配列および配列番号：１１１の可変軽鎖配列；または（ｎ）配列番号：９８の可変重鎖配列および配列番号：１１２の可変軽鎖配列を含む抗体を提供する。
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号：１４６の重鎖配列および配列番号：１４１の軽鎖配列；（ｂ）配列番号：１４７の重鎖配列および配列番号：１４２の軽鎖配列；（ｃ）配列番号：１４８の重鎖配列および配列番号：１４３の軽鎖配列；（ｄ）配列番号：１４９の重鎖配列および配列番号：１４４の軽鎖配列；（ｅ）配列番号：１５０の重鎖配列および配列番号：１４５の軽鎖配列；（ｆ）配列番号：１５６の重鎖配列および配列番号：１５１の軽鎖配列；（ｇ）配列番号：１５７の重鎖配列および配列番号：１５２の軽鎖配列；（ｈ）配列番号：１５８の重鎖配列および配列番号：１５３の軽鎖配列；（ｉ）配列番号：１５９の重鎖配列および配列番号：１５４の軽鎖配列；または（ｊ）配列番号：１６０の重鎖配列および配列番号：１５５の軽鎖配列を含む抗体を提供する。
本明細書において使用されるヒト抗体は、抗体の可変領域または全長鎖がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られるとき、特定の生殖細胞系配列の「産物」または「由来」である重鎖もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もしくは軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスを興味ある抗原で免疫化すること、またはファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを興味ある抗原でスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の「産物」または「由来」であるヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列と非常に近い配列（すなわち、同一性％が非常に高い）であるヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することによりそれ自体同定することができる。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の「産物」または「由来」であるヒト抗体は、例えば、天然体細胞変異または部位特異的変異の意図的導入による、生殖細胞系列配列と比較してアミノ酸の違いを含み得る。しかしながら、選択されたヒト抗体は、一般的に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系配列）と比較して、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含む。１つの場合において、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも８０％、９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。一般的に、特定のヒト生殖細胞系配列由来のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、わずか１０個のアミノ酸の違いを示し得る。１つの場合において、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、わずか５、またはわずか４、３、２もしくは１個のアミノ酸の違いを示し得る。
１つの態様において、本発明の抗体は、ｐＢＷ５２２またはｐＢＷ５２４によってコードされるものである（それぞれ寄託番号ＤＳＭ２２８７３およびＤＳＭ２２８７４の下に、２００９年８月１８日付け、DSMZ, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された）。
相同抗体
さらに別の態様において、本発明の抗体は、本明細書に記載されている抗体のアミノ酸およびヌクレオチド配列と相同である全長重鎖および軽鎖アミノ酸配列；全長重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列、可変領域重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列、または可変領域重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有し、本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の所望の機能特性を維持している。
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離された組換え抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体（またはそれらの抗原結合部分を含む機能性タンパク質）を提供し、ここで：重鎖可変領域が配列番号：９９−１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、または少なくとも９０％（好ましくは、少なくとも９５、９７または９９％）同一であるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域が配列番号：８５−９８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、または少なくとも９０％（好ましくは、少なくとも９５、９７または９９％）同一であるアミノ酸配列を含み；抗体が以下の機能特性の少なくとも１つを示す：（ｉ）インビトロまたはインビボでミオスタチン結合を阻害する、および／または（ｉｉ）Ｓｍａｄ依存経路を介する筋肉分化の阻害を減少させる。
さらなる例において、本発明は、全長重鎖および全長軽鎖を含む単離された組換え抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体（またはそれらの抗原結合部分を含む機能性タンパク質）を提供し、ここで：全長重鎖が配列番号：１４６−１５０および１５６−１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、または少なくとも９０％（好ましくは、少なくとも９５、９７または９９％）同一であるアミノ酸配列を含み；全長軽鎖が配列番号：１４１−１４５および１５１−１５５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、または少なくとも９０％（好ましくは、少なくとも９５、９７または９９％）同一であるアミノ酸配列を含み；抗体が以下の機能特性の少なくとも１つを示す：（ｉ）インビトロまたはインビボでミオスタチン結合を阻害する、および／または（ｉｉ）Ｓｍａｄ依存経路を介する筋肉分化の阻害を減少させる。好ましくは。このような抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢのリガンド結合ドメインに結合する。
別の例において、本発明は、全長重鎖および全長軽鎖を含む単離された組換え抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体（またはそれらの抗原結合部分を含む機能性タンパク質）を提供し、ここで：全長重鎖が配列番号：１６６−１７０および１７６−１８０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、または少なくとも９０％（好ましくは、少なくとも９５、９７または９９％）同一であるヌクレオチド配列によってコードされ；全長軽鎖が配列番号：１６１−１６５および１７１−１７５からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、または少なくとも９０％（好ましくは、少なくとも９５、９７または９９％）同一であるヌクレオチド配列によってコードされ；抗体が以下の機能特性の少なくとも１つを示す：（ｉ）インビトロまたはインビボでミオスタチン結合を阻害する、および／または（ｉｉ）Ｓｍａｄ依存経路を介する筋肉分化の阻害を減少させる。好ましくは。このような抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢのリガンド結合ドメインに結合する。
種々の態様において、抗体は上記の１つ以上の、２つ以上の、または３つの機能特性を示し得る。抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。好ましくは、抗体は完全ヒトＩｇＧ１抗体である。
他の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、上記の配列と８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。他の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、わずか１、２、３、４または５個のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除いて同一であり得る。それぞれ配列番号９９−１１２および配列番号：８５−９８のＶＨおよびＶＬ領域と高い（すなわち、８０％以上）同一性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、それぞれ核酸分子配列番号：１２７−１４０および１１３−１２６の変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲ−介在変異誘発）により得て、次に、本明細書に記載されている機能性アッセイを使用して、維持されている機能（すなわち、上記機能）についてコードされた改変された抗体を試験することができる。
他の態様において、全長重鎖および／または全長軽鎖アミノ酸配列は、上記配列と８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。それぞれ、配列番号：１４６−１５０および１５６−１６０のいずれかの全長重鎖および配列番号：１４１−１４５および１５１−１５５のいずれかの全長軽鎖と、高い（すなわち、８０％以上）同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は、それぞれ核酸分子配列番号：１６６−１７０および１７６−１８０ならびに配列番号：１６１−１６５および１７１−１７５の変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲ−介在変異誘発）により得て、次に、本明細書に記載されている機能性アッセイを使用して、維持されている機能（すなわち、上記機能）についてコードされた改変された抗体を試験することができる。
他の態様において、全長重鎖および／または全長軽鎖ヌクレオチド配列は、上記配列と８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。
他の態様において、重鎖および／または軽鎖ヌクレオチド配列の可変領域は、上記配列と８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。
本明細書において使用される、２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数、およびそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列で共有される同一の位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一の位置の＃／位置の全＃×１００）である。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、以下に記載される数学アルゴリズムを使用して達成することができる。
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル(weight residue table)、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間パーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで利用できる）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970）アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびにギャッウェイト１６、１４、１２、１０、８、６または４および長ウェイト１、２、３、４、５または６を使用して決定することができる。
保存的修飾を有する抗体
１つの態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、ここで、これらのＣＤＲ配列の１つ以上が本明細書に記載されている抗体に基づいて記載されているアミノ酸配列またはそれらの保存的修飾を有し、抗体が本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の所望の機能特性を維持している。したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域からなる単離された組換え抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、またはそれらの抗原結合部分を含む機能性タンパク質を提供し、ここで：重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号：１−１４、およびそれらの保存的修飾からなる群から選択され；重鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号：１５−２８、およびそれらの保存的修飾からなる群から選択され；重鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号：２９−４２、およびそれらの保存的修飾からなる群から選択され；軽鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号：４３−５６、およびそれらの保存的修飾からなる群から選択され；軽鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号：５７−７０、およびそれらの保存的修飾からなる群から選択され；軽鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号：７１−８４、およびそれらの保存的修飾からなる群から選択される。好ましくは、抗体は、以下の機能特性の少なくとも１つを示す：（ｉ）インビトロまたはインビボでミオスタチン結合を阻害する、および／または（ｉｉ）Ｓｍａｄ依存経路を介する筋肉分化の阻害を減少させる。
種々の態様において、抗体は、上記の機能特性の１つまたは両方を示し得る。このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る
他の態様において、哺乳動物細胞における発現のために最適化された本発明の抗体は、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有し、ここで、これらのＣＤＲ配列の１つ以上が本明細書に記載されている抗体に基づいて記載されているアミノ酸配列またはそれらの保存的修飾を有し、抗体が本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の所望の機能特性を維持している。したがって、本発明は、全長重鎖および全長軽鎖からなる哺乳動物細胞における発現のために最適化された単離されたモノクローナル抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を提供し、ここで：全長重鎖が配列番号：１４６−１５０および１５６−１６０群から選択されるアミノ酸配列、およびそれらの保存的修飾を有し；全長軽鎖が配列番号：１４１−１４５および１５１−１５５の群から選択されるアミノ酸配列、およびそれらの保存的修飾を有し；抗体は、以下の機能特性の少なくとも１つを示す：（ｉ）インビトロまたはインビボでミオスタチン結合を阻害する、および／または（ｉｉ）Ｓｍａｄ依存経路を介する筋肉分化の阻害を減少させる。
種々の態様において、抗体は、上記の機能特性の１つまたは両方を示し得る。このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る
本明細書において使用される「保存的配列修飾」なる用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響しないか、または改変しないアミノ酸修飾を示すことが意図される。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当該分野で知られている標準技術、例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発により本発明の抗体に導入することができる。
保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基が同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置き換えることができ、改変された抗体は、本明細書に記載されている機能性アッセイを使用して維持されている機能について試験することができる。
本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されている本発明の種々の特定の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。ＡｃｔＲＩＩＢに対するミオスタチン結合を阻止することができる実施例に記載されている全ての抗体は、高親和性を有するＡｃｔＲＩＩＢにおける配列番号：１８１のアミノ酸１９−１３４間に含まれる同じエピトープに結合する。
したがって、さらなる抗体は、標準ＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイにおいて本発明の他の抗体と交差競合する（例えば、統計的に有意な様式において結合を競合的に阻害する）能力に基づいて同定することができる。本発明の抗体のヒトＡｃｔＲＩＩＢへの結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がヒトＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体と競合することができ；このような抗体が、非限定的な理論によって、競合する抗体とヒトＡｃｔＲＩＩＢにおける同じまたは関連する（例えば、構造的に同様の、または空間的に近接な）エピトープに結合し得ることを証明する。１つの態様において、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ上における本発明の抗体と同じエピトープに結合する抗体は、ヒト組換え抗体である。このようなヒト組換え抗体は、実施例に記載されているとおりに調製および単離することができる。
したがって、本発明は、配列番号：８５に記載されている可変重鎖配列および配列番号：９９に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：８６に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１００に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：８７に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１０１に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：８８に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１０２に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：８９に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１０３に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：９０に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１０４に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：９１に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１０５に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：９２に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１０６に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：９３に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１０７に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：９４に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１０８に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：９５に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１０９に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：９６に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１１０に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：９７に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１１１に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号：９８に記載されている可変重鎖配列および配列番号：１１２に記載されている可変軽鎖配列を有する抗体により認識されるエピトープに結合する抗体を提供する。
さらに詳細なエピトープマッピング試験にしたがって、本発明の好ましい抗体結合領域がより明白に定義されている。
したがって、本発明は、配列番号：１８１のアミノ酸７８−８３（ＷＬＤＤＦＮ−配列番号：１８８）を含むエピトープに結合する抗体を提供する。
本発明は、また、配列番号：１８１のアミノ酸７６−８４（ＧＣＷＬＤＤＦＮＣ−配列番号：１８６）を含むエピトープに結合する抗体を提供する。
本発明は、また、配列番号：１８１のアミノ酸７５−８５（ＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹ−配列番号：１９０）を含むエピトープに結合する抗体を提供する。
本発明は、また、配列番号：１８１のアミノ酸５２−５６（ＥＱＤＫＲ−配列番号：１８９）を含むエピトープに結合する抗体を提供する。
本発明は、また、配列番号：１８１のアミノ酸４９−６３（ＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷ−配列番号：１８７）を含むエピトープに結合する抗体を提供する。
本発明は、また、これらの配列からなるエピトープまたはこれらのエピトープ領域の組合せを含むエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、また、配列番号：１８１のアミノ酸７８−８３（ＷＬＤＤＦＮ）および配列番号：１８１のアミノ酸５２−５６（ＥＱＤＫＲ）を含むか、またはからなるエピトープに結合する抗体を提供する。
操作および修飾された抗体
本発明の抗体は、さらに、出発抗体からの改変された特性を有し得る修飾された抗体を操作する出発物質として、本明細書に示されている１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を使用して製造することができる。抗体は、１つまたは両方の可変領域（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）内で、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域内および／または１つ以上のフレームワーク領域内で、１つ以上の残基を修飾することにより操作することができる。さらに、またはあるいは、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を改変するように、定常領域内で残基を修飾することにより操作することができる。
実施することができる可変領域操作の１つの型はＣＤＲグラフティングである。抗体は、６つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して主に標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間で異なっている。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上にグラフトされた特定の天然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033；Winterの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにQueen et al.の米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号、参照）。
したがって、本発明の別の態様は、それぞれ、配列番号：１−１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号：１５−２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；配列番号：２９−４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；ならびに、それぞれ、配列番号：４３−５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号：５７−７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；および配列番号：７１−８４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、またはそれらの抗原結合部分を含む機能性タンパク質に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体と異なるフレームワーク配列を含み得る。
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体の遺伝子配列を含む公共ＤＮＡデータベースまたは公開された文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子に対する生殖細胞系のＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系の配列データベース（インターネットにおいてwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能）、ならびにKabat, E. A., et al., [上記]; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836において見出すことができる。
本発明の抗体における使用のためのフレームワーク配列の例は、選択された本発明の抗体により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に同様であるものである。ＶＨのＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬのＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一の配列を有するフレームワーク領域上にグラフトでき、または、ＣＤＲ配列は、生殖細胞系配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域上にグラフトできる。例えば、特定の例において、抗体の抗原結合能を維持または増強するためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見出されている（例えば、Queen et alの米国特許５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０、参照）。
可変領域修飾の別の型は、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それにより興味ある抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善させることであり、これは「親和性成熟」として知られる。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発は、変異、抗体結合における効果または興味ある他の機能特性を導入するために実施でき、本明細書に記載されている、および実施例に提供されているインビトロまたはインビボでのアッセイにおいて評価することができる。保存的修飾（上記のとおりの）を導入することができる。該変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であり得る。さらに、一般的にＣＤＲ領域内のわずか１、２、３、４または５個の残基が変異される。
したがって、別の態様において、本発明は、配列番号：１−１４を有する群から選択されるアミノ酸配列を有するからなるＶＨのＣＤＲ１領域、もしくは配列番号：１−１４と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、付加または欠失を有するアミノ酸配列；配列番号：１５−２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ２領域、もしくは配列番号：１５−２８と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、付加または欠失を有するアミノ酸配列；配列番号：２９−４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ３領域、もしくは配列番号：２９−４２と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、付加または欠失を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からなる；配列番号：４３−５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１領域、もしくは配列番号：４３−５６と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、付加または欠失を有するアミノ酸配列；配列番号：５２−７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ２領域、もしくは配列番号：５２−７０と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、付加または欠失を有するアミノ酸配列；ならびに配列番号：７１−８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ３領域、もしくは配列番号：７１−８４と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、付加または欠失を有するアミノ酸配列を有する単離された抗ＡｃｔＲＩＩＢモノクローナル抗体、またはそれらの抗原結合部分を含む機能性タンパク質を提供する。
代替のフレームワークまたはスカフォールド(scaffold)への抗原結合ドメインのグラフティング
多種多様の抗体／免疫グロブリンのフレームワークまたはスカフォールドは、得られたポリペプチドがＡｃｔＲＩＩＢに特異的に結合する少なくとも１つの結合領域を含む限り、使用することができる。このようなフレームワークまたはスカフォールドは、ヒト免疫グロブリンの５つの主要なイディオタイプ、またはそれらのフラグメント（例えば、本明細書の他で開示されているもの）を含み、他の動物種の免疫グロブリン、好ましくはヒト化の局面を有するものを含む。単一の重鎖抗体、例えば、ラクダにおいて同定されたものは、この点で特に重要である。新規フレームワーク、スカフォールドおよびフラグメントは、当業者により発見および開発され続けている。
１つの局面において、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトすることができる非免疫グロブリンのスカフォールドを使用して非免疫グロブリンベースの抗体を作製することに関する。既知または未知の非免疫グロブリンのフレームワークおよびスカフォールドは、配列番号：１８１の標的タンパク質に特異的な結合領域（好ましくは、配列番号：１８２に示されているそれらのリガンド結合ドメイン）を含む限り、使用され得る。このような化合物は、「標的特異的な結合領域を含むポリペプチド」として本明細書において知られる。非免疫グロブリンのフレームワークの例は、以下のセクション（ラクダ抗体および非抗体スカフォールド）でさらに記載されている。
ラクダ抗体
新世界(New World)メンバー、例えば、ラマ種（Lama paccos、Lama glamaおよびLama vicugna)を含むラクダおよびヒトコブラクダ科（Camelus bactrianusおよびCamelus dromaderius）のメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性およびヒト対象に対する抗原性に対して特徴付けられている。この科の哺乳動物において自然に見られる特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠き、したがって他の動物の抗体において典型的な２つの重鎖および２つの軽鎖を有する４鎖の四次構造とは構造的に異なる（ＷＯ９４／０４６７８参照）。
ＶＨＨとして同定された小さい１本の可変ドメインであるラクダ抗体の領域は、標的に対して高い親和性を有する小さいタンパク質を得るための遺伝子工学により得ることができ、「ラクダナノボディ」として既知の低分子量抗体由来タンパク質が得られる（ＵＳ５，７５９，８０８；Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62;およびLauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520参照）。ラクダ抗体および抗体フラグメントの操作されたライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト起源の他の抗体に関して、ラクダ抗体のアミノ酸配列はヒト配列をより密接に似ている配列を得るために組換え的に改変させることができる、すなわち、ナノボディはヒト化することができる。したがって、ヒトに対するラクダ抗体の本来の低い抗原性をさらに低減することができる。
ラクダナノボディは、ヒトＩｇＧ分子の分子量の約１／１０を有し、該タンパク質はわずか数ナノメーターの物理的直径を有する。小さいサイズの１つの結果は、より大きい抗体タンパク質によっては機能的に見えない抗原部位に結合するラクダナノボディの能力であり、すなわち、ラクダナノボディは従来の免疫技術を使用して他の方法では隠れている抗原を検出する試薬、および可能性としては治療剤として有用である。したがって、小さいサイズのさらなる結果は、ラクダナノボディが標的タンパク質の溝または狭い割れ目の特定の部位に結合する結果として阻害することができ、したがって従来の抗体よりも従来の低分子量薬物の機能とより密接に似ている能力で働き得ることである。
さらに、低分子量および緻密化サイズの結果、ラクダナノボディが極めて熱安定性であり、極端なｐＨおよびタンパク質分解消化に対して安定であり、抗原性が低い。さらなる結果は、ラクダナノボディが循環系から組織へ、血液脳関門を介する場合でも容易に移動し、神経組織に影響する障害を処置することができることである。さらにナノボディは、血液脳関門を介する薬物輸送を促進することができる（ＵＳ２００４／０１６１７３８参照）。これらの特徴は、ヒトにおける低い抗原性と結合して、大きな治療的可能性を示す。さらに、これらの分子は、原核細胞、例えば、大腸菌において完全に発現することができ、バクテリオファージで融合タンパク質として発現し、機能性である。
したがって、本発明の特徴は、ＡｃｔＲＩＩＢに対して高い親和性を有するラクダ抗体またはナノボディである。本明細書における１つの態様において、ラクダ抗体またはナノボディは、ラクダ動物で自然に生産され、すなわちＡｃｔＲＩＩＢまたはそのペプチドフラグメントで免疫化した後、他の抗体に関して本明細書に記載されている技術を使用してラクダにより生産される。あるいは、抗ＡｃｔＲＩＩＢラクダナノボディは、例えば、適当に変異させたラクダナノボディタンパク質を提示するファージのライブラリーから標的として本明細書の実施例に記載されているＡｃｔＲＩＩＢを使用したパンニング法を使用してにより操作、すなわち生産される。さらに、操作されたナノボディを、レシピエント対象において４５分から２週間の半減期を有するように遺伝子操作によりカスタマイズすることができる。特定の態様において、ラクダ抗体またはナノボディは、例えば、ＷＯ９４／０４６７８に記載されているナノボディまたは単一のドメイン抗体フレームワーク配列に、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列をグラフティングすることにより得られる。
非抗体スカフォールド
既知の非免疫グロブリンのフレームワークまたはスカフォールドは、アドネクチン（フィブロネクチン）（Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA）、アンキリン（Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland）、ドメイン抗体（Domantis, Ltd (Cambridge, MA) and Ablynx nv (Zwijnaarde, Belgium)）、リポカリン（アンティカリン）（Pieris Proteolab AG, Freising, Germany）、小分子免疫医薬（Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA）、マキシボディ（Avidia, Inc. (Mountain View, CA)）、プロテインＡ（Affibody AG, Sweden）およびアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（Scil Proteins GmbH, Halle, Germany）、タンパク質エピトープ模擬物（Polyphor Ltd, Allschwil, Switzerland）を含むが、これらに限定されない。
（ｉ）フィブロネクチンスカフォールド
フィブロネクチンスカフォールドは、好ましくはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型の１０番目のモジュール（１０ Ｆｎ３ドメイン））に基づく。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、互いにパックしてタンパク質のコアを形成する２つのベータシート間に分布している７または８個のベータストランドを有し、さらにベータストランドに互いに接続し、溶媒に暴露されるループ（ＣＤＲに類似する）を含む。ベータストランドの方向と垂直なタンパク質の境界である、ベータシートサンドイッチのそれぞれのエッジで少なくとも３つのこのようなループが存在する（ＵＳ６，８１８，４１８）。
これらのフィブロネクチン−ベースのスカフォールドは免疫グロブリンではないが、全体の折りたたみは、ラクダおよびラマＩｇＧにおける全体の抗原認識単位を含む重鎖の可変領域である最も小さい機能性抗体フラグメントのものと密接に関連している。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は、性質および親和性において抗体のものと類似している抗原結合特性を模倣する。これらのスカフォールドは、ループのランダム化およびインビボでの抗体の親和性成熟のプロセスと同様であるインビトロでのシャッフリング戦略において使用することができる。これらのフィブロネクチン−ベースの分子は、分子のループ領域を標準クローニング技術を使用して本発明のＣＤＲと置き換えることができるスカフォールドとして使用することができる。
（ｉｉ）アンキリン−Molecular Partners
技術は、異なる標的への結合に対して使用することができる可変領域を支えるためのスカフォールドとして、アンキリン由来反復モジュールを有するタンパク質を使用することに基づく。アンキリン反復モジュールは、２つの抗平行α−ヘリックスおよびβ−ターンからなる３３個のアミノ酸ポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用することによりほぼ最適化される。
（ｉｉｉ）マキシボディ／アビマー(Avimer)−Ａｖｉｄｉａ
アビマーは、タンパク質、例えば、ＬＲＰ−１を含む天然Ａ−ドメイン由来である。これらのドメインは、もともとタンパク質−タンパク質相互作用に使用され、ヒトにおいて、２５０を越えるタンパク質が構造的にＡ−ドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結される多くの異なる「Ａ−ドメイン」モノマー（２−１０）からなる。アビマーは、例えば、ＵＳ２００４／０１７５７５６；ＵＳ２００５／００５３９７３；ＵＳ２００５／００４８５１２；およびＵＳ２００６／０００８８４４．に記載されている方法論を使用して、標的抗原に結合することができるように作製することができる。
（ｖｉ）プロテインＡ−Ａｆｆｉｂｏｄｙ
Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）アフィニティーリガンドは、プロテインＡのＩｇＧ−結合ドメインの１つのスカフォールドに基づく３つのヘリックスバンドを含む小さく単純なタンパク質である。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌の表面タンパク質である。このスカフォールドドメインは５８個のアミノ酸からなり、そのうちの１３個は、多くのリガンド変異体を有するＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）ライブラリーを生産するようにランダム化される（例えば、ＵＳ５，８３１，０１２参照）。Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子は抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して６ｋＤａの分子量を有する。サイズが小さいにもかかわらず、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子の結合部位は、抗体のものと同様である。
（ｖ）Ａｎｔｉｃａｌｉｎ−Ｐｉｅｒｉｓ
Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）は、Ｐｉｅｒｉｓ ＰｒｏｔｅｏＬａｂ ＡＧにより開発された製品である。それらは、通常、生理学的輸送または化学的感受性もしくは不溶性化合物の保存に関与する小さく強力なタンパク質の広範なグループであるリポカリンに由来する。いくつかの天然のリポカリンは、ヒト組織または体液に存在する。
該タンパク質構造は、堅いフレームワークの上に超可変ループを有しており、免疫グロブリンに似ている。しかしながら、抗体またはそれらの組換えフラグメントと対照的に、リポカリンは、１６０から１８０個のアミノ酸残基を有する単一のポリペプチド鎖を含み、単一の免疫グロブリンドメインよりもほんのわずかに大きい。
結合ポケットを構成する４つのループのセットは、顕著な構造可塑性を示し、種々の側鎖を許容する。したがって、結合部位は、高親和性および特異性で異なる形状の所定の標的分子を認識するために、独自のプロセスにおいて再形成することができる。
リポカリンファミリーの１つのタンパク質であるＰｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅのビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）は、４つのループのセットを変異させることによりａｎｔｉｃａｌｉｎの開発に使用されている。「ａｎｔｉｃａｌｉｎ」を記載している特許出願の例は、ＷＯ１９９９／１６８７３である。
（ｖｉ）アフィリン−Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
アフィリンＴＭ分子は、タンパク質および小分子に対する特異的親和性のために設計される小さい非免疫グロブリンタンパク質である。新規アフィリンＴＭ分子は、それぞれ異なるヒト由来スカフォールドタンパク質に基づく２つのライブラリーから非常に迅速に選択することができる。
アフィリンＴＭ分子は、免疫グロブリンタンパク質と構造相同性を示さない。Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓは、一方がヒト眼球レンズの構造タンパク質であるガンマ−クリスタリンであり他方が「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である２つのアフィリンＴＭスカフォールドを使用する。ヒトスカフォールドの両方が非常に小さく、高い温度安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤にほとんど抵抗性である。この高い安定性は、主にタンパク質の拡張されたベータシートによる。ガンマ−クリスタリン由来タンパク質の例は、ＷＯ２００１／００４１４４に記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、ＷＯ２００４／１０６３６８に記載されている。
（ｖｉｉ）タンパク質エピトープ模擬物（ＰＥＭ）
ＰＥＭは、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する中サイズの環状ペプチド様分子（ＭＷ １−２ｋＤａ）であり、主要な二次構造は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する。
フレームワークまたはＦｃ操作
本発明の操作された抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するように、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に作られているものを含む。一般的に、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるように作られる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰変異」することである。さらに具体的には、体細胞変異を行った抗体は、抗体が由来する生殖細胞系配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体が由来する生殖細胞系配列と抗体のフレームワーク配列を比較することにより同定することができる。フレームワーク領域の配列をこれらの生殖細胞系構成に戻すために、体細胞変異は、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発により、生殖細胞系配列に「復帰変異」することができる。このような「復帰変異」抗体もまた、本発明により包含されると意図される。
別のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内または１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を変異し、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を減少させることを含む。このアプローチは、また「脱免疫化」と呼ばれ、ＵＳ２００３／０１５３０４３により詳細に記載されている。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で作られた修飾に加えて、またはその代わりに、本発明の抗体は、一般的に１つ以上の抗体の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞毒性を改変するように、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作され得る。さらに、本発明の抗体は、再び抗体の１つ以上の機能特性を改変するように、化学的に修飾され得る（例えば、１つ以上の化学部分を抗体に結合することができる）、またはそのグリコシル化を改変して修飾され得る。これらの態様のそれぞれは、以下でさらに詳細に記載されている。Ｆｃ領域の残基の番号は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
１つの態様において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が改変される、例えば増加または減少させるように修飾される。このアプローチは、ＵＳ５，６７７，４２５にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖と重鎖の集合を容易にするか、または抗体の安定性を増加または減少させるように改変される。
別の態様において、抗体のＦｃヒンジ領域を、抗体の生物学的半減期を減少させるように変異する。さらに具体的には、抗体が、天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を損なうように、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン接合領域に１つ以上のアミノ酸変異を導入する。このアプローチは、ＵＳ６，１６５，７４５にさらに詳細に記載されている。
別の態様において、抗体は、生物学的半減期を増加させるように修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、ＵＳ６，２７７，３７５に記載されているとおり１つ以上の以下の変異を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるように、抗体は、ＵＳ５，８６９，０４６およびＵＳ６，１２１，０２２に記載されているＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ(salvage)受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で改変することができる。
さらに他の態様において、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を改変するように少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することにより改変される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を維持するように、異なるアミノ酸残基と置換することができる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、両方ともＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌによるＵＳ５，６２４，８２１およびＵＳ５，６４８，２６０にさらに詳細に記載されている。特に、残基２３４および２３５を変異し得る。特に、これらの変異はアラニンへであり得る。したがって、１つの態様において、本発明の抗体は、アミノ酸２３４および２３５の１つまたは両方でＦｃ領域における変異を有する。別の態様において、アミノ酸２３４および２３５の１つまたは両方がアラニンに置換され得る。アミノ酸２３４および２３５の両方のアラニンへの置換は、ＡＤＣＣ活性の減少をもたらす。
別の態様において、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸は、抗体が改変されたＣ１ｑ結合および／または減少もしくは破壊された補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基と置換することができる。このアプローチは、ＵＳ６，１９４，５５１にさらに詳細に記載されている。
別の態様において、１つ以上のアミノ酸残基を改変し、補体を固定する抗体の能力を改変する。このアプローチは、ＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。
さらに別の態様において、Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を介在する抗体の能力を増加させる、および／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させるように、１つ以上のアミノ酸を修飾することにより修飾される。このアプローチは、ＷＯ００／４２０７２にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位はマッピングされ、改善された結合を有する変異体が記載されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604参照）。
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、該抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように修飾することができる。このような糖質修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を改変することにより、達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それによりその部位におけるグリコシル化を除去するように、１つ以上のアミノ酸置換を作ることができる。このような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。このようなアプローチは、Ｃｏ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，７１４，３５０および６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。
さらに、またはあるいは、グリコシル化の改変された型を有する抗体、例えば、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体、または増加したバイセクティング(bisecting)ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を作ることができる。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが証明されている。このような糖質修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現することにより成し遂げることができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当該分野で報告されており、本発明の組換え抗体を発現し、改変されたグリコシル化を有する抗体を生産する宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．によるＥＰ１，１７６，１９５は、細胞系において発現される抗体が低フコシル化を示すように、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子（フコシルトランスフェラーゼをコードする）を有する細胞株について記載している。したがって、１つの態様において、本発明の抗体は、低フコシル化パターンを示す細胞系、例えば、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の発現欠損の哺乳動物細胞系における組換え発現により生産される。ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースをＡｓｎ（２９７）−連結糖質に接合する能力が低下し、宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化も引き起こす変異体ＣＨＯ細胞系であるＬｅｃｌ３細胞を記載している（Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）。ＷＯ９９／５４３４２は、操作された細胞系において発現された抗体が増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を示し、抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらすように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系を記載している（Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照）。あるいは、本発明の抗体は、哺乳動物様グリコシル化パターンについて改変され、グリコシル化パターンとしてフコースを欠く抗体を生産することができる酵母または糸状菌において生産することができる（例えば、ＥＰ１２９７１７２Ｂ１参照）。
本発明によって意図されている本抗体の別の修飾はペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるようにペグ化することができる。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントを、一般的に、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントに結合する条件下で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、反応性エステルまたはＰＥＧのアルデヒド誘導体と反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とアシル化反応またはアルキル化反応することにより実施することができる。本明細書において使用される、「ポリエチレングリコール」なる用語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧのあらゆる形態、例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを包含することを意図する。１つの態様において、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当該分野で知られており、本発明の抗体に適用することができる（例えば、ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４参照）。
本発明に意図される抗体の別の修飾は、得られる分子の半減期を増加させるような、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域と血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントとの抱合体またはタンパク質融合である（例えば、ＥＰ０３２２０９４参照）。
別の可能性は、得られる分子の半減期を増加させるような、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域と血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンに結合することができるタンパク質との融合である（例えば、ＥＰ０４８６５２５参照）。
改変された抗体を操作する方法
上記のとおり、本明細書に示されるＶＨおよびＶＬ配列または全長重鎖および軽鎖配列を有する抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を、全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／またはＶＬ配列、またはこれらに結合する定常領域を修飾することにより、新規抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を創造するために使用することができる。したがって、本発明の別の局面において、本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の構造的特徴は、本発明の抗体の少なくとも１つの機能特性、例えば、ヒトＡｃｔＲＩＩＢへの結合を維持するが、ＡｃｔＲＩＩＢの１つ以上の機能特性（例えば、Ｓｍａｄ活性化の阻害）を阻害する構造的に関連する抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を創造するために使用される。
例えば、本発明の抗体の１つ以上のＣＤＲ領域またはそれらの変異体は、上記のとおりに、既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換え的に組み合わせられ、さらなる組換え的に操作された本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を創造することができる。修飾の他の型は、以前のセクションにおいて記載されているものを含む。操作する方法のための出発物質は、本明細書において提供される１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列または１つ以上のそれらのＣＤＲ領域である。操作された抗体を創造するために、本明細書において提供される１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列または１つ以上のそれらのＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現する）必要はない。むしろ、配列に含まれる情報が、元の配列由来の「第二世代」配列を創造するために出発物質として使用され、次に「第二世代」配列がタンパク質として調製され発現される。
したがって、別の態様において、本発明は、配列番号：１−１４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号：１５−２８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号：２９−４２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域抗体配列；ならびに配列番号：４３−５６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号：５７−７０からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号：７１−８４からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列からなる抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を調製し；少なくとも１個の改変された抗体配列を創造するように、重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変し；タンパク質として改変された抗体配列を発現するための方法を提供する。
したがって、別の態様において、本発明は、配列番号：１４６−１５０および１５６−１６０の群から選択される配列を有する全長重鎖抗体配列；ならびに配列番号：１４１−１４５および１５１−１５５の群から選択される配列を有する全長軽鎖抗体配列からなる哺乳動物細胞における発現に最適化された抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を調製し；少なくとも１つの改変された抗体配列を創造するように、全長重鎖抗体配列および／または全長軽鎖抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変し；タンパク質として改変された抗体配列を発現するための方法を提供する。
改変された抗体配列は、また、配列番号：２９−４２および配列番号：７１−８４からなる群から選択される固定されたＣＤＲ３配列またはＵＳ２００５／０２５５５５２に記載されている最小必須結合決定基ならびにＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列における多様性を有する抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより調製することができる。スクリーニングは、抗体ライブラリーから抗体をスクリーニングするために適当な任意のスクリーニング技術、例えば、ファージディスプレイ技術にしたがって実施することができる。
標準分子生物学技術は、改変された抗体配列を調製および発現するために使用することができる。改変された抗体配列によってコードされる抗体は、本明細書に記載されている抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の機能特性の１つ、いくつかまたは全てを維持しているものであり、ここで、該機能特性は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢに特異的な結合およびＳｍａｄ活性化の阻害を含むが、これらに限定されない。
改変された抗体は、１つ以上、２つ以上または３つ以上の上記機能特性を示し得る。
改変された抗体の機能特性は、当該分野で利用できる、および／または本明細書に記載されている標準アッセイ、例えば、実施例に記載されているもの（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して評価することができる。
本発明の抗体を操作する方法の１つの態様において、変異は、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体コード配列の全てまたは一部にランダム的または選択的に導入することができ、得られる修飾された抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、本明細書に記載されている結合活性および／または他の機能特性についてスクリーニングすることができる。変異方法は、当該分野で公開されている。例えば、ＷＯ０２／０９２７８０は、飽和変異誘発、合成ライゲーションアセンブリまたはそれらの組合せを使用して抗体変異を創造およびスクリーニングするための方法を記載している。あるいは、ＷＯ０３／０７４６７９は、抗体の物理化学的特性を最適化するためのコンピューター使用のスクリーニング方法を使用する方法を記載している。
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の別の局面は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。哺乳動物細胞における発現のために最適化された全長軽鎖ヌクレオチド配列の例は、配列番号：１６１−１６５および１７１−１７５に示されている。哺乳動物細胞における発現のために最適化された全長重鎖ヌクレオチド配列の例は、配列番号：１６６−１７０および１７６−１８０に示されている。
核酸は、細胞溶解物において細胞全体に存在してもよく、または部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ結合、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該分野でよく知られているその他のものを含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から精製されたとき、「単離された」または「実質的に純粋にされた」である。F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York、参照。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでいても含まなくてもよい。１つの態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。核酸は、ベクター、例えば、ファージディスプレイベクターまたは組換えプラスミドベクター中に存在していてもよい。本発明は、また、ｐＢＷ５２２およびｐＢＷ５２４（それぞれ寄託番号ＤＳＭ２２８７３およびＤＳＭ２２８７４の下に、２００９年８月１８日付け、DSMZ, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された）として称されるベクターを提供する。
本発明の核酸は、標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載しているとおりのヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスから製造されたハイブリドーマ）により発現された抗体に関して、ハイブリドーマにより製造された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）得られた抗体に関して、抗体をコードする核酸は、ライブラリーのメンバーである種々のファージクローンから回収することができる。
１つ以上の欠失、付加または置換を含む変異体核酸配列も、本発明の範囲内である。１つの態様において、本発明は、保存的ヌクレオチド置換を含む１つ以上の配列番号：１１３−１４０または１６１−１８０を含む。遺伝子コードの縮重によって、アミノ酸は、１個以上のコドンによってコードされ得る。したがって、ヌクレオチド配列を修正して、翻訳されたアミノ酸配列は同じである可能性がある。
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたとき、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡフラグメントは、別のタンパク質、例えば、抗体定常領域もしくはフレキシブルリンカーをコードする別のＤＮＡ分子またはフラグメントに作動可能に連結されている。この文脈において使用されるとき「作動可能に連結」なる用語は、２つのＤＮＡフラグメントが、例えば、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に残るように、またはタンパク質が所望のプロモーターのコントロール下で発現されるように、機能する方法で連結されることを意味することを意図する。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該分野で知られており（例えば、Kabat, E. A., et al.［上記］、参照）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得る。いくつかの態様において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ中から選択される。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子に関して、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該分野で知られており（例えば、Kabat, E. A., et al.［上記］、参照）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得る。
ｓｃＦｖ遺伝子を創造するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、フレキシブルリンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有するＶＨおよびＶＬ配列が連続する一本鎖タンパク質として発現することができるように、フレキシブルリンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードするフレキシブルリンカーをコードする別のフラグメントに作動可能に連結される（例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554、参照）。
本発明の核酸は、遺伝子送達において使用され得る。すなわち、本発明のポリペプチド（抗体または機能性タンパク質）をコードする核酸は、患者における翻訳のために患者に直接、送達され得る。
該核酸は、一般的に、患者への投与のために「パッケージング」される。遺伝子送達ビヒクルは、非ウイルス、例えば、リポソーム、または複製欠損ウイルス、例えば、Berkner, K.L., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992)により記載されているアデノウイルスまたはMuzyczka, N., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992)および米国特許第５，２５２，４７９号により記載されているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。あるいは、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスが使用され得る。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、複製欠損レトロウイルスベクターにおける発現のために操作され得る。次に、この発現構築物は、単離され、パッケージング細胞が興味ある遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生産するように、ポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターを形質導入されたパッケージング細胞に導入され得る。これらの生産細胞は、インビボでの細胞の操作およびインビボでのポリペプチドの発現のために対象に投与され得る（Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (およびそこで引用されている文献) in Human Molecular Genetics (1996), T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd、参照）。
別のアプローチは、治療用遺伝子が血流または筋肉組織に直接、注射される「裸のＤＮＡ」の投与である。
本発明のモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、慣用のモノクローナル抗体方法論を含む種々の技術、例えば、Kohler and Milstein (1975 Nature 256: 495)の標準体細胞ハイブリダイゼーション技術により生産することができる。モノクローナル抗体を生産するための多数の技術は、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換を使用することができる。
ハイブリドーマを作製するための動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生産は、よく確立された方法である。免疫化プロトコールおよび免役された融合用脾細胞の単離のための技術は当該分野で知られている。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合方法もまた知られている。
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように作製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて作製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、標準分子生物学技術を使用して、興味あるマウスハイブリドーマから得ることができ、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を創造するために、マウス可変領域は、当該分野で知られている方法を使用して、ヒト定常領域に連結することができる（例えば、ＵＳ４，８１６，５６７参照）。ヒト化抗体を創造するために、マウスＣＤＲ領域は、当該分野で知られている方法を使用して、ヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、米国特許第５２２５５３９；５５３０１０１；５５８５０８９；５６９３７６２および６１８０３７０号、参照）。
特定の態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＡｃｔＲＩＩＢに対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろヒト免疫系部分を有する遺伝子導入されたまたは染色体導入されたマウスを使用して製造することができる。これらの遺伝子導入されたまたは染色体導入されたマウスは、本明細書において各々ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称される、および本明細書において「ヒトＩｇマウス」と総称されるマウスを含む。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Medarex, Inc.）は、内因性μおよびκ鎖座を不活性化する標的変異とともに、非再配置ヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を含む（例えば、Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859参照）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現低下を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラス切り換えと体細胞変異を受け、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを作製する（Lonberg, N. et al., 1994 [上記]; reviewed in Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93、およびHarding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭＡｂマウスの作製および使用ならびにこのようなマウスにより実施されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591;およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載されている（これらの全ての内容を具体的な出典明示によりその全体を包含させる）。米国特許第５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，７８９，６５０；５，８７７，３９７；５，６６１，０１６；５，８１４，３１８；５，８７４，２９９；５，７７０，４２９；および５，５４５，８０７号；ならびにＷＯ９２／１０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４；ＷＯ９９／４５９６２；およびＷＯ０１／１４４２４も参照。
別の態様において、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有するマウスを使用して製造することができる。「ＫＭマウス」として本明細書で称されるこのようなマウスは、ＷＯ０２／４３４７８において詳細に記載されている。
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別の遺伝子導入動物系は、当該分野で利用可能であり、本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を製造するために使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Abgenix, Inc.）と称される別の遺伝子導入系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、米国特許第５，９３９，５９８；６，０７５，１８１；６，１１４，５９８；６、１５０，５８４および６，１６２，９６３号に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別の染色体を導入した動物系が、当該分野で利用可能であり、本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を製造するために使用することができる。例えば、「ＴＣマウス」と称されるヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を含むマウスを使用することができる；このようなマウスは、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を有するウシは、当該分野で報告されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894）、本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を製造するために使用することができる。
本発明のヒト組換え抗体は、また、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ方法を使用して作製することができる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ方法は、当該分野で確立されているか、または以下の実施例に記載されている。例えば、米国特許第５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５８０，７１７；５，９６９，１０８；６，１７２，１９７；５，８８５，７９３；６，５２１，４０４；６，５４４，７３１；６，５５５，３１３；６，５８２，９１５および６，５９３，０８１号、参照。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、また、ヒト抗体応答が免疫化で産生することができるようにヒト免疫細胞を再構成されたＳＣＩＤマウスを使用して作製することができる。このようなマウスは、例えば、米国特許第５，４７６，９９６および５，６９８，７６７号に記載されている。
ヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの作製
本発明のヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製するため、免疫化マウスからの脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、適当な不死化細胞系、例えば、マウス骨髄腫細胞系に融合することができる。得られたハイブリドーマを抗原−特異的抗体の生産に関してスクリーニングすることができる。例えば、免疫化マウスからの脾臓リンパ細胞の単細胞懸濁液を、１／６の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８０）に５０％のＰＥＧで融合させることができる。細胞を平底マイクロタイタープレート中で約２×１４５で置き、次に、２０％の胎児クローン血清、１８％の「６５３」馴化培地、５％のｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０：０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴを融合２４時間後に加える）を含む選択培地中で２週間インキュベートする。約２週後、細胞をＨＡＴがＨＴと置き換えられている培地中で培養することができる。次に、個々のウェルをヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体に対してＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることができる。広範なハイブリドーマ増殖が起こると、通常、培地を１０−１４日後に観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングし、まだヒトＩｇＧ陽性のとき、モノクローナル抗体を制限希釈により少なくとも２回サブクローニングすることができる。次に、安定なサブクローンをインビトロで培養し、特性化のために組織培養培地中で少量の抗体を作製する。
ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマをモノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を濾過し、濃縮し、タンパク質Ａ−セファロース（Pharmacia）でアフィニティクロマトグラフィーに付すことができる。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによりチェックし、純度を確認することができる。バッファー溶液をＰＢＳに交換し、濃度を１．４３の吸光係数を使用してＯＤ２８０により測定することができる。モノクローナル抗体をアリコートし、−８０℃で保存することができる。
モノクローナル抗体を生産するトランスフェクトーマの作製
本発明の抗体は、また、例えば、当該分野でよく知られている組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマ中で生産することができる（例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202）。
例えば、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるため、部分的または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または興味ある抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング）により得ることができ、ＤＮＡを、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、発現ベクターに挿入することができる。これに関して、「作動可能に連結」なる用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図された機能を果たすように、ベクターにライゲートされることを意味することを意図する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入するか、または、さらに一般的に、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入することができる。抗体遺伝子は、標準方法（例えば、抗体遺伝子フラグメント上の相補性制限部位およびベクターのライゲーション、または制限酵素認識部位が存在しないとき、平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。本明細書に記載されている抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、そしてＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクターに挿入することにより、いずれかの抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を創造するために使用することができる。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドがインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現をコントロールする調節配列を有する。「調節配列」なる用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳をコントロールするプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990）に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターのデザインが、形質転換された宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者に理解されよう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびパピローマに由来する、哺乳動物細胞における高レベルタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはＰ−グロビンプロモーターのような非ウイルス調節配列が使用され得る。なおさらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーターおよびヒト１型Ｔ細胞白血病ウイルスの長い末端反復配列からの配列を含む、異なる源からの配列、例えば、ＳＲａプロモーター系を含む（Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子を有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５および５，１７９，０１７参照）。例えば、一般的に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上で薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８を選択するため）を含む。
軽鎖および重鎖の発現のため、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」なる用語の種々の形態は、外来ＤＮＡの原核生物または真核生物宿主細胞への導入のために一般的に使用されている多種多様の技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを含むことを意図する。原核生物または真核生物宿主細胞のいずれにおいても本発明の抗体を発現させることは理論上可能である。このような真核細胞、特に哺乳動物細胞が、原核細胞よりも適当に折りたたまれた免疫学的に活性な抗体をアッセンブルおよび分泌しやすいため、真核細胞、特に哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が議論される。抗体遺伝子の原核生物発現は、高収率の活性抗体の生産には無効であることが報告されている（Boss, M. A. and Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13）。
本発明の組換え抗体を発現させるための哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621に記載されているＤＨ ＦＲ選択マーカーと使用されるUrlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。１つの態様において、宿主細胞はＣＨＯ Ｋ１ＰＤ細胞である。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞の使用に関して、別の発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１において示されているＧＳ遺伝子発現系である。１つの態様において、本発明の組換え抗体を発現させるための哺乳動物宿主細胞は、例えば、ＵＳ６，９４６，２９２Ｂ２に記載されている、ＦＵＴ８遺伝子発現を欠いている哺乳動物細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入するとき、宿主細胞中で抗体の発現または宿主細胞を増殖させる培養培地への抗体の分泌を可能にする十分な期間、宿主細胞を培養することにより抗体を生産する。抗体は、標準タンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。
免疫抱合体
別の局面において、本発明は、治療的部分、例えば、細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素に抱合された抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体またはそのフラグメント、接合を取りあげる。このような抱合体は、本明細書において「免疫抱合体」と称する。１つ以上の細胞毒素を含む免疫抱合体は、「免疫毒素」と称する。細胞毒素または細胞毒性剤は、細胞に有害である（例えば、殺す）あらゆる薬剤を含む。
細胞毒素は、当該分野で利用できるリンカー技術を使用して、本発明の抗体に抱合させることができる。細胞毒素を抗体に抱合させるために使用されているリンカーの型の例、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーを含むが、これらに限定されない。例えば、リソソーム区画内の低いｐＨによる開裂に影響しやすい、またはプロテアーゼ、例えば、腫瘍組織において優先的に発現されるプロテアーゼ、例えば、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）による開裂に影響しやすいリンカーを選択することができる。
抗体へ治療剤を抱合させるための細胞毒素、リンカーおよび方法の型のさらなる議論について、Saito, G. et al., 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al., 2003 Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. 2003 Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M., 2002 Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264も参照。
本発明の抗体は、また、放射性免疫抱合体としても称される細胞毒性放射性医薬品を産生するために放射性同位体に抱合することができる。診断的または治療的に使用するために抗体に抱合させることができる放射性同位体の例は、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７を含むが、これらに限定されない。放射性免疫抱合体を製造する方法は、当該分野で確立されている。放射性免疫抱合体の例は、ＺｅｖａｌｉｎＴＭ（DEC Pharmaceuticals）およびＢｅｘｘａｒＴＭ（Corixa Pharmaceuticals）を含め市販されており、同様の方法は、本発明の抗体を使用して、放射性免疫抱合体を製造するために使用することができる。
本発明の抗体抱合体は、所定の生物学的応答を修飾するために使用することができ、薬物部分は、古典的な化学治療剤に限定解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質は、例えば、酵素活性毒素またはその活性フラグメント、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素またはジフテリア毒素；タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子またはインターフェロン−γ；または、生物学的応答修飾因子、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）または他の増殖因子を含み得る。
抗体にこのような治療部分を抱合する技術は、よく知られている、例えば、Amon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Therapy And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Inmunol. Rev., 62:119-58 (1982)、参照。
二重特異性分子
別の局面において、本発明は、本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体またはそのフラグメントを含む二重特異性または多重特異性分子を特徴とする。本発明の抗体またはその抗原結合領域は、誘導体化されるか、または別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に連結し、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を作製することができる。実際に、本発明の抗体は、誘導体化されるか、または１つ以上の他の機能性分子に連結し、２つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を作製することができる；このような多重特異性分子は、また、本明細書において使用される「二重特異性分子」なる用語により包含されることを意図する。本発明の二重特異性分子を創造するために、本発明の抗体は、二重特異性分子となるように、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合またはその他のものにより）１つ以上の他の結合分子、例えば、別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣物に機能的に連結することができる。
したがって、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢに対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープと異なるＡｃｔＲＩＩＢの別のエピトープであり得る。
さらに、二重特異性分子が多重特異性である本発明について、該分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含むことができる。
１つの態様において、本発明の二重特異性分子は、結合特異性のために少なくとも１つの抗体またはその抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖを含む。抗体は、また、軽鎖または重鎖ダイマーまたはそれらのいずれかの最小フラグメント、例えば、ＦｖまたはLadner et al. US4,946,778（この内容を明白に出典明示により包含させる）に記載されている一本鎖構築物であり得る。
本発明の二重特異性分子において使用することができる他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
本発明の二重特異性分子は、当該分野で知られている方法を使用して成分結合特異性を結合させることによって作製することができる。例えば、二重特異性分子のそれぞれの結合特異性は、別々に作製され、次に互いに複合体化させることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、種々のカップリング剤または架橋剤を共有結合複合体のために使用することができる。架橋剤の例は、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648参照）。他の方法は、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83)およびGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載されているものを含む。結合剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両方ともPierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手できる。
結合特異性が抗体であるとき、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合により接合させることができる。特定の態様において、ヒンジ領域は、複合体化の前に、奇数、例えば、１つのスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
あるいは、両方の結合特異性は、同じベクターにおいてコードされ、同じ宿主細胞において発現およびアセンブルされ得る。この方法は、特に、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質であるとき有用である。本発明の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および決定基を含む一本鎖分子または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を作製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３；５，４５５，０３０；４，８８１，１７５；５，１３２，４０５；５，０９１，５１３；５，４７６，７８６；５，０１３，６５３；５，２５８，４９８；および５，４８２，８５８号に記載されている。
二重特異性分子のこれらの特異性標的への結合は、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）またはウエスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは、一般的に、興味ある複合体に対して特異的な標識試薬（例えば、抗体）を使用することにより特定の興味あるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
多価抗体
別の局面において、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する本発明の抗体の少なくとも２つの同一のまたは異なる抗原結合部分を含む多価抗体を提供する。１つの態様において、多価抗体は、抗体の少なくとも２つ、３つまたは４つの抗原結合部分を提供する。抗原結合部分は、タンパク質融合または共有もしくは非共有結合を介して互いに連結することができる。あるいは、結合の方法は、二重特異性分子について記載されている。四価化合物は、例えば、本発明の抗体の定常領域、例えば、Ｆｃまたはヒンジ領域に結合する抗体と本発明の抗体を架橋することにより得ることができる。
医薬組成物
別の局面において、本発明は、薬学的に許容される担体とともに製剤化された、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の１つまたは組合せを含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。このような組成物は、本発明の（例えば、２種以上の異なる）抗体、または免疫抱合体または二重特異性分子の１つまたは組合せを含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的活性を有する抗体の組合せを含むことができる。
本発明の医薬組成物は、また、併用療法、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、併用療法は、本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を、少なくとも１つの他の筋肉量／強度増加剤、例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２またはＩＧＦ−１もしくはＩＧＦ−２の変異体、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、それを活性化しないミオスタチンデコイタンパク質、ベータ２アゴニスト、Ｇｈｒｅｌｉｎアゴニスト、ＳＡＲＭ、ＧＨアゴニスト／模擬物またはフォリスタチンと共に含むことができる。併用療法において使用することができる治療剤の例は、以下の本発明の抗体の使用のセクションにおいてより詳細に記載されている。
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合するあらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。担体は、（例えば、注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与に適しているべきである。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち抗体、免疫抱合体または二重特異性分子を、化合物を不活性にし得る酸および他の天然条件の作用から化合物を保護するために物質でコーティングし得る。
本発明の医薬化合物は、１つ以上の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」は、所望の親化合物の生物学的活性を保持するが、望ましくない毒性作用を付与しない塩を意味する（例えば、Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19、参照）。このような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、無毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など、ならびに無毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などに由来するものを含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに無毒性の有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものを含む。
本発明の医薬組成物は、また、薬学的に許容される抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、アルファ−トコフェロールなど；および金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などを含む。
本発明の医薬組成物において使用され得る適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適当な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルを含む。適当な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用、分散物の場合、必要な粒径の維持および界面活性剤の使用により維持することができる。
これらの組成物は、また、アジュバント、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含み得る。微生物の存在の防止は、上記殺菌手順ならびに種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含の両方により確保され得る。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物に包含させることが望ましいこともある。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの包含により実現され得る。
薬学的に許容される担体は、無菌注射可能溶液または分散液の即時製造調製のための無菌水溶液または分散液および無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬物の使用は、当該分野で知られている。慣用の媒体または薬物が活性な化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が考慮される。補助的な活性化合物も組成物に包含することができる。
一般的に、治療用組成物は、製造および保存の条件下で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたはその他の高濃度の薬物に適した調整構造物として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）および適当なそれらの混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用、分散物の場合、必要な粒径の維持および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含むことができる。注射可能な組成物の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅らせる薬物、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことにより実現することができる。
無菌注射可能溶液は、適当な溶媒中で必要な量の活性な化合物を上記に挙げられた薬剤の１つまたは組合せと混合し、必要なとき、次に無菌的精密濾過をすることにより製造することができる。一般的に、分散液は、基本的分散媒および上記に挙げられたものから必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に活性な化合物を配合することにより製造される。無菌注射可能溶液の製造のための無菌粉末の場合、製造方法は、事前に無菌濾過した溶液から活性剤プラス何らかのさらなる所望の薬剤の粉末が得られる、真空乾燥およびフリーズドドライ（凍結乾燥）である。
単位投与形態を生産するために担体物質と組み合わせることができる活性剤の量は、処置される対象および特定の投与経路に依存して変化する。単位投与形態を生産するために担体物質と組み合わせることができる活性剤の量は、一般的に治療効果を引き起こす組成物の量である。一般的に、１００％のうち、この量は、薬学的に許容される担体との組み合わせで活性剤が約０．０１％から約９９％、約０．１％から約７０％または約１％から約３０％の範囲である。
投与レジメンは、所望の最適応答（例えば、治療応答）を提供するために調節される。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、経時的に数回の分割投与で投与してもよく、または治療状況の緊急性により指示されるとき、比例的に用量を減少または増加してもよい。とりわけ投与の容易性および用量の均一性のため、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが有利である。本明細書において使用される投与単位形態は、処置される対象に対する単位用量として適した物理的に分離した単位を意味し；それぞれの単位は、必要な医薬担体と一緒に所望の治療効果を引き起こすように計算されたあらかじめ決められた量の活性な化合物を含む。本発明の投与単位形態の仕様は、活性な化合物の独自の特徴と達成すべき特定の治療効果、および各個体における治療感受性に関して、このような活性化合物を製剤化する技術に固有の限界により規定され、かつ直接的に依存する。
抗体の投与について、用量は、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常０．０１から５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇもしくは３−７ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。典型的な処置レジメンは、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１月に１回、３月に１回または６月に１回の投与を必要とする。あるいは、抗体は１年に約１回または１回だけ投与され得る。このような投与は、静脈内または皮下に実施され得る。本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体のための投与レジメンは、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、抗体を下記投与スケジュール：４週間毎に６回、次に３月毎；３週間毎；３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、次に３週間毎に１ｍｇ／ｋｇ体重の１つを使用して与える。
用量は、筋肉量および／または強度の上方調節を引き起こす量であるべきである。好ましくは、該効果は骨格筋である。好ましくは、用量は、内臓（例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓）のサイズにおいてわずかに比例的増加で筋肉肥大を引き起こす。このような比例的増加は、体積または質量のいずれかを測定することにより比較され得る。
いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与されるそれぞれの抗体の用量は示される範囲内である。抗体を通常、複数回投与する。各投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３月毎、６月毎または１年毎であり得る。間隔は、また、患者の標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することにより示されるように不定期であり得る。いくつかの方法において、用量は、約１−１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法において、約２５−３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調節される。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ本発明の抗体は、抗ミオスタチン抗体と共投与され得る。
あるいは、抗体を持続放出製剤として投与することができ、この場合、投与頻度は少なくてよい。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般的に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、次に、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与用量および頻度は、処置が予防的または治療的であるかどうかに依存して変化し得る。予防的適用において、比較的低用量を比較的低頻度で長期間投与する。ある患者は、残りの生涯、処置を受け続ける。治療的適用において、ときどき、比較的高用量を比較的短間隔で、疾患の進行を遅らせるかもしくは停止させるまで、または患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで必要である。その後、患者は予防レジメンで投与され得る。
本発明の医薬組成物中の活性剤の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物および投与経路に対して所望の治療応答を達成するために有効であり、患者に毒性がない、活性剤の量を得るために変化させることができる。選択された用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排泄速度、処置の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態および病歴ならびに医薬分野で既知の因子を含む種々の薬物動態因子に依存する。
本発明の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の「治療有効量」は、疾患症状の重症度の減少、疾患無症状の頻度および期間の増加、または疾患の苦痛による機能障害または不都合な点の改善、すなわち、筋肉量および／または強度の増加をもたらすことができる。
本発明の組成物は、１つ以上の当分野で既知の種々の方法を使用して、１つ以上の投与経路により投与することができる。当業者、投与様式および／または投与経路は、所望の結果に依存して変化することが当業者に理解される。本発明の抗体の投与形路は、例えば、注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口経路の投与を含む。本明細書において使用される句「非経口投与」は、通常、注入による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管的、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。１つの態様において、抗体は静脈内に投与される。別の態様において、抗体は皮下に投与される。
あるいは、本発明の抗体は、非経口経路、例えば、局所、上皮または粘膜経路の投与、例えば、鼻腔内、経口的、経膣的、経直腸的、舌下的または局所的により投与することができる。
活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のように、化合物を迅速な放出に対して保護する担体とともに製造することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤の製造のための多数の方法は、特許されているか、一般的に当業者に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978、参照。
治療用組成物は、当該分野で知られている医療デバイスで投与することができる。例えば、１つの態様において、本発明の治療用組成物は、無針皮下注射デバイス、例えば、米国特許第５，３９９，１６３；５，３８３，８５１；５，３１２，３３５；５，０６４，４１３；４，９４１，８８０；４，７９０，８２４または４，５９６，５５６号に示されているデバイスで投与することができる。本発明において有用な既知のインプラントおよびモジュールの例は、コントロールされた速度で薬物を分配するためのインプラント可能な微小注入ポンプを示す米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を介する薬物を投与するための治療デバイスを示す米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを示す米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための流量可変のインプラント可能な注入装置を示す米国特許第４，４４７，２２４号；複数チャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４，４３９，１９６号；および浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４，４７５，１９６号を含む。他のこのような多数のインプラント、送達系およびモジュールは当業者に知られており、ＭｉｃｒｏＣＨＩＰＳＴＭ（Bedford, MA）により製造されるものを含む。
１つの態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体をインビボで適切な分布を確実にするため製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多数の高親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物がＢＢＢを（所望により）通過することを確実にするために、それらは、例えば、リポソーム中で製剤化することができる。リポソームを製造する方法に関して、例えば、米国特許４，５２２，８１１；５，３７４，５４８；および５，３９９，３３１参照。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送される１以上の部分を含み得、したがって標的薬物送達を強化する（例えば、V.V. Ranade, 1989 J. Clin Pharmacol. 29:685、参照）。典型的な標的とする部分は、葉酸またはビオチン（例えば、米国特許５，４１６，０１６参照）；マンノシド（Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180）；界面活性剤タンパク質Ａ受容体（Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090）を含む； K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imrnunomethods 4:273も参照。
本発明の使用および方法
本発明の抗体は、インビトロおよびインビボでの診断および治療有用性を有する。例えば、これらの分子は、種々の障害を処置、予防または診断するために、例えば、インビトロまたはエキソビボで、培養中の、または、例えば、インビボで、対象における細胞に投与することができる。したがって、該抗体は、疾患の処置、ならびに疾患症状の予防および発症の遅延の両方において使用され得る。本明細書において使用される「対象」なる用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、鳥類、両生類およびは虫類を含む。
本発明は、治療有効量の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を投与することを含む病理学的障害（例えば、筋肉消耗性疾患または障害）に罹患している患者を処置する方法を提供する。
本発明は、また、治療における使用のための抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体を提供する。
本発明は、また、病理学的障害の処置のための医薬の製造における抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の使用を提供する。
該方法は、病理学的障害を処置、予防、改善または診断するために特に適当である。
本明細書において使用される「病理学的障害」は、限定はしないが、筋骨格疾患または障害、例えば、筋萎縮であり得る。グルココルチコイド、例えば、コルチゾール、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、またはプレドニゾロンでの処置の結果として含む、筋萎縮の多数の原因が存在する。筋萎縮は、また、神経外傷による脱神経の結果または、変性、代謝性または炎症性神経障害（例えば、Ｇｕｉｌｌｉａｎ−Ｂａｒｒｅ症候群、末梢性神経障害、または環境毒素または薬物への暴露）の結果であり得る。
加えて、筋萎縮は、筋障害、例えば、筋緊張症；先天性筋障害、例えば、ネマリン筋障害、マルチミニコア筋障害および筋細管（中心核）筋障害；ミトコンドリア性筋障害；家族性周期性四肢まひ；炎症性筋炎；例えば、グリコーゲンまたは脂質蓄積症により引き起こされる代謝性筋障害；皮膚筋炎；多発性筋炎；封入体筋炎；骨化性筋炎；横紋筋融解症およびミオグロビン尿症の結果であり得る。
筋障害は、筋ジストロフィー症候群、例えば、デュシェンヌ、ベッカー、筋緊張、顔面肩甲上腕、エメリー・ドレフュス、眼咽頭筋、肩甲上腕、肢帯、福山、先天型筋ジストロフィー、または遺伝的末梢性ミオパシーにより引き起こされ得る。筋骨格疾患は、また、骨粗鬆症、骨折、低身長症、または小人症であり得る。
加えて、筋萎縮は、成人運動ニューロン疾患、小児脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、若年性脊髄性筋萎縮症、多巣性伝導ブロックでの自己免疫性運動神経障害、卒中または脊髄損傷による麻痺、外傷による骨格固定化、長期のベッド休養、自発的不活化、不随意不活化、代謝ストレスまたは栄養不足、癌、ＡＩＤＳ、空腹時、甲状腺障害、糖尿病、良性先天性低血圧、セントラルコア病、やけど、慢性閉塞性肺疾患、肝臓疾患（例えば、線維症、肝硬変症）、敗血症、腎不全、鬱血性心不全、加齢、宇宙旅行または無重力状態で過ごすことの結果であり得る。
処置され得る加齢関連状態の例は、サルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、前立腺癌、卒中、平均寿命の減少、衰弱、記憶障害、しわ、腎機能障害、および加齢性難聴；代謝障害、例えば、ＩＩ型糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖、および肥満を含む。もちろん、患者は、同時に１つ以上のこれらの状態、例えば、サルコペニアおよび肺気腫、またはサルコペニアおよび腎機能障害に罹患していてもよい。
本明細書に記載されている「病理学的障害」であると考慮される他の状態は、急性および／または慢性腎疾患または不全、肝線維症または肝硬変症、癌、例えば、乳癌、パーキンソン病；神経細胞死と関連する状態、例えば、ＡＬＳ、脳萎縮または認知症および貧血を含む。
さらなる状態は、悪液質、リウマチ性関節炎に伴う悪液質および癌に伴う悪液質を含む。
今日までに、これらの障害を処置するための信頼できる、または有効な治療は、ほとんど開発されていない。
肝、腎および肺線維症に寄与する他の受容体中のＡｃｔＲＩＩＢへのアクチビン結合の役割（Werner and Alzheimer, Cytokine Growth Factors Rev 2006, 17(3):157-171）、ならびに癌におけるミオスタチン、アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩＢに対する役割（Tsuchida et al, Endo J, 2008）の報告されている証拠に基づいて、本明細書に記載されている「病理学的障害」は、肝、腎および肺線維症、および限定はしないが、横紋筋肉腫、骨量減少を誘導する癌、肝細胞腺腫、消化器癌により例示される癌を含む。
防止は、加齢関連状態または代謝障害の完全、例えば、全非存在であり得る。防止は、また、対象における加齢関連状態または代謝障害の発生する可能性が、本発明の抗体を受けていない対象よりも起こる可能性が低いという部分的であり得る。
本明細書において称されている加齢関連状態は、５０歳以上の年齢で始まり得る（すなわち、６０、７０、８０またはそれ以上）。
１つの態様において、患者は、強制的な休止／不応の予期された期間前に抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体で前処置され得る。このような期間は、患者が、例えば股または脚に対する手術のために通院するときに起こり得る。不応は、例えば、骨折した肢もしくは関節の鋳造、または麻痺薬の投与により限定され得る。
１つの態様において、処置される患者は、肢（すなわち脚または腕）または関節（すなわち膝関節または股関節）に対する骨折を有する。したがって、１つの態様において、処置される患者は、１つ以上の上腕骨、橈骨、尺骨、手根骨、中手骨、鎖骨、肩甲、大腿骨、寛骨、膝蓋骨、脛骨、腓骨、距骨、踵骨、足根骨、中足骨、坐骨または腸骨に対する骨折を有する。別の態様において、処置される患者は、１つ以上の以下の関節：膝関節、股関節、足関節、肩関節、肘関節における手術を経験しているか、または経験しようとしている。このような手術は、股関節置換および膝関節置換を含む。
固定化による萎縮は、迅速に起こり得るが、通常ゆっくりと起こる。したがって、１つの態様において、患者、関節または肢は、２週間またはそれ以上（すなわち、３週間、４週間、６週間、８週間またはそれ以上）、固定されているか、または固定される。１つの態様において、患者、関節または肢は、１−８週間、２−６週間または３−５週間、固定されているか、または固定される。
さらなる態様において、患者は、以前の骨同化作用処置に応答しないものであり得る。例えば、該患者は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２またはＩＧＦ−１もしくはＩＧＦ−２の変異体、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、それを活性化しないミオスタチンデコイタンパク質、ベータ２アゴニスト、Ｇｈｒｅｌｉｎアゴニスト、ＳＡＲＭ、ＧＨアゴニスト／模擬物またはフォリスタチンでの処置に応答しない。処置に対する患者の応答を測定する簡単な方法は、患者が段の既知の高さに達するまでの時間を計り、処置前および後の両方の結果を比較することであり得る。
本発明の抗体は、単独の活性剤として、または以下のものと組み合わせて、例えば、アジュバントとして、または以下のものと組み合わせて投与され得る。他の薬物、例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２またはＩＧＦ−１もしくはＩＧＦ−２の変異体、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、それを活性化しないミオスタチンデコイタンパク質、ベータ２アゴニスト、Ｇｈｒｅｌｉｎアゴニスト、ＳＡＲＭ、ＧＨアゴニスト／模擬物またはフォリスタチン。例えば、本発明の抗体は、ＷＯ２００７／１４６６８９に記載されているＩＧＦ−１模擬物と組み合わせて使用され得る。
前記にしたがって、本発明は、さらにさらなる局面を提供する：
上記定義の方法は、治療有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト、例えば本発明の抗体、および少なくとも１つの第２の薬物の、例えば、同時または連続の共投与を含み、ここで、該第２の薬物は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２またはＩＧＦ−１もしくはＩＧＦ−２の変異体、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、それを活性化しないミオスタチンデコイタンパク質、ベータ２アゴニスト、Ｇｈｒｅｌｉｎアゴニスト、ＳＡＲＭ、ＧＨアゴニスト／模擬物またはフォリスタチンである。
本発明は、さらに、治療有効量のａ）ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト、例えば、本発明の抗体、およびｂ）例えば上記されている、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２またはＩＧＦ−１もしくはＩＧＦ−２の変異体、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、それを活性化しないミオスタチンデコイタンパク質、ベータ２アゴニスト、Ｇｈｒｅｌｉｎアゴニスト、ＳＡＲＭ、ＧＨアゴニスト／模擬物またはフォリスタチンから選択される少なくとも１つの第２の物質を含む治療的組合せ、例えば、キットを提供する。キットは、さらに、投与のための指示書を含み得る。
本発明の抗体が別の活性剤と組み合わせて投与されるとき、共投与される組合せ化合物の用量は、もちろん、使用される共薬物の型、使用される特定の薬物、処置される状態などに依存して変化する。
別の態様において、本発明の抗体は、筋萎縮に罹患している患者中で選択される患者集団にのみ投与される。別の態様において、本発明の抗体は、骨格筋萎縮に罹患している患者集団に投与される。別の態様において、本発明の抗体は、抗ＡｃｔＲＩＩＢ処置に応答する患者のグループ中で選択される患者集団にのみ投与される。抗ＡｃｔＲＩＩＢ処置に応答する高い可能性を有する患者を同定するバイオマーカーは、以下のいずれかでもよく、これらに限られない：コントロール患者と比較して血清ミオスタチン、ＧＤＦ−１１またはアクチビンの高いレベル。
１つの態様において、本発明の抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢのレベルまたはＡｃｔＲＩＩＢを含む細胞のレベルを検出するために使用することができる。これは、抗体とＡｃｔＲＩＩＢ間の複合体の形成を可能にする条件下で、例えば、サンプル（例えば、インビトロでのサンプル）およびコントロールサンプルを抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体と接触させることにより、成し遂げることができる。該抗体とＡｃｔＲＩＩＢ間で形成される任意の複合体を検出し、サンプルおよびコントロールで比較する。例えば、当該分野でよく知られている標準検出方法、例えば、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーアッセイは、本発明の組成物を使用して実施することができる。
したがって、１つの局面において、本発明は、さらに、抗体またはその一部とＡｃｔＲＩＩＢ間の複合体の形成を可能にする条件下で、ＡｃｔＲＩＩＢに特異的に結合する本発明の抗体またはそれらの抗原結合領域をサンプルおよびコントロールサンプルと接触させることを含む、サンプル中のＡｃｔＲＩＩＢ（例えば、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ）の存在を検出するか、またはＡｃｔＲＩＩＢの量を測定するための方法を提供する。複合体の形成は検出され、コントロールサンプルと比較してサンプル間の複合体形成における違いは、サンプルにおけるＡｃｔＲＩＩＢの存在を示す。
本発明の組成物（例えば、抗体、ヒト抗体および二重特異性分子）および使用のための指示書からなるキットも、本発明の範囲内である。キットは、さらに、少なくとも１つのさらなる試薬または１つ以上のさらなる本発明の抗体（例えば、第１の抗体と異なる標的抗原上のエピトープに結合する相補的活性を有する抗体）を含むことができる。キットは、一般的に、キットの内容の意図される使用を示すラベルを含む。ラベルなる用語は、キット上またはキットと共に提供されるあらゆる文章または記録物、またはキットとの添付物を含む。キットは、さらに、上記定義のとおりの患者は抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体処置に応答するグループに属するか否かを診断するためのツールを含み得る。このようなキットは、凍結乾燥された形態の本発明の抗体、希釈剤および使用のための指示書を含み得る。
本発明は十分に記載されており、さらに以下の実施例および特許請求の範囲で説明されているが、説明のためであり、さらなる限定を意図しない。
全般的
「含む」なる用語は、「包含する」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみを含むか、またはさらなるもの、例えば、Ｘ＋Ｙを含み得る。
数値ｘに関連する「約」なる用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
図１は、親およびＡｃｔＲＩＩＢをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞系におけるＦＡＣＳ滴定によるＭＯＲ０７０７９のＥＣ５０決定を示す。 図２は、２、１０および５０μｇ／ｍｌでの抗ＡｃｔＲＩＩＢ Ｆａｂｓの倍数によるレポーター遺伝子アッセイにおけるミオスタチン誘導ルシフェラーゼ発現の阻害を示す。 図３は、ミオスタチン誘導ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるＦａｂｓのＩＣ５０決定を示す。 図４は、初代ヒト骨格筋細胞への抗体結合を示す。 図５は、骨格筋分化アッセイのミオスタチン誘導阻害におけるＩｇＧのＩＣ５０決定を示す。 図６は、マウス試験を示す：天然動物−１０ｍｇ／ｋｇでのＭＯＲ０８１５９またはＭＯＲ０８２１３の６週間処置におけるインビボでの有効性試験は、体および筋肉重量を増加させた。変化は、（Ａ）体重、（Ｂ）脛骨筋、（Ｃ）足底を有する腓腹筋、（Ｄ）大腿四頭筋および（Ｅ）胸筋について示されている。 図７は、マウス試験を示す：天然動物−２５、５、１ｍｇ／ｋｇでのＭＯＲ０８２１３の６週間処置におけるインビボでの用量応答有効性試験は、体および筋肉重量を用量依存的に増加させた。変化は、（Ａ）体重、（Ｂ）脛骨筋、（Ｃ）足底を有する腓腹筋、（Ｄ）大腿四頭筋および（Ｅ）胸筋について示されている。 図８は、アイソタイプコントロールのみ（黒線）またはＭＯＲ０８２１３の存在下でのアイソタイプコントロール（点線）と比較して、ＭＯＲ０８２１３の存在下でのＭＯＲ０８１５９（太い点線）とＭＯＲ０８１５９のみ（太い黒線）間の交差阻止を証明するＦＡＣＳ出力を示す。 図９は、種々のエピトープ決定技術を使用して、ＭＯＲ０８１５９が結合するＡｃｔＲＩＩＢ残基（配列番号：１８１）の概観を示す。
発明を実施するための形態
機能性アッセイ
レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）
ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞系の培養
親ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（５０ＩＥ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭに維持した。細胞を、３７℃で５％のＣＯ２でインキュベーター中で増殖させ、３−４日毎に二次培養した。ＡｃｃｕｔａｓｅＴＭを使用して細胞を引き離し、次に新鮮培地を含む新しいフラスコに移した。
ＣＡＧＡ−１２ ｌｕｃで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を、親ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞について上記されているとおりに培養したが、細胞増殖培地にＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンに加えて４ｍＭのＬ−グルタミンおよび３μｇ／ｍｌのブラストサイジンを補った。
ミオスタチン誘導ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体のミオスタチン誘導シグナル伝達を阻害する能力を測定するために、安定なレポーター細胞系ＨＥＫ２９３Ｔ／１７ ＣＡＧＡ−１２ ｌｕｃを使用するレポーター遺伝子アッセイを行った。ＣＡＧＡ−１２ルシフェラーゼ応答構築物は、最小のプロモーターおよびリン酸化Ｓｍａｄ−２およびＳｍａｄ−３に特異的である複数のＣＡＧＡボックスの下流にルシフェラーゼ遺伝子を有する。精製されたミオスタチン（ＧＤＦ−１１、アクチビンまたはＴＧＦβも）の添加は、Ｓｍａｄリン酸化、したがってＣＡＧＡ−１２レポーターへの結合を誘導し、ルシフェラーゼ遺伝子発現を引き起こす。
ＨＥＫ２９３Ｔ／１７ ＣＡＧＡ−１２ ｌｕｃ細胞の９０％密集度で、細胞を記載されているとおりに引き離し、２．５×１０５細胞／ｍｌの濃度に培養培地を希釈した。次に、ウェルあたり１００μｌの細胞を平底９６−ウェルプレートに播種し、３７℃で５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。
次の日、陽性コントロールとして使用される抗体（ＦａｂまたはＩｇＧ）および組換えヒトＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃを、所望の濃度にＰＢＳで希釈した。２０μｌの抗体溶液を、前日の播種されたウェルに加え、抗体と結合させるために細胞を１時間培養した。最後に、５０ｎｇ／ｍｌのミオスタチンをウェルに加え、細胞をさらに一晩培養した。
次の朝、１２０μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をそれぞれのウェルに加えた。２分間インキュベーション後、発光を照度計で読んだ。最大の半分の阻害濃度（ＩＣ５０値）を、それぞれの抗体の全滴定後に計算した。
特異性ＥＬＩＳＡ
ヒトＡｃｔＲＩＩＢに対する抗ＡｃｔＲＩＩＢ Ｆａｂ抗体の特異性およびヒトＡｃｔＲＩＩＡおよびマウスＡｃｔＲＩＩＢへの交差反応性を、ＥＬＩＳＡ設定で評価した。さらに、関連受容体（カウンター標的：ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウスＴＧＦ−βＲＩ（ＡＬＫ−５）／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトアクチビンＲＩＢ（ＡＬＫ−４）／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ））への結合を測定した。このために、ＰＢＳに希釈された５μｇ／ｍｌ（他に記載のない限り）の組換えタンパク質を黒色９６−ウェル平底ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレートに加え、コーティングのために一晩４℃でインキュベートした。
次の朝、プレートをＴＢＳＴで洗浄し、ＭＴＢＳＴでブロックした。プレートを数回洗浄後、５μｇ／ｍｌの抗ＡｃｔＲＩＩＢ Ｆａｂを加え、２．５時間インキュベートした。次に、抗原結合Ｆａｂをアルカリホスファターゼ接合ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ Ｆａｂ−特異的でのインキュベーションにより検出し、次にＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光基質を加えた。５３５ｎｍでの蛍光放射を、ＴＥＣＡＮ Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒプレートリーダーで４３０ｎｍでの励起で記録した。
ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ−ミオスタチン結合相互作用ＥＬＩＳＡ
ヒトＡｃｔＲＩＩＢのミオスタチン結合部位をブロックすることを介して阻害Ｆａｂが作用するか否かを評価するために、ｈＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ−ミオスタチン相互作用ＥＬＩＳＡを行った。このため、組換えミオスタチンを５μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈し、黒色９６−ウェル平底Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングした。次の朝、ウェルをＭＴＢＳＴでブロックした。その間に、５０μｇ／ｍｌの抗ＡｃｔＲＩＩＢ Ｆａｂを１０μｇ／ｍｌのＡｃｔＲＩＩＢ／ＦｃとＴＢＳＴ中で室温で１．５時間プレインキュベートし、最後にコーティングされブロックされたウェルに加えた（室温で１．５時間）。ＴＢＳＴバッファーで洗浄後、結合したＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃの検出を、非標識マウス抗−ヒトＩｇ Ｆｃ−特異的抗体およびＰＯＤ−標識ヒツジ抗−マウスＩｇＧ検出抗体を使用して行った。ウェルをＴＢＳＴバッファーで数回洗浄後、Ｑｕａｎｔａ ＢｌｕＴＭ 蛍光発生ペルオキシダーゼ基質を加えた。蛍光をＧＥＮｉｏｓＰｒｏＴＭリーダーにおいて読んだ（励起３２０ｎｍ、放射４３０ｎｍ）。
細胞への結合
細胞
ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して直線状ｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）−ＡｃｔＲＩＩＢ（ＥＣＤ）もしくはＡｃｔＲＩＩＡ（ＥＣＤ）およびｐＰＧＫ−ｐｕｒｏ（ＡｄｄＧｅｎｅ）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣ）を使用して産生された、安定なヒトＡｃｔＲＩＩＡ−およびヒトＡｃｔＲＩＩＢをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（５０ＩＥ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭに維持した。細胞をインキュベーター中で３７℃で５％のＣＯ２で増殖させ、３−４日毎に二次培養した。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅＴＭを使用して引き離し、次に新鮮培地を含む新しいフラスコに移した。
ヒト骨格筋細胞（ｈｕＳｋＭＣ）（Ｃａｍｂｒｅｘ）を、約７０−９０％の密集度で培養した。これらの細胞に対して、２０％のＦＣＳ（Ａｍｉｍｅｄ）を補った骨格筋基礎培地（ｓｋＢＭ；Ｌｏｎｚａ）からなる増殖培地（ＧＭ）を吸引し、細胞をＨＥＰＥＳ−ＢＳＳで洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡとインキュベートした。該細胞を引き離した後、トリプシンをトリプシン中和溶液で中和した。細胞を５分間２２０×ｇで遠心し、ペレットを骨格筋増殖培地で再懸濁した。次に、細胞を実験のために使用するか、または〜３５００細胞／ｃｍ２の細胞密度で二次培養するために播種した。細胞をインキュベーター中で３７℃で５％のＣＯ２で増殖させ、５−６日毎に二次培養した。
ｈＡｃｔＲＩＩＢおよびｈＡｃｔＲＩＩＡを発現する細胞におけるＦＡＣＳ滴定
抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の半数効果濃度（ＥＣ５０）を、ＦＡＣＳにより細胞ｈＡｃｔＲＩＩＡおよびｈＡｃｔＲＩＩＢへの結合を介して決定した。
このために、抗ＡｃｔＲＩＩＢ ＦａｂまたはＩｇＧの連続希釈物を、ウェル当たり１×１０４個のｈＡｃｔＲＩＩＡ−トランスフェクトされた、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−トランスフェクトされた、または親ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞と１時間４℃とインキュベートした。数回洗浄工程後、細胞結合ＦａｂまたはＩｇＧをフィコエリトリン−接合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体で検出した。４℃で１時間インキュベーション後、該細胞を再び洗浄し、ＦＡＣＳバッファーで再懸濁し、該細胞の蛍光強度をＦＡＣＳＡｒｒａｙＴＭ装置で決定した。
初代ヒト骨格筋細胞への結合
抗ＡｃｔＲＩＩＢ ＦａｂまたはＩｇＧならびにアイソタイプ コントロールＦａｂまたはＩｇＧ（１０μｇ）を、チューブ当たりＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％のＦＣＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）中の１０５個のｈｕＳｋＭＣと１時間４℃でインキュベートした。洗浄工程後、細胞結合ＦａｂまたはＩｇＧを、ＦＡＣＳバッファーで１：２００で希釈されたフィコエリトリン−接合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体で検出した。震盪器上で４℃で１時間インキュベーション後、該細胞を再び洗浄し、ＦＡＣＳバッファーで再懸濁し、該細胞の蛍光強度をＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒＴＭ装置で決定した。
親和性測定
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用する選択された抗−ヒトＡｃｔＲＩＩＢ Ｆａｂの親和性測定
直接的抗原固定化標準ＥＤＣ−ＮＨＳのために、アミンカップリング化学を使用した。ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、１０ｍＭの酢酸バッファー、ｐＨ４．５中の約６０００ＲＵのヒト−もしくはマウス−ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ、または約１５００ＲＵのヒト−ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｆｃ（抗原の活性にしたがって）でコーティングした。参照フロー細胞のために、それぞれの量のＨＳＡを使用した。再生を５μｌの１０ｍＭのグリシン／ＨＣｌバッファー ｐＨ１．５で行った。
あるいは、抗原を直接固定せず、ＣＭ５チップ上に捕獲し、抗−ヒト−Ｆｃ抗体（Ｆｃ捕獲キット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ｂｉａｃｏｒｅ）で修飾した。参照フロー細胞について、捕獲抗体を固定したが、抗原を捕獲しなかった。再生を、５μＬの３ＭのＭｇＣｌ２の２回の注射を使用して成し遂げた。
速度論的定量をＦａｂサンプルの連続希釈列を使用して２０μｌ／分の流速でＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ中で行った。Ｆａｂ濃度は、１５．６から５００ｎＭの範囲であった。それぞれの濃度に対する注射時間は１分であった。解離時間を少なくとも２分（またはそれ以上、測定される親和性にしたがって）に合わせた。直線的バッファーのブランク注射を二重参照のために使用した。全てのセンサーグラムを、ＢＩＡ評価ソフトウェア３．２（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して包括的に合わせた。
ＣＫアッセイ
細胞をＧＭから骨格筋基礎培地（ｓｋＢＭ）からなる無血清分化培地へ変化させることにより、播種２４時間後に分化を開始した。細胞をミオスタチン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）または他のＴＧＦ−ｂタンパク質の存在および非存在下で３日間で分化させ、所定の濃度で抗体を試験した。細胞をＰＢＳで洗浄し、次に、レポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、測定まで−８０℃で保存した。ＣＫ活性をＣＫ（ＩＦＣＣ）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を使用して測定した。ＣＫ試薬を製造業者の指示にしたがって調製した。細胞溶解物を室温に調節し、ＣＫ試薬を加え、吸光度を即座に３４０ｎｍで２０分間、１分間隔で読んだ。ＣＫ標準曲線を、ウサギ筋肉由来のＣＫ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して新たに作成した。タンパク質含有量をＢＣＡキットを使用して決定した。
動物モデル
９週齢のメスＣＢ１７／ＩＣＲ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｃｒｌマウス（グループ当たりｎ＝１０、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を体重でランダム化し、次に１０ｍｇ／ｋｇの用量で抗−ヒトＡｃｔＲＩＩＢ抗体（ＭＯＲ８１５９、ＭＯＲ８２１３）またはＩｇＧコントロール抗体を（試験１；比較試験）、または２５、５または１ｍｇ／ｋｇの用量でＭＯＲ８２１３を（試験２；用量応答試験）、０、３、７、１４、２１、２８および３５日目に（１週間に１回と３日目）腹腔内に処置した。体重を１週間当たり２回測定した。投与６週間（４２日間）後、マウスをＣＯ２で安楽死させた。脛骨筋、足底を有する腓腹筋、大腿四頭筋および胸筋を回収し、計量した。
処置プロトコール
コントロール抗体：抗−ニワトリ リゾチーム−ｈＩｇＧ
濃度：２ｍｇ／ｍＬ（試験１）、５ｍｇ／ｍＬ（試験２）、適用量：５ｍＬ／ｋｇ
ビヒクル：５０ｍＭのクエン酸、１４０ｍＭのＮａＣｌまたはＰＢＳ
抗−ヒトＡｃｔＲＩＩＢ抗体：抗ＡｃｔＲＩＩＢ−ＭＯＲ８１５９およびＭＯＲ８２１３、ｈＩｇＧ、
濃度：２ｍｇ／ｍＬ（試験１）、５ｍｇ／ｍＬ（試験２）、１ｍｇ／ｍＬ（試験２）、０．２ｍｇ／ｍＬ（試験２）、適用量：５ｍＬ／ｋｇ
ビヒクル：５０ｍＭのクエン酸、１４０ｍＭのＮａＣｌ
処置グループ：
試験１；ＭＯＲ０８１５９とＭＯＲ０８２１３の比較
１ ＩｇＧコントロール、ｉ．ｐ．（抗−ニワトリ リゾチーム−ＩｇＧ）、１０ｍｇ／ｋｇ
２ 抗ＡｃｔＲＩＩＢ−ＭＯＲ８１５９、ｉ．ｐ．、１０ｍｇ／ｋｇ
３ 抗ＡｃｔＲＩＩＢ−ＭＯＲ８２１３、ｉ．ｐ、１０ｍｇ／ｋｇ
試験２；ＭＯＲ０８２１３の用量応答
１ ＩｇＧコントロール、ｉ．ｐ．（抗−ニワトリ リゾチームＩｇＧ）、２５ｍｇ／ｋｇ
２ 抗ＡｃｔＲＩＩＢ−ＭＯＲ８２１３、ｉ．ｐ．、２５ｍｇ／ｋｇ
３ 抗ＡｃｔＲＩＩＢ−ＭＯＲ８２１３、ｉ．ｐ．、５ｍｇ／ｋｇ
４ 抗ＡｃｔＲＩＩＢ−ＭＯＲ８２１３、ｉ．ｐ．、１ｍｇ／ｋｇ
メンテナンス条件
動物を、２５℃で１２：１２時間の明暗サイクルで４から５匹の動物のグループにおいて飼った。それらに１５．８ＭＪ／ｋｇのエネルギーを有する１８．２％のタンパク質および３．０％の脂肪を含む標準実験食（ＮＡＦＡＧ ３８９０、Ｋｌｉｂａ）を与えた。食料および水は自由に与えた。動物実験を、Ｃａｎｔｏｎ ｏｆ Ｂａｓｅｌ−Ｃｉｔｙ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにおいて有効な規則にしたがって行った。
方法
統計分析
結果を平均＋／−ＳＥＭとして示す。統計分析を、Ｄｕｎｎｅｔｔの複合比較試験、次に一元配置分散分析を使用して実施した。処置（抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体ＭＯＲ８１５９およびＭＯＲ８２１３をコントロール（コントロール抗体）との差について試験し、差が確率値が＜０．０５であるとき有意であると考えた：＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、ＮＳ：ＩｇＧコントロールに対して有意でない。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）により行った。体重は０日目の体重を引くことにより計算し、筋肉重量は０日目の体重（最初の体重）により標準化した。
パニング、抗体同定および特性化
ヒトＡｃｔＲＩＩＢタンパク質に対する治療用抗体を、抗体変異体タンパク質の供給源として、市販のファージディスプレイライブラリー、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーを使用して、高い結合親和性を有するクローンの選択により調製した。
ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーは、全６つのＣＤＲが適当な方法により多様化されるＦａｂライブラリー（Knappik et al., 2000）であり、ファージ表面へのＦａｂの連結のためのＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ技術を使用する（ＷＯ０１／０５９５０）。
ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）ファージミドライブラリー（Rothe et al., 2008）を、特異的Ｆａｂ抗体フラグメントを選択するために使用した。
ライブラリーからＡｃｔＲＩＩＢ−特異的抗体のパニングによる選択
ヒトＡｃｔＲＩＩＢを認識する抗体の選択のために、いくつかのパニング戦略を利用した。
要約すると、ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）抗体−ファージを、異なるＶＨマスター遺伝子を含むいくつかのプールに分けた。
これらのプールを個々に示差的細胞パニングに付し、それによって、ヒトＡｃｔＲＩＩＢで一過性にトランスフェクトされた細胞における選択ラウンドを、組換えヒトＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃタンパク質における選択ラウンドと交替させた。
ｉ．全細胞パニング
パニングにおいて、ＰＢＳに希釈されたファージ粒子を等容量のＰＢＳ／ＢＳＡと混合し、ブロックした。並行して、あらかじめブロックされたチューブ中においても、ファージプール当たり１×１０７個のそれぞれのｈＡｃｔＲＩＩＢを発現する細胞を、ＰＢＳ／３％のＦＣＳ／０．０４％のＮａＮ３で再懸濁し、震盪器で４℃で１時間ブロックした。ブロックされた細胞を遠沈し、あらかじめブロックされたファージ粒子で再懸濁し、３時間インキュベートした。その間に、ファージプール当たり１ｘ１０７個のｈＡｃｔＲＩＩＢノックダウン細胞を調製した。
ファージ−細胞複合体をＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、次にＰＢＳで洗浄した。ｈＡｃｔＲＩＩＢを発現する細胞からファージ粒子の溶離を、グリシンバッファー、ｐＨ２．２で酸性溶離により行った。遠心分離後、溶離物を非緩衝Ｔｒｉｓを加えることにより中和した。
感染および次の遠心分離後に、細菌ペレットを２×ＹＴ培地で再懸濁し、ＬＢ／ＣＡＭ／Ｇｌｃ寒天プレート上に置き、３７℃で一晩インキュベートした。次の朝、コロニーをプレートから掻き取り、ファージをレスキューし、増幅した。
ｉｉ．固相パニング
固相パニングのために、組換えヒトＡｃｔＲＩＩＢ／ＦｃをＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレート上に４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳで洗浄後、コーティングされたウェルを５％のＭＰＢＳＴでブロックした。
選択前に、ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）ファージをブロッキングバッファーにあらかじめ吸着させた。ブロックされたファージをコーティングされた抗原に加え、室温で２時間インキュベートした。非特異的ファージをＰＢＳＴおよびＰＢＳで洗い落とした。結合したファージを２０ｍＭのＤＴＴの添加により溶離した。溶離物を大腸菌ＴＧ−１培養物の感染のために使用した。感染後、細菌をＬＢ／ＣＡＭ／Ｇｌｃ寒天プレート上に置き、３７℃で一晩インキュベートした。次の朝、コロニーをプレートから掻き取り、ファージをレスキューし、増幅した。
最も成功したパニングアプローチは、ＡｃｔＲＩＩＢをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞における第１のパニングラウンド、次に組換えヒトＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃにおける選択ラウンド、再びトランスフェクトされた細胞でのものを有する示差的細胞／タンパク質パニングであることを証明した。
選択されたＦａｂを、親またはｒｈＡｃｔＲＩＩＢをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への結合について分析した。
ＭＯＲ０７０７９ Ｆａｂは、２０ｎＭのＥＣ５０でＡｃｔＲＩＩＢ−トランスフェクトされた細胞に優先的に結合した（図１）。ミオスタチン結合阻害ＥＬＩＳＡにおいて、ＭＯＲ０７０７９ Ｆａｂは、阻害活性を示し、ミオスタチンへのｒｈＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ結合をブロックした。ＥＬＩＳＡにおける強いミオスタチン結合阻害は、ＭＯＲ０７０７９に対してＨＥＫ２９３−ＣＡＧＡ１２を使用するレポーター遺伝子アッセイにおいてミオスタチン阻害により反映した。特異性ＥＬＩＳＡを使用して、ＭＯＲ０７０７９は、ヒトおよびマウスＡｃｔＲＩＩＢに特異的に結合するが、非制御ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ４およびＡＬＫ５受容体に結合しないことを示した。ＭＯＲ７０７９は、また、ＡｃｔＲＩＩＡと比較してＡｃｔＲＩＩＢに優先的に結合することを示した。
ＨｕＣＡＬ（登録商標）免疫グロブリンの生産
ｉ．ＩｇＧ型へのＦａｂの変換
全長免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現するために、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインフラグメントを、ヒトＩｇＧ２に対してｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿ＦＨ Ｆａｂ発現ベクターからｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇベクターシリーズへサブクローニングした。選択されたクローンも、また、位置２３４および２３５でのロイシンをアラニンに変異されているサイレントＩｇＧ１ＬＡＬＡ型に変換し、ＦｃＲγ結合を破壊し、エフェクター機能を軽減させる。
適当な制限酵素（Knappik et al., 2000）を、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇＧ２、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇκ、およびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇλ２へのＶＨおよびＶＬドメインフラグメントのサブクローニングのために使用した。
全てのＤＮＡ調製物を、ＨＫＢ１１細胞へのトランスフェクション前に配列分析に付した。
ｉｉ．ヒトＩｇＧの一過性発現および精製
真核ＨＫＢ１１細胞をＩｇＧの重鎖および軽鎖発現ベクターＤＮＡでトランスフェクトした。細胞培養物上清をトランスフェクション後３または７日目に回収し、標準ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ親和性クロマトグラフィーに付した。他に記載のない限り、バッファー交換を１×ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に行い、サンプルを滅菌濾過した（０．２μｍ）。
ＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ２成熟ライブラリー
選択された抗体フラグメントの親和性および生物学的活性を増加させるために、ＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ２領域を、並行して、トリヌクレオチド指向変異誘発（Virnekas et al., 1994, Nucleics Res. 22:5600-5607）を使用するカセット変異誘発により最適化し、それによりフレームワーク領域は定常を維持する（Nagy et al., 2002, Nature Medicine, 8:801-807）。成熟ライブラリーのクローニングの前に、全ての親Ｆａｂフラグメントを、発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９からＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ成熟ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２５へＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を介して移動させた。このベクターは、Ｎ−末端でシステイン残基に融合しているファージタンパク質ｐＩＩＩならびにＦｄ抗体鎖に融合したＣ−末端システインを提供し、したがって、ファージ表面上のそれぞれのＦａｂフラグメントのジスルフィド連結ディスプレイを可能にする。
ＣＤＲ−Ｈ２ライブラリーの産生のために、それぞれの親ＦａｂのＣＤＲ−Ｈ２領域を切除し、高度に多様化されたＣＤＲ−Ｈ２成熟カセットに置き換えた。
並行して、親クローンのＣＤＲ−Ｌ３領域を多様化されたＣＤＲ−Ｌ３成熟カセットに置き換えた。
成熟ライブラリーのサイズは、４×１０５から１×１０８個のクローンの範囲であった。ベクターバックグラウンドは、全ての場合において１％未満であった。単一クローンの配列決定による品質管理は、高質のそれぞれのライブラリーを示した。
それぞれのＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ２成熟ライブラリーについて、抗体ディスプレイファージを調製し、ファージ力価をスポット滴定により決定した。
親和性成熟に関するパニング戦略
以下の成熟ライブラリーからの抗体ディスプレイファージを、別々のパニングおよびスクリーニングに付した：
リード１：ＭＯＲ０７０７９（Ｌ−ＣＤＲ３成熟）
リード１：ＭＯＲ０７０７９（Ｈ−ＣＤＲ２成熟）
それぞれの抗体を使用する成熟パニングを、ビオチン化ｈＡｃｔＲＩＩＢ／ＦｃおよびｈｕＳｋＭＣについて行った。
新たに産生された成熟ライブラリーからレスキューされたサブコード当たり２×１０１０または１×１０１１個のいずれかのファージを、第１の選択ラウンドに対して使用した。
いくつかの示差的パニングを行い、それにより、組換えビオチン化ｈＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃにおける選択ラウンドをｈｕＳｋＭＣにおける選択ラウンドと交替させた。
溶液パニングの第１および第３ラウンドにおいて、ビオチン化組換えｈＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃを、ストレプトアビジン−コーティング Ｄｙｎａｂｅａｄ上に捕獲した。以下のプロトコールを適用する：それぞれのファージプールについて、ストレプトアビジンビーズをＰＢＳで洗浄し、ブロッキングバッファーで再懸濁した。ＰＢＳに希釈したファージ粒子を０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むブロッキングバッファーと混合し、回転ホイール(rotating wheel)上に維持した。ストレプトアビジン−もしくはビーズ−結合ファージの除去のためにファージ粒子のプレクリーニングを２回行った：ファージプール毎に、ブロックされたストレプトアビジンビーズをブロックされたファージ粒子に加え、回転ホイール上でインキュベートした。磁気装置を介してビーズの分離後、ファージ上清を新鮮なあらかじめブロックされた反応チューブに移し、前吸着を繰り返した。
ブロッキング処理後、ビオチン化ｈＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ抗原をプレクリーニングされ、ブロックされたファージ粒子に加え、回転ホイール上でインキュベートした。ファージ−抗原複合体をブロックされたストレプトアビジンビーズを使用して捕獲し、ファージパニングプールに加え、さらにインキュベートした。ストレプトアビジンビーズに結合したファージ粒子を回収した。次に、ビーズをＰＢＳＴおよびＰＢＳで洗浄した。ストレプトアビジンビーズからファージ粒子の溶離を２０ｍＭのＤＴＴの添加により行った。溶離物を回収し、０．６−０．８のＯＤ６００ｎｍにまで増殖させる大腸菌ＴＧ−１培養の感染のために使用した。
感染および次の遠心分離後、細菌ペレットを２×ＹＴ培地で再懸濁し、ＬＢ／ＣＡＭ／Ｇｌｃ寒天プレート上に置き、３７℃で一晩インキュベートした。次の朝、コロニーをプレートから掻き取り、ファージをレスキューし、ヘルパーファージ感染細胞を０．２５ｍＭのＩＰＴＧを含む培地中で２２℃で一晩培養することを除いて、主に（Krebs et al., 2001）に記載されているとおりに増幅した。ビオチン化ｈＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃにおける溶液パニングの第３のラウンドを、使用される抗原の量を減少させ、洗浄条件のストリンジェンシーを増加させることを除いて、第１のラウンドのプロトコールにしたがって行った。
パニングの第２のラウンド（内因性ｈＡｃｔＲＩＩＢを発現するｈｕＳｋＭＣにおける）のために、ＰＢＳに希釈したファージ粒子を等量のＰＢＳ／ＢＳＡと混合し、ブロックした。並行して、それぞれのサブコードに対して、９×１０５個のｈｕＳｋＭＣを４℃でＰＢＳ／ＦＣＳ／０．０２％のＮａＮ３でブロックした。ブロックされた細胞を遠沈し、あらかじめブロックされたファージ粒子と共に再懸濁し、さらにインキュベートした。
ファージ−細胞複合体をＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、次にＰＢＳで洗浄した。細胞を４１０×ｇで４℃で２分遠心した。ｈＡｃｔＲＩＩＢを発現するｈｕＳｋＭＣからファージ粒子の酸性溶離を、グリシンバッファーｐＨ２．２で１０分間インキュベーション工程により行った。遠心分離後、溶離物を非緩衝Ｔｒｉｓを加えることにより中和した。上清を含むファージを０．６−０．８のＯＤ６００ｎｍにまで増殖させる大腸菌ＴＧ−１培養の感染のために使用した。
感染および次の遠心分離後、細菌ペレットを２×ＹＴ培地で再懸濁し、ＬＢ／ＣＡＭ／Ｇｌｃ寒天プレート上に置き、３７℃で一晩インキュベートした。次の朝、コロニーをプレートから掻き取り、ファージをレスキューし、ヘルパーファージ感染細胞を０．２５ｍＭのＩＰＴＧを含む培地中で２２℃で一晩培養することを除いて、主に（Krebs et al., 2001）に記載されているとおりに増幅した。
非常に強力な結合剤において得られる最も成功したパニングアプローチは、ビオチン化ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃにおいて行われた第１および第３ラウンドならびにｈｕＳｋＭＣにおいて行われた第２のラウンドを有する示差的パニングであることを証明した。
配列決定後、Ｆａｂを発現および精製のために選択し、最も有望なさらなる特徴付けを行った。
多数の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、単一において低い二桁のナノモル範囲までのＥＣ５０値でｈＡｃｔＲＩＩＢ−トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞に結合することを示した。いくつかのＦａｂは、ミオスタチン結合阻害ＥＬＩＳＡにおいてＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃからミオスタチンに移動するが、それらのうちのＭＯＲ０８０６７のみが、レポーター遺伝子アッセイにおいてミオスタチン誘導活性の完全阻害を示した（図２）。
ヒトおよびマウスＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃに対する多数の有望なＦａｂの要約された親和性を以下の表に記載する（表１）。
Figure 0005766179
 表１：ＡｃｔＲＩＩＢ抗原に対する抗ＡｃｔＲＩＩＢ Ｆａｂ−ＦＨの親和性データ
ＦａｂクローンＭＯＲ０８０６７は、ミオスタチン誘導ＲＧＡならびにｒｈＡｃｔＲＩＩＢをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への結合における良い阻害を示した。Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性測定は、１００ｐＭ未満のヒトおよびマウスＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃに対するＫＤ値を示した。ＭＯＲ０８０６７および他の候補物をクロスクローニングアプローチによりさらなる最適化のために選択し、可能性のあるＮ−連結グリコシル化部位を含むＭＯＲ０８０６７を、また、脱グリコシル化アプローチに付した。
第１の親和性成熟由来の抗体の最適化
ａ）ＭＯＲ０８０６７の脱グリコシル化
配列分析にしたがって、この抗体は、重鎖のＣＤＲ−Ｈ２内に可能性のあるＮ−連結グリコシル化部位を含んだ。この部位を除去し、ＭＯＲ０８１５６およびＭＯＲ０８１５９を得た。これらのＭＯＲ０８０６７−誘導体の特性化は以下に記載されている。
ｂ）最適化されたＦａｂのクロスクローニング
さらなる機能性改善およびＣＤＲ−Ｈ２および／またはＣＤＲ−Ｌ３における可能性のあるＮ−連結グリコシル化部位の除去のために、第１の親和性成熟による単一の親和性成熟Ｆａｂ由来の独立して最適化されたＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｌ３領域を組み合わせたが、それぞれのファミリーは独立し続けている。ＭＯＲ０７０７９の子孫をクロスクローニングに入れた。約２００の細菌溶解物をＨＥＫ２９３Ｔ／１７／ＡｃｔＲＩＩＢにおけるＦＡＣＳ親和性ランキングにおいて試験し、最も有望なＦａｂクローンのＭＯＲ０８１４４およびＭＯＲ０８２１３を発現し、精製した。
ｃ）最適化された抗体の特性化
以下のセクションにおいて、ＭＯＲ０８０６７の脱グリコシル化子孫（ＭＯＲ０８１５６、ＭＯＲ０８１５９）およびＭＯＲ０８０６７由来の２つのクロスクローン（ＭＯＲ０８１４４およびＭＯＲ０８２１３）を、詳細に記載する。
レポーター遺伝子アッセイにおけるミオスタチンシグナル伝達を阻害する最適化されたＦａｂの能力を、最も高い濃度で＞９５％阻害を誘導することができる全ての結合剤で測定した（図３）。
Ｂｉａｃｏｒｅを使用する親和性測定実験において、ＭＯＲ０８１５９およびＭＯＲ０８２１３を、ヒトおよびマウスＡｃｔＲＩＩＢの両方への非常に強力な結合剤として同定した（表２）。成熟され最適化されたＦａｂの親和性の増加が、ミオスタチン誘導レポーター遺伝子アッセイにおける有効性の増加を反映することは明らかになった。
Figure 0005766179
 表２：ＡｃｔＲＩＩＢ抗原に対する抗ＡｃｔＲＩＩＢ Ｆａｂの親和性データ
親和性成熟Ｆａｂ（第１の成熟）のＩｇＧ２変換
第１の親和性成熟由来の多数の有望なＦａｂをＩｇＧ２変換について選択した。
ＩｇＧ２発現をＨＫＢ１１細胞の一過性トランスフェクションにより行い、全長免疫グロブリンを細胞培養物上清から精製した。
ＩｇＧへ変換されたとき、全ての候補物は、レポーター遺伝子アッセイにおいてミオスタチン誘導活性を用量依存的に阻害する能力を維持していた（表３）。
Figure 0005766179
 表３：ミオスタチン誘導ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおける抗ＡｃｔＲＩＩＢ ＩｇＧのＩＣ５０決定
ＭＯＲ０８１５９およびＭＯＲ０８２１３がヒト初代筋芽細胞へ結合する能力をＦＡＣＳにより試験し、それらの細胞への特異的結合を、これらの細胞上のＡｃｔＲＩＩＢの低い発現に沿って報告した（図４）。
ＭＯＲ０８１５９およびＭＯＲ０８２１３は、初代骨格筋芽細胞分化のミオスタチン誘導阻害を完全に逆転する能力を示した（図５）。これらの抗体は、また、内因的に生産されたＡｃｔＲＩＩＢリガンドを中和する能力によって、外因性ミオスタチンの非存在下で分化の上記基底レベルを増加させた。
第２の親和性成熟
有効性をさらに改善する第２の親和性成熟のための候補物の選択
ｉ．ＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ２成熟ライブラリーの構築
選択された抗体フラグメント（例えば、ＭＯＲ０８０６７）の親和性および生物学的活性の両方を増加させるために、ＣＤＲ−Ｌ１およびＣＤＲ−Ｈ２領域をトリヌクレオチド指向変異誘発（Virnekas et al.［上記］）を使用するカセット変異誘発により最適化し、それにより、フレームワーク領域は定常を維持した（Nagy et al.［上記］）。成熟ライブラリーのクローニングの前に、全ての親Ｆａｂフラグメントを、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を介して、発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９からＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ成熟ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２５に移した。
全ての成熟ライブラリーのサイズは、いつも、最低限の１×１０７個の独立クローンを産生した。ベクター背景は、全ての場合において１％未満であった。単一のクローンの配列決定による品質管理は、高品質のそれぞれのライブラリーを示した。
ＣＤＲ−Ｌ１およびＣＤＲ−Ｈ２成熟ライブラリーのそれぞれについて、抗体提示ファージを作製し、ファージ力価をスポット滴定により決定した。
ｉｉ．改善された抗体に対するパニング戦略、親和性の順位付けおよびスクリーニング
親和性成熟の第２のラウンドのための示差的パニングは、親ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞および低レベルで内因的にヒトＡｃｔＲＩＩＢを発現するｈｕＳｋＭＣを含んだ。さらに、組換えビオチン化ｈＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ抗原は、全てのパニング戦略において含まれた。
抗ＡｃｔＲＩＩＢ Ｆａｂの順位付けのために、約２７００個の細菌溶解物（それぞれのパニングサブコードに対して〜８８クローン）を、ＭＳＤベース方法において、組換えビオチン化ｈＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ抗原およびｈＡｃｔＲＩＩＢをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞の膜小胞調製物における親和性を順位付けした。高親和性順位付け因子でのヒットを並べた。
加えて、ヒットとして表れなかったランダムに選択されたクローンを、ＦＡＣＳ親和性順位付けにおいて評価した。このために、細菌溶解物を、親ＨＥＫ２９３Ｔ／１７および／またはｈＡｃｔＲＩＩＢをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を使用してスクリーニングした。細胞結合Ｆａｂをフィコエリトリン−接合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体で検出した。溶解物におけるＦａｂ発現の定量化を並行して行った。
全てのパニング戦略は、抗ＡｃｔＲＩＩＢ特異的抗体を生じた。ＭＯＲ０８０６７子孫は、配列分析後に同定することができた。全ての結合剤は、ＣＤＲ−Ｈ２において変異させた。
ＩｇＧ２変換およびＩｇＧ２の特性化（第２の成熟）
再び、第２の親和性成熟由来の最も有望なＦａｂを、ＩｇＧ２変換のために選択した。ＩｇＧ２発現をＨＫＢ１１細胞の一過性トランスフェクションにより行い、全長免疫グロブリンを細胞培養物上清から精製した。
試験された全てのＩｇＧは、初代骨格筋芽細胞分化のミオスタチン誘導阻害を完全に逆転させることができる（表４）。
Figure 0005766179
 表４：骨格筋分化アッセイのミオスタチン誘導阻害における抗ＡｃｔＲＩＩＢ ＩｇＧのＩＣ５０決定
我々は、初代ヒト骨格筋芽細胞におけるＡｃｔＲＩＩＢｈｗのミオスタチンならびに他のＴＧＦβファミリーリガンドの結合を中和する抗ＡｃｔＲＩＩＢ Ａｂの能力を評価した。筋芽細胞分化アッセイにおいて、我々は、非存在またはＭＯＲ０８１５９またはＭＯＲ０８２１３のいずれかの存在下で分化を阻害する可能性のある種々のリガンドを評価した。
Figure 0005766179
 表５：ＭＯＲ０８１５９／ＭＯＲ０８２１３（１０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下での骨格筋分化アッセイの種々のリガンド誘導阻害のＩＣ５０およびＥｍａｘ決定
ミオスタチンおよびＧＤＦ−１１は、同様の有効性で、同様の程度でヒト筋芽細胞分化を阻害することができる。単一の濃度のＭＯＲ０８１５９またはＭＯＲ０８２１３の存在下で、ミオスタチンおよびＧＤＦ−１１用量応答を同じ方法で移動させた。アクチビンＡは、また、分化を阻害することができるが、しかしながら、ＭＯＲ０８１５９またはＭＯＲ０８２１３の存在下で、我々は、Ｅｍａｘおよび効力における変化を伴う非平行移動を観察した。ＢＭＰ−２応答はＭＯＲ０８１５９またはＭＯＲ０８２１３の存在により影響せず、それがＡｃｔＲＩＩＢ結合を介して生じないことを示唆した。
インビボでのマウス試験における抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の特性化
筋肉肥大を誘導する抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の能力を、週毎に１０ｍｇ／ｋｇｉ．ｐで６週間、ＭＯＲ０８１５９またはＭＯＲ０８２１３を投与したＳＣＩＤマウスにおいて評価した（図６）。
両方の抗体は、試験終了時に全ての試験された筋肉の大規模な肥大を誘導することができた。抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体で処置されたマウスの全体重における有意な増加が、処置の１週間後と早期に検出された。
ＭＯＲ０８２１３は、５および２５ｍｇ／ｋｇで全ての試験された筋肉の用量依存に大規模な肥大を誘導することができたが、有意な変化は１ｍｇ／ｋｇ用量で現れなかった（図７）。
交差阻止試験
安定なヒトＡｃｔＲＩＩＢをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（５０ＩＥ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭに維持した。細胞を３７℃で５％のＣＯ２でインキュベーター中で増殖させ、３−４日毎に二次培養した。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅＴＭを使用して引き離し、次に新鮮な培地を含む新しいフラスコに移した。
ヒトＡｃｔＲＩＩＢの同じエピトープに結合する抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の能力を、ｈＡｃｔＲＩＩＢを発現する細胞を使用して、ＦＡＣＳにより評価した。
このために、抗ＡｃｔＲＩＩＢ ＩｇＧを、ウェル当たり１×１０５個のｈＡｃｔＲＩＩＢ−トランスフェクトされた細胞と１時間４℃とインキュベートした。洗浄後、異なるビオチン化抗ＡｃｔＲＩＩＢ ＩｇＧまたはコントロールビオチン化ＩｇＧを、１時間４℃で第１の抗ＡｃｔＲＩＩＢ ＩｇＧと等モル濃度でインキュベートした。洗浄後、細胞結合ビオチン化ＩｇＧをストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で検出した。４℃で１時間インキュベーション後、該細胞を再び洗浄し、ＦＡＣＳバッファーで再懸濁し、該細胞の蛍光強度をＦＡＣＳＡｒｒａｙＴＭ装置で決定した。
ＭＯＲ０８１５９およびＭＯＲ０８２１３を、ＦＡＣＳによりヒトＡｃｔＲＩＩＢをトランスフェクトされた細胞へ共同で結合する能力について試験し、ＭＯＲ０８１５９のみ（太い黒線）またはＭＯＲ０８２１３の存在下でのＭＯＲ０８１５９（太い点線）の特異的な結合を、アイソタイプコントロール（黒線）またはＭＯＲ０８２１３の存在下でのアイソタイプコントロール（点線）と比較して報告した（図８）。
ＭＯＲ０８２１３の存在下で、ＭＯＲ０８１５９の結合は有意に減少し、これら２つの抗体が、同じ部位、または、ある程度の重複を有し得るか、もしくは近くの部位であるが異なっているＭＯＲ０８２１３の結合がＭＯＲ０８１５９の結合を立体的に妨げ得る部位のいずれかに結合をすることが示唆された。
エピトープマッピング
いくつかの相補的方法を、抗体ＭＯＲ０８１５９が結合するエピトープを決定するために使用した。この実施例において、残基番号付けは、全長ＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を基準にする（配列番号：１８１）。
ドットブロット
ＭＯＲ０８１５９エピトープのドットブロット分析を実施した。天然および変性（還元および熱変性）ＡｃｔＲＩＩＢでニトロセルロース膜上にスポットし、ＭＯＲ０８１５９でプローブし、標識化抗−ヒト抗体で検出した。天然ＡｃｔＲＩＩＢのみが減少しなかったが、熱変性ＡｃｔＲＩＩＢは検出された。該結果は、エピトープが立体構造エピトープであることを示した。
変異試験
ＡｃｔＲＩＩＢ（ａａ２１−１２０）の細胞外ドメインのライブラリーを変異性ＰＣＲにより産生し、変異体を大腸菌のペリプラズムにおいて発現した。ＭＯＲ０８１５９への約３０’０００（理論的なライブラリーサイズのわずか）のこれらの変異体の結合を、コロニーフィルタースクリーニングおよびウェスタン染色により試験した。１週間だけ示すか、またはＭＯＲ０８１５９への結合示さない変異体を、ＥＬＩＳＡによりさらに確認した。ＡｃｔＲＩＩＢ変異体の発現レベル（抗−Ｆｌａｇ抗体で検出される）およびＭＯＲ０８１５９結合を、野生型ＡｃｔＲＩＩＢと比較した。発現が野生型の少なくとも７５％であり、ＭＯＲ０８１５９への結合が２５％未満であったとき、変異がＭＯＲ０８１５９結合に関連するとみなした。明らかな構造の歪み（例えば、Ｓ−Ｓ架橋システインの変異であろうような）ではない単一点変異を有する変異体のみを考慮した。
ＭＯＲ０８１５９結合を防止する多数の変異体が位置Ｋ７５からＤ８１の範囲において見出され、この領域が抗体結合に対して重要であることを示した。位置Ｗ７８、Ｄ８０およびＤ８１での変異は、ＭＯＲ０８１５９結合を有意に減少させることを見出した。
環状ペプチドアレイ
ペプチドマイクロアレイで提示された抗原由来環状ペプチドの回収物を、興味ある抗体とインキュベートした。ペプチド抗体結合の決定を、ペプチドマイクロアレイを一次抗体、次に一次抗体のＦｃ部分に対する蛍光的に標識された二次抗体とインキュベートするＲｅｐｌｉＴｏｐｅ分析により実施した。数回の洗浄工程後、ペプチドマイクロアレイをマイクロアレイ遠心機を使用して乾燥させ、適当な波長セッティングで高分解能マイクロアレイスキャン系でスキャンした。
マイクロアレイは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｓｅｒへ交換されたＣｙｓ残基を有する）由来の環状ペプチドをそれぞれ示す３つのサブアレイからなり、これをスキャンした（ペプチドスキャンフォーマット１５／１２）。コントロール実験として、非関連抗体（ＡＣＥ１８５４３、アイソトープコントロール）、次に蛍光的に標識された二次抗体（Ｃｙ−５標識抗−ヒトＩｇＧ）とのインキュベーションを、偽陽性シグナルを決定するために実施した。さらに、標的抗体、次に蛍光的に標識された二次抗体でのインキュベーションを実施した。
抗体ＭＯＲ０８１５９（ＡＣＥ１９８１９）は、３つの試験されたペプチド（番号１８−２０）において見出された１つのエピトープを認識することを示した。
１８ ＩＥＬＶＫＫＧＳＷＬＤＤＦＮＳ （配列番号：１８３）
１９ ＶＫＫＧＳＷＬＤＤＦＮＳＹＤＲ （配列番号：１８４）
２０ ＧＳＷＬＤＤＦＮＳＹＤＲＱＥＳ （配列番号：１８５）
ＭＯＲ０８１５９が結合すると考えられるこれらのペプチドの共通する配列は、７６ＧＣＷＬＤＤＦＮＣ８４（配列番号：１８６）である。
より弱い結合特性を有する第２の領域も、この方法を使用して同定した。この第２の領域は、配列４９ＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷ６３（配列番号：１８７）を有する。
Ｘ線結晶学
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ ａａ２０−１２０およびａａ２４−１１７を発現した。加えて、ＭＯＲ０８１５９ ＦａｂおよびＦｖ領域を発現し、精製した（全ての発現は大腸菌において行った）。これらのタンパク質を使用して、４つのタンパク質複合体を調製し、精製し、結晶化した（ＭＯＲ０８１５９Ｆａｂ−ＡｃｔＲＩＩＢ ２０−１２０、ＭＯＲ０８１５９Ｆａｂ−ＡｃｔＲＩＩＢ ２４−１１７、ＭＯＲ０８１５９Ｆｖ−ＡｃｔＲＩＩＢ ２０−１２０、ＭＯＲ０８１５９Ｆｖ−ＡｃｔＲＩＩＢ ２４−１１７）。
遊離ＭＯＲ０８１５９ ＦａｂのＸ線構造を１．７８Å分解能で解析した。ＡｃｔＲＩＩＢ−ＬＢＤとのＦｖ複合体のＸ線構造を３．３５Å分解能で解析した。接触残基を決定するために標準３．９Å距離カットオフを使用して、配列７６ＧＣＷＬＤＤＦＮＣ８４が７８ＷＬＤＤＦＮ８３配列（配列番号：１８８）由来の主要な結合寄与を有する重要な領域であることを確認した。加えて、相互作用も、ペプチド領域４９ＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷ６３で見出した。
種々のエピトープマッピング実験に対する結果を図９に要約した。
ＳＥＴによる親和性の確認
抗原（ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン）の連続希釈物を、ＰＢＳ０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０中で調製し、抗体（ＭＯＲ０８１５９）をそれぞれの抗原濃度に加え、一定の抗体濃度に到達させた。１００μｌ／ウェルのそれぞれの希釈混合物をデュプリケートで９６−ウェル ポリプロピレンＭＴＰ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に分配した。アッセイバッファーをネガティブコントロールとして使用し、抗原を含まないサンプルをポジティブコントロール（Ｂｍａｘ）として使用した。プレートを密閉し、一晩インキュベートした。９６−ウェル Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ＭＴＰ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）をＰＢＳに希釈した２５μｌの０．１μｇ／ｍｌのマウスＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃでコーティングした。また、このプレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、抗原でコーティングされたＨｉｇｈ Ｂｉｎｄ ＭＴＰをＰＢＳ／０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。次に、プレートをＰＢＳ／５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡブロックした。洗浄工程を繰り返し、ポリプロピレンＭＴＰからの５０μｌ／ウェルの抗体抗原調製物を抗原でコーティングされたＨｉｇｈ Ｂｉｎｄ ＭＴＰに移した。Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ＭＴＰを室温で２５分インキュベートした。３回のさらなる洗浄工程後、アッセイバッファーで希釈された２５μｌの１μｇ／ｍｌ Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ−ｌａｂｅｌｅｄ ヤギ抗−ヒト−検出抗体（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）をそれぞれのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄後、５０μｌのＲｅａｄ バッファー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）をそれぞれのウェルに移した。電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを産生し、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００リーダー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）により検出した。
ＥＣＬ値を対応する抗原濃度に対してプロットした。ＫＤを、Piehler J, et al. (J Immunol Methods; 1997, 201(2): 189-206)により記載されているフィットモデルでプロットを合わせることにより決定した。
報告されたＫＤ値および標準偏差を、独立実験から得られた個々のＫＤ値から決定した。
これらの実験から、１．７３（±０．３１）ｐＭの解離平衡定数ＫＤに対する平均値をヒトＡｃｔＲＩＩＢに対して決定し、４３４（±２５）ｐＭの解離平衡定数ＫＤに対する平均値をＡｃｔＲＩＩＡに対して決定した。
本発明は例のみ記載されており、修飾が本発明の範囲および精神内に維持されると理解する。

Claims (21)

  1. 配列番号： ９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号：２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
    配列番号：３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
    配列番号：５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号：６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
    配列番号：７９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、
    抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体またはそれらの抗原結合断片。
  2. 配列番号：９３の可変軽鎖配列および配列番号：１０７の可変重鎖配列を含む、ＡｃｔＲＩＩＢ結合抗体またはそれらの抗原結合断片。
  3. （ａ）配列番号：１４６の重鎖配列および配列番号：１４１の軽鎖配列；または
    （ｂ）配列番号：１５６の重鎖配列および配列番号：１５１の軽鎖配列
    を含む、ＡｃｔＲＩＩＢ結合抗体またはそれらの抗原結合断片。
  4. 前記抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１〜３のいずれかに記載の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体またはそれらの抗原結合断片。
  5. Ｆｃ領域の変異を介して改変されたエフェクター機能を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体。
  6. 請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはそれらの抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
  7. 配列番号：１２１、１３５、１６１、１６６、１７１、または１７６の１つまたはそれ以上を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  8. １つまたはそれ以上の請求項６または請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むクローニングまたは発現ベクター。
  9. 請求項８に記載の１つまたはそれ以上のベクターを含む、宿主細胞。
  10. 請求項１−５のいずれかに記載の抗体またはそれらの抗原結合断片の生産のための方法であって、請求項９に記載の宿主細胞を培養し、該抗体またはそれらの抗原結合断片を単離することを含む方法。
  11. 請求項１−５のいずれかに記載の抗体またはそれらの抗原結合断片または請求項６または請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
  12. 薬学的に許容される希釈剤または担体をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. １つまたはそれ以上のさらなる活性剤をさらに含む、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
  14. 前記さらなる活性剤がＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２またはＩＧＦ−１もしくはＩＧＦ−２の変異体、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、それを活性化しないミオスタチンデコイタンパク質、ベータ２アゴニスト、Ｇｈｒｅｌｉｎアゴニスト、ＳＡＲＭ、ＧＨアゴニスト／模擬物またはフォリスタチンから選択される請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 医薬として使用するための、請求項１−５のいずれかに記載の抗体またはそれらの抗原結合断片、請求項６または請求項７に記載のポリヌクレオチド、または請求項１１−１４のいずれかに記載の医薬組成物。
  16. 筋骨格疾患または障害の処置のための医薬の製造における、請求項１−５のいずれかに記載の抗体またはそれらの抗原結合断片、請求項６または請求項７に記載のポリヌクレオチド、または請求項１１−１４のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
  17. 筋骨格疾患または障害の処置における使用のための、請求項１−５のいずれかに記載の抗体またはそれらの抗原結合断片、請求項６または請求項７に記載のポリヌクレオチド、または請求項１１−１４のいずれかに記載の医薬組成物。
  18. 前記筋骨格疾患または障害が、筋萎縮である、請求項１６に記載の使用。
  19. 処置される患者が、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２またはＩＧＦ−１もしくはＩＧＦ−２の変異体、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、それを活性化しないミオスタチンデコイタンパク質、ベータ２アゴニスト、Ｇｈｒｅｌｉｎアゴニスト、ＳＡＲＭ、ＧＨアゴニスト／模擬物またはフォリスタチンで以前に処置されている、請求項１８に記載の使用。
  20. 処置される患者が、高齢者であるか、または、無重力状態で過ごしている、請求項１８に記載の使用。
  21. ｐＢＷ５２４（ＤＳＭ２２８７４）によってコードされるＡｃｔＲＩＩＢ抗体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2426005T3 (es) * 2004-07-23 2013-10-18 Acceleron Pharma Inc. Polipéptidos del receptor ACTRII, procedimientos y composiciones
EP1855694B1 (en) 2005-02-09 2020-12-02 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense composition for treating muscle atrophy
EP3811965A1 (en) 2005-11-23 2021-04-28 Acceleron Pharma, Inc. Activin-actriia antagonists in use for promoting bone growth
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
US20100028332A1 (en) * 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
EP2599495A1 (en) 2007-02-01 2013-06-05 Acceleron Pharma, Inc. Activin-ActRIIa Antagonists and Uses for Treating or Preventing Breast Cancer
TW201940502A (zh) 2007-02-02 2019-10-16 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
KR20200054317A (ko) 2007-02-09 2020-05-19 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ＡｃｔＲⅡＡ 길항제 및 암 환자에서 골 생장을 촉진시키기 위한 이의 용도
TW201718635A (zh) 2007-03-06 2017-06-01 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
CA2699936A1 (en) 2007-09-18 2009-03-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
CA2729096C (en) * 2008-06-26 2020-04-28 Acceleron Pharma Inc. Methods for dosing an actriib antagonist and monitoring of treated patients
HUE051137T2 (hu) 2008-08-14 2021-03-01 Acceleron Pharma Inc GDF-csapdák
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
CA2997971A1 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Amgen Inc. Variants of activin iib receptor polypeptides and uses thereof
WO2010083034A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
ES2655877T3 (es) * 2009-04-27 2018-02-22 Novartis Ag Composiciones y métodos para aumentar el crecimiento muscular
US8178488B2 (en) 2009-06-08 2012-05-15 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
EP2440577A4 (en) 2009-06-12 2013-01-23 Acceleron Pharma Inc SHORTEN ACTRIIB FC FUSION PROTEINS
MX340451B (es) * 2009-09-09 2016-07-08 Acceleron Pharma Inc Antagonistas de actriib y dosificacion y usos de los mismos.
EP3260130B1 (en) * 2009-11-03 2021-03-10 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
US8710016B2 (en) 2009-11-17 2014-04-29 Acceleron Pharma, Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2821992A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CN103298832A (zh) 2010-11-08 2013-09-11 阿塞勒隆制药公司 Actriia结合剂及其用途
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
DK2726099T3 (en) * 2011-07-01 2018-11-05 Novartis Ag Method of treating metabolic disorders
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
HRP20220250T1 (hr) 2011-10-03 2022-04-29 Modernatx, Inc. Modificirani nukleozidi, nukleotidi i nukleinske kiseline, te njihove uporabe
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
WO2013063536A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-02 Acceleron Pharma, Inc. Actriib binding agents and uses thereof
US8765385B2 (en) * 2011-10-27 2014-07-01 Ravindra Kumar Method of detection of neutralizing anti-actriib antibodies
SI2780368T1 (en) 2011-11-14 2018-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. INGREDIENTS AND PROCEDURES FOR INCREASING PURE MASS AND MICROWAVE WITH SPECIFIC ANTAGONISING OF GDF8 AND / OR ACTIVITY A
SI2791160T1 (sl) 2011-12-16 2022-07-29 Modernatx, Inc. Sestave modificirane MRNA
US10039813B2 (en) 2012-02-07 2018-08-07 Massachusetts Institute Of Technology Use of antagonists of ghrelin or ghrelin receptor to prevent or treat stress-sensitive psychiatric illness
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
AU2013243952A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2013188448A2 (en) * 2012-06-11 2013-12-19 Amgen Inc. Dual receptor antagonistic antigen-binding proteins and uses thereof
WO2014030683A1 (ja) * 2012-08-21 2014-02-27 国立大学法人九州大学 貧血患者の貧血の要因を検出するためのバイオマーカー
EP2912462B1 (en) 2012-10-24 2019-08-07 Celgene Corporation Biomarker for use in treating anemia
US10195249B2 (en) 2012-11-02 2019-02-05 Celgene Corporation Activin-ActRII antagonists and uses for treating bone and other disorders
SMT202200337T1 (it) 2012-11-26 2022-09-14 Modernatx Inc Rna modificato al livello del terminale
PE20151612A1 (es) 2012-12-18 2015-11-19 Novartis Ag Polipeptidos estabilizados del factor de crecimiento tipo insulina
MX2015009901A (es) 2013-02-01 2016-04-06 Santa Maria Biotherapeutics Inc Administración de un compuesto de antiactivina a a un sujeto.
WO2014144231A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Massachusetts Institute Of Technology Use of antagonists of growth hormone or growth hormone receptor to prevent or treat stress-sensitive psychiatric illness
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2014172448A2 (en) * 2013-04-17 2014-10-23 Anaptysbio, Inc. Antibodies directed against activin receptor type ii (actrii)
TWI655207B (zh) 2013-07-30 2019-04-01 再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
AU2014307589A1 (en) * 2013-08-14 2016-02-11 Novartis Ag Methods of treating sporadic inclusion body myositis
EP3043789B1 (en) 2013-09-09 2020-07-08 vTv Therapeutics LLC Use of a ppar-delta agonists for treating muscle atrophy
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CA2926173A1 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Novartis Ag Insulin-like growth factor mimetics for use in therapy
US10323076B2 (en) 2013-10-03 2019-06-18 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
UY35874A (es) 2013-12-12 2015-07-31 Novartis Ag Un proceso para la preparación de una composición de proteínas pegiladas
EP3094751A4 (en) * 2014-01-14 2017-06-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Activin inhibitor response prediction and uses for treatment
JP2017510622A (ja) 2014-01-27 2017-04-13 ノバルティス アーゲー 筋萎縮を予測するバイオマーカー、方法および使用
TW201622746A (zh) 2014-04-24 2016-07-01 諾華公司 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
CN107135646B (zh) 2014-06-13 2022-03-15 阿塞勒隆制药公司 用于治疗溃疡的方法和组合物
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
HK1243940A1 (zh) 2014-11-06 2018-07-27 Scholar Rock, Inc. 抗原肌肉生长抑制素/潜在肌肉生长抑制素的抗体及其用途
WO2016090035A2 (en) * 2014-12-02 2016-06-09 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Modulators of activin and methods for modulating immune responses and t follicular helper cells
JP2018501307A (ja) 2014-12-03 2018-01-18 セルジーン コーポレイション アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト及び貧血を治療するための使用
TN2017000217A1 (en) 2014-12-08 2018-10-19 Novartis Ag Myostatin or activin antagonists for the treatment of sarcopenia
WO2016138099A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 Massachusetts Institute Of Technology Use of ghrelin or functional ghrelin receptor agonists to prevent and treat stress-sensitive psychiatric illness
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
IL255010B2 (en) 2015-04-15 2024-01-01 Regeneron Pharma Methods of increasing strength and functionality with gdf8 inhibitors
PT3286206T (pt) 2015-04-22 2021-04-01 Biogen Ma Inc Novas proteínas híbridas bloqueadoras de ligando actriib para tratar doenças de desgaste muscular
SMT202500263T1 (it) 2015-09-15 2025-09-12 Scholar Rock Inc Anticorpi anti-pro-miostatina/miostatina latente e loro usi
EP3359668A4 (en) 2015-10-09 2019-06-05 Sarepta Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING DUCHENNE MUSCLE DYSTROPHY AND ASSOCIATED ILLNESSES THEREOF
HK1254630A1 (zh) 2015-11-11 2019-07-26 Novartis Ag 肌抑素拮抗剂的用途、含有它们的组合及其用途
KR20180094110A (ko) 2016-01-08 2018-08-22 스칼러 락, 인크. 항-프로/잠재성 미오스타틴 항체 및 그의 사용 방법
CU20180088A7 (es) 2016-02-17 2019-05-03 Novartis Ag Anticuerpos anti tgfbeta 2
KR102866147B1 (ko) * 2016-03-10 2025-09-30 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈 타입 2 수용체 결합 단백질 및 이의 용도
WO2017177013A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Acceleron Pharma Inc. Alk7 antagonists and uses thereof
JP7138567B2 (ja) * 2016-04-27 2022-09-16 ノバルティス アーゲー 成長分化因子１５に対する抗体およびそれらの使用
KR102271635B1 (ko) * 2016-06-13 2021-07-06 스칼러 락, 인크. 미오스타틴 억제제의 용도 및 조합 요법
JP2019522658A (ja) 2016-06-22 2019-08-15 ノバルティス アーゲー 線維症の治療に使用するためのＷｎｔ阻害剤
CN110198743B (zh) * 2016-10-05 2023-07-18 艾科赛扬制药股份有限公司 用于治疗肾脏疾病的组合物和方法
JOP20190085A1 (ar) 2016-10-20 2019-04-17 Biogen Ma Inc طرق علاج الضمور العضلي ومرض العظام باستخدام بروتينات احتجاز مركب ترابطي actriib هجين حديثة
GB201620119D0 (en) 2016-11-29 2017-01-11 Pharmafox Therapeutics Ag Compounds
JOP20190152A1 (ar) 2016-12-21 2019-06-20 Novartis Ag مضادات الميوستاتين، الآكتيفين أو مستقبلات الآكتيفين للاستخدام في علاج السمنة والحالات ذات الصلة
DK3565592T5 (da) 2017-01-06 2024-09-02 Scholar Rock Inc Behandling af stofskiftesygdomme ved inhibering af myostatinaktivering
WO2018162931A1 (en) * 2017-03-10 2018-09-13 Ucl Business Plc Method relating to myostatin pathway inhibition
JP7339159B2 (ja) * 2017-03-24 2023-09-05 ノバルティス アーゲー 心疾患の予防および治療方法
EP3645564A1 (en) * 2017-06-28 2020-05-06 Novartis AG Methods for preventing and treating urinary incontinence
AU2019226551B2 (en) 2018-03-01 2025-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for altering body composition
US20220242956A1 (en) * 2019-05-30 2022-08-04 Acceleron Pharma Inc. Actrii-binding proteins and uses thereof
JP7663559B2 (ja) 2019-09-03 2025-04-16 ノバルティス アーゲー Ａｃｔｒｉｉ受容体拮抗薬を含む肝疾患または肝臓障害の治療
EP4200017A1 (en) 2020-08-20 2023-06-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for preventing and treating cardiac dysfunction and covid-19 with activin a antagonists
EP4279594A4 (en) * 2021-01-13 2024-11-27 Astellas Pharma Inc. BINDING OF MULTISPECIFIC ANTIBODIES TO ACTRIIA, ACTRIIB AND FN14
TW202323296A (zh) 2021-08-27 2023-06-16 美商維紗妮絲生物公司 組合療法
WO2023147309A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Reneo Pharmaceuticals, Inc. Use of ppar-delta agonists in the treatment of disease
WO2024014989A1 (ru) * 2022-07-14 2024-01-18 Общество с ограниченной ответственностью "БИОМЕД-РЕСУРС" Рекомбинантный белок gbd-actriib для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы
CA3265879A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Versanis Bio, Inc. ACTRII FIXED SINGLE-DOSE ANTIBODY TREATMENTS
TW202430247A (zh) 2022-12-22 2024-08-01 美商供石公司 肌肉生長抑制素活化之選擇性及強效抑制劑
WO2025027052A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Sixpeaks Bio Ag Antibody conjugates and fusion proteins
AR133979A1 (es) 2023-09-28 2025-11-19 Sixpeaks Bio Ag ANTICUERPOS DIRIGIDOS A ActRIIA Y ActRIIB
WO2025183966A1 (en) 2024-02-28 2025-09-04 Versanis Bio, Inc. Actrii antibodies with extended half life
WO2025245160A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Scholar Rock, Inc. Myostatin-selective inhibitors for treating metabolic disorders

Family Cites Families (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JPH02500329A (ja) 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
JP2989002B2 (ja) 1988-12-22 1999-12-13 キリン―アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ATE139258T1 (de) 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU8507191A (en) 1990-08-29 1992-03-30 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE69330523D1 (de) 1992-08-21 2001-09-06 Vrije Universiteit Brussel Bru Immunoglobuline ohne leichte ketten
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5444047A (en) * 1994-06-16 1995-08-22 Dipasquale; Gene Treatment of arthritic and post-surgical orthopedic conditions with Insulin-like Growth Factor-I
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP0969736B1 (en) 1996-05-20 2006-06-28 Novozymes A/S A method of obtaining protein hydrolysates
EP0938571B8 (en) 1996-10-28 2008-07-02 University of Lausanne Method for the oligomerisation of peptides
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
ATE319745T1 (de) 1997-05-21 2006-03-15 Biovation Ltd Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
WO1999006559A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6656475B1 (en) * 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US6696260B1 (en) 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
AU3672800A (en) 1999-04-09 2000-11-14 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
PT1144607E (pt) 1999-07-20 2009-04-22 Morphosys Ag Novos métodos para apresentar (poli)peptídeos/ proteínas em partículas bacteriofágicas através de ligações dissulfureto
CN1371416B (zh) 1999-08-24 2012-10-10 梅达里克斯公司 人ctla-4抗体及其应用
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
US7029872B2 (en) 2000-06-28 2006-04-18 Glycofi, Inc Methods for producing modified glycoproteins
US7060802B1 (en) * 2000-09-18 2006-06-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tumor-associated marker
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
ES2405944T3 (es) 2000-11-30 2013-06-04 Medarex, Inc. Ácidos nucleicos que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir de ratones transcromoscómicos transgénicos zadas
UY27087A1 (es) 2001-01-05 2002-06-20 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
JP2004532038A (ja) 2001-05-17 2004-10-21 ディヴァーサ コーポレイション 新規抗原結合分子の治療、診断、予防、酵素、産業ならびに農業各分野への応用とそのための新規抗原結合分子の作製とスクリーニングの方法
ATE430580T1 (de) 2001-10-25 2009-05-15 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
KR20050033563A (ko) * 2002-06-28 2005-04-12 센토코 인코포레이티드 포유동물 ｅｐｏ 모방 ｃｈ1 결실된 모방체, 조성물, 방법및 용도
AU2003277828B2 (en) 2002-10-29 2009-06-04 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
JP5110877B2 (ja) 2003-06-02 2012-12-26 ワイス・エルエルシー 神経筋障害を処置するための、コルチコステロイドと組み合わせたミオスタチン（ｇｄｆ８）インヒビターの使用
AU2005207003C1 (en) 2004-01-20 2013-06-13 Humanigen, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
US7575751B2 (en) 2004-04-27 2009-08-18 Research Development Foundation Activin-A mutants
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
ES2426005T3 (es) 2004-07-23 2013-10-18 Acceleron Pharma Inc. Polipéptidos del receptor ACTRII, procedimientos y composiciones
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound
US20060034831A1 (en) 2004-08-12 2006-02-16 Wyeth Combination therapy for diabetes, obesity and cardiovascular diseases using GDF-8 inhibitors
CA2538208A1 (en) * 2005-05-04 2006-11-04 Universite Laval Modulation of myostatin and use thereof in cell transplantation-based treatment of muscle disease
EP3327033A1 (en) * 2005-08-19 2018-05-30 Wyeth LLC Antagonist antibodies against gdf-8 and uses in treatment of als and other gdf-8-associated disorders
WO2007027957A2 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in leukemia signaling pathways
US8067562B2 (en) * 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
AU2006321906C1 (en) 2005-12-06 2014-01-16 Amgen Inc. Uses of myostatin antagonists
US8008074B2 (en) * 2006-03-20 2011-08-30 The Uab Research Foundation Compositions and methods for improving bone mass through modulation of receptors of PTH and fragments thereof
JP2009539805A (ja) 2006-06-09 2009-11-19 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 安定化されたインスリン様増殖因子ポリペプチド
US8097596B2 (en) * 2006-06-30 2012-01-17 Lakewood-Amedex, Inc. Compositions and methods for the treatment of muscle wasting
WO2008016314A1 (en) * 2006-08-03 2008-02-07 Orico Limited Myostatin antagonists
TW201940502A (zh) * 2007-02-02 2019-10-16 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
TW201718635A (zh) 2007-03-06 2017-06-01 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
ES2655877T3 (es) * 2009-04-27 2018-02-22 Novartis Ag Composiciones y métodos para aumentar el crecimiento muscular

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