JP5746469B2 - Ｄｎａによって導かれたナノ粒子凝集 - Google Patents

Description

本出願は、米国仮出願第60/849,451号（２００６年１０月４日出願）の利益を主張する。本出願はまた、米国仮出願第60/957,543号（２００７年８月２３日出願）の利益を主張する。これらの出願の夫々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

本発明は、米国エネルギー省によって授与された契約番号DE-AC02-98CH10886のもと、米国政府補助を受けてなされた。米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。

本発明は、ＤＮＡによって導かれた粒子凝集の分野に関し、とくに、ＤＮＡによって導かれた粒子凝集の三次元構造化に関する。

ＤＮＡベースのナノシステムの動態挙動を制御する能力は、センシング、ナノデバイス凝集化、および遺伝子送達における新興のナノ粒子アプリケーションに求められている。ＤＮＡベースの方法論は、ＤＮＡキャップされたナノ材料間の調整可能でプログラム可能なハイブリダイゼーションを利用する。このアプローチによって、凝集したナノ粒子の光学的および物理的特性に基づく高感度の検出システムならびにそれらの新規な融解／脱凝集特性に基づく検出の開発が可能になっている。

最近、金属（金、銀、プラチナ）のナノ粒子、半導体（ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳｅＺｎＳ）のナノ粒子、磁性（Ｆｅ_２Ｏ_３、ＦｅＰｔ）のナノ粒子の自己凝集は、２つのクラス、すなわち、有機溶媒に基づくシステムおよび水溶液に基づくシステムに分けられる。夫々のシステムは、その利点および欠点を有する。有機溶媒のシステムにおいて、ナノ粒子は、疎水性リガンド（アルカンチオール単層、ポリマー、多座リガンド）の高密度シェルでカプセル化されている。ナノ粒子のこのクラスの利点は、分野がより成熟していることであり、粒子が非常に安定し、表面でのナノ粒子の層ごとの凝集または溶液中の制御された会合のように多くの凝集ルートが実践されている。このクラスの欠点は、ナノ粒子表面でのアドレス可能な化学剤の欠如、厳しい有機溶媒環境（トルエン、ヘキサンなど）および調整可能な凝集後の構造化の欠如である。

対照的に、水溶液に基づくナノ粒子システムの使用は、成熟したものではなく、それには有機溶媒システムを超える利点があり得る。第一に、溶媒に関する環境の問題に悩まされず、第二に、該システムによって、生物学的に活性または生物学的に模倣された表面カプセル化を備えたナノ粒子の機能化が可能になる。例えば、ＤＮＡ、タンパク質、脂質および複数の成分の拡張された階層の自己凝集性質の能力は、人の合成能力に類がない。

メタ材料（metamaterials）は、自然に容易には観察されない例外的な特性を示す規則的なナノ合成物のクラスである。光学、磁性および医学分野におけるそれらの適用による利益を得るため、個々のナノ粒子から創出された三次元構造が求められている。リソグラフおよび従来の自己凝集アプローチを含む現在の方法は、制御可能な秩序および粒子−粒子距離を備えた三次元構造を組み上げるそれらの能力によって制限される。

三次元におけるナノ対象物の正確な位置付けおよび規則的な組織化、機能的デバイスおよび新たな磁性、プラズモニック（plasmonic）および光子材料の創出のカギは、ナノサイエンスの挑戦的で活発な開発フロンティアである。種々の自己凝集した秩序相が、幾何学的因子、電荷および双極子の微妙な相互作用および立体的相互反応の結果として、キャップされていないナノ粒子のバイナリー混合物に対して観察された。ナノ粒子凝集を導く生体分子を用いる代替的なアプローチは、粒子間距離および凝集体構造の調整能力によって、有利であるとされる。さらに、生体相互作用のアドレス化能力（addressability）によって、多重構成システムの合理的な創出が許容され、一方で、生体分子の構成の豊富なエネルギー的展望によって、動的な再構成システムの実現可能性が提示される、これらの特性のいくつかは、１次元および２次元にナノ対象物を位置付けるために用いられる設計されたタンパク質およびＤＮＡ骨格（scaffolds）を示している。ＤＮＡ機能化したマイクロおよびナノ対象物の挙動およびそれらの三次元の凝集は、広範囲な光学的、構造的および理論的研究の対象である。しかしながら、アドレス可能な生物学的相互作用を介した長距離三次元（３Ｄ）秩序化は、未だ捉えられていない。

概要
これらの核酸機能化システムが、より精巧な検出およびより複雑化の底上げ構造を可能にするため、その凝集動態の調整のためのプロトコールが有益である。加えて、かかる凝集を仕立てる能力ならびに環境的に良性の条件、すなわち水溶液のもと、実験を行う能力は、分野に非常に有益である。

凝集動態を制御することおよび生体相互作用を介して長距離三次元秩序を創出することの望ましさを認めることによって、いわゆる「バイオインスパイア（bio-inspired）」されたメタ材料、すなわち本発明のある態様が、それを生成するための材料および方法を提供する。

ある態様において、本発明は、ＤＮＡの部分的に相補的な配列によって機能化され、長距離秩序を有する２つのタイプの粒子の凝集体を提供する。これらの粒子は、ナノオブジェクト、マイクロオブジェクトまたは粒子の他の形態であってもよい。ある態様において、機能化された粒子は、実質的に相互作用せず、２つのタイプの互いに相補的である粒子のＤＮＡ配列の結合領域を有するＤＮＡの離れた配列で結合する。ある態様において、粒子は、約１ｎｍ〜約１００ｎｍの大きさ（dimension）を有するナノ粒子である。ある態様において、粒子は、約０．１μｍ〜約１００μｍの大きさを有するマイクロ粒子である。ある態様では、かかる凝集をなすための方法が記載されている。

ある態様において、２つのタイプの粒子は、それらの機能化したＤＮＡを介して相互作用し、凝集体を形成する。ある態様において、３つまたはそれ以上のタイプの粒子が凝集体の部分を形成する。ある態様において、凝集体はアモルファスである。ある態様において、凝集体は、長距離結晶性秩序（long-range crystalline order）を示す。いくつかの例示では、結晶性およびアモルファスの領域の両方を含み得る。

ある態様において、粒子凝集体の特性は、ＤＮＡ配列の相補的および非相補的セグメントの長さを選択することによって制御される。ある態様において、相補的および非相補的または「中性（neutral）」のＤＮＡの比率は、凝集体のある特性を制御するために特定される。ある態様において、制御される特性は、凝集体の融点、凝集体における粒子間の距離、凝集体の結晶単一性の程度、結晶構造などである。

ある態様によって、夫々のＤＮＡ配列の相互に相補的なセグメントに沿って結合し、ＤＮＡ配列の非相補的な中性のセグメントに沿って結合しない、少なくとも２つのタイプのＤＮＡキャップされた粒子を用いた長距離結晶性秩序を有するメタ材料を製造する方法が提供される。ある態様において、プラズモニック結晶が、粒子をキャップするＤＮＡの相互に相補的なセグメントによる結合領域に沿って結合し、ＤＮＡの中性セグメントの領域に沿って結合しない、同一または異なる材料の、２つまたはそれ以上のタイプの粒子を含むメタ材料から形成される。

本明細書に記載の方法によって製造されたメタ材料のある態様によって、結晶の約１０体積％未満を占める機能化された粒子を伴う極めて開放的な結晶構造が提供される。ある態様において、これらの開放的な構造は、触媒としてまたは触媒の基質として用いられる。

この文脈において、「中性」は、ＤＮＡ配列の相互作用しない性質を意味し、電荷の分配を意味しないと理解されるべきである。

要約である前述のことが、図面および後述する詳細な記載を参照してより理解され得る本発明のいくつかの面の詳細な記載に必要であることも理解されるべきである。

図１Ａおよび図１Ｂは、ナノ粒子のＤＮＡ媒介凝集の模式図を示す。 図２Ａおよび図２Ｂは、相補一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡキャッピングを伴うナノ粒子のＤＮＡ誘導自己凝集を示す概念図である。 図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、ハイブリダイゼーションの前後に、相補的および非相補的なｓｓＤＮＡキャッピングの両方を伴うナノ粒子間の凝集を示す概念図である。 図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃおよび図４Ｄは、異なった時間における凝集体に対する、典型的な紫外線可視分光光度法（ＵＶ−Ｖｉｓ）の漸進的変化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、および動的光散乱（ＤＬＳ）の結果、およびこれらに由来する動態プロットを示す。 図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃおよび図４Ｄは、異なった時間における凝集体に対する、典型的な紫外線可視分光光度法（ＵＶ−Ｖｉｓ）の漸進的変化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、および動的光散乱（ＤＬＳ）の結果、およびこれらに由来する動態プロットを示す。 図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃおよび図５Ｄは、８５％および９５％の中性ＤＮＡを含む凝集体の、動態プロフィール、ＤＬＳ結果、およびＴＥＭ写真図を示す。 図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃおよび図５Ｄは、８５％および９５％の中性ＤＮＡを含む凝集体の、動態プロフィール、ＤＬＳ結果、およびＴＥＭ写真図を示す。 図６は、ナノ粒子間のＤＮＡ結合の構造の模式図である。 図７は、Ｔｐｍでのアニーリング前およびアニーリング後のシステムに対する小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）パターンを示す。 図８は、図７に示された散乱パターンに対する抽出された構造因子Ｓ（ｑ）を示す。 図９は、ＳＡＸＳ写真図および凝集体融解温度をまたいだ加熱冷却サイクルを介して模式的に示したその構造変化とシステムＩＶに対して抽出された構造因子Ｓ（ｑ）を示す。 図１０は、結晶化されたシステムＩＶの構造決定を示す。 図１１は、ＤＮＡキャップされた金ナノ粒子のＴＥＭ写真図の典型的なセットおよび統計分析を含む。 図１２は、結晶形成後のシステムＩＶから収集された走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真図の典型的なセットを含む。 図１３は、結晶形成後のシステムＩＶから収集されたＴＥＭ写真図の典型的なセットを含む。 図１４は、プレアニーリングおよび結晶化状態におけるシステムＩＶの会合体の一連の融解プロフィールを示す。 図１５は、図１４に対応する一次導関数プロットを示す。 図１６は、７１℃でのシステムＩＶに対する散乱強度を示す。 図１７は、ＤＮＡ／金ナノ粒子ハイブリッドシステムにおいて形成された開放的なｂｃｃ格子を示す。 図１８は、加熱中のｓｙｓ−Ｌ３０の模式図および典型的な温度依存二次元（２Ｄ）ＳＡＸＳパターンおよび夫々の抽出された構造因子Ｓ（ｑ）を示す。 図１９Ａは、冷却中のｓｙｓ−Ｌ３０の温度依存ＳＡＳＸパターンを示す。 図１９Ｂは、冷却中の温度依存の最近接距離（nearest neighbor distance）を示す。 図１９Ｃは、空気中で乾燥後のｓｙｓ−Ｌ３０結晶のＳＥＭ写真図である。 図２０Ａは、ｓｓＤＮＡ−ＡｕＮＰｓの典型的なＴＥＭ写真図である。 図２０Ｂは、キャップしていないＡｕＮＰ、ｓｓＤＮＡ−ＡｕＮＰ−ＡおよびｓｓＤＮＡ−、ＡｕＮＰ−Ｂに対するＤＬＳ結果を示す。 図２１は、加熱中のｓｙｓ−Ｌ７０の典型的な温度依存２ＤＳＡＸＳパターンを示す。

詳細な説明
長距離秩序（long-range order）を有する構造へのナノ粒子の自己凝集は、粒子サイズに関する粒子間のポテンシャルおよびその範囲の形態ならびに凝集動態のコントロールによって決まる。ナノ粒子の凝集を媒介するためのＤＮＡの使用によって、これらのパラメータの質的調整が可能になり得る。ＤＮＡハイブリダイゼーションの接着エネルギーとＤＮＡ鎖の相互作用によって提供される立体反発との間のバランスは、長距離秩序化の形成および秩序相の多様性において役割を担い得る。このアプローチの実験的履行によって、システム凝集の動態およびオフセットを制御する粒子間の浸透圧の広範囲を提供する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の能力が示されている。これらの計算と研究にも拘わらず、ＤＮＡ媒介ナノ粒子凝集における長距離秩序化は未だ観察されていない。

ＤＮＡキャップされたナノ粒子のモデルシステムは、ハイブリダイゼーションが誘導する引力（attraction）および浸透圧反発力（osmotic repulsion）を制御するＤＮＡ構造とＤＮＡ媒介凝集における粒子の内部配置との間の依存性を全体的に調査するために用いられ得る。かかる凝集における構造進化をモニターする簡便な方法は、インサイチュ（in situ）でのシンクロトロン小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）を用いることである。本発明は、いくつかの面において、十分に定義された三次元（３Ｄ）結晶性粒子組織体の形成に必要なＤＮＡ設計および熱力学的経路を同定する。ある態様において、かかる構造は形成される。

図１〜５から分かるように、ＤＮＡの特性および組成は、自己凝集動態ならびに最終的に凝集した会合体サイズおよびナノ粒子の形態を最終的に制御するために用いられ得る。本発明の１つの態様において、キャップするＤＮＡのスペーサ配列は、会合を促進する相補配列をナノ粒子の界面から離して拡張(extend)するために、その相補配列とのハイブリダイゼーションを介して「剛性（rigid）」にされる。本発明のこの態様において、スペーサ配列は、キャップするＤＮＡの粒子結合の末端の近くに位置付けられる。スペーサ配列は、その相補体とハイブリダイズする場合、キャップするＤＮＡの会合促進配列は、もはやナノ粒子表面との相互作用がなく、よってハイブリダイゼーションおよび会合動態を促進する。

この態様の他の面は、スペーサ配列の剛性化を利用して会合したナノ粒子の粒子間距離を制御することに関する。スペーサ配列およびその相補体の長さを変えることによって、会合体中の粒子間距離を制御することができる。

本発明の他の態様において、中性の非相補的なＤＮＡは、キャッピング混合物に含まれている。会合促進相補ＤＮＡに関連する中性の非相補的なＤＮＡの量を変化させることによって、会合体のサイズおよびナノ粒子あたりの可能な結合数を制御することができる。この態様において、剛性化したスペーサ配列の使用によって、会合動態のさらなる促進が提供される。

図１Ａおよび図１Ｂは、従来のナノ粒子のＤＮＡ媒介凝集の模式図を示す。図１Ａにおいて、ナノ粒子Ａ（２）およびナノ粒子Ｂ（４）のＤＮＡ配列は、互いに相補的であり、混合すると粒子は自己凝集する。図１Ｂにおいて、ナノ粒子Ｃ（６）およびナノ粒子Ｄ（８）のＤＮＡは互いに相補的ではないが、クロスリンカー鎖（１３）の離れた部分と夫々相補的であり、これが自己凝集を誘導する。スキーム１（図１Ａ）において、ナノ粒子のセットは、相補的な一本鎖ＤＮＡで機能化されている。２つの粒子を一緒に混合すると、ＤＮＡ間にハイブリダイゼーションが起き、終局的に大きなスケールの会合が起きる。図１Ｂのスキーム２において、ナノ粒子のセットは、最初に非相補的なセットのＤＮＡで機能化されている。しかしながら、一本鎖片のＤＮＡ（１３）（それらの部分はＤＮＡの夫々に相補的である）を追加すると、クロスリンキングが起き、凝集が起きる。スキーム２に示した戦略は、生体診断においてその有用性によって、より一般的に用いられるルートである。これらのケースにおいて、クロスリンカー鎖（１３）は、濃度が分からないまたは配列の分からない標的鎖である。ＤＮＡで機能化されたナノ粒子の追加によって、クロスリンカーによって誘導された任意の会合が、その検出をもたらす。検出は、溶液に溶解した場合、ワインレッドであり、凝集した場合、より濃い赤または紫である金ナノ粒子自体の光学的特性に基づいている。

図１Ａにおいて、粒子Ａ（２）およびＢ（４）は、相補的な認識配列（３）および非相補的なスペーサ領域（５）を有する。これらの配列は、両方の粒子上で同じである必要はなく、異なる塩基配列の領域を含んでいてもよく、異なる長さであってもよい。それらはハイブリダイズして、スペーサ（１４）および相互に相補的な認識配列の結合によって提供される、リンカー（１２）によって形成された結合領域（１０）でハイブリッドを形成する。さらなるインキュベーションによって、結合したナノ粒子（ＮＰ）は会合体（１６）を形成し得る。図１Ｂは、２つの粒子、Ｃ（６）およびＤ（８）が相互に相補的ではない状況を示す。先と同様、それらは認識配列（７）およびスペーサ配列（９）を有する。これらの配列は、両方の粒子上で同じである必要はなく、異なる塩基配列の領域を含んでいてもよく、異なる長さであってもよい。この状況において、リンカー（１３）は、結合領域（１１）に沿って２つの粒子を結合することが求められる。ハイブリダイゼーションにおいて、リンカーは、スペーサ（１５）によってキャップされていないＮＰから遠ざけられる結合領域（１１）に沿って粒子に結合する。再度、結合したＮＰは、会合（１８）を形成し得る。

ＤＮＡ誘導される自己凝集を用いることの第二の新規な特性は、用いられるＤＮＡの配列、ナノ粒子間の結合数および局所の塩環境に依存する温度で融解するＤＮＡ結合の傾向である。これは、さらなる生体診断アプローチが、凝集融解温度だけでなく、ナノ粒子凝集を簡単に脱凝集する能力に基づいて開発されることを可能にする。この脱凝集は、これらのシステムの顕著な特性であり、類似の現象は、他のシステムにおいては見られない。ナノ粒子のＤＮＡ誘導される自己凝集を用いることの第三の利点は、複合体および拡張した構造を形成する、ＤＮＡのユニークな特性である。ＤＮＡ骨格化（DNA-scaffolding）として知られるこの分野において、ＤＮＡアドレス化能力およびプログラム化能力が、拡張した幾何学的および形態学的な形成を有効にする。

ナノ粒子を自己凝集するためのＤＮＡの使用におけるこれらの進展にも拘わらず、まだ多くの制限と技術的ハードルが存在する。これらのいくつかの制限には、ナノ粒子のインターフェースに対するＤＮＡの凝集阻害配位（assembly-interfering coordination）が含まれる。ナノ粒子表面は反応性が高く、一般的に正に荷電しているので、ＤＮＡは表面に強く吸着する。このことによって、ＤＮＡ配列がハイブリダイゼーションに向けられなくなり、不十分なナノ粒子凝集動態となる。これは、低いＤＮＡ被覆を用いるシステムに対してとくに当てはまる。本発明の１つの面は、この問題に、凝集を促進する相補ＤＮＡ配列をナノ粒子表面から離して拡張すること(extension)を通じて対処する。

自己凝集は、確かにＤＮＡハイブリダイゼーションによって誘導される一方で、凝集動態および会合サイズを制御することおよび最適化することの困難さは、まだ適用を制限している。したがって、凝集動態を増大させる能力は、生体診断に対するより短い検出時間を導くことができ、サイズ排除に基づいた広範囲の精製ステップなしに会合形態を制御する能力は、会合形態および空間の特性（粒子間の距離）ならびに会合融解特性の制御を助ける。したがって、本発明の他の面は、会合形態の促進された動態制御のシステムを提供する。

粒子の多様なタイプ（金属、半導体、磁性、誘電性およびそれらの組み合わせ）および形態（球形、棒状、２０面体、平面状、チューブ状など）は、３Ｄ秩序構造の部分を形成することができ、その凝集のプロセスにおいて用いることができる。ここで用いたように、特段の断りがない限り、「粒子」は、マイクロオブジェクト（マイクロスフェア、マイクロロッドなどを含む）およびナノオブジェクト（フラーレン、量子ドット、ナノロッド、ナノチューブなど）を含むと解釈すべきである。種々の長さのＤＮＡは、金属−ＤＮＡ結合（チオール−またはアミン−末端化ＤＮＡの修飾していないＡｕ、ＡｇまたはＰｔナノ粒子と化学吸着を介して、など）、有機クロスリンキング（アミン−、チオール−、カルボン酸−などで機能化したＤＮＡと、カルボン酸、アミン、チオール、ケトン、アルデヒドなどで表面機能化した粒子との間の化学的カップリングを介して）、バイオアフィニティー（生体機能化されたＤＮＡと生物学的に修飾した粒子との間の、タンパク質−タンパク質、ＤＮＡ−タンパク質、ＤＮＡ−ＤＮＡなどの特異的生物学的相互作用を介して）などを含む多数の機能化ルートを介してこれらの粒子に付着させることができる。

さらに、マイクロおよびナノオブジェクトの核酸機能化は、ＤＮＡ機能化に限定する必要はない。リボ核酸（ＲＮＡ）はＤＮＡよりむしろ、または共に、用いることができ、そのユニークな特性の利点を得る。同様に、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡよりもより安定的であり得、ＤＮＡ機能化粒子に苛酷過ぎる環境における使用を見出し得る。

ここで、ＤＮＡで導かれる粒子凝集およびそれらを作成する方法のいくつかの具体例を以下に続ける。例は、例示するのみで何ら限定するものではないことを理解すべきである。例えば、用いたＤＮＡ配列は、列挙されたものである必要はなく、所望の長さの相補体および非相互作用セグメントを伴う任意のＤＮＡ配列が用いられ得る。さらに、Ａ鎖およびＢ鎖の両方とも、全体に非相互作用であってもよく、離れた結合配列によってハイブリダイズし、連結し得る。スペーサおよびリンカー領域の長さおよび／または長さの割合は、記載されたものから変更してもよい。粒子材料の選択およびサイズは、得られたメタ材料の提案された適用に依存する。粒子ＡおよびＢは、とくに異なった材料、例えば、金および銀であってよく、材料のタイプ、例えば、金およびセレン化カドニウムであってさえもよい。３つまたはそれ以上の粒子タイプを凝集することができ、例えば、金−銀−プラチナまたは鉄−炭素−クロム−バナジウムであってよい。

例１：凝集動態の調整可能性
ナノ粒子合成：
金ナノ粒子（Ａｕ、９．６±０．６ｎｍ）を、わずかに改変したクエン酸塩（Ｃｉｔ）の還元法によって合成した。簡単には、熟成した１ｍＭ ＨＡｕＣｌ_４を、３０分間、約９５℃まで加熱した。この溶液に対し、温めた３８ｍＭクエン酸三ナトリウム溶液（１０ｍｌ）を１アリコート加えた。最初の色が赤に変化したら、次いで溶液をすぐに約８０℃まで冷却し、２時間アニールした。次いでサンプルを、一晩攪拌しながら室温まで自然放冷した。次いで溶液を遠心分離（３０分間、７，０００ＲＰＭ）で精製し、光から保護して所望の濃度で貯蔵した。典型的な実験において、Ａｕ粒子のサイズは、沸騰時間が長くなるにつれて増大した。Ａｕ濃度は、測定した吸光係数の１．０×１０^８Ｌ ｍｏｌｅ^−１ｃｍ^−１を介して算出した。

ＤＮＡナノ粒子の修飾：
チオール機能化一本鎖オリゴヌクレオチドのタイプ１（1 = 5'- TAC TTC CAA TCC AAT-(T)₁₅-C₃H₆-SH-3'）およびタイプ２（2 = 5'- ATT GGA TTG GAA GTA-(T)₁₅-C₃H₆-SH-3'）を、ジスルフィドとしてIDT, Inc.から購入した。典型的な実験において、サンプルは、最初に、凍結溶解したサンプル（２００〜３００ナノモル）を、３０分間、精製水またはバッファー中、０．３ｍｌの１００ｍＭジチオールスレイトール（ＤＴＴ）溶液に溶解することによって還元した。次いで、サンプルを新たに調製した架橋されたデキストランゲル（Sephadex（登録商標））カラムにロードし、２．５ｍｌの１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で溶出した。オリゴヌクレオチド濃度は、特定の吸光係数でＵＶ−Ｖｉｓ分析を用いて定量した。タイプ１およびタイプ２のｓｓＤＮＡに対する３’−チオール修飾は、モデル研究として選択したが、５’−チオール修飾もまた用いることができる。５’−チオール修飾（ＨＳＣ_６Ｈ_１２−ｓｓＤＮＡ）リンカー配列によって、３’−チオール修飾（ＨＳＣ_３Ｈ_６−ｓｓＤＮＡ）と比較した場合、ゲル電気泳動測定を用いて、金ナノ粒子の表面密度を増大させ得ることが最近明らかになった。１５塩基（１５ｂ）ポリｄＴスペーサは、サンプルの安定性および被覆（coverage）を改善するため、金インターフェースに対する低い配位が知られているため選択した。

次いで、高いＤＮＡ被覆の方法に続いて、合成したＡｕ粒子をオリゴヌクレオチド１または２で機能化した。典型的な実験において、５０〜３００μＭオリゴヌクレオチド溶液のアリコート（１〜５０μｌ）をＣｉｔ−Ａｕの精製水溶液（［Ｃｉｔ−Ａｕ］＝１０〜３０ｎＭ）に加えた。オリゴヌクレオチド／Ａｕの比率は、Ａｕの被覆を制御するために操作した。本実験において、該比率は、３００：１を維持した。オリゴヌクレオチド＋Ａｕ溶液を、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．１）に入れる前に、少なくとも１２時間、非緩衝液でインキュベートし、さらに室温で約４時間、アニーリングした。次いで、塩濃度は、最初、約６時間で０．１Ｍ ＮａＣｌ、最終的にさらに１２時間で０．３Ｍ ＮａＣｌに増大させた。オリゴヌクレオチド修飾Ａｕ（１−Ａｕ、２−Ａｕ）は、これらの高い塩濃度で、長期に安定的であった。溶液を３０分間、７，０００ＲＰＭでの遠心分離によって、過剰のＤＮＡを精製した。上清を集め、過剰のＤＮＡを測定し、濃縮された粒子を０．３Ｍ ＰＢＳに再分散させた。この洗浄プロセスは、典型的には、少なくとも３回繰り返した。このフィード割合で夫々のＡｕと結合したタイプ１またはタイプ２オリゴヌクレオチドの数（ｎ）は、蛍光およびＵＶ−Ｖｉｓ分析により、約５０（約２６．４ｐｍｏｌ／ｃｍ^２）と算出された。

サンプル調製：
本研究において、１−Ａｕおよび２−Ａｕの間の凝集（図２Ａのｓｙｓ−ＶＩＩ）は、攪拌しながら、等体積（２００μｌ）の１−Ａｕおよび２−Ａｕを等濃度（［Ａｕ］＝４．５〜７．５ｎＭ）で組み合わせることによって行った。ｓｙｓ−ＶＩＩＩ（図２Ｂ）において、１−Ａｕおよび２−Ａｕ前駆体の同一のスペーサセグメントを、０．３Ｍ ＰＢＳにモル比５００：１で、１５塩基オリゴ−ｄＡによって最初にハイブリダイズした。この比率は、ｎがナノ粒子あたり約５０の場合、表面結合１または２のおよそ１０倍過剰であることを考慮している。サンプルを一晩インキュベートし、ｄｓＤＮＡスペーサセグメントを形成し、１^＊−Ａｕおよび２^＊−Ａｕを得て、上記のように複数の遠心分離とバッファーでの洗浄によって、過剰なオリゴ−ｄＡを精製した。どのぐらいの量の利用可能なオリゴ−ｄＴスペーサ配列が、この過剰濃度のオリゴ−ｄＡによってハイブリダイズするかは、現在、決定されていない。最近の熱力学的調査によって、ナノ粒子表面での不飽和のハイブリダイゼーションが一般的であることが示されている。しかしながら、動的光散乱（ＤＬＳ）測定が理想的なモデルに近接したＤＮＡキャッピングの厚さの値を明らかにするので、おそらくスペーサ配列の多くの割合でハイブリダイズしている。比較目的のため、ｓｙｓ−ＶＩＩＩの凝集は、常に、通常の実験室での誤差パラメータ内で、同一のＡｕサイズ、ＤＮＡ被覆、溶液条件および濃度で行った。

この例は、表面結合ＤＮＡのコンフォメーション（conformation）を仕立てることによって達成される凝集動態の調整可能性を示すためのものである。用いたモデルシステムは、図２Ａおよび図２Ｂにおいて示されるように、一本鎖（ｓｓ）または部分剛性二本鎖（ｄｓ）スペーサ配列で相補的にキャップされた金ナノ粒子（Ａｕ、９．６±０．６ｎｍ）であった。Ａｕは、ＤＮＡ１（1 = 5'- TAC TTC CAA TCC AAT-(T)₁₅-C₃H₆-SH-3'）またはＤＮＡ２（2 = 5'- ATT GGA TTG GAA GTA-(T)₁₅-C₃H₆-SH-3'）の約５０の一本鎖でキャップし、夫々、１−Ａｕ（２０）および２−Ａｕ（２２）を形成した。第一の凝集システム（ｓｙｓ−ＶＩＩ）において、ｓｓＤＮＡキャッピングだけを用いた（すなわち、１−Ａｕ＋２−Ａｕ）。システム２（ｓｙｓ−ＶＩＩＩ）において、同じタイプの粒子、１−Ａｕおよび２−Ａｕを、最初に、そのオリゴ−ｄＴスペーサセグメント（(T)₁₅）で１５塩基オリゴ−ｄＡ鎖とハイブリダイズし、部分的にｄｓＤＮＡキャッピングの１^＊−Ａｕ（２４）および２^＊−Ａｕ（２６）を形成した。このハイブリダイゼーションによって、コイルされたｓｓＤＮＡから部分的に剛性のｄｓＤＮＡへのコンフォメーション変化がもたらされ、これが粒子インターフェイスから離れてＤＮＡ（１および２）の会合促進相補配列の拡張がもたらされ、Ａｕインターフェイスに対するコイル化の凝集阻害効果および配位を克服するのに寄与する。ｓｙｓ−ＶＩＩおよびｓｙｓ−ＶＩＩＩで形成された会合体（２８、３０）は夫々、異なるサイズまたは同じサイズであり得る。粒子１−Ａｕおよび２−Ａｕは、ｓｓＤＮＡで機能化しただけである。結合ＤＮＡ（３２）は、相互にハイブリダイズし、一方、中性ＤＮＡ（３６）はハイブリダイゼーションに関与しない。粒子１^＊−Ａｕ（２４）および２^＊−Ａｕ（２６）は、ハイブリダイゼーションに寄与しない中性（凝集プロセスにおいてハイブリダイズすることができない非相補的ＤＮＡ鎖）のｓｓＤＮＡ（３８）および部分的にハイブリダイズした部分的に剛性のＤＮＡ（４０）の両方で機能化されている。部分的に剛性の機能化ＤＮＡ（４０）は、キャップされていないナノオブジェクト表面からの結合領域から離れており、ｓｓＤＮＡに対するよりも、より大きな粒子間距離をもたらす。

ｓｙｓ−ＶＩＩおよびｓｙｓ−ＶＩＩＩにおける凝集によって、数千の個別のＡｕＮＰを含む大きな会合体の成長がなされる。これらの会合体の融解特性を特徴付けし、ｓｙｓ−ＶＩＩおよびｓｙｓ−ＶＩＩＩの夫々に対し、融解温度（Ｔｍ）が約５９℃および約６１℃であることが明らかになった。これらの結果は、ＡｕＮＰ間のＤＮＡ結合の証拠を提供し、ｓｙｓ−ＶＩＩおよびｓｙｓ−ＶＩＩＩの間の局所的な差異を示唆している。

これらを調査するために、本発明者らは、紫外線可視分光光度法（ＵＶ−Ｖｉｓ）でインサイチュでの自己凝集プロセスをモニターした。ＵＶ−Ｖｉｓは、Ａｕおよび凝集したＡｕナノ構造に関連し、多くの比色検出法の基礎となっている表面プラズモン（ＳＰ）共鳴バンドを探査する。図４は、事実上同一の条件および濃度での凝集の間測定された、ｓｙｓ−ＶＩＩ（Ａ）およびｓｙｓ−ＶＩＩＩ（Ｂ）のＵＶ−Ｖｉｓデータのセットを示す。凝集は、バンドを拡げること（５２５〜９００ｎｍ）を伴うＳＰバンド位置の赤方偏移および時間とともに減少する吸光によって、ＵＶ−Ｖｉｓにおいて明らかになる。

図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、異なる回の凝集体からの、典型的なＵＶ−Ｖｉｓ、ＴＥＭおよびＤＬＳの結果の発展およびそれらに由来する動態プロットを示す。ｓｙｓ−ＶＩＩ（図４Ａ）およびｓｙｓ−ＶＩＩＩ（図４Ｂ）における凝集に対する代表的なＵＶ−ＶｉｓおよびＴＥＭの結果は、１０分（ａ）、６０分（ｂ）、１８０分（ｃ）、３５０分（ｄ）および４８５分（ｅ）で測定した。図４Ａの会合体（５６）は、図４Ｂの会合体（５８）よりも全ての時間のステップにおいて同様にみられた。ここで用いた特定の溶液は、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．０（以下、０．３Ｍ ＰＢＳ）において、［１−Ａｕ］＝［２−Ａｕ］＝４．６ｎＭ、［１^＊−Ａｕ］＝［２^＊−Ａｕ］＝４．６ｎＭであった。Avrami近似（Avrami fitting）で５２５ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓによってモニターしたｓｙｓ−ＶＩＩ（Ｉ）およびｓｙｓ−ＶＩＩＩ（ＩＩ）の動態プロットは、図４Ｃに示す。キャップしていないＡｕ、１−Ａｕおよび１^＊−ＡｕのＤＬＳ結果を図４Ｄに表す。

最近、ＤＮＡ媒介凝集の光学特性の電気力学的シミュレーションは、図４Ａおよび４Ｂに似た変化を示す、成長する会合、時間とともに増加する吸光、および会合が数百の個々のＡｕを含む要件において、Ａｕのスクリーニングからの吸光スペクトルへの大きな貢献を明らかにする。実験システムにおいて、会合はまた、長い凝集時間の沈降に続く。ｓｙｓ−ＶＩＩ（図４Ａ）において、凝集の最初の１時間は、ＳＰバンドの変化がほとんど観察できないことが分かる（ａ〜ｂ）。約８時間にわたり、表面プラズモン共鳴バンド（ＳＰバンド）は、顕著な吸光減少を伴い、５２５ｎｍから５３３ｎｍの波長で赤方偏移している（ｃ〜ｅ）。ｓｙｓ−ＶＩＩのこれらの変化は、１−Ａｕおよび２−Ａｕの間の比較的非効率なハイブリダイゼーションおよびゆっくりとした会合の成長の結果である。

これに対し、図４Ｂは、ｓｙｓ−ＶＩＩＩの増大されたＵＶ−Ｖｉｓの進行を示し、ｓｙｓ−ＶＩＩとの２つの主要な差異を示す。第一に、即時の約５３５ｎｍへの赤方偏移（ａ）に続き、１時間後の継続的な赤方偏移と拡がりがある（ｂ）。第二に、長い反応時間での吸光の減少が、より高い割合で進行する（ｃ〜ｅ）。これらの光学的変化は、凝集動態がより速いことおよび会合サイズがｓｙｓ−ＶＩＩよりｓｙｓ−ＶＩＩＩにおいてより大きいことの両方が示唆される。

会合サイズおよび形態を調査するため、対応するＵＶ−Ｖｉｓスペクトルからのサンプルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の結果もまた図４Ａおよび４Ｂに示す。凝集の間の会合サイズ増大の傾向が、与えた凝集時間に対し、より大きな形態を示すｓｙｓ−ＶＩＩＩの会合で、明確に観察される。これらの会合体のそれらの変性バッファー環境における構造の詳細を探査するため、本発明者らは、シンクロトロン放射を伴うインサイチュでの小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）を利用した。ＳＡＸＳの結果は、５０℃でのアニーリングの後、１１〜１２ｎｍの凝集した会合体の粒子間距離を明らかにし、ｓｙｓ−ＶＩＩＩが一貫して、ｓｙｓ−ＶＩＩに対し、０．５〜１．０ｎｍのより大きな粒子間距離を示した。

ｓｙｓ−ＶＩＩおよびｓｙｓ−ＶＩＩＩにおける凝集プロセスをさらに評価するため、続く、５２５ｎｍでのＳＰバンドで動態をモニターした（図４Ｃ）。動態プロットは、吸光度において緩やかな減衰を描き、それはｓｙｓ−ＶＩＩＩでより顕著である。さらなる波長での動態プロフィールは、同様の傾向を示す。これらの動態プロフィールを質的に対照させるため、本発明者らは、核形成と成長のAvrmiの法則を用いて、それらについて記載した。５２５ｎｍのＳＰバンドが主として個々の粒子および比較的小さな会合体（数百のＡｕＮＰ）に起因することを仮定すると、
Ａｂｓ＝Ａｂｓ_０ｅｘｐ（−（（ｔ−ｔ_０）／τ）^ｎ）
（式中、ｔは、凝集時間であり、ｔ_０は、反応開始時間であり、τは、反応速度および会合体形状に依存する特定時間であり、ｎは、会合体の成長の物理的メカニズムに依存するAvrami指数である）のようにパラメータ化することができる。上記のとおり、この記載が、吸光に影響する種々の因子を分離しない一方、観察された効果の合理的な記載を提供する。図４Ｃにおける動態プロットをフィッティングすることによって、本発明者らは、ｓｙｓ−ＶＩＩおよびｓｙｓ−ＶＩＩＩの夫々に対し、τが５６８分および３２８分、ｎが２．２および２．４であることを決定した。ｓｙｓ−ＶＩＩＩのτの減少は、増大した凝集速度を示し、その一方で、ｎの大きさは一定でない反応速度を示唆し、これは成長した会合体の拡散の制限された成長および合体に起因することが可能である。τの大きさは、Ａｕ濃度並びにＤＮＡ表面密度に影響されるが、しかしながら、ｓｙｓ−ＶＩＩＩ＞ｓｙｓ−ＶＩＩのような動態の傾向は、常に観察された。ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡキャッピングの等量の混合物を用いた場合、中間体のτが４９２分であることが観察されることが着目されて興味深い。

観察された動態の増大（約２倍）は、ＤＮＡキャッピングの加えられた剛性に起因するかもしれず、それは会合を促進する相補配列をＡｕインターフェイスから離れて拡張する。この効果をモデル化するため、ＤＮＡキャッピングの厚さ（Ｔ）を、各システムにおける粒子に対し概算した（図２）。ｓｙｓ−ＶＩＩにおけるナノ粒子のＴ（Ｔ_１）は、
Ｔ_１＝Ｔ_１ ^Ｃ、約６ｎｍ
（式中、Ｔ_１ ^Ｃは、ミミズ鎖モデル（worm-like chain model）として記載される３０塩基ランダムコイルオリゴヌクレオチドの両端間距離（end-to-end distance）である）としてモデル化した。ｓｙｓ−ＶＩＩＩにおけるナノ粒子のＴ（Ｔ_２）は、
Ｔ_２＝Ｔ_２ ^Ｒ＋Ｔ_２ ^Ｃ、約９ｎｍ
（式中、Ｔ_２ ^Ｒは、剛性ｄｓＤＮＡ１５塩基対スペーサセグメントの長さであり、Ｔ_２ ^Ｃは、残りの１５塩基オリゴヌクレオチドの両端間距離である）としてモデル化した。この近似から、本発明者らは、ｓｙｓ−ＶＩＩＩ対ｓｙｓ−ＶＩＩにおいて、単離されたナノ粒子に対し、約３ｎｍのＴの増大を期待することができる。

Ｔにおける実際の変化を測定するためにＤＬＳを利用した。図４Ｄは、単離したキャップされていないＡｕ、１−Ａuおよび１^＊−ＡｕのＤＬＳの結果を示し、これにより流体力学直径の値（Ｄ_ｈ）が、夫々、約１０．１、約２１．０および約２８．１ｎｍであることが明らかになった。これらの値は、夫々、ｓｙｓ−ＶＩＩおよびｓｙｓ−ＶＩＩＩについて、Ｔが約５．５ｎｍおよび約９．０ｎｍに対応する。単離したナノ粒子のＴにおけるこの約３．５ｎｍの増大は、概算した差異に接近しており、凝集した会合体のｓｙｓ−ＶＩＩＩにおける増大した粒子間距離を示すＳＡＸＳの結果が得られ、ハイブリダイズした配列をインターフェイスから拡張することによって、より好ましい凝集条件の原因になるとの結論を補強する。

ＤＮＡキャッピング構造の剛性の増大によって、ナノ粒子のインターフェイスから離れた会合促進相補配列の拡張を可能にし、増大した凝集動態を容易にし、凝集した会合体の粒子間距離の増大の手段を提供する。このアプローチによって、より複雑化したＤＮＡキャップされたシステムを一般化することができ、これにより、設計によるナノ構築における潜在的な用途を有し得る。

計算：
ナノ粒子インターフェイスでのＤＮＡキャッピングの厚さ（Ｔ）を概算するため、本発明者らは、ＤＮＡの平均二乗両端間距離（mean square end-to-end distances）（＜Ｒ^２＞）を概算した。ｓｓＤＮＡキャッピングの場合、厚さ（Ｔ）は、Ｔ_１＝Ｔ_１ ^Ｃ、約６ｎｍと概算され、ここで、Ｔ_１ ^Ｃは、

の（＜Ｒ^２＞）^０．５で概算され、式中、Ｐは持続長（persistence length）（約１ｎｍ）であり、ＬはｓｓＤＮＡの場合（ｓｙｓ−ＶＩＩ）の輪郭長（contour length）（約０．６５ｎｍ／塩基）である。ｄｓＤＮＡキャッピングの場合（ｓｙｓ−ＶＩＩＩ）、Ｔ_２＝Ｔ_２ ^Ｒ＋Ｔ_２ ^Ｃ、約９ｎｍであり、Ｔ_２ ^Ｒは、１５塩基対二重らせん（０．３４ｎｍ／塩基）の概算される長さであり、付加的な１５塩基Ｔ_２ ^Ｃは、前記のとおり計算した。これらの理想化された概算において、これらの効果の固有の量的インプリメンテーションが、該システムにむしろ困難であることから、鎖−鎖、鎖−表面の相互作用は考慮しなかった。しかしながら、かかる相互作用は、単にＤＮＡキャッピングの厚さの絶対値を変化させるだけで、Ｔ_２がＴ_１よりも長いという全体的な結論に影響することはない。Ａｕインターフェイスから離れたリンカーセグメントの物理的拡張のほか、金表面の減少した配位など、かかる変化は、ＤＮＡキャッピングにおける多数の空虚な空間を開放することができ、これによりハイブリダイゼーションを促進し得る。

動態モデル：
研究したシステムの間の凝集動態における差異の定量は、核形成の成長に対するAvramiの法則を用いた動態プロットによって記述し得る。この記述において、ＤＮＡ機能化ナノ粒子の会合体の等方的成長は、体積フラクション
χ＝１−ｅｘｐ（−（（ｔ−ｔ_０）／τ）^ｎ）
（式中、ｔは、時間であり、ｔ_０は、反応開始時間であり、τは、反応速度および会合体形状に依存する特定時間であり、ｎは、会合体の成長の物理的メカニズムに依存するAvrami指数である）を備えた新たな変換相の形成が導かれる等温反応である。したがって、５２５ｎｍでの吸光が、主として個々の粒子および比較的小さな粒子クラスタ（数百個未満のＡｕ粒子）に起因することができ、吸光度Ａおよび粒子もしくは小さなクラスタの定数Ｃとの間の比例、すなわち動的プロットは、
Ａ＝Ａ_０ｅｘｐ（−（（ｔ−ｔ_０）／τ）^ｎ）
（式中、Ａ_０は、Ｃと直接関連する）
として、パラメータ化することができる。このパラメータ化が、吸光に影響を与える種々の因子を分けない一方、前記のとおり、観察された結果の合理的な記述を提供する。

器械類：
この例における測定は、次の器械類を用いて行った。この詳細は、任意の特別な製造者への注意書きのためより、具体的な例を用いることによって提示された明瞭さのために提供され、同様の能力の任意の器械類が用いられ得る。

紫外線可視分光光度法（ＵＶ−Ｖｉｓ）：
ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、Perkin-Elmer Lambda 35 spectrometer（２００〜９００ｎｍ）で収集した。融解分析は、Perkin-Elmer PTP-I Peltier Temperature Programmerとともに行い、攪拌しながら、２０℃〜７５℃の間を１℃／分の温度傾斜で行った。

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）：
ＴＥＭ写真図は、１２０ｋＶで操作したJEOL-1300顕微鏡で収集した。サンプルは、炭素被覆した銅グリッドの上へ、ナノ粒子または凝集の水溶液を滴下し、続いて、５分後にろ紙で過剰な溶液をゆっくりと除去して調製した。

高分解能透過型電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）：
ＨＲＴＥＭ写真図は、ブルックヘブン国立研究所（Brookhaven National Laboratory Center）の機能性ナノマテリアル電子顕微鏡施設（Functional Nanomaterials Electron Microscopy Facility）で、４００ｋＶで操作されたJEOL-4000 EX顕微鏡で収集した。サンプルは、炭素被覆した銅グリッドの上へ、水溶液を滴下し、続いて、５分後にろ紙で過剰な溶液をゆっくりと除去して調製した。

動的光散乱（ＤＬＳ）：
ＤＬＳの結果は、Malvern Zetasizer ZS装置を用いて測定した。該装置は、６３３ｎｍレーザー源および１７３°での後方散乱検出器を装備している。データは、CONTIN法を用いて分析した。

小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）：
インサイチュでのＳＡＸＳ実験は、National Synchrotron Light Source (NSLS) X-22Bビームラインで行った。散乱データは、ＣＣＤ領域検出器で収集し、散乱のＩＤプロファイルは、強度対散乱ベクトル
ｑ＝［（４πｎ／λ_０）／ｓｉｎ（θ／２）］
（式中、夫々、ｎは、媒体の屈折率であり、λ_０は、投射したＸ線の波長であり、θは、散乱角である）で表した。粒子間の空間ｄは、
ｄ＝２π／ｑ
で計算した。ｑの値は、ベヘン酸銀（ｑ＝０．１０７６Å^−１）に対して較正した。ＳＡＸＳの結果は、ＤＮＡ媒介凝集に対して収集した。十分な沈殿および０．３ＭのＰＢＳバッファー液に分散した後のサンプルを、次いで５０℃でアニーリングし、熱力学的に安定した会合体を得た。サンプルは温度制御下のホルダーにおいて石英のキャピラリの中に含めた。

粒子間距離およびナノ粒子の間の結合数を制御する能力もまた、現在制限されている。これらの特徴の制御は、ナノ粒子凝集体をベースとした新規な材料の光学的および電子的特性を規定する。本発明の他の面は、粒子間の空間を制御するためのシステムおよび各ナノ粒子の結合数を変化させる方法を提供する。

表面に対する一本鎖ＤＮＡの配位の問題を克服するため、本発明者らは、凝集において直接関与しない表面結合ＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ領域を用いた。このことは、会合促進相補ＤＮＡ配列をナノ粒子のインターフェイスから離して拡張し、したがって、ＤＮＡハイブリダイゼーションのアクセス可能性を増大させる（図２Ｂのスキーム２）。図２Ａおよび２Ｂは、ナノ粒子のＤＮＡ誘導自己凝集の概念図を示す。図２Ａ（ｓｙｓ−ＶＩＩ）は、相補一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡキャッピングを備えたナノ粒子のＤＮＡ誘導自己凝集の概念図を示す。図２Ｂに示すｓｙｓ−ＶＩＩＩは、ＤＮＡ鎖のスペーサ配列のハイブリダイゼーションの後、同じタイプのｓｓＤＮＡキャップされたナノ粒子を示し、これは会合促進相補ＤＮＡ配列をナノ粒子のインターフェイスから離して拡張する。

凝集動態および会合サイズをよりよく制御するため、相補ＤＮＡ鎖（ハイブリダイゼーションをベースとした粒子間の凝集プロセスを駆動するのに相補ＤＮＡを用いる）および中性ＤＮＡ鎖の組合せを用いて、粒子間の親和性を微調整することができる。加えて、これらＤＮＡ分子のスペーサ領域は、二本鎖にされ、ＤＮＡをナノ粒子の表面から離して拡張し、凝集プロセスの部分としてハイブリダイズするＤＮＡを、よりアクセス可能にする。同様の理由から、本発明者らは、中性ＤＮＡにおける二本鎖スペーサ配列の使用も示す（スキーム３、図３）。二本鎖スペーサ配列およびハイブリダイゼーションにより駆動された凝集のための一本鎖領域の使用によっても、粒子間距離のよりよい制御を許容する。

図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、ハイブリダイゼーションの前後に、相補的および非相補的なｓｓＤＮＡキャッピングの両方を伴うナノ粒子間の凝集を示す概念図を示す。相補的および非相補的なｓｓＤＮＡキャッピング（Ａ：ＣおよびＡ’：Ｃ）の両方を伴うナノ粒子間の凝集に対する概念図を図３Ａに示し、ここで、Ａ（４４）およびＡ’（４６）は相補的な会合促進配列であり、Ｃ（５２）は、「中性」の関係のない（非相補的な）配列を示す。相補および中性キャッピング配列の間の割合は、このシステムにおいて制御することができる。図３Ｂは、会合促進相補鎖のスペーサ配列を選択的にハイブリダイズして剛性セグメント（^＊Ａ：Ｃおよび^＊Ａ’：Ｃで示す）を形成した後の事実上同一である凝集システムを示し、ここで^＊Ａ（４８）および^＊Ａ’（５０）は部分的に剛性である。相補および中性鎖のスペーサ配列をハイブリダイズした後の同様のナノ粒子システム（^＊Ａ：^＊Ｃおよび^＊Ａ’：^＊Ｃで示す）を図３Ｃに示し、ここで^＊Ｃ（５４）は部分的に剛性である。

例２：凝集動態の増強
凝集動態は、ナノ粒子が１つ以上のタイプのｓｓＤＮＡで機能化された場合、より劇的に増強された。図３は、相補タイプ１（Ａ、Ａ’、^＊Ａおよび^＊Ａ’）のｓｓＤＮＡと、中性、ハイブリダイズしない鎖のタイプ３（Ｃおよび^＊Ｃ）（3=5'- TTC TCT ACA CTG TCT-(T)₁₅-C₃H₆-SH-3'）の両方を有するシステムの模式図を示す。タイプ１（またはタイプ２）およびタイプ３の間の割合は、機能化方法を介して制御することができる。

図５Ａは、約７５％の非相補的中性タイプ３（Ｃ）ｓｓＤＮＡおよび２５％の相補鎖（Ａ、Ａ’）タイプ１およびタイプ２からなるシステムに対する動態プロットのセットを示す。タイプ３のｓｓＤＮＡの存在により、凝集は非常にゆっくりしていた（丸）。しかしながら、会合促進相補タイプ１（^＊Ａ）およびタイプ２（Ａ’）のｓｓＤＮＡのスペーサ配列が選択的ハイブリダイゼーションすると、凝集動態は劇的に増大する（三角）。図５Ｂは、ＤＬＳで測定した事実上同一のシステムを示し、ここで、スペーサ配列を剛性化するためのオリゴ−ｄＡの付加により、凝集された会合サイズにおける劇的な変化が示されている。同様の結果が、０〜９５％のタイプ３の非相補中性ｓｓＤＮＡを有するシステムから得られた。この方法はまた、凝集した会合サイズの制御も可能にする。図５Ｃは、９５％の非相補中性ＤＮＡを含むシステムの最終的な凝集サイズを示す。各会合体（６０）は、数個（１〜４個）のナノ粒子だけを含んでいる。図５Ｄは、８５％の中性ＤＮＡを含む同様のシステムのＴＥＭ写真図を示し、各会合体（６２）が約５〜１５個のナノ粒子を含むことが分かる。

図５Ａ、５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄは、８５％および９５％の中性ＤＮＡを含有する凝集体の動態プロフィール、ＤＬＳ結果およびＴＥＭ写真図を示す。図５Ａは、ＵＶ−Ｖｉｓによって測定した動態プロフィールを示し、オリゴ−ｄＡの付加の後の劇的に増大した凝集を示している（三角）。図５Ｂにおいて、事実上同一のサンプルのＤＬＳの結果が、オリゴ−ｄＡを付加すると、会合サイズが劇的に増大することを示す（三角）。図５Ｃは、９５％の非相補的ＤＮＡを有するシステムの凝集のＴＥＭ写真図を示す。８５％の非相補的ＤＮＡを有するシステムの凝集のＴＥＭ写真図（図５Ｄ）は、図５Ｃのものと比較することができ、中性ＤＮＡのより少ないフラクションの増大した会合サイズを再度示している。

これらの結果は、ＤＮＡが非常に自由度が高いので、また、ｓｓＤＮＡの種々の領域が選択的にハイブリダイズされ得るので、このタイプのシステムが、非常に正確で予測可能なナノ粒子の自己凝集の将来的な開発にとって理想的な候補であることを示す。本発明の技術の利点は、ＤＮＡキャッピングの簡単な部分的なハイブリダイゼーションが、増大した凝集動態を可能にすることのデモンストレーションである。加えて、中性、非相補的ＤＮＡの使用によって、会合サイズおよびナノ粒子間の結合数を制御するために用いることができる。

例３：結晶性金ナノ粒子凝集体
ナノ粒子合成およびＤＮＡ機能化：
金ナノ粒子（Ａｕ、１１．４±１．０ｎｍ）を、最初、ｍＭのＨＡｕＣｌ_４溶液を約９５℃で３０分間加熱することによって合成した。この溶液に対し、温めた（約４０℃）３８ｍＭクエン酸三ナトリウム溶液の１０ｍｌのアリコートを加え、数分間反応させた。最初の色が赤に変わると、溶液を直ぐに約８０℃に冷却し、２時間アニールした。サンプルを室温に放冷し、一晩放置した。次いで、溶液を、遠心分離（３０分、４，５００ｇ）によって精製し、所望の濃度で暗所に貯蔵した。

チオールまたはアミンに修飾された一本鎖オリゴヌクレオチドをジスルフィドとして購入した（Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA, U.S.A; Primesyn Lab Inc., Hillsborough, NJ, U.S.A）（表１）。ナノ粒子の機能化の前に、オリゴヌクレオチドを最初に、凍結溶解したサンプル（１００〜３００ナノモル）を、３０分間、精製水またはバッファー中、０．３ｍｌの１００ｍＭジチオールスレイトール（ＤＴＴ）溶液に溶解することによって還元した。還元したＤＮＡを新たに精製した架橋したデキストランゲルカラム（G-25、Amersham Bioscience）にロードし、２．５ｍｌの１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．０）で溶出した。ＤＮＡを、特定のＤＮＡ吸光係数でＵＶ−Ｖｉｓ分析を用いて定量した。

合成したＡｕＮＰは、次いで、長さ３０〜２００塩基のＤＮＡで機能化した。典型的な実験において、精製したＤＮＡ ５０〜３００μＭ溶液のアリコート（１〜５０μｌ）を、１ｍｌのＡｕの溶液（［Ａｕ］＝１０〜３０ｎＭ）に添加した。ｓｓＤＮＡ＋Ａｕ溶液は、濃度を１０ｍＭ（ｐＨ＝７．１）にするためのリン酸バッファーの添加の前に、少なくとも３時間、室温で、非緩衝液においてインキュベートした。溶液を、ＮａＣｌ（０．０２５Ｍ）の添加の前に、４時間、２５℃でアニールした。次いで、塩濃度は、２４時間にわたり、０．０２５から０．３Ｍ ＮａＣｌに徐々に増大し、次いで、さらに２４時間、０．３Ｍで放置した。過剰なＤＮＡは、次に、３０分間、４，５００ｇでの遠心分離によって、溶液から除去した。この精製プロセスを３回繰り返した。蛍光およびＵＶ−Ｖｉｓ分析は、各粒子に結合しているｓｓＤＮＡの総数（ｎ）が約６０（±５）（約３１．７ｐｍｏｌ／ｃｍ^２）であることを示していた。

ＳＡＸＳサンプル調製：
ＤＮＡ媒介で凝集した会合体からなるサンプルを、以下の文献に記載の方法で調製した。各システムにおいて、凝集は、１０ｍＭリン酸バッファー、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．１の２００μＬの溶液中、タイプＡおよびタイプＢのＤＮＡキャップされたＡｕの等モル量（［Ａ］＝［Ｂ］＝約３０ｎＭ）の組合せによって、２５℃で行った。会合体は、一晩凝集させ、得られた沈殿を集め、バッファー中、およそ１．０ｍｍの直径の石英キャピラリーに移した。キャピラリーは、ワックスでシールし、蒸散を防いだ。

小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）：
ＳＡＸＳ実験は、インサイチュで、National Synchrotron Light Source(NSLS)のX-21ビームラインで行った。散乱データは、ＭＡＲ ＣＣＤ領域検出器で収集し、一次元（１Ｄ）散乱強度対散乱ベクトル
ｑ＝（４π／λ）ｓｉｎ（θ／２）
（式中、λ＝1.5498Åは投射したＸ線の波長であり、θは散乱角である）
を測定した。データは、構造因子Ｓ（ｑ）対ｑで示される。ｑの値は、ベヘン酸銀（ｑ＝０．１０７６Ａ^−１）標品で較正した。Ｓ（ｑ）は、Ｉ_ａ（ｑ）／Ｉ_ｐ（ｑ）として計算され、式中、Ｉ_ａ（ｑ）およびＩ_ｐ（ｑ）は、夫々、考慮したシステムおよび会合していないＡｕに対するＣＣＤイメージの平均化した角度によって抽出されたバックグラントを補正した１Ｄ散乱強度である。Ｓ（ｑ）におけるピーク位置は、データに対するLorenzian形態をフィッティングすることによって決定される。

ＵＶ−Ｖｉｓ：
ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、Perkin-Elmer Lambda 35 spectrometer（２００−１１００ｎｍ）で収集した。融解分析は、Perkin-Elmer PTP-I Peltier Temperature Programmerとともに行い、１０ｍＭリン酸バッファー、０．２０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．１のバッファー溶液中、攪拌しながら、２０℃〜７５℃の間を１℃／分の温度傾斜で行った。

図６は、アプローチの模式図を示し、ここで、ＤＮＡキャップされた１１．４ｎｍの金ナノ粒子は、システムＩ〜ＶＩにおいて示したように、付着したＤＮＡの構造によって仕立てられ得る。凝集したシステムは、相補ＤＮＡキャッピングを備えたナノ粒子（粒子ＡおよびＢという）のセットの組合せによって調製し得る。キャッピングにおけるＤＮＡは、Ａ−Ｂハイブリダイゼーションに関与する外側の認識配列およびハイブリダイゼーションに関与しない内側のスペーサ配列を有する。これらのシステムにおいて、認識配列の長さは、粒子間の吸着のスケールを決め、一方で、フレキシブルなまたは剛性のスペーサは、反発的な相互作用の強さおよび範囲を規定する。かかる反発は、ハイブリダイズされた鎖、および幾何学的制約によってハイブリダイズできない鎖のエントロピックな相互作用を介して発生する。ＤＮＡキャッピングにおける認識またはスペーサセグメントの長さを独立して改変することによって、全体的な粒子間相互作用を変化させ得る。本発明のある態様の特定の例を以下に示す。

６つの典型的な機能化されたナノ粒子システム、すなわちシステムＩ〜ＶＩは、同じ方法で製造した。システムＩ〜Ｖにおいて、等モル量のＡ（第一のタイプの粒子、１０４）およびＢ（第二のタイプの粒子、１０６）のハイブリダイゼーションによって誘導された凝集によって、２５℃で２４時間のインキュベーションの後に収集したマイクロメートルサイズの会合体が得られた。システムＶＩ（１０２）は、システムＩＶのスペーサ領域のハイブリダイズによって調製される。これらの会合体のナノスケールの構造は、次いで、±０．１℃の安定性を有する温度制御下でのインサイチュＳＡＸＳ（λ＝１．５４９８Å）において研究した。図７は、凝集融解温度（Ｔ_ｍ）より数度低いプレ融解温度（Ｔ_ｐｍ）に会合体を加熱し、約２８℃でのシステムＩ〜ＶＩからの会合体に対して得られたＳＡＸＳ写真図の代表的なセットを示す。図８は、対応する構造因子Ｓ（ｑ）を示し、第一の散乱ピークの位置を明らかにした。このピークの位置ｑ_１は、粒子間の最短の相関長
ｄ＝２π／ｑ_１
に対応する。システムＩ（９２）、ＩＩ（９４）、Ｖ（１００）およびＶＩ（１０２）に対し、約２８℃で観察された空間（ｄ_Ｉ＝１５．６、ｄ_ＩＩ＝１９．４、ｄ_Ｖ＝１７．９、ｄ_ＶＩ＝２７．８ｎｍ）は、粒子間のＤＮＡ結合の両端間距離に対するミミズ鎖モデルによって概算された理想的システムよりも短い。システムＩＩＩ（９６）は、モデルのｄよりも約１ｎｍ長いｄを示し、一方、約２３．５ｎｍのｄを有するシステムＩＶ（９８）は、モデルと最も近い値が得られた。ＤＮＡの非単軸（non-uniaxial）のハイブリダイゼーションおよび局所のハイブリダイゼーションの欠陥は、理想化された場合と比較した、かかるｄの変動の原因となるかも知れず、結果として最初の凝集の後、粒子が室温での非平衡状態で停止することとなる。かかる場合において、アニーリングは、システムを熱力学平衡にするのに有利であり得る。

図７は、凝集時のサンプル（１１４、Ｔ＝室温）およびプレ融解（Ｔ＝Ｔ_ｐｍ）条件のサンプル（１１８）の散乱パターンを示す。これらの温度で、粒子間の接着エネルギーは減少し、局部ＤＮＡおよび粒子の転移が可能になる。各システムにおいて、より低いｑ値へと偏移したＳ（ｑ）のピークが観察され（図８）、ｄの増大を示し、アニーリングを伴うハイブリダイゼーションのより単軸性の特徴が発展すること並びに増大した温度に伴うＤＮＡのコンフォメーション変化に寄与することができる。たとえば、システムＩＶは、粒子の表面−表面距離の約２０％（約４．５ｎｍ）の増加に対応する約０．００５Å^−１のｑ偏移を示した。加えて、Ｔ_ｐｍでのＳＡＸＳ測定は、すべてのシステムにおいて、改善された秩序化に寄与する散乱ピークの先鋭化を示した。室温に比べて、Ｔ_ｐｍでのシステムＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶは、散乱の相関長が１０〜２０％の増大を示す。

式中、Δｑは、回折ピークの分解能を補正したＦＷＨＭ

であり、ξは、数個の粒子間の空間だけに制限されている。対照的に、システムＩＶおよびＶＩは、５０％を超えるξ増加を示し、約５ｄまでの、より高い秩序ピークの出現を伴う。温度を伴うこれらの再編成は、会合体における粒子が最初に準安定状態に捕獲されることを示す。Ｔ_ｐｍでアニーリングすると、ＤＮＡ結合の局所の転移が起こり得て、粒子間のＤＮＡ結合の数を最大化することによって、粒子間の相互作用が最適化する粒子の位置および方向が再調整される。この効果の構成はスペーサ構造であり、それは、結合のより大きなフレキシビリティおよび粒子の再配置または回転に必要なより小さなエネルギーによって、大きな局所転移を可能にする。

ＤＮＡ結合した粒子システムの脱凝集は、Ｔ_ｍでのＤＮＡの脱ハイブリダイゼーションによる、さらなる温度の増大を起こす。この事象は、図８に示される散乱ピークの消失および単に拡散した散乱の出現によって明確になり、それは、凝集体よりも個々のナノ粒子の形成因子のサインである。システムＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶは、数分以内の構造の脱凝集を明らかにし、一方で、システムＩおよびＶＩは、十分にゆっくりとした動態によって、広い残留ピークを示した。システムＶにおいて、３０塩基（３０−ｂ）の認識セグメントのハイブリダイゼーションによって、Ｔ_ｍ＞８５℃になる。Ｔ_ｍ以下に冷却すると、各サンプルは、システムＩＶを除いて、それらのプレ融解状態と同じ構造に脱凝集することが見出され、それは、自発的な結晶形成を示唆する例外的にシャープなリングパターンを示した。低い温度スペクトル（１１４）は、より暗い線によって示され、より高い温度スペクトル（１２）は、より明るい線で示される。

システムＩＶにおける秩序化へ向けた実験を図９に示し、それは、散乱パターンおよび、融解前のアニーリングした状態（５６℃）、融解後（７１℃）、融解中（６０℃）および再凝集後の秩序化状態（５７℃、３０℃）におけるシステムのそれぞれのＳ（ｑ）を示す。これは、準安定状態（１３２）、ｄｓＤＮＡ融解点より高い脱凝集状態（１３４）、融解点より低い冷却された結晶性状態（１３６）によって、図９に示されている。秩序化された構造の証拠が、Ｔｍより低い、約６０℃で直ちに現れ始め、ここで、Ｓ（ｑ）は、ナノ粒子の形成因子によって大きな貢献に関与する強い拡散した散乱の存在において、いくつかの回折ピークを明らかにする。これは、凝集しない粒子が共存する新しい形成相の核の存在を示唆している。さらに、５９℃〜５７℃に冷却すると、方向づけられていない多結晶のサンプルの鋭い循環的なパターン特性の散乱および出現、すなわちパウダー散乱に貢献する粒子形成因子の劇的な還元によって証拠づけられたように、サンプルの結晶化が観察される。この結晶形成は、数分間だけ起こり、１℃／分までの冷却速度によっては影響されない。

図９のＳＡＸＳパターンは、分解能の制限されたBraggのピークの７つの秩序を明らかにし、システムＩＶの結晶性３Ｄ構造を示し、これは、長距離秩序化の顕著な程度を伴い、数百ナノメートルより大きなξを伴う。一度形成されると、結晶性構造の発展は、複数の凝集−脱凝集サイクルにわたる、秩序化の質およびシステムの挙動を変化させる顕著な損失なしに可逆的である。加えて、結晶性構造は、数日間のＳＡＸＳモニタリングにわたり、溶液中、安定であった。ピークの位置の割合の分析により、
ｑ_Ｘ／ｑ_１＝√ｌ：√２：√３：√４：√５：√６：√７
であり、これはＩｍ’３ｍスペース基、図１０に示されるような体心立方（ｂｃｃ）構造
に対応することが明らかになった。Ｓ（ｑ）におけるピークの高さもまた、ｂｃｃ配置に対して予測された相対強度に質的に追従する。構造について対応する格子定数（ａ）は、５７℃で約３７．５ｎｍであり、３０℃まで冷却した後、約３４．８ｎｍであって、これは、第一の配位殻において粒子の核の間の２１．１ｎｍおよび１８．７ｎｍの表面−表面距離に相当する。この構造は、全く開放的であり、構造の体積の約３〜４％だけがナノ粒子によって占有され、他の４〜５％がＤＮＡによって占有されている。したがって、凝集された構造の体積の約９０％以上が、溶媒分子によって占有され、それは、ｂｃｃ配向におけるパックされた剛体球における約３２％の典型的な空虚な空間よりもはるかに高い。

凝集体の結晶構造は、ｂｃｃ構造形成は一般に剛体球パッキングには観察されず、六方最密（ｈｃｐ）または面心立方（ｆｃｃ）相を形成する傾向があるため、予測できなかった。ｈｃｐおよびｆｃｃの両方の構造は「最密」とされ、ｂｃｃ構造は「非最密」とされるが、機能化された粒子が典型的には、理想の剛体球と同じように最密ではないことに着目すべきである。ｂｃｃ構造は、Ａの配位殻における粒子Ｂだけを有することによって、また逆も同様に、主として反発的なＡ−ＡおよびＢ−Ｂ相互作用とともに、典型的なバイナリーＡ−Ｂシステムにおける相互作用エネルギーの最適化の要求をよく調和させる。しかしながら、種々の結晶構造は、プロセッシング条件または粒子を機能化するＤＮＡの構造を変えることによって、形成され得る。

システムＩ〜ＶＩにおけるスペーサの長さおよびフレキシビリティを変えることは、凝集したｂｃｃ結晶性相の形成のための条件の決定を許容し、与えられた認識配列の長さ、より長い、よりフレキシブルなスペーサ配列は、凝集した結晶性相の形成を助けることを示す。これらのＤＮＡ配列における構造的な変化は、長距離秩序に潜在的な好ましい粒子間相互作用と関連することができる。とくに、ＤＮＡにおけるスペーサセグメントの長さは、少なくとも部分的に、粒子サイズに関連する相互作用の範囲を決定し、この典型的な実験において、最長のスペーサの研究のための粒子サイズのオーダーである。ＤＮＡ誘導結晶化は、結晶性相、最も豊富であるｂｃｃ相で、多様性を達成するために、粒子サイズまたはより大きなオーダーの長距離相互作用を要求し得る。スペーサの長さおよびフレキシビリティによって決定されるこの潜在力の柔軟性は、粒子の等しい空間の置換に対するより低いエネルギー損失を許容する。ＤＮＡ媒介相互作用の複雑さ、それらの個別の塩基対、並びに、込み合い効果は、潜在力の柔軟さの誘発の量的決定を与えたが、自発的なｂｃｃ結晶の形成の条件の組み合わせの経験的な表現は、ナノ粒子の凝集の待望のプログラムされた秩序化に向けた重要なステップである。よく秩序化されたメタ材料を作成するためのこのアプローチは、異なる凝集条件および材料に特有な豊富に多様な相を導き得る。この多様性は、たとえば、他の修飾の間に、ＤＮＡ配列のスペーサおよび認識セグメントの長さを変更することによって、または、それらの長さの比率を変えることによって達成され得る。

ＤＮＡキャップされた金ナノ粒子の長距離秩序は、ＤＮＡ設計の修飾を介して粒子間の相互作用を変化させることによって達成し得る。ＤＮＡセグメントの長さと剛性との相関、および凝集体の内部構造は、ＳＡＸＳをインサイチュで用いて調査することができる。ここで記載された技術を用いて創出されたＤＮＡキャップされたナノ粒子のｂｃｃ結晶構造は、数百ナノメートルを超える相関長が存在し、顕著に開放的であり、粒子は格子体積の約４％だけを占有している。ナノ粒子のこの結晶性組織は、熱力学的に安定であり、可逆的であって、およそ３０℃の温度範囲にわたり、格子定数のほぼ１０％の膨張を示している。例のプロセスは、ＤＮＡを介したナノ粒子の凝集における長距離秩序を誘導する能力を示している。長距離秩序は、少なくとも１０の粒子間距離または単位セルにわたり存続する。このことは、生体認識相互作用を伴うナノスケールのオブジェクトからの３Ｄ結晶性構造の創出のための新しい経路を示唆している。かかる経路は、これらのシステムにおける種々の相を製造することができ、設計による次世代のメタ材料を導き得る。付随的に増大した表面積を有する開放的な構造は、化学反応を促進することができる触媒のように作用することによって、または触媒のホストとなることによって、触媒作用において有利に用いられ得る。

図６は、ＤＮＡ結合の典型的な構造を示し、一方、図７は、対応する結合構造を有する、アニールしていないおよびアニールしているＤＮＡ結合ナノ粒子会合体の小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）の結果を示す。図６の模式図において、認識（相補的）配列は、ＤＮＡキャップされた粒子Ａの結合の底部およびキャップされた粒子Ｂの結合の上部に示されている（明確さのため、１つの粒子間結合のみを示す）。上述した例において、システムＩのナノ粒子は、夫々、３塩基の相互作用しない中性領域および、粒子Ａが粒子Ｂと１５塩基対（ｂｐ）の二本鎖結合領域を形成する１５塩基の相補結合領域を有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の配列によって機能化されている。システムＩＩにおいて、両方の粒子は、１５塩基の中性領域および１５塩基の結合領域を有し、ハイブリダイズした場合、１５塩基対の結合領域を形成する。システムＩＩＩは非対象であり、粒子Ａは、３５塩基のスペーサおよび１５塩基のリンカーを有し、一方、粒子Ｂは、夫々１５塩基のスペーサセグメントとリンカーセグメントを有する。システムＩＶにおいて、ＡおよびＢの粒子の両方は、３５塩基のスペーサ（中性）セグメントおよび１５塩基のリンカー（相補的）セグメントで機能化している。システムＶの機能化した粒子は、３塩基のスペーサおよび３０塩基のリンカーのＤＮＡ配列を有し、一方、システムＶＩにおいて、スペーサは二本鎖で３５塩基対からなり、リンカーは１５塩基のｓｓＤＮＡを含む。システムＶＩの機能化した粒子は、システムＩＶ粒子のスペーサセグメントのハイブリダイズによって得られる。

アニーリングしていないシステムおよびプレ融解温度、Ｔ_ｐｍ、各写真図で示した実験温度でアニーリングしたシステムに対するＳＡＸＳパターンを図７に示す。左側のシリーズは、アニーリングしていないシステムの結果を示し、一方、右側のシリーズは、アニーリングしたサンプルに対応している。アニーリングしていないシステムＩ〜Ｖの散乱パターンは２８℃で、アニーリングしていないシステムＶＩは３０℃で得た。アニーリングしたサンプルのデータは、システムＩは５９℃、システムＩＩは５７℃、システムＩＩＩは５３℃、システムＩＶは５６℃、システムＶは７１℃、システムＶＩは６２℃で得た。

図８は、図７で示した散乱パターンの抽出した構造因子Ｓ（ｑ）を示す。太線は、アニーリング前のシステムのＳ（ｑ）を示し、一方、細線はアニーリングしたシステムのＳ（ｑ）を示す。システムＩからＶＩの第一Ｓ（ｑ）ピークの位置は、夫々、低温で、ｑ_Ｉ＝０．０４０３、ｑ_ＩＩ＝０．０３２４、ｑ_ＩＩＩ＝０．０２７３、ｑ_ＩＶ＝０．０２６６、ｑ_Ｖ＝０．０３５１、ｑ_ＶＩ＝０．０２２６Å^−１、Ｔ_ｐｍで、ｑ_Ｉ＝０．０３７、ｑ_ＩＩ＝０．０２９８、ｑ_ＩＩＩ＝０．０２４４、ｑ_ＩＶ＝０．０２３３、ｑ_Ｖ＝０．０２９、ｑ_ＶＩ＝０．０１９９Å^−１であった。図８において、細線はアニーリングしたサンプルを示し、太線はアニーリングしていないサンプルを示す。

図９は、システムＩＶのＳＡＸＳ写真図、抽出した構造因子Ｓ（ｑ）、結晶化経路の模式図を示す。ナノ粒子のアニーリングしていないシステムは準安定である。温度が上がると、システムは融解し脱凝集する。結晶化は冷却すると起こり、連続した凝集体融解温度をまたいだ加熱／冷却サイクルを通じて再生可能で安定である。Ｓ（ｑ）のラインは、４．４単位ずつ連続的に偏移する。インサートは、ｑの範囲が０．０１８から０．０６８Å^−１の６０℃でのＳ（ｑ）の拡大図を示す。

図１０にみられるように、システムＩＶの結晶構造はｍ、ＳＡＸＳを用いて決定した。点線（１４０）は、点散乱体の体心立方（ｂｃｃ）格子の予測されるＳ（ｑ）ピークの大きさおよび位置を示す。３０℃で取得した実験データ（１３８）は、理論的な予測に非常に厳密に一致し、システムＩＶのナノ粒子が三次元結晶にｂｃｃ構造で凝集することを示している。ｂｃｃ構造の単位セルの表現（１４２）は、挿入図に示す。提案された粒子配置は、相補的ＤＮＡ結合配列を備えた粒子を表す明暗の球形によって示している。粒子Ａは、粒子Ｂを最も近い隣接物として有し、また逆も同様であり、換言すれば、粒子Ａの配位圏は粒子Ｂだけからなり、また逆も同様である。システムＩＶの格子パラメータａは、Ｔ＝３０℃で３４．８ｎｍ、Ｔ＝５７℃で３７．５ｎｍである。

図１１は、システムＩからＶＩにおいて用いたＤＮＡキャップされた金ナノ粒子のＴＥＭ写真図の典型的なセットおよび統計分析を含む。左側の顕微鏡写真においてスケールバーは７０ｎｍであり、一方、右側の写真図では１０ｎｍである。粒子サイズの統計分析によって、ナノ粒子（１４４）の一次元の１１．４±１．０ｎｍを得た。

図１２は、結晶形成後のシステムＩＶから収集されたＳＥＭ写真図の典型的なセットを含む。最も左側のＳＥＭ写真図のスケールバーは、１００マイクロメートルであり、他の２つの写真図のものは、１００ｎｍに対応する。ナノ粒子（１４６）は、基材の暗いバックグラウンドに明るく表れる。同様に、図１３は、結晶形成後のシステムＩＶから収集されたＴＥＭ写真図の典型的なセットを示す。最も左側のＴＥＭ写真図のスケールバーは、１００ｎｍであり、他の２つの写真図のものは、９０ｎｍを示す。拡大した挿入図の部分は、最も右側の顕微鏡写真においてボックスで示す。先と同様、ナノ粒子（１５０）を明確に見ることができた。

図１４は、プレアニーリングおよび結晶化状態におけるシステムＩＶの会合体の一連の融解プロフィールを示し、一方、それらの温度に関する最初の誘導体を図１５に表す。実線はアニーリング前の会合体に対応し、破線は結晶化構造に対応する。図１５におけるプロットの分析によって、プレアニーリング形態の融解温度が６３℃であり、結晶性形態では６２℃であることが得られた。データは、０．２０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸バッファー溶液（ｐＨ７．１）の会合体について得た。温度変化の割合は、１分あたり１℃であった。

図１６は、ｑの関数としての、７１℃でのシステムＩＶの散乱強度を示す。データは、黒丸（１６０）によって示され、一方、実線（１６２）は、サイズのガウス分布を有する回転楕円体の粒子の予測へのデータのフィッティングを示す。フィッティングされた粒子の直径は、１１．５±１．２ｎｍであり、ＴＥＭ（図１１）によって決定された直径１１．４±１．０ｎｍに極めて近い。

同様の結果は、大いに異なるサイズおよび構成の粒子を用いても達成され得る。

例４：ポリスチレンマイクロ粒子
ポリスチレン粒子の表面修飾：
３０〜２００塩基の範囲の塩基を有する一本鎖の３’−一級アミン修飾ｓｓＤＮＡを、カルボキシル化されたポリスチレンコロイド球体（１．９μｍ）の上にグラフトした。典型的な修飾において、０．１５ｗｔ％の粒子を懸濁し、１００ｍＭイミダゾールバッファー（ｐＨ７．０）中、１５μＭ ＤＮＡ溶液で、３時間、５０℃で、１００ｍＭ ＥＤＡＣの存在下でインキュベートした。修飾した粒子は、０．５％ＳＤＳ溶液中、連続した遠心分離（８００ｇ、６分）で３回洗浄し、上清を取り換えた。次いで同様に、熱い（６０℃）脱イオン水で３回洗浄し、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．７）に再分散し、４０℃で貯蔵した。

表面の非相補ＤＮＡの数ｆ_Ｎは、グラフト工程において用いたリンカー（Ｌ）ＤＮＡ濃度［Ｌ］および中性（Ｎ）ＤＮＡ濃度［Ｎ］の割合の変化
ｆ_Ｎ＝［Ｎ］／（［Ｎ］＋［Ｌ］）
によって制御される。ＤＮＡ機能化は、金ナノ粒子の場合と同様に行った。ＤＮＡ表面密度は、蛍光測定によって定量され、およそ１０ｎｍ^２あたり０．３鎖、または、１マイクロ粒子あたり約３００，０００の総ｓｓＤＮＡ鎖であった。

ｆ_Ｎ＜０．５０では、大きな会合体だけが観察され、夫々数千の粒子を含んでいた。０．５０から０．９０の間のｆ_Ｎでは、ｆ_Ｎが増大するにつれて、会合体サイズが小さくなり、数個のポリスチレン（ＰＳ）粒子のクラスターだけが含まれていた。ｆ_Ｎが約０．９５に達した場合、単離した凝集していないＰＳだけが観察された。したがって、ｆ_Ｎ増加に伴う会合体サイズの減少の効果は、引っ張り合う相互作用のバランスにおいて、ＮｓｓＤＮＡによって提供される浸透性の反発作用の強い影響が指摘される。同様の結果が、機能化されたＡｕナノ粒子（ＡｕＮＰ）に対し得られ、ｆ_Ｎが増大するにつれて、会合体の成長における有意な減少が見られた。ＡｕＮＰの融解温度もまた、ｆ_Ｎが増大すると減少した。

例５：ラテックスマイクロ粒子
ラテックス粒子の表面修飾：
約１．９μｍのラテックス球体を調製し、続いて、それらの表面を、ポリスチレンマイクロ粒子に対するのと同じ工程で修飾した。表面の非相補ＤＮＡの数ｆ_Ｎは、再度、グラフト工程において用いた［Ｌ］および［Ｎ］のＤＮＡ濃度の割合の変化
ｆ_Ｎ＝［Ｎ］／（［Ｎ］＋［Ｌ］）
によって制御される。ＤＮＡ機能化は、金ナノ粒子の場合と同様に行った。ＤＮＡ表面密度は、蛍光測定によって定量した。

ＰＳマイクロ粒子と同様の結果が観察され、会合体サイズは、ｆ_Ｎが増大するにつれて減少した。加えて、会合体の凝集の割合が、ｆ_Ｎが増大するにつれて減少することが観察された。さらに、これらの結果が、０〜１４０ｍＭの広い範囲のイオン強度で観察された。しかしながら、与えられたｆ_Ｎに対し、会合体サイズは、イオン強度の増大とともに増大した。

マイクロメートルの大きさで、ラテックスおよびＰＳ粒子の表面は、結合および中性ＤＮＡの両方に関し、平坦であると仮定し得る。したがって、同様の結果が、大きな粒子および平坦な表面に対するハイブリダイゼーションによって接着されたナノおよびマイクロオブジェクトにおいて得られ得る。

例６：ナノ粒子のリンカーＤＮＡ媒介結晶化
金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）合成：
簡単には、１ｍＭ ＨＡｕＣｌ４水溶液を１５〜３０分間沸騰するように加熱した。次いで、３８ｍＭの濃度の１０ｍＬのクエン酸三ナトリウム溶液を１アリコートの溶液に添加した。最初の色が赤に変わったら、溶液を直ちにＨ_２Ｏで急冷し、室温まで放冷した。溶液を貯蔵し、光から保護した。Ａｕ濃度は、１．０×１０^８Ｌｍｏｌｅ^−１ｃｍ^−１の吸光係数を介して計算した。

ＤＮＡナノ粒子修飾：
典型的には、ジスルフィドとして購入した（IDT Inc.から）チオール機能化一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＤＮＡ−ＡおよびｓｓＤＮＡ−Ｂ、配列は下記参照）を、最初に、ジチオールスレイトール（ＤＴＴ）水溶液で還元し、続いて、新たに精製した架橋したデキストランゲルカラム（G-25, Amersham Bioscience）において、リン酸バッファー（ｐＨ＝７．０）で溶出した。ＤＮＡを、特定のＤＮＡ吸光係数でＵＶ−Ｖｉｓ分析を用いて定量した。合成したＡｕナノ粒子（ＡｕＮＰ）は、次いで、既に記載したように、ｓｓＤＮＡ−ＡまたはｓｓＤＮＡ−Ｂで機能化した。洗浄プロセスは、典型的には、少なくとも３回繰り返した。最終的なｓｓＤＮＡ−ＡｕＮＰは、０．３Ｍ ＰＢＳに分散した。各ＡｕＮＰに結合したｓｓＤＮＡ数は、約５０個と概算した。

リンカーＬ３０およびＬ７０は、ＰＡＧＥ精製でIDT Inc.によって提供され、さらなる精製をしないで用いた。等モル量の２０〜４０ｎＭの濃度のｓｓＤＮＡ−ＡｕＮＰ−ＡおよびｓｓＤＮＡ−ＡｕＮＰ−Ｂ、ならびに、０．２〜０．８μＭの濃度のリンカーＬ３０またはリンカーＬ７０を混合することによって、凝集体を得た。次いで、サンプルを６５℃に加熱し、その温度で１０分間保ち、次いで、約２時間で室温に冷却した。懸濁液をキャピラリーチューブに移し、沈殿物をキャピラリーチューブの底に沈殿させるため一晩放置した。次いで、サンプルを測定する準備を整えた。

器械類：
この例における測定は、次の器械類を用いて行った。この詳細は、任意の特別な製造者への注意書きのためより、具体的な例を用いることによって提示された明瞭さのために提供され、同様の能力の任意の器械類が用いられ得る。

ＴＥＭ：
ＴＥＭ実験は、１２０ｋＶで操作したJEOL-1300顕微鏡で行った。サンプルは、炭素被覆した銅グリッドの上へ溶液を滴下し、次いで、過剰な溶液を除去して調製した。

ＳＥＭ：
サンプルを洗浄したシリコン基板上に置き、典型的には１ｋＶの電圧および１０μＡの放出電流で、Hitachi S-4800 Scanning Electron Microscopeを用いて測定した。

ＳＡＸＳ：
ＳＡＸＳ実験は、National Synchrotron Light Source (NSLS) X-21ビームラインで行った。バッファー溶液中のサンプルは、石英キャピラリーチューブに入れた。温度コントローラは、±０．０１℃の正確さと高温における約０．２℃のオーバーシュート（overshoot）を有している。散乱データは、各温度で、１０分間の平衡の後、ＣＣＤ領域検出器で収集した。散乱ベクトルｑは、ベヘン酸銀を用いて較正した。

ＤＬＳ：
ＤＬＳの測定は、Malvern Zetasizer ZS装置で処理した。該装置は、６３３ｎｍレーザー源および１７３°での後方散乱検出器を装備している。データは、CONTIN法を用いて分析した。

ＵＶ−Ｖｉｓ：
ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、Perkin-Elmer Lambda 35 spectrometer（２００〜９００ｎｍ）において収集した。

このアプローチにおいて、ＮＰに付着したｓｓＤＮＡは相補的ではなく、２つの末端がＮＰの夫々のｓｓＤＮＡと相補的であるリンカーが必要である（図１７の挿入図参照）。本発明者らは、等モル量の２つのタイプのｓｓＤＮＡキャップされたＡｕＮＰ（ｓｓＤＮＡ−ＡｕＮＰ−ＡおよびｓｓＤＮＡ−ＡｕＮＰ−Ｂとする）および０．３Ｍ ＰＢＳバッファー（１０ｍＭリン酸バッファー、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝約７．０）中、異なる長さのリンカーＤＮＡを混合することによって、２つのセットのＤＮＡ／ＡｕＮＰハイブリッドシステム（Ｓｙｓ−Ｌ７０およびＳｙｓ−Ｌ３０）を作り出した。ＡｕＮＰは、電子顕微鏡および／または動的光散乱の結果から推定することができる直径が１１．５±１．１ｎｍである。

２つのタイプのキャッピングｓｓＤＮＡは、非相補的である：タイプＡ（A=5'-ATTGGAAGTGGATAA-(T)₁₅-C₃H₆-SH）およびタイプＢ（B=HS-C₆H₁₂-(T)₁₅-TAACCTAACCTTCAT-3'）。夫々は、１５塩基の外部認識部分およびＡｕＮＰ表面から認識配列を離すスペーサとして役立つ１５塩基のポリＴを有している。このスペーサは、事実上、任意の長さであってよく、少なくとも５塩基のポリＴ（またはポリＡまたは他の相互作用しない配列（所望により））を含む。リンカーＤＮＡは、夫々、Ｌ７０（5'-TTATCCACTTCCAAT-(T)₇₀-ATGAAGGTTAGGTTA-3'）およびＬ３０（5'-TTATCCACTTCCAAT-(T)₃₀-ATGAAGGTTAGGTTA-3'）である。夫々は、フレキシブルなポリＴおよびＡｕＮＰ上のｓｓＤＮＡの夫々の末端と相補的な２つの末端を有している。フレキシブルなポリＴ配列は、事実上、少なくとも５塩基長の任意の長さであってよい。１５塩基対のｄｓＤＮＡの融解温度は、約６０℃で、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用いて測定される。

図１７は、ＤＮＡ／Ａｕナノ粒子ハイブリッドシステムにおける開放的なｂｃｃ格子の形成を支持するデータを示す。データ（ポイント２０２）は、ｂｃｃ格子の構造因子に対するフィット（２０４）によく一致する。挿入図に見られるように、粒子Ａ（２０６）は、完全に粒子Ｂ（２０８）に囲まれ、粒子Ｂの最も近い隣接物もまた粒子Ａだけである。ＤＮＡ（２１０）は、粒子が、理論上予測されたものと同様に密に充填することを防ぐが、それによっては、顕著に開放的な結晶構造は完全には説明されない。

図１８は、加熱中のＳｙｓ−Ｌ３０の模式図および典型的な温度依存２Ｄ ＳＡＸＳパターンおよび夫々の抽出された構造因子Ｓ（ｑ）を示す。２つのタイプの粒子（２１２、２１４）は、中性領域（２２２、２２４）を有するリンカー（２１６）で結合されている。該構造は、次いで、結合領域（２１８、２２０）に沿って結合される。２つの粒子の結合は、図１８に示す。秩序の程度は、温度が、構造が約５９℃で融解するまで上がるにつれて、準安定（２２６）から結晶性（２２８）へ無秩序（２３０）へと増大する。

図１９Ａは、冷却中のＳｙｓ−Ｌ３０の温度依存ＳＡＸＳパターンを示す。構造の長距離秩序は、室温まで維持される。図１９Ｂは、冷却中の温度依存最隣接距離の減少を示す。図１９Ｃは、空気中で乾燥した後のＳｙｓ−Ｌ３０結晶のＳＥＭ写真図である。黒い線（２３８）は、サンプル中の隙間であり、一方、ドット（２３６）は秩序化したナノ粒子である。スケールバーは１００ｎｍである。

図２０Ａは、高倍率でのｓｓＤＮＡ−ＡｕＮＰ（２４０）の典型的なＴＥＭ写真図である。図２０Ｂは、キャップされていないＡｕＮＰ、ｓｓＤＮＡ−ＡｕＮＰ−ＡおよびｓｓＤＮＡ−ＡｕＮＰ−ＢのＤＬＳ結果を示す。ｓｓＤＮＡ−ＡｕＮＰ−ＡおよびｓｓＤＮＡ−ＡｕＮＰ−Ｂの両方で、キャップされていない粒子よりも大きな直径への偏移が示された。

図２１は、加熱中のＳｙｓ−Ｌ７０の典型的な温度依存２Ｄ ＳＡＸＳパターンを示す。リングの鋭さは、秩序の程度を示し、それは室温からＤＮＡキャップされた構造の融解温度の丁度低い温度まで増大している。

これまでの記載が本発明の個々の態様に関連する一方で、ここの教示を用いることをなす当業者は、本発明の広範な面において本発明から外れることなく、種々の変更および改変を提案し得ることを理解すべきである。例えば、特定の態様が、直径約１０ｎｍのＡｕナノ粒子を用いることを記載するが、様々な大きさの他の材料（金属、半導体、磁性、誘電性）の粒子に置換し得る。同様に、システムＩ〜ＶＩは、決まったサイズの結合および中性セグメントを有するように記載されている。実際には、結合領域は、約１０から約２００塩基を有していてもよく、１０から２００塩基対の二本鎖結合領域を形成し、一方で、相互作用しない中性セグメントは、約３から約２００塩基を含み得る。また、選ばれた例は、同じ材料の粒子を引用しているが、金属および半導体などのように混合した粒子を用いることができる。マイクロメートルのオーダー（０．１μｍから１００μｍ）の大きさを有するマイクロ粒子は、ナノメートルのオーダー（１ｎｍから１００ｎｍ）の大きさを備えたナノ粒子の代わりに用いることができる（例４および５参照）。例のシステムＶＩに関連して記載したように、中性セグメントのＤＮＡ配列は一本鎖である必要はない。

さらに、具体性のため、例はＤＮＡの機能化に関して記載されているが、マイクロおよびナノオブジェクトは、ＲＮＡまたはＰＮＡで機能化されても適切である可能性がある。ＲＮＡおよびＰＮＡの両方とも、ＤＮＡと同じようなアドレス可能な特性、同様の融解温度および構造を有する。ＰＮＡは人工的であり、ＤＮＡよりも分解に対し、より耐性であり、非水性溶媒においてを含めて、ＤＮＡに対して有害な条件下でも用いることが可能である。ＤＮＡおよびＲＮＡは、例えば、協調して用いられ得る。この場合において、少なくともいくつかの中性ＤＮＡと置き換えて、触媒的に活性なＲＮＡ鎖を用いることによって、中性およびハイブリダイズするＤＮＡの組み合わせの物理的利点の全てを提示することができ、一方で、会合体がさらなる反応に参加または触媒することを可能にする。

先の記載は実例であり、本発明はここに追加されたクレームによってのみ制限されている。

Claims (35)

1. 第一の配列を有する第一の核酸で機能化された第一のタイプの複数の粒子であって、第一の核酸が、同一分子上に、一本鎖の結合セグメントおよびスペーサセグメントを含み、スペーサセグメントの少なくとも１つのセグメントが二本鎖である前記粒子と、
   第二の配列を有する第二の核酸で機能化された第二のタイプの複数の粒子であって、第二の核酸が、同一分子上に、一本鎖の結合セグメントおよびスペーサセグメントを含み、スペーサセグメントの少なくとも１つのセグメントが二本鎖である前記粒子と
   第三の配列を有する第三の核酸を有するクロスリンカーであって、同一分子上に、
   第一の核酸の結合セグメントに相補的な第一結合セグメント、
   第二の核酸の結合セグメントに相補的な第二結合セグメント、および
   少なくとも５塩基のポリＴ ＤＮＡを有する中性セグメント
   を含み、中性セグメントが、第一結合セグメントと第二結合セグメントとを分離している前記クロスリンカーと
   を含む粒子凝集体であって、
   第一および第二の核酸の結合セグメントが互いに相補的ではなく、
   第一および第二のタイプの粒子は、第一の核酸の結合セグメントと、クロスリンカーの第一結合セグメントとの間、および、第二の核酸の結合セグメントと、クロスリンカーの第二結合セグメントとの間で、それぞれ二本鎖核酸を形成することによって結合し、結合した粒子は、会合して粒子凝集体を形成し、
   第一の核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される核酸を含み、
   および
   粒子凝集体が長距離結晶性秩序を示す、
   前記粒子凝集体。
2. 第一および第二の核酸のスペーサセグメントが、それぞれ少なくとも５塩基のポリ−Ｔ ＤＮＡを含む、請求項１に記載の粒子凝集体。
3. 長距離結晶性秩序が、１０粒子間間隔を超えて広がる、請求項１または２に記載の粒子凝集体。
4. 長距離結晶性秩序が、三次元である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の粒子凝集体。
5. スペーサセグメントの複数のセグメントが、二本鎖である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の粒子凝集体。
6. 第一および第二のタイプの粒子が、異なる組成を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の粒子凝集体。
7. 第一のタイプの粒子が、０．１から１００マイクロメートルの大きさを有するマイクロオブジェクトを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粒子凝集体。
8. 第一のタイプの粒子が、１から１００ナノメートルの大きさを有するナノオブジェクトを含み、第一のタイプのナノオブジェクトが、金属、半導体、誘電性および磁性からなる群から選択される特性を有してもよい、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粒子凝集体。
9. 第一のタイプのナノオブジェクトが、金ナノオブジェクトである、請求項８に記載の粒子凝集体。
10. 第四の配列を有する第四の核酸で機能化した第三のタイプの複数のナノオブジェクトであって、第四の核酸が、同一分子上に、一本鎖の結合セグメントおよびスペーサセグメントを含む前記ナノオブジェクトをさらに含み、かつ
    第一および第三のタイプの粒子は、第一および第四の核酸の結合セグメントとの間で二本鎖核酸を形成することによって結合されている、
    請求項８または９に記載の粒子凝集体。
11. リンカーが、１０から２００塩基対を含み、
    第一の核酸のスペーサセグメントが、３から２００塩基を含むＤＮＡスペーサ領域を含み、および、
    第二の核酸のスペーサセグメントが、３から２００塩基を含むＤＮＡスペーサ領域を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の粒子凝集体。
12. リンカーが、１５塩基対のＤＮＡを含み、
    第一の核酸のスペーサセグメントが、３５塩基を含むＤＮＡスペーサ領域を含み、および、
    第二の核酸のスペーサセグメントが、３５塩基を含むＤＮＡスペーサ領域を含む、請求項１１に記載の粒子凝集体。
13. 粒子凝集の特性を制御する方法であって、
    同一分子上に第一の結合領域および第一のスペーサ領域を有する第一の核酸で第一種の粒子をキャップすること、
    同一分子上に第二の結合領域および第二のスペーサ領域を有する第二の核酸で第二種の粒子をキャップすること、
    ここで、第一および第二の核酸の結合領域は互いに相補的ではない、
    第一の核酸の第一の結合領域に相補的な第一結合領域と、第二の核酸の第二の結合領域に相補的な第二結合領域と、少なくとも５塩基のポリＴ ＤＮＡを有する中性領域とを同一分子上に含む、第三の核酸を有するクロスリンカーにより、第一および第二の核酸の間の結合を形成すること、
    ここで、中性領域が、第一結合領域と第二結合領域とを分離するものであり、結合を形成することが、第一の核酸の第一の結合領域と、第三の核酸の第一結合領域とをハイブリダイズすること、および、第二の核酸の第二の結合領域と、第三の核酸の第二結合領域とをハイブリダイズすることを含む、
    核酸キャップされた粒子の結合した種の凝集体を作ること、
    夫々の核酸の第一および第二の結合領域の長さ、第一および第二のスペーサ領域の長さ、ならびにクロスリンカーの中性領域の長さを規定することによって、凝集体の特性を制御すること、
    を含み、ここで、スペーサ領域の少なくとも１つのセグメントは二本鎖であり、第一の核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される核酸を含む、
    前記方法。
14. 第一の核酸が、ＤＮＡを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 相互作用しない核酸で第三種の粒子をキャップすることをさらに含み、ここで第三種の粒子をキャップする全ての核酸に対する第三種の粒子をキャップする相互作用しない核酸のモル比は９５％未満である、請求項１３または１４に記載の方法。
16. 凝集体の特性を制御することが、第一種および第二種の粒子の間の結合数を制御することを含むか、または、
    凝集体の特性を制御することが、凝集体の融解温度を制御することを含むか、または、
    凝集体の特性を制御することが、粒子の間の粒子間距離を制御することを含むか、または、
    凝集体の特性を制御することが、凝集体の凝集率を制御することを含むか、または、
    凝集体の特性を制御することが、凝集体の形態を制御することを含む、
    請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 凝集体の形態を制御する場合、粒子が、ナノオブジェクトであり、
    凝集体の形態を制御することが、長距離三次元結晶性秩序を示す凝集体を形成することを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 凝集体の形態を制御することが、アニールしていない凝集体を、その融解温度より低い温度でアニールすること、アニールした凝集体を、その融解温度より高い温度に加熱すること、および融解した凝集体を、その融解温度より低い温度に冷却して、長距離三次元結晶性秩序を示す凝集体を形成することを含む、請求項１７に記載の方法。
19. メタ材料を構築する方法であって、
    第一のタイプの複数の粒子を第一の核酸で機能化すること、
    第二のタイプの複数の粒子を第二の核酸で機能化すること、
    ここで、第一の核酸が、同一分子上に、少なくとも３つの一本鎖塩基の第一の群と、少なくとも１つのスペーサ領域を形成する、第二の核酸の複数の塩基と相補的ではない核酸の第一の領域とを含み、スペーサ領域の少なくとも１つのセグメントが二本鎖であり、第一の群が第一の結合領域を形成し、
    第二の核酸が、少なくとも３つの一本鎖塩基の第二の群を含み、第二の群が第二の結合領域を形成し、
    第一および第二の核酸の結合領域が互いに相補的ではなく、第一の核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される核酸を含み、
    第一の核酸を、クロスリンカーとハイブリダイズすること、
    第二の核酸を、クロスリンカーとハイブリダイズすること、
    ここで、クロスリンカーが、第一の核酸の第一結合領域に相補的な第一結合領域と、第二の核酸の第二結合領域に相補的な第二結合領域と、少なくとも５塩基のポリＴ ＤＮＡを有する中性領域とを同一分子上に含み、中性領域が、第一結合領域と第二結合領域とを分離するものであり、第一および第二のタイプの機能化した粒子は、それらの夫々のＤＮＡとクロスリンカーとがハイブリダイズした領域で結合している、
    第一および第二のタイプの機能化され、結合した粒子に凝集体を形成させること、
    凝集体をアニーリングすること、
    凝集体を融解すること、および
    融解した凝集体をその融解温度よりも低い温度に冷却してメタ材料を形成すること、ここでメタ材料が長距離三次元結晶性秩序を示す、
    を含む、前記方法。
20. 第一の核酸が、ＲＮＡである、請求項１９に記載の方法。
21. 結合した粒子に凝集体を形成させることが、結合した粒子に自己凝集させることを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 第一および第二のタイプの粒子が、ナノメートルのオーダーの大きさを有するナノオブジェクトである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 長距離三次元結晶性秩序を示すメタ材料を含み、ここで、メタ材料は、タイプ１および２の複数のナノオブジェクトを含み、タイプ１のナノオブジェクトは、結合領域およびスペーサ領域を含む第一の核酸で機能化され、ここで、スペーサ領域の少なくとも１つのセグメントは二本鎖であり、タイプ２のナノオブジェクトは、結合領域およびスペーサ領域を含む第二の核酸で機能化され、第一の核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される核酸を含み、機能化されたナノオブジェクトは、それらの夫々の結合領域のハイブリダイゼーションで結合され、結合されたナノオブジェクトは、非最密結晶構造に凝集し、
    タイプ１および２のナノオブジェクトの結合領域が相互作用せず、
    機能化されたナノオブジェクトが、第三の核酸の第一および第二の認識領域と、それらの夫々の結合領域のハイブリダイゼーションによって結合され、
    第一の認識領域が、タイプ１のナノオブジェクトの結合領域と相補的であり、
    第二の認識領域が、タイプ２のナノオブジェクトの結合領域と相補的であり、
    第三の核酸は、少なくとも５塩基のポリＴ ＤＮＡの中性セグメントを有し、中性セグメントは第三の核酸の第一および第二の認識領域を分離する、
    プラズモニック結晶。
24. 第二の核酸が、ＰＮＡを含む、請求項２３に記載のプラズモニック結晶。
25. 第二の核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、並びに、ＲＮＡとＤＮＡからなる群から選択される、請求項２３に記載のプラズモニック結晶。
26. メタ材料が、体心立方結晶構造を有する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のプラズモニック結晶。
27. 機能化されたナノオブジェクトが、結晶体積の１０％未満を占める、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のプラズモニック結晶。
28. 結合セクションおよびスペーサセクションを含む核酸で夫々機能化された２つのタイプのナノオブジェクトを含むナノ粒子凝集を含む触媒であって、スペーサセクションの少なくとも１つのセグメントは二本鎖であり、
    機能化された２つのタイプのナノオブジェクトの夫々は、それらの夫々の結合セクションのクロスリンキングによって、第三の核酸を有するクロスリンカーと結合されており、第三の核酸は、機能化された２つのタイプのナノオブジェクトの結合セクションに相補的な第一および第二の結合セクションと、中性セグメントとを含み、第三の核酸の中性セグメントは、少なくとも５塩基のポリＴ ＤＮＡを有し、かつ第三の核酸の第一および第二の結合セクションを分離し、
    ２つのタイプのナノオブジェクトの核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択され、
    ナノ粒子凝集が長距離結晶性秩序を示し、
    長距離結晶性秩序が、非最密結晶構造を有する結晶を含み、
    ナノ粒子凝集が、化学反応を触媒するように作動可能である、前記触媒。
29. 機能化したナノオブジェクトが、結晶の総体積の１０％未満を占有している、請求項２８に記載の触媒。
30. 非最密結晶構造が、体心立方結晶構造である、請求項２８または２９に記載の触媒。
31. ナノ粒子凝集が、さらに第三のタイプのナノオブジェクトを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の触媒。
32. 第三のタイプのナノオブジェクトが、相互作用しない核酸で機能化され、ここで、第三のタイプのナノオブジェクトを機能化する全ての核酸に対する第三のタイプのナノオブジェクトを機能化する相互作用しない核酸のモル比が、９５％未満である、請求項３１に記載の触媒。
33. 核酸が、ＰＮＡ、ＲＮＡ、並びに、ＤＮＡとＲＮＡからなる群から選択される、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の触媒。
34. 核酸がＲＮＡであり、ＲＮＡが、化学反応を触媒するように作動可能である、請求項３３に記載の触媒。
35. ナノ粒子凝集が、ナノ粒子凝集の表面に吸着される無機材料をさらに含み、無機材料が化学反応を触媒するように作動可能である、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の触媒。

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